DE2252844C2

DE2252844C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Entfernen unerwünschter Stoffe aus flüssigen Proben

Info

Publication number: DE2252844C2
Application number: DE2252844A
Authority: DE
Inventors: Thomas Henry Newark Del. Adams; Warren Keene Wilmington Del. Miller
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1971-10-28
Filing date: 1972-10-27
Publication date: 1984-02-16
Also published as: GB1416448A; NL177443C; JPS4852287A; NL7214564A; IT982362B; US3794467A; SE404302B; CH562449A5; DE2252844A1; JPS524478B2; NL177443B; FR2157974B1; FR2157974A1; CA976672A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtung zum Entfernen unerwünschter Stoffe aus flüssigen Proben, bei dem die flüssige Probe durch ein Gefäß geleitet wird, das mindestens teilweise mit starren, porösen Teilchen gefüllt ist.

Die üholometrische Analyse von flüssigen Proben isl eine bekannte chemische Analysenmethode, die besonders auf dem klinischen Gebiet Anwendung findet, wo das Bedürfnis, Körperflüsslgkeiten schnell analysleren zu können, zur Entwicklung automalischer Geräte geführt hat, die eine Reihe von analytischen Untersuchungen durchführen. Die meisten dieser Geräte machen von bekannten biochemischen Reaktionen zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten Bestandteilen in flüssigen Proben Gebrauch. Bei diesen Tests wird ein Reagens, das in Gegenwart des betreffenden Bestandteils eine Reaktion auslöst, in die Flüssigkeit eingeführt. Die dadurch ausgelöste Reaktion beeinflußt die photometrische Dichte der Flüssigkeitsprobe, die dann mit einem Photometer festgestellt wird. Beispiele für derartige Analysen sind die Untersuchungen auf Harnstoffstickstoff und Biutglucose, wie sie in den Beispielen der US-PS 34 76 515 beschrieben sind.

Unter Umständen verlieren diese Testmethoden jedoch ihre Wirksamkeil, wenn nämlich die Reagenzien mit anderen Stoffen reagieren, die in der Probe enthalten sind. Diese Reaktionen machen die photometrische Analyse gewöhnlich unzuverlässig, indem sie zur Bildung eines Niederschlages führen, der die Flüssigkeit trübt. Diese Schwierigkeit tritt besonders bei Körperflüssigkeiten auf, in welchem Falle die störenden Stoffe gewöhnlich Proteine sind. Daher müssen für viele analytische Routinetestmethoden die Proteine zuerst aus der Probe entfernt werden.

Wenn die Analyse von Hand durchgeführt wird, kann man die störenden Stoffe oft durch Ausfällen und Abzentrifugieren entfernen. Beim Zentrifugieren bildet sich aber nicht immer eine feste Masse, so daß das Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit schwierig wird. Oft bildet sich ein Film, der auf der Flüssigkeit schwimmt. Ferner erfordert das Zentrifugieren eine zweistufige Probenahme, nämlich einmal vor und einmal nach dem Zentrifugieren; diese zusätzliche Probenahme bringt eine weitere Wahrscheinlichkeit von fehlerhaften quantitativen Ergebnissen mit sich. Ferner ist das Zentrifugieren für automatische Geräte unpraktisch.

Niederschläge können auch durch Abfiltrieren von Flüssigkelten getrennt werden. Beim Filtrieren können aber gelöste Stoffe durch Adsorption an dem Filterpapier oder durch Ausfällung verlorengehen. Weiterhin ist für die Filtration, ebenso wie für das Zentrifugleren, im allgemeinen eine doppelte Probenahme erforderlich, wodurch die Möglichkeit ungenauer quantitativer Ergebnisse vergrößert wird. Ferner bildet das Filterpapier eine Quelle für Verunreinigungen und muß von Zeit zu Zeit ausgewechselt werden, und schon ein winziges Loch macht das Filterpapier unwirksam.

Gemäß der FR-PS 70 30 343 werden mit Ionenaustauschharz und Hydroxyapatit beschickte Säulen zum Entfernen von geladenen Teilchen bzw. Makromolekülen bei Verwendung automatischer Geräte angewandt. Das Ionenaustauschharz hält aber auch andere Stoffe zurück, die eine ähnliche Ladung aufweisen wie der zu entfernende Stoff, und 1st nicht imstande, neutrale Moleküle zu entfernen. Hydroxyapatit hat ähnliche Anwendungsgrenzen, indem er auch andere Moleküle zurückhält, die die gleiche Größe und Ladung haben wie der unerwünschte Stoff, und nicht imstande isl, kleine, neutrale Teilchen zu entfernen.

Schon früh in der Entwicklung der automatischen Analyslergeräte hat man die Notwendigkeit einer automatischen Methode zum Entfernen unerwünschter Stoffe erkannt. So beschreibt die US-PS 27 97 149 eine Dialysiervorrichtung, die »kristalloide« Bestandteile aus einer

Lösung von »kristalloiden« und »nicht-krislalloiden« (oder kolloidalen) Bestandteilen proportional zu dem Anteil der kristalloiden Substanz in der Flüssigkeit entfernt. Diese Methode erfordert aber eine mehr oder weniger kontinuierliche Strömung der flüssigen Probe und ist daher für Einzelanalysen nicht brauchbar. Ferner leidet diese Methode auch an mehreren positiven Nachteilen. Die Dialyse beruht auf der Diffusion von krislalloiden Bestandteilen durch eine semipermeable Membran, und dies ist ein langsamer Prozeß. Infolgedessen muß in das Gerät eine größere Probemenge für die Analyse eingeführt werden, damit in einer nicht übermüßig langen Zeitspanne eine genügende Menge durch die Membran hindurchdiffundieren kann. Da ferner die verschiedenen Makromoleküle verschiedene Diffusionsgeschwindigkeiten haben, läßt sich die Menge eines jeden durch Dialyse entfernten Makromoleküls schwer eichen. Außerdem läßt s,ich der auf diese Weise entfernte Stoff nicht in einer Form sammeln, in der er gewaschen wenden kann und quantitativ genaue Ergebnisse liefert. Schließlich leidet die Membran an den gleichen Nachteilen wie das Filter, weil sie eine Quelle für Verunreinigungen darstellt und schon durch ein winzige:. Loch unbrauchbar wird.

Aus der US-PS 35 19 390 ist eine für einen medizinischen Test zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion geeignete, spritzenähnliche Vorrichtung bekannt. Diese spritzenähnliche Vorrichtung enthält !onenaustauschkörperchen und zwischen den lonenaustauschkörperchen befindet sich zur Erleichterung des Ionenaustausches Natriumeitrat. Eine irgendwie geartete Ausfällung findet «1 hierbei nicht statt.

Aus der US-PS 27 36 638 ist ein Verfahren zur Aufspürung und quantitativen Bestimmung von Schwefeldioxid bekannt, bei dem ein länglicher Körper mit inerten Teilchen verwendet wird. Ein Gas, das SO₂ enthält, bzw. auf SO₂ untersucht werden soll, wird durch die Vorrichtung geleitet, und das eventuell vorhandene SO₂ bestimmt. Für die Untersuchung von Flüssigkeiten ist dieses Verfahren bzw. die dafür geeignete Vorrichtung nicht gedacht. Darüber hinaus soll Im Rahmen dieses Verfallrens die Verwendung von flüssigen Reaktionsmitteln -ausgeschlossen werden, da diese Nachteile aufweisen (siehe Zeilen 51 und 52 in Spalte 1 der US-PS).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein effektives Verfahren zum Entfernen unerwünschter Stoffe aus flüssigen Pro- -Ti ben zur Verfügung zu stellen, bei dem die oben geschilderten Nachteile, die bei Ionenaustauschverfahren, Zentrlfugierverfahren oder Filtrierverfahren unter Verwendung von Filterpapier auftreten, vermieden werden.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren der ϊο eingangs erwähnten Art. das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zwischenräume zwischen den porösen Teilchen und die Räume In den Poren der Teilchen mindestens teilweise mit einem Fällmittel für den unerwünschten Stoff gefüllt sind und die Teilchen einen Durchmesser von etwa 37 bis 125 μιτι und Porengrößen von etwa 17,5 bis 125 nm haben.

Die poröse Beschaffenheit der Teilchen hat zwei wichtige Aufgaben. Erstens tragen die Poren dazu bei, daß der sich aus dem unerwünschten Stoff bildende Niederschlag eo zurückgehalten wird. Zweitens führen die Poren zu einer besseren Durchmischung der flüssigen Probe und des Fällmittels. Dies nimmt besondere Bedeutung an, wenn das Fällmittel flüssig ist. Durch das Mischen wird die Grenzfläche zwischen der flüssigen Probe und der das Fällmittel enthaltenden Lösung zerstört. Wahrscheinlich erzeugt die Porosität der Teilchen eine Turbulenz In den Fliissiekelten bei deren Hindurchströmen durch die Teilchen. Ferner halten die Oberflächen der Poren eine gewisse Menge flüssiges Fällmittel zurück, die dann mit der Probe bei deren Durchgang durch die Poren in Berührung kommt.

Das Abfiltrieren eines Niederschlages auf Filterpapier oder das Zurückhalten eines gelösten Stoffes hinter einer Dialysiermembran erfordert, daß das Filtrierpapier oder die Membran unverletzt bleibt und kein Loch oder keinen Riß bekommt. Tatsächlich bilden sich aber solche Löcher oder Risse in Filterpapier oder Membranen wegen deren laminarer Struktur aus, so daß die störenden Stoffe, die eigentlich zurückgehalten werden sollten, durch das Papier oder die Membran hindurchtreten und die Probe verunreinigen. Die Zurückhaltung eines Niederschlages durch die porösen Teilchen beruht dagegen auf der Tatsache, daß die Teilchen einen bestimmten Raum in einem Gefäß einnehmen und füllen. Daher gibt es keine Möglichkeit zur Ausbildung von Löchern, wie in einem Film, und deshalb entfällt diese Quelle für Verunreinigungen. Sollte die Struktur der porösen Teilchen tatsächlich zu einem gewissen Ausmaß zusammenfallen (obwohl Ihre starre Beschaffenheit dies verhindern sollte), dann besteht der Endeffekt In einer Verminderung der Porengröße und dem Zwischenraumvolumen zwischen den Teilchen, so daß die Fähigkeit der Teilchen, einen Niederschlag zurückzuhalten, hierdurch sogar erhöht wird. Dies ist besonders wichtig, wenn man Druck anwendet, um die Flüssigkeit durch den Filtermechanismus hindurchzutreiben; denn bei der automatischen Analyse wird häufig Druck angewandt, um die Geschwindigkeit zu erhöhen, und daher besteht hier eine um so größere Gefahr der Ausbildung von Löchern In Filterpapieren oder Dialysiermembranen, so daß diese ihre Wirksamkeit verlieren.

Ferner erfordert die Verwendung von porösen Teilchen nur eine einmalige Probenahme. Man kann eine bestimmte Menge aus der zu reinigenden Flüssigkeit entnehmen und diese ganze Menge (abzüglich des Niederschlages) durch die Teilchen hindurchtreiben und dann für die Analyse gewinnen. Weiterhin kann der Niederschlag, der von den Teilchen zurückgehalten wird, mit einer bestimmten Menge an Verdünnungsmittel gewaschen werden, und die kombinierten bestimmten Flüssigkeitsmengen können nach der Reinigung quantitativ analysiert werden.

Das Reinigen von flüssigen Proben durch Hindurchleiten durch poröse Perlen, die ein Fällmittel enthalten, steigert die Genauigkeit der Analyse der gereinigten Probe auch noch in anderer Weise. Die Nlederschlagsstellchen bilden sich nämlich, während die flüssige Probe durch die porösen Perlen hindurchläuft. Dies gibt den Molekülen des gelösten Stoffes, die nicht ausgefällt werden sollen, die Möglichkeit, sich von dem Niederschlag zu trennen. Indem sie durch die Perlen hindurchströmen, während sich der Niederschlag bildet. Die Moleküle des gelösten Stoffes bewegen sich von dem Niederschlag aus stromabwärts, während sich der Niederschlag bildet. Hierdurch wird die Notwendigkeit vermieden, die Moleküle des gelösten Stoffes durch den Niederschlag nach dessen Bildung hindurchzuleiten, wie es bei Filterpapier der Fall ist. Dadurch werden die Moleküle des gelösten Stoffes davor bewahrt, daß sie beim Versuch, sie durch den Niederschlag hindurchzutreiben, von diesem festgehalten werden, und daher erhält man auf diese Weise quantitativ genauere Ergebnisse.

Oft müssen besondere, unerwünschte Stoffe entfernt werden, während alle anderen Bestandteile In der flüssigen Probe verbleiben müssen. Die Spezifität des Enlzu-

ges bei Verwendung von porösen Teilchen hängt von der Spezifität des flüssigen Fällmittels für den zu entfernenden Stoff ab. Die Ausfällung ist jedoch eine chemische Reaktion und weist daher eine größere Spezifität auf als die Klassierung nach Ladung und Größe, wie sie bei lonenausiauschharzen und Hydroxyapalit erfolgt.

Wenn das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung für die automatische Analyse flüssiger Proben verwendet werden, besteht das Verfahren darin, dall man im wesentlichen die ganze Probe durch die ein Fällmittel, vorzugsweise ein flüssiges Fällmittel, enthaltenden Teilchen hindurchtreibt, um praktisch die Gesamtmenge des unerwünschten Stoffes zu entfernen, die Probe dann in eine Reaktionskanimer einbringt und den betreffenden Bestandteil bestimmt. Vor der. Bestimmung müssen gewöhnlich Reagenzien, die mit dem durch Analyse zu bestimmenden Bestandteil eine Reaktion auslösen, in die flüssige Probe eingeführt werden. Wenn diese Reaktion die photometrische Dichte der flüssigen Probe beeinflußt, kann die Bestimmung photometrisch durchgeführt werden. Ein geeignetes Analysenverfahren und eine dazu geeignete Vorrichtung ist beispielsweise aus der DE-OS 20 41 224 bekannt.

Die automatische Vorrichtung besieht aus einem Gefäß, das mindestens teilweise mit starren porösen Teilchen gefüllt ist, wobei die Räume in den Poren und zwischen den Teilchen mit einem Fällmittel für den unerwünschten Stoff gefüllt sind, einer Probenahmevorrichlung zum Entnehmen einer flüssigen Probe aus ihrem ursprünglichen Behälter und zum Hindurchtreiben praktisch der gesamten Probe durch die porösen Teilchen in eine Reaktionskammer, und einer Vorrichtung zum Analysieren der flüssigen Probe. Gewöhnlich gehören auch noch Mittel zum Auslösen einer Reaktion dazu. Gemäß einer Ausführungsform wird die flüssige Probe durch die porösen Teilchen getrieben, indem man ein Verdünnungsmittel hinter der Probe einführt. Dieses Verdünnungsmittel verdrängt praktisch die gesamte Probe und eine gewisse Menge des flüssigen Fällmittels in die ReakHonskamrner. Da praktisch die gesamte Probe, nicht nur ein Teil derselben, durch die Teilchen hindurch in die Analysenslufe gefördert wird, benötigt man nur eine einzige Probe, und man kann mit einer geringeren Anlangsprobenmenge arbeiten. Da ferner die porösen Teilchen in Form einer kleinen, unaufwendigen Patrone vorliegen können, kann man die flüssige Probe durch eine zum Wegwerfen nach Gebrauch bestimmte Palrone in das automatische Gerät einführen, wodurch die Gelahr einer Verunreinigung beseitigt wird.

Dieses analytische Verfahren hat den Vorteil, besonders in Verbindung mit einem automatischen Gerät, daß keine zwischenzeitlichen Verfahrensstufen des Entfernens und der Gewinnung nötig sind. Die flüssige Probe wird direkt durch die porösen Teilchen in die Reaktionskammer geleitet. Jedoch muß ein Verfahren zum Entfernen störender Stoffe mit Hilfe von Teilchen, wenn es in ein automatisches Gerät einbezogen werden soll, wenigstens zwei Anforderungen erfüllen. Erstens muß das Verfahren innerhalb der durch das Gerät bedingten Raum- und Zeitgrenzen praktisch den gesamten unerwünschten Stoff entfernen. Die Teilchenschicht, durch die die flüssige Probe geleitet wird, kann nur einige Zentimeter lang sein, wenn sie als Bestandteil eines Meßgerätes ausgebildet sein soll. Ferner darf die zum Hindurchleiten der Probe durch die Teilchenschicht erforderliche Zeit einige Minuten nicht überschreiten, ohne den Wirkungsgrad des Gerätes wesentlich zu vermindern.

Zweitens muß die flüssige Probe der Reaktionskammer In einer Form zugeführt werden, die für die Analyse nach einem automatischen Verfahren geeignet ist, das seiner Natur nach mit genau bestimmten Volumina und Konzentrationen von Probe und Reagenzien durchgeführt werden muß. Normalerweise wird die flüssige Probe mit einem Verdünnungsmittel gemischt, bevor die Reagenzien zugesetzt werden. Wenn die Mittel, die zum Entfernen des störenden Stoffes angewandt werden, die Konzentration der Probe in einer nicht vorhersehbaren ίο Weise ändern, läßt sich die Analyse automatisch nicht genau durchführen.

Gemäß der Erfindung wird ein beträchtlicher Entzug des störenden Stoffes erreicht, indem man poröse Teilchen verwendet, die eine Flüssigkeit enthalten, welche nur auf den unerwünschten Stoff als Fällmittel wirkt, so daß der Rest der Probe ungeändert durch die Teilchen hindurchgeht. Eine kurze Säule von porösen Teilchen mit dem Fällmittel entfernt in wirksamer Weise praktisch den gesamten unerwünschten Stoff, und wenn man die flüssige Probe durch die kurze Säule unter Druck hindurchtreibl, kann die gesamte flüssige Probe in weniger als 2 Minuten durch die Säule geleilet werden. Gewöhnlich wird die Probe durch die Säule unter der Einwirkung eines unter Druck stehenden Verdünnungsmittels hindurchgetrieben. Wenn man die richtige Menge an Verdünnungsmittel anwendet, gelangen die gesamte flüssige Probe, eine bekannte Menge des Verdünnungsmittels sowie eine bekannte Menge des flüssigen Fällmittels in die Reaktionskammer, und es besteht keine Ungewißheit über die Konzentration des Gemisches in der Reaklionskammer.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird auf die Zeichnungen Bezug genommen.

Fig. 1 zeigt in Form eines Diagramms den Wirkungsgrad einer mit porösen Glasperlen gefüllten Säule für die Entfernung von Proteinen in Abhängigkeit von der Porengröße.

Fig. 2 ist eine schematische Darstellung einer einfachen Ausführungsform eines automatischen Analysierge-ίο rates, das im Rahmen der Erfindung verwendet werden kann.

Fig. 3 ist ein Querschnitt durch eine mit Glasperlen beschickte Säule, die in dem automatischen Analysiergerät gemäß Fig. 2 verwendet werden kann. Fig. 4 zeigt schematisch eine analytische Testpackung für die Verwendung gemäß der Erfindung in einem automalischen Analysiergerät.

Um die porösen Teilchen zum Entfernen von unerwünschten Stoffen verwenden zu können, werden sie in ein Gefäß eingebracht, das den Durchgang der flüssigen Probe durch die Teilchen gestattet. Eine hohle Säule, die an einem oder beiden Enden von einem Sieb bedeckt ist, das die porösen Teilchen in der Säule zurückhält, stellt eine besonders geeignete Gefäßart dar. Eine andere Gefäßan ist z. B. ein Trichter. Es ist nichts weiter erforderlich, als daß das Gefäß eine Schicht der Teilchen in einer solchen Anordnung enthält, daß die flüssige Probe durch die Teilchen hindurchströmen kann.

Die porösen Teilchen erfüllen bei dem Entfernen von unerwünschten Stoffen zwei Hauptaufgaben. Sie tragen zum Vermischen der flüssigen Probe und des flüssigen Fällmittels bei, und sie halten die Teilchen des sich aus dem unerwünschten Stoff bildenden Niederschlages zurück. Ein kritisches Merkmal der Teilchen sind ihre Poren. Diese müssen so groß sein, daß die flüssige Probe hindurchströmen und der Niederschlag in die Poren eintreten kann; sie müssen aber auch so klein sein, daß sie die Mischung der Flüssigkeit hervorrufen und den Nie-

dersclilag zurückhallen. Teilchen mit Porengrößen von etwa 17,5 bis 125 um genügen diesen beiden Anforderungen. Dieses sind jedoch keine absoluten Grenzen. Teilchen, die einen nominellen Porendurchmesser in diesem Bereich haben, sind im Handel erhältlich und genügen für den Zweck der Erfindung, obwohl Tabelle I zeigt, daß der nominelle Porendurchmesser dieser Teilchen nicht notwendigerweise mit dem mittleren Porendurchmesser übereinstimmt.

Tabelle I

Nomineller Poren	Mittlerer Poren-
durchmesser, nm	durchmesserbereich, nm
7,5	6,0- 9,0
12,5	10,0- 15,0
17,5	15.0- 20,0
24,0	20,0- 27,5
37,0	31,5- 42,5
55,0	49,5- 60,5
70,0	63,0- 77,0
125,0	112,5-137,5
200,0	180,0-220,0

Erfindung.
Die maximale Abmessung der porösen Teilchen

Lösung sein, deren gelöster Stoff mit dem unerwünschten Stoff einen Niederschlag erzeugt.

Wenn der Zweck der Reinigung nur darin besteht, den unerwünschten Stoff zu entfernen, kann man jedes Fällmittel verwenden, das hierfür ausreicht. Wenn aber nicht nur ein unerwünschter Stoff entfernt werden soll, sondern auch andere Stoffe in der flüssigen Probe verbleiben sollen, muß ein Fällmittel gewählt werden, welches zwar den unerwünschten Stoff ausfällt, aber die anderen lu Stoffe, die in der Lösung verbleiben müssen, nicht beeinflußt. Der letztgenannte Fall ist z. B. gegeben, wenn anschließend Analysen auf diese Stoffe durchgeführt werden sollen. Wenn es kein Mittel zum Ausfällen des unerwünschten Stoffes gibt, ist diese Methode nicht anwendbar.

Der tntzug von Proteinen wird immer häufiger angewandt, well in neuerer Zeit automatische Verfahren zur klinischen Analyse entwickelt worden sind, bei denen die Proteine stören. Da es viele Fällmittel für Proteine gibt, eignen sich das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung besonders zum Entfernen von Proteinen. Einige der Stoffe, die bekanntlich Proteine ausfällen, sind organische Lösungsmittel entweder in reinem Zustand oder mit einem Gehalt an gelösten Stoffen, sowie wäßrige Lösungen, die Schwermelallionen, hohe Salzkonzentrationcn oder anionische Fällmittel enthalten. Beispiele für diese sind Aceton und Äthanol, Ammoniumsullatlösungen. Lösungen von Quecksilber(II)-, Eisendll)-,

Ferner brauchen bei diesen Teilchen nach den Anga- Zink-, Cadmium-, Blei- oder KupferdD-ionen sowie ben des Lieferanten nur 80°,, der Poren Grölten innerhalb 30 Trichloressigsäure, Wolframsäure, Metaphosphorsäure ± 10°,, des mittleren Porendurchmessers aufzuweisen. und Perchlorsäure.

Trotzdem eignen sich diese Teilchen für die Zwecke der In der in Fig. 2 dargestellten automatischen Vorrichtung, die abgesehen von der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung aus der DE-OS 20 41 224 bekannt ist, beflnbeträgt etwa 37 bis 125 μηι. Wenn die Teilchen wesent- 35 det sich die flüssige Probe anfänglich in dem Probenbelich größer sind, sind die Zwischenräume zwischen ihnen halter 11. Ein Teil der flüssigen Probe wird unter der so groß, daß Verunreinigungen und Niederschlag hin- Wirkung der Pumpe 13 aus diesem Behälter in eine durchtreten können und die angeblich reine Probe verun- Sonde 12 abgezogen und unter einem solchen Druck in reinigen. Wesentlich kleinere Teilchen lassen sich schwer die mit porösen Perlen beschickte Säule 14 ausgetragen, hantieren und auf dem Sieb zurückhalten. Sie vermin- 40 daß die Probe vollständig durch die (stark vergrößert dardcrn aulierdem die Strömungsgeschwindigkeit der Probe. gestellten) Perlen 21 hindurchströmt und in einer kurzen Die porösen Teilchen brauchen keine besondere Form Zeitspanne in die Reaktionskammer 15 ausgetragen wird, zu haben. Eine Kugelform verleiht ihnen jedoch ein Eine Methode, um zu gewährleisten, daß die flüssige freies Fließvermögen, so daß sie sich leicht in dichter Probe vollständig durch die Säule durchgesetzt wird. Packung in das Gefäß einfüllen lassen. Die Teilchen sol- 45 besteht darin, daß man die Pumpe, bevor sie die Probe len aber starr sein, damit sie ihre Form unter dem ansaugt, so viel Verdünnungsmittel ansaugen läßt, daß Gewicht der Flüssigkeit beibehalten und der Kraft der die Probe durch die Säule von dem hinter ihr nachströ-Flüssigkeiten widerstehen können, die durch sie hin- menden Verdünnungsmittel hindurchgetrieben wird, durchströmen, besonders wenn die Flüssigkeiten, wie es Wenn die Glasperlensäule ein trockenes Fällmittel entbei automatischen Geräten oft der Fall ist, unter einem 50 hält, kann sie zunächst mit einer gewissen Menge Flüs-Druck im Bereich von etwa 0,07 bis 7 bar durch die Teil- sigkeit gesättigt werden. Dann kann die Pumpe 13 eine chen hindurchgetrieben werden. Im Handel erhältliche
Teilchen in Perlform haben oft eine unregelmäßige Form
und fallen in verschiedenen Teilchen- und Porengrößen
an.

Als Fällmittel kann jeder Stoff verwendet werden, der die Ausfällung des unerwünschten Stoffes in dem gewünschten Ausmaß herbeiführt. Unter Umständen stören geringe Mengen an dem unerwünschten Stoff die nachfolgende Verwendung oder Analyse der Probe nicht. Daher braucht ein geeignetes Fällmittel nicht die Gesamtmenge des unerwünschten Stoffes auszufällen, sondern es genügt, wenn es so viel von diesem Stoff entfernt, daß der Rest für die nachfolgende Verwendung

oder Analyse zugelassen werden kann. Das Fällmittel 65 Verdünnungsmittel in der Sonde größer ist als die Menge kann ein zwischen den Teilchen und in den Poren ver- der ursprünglich In der Säule enthaltenen Flüssigkeit, teilter fester Stoff, ein reines Lösungsmittel, das den wird durch das Einspritzen des Sondeninhalts in die uneewünschten Stoff in Lösung entfernt, oder eine Säule zunächst die Flüssigkeit, dann die flüssige Probe

bestimmte Menge Verdünnungsmittel, weiches aus der gleichen oder einer anderen Flüssigkeit als derjenigen bestehen kann, mit der die Säule zuvor beschickt worden ist, in die Sonde einsaugen. Hierauf wird die gewünschte Probenmenge hinter dem Verdünnungsmittel in die Sonde eingesaugt. Wenn der Inhalt der Sonde in die Säule eingespritzt wird, wird zuerst die flüssige Probe und dann das Verdünnungsmittel ausgetragen.

Wenn entweder ein flüssiges Fällmittel oder ein trokkenes Fällmittel, das zunächst mit etwas Flüssigkeit gesättigt worden Ist, verwendet wird, verdrängt die aus der Sonde in die Säule eingefüllte Flüssigkeit die bereits in der Säule enthaltene Flüssigkeit. Wenn die Menge an

und schließlich derjenige Teil des Verdünnungsmittels aus der Säule verdrängt, der die Süttigungskapazitäl der Säule übersteigt. Am Ende des Pumpvorganges werden die gesamte flüssige Probe und die Gesamtmenge an Verdünnungsmittel sowie eine der zweiten Menge des Verdünnungsmittels entsprechende Flüssigkeitsmenge in die Reaktionskammer verdrängt. Auf diese Weise kann die genaue Flüssigkeitsmenge In der Reaktionskammer und mithin die Probeilkonzentration gesteuert werden.

Dann werden verschiedene Reagenzien aus den Kammern 16, 17 und 18 in die Reaktionskammer eingeführt, um eine Reaktion auszulösen. Die Undurchsichtigkeit der Flüssigkeit in der Reaktionskammer nach einer bestimmten Zeil oder die Änderung der Undurchsichtigkeii in einer bestimmten Zeitspanne wird pholomctrlsch durch Bestrahlen der Flüssigkeit mit der Lichtquelle 20 und Messen der Intensität des durchfallenden Lichts mit Hilfe des Photometers 19 bestimmt.

Hs gibt zahlreiche bekannte Abänderungen des in Fig. 2 dargestellten einfachen automatischen Analysiergerätes. Zu diesen gehören Abänderungen der Methode zum Überführen der Flüssigkeit aus dem Probenbehälter in die Reaktionskammer, Abänderungen der Methode zum Einführen der Reagenzien, Abänderungen der Methode zur photometrischen Analyse der Flüssigkeit und zahllose Zwischenstufen der Konditionierung. Zwei Abänderungen sollen besonders erwähnt werden: In gewissen Fällen tritt die zu überwachende Änderung der Flüssigkeit von selbst ein und braucht nicht ausgelöst zu werden. In diesen Fällen brauchen keine Reagenzien in die Reaktionskammer eingeführt zu werden. Ferner können, obwohl die photomelrische Analyse das normale Verfahren zum Bestimmen der betreffenden Bestandteile ist, andere Analyseverfahren, wie die kolorimetrisch^ Analyse, angewandt werden.

Ein für die Zwecke der Erfindung besonders geeignetes Gerät ist in der IT-PS 8 83 635 beschrieben. Aus der US-PS 36 12 360 ist eine besondere Probenüberführungsvorrichtung bekannt, die sich ebenfalls für die Zwecke der Erfindung besonders gut eignet.

Wenn die mit porösen Perlen beschickte Säule in einem automatischen Gerät verwendet wird, muß die Probe durch die Perlen hindurchireten und der störende Stoff in so kurzer Zeit entfernt werden, wie es durch die anderen Arbeitsvorgänge des Gerätes bedingt wird. Die meisten analytischen Geräte führen ihre Analyse in 10 bis 20 Minuten durch. Daher darf die Probe nicht langer als einige (vorzugsweise 2) Minuten in den Perlen verweilen. Die Verlängerung dieses Zeitraumes würde die zeitsparende Beschaffenheit des automatischen Gerätes 5» erheblich beeinträchtigen. Urn dies zu vermeiden, ist die erfindungsgemäß veiwendete Säule beträchtlich verkürzt worden, und die Probe wird unter Druck, vorzugsweise unter einem Druck von 0,07 bis 7 bar, durch die Säule getrieben. Um diesen Druck zur Einwirkung zu bringen, muß eine Pumpe verwendet werden, die die Flüssigkeil unmittelbar in die Säule treibt. Ferner muß der Weg von der Pumpe zur Austrittsöffnung und in die Reaktionskammer dicht sein, damit der von der Pumpe ausgeübte Druck die Flüssigkeit durch die Säule treibt und sich nicht durch Undichtigkeiten zerstreut. Wie in Fig. 2 dargestellt, ist die Säule ein Rohr mit einer Eintrittsöffnung 22. die so ausgebildet ist, daß sie ohne Undichtigkeiten unmittelbar mit der Sonde 12 zusammenpaßt.

Flg. 3 zeigt eine einfache Säule 14 mit porösen Perlen &5 21, die erfindungsgemäß verwendet werden kann. Die Säule 14 ist mit zwei Gummikappen 24 und 25 versehen, von denen eine eine Austrittsöffnung 26 aufweist. Bei dieser Anordnung ist die Sonde 12 als Injektionsnadel ausgebildet, die durch die Gummikappe 24 eingestochen werden kann und dann eine flüsslgkeitsdichte Verbindung mit der Säule bildet. Flüssigkeit wird aus der Sonde direkt durch die Säule 14, das Sieb 28 und die Austrittsöffnung 26 in die Reaktionskammer getrieben.

Fig. 4 erläutert eine analytische Testpackung, bei der eine mit porösen Perlen beschickte Säule, eine Reaktionskammer und die in die Reaktionskammer einzuführenden Reagenzien sämtlich in der gleichen Packung enthalten sind. Die Packung ist in der US-PS 34 76 515 beschrieben. Sie besteht aus einem starren Kopfstück 30, an dem ein Beutel 31 aus durchsichtigem Kunststoff befestigt ist. Das Kopfstück enthält die mit porösen Perlen beschickte Säule 32, die am einen Ende eine Einlaßöffnung 33 und am anderen Ende eine Auslaßöffnung 35 aufweist. Die Säule ist mit Gummipropfen 51 und 52 verschlossen, so daß eine Injektionsnadel durch die Öffnung 33 eingeführt werden kann. Im Betrieb arbeilet die Säule ähnlich derjenigen, die an Hand von Fig. 3 beschrieben wurde. In diesem Falle mündet jedoch die Auslaßöffnung 35 in eine Reaktionskammer 36 ein, die in dem durchsichtigen Kunststoffbeutel durch eine Schweißnaht 53 gebildet wird, die rings um den Umfang des Beutels verläuft. Die Reagenzien sind in Form von festen Stoffen oder Flüssigkeiten in Fächern enthalten, die in der Reaktionskammer durch die zerbrechbaren Dichtungen 37 bis 42 gebildet werden. Die Reaktion wird eingeleitet, indem man die Reaktionskammer 36 zusammendrückt, bis die in ihr enthaltene flüssige Probe gegen die zerbrechbaren Dichtungen getrieben wird und diese zerbricht, so daß der Inhalt in die Reaktionskammer ausgetragen wird. Wenn man die Anordnung so trifft, daß einige der zerbrechbaren Dichtungen geschützt werden, während andere zerbrechen, können die Reagenzien zu den geeigneten Zeitpunkten in die Reaktionskammer eingeführt werden. Sobald die Reaktion eingeleitet ist, kann der Inhalt der Reaktionskammer nach dem Verfahren der IT-PS 8 70 125 photometrisch analysiert werden. Die in Fig. 4 dargestellte Anordnung ist eine in vielen Hinsichten bevorzugte Anordnung. Zu ihren Vorteilen gehört, daß jeder Analysenprobe eine besondere Perlensäule zugeordnet ist, und daß das ganze System einschließlich der Perlen nach Beendigung der Analyse weggeworfen werden kann.

Beispiel 1

Fig. 1 zeigt den Einfluß der Porengröße auf den Entzug eines unerwünschten Stoffes, der in diesem Falle ein Protein ist. Glasperlen mit Größen von 37 bis 75 μηι und den angegebenen Porengrößen werden dicht in eine 9 cm hohe Säule mit einer lichten Weite von 0,5 cm eingefüllt. An beiden Enden werden Gummistopfen eingesetzt. Die Räume in den Poren und zwischen den Perlen werden mit einer Wolframsäurelösung gefüllt, die aus 10 ml destilliertem Wasser, 10 ml lOtiger Na₂Wo₄ · 2H₂O-Lösung, 0,05 ml konzentrierter Phosphorsäure und 25 ml 0,67-normaler Schwefelsäure besteht. 0,100 ml Serum, die insgesamt 4,60 mg Protein enthalten, werden in die Säule eluiert. Dann wird die Säule mit den in Fig. 1 angegebenen Strömungsgeschwindigkeiten mit destilliertem Wasser eluiert. Das Eluieren mit Wasser wird fortgesetzt, bis insgesamt 5 ml Fällmittel, Probe und Wasser aufgefangen worden sind. Nach Zusatz von 64%iger Trichloressigsäure zu den eluierten Proben wird die Trübung photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 μηι bestimmt. Das Diagramm zeigt die Ergebnisse. Auf der Abszisse sind die Porengrößen und auf der Ordinate die

in der Probe nach dem Durchgang durch die Säule verbleibenden Proteinmengen aufgetragen. Das Diagramm zeigt einen praktisch vollständigen Entzug des Proteins bei beiden Strömungsgeschwindigkeiten im Porengrößenbereich von 37 bis 70 nm. Oberhalb 70 um treten bei der niedrigeren Strömungsgeschwindigkeit von 2,28 ml/min beträchtliche Proteinmengen durch die Säule hindurch, während bei der höheren Strömungsgeschwindigkeit von 4,75 ml/min bis zu Porengrößen von 125 nm kein Protein durch die Säule hindurchgelassen wird, während die Säule oberhalb dieser Porengröße nur sehr wenig Protein durchläßt. Diese beträchtlich bessere Leistung bei der höheren Strömungsgeschwindigkeit führt zu dem Schluß, daß die Poren in den strömenden Flüssigkeiten Turbulenz hervorrufen und auf diese Weise eine stärkere Vermischung zustande bringen.

Beispiel 2

Versuche, um den Wirkungsgrad von porösen Perlen für den Entzug von zugesetztem Protein aufzuzeigen, werden nach einem automatischen Verfahren und mit der in Fig. 4 dargestellten Packung durchgeführt. Diese Versuche haben den Zweck, den Einfluß von Proteinen auf die Harnsäureanalyse mit und ohne Durchgang der proteinhaltigen Proben durch eine mit porösen Perlen beschickte Säule, die ein Fällmittel für die Proteine enthält, zu bestimmen.

Testpackungen ähnlich derjenigen gemäß Fig. 4 für die Harnsäureanalyse werden zusammengestellt, indem 0,4 mg CuSO₄, 2,0 mg Natriumbicinchoninat bzw. 120 mg K₂COi in gesonderten Fächern untergebracht werden. Die Kopfstücke 30 der Packungen sind die gleichen wie in Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß das Fällmittel 0,17-molare NaAVo₄-LoSUiIg, 0,112-normale Schwefelsäure und 0,016-normale Phosphorsäure in destilliertem Wasser enthält. Vor dem Zusammensetzen der fertigen Packung werden 4 bis 5 ml dieses Fällmittels durch jede Säule eluie'rt.

Vier Proben von kristallinem menschlichem Albumin werden in je 5 ml destilliertem Wasser gelöst und direkt in die analytischen Testpackungen eingebracht, so daß die zum Proteinentzug bestimmten, mit Glasperlen beschickten Säulen umgangen werden. Die Konzentrationen des Albumins in jeder Teslpackung sind in Spalte 3 der Tabelle II angegeben. Spalte 4 der Tabelle II zeigt, daß das Albumin nicht durch die Säule mit den porösen Perlen hindurchgeht.

Spalte 5 der Tabelle Il gibt die Ergebnisse der mit dem automatischen klinischen Analysiergerät an den Proben durchgeführten photometrischen Harnsäureanalysen an. Bei diesen Analysen werden die oben genannten BesiaridieHe zu der Probe in der Testpackung zugesetzt, und nach einigen Minuten wird die Differenz aus der Absorption bei 540 nm und derjenigen bei 470 nm gemessen.

Diese Proben enthalten keine Harnsäure. Die Werte der Spalte 5 zeigen daher die von den Proteinen verursachte Störung der Harnsäureanalyse. Jeder der Zahlen in Spalte 5 der Tabelle II ist ein Mittelwert aus zwei bis drei Bestimmungen.

Für die fünfte Probe werden 0,060 ml einer Lösung von 7 g kristallinem menschlichem Albumin je 100 ml destillierten Wassers in die Kolonne eingeführt. Dann eluiert man mit destilliertem Wasser, bis insgesamt 5,0 ml in der Testpackung aufgefangen worden sind. Wenn keines der Proteine in der Säule zurückgehalten worden wäre, würde dieses Verfahren zu einer Proteinkonzentration in der Testpackung von 84,0 mg je 100 ml geführt haben, wie sie in Spalte 3 der Tabelle II in Klammern angegeben ist. Spalte 5 zeigt die Ergebnisse der photometrischen Harnsäurebestimmung an dieser Probe. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigen, daß das in der Säule nicht entzogene Protein bei der Analyse einen Harnsäurewert von 0,20 mg je 100 ml ergibt. Dies unterscheidet sich in sehr günstiger Weise von den Ergebnissen der vierten Probe in der unmittelbar vorhergehenden Reihe der Tabelle II. Wäre die Probe 4 durch Verdünnen einer anfänglichen Menge von 0,060 ml in der Testpakkung auf 5 ml erhalten worden, wie es bei der Probe 5 der Fall ist. dann wäre die anfängliche Proteinkonzentraiion in der Probe 4 genau die gleiche gewesen wie diejenige in der Probe 5, wie es sich aus der zweiten Spalte der Tabelle II ergibt. Da die Harnsäureaiialyse für die Probe 4 jedoch einen Wert von 6.25 mg je 100 ml ergibt, während die Analyse für die Probe 5 nur einen Wert von 0,20 mg je 100 ml ergibt, hai die mit porösen Glasperlen beschickte Säule der Probe 5 mehr als 98",. des störenden Proteins entzogen.

Die an den Proben 4 und 5 gewonnenen Ergebnisse nehmen in Anbetracht der Tatsache besondere Bedeutung an, daß die Proteinkonzentration von 7 g je 100 ml in diesen Proben ziemlich genau der Konzentration in menschlichem Serum entspricht, während die Beeinflussung der Harnsäureaiialyse durch dieses Protein in der Probe 4 um 6,25 mg je 100 ml im Bereich der tatsächlichen Hamsiäurekonzenlration in menschlichem Serum liegt, deren obere Grenze 8.0 mg je 100 ml beträgt. Wenn man also das Protein vor der Harnsäureanalyse nicht entfernt, täuscht dieses Protein selbst einen Harnsäuregehalt vor, der, wenn er zu dem tatsächlich in dem Serum vorhandenen Harnsäuregehalt addiert wird, einen anormal hohen Harnsäurespiegel ergibt. Hierdurch wird das Analyseverfahren wertlos. Die an der Probe 5 gewonnenen Ergebnisse zeigen jedoch, daß die mit porösen Perlen beschickte Säule der Probe so viel Prolein entzieht, daß die Harnsäureanalyse möglich wird.

Beispiel 3

Mit den analytischen Harnsäuretestpackungen gemäß Beispiel 2 wird eine Reihe von Analysen von menschlichem Serum durchgeführt. Alle Proben strömen durch eine mit porösen Glasperlen beschickte Säule zum Entfernen der Proteine hindurch. Zur Analyse wird das in Beispiel 2 genannte Gerät verwendet.

An den gleichen Proben werden außerdem Harnsäureanalysen nach der Dialysiermethode zur Entfernung der Proteine durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle III einander gegenübergestellt.

Zwischen diesen Gruppen von Werten wird ein Übereinstimmungskoeffizient von 0,988 erhalten, der dem Wert von 1,0 für völlige Übereinstimmung sehr nahekommt. Ein Diagramm, in dem die poröse Glasperlenmethode mit der Dialysemethode verglichen wird, ergibt als Kurve eine Linie mit einer Steigerung von 1,026 und einem Koordinatenschnittpunkt von 0,238, woraus folgt, daß die mit den porösen Glasperlen erzielten Resultate im Mittel um 0,238 mg je 100 ml höher liegen als die mit der Dialysiermethode erhaltenen Ergebnisse.

Die Säule zum Entfernen der Proteine entzieht also biologischen Proben die Proteine in wirksamer Weise. Durch Verwendung dieser Säule bei der Harnsäureanalyse gewinnt man Ergebnisse, die mit denjenigen der üblichen Laboratoriumsmethoden unter Anwendung der Dialyse zum Entzug der Proteine in enger Übereinstimmung stehen.

13

14

Tabelle II

Probe Proteinkonzentration Proteinkonzentration Durch die Protein- Durch Störung

in der Probe in der Testpackung entzugssäule gefundener Harnsäure

geleitet gehalt, mg-%

2. s -

3. 1.Ξ -

4. I J 7 g-%

5. S < 7 g-%

1,4 mg-%*)

2,8 mg-%

5,6 mg-%

84,0 mg-%

(84.0 mg-%)

*) g-°D = Gramm je 100 ml Lösung
mg-%= Milligramm je 100 ml Lösung.

nein nein nein nein ja

0,05 0,30 0,65 6,25 0,20

Tabelle III

Mit porösen Glasperlen beschickte Säule. mg-% Harnsäure	Hierzu 2	Dialyse
3.20	2,9
3.30	2,8
5,35	4,7
9.70	8,8
5.65	5,8
3.05	3,0
5.10	4,8
3.10	2,6
6.40	5,7
6.35	6,6
6,90	7,1
7.10	6,4
9.65	9,2
6.40	5.8
5.45	5,4
Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Entfernen unerwünschter Stoffe aus flüssigen Proben, bei dem die flüssige Probe durch ein Gefäß geleitet wird, das mindestens teilweise mit starren, porösen Teilchen gefüllt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenräume zwischen den porösen Teilchen und die Räume in den Poren der Teilchen mindestens teilweise mit einem Fällmittel für den unerwünschten Stoff gefüllt sind und die Teilchen einen Durchmesser von etwa 37 bis 125 μπι und Porengrößen von etwa 17,5 bis 125 nm haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Glasteilchen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Entfernen von Proteinen als Fällmittel flüssige Proteinfällmittel, nämlich organische Lösungsmittel, wäßrige Lösungen mit hoher Salzkonzentration, wäßrige Schwermetallösungen oder wäßrige Lösungen von anionischen Fällmitteln, verwendet.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis 3, umfassend ein mindestens teilweise mit starren, porösen Teilchen gefülltes Gefäß, das für den Durchgang von flüssigen Proben durch die Teilchen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenräume zwischen den porösen Teilchen (21) und die Räume in den Poren der Teilchen (21) mindestens teilweise mit einem Fällmittel für den unerwünschten Stoff gefüllt sind und die Teilchen einen Durchmesser von etwa 37 bis 125 um und Porengrößen von etwa 17,5 bis ϊ 25 nm haben.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4 in Verbindung mit einer Flüssigkeitssonde (12) zum Entnehmen einer bestimmten Menge der flüssigen Probe aus einem Probenbehälter (11) und zum Hindurchtreiben der flüssigen Probe durch die Teilchen (21) in eine Reaktionskammer (15),

einer Einrichtung (16, 17, 18), um in die in der Reak- <to tionskammer (15) befindliche flüssige Probe mindestens ein Reagens einzuführen, das mit dem durch Analyse zu bestimmenden Bestandteil so reagiert, daß in der flüssigen Probe eine Änderung hervorgerufen wird, und einem Analyslergerät (19, 20) zum Bestimmen des betreffenden Bestandteils.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Analyslergerät (19, 20) ein photometrlsches Analysiergerät ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeitssonde (12) eine Pumpe (13) aufweist, die die flüssige Probe unter Druck durch die Teilchen (21) in die Reaktionskammer (15) treibt.

8. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3 In einem Verfahren zur automatischen Analyse von flüssigen Proben auf einen bestimmten Bestandteil.

60