WO2010143582A1 - フェニルシクロプロピルアミン誘導体及びlsd1阻害剤 - Google Patents

フェニルシクロプロピルアミン誘導体及びlsd1阻害剤 Download PDF

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WO2010143582A1
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直樹 宮田
孝禎 鈴木
理恵 上田
民夫 水上
隆造 佐々木
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公立大学法人名古屋市立大学
学校法人関西文理総合学園
株式会社フロンティアファーマ
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    • C07C2601/02—Systems containing only non-condensed rings with a three-membered ring

Definitions

  • the present invention relates to a phenylcyclopropylamine derivative capable of selectively inhibiting the function of LSD1 and an LSD1 inhibitor using the same.
  • Histone is a protein that folds DNA in eukaryotes to form a chromatin structure and is deeply involved in gene expression. That is, histones are chemically modified by the action of various enzymes, which are thought to change the chromatin structure and control gene expression. In recent years, various knowledge about such epigenetic gene regulation has been discovered.
  • Lysine-specific demethylase (hereinafter referred to as “LSD1”) is the first discovered histone demethylase, which is a monomethylated and dimethylated form of the fourth lysine residue of histone H3 (H3K4me1 / 2). It catalyzes the demethylation reaction to formaldehyde as a by-product (see Non-Patent Document 1). LSD1 also forms a complex with flavin adenine dinucleotide (hereinafter referred to as “FAD”), which is a type of coenzyme, and FAD acts as a redox mediator to oxidize lysine residues by oxygen (the following reaction). See formula).
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • LSD1 is overexpressed in prostate cancer and has been shown to interact with androgen receptor (AR) to activate AR-dependent transcription. Moreover, it has been reported that when LSD1 is knocked down, transcriptional activation induced by androgen is suppressed and cell proliferation is inhibited (Non-patent Document 2). However, at this stage, there are many unclear points regarding biological significance, such as how LSD1 affects living organisms. For this reason, if a substance that inhibits the catalytic action of LSD1 (ie, LSD1 inhibitor) is found, it can be expected to be used as a bioprobe for examining the function of LSD1 or applied as an anticancer agent.
  • LSD1 inhibitor a substance that inhibits the catalytic action of LSD1
  • Non-patent Document 1 tranylcypromine (a) and derivatives thereof
  • LSD1 belongs to the amine oxidase family and has high homology with polyaminooxidase (PAO) and monoaminooxidase (MAO), so that tranylcypromine (a) and the conventionally known tranylcypromine derivatives Has the disadvantage that it also inhibits MAO-A and MAO-B and cannot selectively inhibit LSD1.
  • Nylamide (b) shown below is also known as an LSD1 inhibitor other than tranylcypromine (a) and its derivatives, but this compound is also not selective with MAO inhibitors (Non-patent Document 1). ).
  • the following compound (c) designed on the basis of the catalytic mechanism is an inhibitor selective for LSD1, but is a peptide compound and has a problem of not passing through the cell membrane because of its high polarity and large molecular weight ( Non-patent document 3).
  • Patent Document 1 describes that the following polyamine compound (d) functions as an inhibitor of LSD1. However, no mention is made of selectivity with MAO inhibitors. In addition, the polyamine compound (d) is not useful as an LSD1-selective inhibitor because it has various physiological activities such as protein synthesis related to growth factors and intracellular concentration regulation mechanism.
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional situation, and an object to be solved is to provide a compound and an LSD1 inhibitor capable of selectively inhibiting the function of LSD1.
  • tranylcypromine inhibits the function of LSD1, and in order to further enhance its selectivity, various derivatives of tranylcypromine were synthesized, and their LSD1 inhibitory effect, MAO inhibitory effect, cancer growth We have earnestly studied about the suppression effect. As a result, the present inventors have found a compound that can solve the above problems and have completed the present invention.
  • the phenylcyclopropylamine derivative of the present invention has the following general formula (I) or (II) (wherein R 1 is hydrogen, an alkyl group to which a substituent may be bonded, or a substituent bonded.
  • R 2 represents an optionally substituted phenyl group or a heterocyclic group to which a substituent may be bonded
  • R 2 represents an alkylene group which may have a branch and may have a substituent bonded thereto
  • R 2 3 represents an alkyl group to which a substituent may be bonded, a phenyl group to which a substituent may be bonded, a heterocyclic group to which a substituent may be bonded, and a benzyl group to which a substituent may be bonded.
  • R 4 represents an alkyl group to which a substituent may be bonded, a phenyl group to which a substituent may be bonded, a heterocyclic group to which a substituent may be bonded, or a substituent bonded thereto.
  • Alkyloxy groups and substituents that may be bonded And phenyl group may have, may be substituents bonded alkylamino group and a substituted group represents either a phenyl amino group be bonded
  • X is O, NH 2, NHCO, CONH , S or CH 2 ), or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate or prodrug thereof.
  • the phenylcyclopropylamine derivatives (I) and (II) of the present invention have a high LSD1 inhibitory activity, and the inhibitory action of MAO-A, MAO-B, etc. Small compared to the inhibitory effect. That is, LSD1 inhibition can be selectively caused. Therefore, it can be suitably used as a biological tool for examining the function of LSD1. It also has cancer cell growth inhibitory action and is expected to be used as an anticancer agent.
  • the “prodrug” refers to a compound that is hydrolyzed in vivo to regenerate the phenylcyclopropylamine derivative (I) or (II). For example, the amino group hydrogen is replaced with an alkanoyl group (acyl group).
  • Derivatives that is, amidated derivatives
  • hemiaminal ether derivatives derivatives substituted with alkoxycarbonyloxymethyl groups, N-oxide derivatives and the like.
  • the pharmaceutically acceptable salt include pharmaceutically acceptable salts such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfate, nitrate, and other inorganic acid salts, formate salts, acetic acid.
  • Salt propionate, maleate, fumarate, succinate, lactate, malate, tartrate, citrate, ascorbate, malonate, oxalate, glycolate, phthalic acid
  • organic acid salts such as salts and benzenesulfonate.
  • these salts can also be used in combination.
  • phenylcyclopropylamine derivatives (I) or (II) of the present invention the following general formula (1) (wherein R 1 represents hydrogen or a phenylamide group, and R 2 has a branch) Or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate or prodrug thereof, wherein the compound represents a certain alkylene group, and the cyclopropylamine substituent is bonded to the meta or para position.
  • R 1 represents hydrogen or a phenylamide group
  • R 2 has a branch
  • a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate or prodrug thereof wherein the compound represents a certain alkylene group, and the cyclopropylamine substituent is bonded to the meta or para position.
  • Preferred are phenylcyclopropylamine derivatives.
  • R 2 is particularly preferably an ethylene group. More preferably, it comprises a phenylcyclopropylamine derivative (2) having a phenylamide group represented by the following structural formula (2) or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate or prodrug thereof. is there. According to the test results of the present inventors, this compound has particularly large LSD1 inhibitory activity and is excellent in selectivity with MAO inhibition.
  • Example 1 In Example 1, (S) -trans-N-3- [3- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -1-benzylcarbamoylpropylbenzamide hydrochloride (NCL-1) was synthesized (see the following chemical formula). Details are as follows.
  • compound (9) was synthesized according to the following reaction route as one precursor for synthesizing NCL-1.
  • Step 1-1 Synthesis of trans-3- (3-hydroxyphenyl) acrylic acid methyl ester (4) 3- (3-hydroxyphenyl) acrylic acid (3) (25.0 g) was dissolved in methanol (82 mL) and concentrated sulfuric acid (2.0 mL) was added and refluxed for 24 hours. The reaction mixture was concentrated, and the residue was dissolved in ethyl acetate (1000 mL) and washed with water (500 mL) and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (500 mL).
  • Step 1-2 Synthesis of trans-3- (3methoxymethoxyphenyl) acrylic acid methyl ester (5)
  • Trans-3- (3-hydroxyphenyl) acrylic acid methyl ester (4) (25.8 g) obtained in Step 1-1 was converted to acetone. (220 mL), potassium carbonate (40.0 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 min.
  • Methoxymethyl chloride (11 mL) was slowly added to the solution and stirred at room temperature for 12 hours.
  • Step 1-3 Synthesis of trans-2- (3-methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid methyl ester (6)
  • sodium hydride (60%) (6.32 g) and trimethylsulfonium iodide (34.8 g)
  • dimethyl sulfoxide (137 mL) was slowly added dropwise at room temperature.
  • a solution of trans-3- (3methoxymethoxyphenyl) acrylic acid methyl ester (5) (27.0 g) obtained in Step 1-3 in dimethylsulfoxide (137 mL) was added. It was dripped.
  • Step 1-4 Synthesis of trans-2- (3-methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid (7) trans-2- (3-methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid methyl ester (6) (6.70) obtained in Step 1-3 g) was dissolved in methanol (56 mL), a solution of potassium hydroxide (16.0 g) in methanol (130 mL) was added under ice cooling, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 15 hours. The reaction mixture was concentrated, and the residue was suspended in water (100 mL) and washed with dichloromethane (100 mL).
  • Step 1-5) Synthesis of trans-2- (3-methoxymethoxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (8) trans-2- (3-methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid (7) (6.00) obtained in Step 1-4 g) was dissolved in cyclohexane (320 mL), and diphenylphosphoryl azide (6.7 mL) and triethylamine (4.5 mL) were added at 0 ° C. under an argon atmosphere. The reaction mixture was refluxed for 3 hours, tert-butanol (52 mL) was added, and the mixture was further refluxed for 11 hours.
  • Step 1-6 Synthesis of trans-2- (3-hydroxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (9) trans-2- (3-methoxymethoxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (8) obtained in Step 1-5 ( 3.70 g) was dissolved in dichloromethane (60 mL), 4N hydrochloric acid ethyl acetate solution (68 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hr.
  • reaction mixture was concentrated, the residue was dissolved in 1,4-dioxane (33 mL) and water (33 mL), and triethylamine (20 mL) and Boc2O (4.6 mL) were added.
  • the reaction solution was stirred at room temperature for 12 hours, poured into a 10% citric acid solution (200 mL), and extracted with ethyl acetate (300 mL).
  • compound (13) was synthesized according to the following reaction route as the other precursor for synthesizing NCL-1.
  • Step 1--7 Synthesis of (S) -1-benzylcarbamoyl-3-hydroxypropyl tert-butylcarbamate (11) N-tert-butoxycarbonyl (S) -homoserine (10) (5.50 g), benzylamine (2.8 mL), PyBOP ( 13.1 g) and triethylamine (7.0 mL) were dissolved in N, N-dimethylformamide (55 mL) and stirred at room temperature for 10 hours. The reaction mixture was diluted with water (300 mL) and extracted with chloroform (300 mL).
  • Step 1-8) Synthesis of (S) -2-amino-N-benzyl-4-hydroxybutanamide hydrochloride (12)
  • (S) -1-benzylcarbamoyl-3-hydroxypropyl tert-butylcarbamate (12) obtained in Step 1-7 11) (5.40 g) was dissolved in dichloromethane (60 mL), 4N hydrochloric acid 1,4-dioxane solution (87 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hr. The reaction mixture was concentrated to give the compound (4.27 g, yield 100%) as a white solid.
  • the 1 H NMR data of the compound (12) is shown below.
  • Step 1-9) Synthesis of (S) -N- (1-benzylcarbamoyl-3-hydroxypropyl) benzamide (13)
  • Step 1-10) Synthesis of (S) -trans- [2- [3- (3-benzoylamino-3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (14)
  • (S) -N obtained in step 1-9 -(1-Benzylcarbamoyl-3-hydroxypropyl) benzamide (13) (200 mg) and trans-2- (3-hydroxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (9) obtained in Step 1-6 ( 230 mg) and triphenylphosphine (504 mg) were dissolved in anhydrous tetrahydrofuran (3 mL), and diisopropyl azodicarboxylate (1 mL) was added under ice cooling.
  • Step 1-11 Synthesis of (S) -trans-N-3- [3- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -1-benzylcarbamoylpropylbenzamide hydrochloride (NCL-1) (S)-obtained in step 1-10 Trans- [2- [3- (3-Benzoylamino-3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (14) (70 mg) was dissolved in dichloromethane (1 mL) and 4N hydrochloric acid ethyl acetate solution (0.8 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours.
  • Example 2 In Example 2, (S) -trans-N-3- [4- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -1-benzylcarbamoylpropylbenzamide hydrochloride (NCL-2) was synthesized (see the following chemical formula). Details are as follows.
  • compound (21) was synthesized according to the following reaction route.
  • Step 2-1 Synthesis of trans-3- (4-hydroxyphenyl) acrylic acid methyl ester (16) 3- (4-hydroxyphenyl) acrylic acid (15) (20.0 g) was used as a starting material to obtain Compound (16) (21.2 g, yield 99%) as a white solid.
  • the 1 H NMR data of the compound (16) is shown below.
  • Step 2-2 Synthesis of trans-3- (4-methoxymethoxyphenyl) acrylic acid methyl ester (17)
  • the trans-3- (4-hydroxy) obtained from Step 2-1 was prepared in the same manner as in Step 1-2 of Example 1. From phenyl) acrylic acid methyl ester (16) (10.0 g), compound (17) (11.1 g, yield 89%) was obtained as a colorless oil.
  • the 1 H NMR data of the compound (17) is shown below.
  • Step 2-3 Synthesis of trans-2- (4-methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid methyl ester (18)
  • trans-3- Compound (18) (1.68 g, 14% yield) was obtained as a colorless oil from (methoxymethoxyphenyl) acrylic acid methyl ester (15) (11.0 g).
  • the 1 H NMR data of the compound (18) is shown below.
  • Step 2-4 Synthesis of trans-2- (4-methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid (19) Trans-2- (4-methoxy) obtained from Step 2-3 by the same method as in Step 1-4 of Example 1 From methoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid methyl ester (18) (1.68 g), compound (19) (1.50 g, yield 95%) was obtained as a white solid.
  • the 1 H NMR data of the compound (19) is shown below.
  • Step 2-5) Synthesis of trans-2- (4-methoxymethoxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (20) Trans-2- (4) obtained from Step 2-4 in the same manner as in Step 1-5 of Example 1 Compound (20) (788 mg, yield 56%) was obtained as a pale yellow solid from -methoxymethoxyphenyl) cyclopropanecarboxylic acid (19) (1.05 g).
  • the 1 H NMR data of the compound (20) is shown below.
  • Step 2-6 Synthesis of trans-2- (4-hydroxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (21)
  • trans-2- (4- From methoxymethoxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (20) (476 mg) was obtained as a pale yellow oil.
  • the 1 H NMR data of the compound (21) is shown below.
  • Step 2--7 Synthesis of (S) -trans- [2- [4- (3-benzoylamino-3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (22)
  • Step 1-7 of Example 1 Coupling synthesized in steps 1-7 to 1-9 in Example 1 with trans-2- (4-hydroxyphenyl) cyclopropyl tert-butylcarbamate (21) (220 mg) obtained from Step 2-6
  • the precursor (13) was coupled to obtain the compound (22) (83 mg, yield 25%) as a pale yellow solid.
  • the 1 H NMR data of the compound (22) is shown below.
  • Step 2-8) Synthesis of (S) -trans-N-3- [4- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -1-benzylcarbamoylpropylbenzamide hydrochloride (NCL-2) Method similar to step 1-11 of Example 1 (S) -trans- [2- [4- (3-benzoylamino-3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (22) (83 mg) obtained from step 2-7 From the above, compound (NCL-2) (18 mg, yield 25%) was obtained as a pale yellow solid. The melting point, 1 H NMR, 13 C NMR and MS (FAB) data of NCL-2 are shown.
  • Example 3 trans-4- [3- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -N-benzylbutyramide hydrochloride (NCL-3) was synthesized (see the following chemical formula). Details are as follows.
  • Example 3 the compound (9) synthesized in Example 1 (Steps 1-1 to 1-6) was used as a precursor for synthesizing NCL-3. Moreover, the compound (24) was synthesized by the following reaction as another precursor for synthesizing NCL-3.
  • Step 3-1 Synthesis of N-benzyl-4-chlorobutyramide (24) Benzylamine (1.1 mL) and triethylamine (4.5 mL) were dissolved in dichloromethane (26 mL), and 4-chlorobutyryl chloride (23) (23) ( 1.5 mL) in dichloromethane (15 mL) was added dropwise. After stirring at 0 ° C for 30 minutes, the reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted with ethyl acetate (200 mL).
  • Step 3-2 Synthesis of trans-2- [3- (3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (25) trans-2- (3-hydroxyphenyl) cyclo obtained in Step 1-6 of Example 1
  • Propyl tert-butyl carbamate (9) 400 mg was dissolved in acetonitrile (7.5 mL), cesium carbonate (1.54 g) and sodium iodide (70 mg) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes.
  • Step 3-3 Synthesis of trans-4- [3- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -N-benzylbutyramide hydrochloride (NCL-3)
  • NCL-3 trans-2- [3- (3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (25) (140 mg)
  • the compound (NCL- 3) (82 mg, 69% yield) was obtained as a white solid.
  • the melting point, 1 H NMR, 13 C NMR, and MS (ELC) data of NCL-3 are shown.
  • Example 4 trans-4- [4- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -N-benzylbutyramide hydrochloride (NCL-4) was synthesized (see the following chemical formula). Details are as follows.
  • Example 4 the compound (21) synthesized in Step 2-1 to Step 2-6 in Example 2 was used as the coupling precursor. As the other coupling precursor, the compound (24) synthesized in Step 3-1 in Example 3 was used.
  • Step 4-1 Synthesis of trans-2- [4- (3-benzylcarbamoylpropoxy) phenyl] cyclopropyl tert-butylcarbamate (26)
  • compound (21) 500 mg
  • Compound (24) was coupled to obtain Compound (26) (NCL-3) (82 mg, 69% yield), which is a phenylcyclopropylamine derivative of Example 4, as a white solid.
  • NCL-3 82 mg, 69% yield
  • Step 4-2 Synthesis of trans-4- [4- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -N-benzylbutyramide hydrochloride (NCL-4)
  • NCL-4 [4- (2-aminocyclopropyl) phenoxy] -N-benzylbutyramide hydrochloride (NCL-4)
  • compound (NCL-4) 82 mg, yield 69%) which is a phenylcyclopropylamine derivative of Example 4 was obtained as a white solid.
  • the melting point, 1 H NMR, 13 C NMR, and MS (ELC) data of NCL-4 are shown.
  • the LSD1 enzyme was prepared as follows. A plasmid encoding a recombinant protein in which 5 residues of histidine were added to the N-terminus of full-length LSD1 (1-851aa) was prepared, and LSD1 was expressed using recombinant Escherichia coli transformed with this plasmid. Thereafter, the recombinant E. coli was lysed by sonication, and the soluble fraction was purified by HisTrap chromatography to obtain an LSD1 enzyme solution.
  • the enzymatic activity of LSD1 was measured by coloring hydrogen peroxide generated during the demethylation reaction of LSD1 with peroxidase and a reagent and quantifying it by absorptiometry. That is, in a 384-well microtiter plate, 50 mM Hepes-NaOH buffer (pH 7.5), 0.1 mM 4-aminoantipyrine, 1 mM 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid, 20 ⁇ M histone H3-lysine 4 dimethyl peptide The enzyme reaction was measured over time for 30 minutes at 25 ° C. with 20 ⁇ l of 0.05 ⁇ M LSD1, 0.35 ⁇ M horseradish peroxidase.
  • the measurement was performed by measuring the absorbance of the product at 515 nm using Spectra Max M2e (Molecular Devices).
  • inhibitory activity the enzyme activity when dimethyl sulfoxide was added was taken as 100%, the residual activity was measured by varying the addition concentration of phenylcyclopropylamine derivatives, and the concentration that inhibited 50% of the activity. (IC 50 ) was determined.
  • ⁇ Monoamine oxidase inhibitory activity measurement test Measurement of monoamine oxidase A (MAO-A) and monoamine oxidase B (MAO-B) inhibitory activity using MAO-Glo assay kit from Promega and MAO-A and MAO-B purchased from Sigma-Aldrich Went like that. 12.5 ⁇ L 4 ⁇ MAO substrate (final concentration 40 ⁇ M), 12.5 ⁇ L 4 ⁇ inhibitor solution (final concentration 0.1-1000 ⁇ M), 25 ⁇ L MAO-A (final concentration 9 unit / mL) or 25 ⁇ L MAO -B (final concentration 2.3 unit / mL) was mixed and reacted at room temperature for 1 hour.
  • MAO-A monoamine oxidase A
  • MAO-B monoamine oxidase B
  • FIG. 3 The results of the inhibitory activity against MAO-A are shown in FIG. As shown in the figure, all of the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to 4) exhibited MAO A inhibitory activity lower than that of tranylcypromine and pargyline. Among these, NCL-1 of Example 1 and NCL-2 of Example 2 having an amino acid structure had particularly low inhibitory activity. As for MAO-B inhibitory activity, as shown in FIG. 3, the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to 4) all have lower MAO-B inhibition than tranylcypromine and pargyline (see the following chemical formula). In particular, NCL-1 of Example 1 and NCL-2 of Example 2 showed particularly low inhibitory activity.
  • ⁇ Cancer cell growth inhibition> (1) Measurement of inhibitory activity on proliferation of HeLa cells Measurement of inhibitory activity of compounds on proliferation of HeLa cells, which are cell lines derived from human cervical cancer, for the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to 4). It was evaluated by doing. The details are shown below.
  • Cell growth inhibitory activity was determined by 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. This assay is based on the principle that the amount of NADH is measured by measuring the absorbance when NADH contained in mitochondria of living cells reacts with MTT and develops color. It was. HeLa cells were seeded on a 96-well microtiter plate in an RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum at 100 ⁇ l per well, cultured for 24 hours in a CO 2 incubator, and then compounds were added.
  • MTT 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the inhibitory activity is defined as the concentration at which 50% of the activity is inhibited by measuring the residual activity by varying the addition concentration of the phenylcyclopropylamine derivative with the enzyme activity when dimethyl sulfoxide is added as 100%. IC 50 ).
  • Table 1 summarizes the results of the LSD1 inhibitory activity test, monoamine oxidase inhibitory activity test, and HeLa cell proliferation inhibitory test. From this table, the IC 50 for LSD1 of the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to NCL-4) is smaller than the IC 50 for MAO-A, particularly Example 1 (NCL-1) and Example 2. (NCL-2) was found to be extremely excellent in selectivity for LSD1 inhibitory activity. Moreover, it turned out that the compound (NCL-1) of Example 1 and the compound (NCL-2) of Example 2 have excellent selectivity for MAO-B. Such excellent selectivity for LSD1 is presumed to be due to the amino acid structure possessed by Example 1 (NCL-1) and Example 2 (NCL-2). In addition, the value of GI 50 for cell growth of HeLa cells was found to be much lower than that of tranylcypromine for all the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to 4) and to have a high cell growth inhibitory effect. .
  • HCT116 which is a human colon cancer-derived cell line, and human prostate
  • the inhibitory activity against proliferation of PC-3 a cell line derived from cancer, KYSE150, a cell line derived from human esophageal cancer, and SH-SY5Y, a cell line derived from human neuroblastoma, is the same as that of HeLa cells. Determined by assay method.
  • Table 2 shows the GI 50 when the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to 4) and tranylcypromine were added to HeLa cells, HCT116 cells, PC-3 cells, KYSE150 cells and SH-SY5Y cells. Shown in From this table, it can be seen that the compounds of Examples 1 to 4 (NCL-1 to 4) have much lower GI 50 values than tranylcypromine for all cells.
  • the phenylcyclopropylamine derivative and LSD1 inhibitor of the present invention are expected to be used as a biological tool for examining the function of LSD1 or as an anticancer agent.

Abstract

【課題】LSD1の機能を選択的に阻害することのできる化合物及びLSD1阻害剤を提供する。 【解決手段】本発明のフェニルシクロプロピルアミン誘導体は、下記一般式（Ｉ）若しくは（II）（ただし、両式中Ｒ１は水素、置換基が結合していてもよいアルキル基、フェニル基及び複素環基のいずれかを示し、Ｒ２は分枝を有することがあり置換基が結合していてもよいアルキレン基を示し、Ｒ３は置換基が結合していてもよいアルキル基、フェニル基、複素環基及びベンジル基のいずれかを示し、Ｒ４は置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基、置換基が結合していてもよい複素環基、置換基が結合していてもよいアルキルオキシ基、置換基が結合していてもよいフェニルオキシ基、置換基が結合していてもよいアルキルアミノ基及び置換基が結合していてもよいフェニルアミノ基のいずれかを示し、ＸはＯ、ＮＨ２、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、Ｓ又はＣＨ２を示す）の化合物又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とする。

Description

フェニルシクロプロピルアミン誘導体及びLSD1阻害剤
　本発明は、LSD1の機能を選択的に阻害することのできるフェニルシクロプロピルアミン誘導体及びそれを用いたLSD1阻害剤に関する。
　ヒストンは、真核生物においてＤＮＡを折りたたんでクロマチン構造を形成するタンパク質であり、遺伝子の発現に深くかかわっている。すなわち、ヒストンは様々な酵素の働きによって化学修飾され、これによりクロマチン構造が変化し、遺伝子の発現が制御されると考えられている。近年、こうしたエピジェネティックな遺伝子制御に関する様々な知見が発見されている。
　Lysine-specific demethylase（以下「LSD1」という）は、最初に発見されたヒストンの脱メチル化酵素であり、ヒストンH3の4番目のリシン残基のモノメチル化体及びジメチル化体(H3K4me1/2)の脱メチル化反応を触媒し、ホルムアルデヒドを副生する（非特許文献１参照）。また、LSD1は補酵素の一種であるフラビンアデニンジヌクレオチド（以下「ＦＡＤ」という）と複合体をつくり、ＦＡＤが酸化還元のメディエーターとなって、酸素によるリジン残基の酸化が進行する（下記反応式参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　一方、LSD1は前立腺がんにおいて過剰発現しており、アンドロゲン受容体（AR）と相互作用してAR依存性の転写を活性化することが明らかになっている。また、LSD1をノックダウンすると、アンドロゲンによって誘発された転写活性化が抑制され、細胞増殖が阻害されるということが報告されている（非特許文献２）。しかし、現在の段階ではLSD1が生体にどのような影響を与えるかなど、生物学的意義に関して不明な点が多い。このため、LSD1の触媒作用を阻害する物質（すなわちLSD1阻害剤）を見つければ、これをLSD1の機能を調べるためのバイオプローブとして用いたり、抗がん剤として応用したりすることが期待できる。
　しかしながら、現在までに活性が強くて、LSD1の機能を選択的に阻害する低分子量化合物は知られていない。これまでに報告されたLSD1を阻害する低分子量の化合物として、トラニルシプロミン（tranylcypromine）（ａ）やその誘導体が挙げられる（非特許文献１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　しかし、トラニルシプロミン（ａ）はLSD1阻害活性が弱い(ａ;IC50=21μM)という問題があった。また、LSD1はアミンオキシダーゼファミリーに属しており、ポリアミノオキシダーゼ（ＰＡＯ）やモノアミノオキシダーゼ（MAO）との相同性が高いために、トラニルシプロミン（ａ）やこれまで知られているトラニルシプロミン誘導体はMAO-AやMAO-Bをも阻害してしまい、選択的にLSD1を阻害することができないという欠点があった。
　トラニルシプロミン（ａ）及びその誘導体以外のLSD1阻害剤として、下記に示すニアラミド（Nialamide）（ｂ）も知られているが、この化合物もMAO阻害剤との選択性はない（非特許文献１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　一方、触媒メカニズムを基に設計された下記化合物（ｃ）はLSD1に選択的な阻害薬ではあるが、ペプチド化合物であり、極性が高くて分子量も大きいため、細胞膜を通らないという問題がある（非特許文献３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　また、特許文献１には、下記ポリアミン化合物（ｄ）がLSD1の阻害剤として機能することが記載されている。しかしながら、MAO阻害剤との選択性については何ら言及されていない。また、ポリアミン化合物（ｄ）は成長因子に関わるタンパク質合成や細胞内濃度調節機構に関与するなど、様々な生理活性を持つとされているので、LSD1選択的阻害薬として有用ではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
ＷＯ２００７／０２１８３９
Biochemistry 2007, 46, 4408-4416 Nature 2005, 437, 436-439 J.AM.CHEM.SOC.2006,128, 4536-4537
　本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、LSD1の機能を選択的に阻害することのできる化合物及びLSD1阻害剤を提供することを解決すべき課題としている。
　本発明者らは、トラニルシプロミンがLSD1の機能を阻害することに注目し、さらにその選択性を高めるべく、トラニルシプロミンの各種誘導体を合成し、そのLSD1阻害効果、MAO阻害効果、癌増殖抑制効果等について鋭意研究を重ねた。その結果、上記課題を解決可能な化合物を発見し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明のフェニルシクロプロピルアミン誘導体は、下記一般式（Ｉ）若しくは（II）（ただし、両式中Ｒ１は水素、置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基及び置換基が結合していてもよい複素環基のいずれかを示し、Ｒ２は分枝を有することがあり置換基が結合していてもよいアルキレン基を示し、Ｒ３は置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基、置換基が結合していてもよい複素環基及び置換基が結合していてもよいベンジル基のいずれかを示し、Ｒ４は置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基、置換基が結合していてもよい複素環基、置換基が結合していてもよいアルキルオキシ基、置換基が結合していてもよいフェニルオキシ基、置換基が結合していてもよいアルキルアミノ基及び置換基が結合していてもよいフェニルアミノ基のいずれかを示し、ＸはＯ、ＮＨ２、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、Ｓ又はＣＨ２を示す）の化合物、又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなること特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明者らの試験結果によれば、上記本発明のフェニルシクロプロピルアミン誘導体（I）及び（II）は、LSD1の阻害活性が高く、MAO-AやMAO-Bなどの阻害作用は、LSD1阻害作用に比べて小さい。すなわち、選択的にLSD1阻害を起こすことができる。このため、LSD1の機能を調べるための生物学的ツールとして好適に用いることができる。また、癌細胞増殖抑制作用も有しており、抗がん剤として利用することも期待される。
　なお、「プロドラッグ」とは、生体内で加水分解されてフェニルシクロプロピルアミン誘導体（I）又は（II）を再生する化合物をいい、例えばアミノ基の水素をアルカノイル基（アシル基）に置換した誘導体（すなわちアミド化した誘導体）、ヘミアミナールエーテル誘導体、アルコキシカルボニルオキシメチル基に置換した誘導体、N-オキシド誘導体等が挙げられる。
　また、薬学上許容される塩としては、また、薬学上許容される塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、これらの塩を組み合わせて用いることもできる。
　上記本発明のフェニルシクロプロピルアミン誘導体（I）又は（II）の中でも、下記一般式（１）（ただし、式中Ｒ１は水素又はフェニルアミド基を示し、Ｒ２は分枝を有することのあるアルキレン基を示し、シクロプロピルアミン置換基はメタ位又はパラ位に結合している）の化合物又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とするフェニルシクロプロピルアミン誘導体が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　また、Ｒ２はエチレン基とすることが特に好ましい。さらに好ましいのは、下記構造式（２）に示す、フェニルアミド基を有するフェニルシクロプロピルアミン誘導体（２）又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることである。本発明者らの試験結果によれば、この化合物は特にLSD1阻害活性が大きく、MAO阻害との選択性にも優れている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　以下、本発明を具体化した実施例について詳細に説明する。
（実施例１）
　実施例１では、(S)-トランス-N-3-[3-(2-アミノシクロプロピル) フェノキシ]-1-ベンジルカルバモイルプロピルベンズアミド塩酸塩（NCL-1）を合成した（下記化学式参照）。詳細は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　まず、NCL-1を合成するための一方の前駆体として、化合物（９）を以下の反応ルートにしたがって合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　以下に合成法の詳細を示す。
（ステップ１－１）
トランス-3- (3-ヒドロキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（４）の合成
　3- (3-ヒドロキシフェニル)アクリル酸（３）（25.0 g）をメタノール（82 mL）に溶解し、濃硫酸（2.0 mL）を加え、24時間還流した。反応液を濃縮し、残査を酢酸エチル（1000 mL）に溶解させ、水（500 mL）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（500 mL）で洗浄した。有機層を飽和食塩水（500 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮し、化合物（４）（25.9 g, 収率96%）を白色固体として得た。化合物（４）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.60 (1H, d, J = 15.8 Hz), 7.21 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.98 (1H, t, J =1.8 Hz), 6.82 (1H,dd, J =8.0, 1.8Hz), 6.44 (1H, d, J =15.8 Hz), 3.77 (3H, s).
（ステップ１－２）
トランス-3-(3メトキシメトキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（５）の合成
　ステップ１－１で得られたトランス-3- (3-ヒドロキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（４）（25.8 g）をアセトン（220 mL）に溶解し、炭酸カリウム（40.0 g）を加え、室温で20分攪拌した。その溶液にメトキシメチルクロリド（11 mL）をゆっくりと加え、室温で12時間攪拌した。炭酸カリウムをろ過後、ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝10 ：1）で精製し、化合物（５）（27.2 g, 収率84%）を無色の油状物として得た。化合物（５）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.66 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.30 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.20 (1H, s), 7.17 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.07 (1H, dd, J = 8.0, 2.4 Hz), 6.43 (1H, d, J = 16.0 Hz), 5.19 (2H, s), 3.81 (3H, s), 3.49 (3H, s).
（ステップ１－３）
トランス-2-(3-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸メチルエステル（６）の合成
　水素化ナトリウム（60%）（6.32 g）とトリメチルスルホニウムヨージド（34.8 g）の混合物に、ジメチルスルホキシド（137 mL）を室温でゆっくりと滴下した。その反応液を室温で1時間攪拌した後、ステップ１－３で得られたトランス-3-(3メトキシメトキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（５）（27.0 g）のジメチルスルホキシド（137 mL）溶液を滴下した。反応液を室温で4時間攪拌した後、10%クエン酸水溶液（500 mL）を加え、酢酸エチル（500 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（500 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝10 ：1）で精製し、化合物（６）（6.70 g, 収率23%）を無色の油状物として得た。化合物（６）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm) 
d：7.19 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.89 (1H, dd, J =8.0, 2.5 Hz), 6.78 (1H, t, J = 2.5 Hz), 6.74 (1H, d, J =8.0 Hz), 5.16 (2H, s), 3.71 (3H, s), 3.47 (3H, s), 2.51-2.49 (1H, m), 1.92-1.89 (1H, m), 1.61-1.57 (1H, m) 1.34-1.31 (1H, m).
（ステップ１－４）
トランス-2-(3-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸（７）の合成
　ステップ１－３で得られたトランス-2-(3-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸メチルエステル（６）（6.70 g）をメタノール（56 mL）に溶解させ、氷冷下、水酸化カリウム（16.0 g）のメタノール溶液（130 mL）を加え、反応液を室温で15時間攪拌した。反応液を濃縮し、残査を水（100 mL）に懸濁させ、ジクロロメタン（100 mL）で洗浄した。水層に2N塩酸を加えて酸性（pH 1）にし、ジクロロメタン（300 mL）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮し、化合物（７）（6.00 g, 収率95%）を無色の油状物として得た。化合物（７）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.20 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.90 (1H, dd, J = 8.0, 1.9 Hz),  6.79 (1H, t, J = 1.9 Hz), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz), 5.16 (2H, s), 3.48 (3H, s), 2.60-2.56 (1H, m), 1.92-1.89 (1H, m), 1.65 (1H, quintet, J = 5.0 Hz)1.42-1.38 (1H, m).
（ステップ１－５）
トランス- 2-(3-メトキシメトキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（８）の合成
　ステップ１－４で得られたトランス-2-(3-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸（７）（6.00 g）をシクロヘキサン（320 mL）に溶解させ、ジフェニルホスホリルアジド（6.7 mL）とトリエチルアミン（4.5 mL）をアルゴン雰囲気下、0 ℃で加えた。反応液を3時間還流後、tert-ブタノール（52 mL）を加え、さらに11時間還流した。反応液を濃縮後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝ 7 ：1）で精製し、化合物（８）（3.70 g, 収率47%）を白色固体として得た。化合物（７）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.17 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.85 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.78 (1H, s), 6.76 (1H, s), 5.15 (2H, s),4.82 (1H, broad s), 3.47 (3H, s)2.72-2.76 (1H, m), 1.98-2.02 (1H, m), 1.45 (9H, s), 1.74-1.16 (2H, m).
（ステップ１－６）
トランス-2-(3-ヒドロキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（９）の合成
　ステップ１－５で得られたトランス-2-(3-メトキシメトキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（８）（3.70 g）をジクロロメタン（60 mL）に溶解させ、4N塩酸酢酸エチル溶液（68 mL）を加え、室温で4時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を1,4-ジオキサン（33 mL） と水 (33 mL)に溶解させ、トリエチルアミン (20 mL) と Boc2O (4.6 mL)を加えた。反応液を室温で12時間攪拌後、10%クエン酸溶液（200 mL）に注ぎ、酢酸エチル（300 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（300 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝ 5 ：1）で精製し、化合物（９）（1.59 g, 収率35%）を無色の油状物として得た。化合物（９）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.10 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.67 (1H, d, J =8.0 Hz), 6.64 (1H, dd, J = 8.0, 2.4 Hz), 6.59 (1H, s), 5.28 (1H, broad s), 4.86 (1H, broad s), 2.69-2.72 (1H, m), 1.97-2.01 (1H, m), 1.46 (9H, s), 1.15-1.12 (2H, m).
　さらに、NCL-1を合成するための他方の前駆体として、化合物（１３）を以下の反応ルートにしたがって合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　以下に合成法の詳細を示す。
（ステップ１－７）
(S)-1-ベンジルカルバモイル-3-ヒドロキシプロピルtert-ブチルカルバメート（１１）の合成
　N- tert-ブトキシカルボニル(S) -ホモセリン（１０）（5.50 g）、ベンジルアミン（2.8 mL）、PyBOP（13.1 g）、トリエチルアミン（7.0 mL）をN,N-ジメチルホルムアミド（55 mL）に溶解させ、室温で10時間攪拌した。反応液を水（300 mL）で希釈し、クロロホルム（300 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（300 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝ 1 ：2）で精製し、化合物（１１）（5.46 g, 収率70%）を白色固体として得た。化合物（１１）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.35-7.32 (2H, m), 7.29-7.25 (3H, m), 6.71 (1H, broad s), 5.58 (1H, d, J = 7.3 Hz), 4.45 (2H, s), 4.35 (1H, s), 3.71 (2H, s), 3.27 (1H, broad s), 2.04-1.98 (1H, m), 1.72-1.85 (1H, m), 1.43 (9H, s)
（ステップ１－８）
(S)-2-アミノ-N-ベンジル-4-ヒドロキシブタンアミド塩酸塩（１２）の合成
　ステップ１－７で得られた(S)-1-ベンジルカルバモイル-3-ヒドロキシプロピルtert-ブチルカルバメート（１１）（5.40 g）をジクロロメタン（60 mL）に溶解させ、4N塩酸1,4-ジオキサン溶液（87 mL）を加え、室温で5時間攪拌した。反応液を濃縮し、化合物（4.27 g, 収率100%）を白色固体として得た。化合物（１２）の1H NMRのデータを以下に示す。
d：1H NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
7.44-7.41 (2H, m), 7.34-7.30 (3H, m), 7.27 (1H, broad s), 4.43 (2H, s), 3.94 (1H, d, J = 7.0 Hz) 2.03 (2H, s)
（ステップ１－９）
(S)-N-(1-ベンジルカルバモイル-3-ヒドロキシプロピル)ベンズアミド（１３）の合成
　ステップ１－８で得られた(S)-2-アミノ-N-ベンジル-4-ヒドロキシブタンアミド塩酸塩（１２）（118 mg）、安息香酸（60 mg）、PyBOP（303 mg）、トリエチルアミン（0.2 mL）をN,N-ジメチルホルムアミド（1 mL）に溶解させ、室温で20時間攪拌した。反応液を水（100 mL）で希釈し、ジクロロメタン（100 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（100 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　ｎ-ヘキサン：酢酸エチル＝2：3）で精製し、化合物（１３）（72 mg, 収率47%）を白色固体として得た。化合物（１３）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.79 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.53 (1H, t, J = 7.3 Hz), 7.44 (2H, t, J = 8.0 Hz), 7.33-7.25 (5H, m), 7.06 (1H, d, J = 7.3 Hz), 6.89 (1H, broad s), 4.77 (1H, q, J = 6.4 Hz), 4.47-4.45 (2H, m), 4.32-4.28 (1H, m), 4.22-4.18 (1H, m), 2.28-2.19 (2H, m), 2.03 (3H, s).
<カップリング反応>
　ステップ１－１～ステップ１－６で合成したカップリング前駆体である化合物（９）と、ステップ１－７～ステップ１－９で合成したカップリング前駆体（１３）とを用いて、化１１に示す合成ルートに従い、光延反応を用いたカップリング反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　以下にカップリング反応の詳細を示す。
（ステップ１－１０）
(S)-トランス-[2-[3-(3-ベンゾイルアミノ-3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル] シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（１４）の合成
　ステップ１－９で得られた(S)-N-(1-ベンジルカルバモイル-3-ヒドロキシプロピル)ベンズアミド（１３）（200 mg）と、ステップ１－６で得られたトランス-2-(3-ヒドロキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（９）（230 mg）と、トリフェニルホスフィン（504 mg）とを無水テトラヒドロフラン（3 mL）に溶解させ、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（1mL）を加えた。反応液を室温で5時間攪拌後、濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝ 1 ：1）で精製し、化合物（１４）（64 mg, 収率18%）を淡黄色固体として得た。化合物（１４）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.82 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.52 (1H, t, J = 8.5 Hz), 7.46 (2H, t, J = 8.5 Hz), 7.26-7.21 (5H, m), 7.16 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.92 (1H, s), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.63 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.60 (1H, broad s), 4.88 (1H, quartet, J = 6.0 Hz), 4.47 (2H, d, J = 6.0 Hz), 4.32-4.29 (1H, m), 4.13-4.10 (1H, m), 2.65-2.70 (1H, m), 2.43-2.37 (2H, m), 1.99-1.97 (1H, m), 1.45 (9H, s), 1.14-1.10 (2H, m).
（ステップ１－１１）
(S)-トランス-N-3-[3-(2-アミノシクロプロピル) フェノキシ]-1-ベンジルカルバモイルプロピルベンズアミド塩酸塩（NCL-1）の合成
　ステップ１－１０で得られた(S)-トランス-[2-[3-(3-ベンゾイルアミノ-3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル] シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（１４）（70 mg）をジクロロメタン（1 mL）に溶解させ、4N塩酸酢酸エチル溶液（0.8 mL）を加え、室温で4時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をクロロホルム-メタノールから再結晶し、実施例１の化合物（NCL-1）（22 mg, 収率36%）を淡黄色固体として得た。NCL-1の融点、1H NMR、13C NMR、MS (FAB)のデータを示す。
融点 134.8-139.1 ℃
1H NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：7.84 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.54 (1H, t, J = 8.5 Hz), 7.46 (2H, t, J = 8.5 Hz), 7.26-7.17 (6H, m), 6.77 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 6.74-6.72 (1H, m), 6.67 (1H, d, J = 1.5 Hz), 4.47-4.37 (2H, m), 4.08 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.28-2.24 (2H, m), 1.35-1.33 (1H, m), 1.29-1.26 (1H, m) 
13C NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：173.93, 170.34, 160.52, 141.32, 139.79, 135.21, 132.96, 130.81, 129.55, 128.54, 128.46, 128.19, 120.00, 114.15, 114.05, 113.84, 65.92, 53.13, 44.15, 32.68, 31.96, 22.58, 13.84
MS (FAB) m/z = 444 (M+)
Anal. Calcd. for C27H30ClN3O3 3/2H2O: C, 63.96; H, 6.56; N, 8.29. 
Found: C, 63.83; H, 6.29; N, 7.98. 3/2
（実施例２）
　実施例２では、(S)-トランス-N-3-[4-(2-アミノシクロプロピル)フェノキシ]-1-ベンジルカルバモイルプロピルベンズアミド塩酸塩（NCL-2）を合成した（下記化学式参照）。詳細は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　まず、NCL-2を合成するための一方の前駆体として、化合物（２１）を以下の反応ルートにしたがって合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　以下に合成法の詳細を示す。
（ステップ２－１）
トランス-3- (4-ヒドロキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（１６）の合成
　実施例１のステップ１－１と同様の方法により、3-(4-ヒドロキシフェニル)アクリル酸（１５）（20.0 g）を出発原料とし、化合物（１６）（21.2 g, 収率99%）を白色固体として得た。化合物（１６）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.64 (1H, d, J = 15.8 Hz), 7.43 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.84 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.31 (1H, d, J =15.8 Hz), 5.21 (1H,s), 3.80 (3H, s).
（ステップ２－２）
トランス-3-(4-メトキシメトキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（１７）の合成
　実施例１のステップ１－２と同様の方法により、ステップ２－１より得られたトランス-3- (4-ヒドロキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（１６）（10.0 g）より、化合物（１７）（11.1 g, 収率89%）を無色油状物として得た。化合物（１７）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.65 (1H, d, J = 6.2 Hz), 7.47 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.04 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.33 (1H, d, J = 6.2 Hz), 5.20 (2H, s), 3.80 (3H, s), 3.48 (3H, s).
（ステップ２－３）
トランス-2-(4-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸メチルエステル（１８）の合成
　実施例１のステップ１－３と同様の方法により、ステップ２－２より得られたトランス-3-(4-メトキシメトキシフェニル)アクリル酸メチルエステル（１５）（11.0 g）より、化合物（１８）（1.68 g, 収率14%）を無色油状物として得た。化合物（１８）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.03 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.95 (2H, d, J =8.5 Hz), 5.14 (2H, s), 3.71 (3H, s), 3.46 (3H, s), 2.51-2.47 (1H, m), 1.85-1.81 (1H, m), 1.58-1.54 (1H, m) 1.29-1.25 (1H, m).
（ステップ２－４）
トランス-2-(4-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸（１９）の合成
　実施例１のステップ１－４と同様の方法により、ステップ２－３より得られたトランス-2-(4-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸メチルエステル（１８）（1.68 g）より、化合物（１９）（1.50 g, 収率95%）を白色固体として得た。化合物（１９）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.05 (2H, d, J = 6.7 Hz), 6.94 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.12 (2H, s), 3.42 (3H, s), 2.43-2.39 (1H, m), 1.76-1.73 (1H, m), 1.49-1.46 (1H, m), 1.33-1.28 (1H, m).
（ステップ２－５）
トランス- 2-(4-メトキシメトキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（２０）の合成
　実施例１のステップ１－５と同様の方法により、ステップ２－４より得られたトランス-2-(4-メトキシメトキシフェニル)シクロプロパンカルボン酸（１９）（1.05 g）より、化合物（２０）（788 mg, 収率56%）を淡黄色固体として得た。化合物（２０）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.07 (2H, d, J = 8.2 Hz), 6.94 (2H, d, J = 8.2 Hz), 5.13 (2H, s), 4.89 (1H, broad s), 3.46 (3H, s), 2.64-2.69 (1H, m), 2.02-1.98 (1H, m), 1.46 (9H, s), 1.12-1.09 (2H, m).
（ステップ２－６）
トランス-2-(4-ヒドロキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（２１）の合成
　実施例１のステップ１－６と同様の方法により、ステップ２－５より得られたトランス- 2-(4-メトキシメトキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（２０）（476 mg）より、化合物（２１）（300 mg, 収率74%）を淡黄色油状物として得た。化合物（２１）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：6.94 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.72 (2H, d, J =8.5 Hz), 5.13 (1H, broad s), 4.84 (1H, broad s), 2.60-2.70 (1H, m), 1.98 (1H, m), 2.09-1.96 (1H, m), 1.10-1.05 (2H, m).
　NCL-2を合成するための他方の前駆体として、実施例１のステップ１－７～ステップ１－９で合成した化合物（１３）を用いた。
<カップリング反応>
　上記ステップ２－１～ステップ２－６で合成したカップリング前駆体である化合物（２１）と、化合物（１３）とを用いて、光延反応によるたカップリング反応によって、実施例２の化合物NCL-2を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　以下に合成法の詳細を示す。
（ステップ２－７）
(S)-トランス-[2-[4-(3-ベンゾイルアミノ-3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル] シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（２２）の合成
　実施例１のステップ１－７と同様の方法により、ステップ２－６より得られたトランス-2-(4-ヒドロキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（２１）（220 mg）と
実施例１のステップ１－７～１－９で合成したカップリング前駆体（１３）のカップリングを行い、化合物（２２）（83 mg, 収率25%）を淡黄色固体として得た。化合物（２２）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.79 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.53-7.49 (1H, m), 7.41 (2H, t, J = 8.5 Hz), 7.26-7.13 (5H, m), 7.04 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.71 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.94-4.89 (2H, m), 4.46-4.38 (2H, m), 4.25-4.21 (1H, m), 4.08-4.04 (1H, m), 2.55-2.59 (1H, m), 2.43-2.37 (2H, m), 1.95-2.01 (1H, m), 1.45 (9H, s), 1.08 (2H, t, J = 7.0 Hz).
（ステップ２－８）
(S)-トランス-N-3-[4-(2-アミノシクロプロピル) フェノキシ]-1-ベンジルカルバモイルプロピルベンズアミド塩酸塩（NCL-2）の合成
　実施例１のステップ１－１１と同様の方法により、ステップ２－７より得られた、(S)-トランス-[2-[4-(3-ベンゾイルアミノ-3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル] シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（２２）（83 mg）より、化合物（NCL-2）（18 mg, 収率25%）を淡黄色固体として得た。NCL-2の融点、1H NMR、13C NMR、MS (FAB)のデータを示す。
融点：141.2-144.5 ℃
1H NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：7.83 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.54 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.45 (2H, t, J = 7.0 Hz), 7.27-7.19 (6H, m), 7.05 (2H, dd, J = 9.0 Hz), 6.84 (2H, d, J = 9.0 Hz), 4.40 (2H, d, J = 8.0 Hz), 4.06 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.74-2.72 (1H, m), 2.42-2.36 (1H, m), 2.29-2.21 (1H, m), 1.34-1.29 (1H, m), 1.26-1.22 (1H, m)
13C NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：173.91, 170.32, 159.23, 139.80, 135.21, 132.93, 131.84, 129.55, 129.52, 128.62, 128.52, 128.48, 128.17, 115.89, 65.95, 53.13, 44.16, 32.70, 31.73, 21.96, 13.41
MS (FAB) m/z = 444 (M+);
Anal. Calcd For C27H30ClN3O3 2H2O: C, 62.84; H, 6.64; N, 8.14.
Found: C, 62.47; H, 6.08; N, 8.21.
（実施例３）
　実施例３では、トランス-4-[3-(2-アミノシクロプロピル)フェノキシ]-N-ベンジルブチルアミド塩酸塩（NCL-3）を合成した（下記化学式参照）。詳細は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
<カップリング前駆体>
　実施例３では、NCL-3を合成するための前駆体として、実施例１（ステップ１－１～１－６）で合成した、化合物（９）を用いた。また、NCL-3を合成するためのもう一方の前駆体として、化合物（２４）を次の反応によって合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（ステップ３－１）
N-ベンジル-4-クロロブチルアミド（２４）の合成
　ベンジルアミン（1.1 mL）とトリエチルアミン（4.5 mL）をジクロロメタン（26 mL）に溶解し、氷冷下、4-クロロブチリルクロリド（２３）（1.5 mL）のジクロロメタン（15 mL）溶液を滴下した。0°Cで30分攪拌後、反応液を水（100 mL）に注ぎ、酢酸エチル（200 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（100 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝ 3 ：1）で精製し、化合物（２４）（1.26 g, 収率59%）を淡黄色油状物として得た。化合物（２４）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.36-7.26 (5H, m), 5.84 (1H, broad s), 4.44 (2H, d, J = 5.8 Hz), 3.62 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.40 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.14 (2H, quintet, J = 7.0 Hz). 
　NCL-3を合成するための他方の前駆体として、実施例１のステップ１－１～ステップ１－６で合成した化合物（９）を用いた。
<カップリング反応>
　上記のようにして合成した化合物（２４）と化合物（９）とを光延反応によってカップリングさせて実施例３の化合物NCL-3を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　以下に合成法の詳細を示す。
（ステップ３－２）
トランス-2-[3-(3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル]シクロプロピル tert-ブチルカルバメート（２５）の合成
　実施例1のステップ１－６で得られたトランス-2-(3-ヒドロキシフェニル)シクロプロピルtert-ブチルカルバメート（９）（400 mg）をアセトニトリル（7.5 mL）に溶解させ、炭酸セシウム（1.54 g）、ヨウ化ナトリウム（70 mg）を加えて、室温で15分間攪拌した。反応液にステップ３－１で得られたN-ベンジル-4-クロロブチルアミド（２５）（900 mg）のアセトニトリル（10 mL）溶液を添加し、9時間加熱還流した。反応液をろ過し、不溶物を取り除き、ろ液を濃縮後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　n-ヘキサン：酢酸エチル＝ 1：1）で精製し、化合物（２４）（140 mg, 収率21%）を淡黄色油状物として得た。化合物（２５）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.30-7.24 (5H, m), 7.15 (1H, t, J = 7.0 Hz), 6.71 (1H, d, J = 7.0 Hz), 6.66 (1H, d, J = 7.0 Hz), 6.62 (1H, s),  5.85 (1H, broad s), 4.84 (1H, broad s), 4.44 (2H, d, J = 5.8 Hz), 3.99 (2H, t, J = 5.8 Hz), 2.67-2.75 (1H, m), 2.43 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.16-2.13 (2H, m), 2.01-1.96 (1H, m), 1.45 (9H, s), 1.12-1.15 (2H, m).
（ステップ３－３）
トランス-4-[3-(2-アミノシクロプロピル)フェノキシ]-N-ベンジルブチルアミド塩酸塩（NCL-3）の合成
　実施例１のステップ１－１１と同様の方法により、ステップ３－２より得られた、トランス-2-[3-(3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル]シクロプロピル tert-ブチルカルバメート（２５）（140 mg）より、実施例３のフェニルシクロプロピルアミン誘導体である化合物（NCL-3）（82 mg, 収率69%）を白色固体として得た。NCL-3の融点、1H NMR、13C NMR、MS (ELC)のデータを示す。
融点：83.3-86.7 °C
1H NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：7.26-7.17 (6H, m), 6.77 (1H, dd, J = 7.6, 2.5 Hz), 6.72 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.69 (1H, s), 4.36 (2H, s), 3.98 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.82-2.80 (1H, m), 2.43 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.32-2.30 (1H, m), 2.10-2.06 (2H, m), 1.39-1.35 (1H, m), 1.32-1.28 (1H, m)
13C NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：175.37, 160.71, 141.30, 140.02, 130.78, 129.53, 128.52, 128.18, 119.68, 113.94 113.81, 68.06, 33.46, 31.96, 26.57, 22.62, 13.84
MS (ELC) m/z: 325 (M+)
Anal. Calcd For C20H25ClN2O2 2/3H2O: C, 64.42; H, 7.12; N, 7.51.
Found: C, 64.44; H, 6.87; N, 7.80.
（実施例４）
　実施例４では、トランス-4-[4-(2-アミノシクロプロピル)フェノキシ]-N-ベンジルブチルアミド塩酸塩（NCL-4）を合成した（下記化学式参照）。詳細は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
<カップリング前駆体>
　実施例４では、カップリング前駆体は、実施例２におけるステップ２－１～ステップ２－６で合成した、化合物（２１）を用いた。また、もう一方のカップリング前駆体としては、実施例３におけるステップ３－１で合成した化合物（２４）を用いた。
<カップリング反応>
　上記のようにして合成した化合物（２４）と化合物（２１）とを光延反応によってカップリングさせて実施例４の化合物NCL-4を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　以下に合成法の詳細を示す。
（ステップ４－１）
トランス-2-[4-(3-ベンジルカルバモイルプロポキシ)フェニル]シクロプロピル tert-ブチルカルバメート（２６）の合成
　実施例３のステップ３－２と同様の方法により、化合物（２１）（500 mg）と化合物（２４）とをカップリングさせ、実施例４のフェニルシクロプロピルアミン誘導体である化合物（２６）（NCL-3）（82 mg, 収率69%）を白色固体として得た。化合物（２６）の1H NMRのデータを以下に示す。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm)
d：7.32-7.24 (5H, m), 7.05 (2H, d, J = 8.2 Hz), 6.75 (2H, d, J = 8.2 Hz), 5.82 (1H, broad s), 4.84 (1H, broad s),  4.44 (2H, d, J = 5.8 Hz), 3.97 (2H, t, J = 5.8 Hz), 2.60-2.70 (1H, m), 2.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.16-2.12 (2H, m), 1.97-2.04(1H, m), 1.46 (9H, s), 1.02-1.15 (2H, m).
（ステップ４－２）
トランス-4-[4-(2-アミノシクロプロピル)フェノキシ]-N-ベンジルブチルアミド塩酸塩（NCL-4）の合成
　実施例１のステップ１－１１と同様の方法により、ステップ４－１より得られた、化合物（２６）（140 mg）より、実施例４のフェニルシクロプロピルアミン誘導体である化合物（NCL-4）（82 mg, 収率69%）を白色固体として得た。NCL-4の融点、1H NMR、13C NMR、MS (ELC)のデータを示す。
融点：156.3-159.4 °C; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm)
d：7.27-7.21 (5H, m), 7.06 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.83 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.35 (2H, s), 3.95 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.75-2.74 (1H, m), 2.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.30-2.27 (1H, m), 2.09-2.05 (2H, m), 1.35-1.32 (1H, m), 1.27-1.24 (1H, m)
d：13C NMR (CD3OD, 500 MHz, d; ppm) 175.34, 159.44, 140.06, 131.58, 129.51, 128.61, 128.53, 128.16, 115.81, 68.17, 44.11, 33.48, 31.73, 26.59, 21.96, 13.40
MS (ELC) m/z: 325 (M+)
Anal. Calcd For C20H25ClN2O2 H2O: C, 63.40; H, 7.18; N, 7.39.
Found: C, 63.50; H, 6.68; N, 7.44.
－評　　価－
　以上のようにして得られた実施例１～実施例４の化合物（NCL-1～NCL-4）について、LSD1阻害活性試験、モノアミンオキシダーゼ阻害活性試験及びHeLa細胞増殖阻害試験を行った。
＜LSD1阻害試験＞
　LSD1酵素は以下のようにして調製した。
　全長のLSD1（1-851aa）のN末端にヒスチジン5残基を付加した組換えタンパク質をコードするプラスミドを調製し、このプラスミドで形質転換した組換え大腸菌を用いてLSD1を発現させた。その後、組換え大腸菌を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーで精製し、LSD1酵素溶液を得た。LSD1の酵素活性は、LSD1の脱メチル化反応の際に生成する過酸化水素をペルオキシダーゼと試薬によって発色させ、吸光光度法で定量することにより測定した。すなわち、384ウエルマイクロタイタープレート内で、50mM Hepes-NaOH buffer（pH7.5）、0.1mM 4-アミノアンチピリン、1mM 3,5-ジクロロ-2-ヒドロキシベンゼンスルホン酸、20μM histone H3- lysine 4 dimethyl peptide、0.05μM LSD1、0.35μM horseradish peroxidaseからなる20μlの溶液を25℃で30分間、経時的に酵素反応を測定した。測定にはSpectra Max M2e(Molecular Devices社)を用いて、生成物の515nmでの吸光度を測定して求めた。また、阻害活性については、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）添加時の酵素活性を100%とし、フェニルシクロプロピルアミン誘導体の添加濃度を様々に変えて残存活性を測定し、50％の活性を阻害する濃度（IC50）を求めた。
　LSD1阻害試験の結果を図１に示す。この図に示すように、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）は、いずれもtranylcypromineより高いLSD1阻害活性を示した。また、実施例１～４のの化合物（NCL-1～４）中でも、アミノ酸構造を有する実施例１のNCL-1及び実施例２のNCL-2では、極めて高いLSD1阻害活性を示した。
＜モノアミンオキシダーゼ阻害活性測定試験＞
　モノアミンオキシダーゼA（MAO-A）及びモノアミンオキシダーゼB（MAO-B）阻害活性の測定を、Promega社のMAO-GloアッセイキットとSigma-Aldrich社から購入したMAO-AおよびMAO-Bを用いて以下のように行った。
　12.5 μLの4倍MAO基質（最終濃度40 μM）、12.5 μLの4倍阻害剤溶液（最終濃度0.1~1000 μM）、25 μLのMAO-A（最終濃度 9 unit/mL）あるいは25 μLのMAO-B（最終濃度2.3 unit/mL）を混合し、室温で1時間反応させた。この反応液に50 μLのルシフェリン検出試薬を添加し、室温で20分反応させ、蛍光プレートリーダーも用いて蛍光強度（蛍光測定波長：562 nm）を測定し、IC50値（酵素を50%阻害する阻害剤濃度）を求めた。
　MAO-Aに対する阻害活性の結果を図２に示す。この図に示すように、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）は、いずれもtranylcypromineやpargylineより低いMAO A阻害活性を示した。その中でも、アミノ酸構造を有する実施例１のNCL-1及び実施例２のNCL-2では、特に阻害活性が低かった。
　また、MAO-Bに対する阻害活性についても、図３に示すように、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）は、いずれもtranylcypromineやpargyline（下記化学式参照）より低いMAO-B阻害活性を示し、その中でも、実施例１のNCL-1及び実施例２のNCL-2では、特に阻害活性が低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
＜がん細胞増殖阻害＞
（１）HeLa細胞の増殖に対する阻害活性の測定
　上記実施例１～４の化合物（NCL-1～４）について、ヒト子宮頸がん由来細胞株であるHeLa細胞の増殖に対する化合物の阻害活性を測定することにより評価した。以下にその詳細を示す。
　細胞増殖阻害活性は、3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）アッセイ法により求めた。このアッセイ法は、生きた細胞のミトコンドリアに含まれるＮＡＤＨがＭＴＴと反応して発色するときの吸光度を測定して、ＮＡＤＨの量を測定することを原理とするものであり、以下の手順で行った。
　96ウエルマイクロタイタープレートにHeLa細胞を１ウエルあたり100μlの10%ウシ胎児血清含有RPMI1640培地に5000細胞ずつ播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した後、化合物を添加した。48時間培養後、5mg/mlのMTT液を１ウエルあたり10μl入れ、CO2インキュベーターでさらに3時間培養した。可溶化溶液(0.04mol/l 塩酸-イソプロパノール)を１ウエルあたり100μl入れて激しくボルテックス後、Fusion-aFP（PerkinElmer社製）で560nmの吸光度を測定し、細胞の生存量を求めた。また、阻害活性は、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）添加時の酵素活性を100%とし、フェニルシクロプロピルアミン誘導体の添加濃度を様々に変えて残存活性を測定し、50％の活性を阻害する濃度（IC50）を求めた。
　HeLa細胞増殖に対する阻害活性の結果を図４に示す。この図から、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）は、いずれもtranylcypromineよりも高い阻害活性を示し、特に実施例１（NCL-1）及び実施例４（NCL-4）において、顕著な増殖阻害活性を示すことが分かった。
　LSD1阻害活性試験、モノアミンオキシダーゼ阻害活性試験及びHeLa細胞増殖阻害試験を行った結果をまとめて表１に示す。この表から、実施例１～４の化合物（NCL-1～NCL-4）のLSD1に対するIC50は、MAO-Aに対するIC50よりも小さく、特に実施例１（NCL-1）及び実施例２（NCL-2）では、LSD1阻害活性についての選択性に極めて優れていることが分かった。また、実施例１の化合物（NCL-1）及び実施例２の化合物（NCL-2）では、MAO-Bに対しても、優れた選択性を有していることが分かった。こうしたLSD1に対する優れた選択性は、実施例１（NCL-1）及び実施例２（NCL-2）が有しているアミノ酸構造に起因するものと推定される。
　また、HeLa細胞の細胞増殖に対するGI50の値は、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）のいずれの化合物も、tranylcypromineより遥かに低く、細胞増殖抑制効果が高いことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
（２）HeLa細胞以外のがん細胞に対するの増殖に対する阻害活性の測定
　また、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）について、ヒト大腸がん由来細胞株であるHCT116、ヒト前立腺がん由来細胞株であるPC-3、ヒト食道がん由来細胞株であるKYSE150、及びヒト神経芽腫由来細胞株であるSH-SY5Yの増殖に対する阻害活性についても、HeLa細胞の場合と同様のMTTアッセイ法により求めた。
　HCT116、PC-3、KYSE150及びSH-SY5Yの増殖に対する阻害活性の測定結果を図５～図８に示す。これらの図から、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）は、いずれのがん細胞に対しても、tranylcypromineよりも高い阻害活性を示すことが分かった。
　また、HeLa細胞、HCT116細胞、PC-3細胞、KYSE150細胞及びSH-SY5Y細胞増殖に対して実施例１～４の化合物（NCL-1～４）及びtranylcypromineを添加した時のGI50を表２に示す。この表から、実施例１～４の化合物（NCL-1～４）は、いずれの細胞に対してもtranylcypromineより遥かにGI50の値が低いことが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
LSD1に対する阻害活性を示す図である。 MAO-Aに対する阻害活性を示す図である。 MAO-Bに対する阻害活性を示す図である。 HeLa細胞増殖に対する阻害活性を示す図である。 HCT116細胞増殖に対する阻害活性を示す図である。 PC-3細胞増殖に対する阻害活性を示す図である。 KYSE150細胞増殖に対する阻害活性を示す図である。 SH-SY5Y細胞増殖に対する阻害活性を示す図である。
　本発明のフェニルシクロプロピルアミン誘導体及びLSD1阻害剤は、LSD1の機能を調べるための生物学的ツールとして用いたり、抗がん剤として用いたりすることができると期待される。

Claims (5)

  1. 　下記一般式（Ｉ）若しくは（II）（ただし、両式中Ｒ１は水素、置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基及び置換基が結合していてもよい複素環基のいずれかを示し、Ｒ２は分枝を有することがあり置換基が結合していてもよいアルキレン基を示し、Ｒ３は置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基、置換基が結合していてもよい複素環基及び置換基が結合していてもよいベンジル基のいずれかを示し、Ｒ４は置換基が結合していてもよいアルキル基、置換基が結合していてもよいフェニル基、置換基が結合していてもよい複素環基、置換基が結合していてもよいアルキルオキシ基、置換基が結合していてもよいフェニルオキシ基、置換基が結合していてもよいアルキルアミノ基及び置換基が結合していてもよいフェニルアミノ基のいずれかを示し、ＸはＯ、ＮＨ２、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、Ｓ又はＣＨ２を示す）の化合物又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とするフェニルシクロプロピルアミン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　下記一般式（１）（ただし、式中Ｒ１は水素又はフェニルアミド基を示し、Ｒ２は分枝を有することのあるアルキレン基を示し、シクロプロピルアミン置換基はメタ位又はパラ位に結合している）の化合物又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とする請求項１記載のフェニルシクロプロピルアミン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  3. 　Ｒ２はエチレン基であることを特徴とする請求項２記載のフェニルシクロプロピルアミン誘導体。
  4. 　Ｒ１はフェニルアミド基であることを特徴とする請求項３に記載のフェニルシクロプロピルアミン誘導体。
  5. 　請求項１乃至４のいずれか１項に記載のフェニルシクロプロピルアミン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするLSD1阻害剤。
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