WO2010130459A2 - Verfahren zum behandeln einer ziel- und restpartikel enthaltenden population von in flüssigkeitströpfchen suspendierten objekten sowie vorrichtung zum durchführen dieses verfahrens - Google Patents

Verfahren zum behandeln einer ziel- und restpartikel enthaltenden population von in flüssigkeitströpfchen suspendierten objekten sowie vorrichtung zum durchführen dieses verfahrens Download PDF

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Klaus Lennartz
Thomas Van Den Boom
Bedrich Hosticka
Werner Brockherde
Benjamin Bechen
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Universität Duisburg Essen
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    • G01N2015/1028—Sorting particles

Definitions

  • the invention relates to a method having the features of the preamble of claim 1 and a corresponding device according to claim 12. Accordingly, it is provided to treat individual, in particular biological, objects of a population suspended in liquid droplets, containing target and residual particles population using at least one substrate and an electronic, especially digital microfluidic, circuit or control, thereby enabling digital microfluidic droplet motions via digital microfluidics.
  • An essential objective for treating populations suspended in liquids of mutually differing, in particular biological objec- Part of target and residual particles is the sorting of such a population into those objects that are desired or sought to be used further (target particles) and those whose re-use is not in focus (residual particles).
  • target particles those objects that are desired or sought to be used further
  • residual particles those whose re-use is not in focus
  • so-called flow cytometers have been used for almost 40 years, which perform a droplet-based sorting by means of a filamentary and vertically directed, controlled liquid flow according to the so-called jet-in-air principle.
  • the downwardly directed liquid thread is dissected by means of suitable vibration exciters into a string of pearls of smallest liquid droplets, after which the liquid thread has been analyzed by optical methods at which points it contains a biological object of interest, such as a cell. Subsequently, the liquid droplets are deflected by an electric field in one direction or the other, according to whether or not a liquid droplet contains or does not contain a sought-after cell. In this way, sought-after cells can be collected separately from cells that are not searched for. This method requires that only a very small number of cells, preferably only one cell, be present in one droplet. Consequently, all cells present in the fluid must go through the analysis position one at a time.
  • FACS Fluorecence-Activated Cell Sorting
  • the object of the invention is to treat populations of target and residual particles suspended in liquid droplets by means of a generic process and to treat them from one another, preferably individual, in particular biological objects, by comparatively few process steps.
  • "treating" is understood to mean a sorting into target and residual particles
  • a method having the features of claim 1 and a device having the features of claim 12 are proposed. Accordingly, it is provided with regard to a generic method to initially generate liquid droplets of suitable composition of target and residual particles. Each generated liquid droplet is examined in a first analysis position for the presence of at least one target or residual particle. Liquid droplets without target particles are subsequently removed from the substrate via a residual particle sink. Liquid droplets with at least one target particle are fed by means of the substrate to a second treatment stage.
  • the method according to the invention makes it possible, in further treatment stages, to isolate samples to the level of individual cells / particles.
  • DMF digital microfluidic droplet motion
  • the invention makes it possible to dispense with a large number of process steps, because liquid droplets containing a population of biological objects, but none of them considered as target or residual particles is to be immediately discarded from the process via the residual particle sink together with the liquid of the affected liquid droplet.
  • flow cytometry in which each biological object present in the liquid is analyzed, preferably completely, ie correspondingly many analysis steps are required, a very considerable reduction in the analytical steps is achieved by the invention.
  • This advantage is also achieved over the cascading method described above. Only the liquid droplets loaded with target particles are fed to a further treatment stage. In this case, biological as well as non-biological objects can be present in a number from 1 to about 10 3 in a single liquid droplet. If necessary, the number can still be increased.
  • Bio objects for which the method according to the invention is used include whole cell aggregates, individual highly developed cells, cell constituents, chromosomes and also microbiological objects, such as viruses, however, the invention is not limited to the treatment of biological objects, "Treating" populations of biological objects includes not only separating, but also performing chemical reactions, staining, washing, fading, hybridization, and other treatment procedures on biological objects Understood. By “population” is meant a plurality of mutually differing objects.
  • the biological objects suspended in a liquid are kept in a storage container or in an intermediate container in motion or stored in such a way that they do not sediment.
  • the container has on at least one side of an opening, preferably a plurality of spaced apart openings or ports whose size and shape is selected so that at these points from the stock individual liquid droplets of suitable size can be deducted or removed from the total volume, such as it especially in the document Accordingly, it is preferred if a DMF chip with its channels or trajectories for droplet transport directly contacts the respective ports In this way, a multiplicity of parallel droplet paths can be used for droplet transport to an analysis position, and multiple microchips can be "docked" in the same manner on the same side or at other locations on a prebranch, e.g. B. to increase the parallelization yet.
  • the respective liquid droplet contains at least one target particle or a minimum target particle concentration. If so, this liquid droplet is navigated along one of the droplet trajectories on the substrate to a transfer position at a path end (transfer point) at which the droplet is delivered to a further treatment stage.
  • This may be an intermediate container. Droplets that contain no or too few target particles are directed into a different path than the droplets with target particles. At the end of the path for non-interest droplets, the droplet is transferred to a droplet sink. This may be a droplet collector.
  • any analyzes may be performed, such as by means of photodetectors, the marked samples optically, e.g. detect by means of light scattering and / or fluorescence measurement and enable their detection at the level of individual cells / particles.
  • Resistance measurements for particle size determination e.g. in accordance with the Coulter principle (the Coulter counter detects changes in the electrical conductivity of a liquid which is covered by a diaphragm and contains biological particles).
  • the sorting can also be done by magnetic activation.
  • the architecture of the DMF chips for the treatment of the biological objects is preferably made modular. This not only allows a high degree of parallelization of the generated droplets, but also allows the transfer of droplets between the path ends of adjacent modules, so that further treatment steps can connect directly. Individual modules can be assigned different tasks, for instance because certain treatment steps do not or do not find room on the preceding modules. It is also possible to use modules which allow three-dimensional movement paths, so that liquid droplets can be treated in different, in particular parallel, planes and also transported from one plane to another plane.
  • the treatment of a target and residual particle-containing population of biological droplets suspended in liquid droplets is performed in a stepwise manner such that droplets of liquid of non-interest populations, after detection, directly and without intersection with trajectories for residual liquid particles of interest be supplied.
  • a residual particle sink can be used for a plurality of droplet ports and correspondingly for a plurality of movement paths on the microchip.
  • a division of the liquid droplets of interest takes place.
  • the partial droplets are subsequently analyzed individually and subsequently collected or removed in a further residual particle sink, if they are not of interest and supplied for further treatment, if they are of interest, that is to say contain at least one target particle.
  • the droplet division is preferably carried out on the same microchip on which the first residual particle sink is located. In principle, however, it is also possible first to transfer the liquid droplets of interest to another microchip and then to treat them further.
  • the sub-droplets can also be further treated on the microchip on which the droplet separation has taken place, i. especially in a second analysis position for the presence of target particles.
  • This second analysis step preferably takes place on altered droplet motion paths, namely those in which the electrodes and, if appropriate, their distances of the smaller droplet size are correspondingly smaller.
  • This can in principle take place on the same microchip on which a droplet partition has already taken place.
  • another microchip module which has smaller electrodes is preferably used for the further treatment.
  • the electrodes can also be designed in the same size and interconnected to smaller and larger electrode surfaces.
  • the shape of the resulting surfaces may be square, rectangular or even round. In this way, the electrode surfaces on the substrate could be adapted to the respective droplet size at any point.
  • particle-free liquid droplets can be combined with a particle-containing liquid droplet.
  • particle-free liquid droplets are understood to mean that no objects interfering with the treatment process or the treatment target are present in this liquid droplet.
  • the liquid droplets in particular on the microchip, can be cooled, heated, or fumigated in order to create optimal conditions for the cells I with the aim of avoiding their change or death during sorting as far as possible.
  • droplet size the number of biological objects per droplet and analysis settings in a pre-sorting stage.
  • optimal values for droplet size and cell count / droplets in limits imposed by the system on the basis of the percentage distribution of the cells of interest present in the total population. For example, one selects high cell count / droplets with low percentage of cells of interest and a simultaneously large total population and low cell count / droplets at high concentration of cells of interest.
  • sorting modes such as purity, impurities (for example non-vital cells or cell fragments), in particular in the presorting stage, can be assigned Define cell populations and the desired number of cells to collection vessels (mixtures / series of equal or dissimilar cell numbers). Depending on the initial load of the individual droplets, these would now be analyzed, divided and presorted in more or less stages. Droplets without cells of interest can be early sorted out and added to the waste. Droplets with at least one cell of interest may be navigated towards the collection vessel. If the analysis of whether there is at least one cell of interest in a droplet is doubtful, the system may decide, based on the preliminary analysis, whether the droplet is discarded or put to further analysis and division.
  • impurities for example non-vital cells or cell fragments
  • sorting parameters can be further optimized by the system also self-learning. In this case, the number of cells should be chosen lower at the first generation of the droplets. If, during presorting, it is found that several cells are in one droplet and they belong to the same target population, this droplet can be delivered to the target collection vessel without further analysis and division.
  • droplets after division become too small for the given electrode size, these droplets can be merged with droplets without cells.
  • the cell number / droplet is approximately at the single cell level, the droplets with the identified cells of interest in the fine sorting stage are delivered to the target collection vessels. Similarly, droplets of cells of interest can be navigated directly to the special sorting stage directly from the fine sorting stage, bypassing the collection vessels.
  • the system can be extended with add-on modules such as holding, dyeing, washing and fading.
  • add-on modules such as holding, dyeing, washing and fading.
  • the measurement of weak, specific fluorescence signals can be improved by bleaching by determining the more stable autofluorescence signal of the cells and of the initially determined sum of autofluorescence and specific fluorescence is subtracted.
  • modules may be used, e.g. for image analysis and subsequent manual sorting decisions, for cell assays on cell populations, single cells or cell components, for cell fusion, for polymerase chain reaction (PCR), for gene expression analysis (BioChip). These modules can be used in pre-sorting as well as in fine sorting.
  • PCR polymerase chain reaction
  • BioChip gene expression analysis
  • Figure 1 shows the first stage of a sorting device in a schematic representation.
  • FIG. 2 shows a further embodiment of a sorting device
  • 3 shows a schematic representation of a DMF chip in vertical section; 4 shows a modular sorting device;
  • each generated liquid droplet is moved via a DMF microchip 20 by means of electrodes 22 into a first analysis position 30A and there examined for the presence of at least one target or remainder particle.
  • Liquid droplets without target particles are subsequently removed from the substrate via a residual particle or droplet sink 40.
  • Liquid droplets with at least one target particle are fed by means of the substrate to a second treatment stage.
  • an intermediate container 4 may be provided
  • DMF digital microfluidic droplet movement
  • a row droplet movement path 22A
  • a layer of the substrate FOG.
  • Droplet-moving plane 21 Droplet-moving plane 21
  • liquid droplets loaded with target particles are fed to a further treatment stage.
  • biological as well as non-biological objects in a number from 1 to 10 3 , possibly also beyond, can be present in a single liquid droplet.
  • the biological objects suspended in a liquid are kept in motion in a storage container (container 2) or stored so that they do not sediment.
  • the spaced-apart openings or ports 3A 1 ... are chosen in size and shape so that at these points from the stock individual liquid droplets of suitable size can be deducted from the total volume or dissolved out.
  • the DMF microchip 20 with its channels or trajectories for droplet transport (droplet motion paths 22A) is docked directly to the respective ports 3A 1 ... of the storage container.
  • the respective liquid droplet contains at least one target particle or a minimum target particle concentration. If so, this liquid droplet is navigated along one of the droplet travel path 22B on the substrate to a transfer position 50 at a path end 25 (transfer point) where the droplet is delivered to another treatment stage. This may be an intermediate container 4. Droplets containing no or too few target particles are directed via different movement paths 22C than the droplets with target particles. At the end (s) 24 of this non-droplet path (s) 22C, the droplets are passed to at least one droplet sink 40 to a droplet receiver 41.
  • the mode of operation of this exemplary arrangement is that cells or microparticles labeled from a large reservoir (container 2) together with unlabelled cells or microparticles are collected in a surrounding liquid and brought to the analysis units (first analysis positions 30A) on any number of parallel paths What happens through an electrodynamic drive such as electrowetting.
  • electrodes 22 are arranged in succession along the intended droplet movement paths 22A on a DMF microchip 20, not shown, and controlled in such a way that the droplets are pulled over a traveling electrical potential in the predetermined direction. This process can be done on upwardly open paths, but also along channels or between vertically spaced-apart electrode-bearing surfaces of the DMF microchip.
  • branches of the droplet movement paths 22A are provided in the form of intersections or T-joints.
  • a path of travel 22B extending transversely of the first droplet moving thread 22A provides a direct connection to a cell of interest 4, which is transferred at a droplet transfer position 50 at the path end 25, while the third droplet communication paths 22C connect to a droplet.
  • Make collection container 41 for non-interest cells which are passed to droplet sinks 40 at the path ends 24.
  • the arrows and points pointing down indicate that more sorting modules can join.
  • the right-pointing dots and arrow indicate that there may be additional ports and droplet motion paths on the same microchip, or other sorting modules of that stage may receive their cells containing droplets from the same or a parallel-connected reservoir Parallelization and thus increase the sorting performance.
  • FIG. 2 shows, by way of example, an alternative embodiment of the device according to FIG. 1, which can be used alternatively or which can be used in a further sorting step following the first sorting step, for example according to FIG. 1, possibly after intervening intermediate sorting passes.
  • a further sorting stage can follow the path end 25 of the droplet movement path 22B.
  • a further analysis position 3OB is provided at the path end, which in the illustrated and insofar preferred case can differentiate between a plurality of cells of interest, which subsequently via droplet movement paths 22D and 22E in collection Gr.1 - Gr.5 each collected by property of the cell or its components.
  • these droplet motion paths and analysis position may be provided on the dash-dotted line DMF microchip.
  • the object-of-interest droplet catcher 41 can also be guided via a collection path 22F (corresponding to the object-of-interest collection path 22B). This is shown by way of example as an alternative detail to FIG. Such a "BUS" line for equivalent droplets reduces the control effort.
  • the detection principle is exemplified in FIG.
  • the microfluidic droplet motion paths are embedded as channels on a CMOS chip (silicon substrate).
  • the electrodes can be accommodated and electrically controlled.
  • silicon based photodetectors with a structured color filter are also mounted in this layer.
  • the droplets with the populations of biological objects pass between silicon and e.g. a glass substrate as a lid.
  • the excitation light can then be coupled in by means of glass fibers, etc., via the glass cover.
  • the electrodes can also be realized optically transparent, for example.
  • the treatment of a population of biological objects of target and residual particles suspended in liquid droplets (F) is carried out step by step such that liquid droplets with non-interesting populations after detection at 30 A directly and without crossing with Movement paths for interested liquid droplets of the residual particle sink 40 are supplied.
  • a single residual particle sink can be used for a plurality of droplet ports 3 and correspondingly for a plurality of droplet movement paths 22A on the microchip 2OA, 2OB, 2OC. Thereafter, preferably on the same microchip, a split of the liquid droplets of interest occurs at 32A.
  • the partial droplets F 1 , F 2 are subsequently analyzed individually at 3OC and subsequently in a further residual particle sink 40 '; 50 'collected or discharged, if they are not interested, further treatment, if they are of interest, so for example at least one target particle included.
  • the droplet division is preferably carried out on the same microchip 20A, on which the first residual particle sink 40, 50 is located.
  • the second analysis step takes place in the illustrated and thus preferred embodiment of FIG. 4 on changed droplet motion paths, namely those in which the electrodes 22 'of smaller droplet size are correspondingly smaller.
  • the areas of the electrodes 22 'of the microchip 2OB are about% as large as the areas of the electrodes 22 of the microchip 20A and about four times as large as the areas of the electrodes 22' of the microchip 2OC.
  • a further microchip module 2OB is used, which has the smaller electrodes 22 '.
  • the electrodes can also be designed in the same size and interconnected to smaller and larger electrode surfaces.
  • the shape of the resulting surfaces may be square, rectangular or even round. In this way, the electrode surfaces on the substrate could be adapted at any point to the respective droplet size.
  • particle-free liquid droplets FO can be combined with a particle-containing liquid droplet F.
  • the liquid droplets can be cooled, heated or gassed, in particular on the microchip, in order to create optimum conditions for the target particles. Further, it is possible to move liquid droplets containing target or residual particles along a "holding loop" or to return them to a previous stage, the latter being realized for fine sorting on microchip 2OC for droplets of interest by means of corresponding movement paths 22G and 22H.
  • the architecture of the DMF chips for the treatment of the biological objects is preferably made modular. This not only allows a high degree of parallelization of the generated droplets, but also allows the transfer of droplets between the path ends of adjacent modules, so that further treatment steps can connect directly. Individual modules can be assigned different tasks, for instance because certain treatment steps do not or do not find room on the preceding modules. It is also possible to use modules that allow three-dimensional movement paths, so that liquid droplets can be treated in different, in particular parallel, planes and also transported from one plane to another plane.
  • Droplet Sources 32A Droplet Division Position 0 DMF Microchip 40 Droplet OA DMF Microchip 40 'Droplet Dump OB DMF Microchip 40 "Droplet Dump OC DMF Microchip 40'" Droplet Drop 1 Droplet Move Level 41 Droplet Tray 2 Electrodes 50 Droplets -Reading position 2 'electrodes 50' droplet passing position 2 "electrodes 50" droplet passing position 2A droplet moving paths 50 '"droplet passing position 2B droplet moving paths 60 control electronics 2C droplet moving paths 2D droplet moving paths A target particles 2E droplet moving paths B residual particles 2F droplet motion paths F liquid droplets 2G droplet motion paths F1 part droplets 2H droplet motion paths F2 part droplets 3 first path end FO particle free liquid droplet 4 second path end 5 third path end

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Abstract

Diese Anmeldung offenbart ein Verfahren zum Behandeln einer Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, sich voneinander unterscheidenden, insbesondere biologischen Objekten unter Verwendung mindestens eines Substrates und einer digitalen mikrofluidischen Schaltung oder Steuerung, die eine digitale mikrofluidische Tröpfchen-Bewegung ermöglicht, wobei Flüssigkeitströpfchen geeigneter Zusammensetzung aus Ziel- und Restpartikeln generiert werden, sowie jedes Flüssigkeitströpfchen in einer ersten Analyseposition auf das Vorhandensein mindestens eines Ziel- oder Restpartikels untersucht wird, wobei Flüssigkeitströpfchen ohne Zielpartikel nachfolgend über eine Restpartikelsenke von dem Substrat entfernt werden und Flüssigkeitströpfchen mit mindestens einem Zielpartikel oder einer vorgegebenen Mindestzahl an Zielpartikeln mittels des Substrates einer nächsten Behandlungsstufe zugeführt werden.

Description

VERFAHREN ZUM BEHANDELN EINER ZIEL- UND RESTPARTIKEL ENTHALTENDEN POPULATION VON IN FLÜSSIGKEITSTRÖPFCHEN SUSPENDIERTEN OBJEKTEN SOWIE VORRICHTUNG ZUM DURCHFÜHREN DIESES VERFAHRENS
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 und eine entsprechende Vorrichtung gemäß Anspruch 12. Demnach ist vorgesehen, vorzugsweise einzelne, insbesondere biologische, Objekte einer in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population zu behandeln unter Verwendung mindestens eines Substrates und einerelektronischen, insbesondere digitalen mikrofluidischen, Schaltung oder Steuerung, wodurch digitale mikrofluidische Tröpfchenbewegungen mittels digitaler Mikrofluidik ermöglicht werden.
TECHNOLOGISCHER HINTERGRUND
Eine wesentliche Zielsetzung zum Behandeln von in Flüssigkeiten suspendierten Populationen sich voneinander unterscheidender, insbesondere biologischer Objek- te aus Ziel- und Restpartikeln ist das Sortieren einer solchen Population in solche Objekte, die erwünscht sind oder gesucht werden, um diese weiter zu verwenden (Zielpartikel) und solche, deren Weiterverwendung nicht im Fokus stehen (Restpartikel). Zu diesem Zweck werden seit fast 40 Jahren so genannte Fluss-Zytometer verwendet, die eine tröpfchenbasierte Sortierung mittels eines fadenförmigen und vertikal gerichteten, kontrollierten Flüssigkeitsstromes nach dem so genannten Jet- in-air-Prinzip vornehmen. Der nach unten gerichtete Flüssigkeitsfaden wird mittels geeigneter Schwingungserreger in eine Perlenschnur kleinster Flüssigkeitströpfchen zerlegt, nachdem der Flüssigkeitsfaden mit optischen Methoden daraufhin analysiert wurde, an welchen Stellen er ein interessierendes biologisches Objekt, wie eine Zelle enthält. Nachfolgend werden die Flüssigkeitströpfchen durch ein e- lektrisches Feld in die ein oder andere Richtung abgelenkt, dies nach der Maßgabe, ob ein Flüssigkeitströpfchen eine gesuchte Zelle enthält oder nicht enthält. Auf diese Weise können gesuchte Zellen von nicht gesuchten Zellen getrennt gesammelt werden. Dieses Verfahren setzt voraus, dass nur eine äußerst geringe Zahl von Zellen, vorzugsweise nur eine Zelle in einem Tröpfchen vorliegt. Demzufolge müssen alle in der Flüssigkeit vorhandenen Zellen die Analyseposition einzeln durchlaufen. Dieses auch als FACS (Fluorecence-Activated Cell Sorting) bezeichnete Verfahren gestattet es z.B., menschliche Stammzellen aus Blutplasma zu gewin- nen. Auf diese Weise konnten durch so genanntes Hochgeschwindigkeitssortieren in kommerziellen FACS- Geräten über 40.000 Zellen je Sekunde sortiert werden. Dabei fallen z.B. etwa 6.000 Stammzellen je Stunde an. Höheren Gewinnungsraten und Sortiergeschwindigkeiten sind bei dieser Methode physikalische Grenzen gesetzt, die - im Falle der Sortierung von Zellen - bei etwa 100.000 Zellen pro Se- künde vermutet werden. Außerdem lassen sich systembedingt massive Aerosol- Bildung und hydrodynamische Belastungen nicht vermeiden.
Zur Erzielung deutlich höherer Zellsortiergeschwindigkeiten wurde daher vorgeschlagen (James F. Leary, ULTRA HIGH-SPEED SORTING, International Society for Analytical Cytology, Cytometry Part A 67A, Seite 67-85), Ultrahochgeschwindig- keitszellsortierung durch Kaskadierung zu erreichen, d.h., dass von einem Reservoir ausgehend die Zellverbände entlang von sich immer wieder teilenden Pfaden bis hin zu einer Vielzahl von Analysepunkten transportiert werden und jeder Analyseposition nachgeschaltet ein Sortierschritt erfolgt. Durch die Kaskadierung, wie sie u.a. in der WO03/060486 A1 beschrieben wird, wird unter anderem eine hochgradige Parallelisierung von Sortierschritten möglich, wodurch Sortiergeschwindigkeiten von 1.000.000 Zellen pro Sekunde erreichbar sein sollen.
Eine alternative Zeilsortierungsmethode zur Durchflusszytometrie beschreibt die Veröffentlichung von Irena Barbulovic-Nad et al, DIGITAL MICROFLUIDICS FOR CELL-BASED ASSAYS, veröffentlicht durch The Royal Society of Chemistry in Lab Chip, 2008, 8, Seiten 519 - 526. Danach werden eine Vielzahl von Zellen enthaltende Flüssigkeitströpfchen über die Oberfläche oder in einer Deckschicht eines Mikrochips, die in 7x7 mm große Elektroden unterteilt ist, nach der Elektrowetting Methode oder nach der Dielektrophorese Methode oder einer anderen Methode zum Generieren und Manipulieren von Mikrotröpfchen in einem digitalen mikroflui- dischen Substrat, von einem Reservoir ausgehend, zu bestimmten Positionen hin transportiert und mit Reagenzien, wie auch Farbstoffen, die auf gleiche Weise von Elektrode zu Elektrode transportiert, analysiert und/oder zusammengeführt werden. Die Methode der digitalen Mikrofluidik wird in der Veröffentlichung ULTRA HIGHSPEED SORTING als zukünftige Möglichkeit der Zellsortierung vorgeschlagen.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, mittels eines gattungsgemäßen Verfahrens Ziel- und Restpartikel enthaltende Populationen von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, sich von einander unterscheidenden, vorzugsweise einzelnen, insbesondere biologischen Objekten durch vergleichsweise wenige Prozessschritte zu behandeln. Dabei wird unter „Behandeln" im einfachsten Fall eine Sortierung in Ziel- und Restpartikel verstanden. Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 12 vorgeschlagen. Demnach ist hinsichtlich eines gattungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, zunächst Flüssigkeitströpfchen geeigneter Zusammensetzung aus Ziel- und Restpartikeln zu generieren. Jedes generierte Flüssigkeitströpfchen wird in einer ersten Analyseposition auf das Vorhandensein mindestens eines Ziel- oder Restpartikels untersucht. Flüssigkeitströpfchen ohne Zielpartikel werden nachfolgend über eine Restpartikelsenke von dem Substrat entfernt. Flüssigkeitströpfchen mit mindestens einem Zielpartikel werden mittels des Substrats einer zweiten Behandlungsstufe zugeführt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in weiteren Behandlungsstufen Proben bis zum Niveau einzelner Zellen/Partikel zu isolieren.
Zwar können Tröpfchenbewegungen in gewissem Umfang durch Schwerkraftein- fluss erreicht werden, doch ist vorzugsweise eine digitale mikrofluidische Tröpfchenbewegung (DMF) in der Weise vorgesehen, dass Potentiale zwischen Elektroden in einer Reihe, entlang der sich die Tröpfchen auf einer Oberfläche des Sub- strates oder in einer Schicht des Substrates bewegen können sollen, vorgesehen, wobei der Antrieb der Tröpfchen nach der Methode des Elektrowetting und in einem untergeordneten Verfahrensabschnitt auch nach der Methode der Dielektrophorese erfolgen kann. Beim Elektrowetting werden Kräfte durch nicht symmetrische Kontaktwinkel generiert. Bei der Dielektrophorese werden anziehende oder abstoßende Kräfte durch Polarisationseffekte in unregelmäßigen elektrischen Feldern hervorgerufen. Mittels DMF-Schaltkreisen ist es möglich, Flüssigkeitströpfchen zu bilden, zu transportieren, zu unterteilen und zu verbinden. Diese Hauptoperationen werden in der Veröffentlichung von Sung Kwon Cho et al „CREATING, TRANSPORTING, CUTTING, AND MERGING LIQUID DROPLETS BY ELECTROWETTING BASED ACTUATION FOR DIGITAL MICROFLUIDIC CIRCUITS" im Journal of Microe- lectrochemical Systems, Vol. 12, No. 1 , Februar 2003, Seiten 70 - 80, für das E- lektrowettingverfahren beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hier einbezogen wird.
Durch die Erfindung wird es möglich, auf eine große Vielzahl von Prozessschritten zu verzichten, weil Flüssigkeitströpfchen, die eine Population von biologischen Objekten enthalten, von denen aber keines als Ziel- respektive Restpartikel betrachtet wird, sofort über die Restpartikelsenke samt der Flüssigkeit des betroffenen Flüssigkeitströpfchen aus dem Prozess ausgesondert werden. Anders als bei der Durchflusszytometrie, bei der jedes in der Flüssigkeit vorhandene biologische Objekt, vorzugsweise vollständig, analysiert wird, also entsprechend viele Analyse- schritte erforderlich sind, wird durch die Erfindung eine ganz erhebliche Verminderung der Analyseschritte erreicht. Dieser Vorteil wird ebenso gegenüber der oben beschriebenen Kaskadierungsmethode erzielt. Nur die mit Zielpartikeln befrachteten Flüssigkeitströpfchen werden einer weiteren Behandlungsstufe zugeführt. Dabei können biologische sowie nicht biologische Objekte in einer Anzahl von 1 bis etwa 103 in einem einzelnen Flüssigkeitströpfchen vorliegen. Gegebenenfalls lässt sich die Anzahl noch erhöhen.
Unter „biologischen Objekten", für die das erfindungsgemäße Verfahren zum Einsatz kommt, zählen ganze Zellverbände, einzelne hochentwickelte Zellen, Zellbe- standteile, Chromosomen und auch mikrobiologische Objekte, wie z.B. Viren. Die Erfindung ist aber nicht auf die Behandlung von biologischen Objekten beschränkt, sondern auch für nicht biologische Populationen von Ziel- und Restpartikeln anwendbar. Unter „Behandeln" von Populationen biologischer Objekte wird neben dem Trennen auch das Durchführen chemischer Reaktionen, das Färben, das Wa- sehen, das Ausbleichen, das Hybridisieren und andere Behandlungsprozeduren an biologischen Objekten verstanden. Unter „Population" wird eine Mehrzahl von einander sich unterscheidenden Objekten verstanden.
Es ist nun auf verschiedene Weise möglich, die Erfindung auszuführen. Gemäß einer ersten Ausführungsform werden die in einer Flüssigkeit suspendierten biologischen Objekte, wie z.B. gemischte Zellverbünde, in einem Vorratsbehältnis oder in einem Zwischenbehältnis so in Bewegung gehalten oder aufbewahrt, dass sie nicht sedimentieren. Das Behältnis weist an mindestens einer Seite eine Öffnung, vorzugsweise eine Mehrzahl von voneinander beabstandeten Öffnungen oder Ports auf, deren Größe und Form so gewählt ist, dass an diesen Stellen aus dem Vorrat einzelne Flüssigkeitströpfchen geeigneter Größe aus dem Gesamtvolumen abgezogen oder herausgelöst werden können, wie es insbesondere in der Druckschrift „CREATING, TRANSPORTING, CUTTING, AND MERGING LIQUID DROPLETS BY ELECTROWETTING BASED ACTUATION FOR DIGITAL MICROFLUIDIC CIRCUITS (a.a.O.)" beschrieben ist. Dementsprechend ist es bevorzugt, wenn sich ein DMF-Chip mit seinen Kanälen oder Bahnen für den Tröpfchentransport direkt an die jeweiligen Ports des Vorratsbehältnisses anschließt. Auf diese Weise kann eine Vielzahl paralleler Tröpfchenpfade für den Tröpfchentransport bis hin zu einer Analyseposition genutzt werden. Auch können mehrere Mikrochips auf die gleiche Weise an derselben Seite oder an weiteren Stellen eines Voratsbehältnisses „angedockt" werden, z. B. um die Parallelisierung noch zu vergrößern.
In der Analyseposition wird festgestellt, ob das jeweilige Flüssigkeitströpfchen mindestens ein Zielpartikel oder eine minimale Zielpartikelkonzentration enthält. Bejahendenfalls wird dieses Flüssigkeitströpfchen entlang einer der Tröpfchen- Bewegungsbahnen auf dem Substrat in eine Weitergabeposition an einem Pfaden- de (Übergabepunkt) navigiert, an dem das Tröpfchen an eine weitere Behandlungsstufe abgegeben wird. Hierbei kann es sich um einen Zwischenbehälter handeln. Tröpfchen, die keine oder zu wenige Zielpartikel enthalten, werden in einen anderen Bewegungspfad gelenkt als die Tröpfchen mit Zielpartikeln. An dem Ende des Pfades für nicht interessierende Tröpfchen wird das Tröpfchen an eine Tröpf- chensenke übergeben. Hierbei kann es sich um einen Tröpfchenauffangbehälter handeln.
Wegen der Parallelisierung der Sortiervorgänge auf jedem Mikrochip kommt es bei zweidimensionaler Anordnung der die Tröpfchenbewegung hervorrufenden Elekt- roden zu Kreuzungen von Wegstrecken. Um hier Kollisionen von Ziel- und Restpartikeln zu vermeiden oder zumindest weitgehend auszuschließen, werden geeignete Sortieralgorithmen verwendet, die die Elektroden steuern. Wenn, wie bevorzugt, die Anzahl von biologischen Objekten in einem Flüssigkeitströpfchen derart gewählt wird, dass die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins eines Zielpartikels in dem Tröpfchen sehr gering ist, können somit sehr viele Tröpfchen als Ganzes verworfen werden. Dies führt zum Einen zu einer Verringerung des Sortieraufwandes. Zum Anderen werden dadurch die Häufigkeiten potentieller Tröpfchenkollisionen an sich kreuzenden Bewegungspfaden gering gehalten und der Steuerungsaufwand für die Tröpfchenbewegung somit verringert.
In den Analysepositionen können beliebige Analysen durchgeführt werden, wie z.B. mittels Fotodetektoren, die markierte Proben optisch, z.B. mittels Lichtstreuung und/oder Fluoreszenzmessung erkennen und deren Nachweis auf dem Niveau einzelner Zellen/Partikel ermöglichen. Es können auch Widerstandsmessungen zur Partikelgrößenbestimmung, z.B. nach dem Coulter-Prinzip (der Coulter-Counter detektiert Änderungen in der elektrischen Leitfähigkeit einer durch eine Blende be- obachteten, biologische Partikel enthaltenden Flüssigkeit) vorgenommen werden. Die Sortierung kann auch durch magnetische Aktivierung erfolgen.
Die Architektur der DMF-Chips zur Behandlung der biologischen Objekte wird vorzugsweise modular ausgestaltet. Dies ermöglicht nicht nur einen hohen Grad an Parallelisierung der generierten Tröpfchen, sondern gestattet auch die Übergabe von Tröpfchen zwischen den Pfadenden benachbarter Module, so dass weitere Behandlungsschritte sich unmittelbar anschließen können. Einzelnen Modulen können unterschiedliche Aufgaben zugeordnet werden, etwa weil auf den vorangehenden Modulen gewisse Behandlungsschritte nicht oder nicht mehr Platz finden. Ebenso ist es möglich, Module zu verwenden, die dreidimensionale Bewegungspfade ermöglichen, so dass Flüssigkeitströpfchen in unterschiedlichen, insbesondere parallelen Ebenen behandelt und auch von einer Ebene in eine andere Ebene transportiert werden können.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Behandlung einer Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten biologischen Objekten stufenweise derart vorgenommen, dass Flüssigkeitströpfchen mit nicht interessierenden Populationen nach der Detektion auf direktem Wege und ohne Kreuzung mit Bewegungspfaden für interessierende Flüssigkeits- tröpfchen der Restpartikelsenke zugeführt werden. Hierbei kann eine Restpartikelsenke für mehrere Tröpfchenports und entsprechend für mehrere Bewegungspfade auf dem Mikrochip verwendet werden. Vorzugsweise auf demselben Mikrochip fin- det danach eine Teilung der interessierenden Flüssigkeitströpfchen statt. Die Teiltröpfchen werden nachfolgend einzeln analysiert und nachfolgend in einer weiteren Restpartikelsenke gesammelt oder abgeführt, wenn sie nicht interessieren und der weiteren Behandlung zugeführt, wenn sie interessieren, also z.B. mindestens ein Zielpartikel enthalten. Die Tröpfchenteilung wird vorzugsweise auf demselben Mik- rochip durchgeführt, auf dem sich auch die erste Restpartikelsenke befindet. Grundsätzlich ist es aber auch möglich, die interessierenden Flüssigkeitströpfchen zunächst an einen weiteren Mikrochip zu übergeben und danach erst weiter zu behandeln.
Die Teiltröpfchen können an sich auch auf dem Mikrochip, auf dem die Tröpfchenteilung stattgefunden hat, weiterbehandelt werden, d.h. insbesondere in einer zweiten Analyseposition auf das Vorliegen von Zielpartikeln hin analysiert werden. Vorzugsweise findet dieser zweite Analyseschritt auf veränderten Tröpfchen- Bewegungspfaden statt, nämlich solchen, bei denen die Elektroden und ggf. deren Abstände der geringeren Tröpfchengröße entsprechend kleiner sind. Das kann grundsätzlich auf demselben Mikrochip stattfinden, auf dem eine Tröpfchenteilung bereits stattgefunden hat. Bevorzugt wird für die Weiterbehandlung allerdings ein anderes Mikrochipmodul verwendet, das kleinere Elektroden aufweist. Durch diese Verkleinerung der Elektrodengröße ist eine (überlagerte) Kaskadierung erreichbar, insbesondere eine Verdopplung der Bewegungspfade von einem Modul zum nächsten. Auf diese Weise kann eine Vereinzelung von Zielpartikeln schrittweise erfolgen.
Zudem können die Elektroden auch in gleicher Größe ausgeführt und zu kleineren und größeren Elektrodenflächen zusammengeschaltet werden. Die Form der resultierenden Flächen kann quadratisch, rechteckig oder auch rund sein. Auf diese Weise könnten die Elektrodenflächen auf dem Substrat an jeder Stelle an die jeweilige Tröpfchengröße angepasst werden.
Wenn die Tröpfchengröße aufgrund mehrfacher Tröpfchenteilung so gering wird, dass der Tröpfchentransport und/oder die in den Tröpfchen enthaltenden Zielparti- kel unter der geringen Flüssigkeitsmenge leiden, können nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung partikelfreie Flüssigkeitströpfchen mit einem partikelenthaltenden Flüssigkeitströpfchen vereint werden. Hierbei wird unter partikelfreiem Flüssigkeitströpfchen verstanden, dass in diesem Flüssigkeitströpfchen keine den Behandlungsvorgang oder das Behandlungsziel störenden Objekte vorliegen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Flüssigkeitströpfchen, insbesondere auf dem Mikrochip, gekühlt, erwärmt, oder begast werden, um optimale Bedingungen für die Zellen I mit dem Ziel zu schaffen, deren Verände- rung oder Absterben während des Sortierens möglichst weitgehend zu vermeiden.
Weiter ist es möglich, Ziel- oder Restpartikel enthaltende Flüssigkeitströpfchen entlang einer „Warteschleife" zu bewegen und/oder sie in eine vorangehende Stufe zurück zu führen. So können bei sehr kleinen Probenvolumina mit nur geringer An- zahl an Zielpartikeln Mehrfachuntersuchungen durchgeführt und insbesondere der Verlust solcher Partikel vermieden oder in engen Grenzen gehalten werden.
Weiterhin kann es von Vorteil sein, die Tröpfchengröße, die Zahl an biologischen Objekten je Tröpfchen und Analyseeinstellungen in einer Vorsortierungsstufe zu definieren. So ist es möglich, anhand der prozentualen Verteilung der in der Gesamtpopulation vorhandenen interessierenden Zellen optimale Werte für die Tröpfchengröße und die Zellzahl/Tröpfchen in für das System vorgegebenen Grenzen zu definieren. Z.B. wählt man hohe Zellzahl/Tröpfchen bei geringen prozentualen Anteilen an interessierenden Zellen und einer gleichzeitig großen Gesamtpopulation und geringe Zellzahl/Tröpfchen bei hoher Konzentration an interessierenden Zellen.
Ebenso kann anhand der prozentualen Verteilung bestimmt werden, ab welchem späteren Teilungsschritt Detail-Analysen erfolgen sollen, z.B. ab ca. 10 Zellen/Tröpfchen.
Ferner kann man, insbesondere in der Vorsortierstufe, Sortiermodi wie Reinheit, Verunreinigungen (z.B. nicht vitale Zellen oder Zellbruchstücke), Zuordnung der Zellpopulationen und der angestrebten Anzahl von Zellen zu Sammelgefäßen (Mischungen/Serien von gleichen oder ungleichen Zellzahlen) definieren. Je nach Startbeladung der einzelnen Tröpfchen würden diese nun in mehr oder weniger vielen Stufen analysiert, geteilt und vorsortiert. Tröpfchen ohne interessierende Zellen können früh aussortiert und dem Abfall zugeführt werden. Tröpfchen mit mindestens einer interessierenden Zelle können in Richtung Sammelgefäß navigiert werden. Sollte die Analyse, ob z.B. in einem Tröpfchen mindestens eine interessierende Zelle vorhanden ist, zweifelhaft sein, kann das System anhand der Voranalyse entscheiden, ob das Tröpfchen verworfen oder einem weiteren Analyse- und Teilungsvorgang zugeführt wird.
Während des Sortiervorgangs, falls z.B. wegen zu hoher Zellkonzentration zu oft zweifelhafte Analyse-Ergebnisse vorliegen, können bestimmte Sortierparameter vom System auch selbstlernend weiter optimiert werden. In diesem Fall sollte die Zellzahl bei der ersten Generierung der Tröpfchen niedriger gewählt werden. Sollte bei der Vorsortierung festgestellt werden, dass sich in einem Tröpfchen mehrere Zellen befinden und dass diese zu der gleichen Zielpopulation gehören, kann dieses Tröpfchen ohne weitere Analyse und Teilung dem Ziel-Sammelgefäß zugeführt werden.
Sollten Tröpfchen nach Teilungen zu klein werden für die vorgegebene Elektrodengröße, können diese Tröpfchen mit Tröpfchen ohne Zellen zusammengeführt werden. Wenn die Zellzahl/Tröpfchen in etwa auf Einzelzellniveau liegt, werden die Tröpfchen mit den ermittelten Zellen von Interesse in der Feinsortierstufe den Ziel-Sammelgefäßen zugeführt. Ebenso können Tröpfchen mit Zellen von Interesse direkt von der Feinsortierstufe, unter Umgehung der Sammelgefäße, zu speziellen Modulen navigiert werden.
Für besondere Anwendungen kann das System mit Zusatzmodulen erweitert werden, wie Warteschleifen, Färben, Waschen und Ausbleichen. Die Messung schwacher, spezifischer Fluoreszenz-Signale kann mittels Ausbleichung verbessert werden, indem das beständigere Autofluoreszenzsignal der Zellen ermittelt und von der anfangs ermittelten Summe aus Autofluoreszenz und spezifischer Fluoreszenz subtrahiert wird.
Weiterhin können Module verwendet werden, z.B. für Bildanalyse und darauf aufbauende manuelle Sortierentscheidungen, für Zellassays an Zellpopulationen, Einzelzellen oder Zellkomponenten, für Zeil-Fusionierung, für Polymerase- Kettenreaktion (PCR), für Genexpressions-Analyse (BioChip). Diese Module können sowohl bei den Vorsortierstufen als auch bei der Feinsortierung eingesetzt werden.
Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen, erfindungsgemäß zu verwendenden Bauteile unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, sowie aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Zeichnungen, in denen - beispielhaft - Ausführungsbeispiele von Sortiervorrichtungen dargestellt sind. Auch einzelne Merkmale der Ansprüche oder der Ausführungsformen können mit anderen Merkmalen anderer Ansprüche und Ausführungsformen kombiniert werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
In der Zeichnung zeigen
Fig. 1 die erste Stufe einer Sortiervorrichtung in schematischer Darstellung;
Fig. 2 eine weitere Ausführungsform einer Sortiervorrichtung;
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines DMF-Chips im Vertikalschnitt; Fig. 4 eine modulare Sortiervorrichtung;
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Gemäß dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 ist vorgesehen, zunächst Flüssigkeitströpfchen geeigneter Zusammensetzung aus Ziel- und Restpartikeln an Öffnungen oder Ports 3A bis 3D aus einem Behälter 2 herauszulösen, d.h. zu generieren. Jedes generierte Flüssigkeitströpfchen wird über ein DMF-Mikrochip 20 mittels Elektroden 22 in eine erste Analyseposition 3OA bewegt und dort auf das Vorhandensein mindestens eines Ziel- oder Restpartikels untersucht. Flüssigkeitströpfchen ohne Zielpartikel werden nachfolgend über eine Restpartikel- oder Tröpfchensenke 40 von dem Substrat entfernt. Flüssigkeitströpfchen mit mindestens einem Zielpartikel werden mittels des Substrats einer zweiten Behandlungsstufe zugeführt. Hier- zu kann ein Zwischenbehälter 4 vorgesehen sein
Zur Tröpfchenbewegungen ist vorzugsweise eine digitale mikrofluidische Tröpfchenbewegung (DMF) in der Weise vorgesehen, dass Potentiale zwischen Elektroden 22 einer Reihe (Tröpfchen-Bewegungspfad 22A) entlang einer Oberfläche des Substrates (Mikrochip 20, siehe Fig.2) oder in einer Schicht des Substrates (Tröpfchen-Bewegungs-Ebene 21 ) bewegen sollen, wobei der Antrieb der Tröpfchen unter anderem nach der Methode des Elektrowetting und/oder der Dielektrophorese erfolgen kann. Mittels an sich bekannter DMF-Schaltkreise ist dies möglich.
Nur die mit Zielpartikeln befrachteten Flüssigkeitströpfchen werden einer weiteren Behandlungsstufe zugeführt. Dabei können biologische sowie nicht biologische Objekte in einer Anzahl von 1 bis 103, ggf. auch darüber hinaus, in einem einzelnen Flüssigkeitströpfchen vorliegen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform werden die in einer Flüssigkeit suspendierten biologischen Objekte, wie z.B. gemischte Zellverbünde, in einem Vorratsbehältnis (Behälter 2) so in Bewegung gehalten oder aufbewahrt, dass sie nicht sedimentie- ren. Die voneinander beabstandeten Öffnungen oder Ports 3A1... sind in ihrer Größe und Form so gewählt ist, dass an diesen Stellen aus dem Vorrat einzelne Flüssigkeitströpfchen geeigneter Größe aus dem Gesamtvolumen abgezogen oder herausgelöst werden können. Dementsprechend ist der DMF-Mikrochip 20 mit seinen Kanälen oder Bahnen für den Tröpfchentransport (Tröpfchen-Bewegungspfade 22A) direkt an die jeweiligen Ports 3A1... des Vorratsbehältnisses angedockt.
In den Analysepositionen 3OA wird festgestellt, ob das jeweilige Flüssigkeitströpfchen mindestens ein Zielpartikel oder eine minimale Zielpartikelkonzentration ent- hält. Bejahendenfalls wird dieses Flüssigkeitströpfchen entlang eines der Tröpfchen-Bewegungspfades 22B auf dem Substrat in eine Weitergabeposition 50 an einem Pfadende 25 (Übergabepunkt) navigiert, an dem das Tröpfchen an eine weitere Behandlungsstufe abgegeben wird. Hierbei kann es sich um einen Zwischenbehälter 4 handeln. Tröpfchen, die keine oder zu wenige Zielpartikel enthalten, werden über andere Bewegungspfade 22C gelenkt als die Tröpfchen mit Zielpartikeln. An dem oder den Ende/n 24 dieses/dieser Pfade/s 22C für nicht interessierende Tröpfchen werden die Tröpfchen über mindestens eine Tröpfchensenke 40 an einen Tröpfchenauffangbehälter 41 übergeben.
Um Kollisionen von Ziel- und Restpartikeln zu vermeiden oder zumindest weitgehend auszuschließen, werden geeignete Sortieralgorithmen verwendet, die die E- lektroden 22 steuern.
Die Betriebsweise dieser beispielhaften Anordnung ist die, dass aus einem großen Reservoir (Behälter 2) markierte Zellen bzw. Mikropartikel zusammen mit nicht markierten Zellen bzw. Mikropartikeln in einer umgebenden Flüssigkeit abgeholt und auf beliebig vielen parallelen Wegstrecken zu den Analyseeinheiten (erste Analysepositionen 30A) gebracht werden, was durch einen elektrodynamischen Antrieb wie das Elektrowetting, geschieht. Hierzu sind entlang der vorgesehenen Tröpf- chen-Bewegungspfade 22A nacheinander Elektroden 22 auf einem nicht dargestellten DMF Mikrochip 20 angeordnet und so gesteuert, dass die Tröpfchen über ein wanderndes elektrisches Potential in die vorgegebene Richtung gezogen werden. Dieser Vorgang kann auf nach oben offenen Bahnen, aber auch entlang von Kanälen oder zwischen mit vertikalem Abstand von einander angeordneten Elektroden tragenden Flächen des DMF-Mikrochips geschehen. In dem in Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel sind Verzweigungen der Tröpfchenbewegungspfade 22A in Gestalt von Kreuzungen oder T-Verbindungen vorgesehen. Ein quer zu dem ersten Tröpfchenbewegungsfaden 22A verlaufender Bewegungspfad 22B schafft eine direkte Verbindung zu einem Zwischenbehälter 4 für interessierende Zellen, die an einer Tröpfchen-Weitergabeposition 50 am Pfadende 25 übergeben werden, während die dritten Tröpfchen-Verbindungspfade 22C eine Verbindung zu einem Tröpf- chen-Auffangbehälter 41 für nicht interessierende Zellen herstellen, die an Tröpfchensenken 40 an den Pfadenden 24 übergeben werden.
Die nach unten gerichteten Pfeile und Punkte deuten an, dass sich weitere Sortiermodule anschließen können. Die nach rechts weisenden Punkte nebst Pfeil deuten an, dass sich auf demselben Mikrochip weitere Ports und Tröpfchen- Bewegungspfade befinden können, oder sich weitere Sortiermodule dieser Stufe anschließen können, die ihre Zellen enthalten Tröpfchen aus demselben oder einem parallel geschaltetem Reservoir beziehen können, um die Parallelisierung und damit die Sortierleistung erhöhen.
Die Figur 2 zeigt beispielhaft eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung nach Figur 1 , welche alternativ verwendbar ist oder die in einem dem ersten Sortierschritt z.B. nach Figur 1 folgenden weiteren Sortierschritt - ggf. nach zwischengeschalteten Zwischensortiersch ritten - verwendet werden kann. Der Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel besteht darin, dass sich eine weitere Sortierstufe an das Pfadende 25 des Tröpfchenbewegungspfades 22B anschließen kann. Zu diesem Zweck ist an dem Pfadende eine weitere Analyseposition 3OB vorgesehen, die in dem dargestellten und insoweit bevorzugten Fall eine Differenzierung zwischen einer Mehrzahl interessierender Zellen vornehmen kann, die nachfolgend über Tröpfchen-Bewegungspfade 22D und 22E in Sammelbehälter Gr.1 - Gr.5 je nach Eigenschaft der Zelle oder deren Komponenten gesammelt werden. Auch diese Tröpfchenbewegungspfade und Analyseposition können auf dem strichpunktiert angedeutetem DMF Mikrochip vorgesehen sein.
Alternativ zu den Ausführungsformen nach Figur 1 und 2, kann auch der Tröpf- chenauffangbehälter 41 für nicht interessierende Objekte über einen Sammelpfad 22F (in Entsprechung des Sammelpfades 22B für interessierende Objekte) geführt werden. Dies ist beispielhaft als alternatives Detail zu Figur 1 dargestellt. Eine solche „BUS"-Leitung für gleichwertige Tröpfchen vermindert den Steuerungsaufwand.
Das Detektionsprinzip wird in Figur 3 beispielhaft verdeutlicht. Die mikrofluidische Tröpfchenbewegungspfade sind als Kanäle auf einem CMOS Chip (Siliziumsubstrat) eingebettet. Darin lassen sich die Elektroden unterbringen und elektrisch ansteuern. In dem dargestellten Beispiel sind Fotodetektoren auf Siliziumbasis mit einem strukturierten Farbfilter ebenfalls in dieser Schicht angebracht. Die Tröpfchen mit den Populationen an biologischen Objekten laufen zwischen Silizium und z.B. einem Glassubstrat als Deckel. Über den Glasdeckel kann dann das Anregungslicht mittels Glasfasern, etc. eingekoppelt werden. Die Elektroden lassen sich beispielsweise auch optisch transparent realisieren.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung nach Figur 4 wird die Behandlung einer Population von in Flüssigkeitströpfchen (F) suspendierten biologischen Objekten aus Ziel- und Restpartikeln stufenweise derart vorgenommen, dass Flüssigkeitströpfchen mit nicht interessierenden Populationen nach der Detektion bei 3OA auf direktem Wege und ohne Kreuzung mit Bewegungspfaden für interessie- rende Flüssigkeitströpfchen der Restpartikelsenke 40 zugeführt werden. Hierbei kann eine einzige Restpartikelsenke für mehrere Tröpfchenports 3 und entsprechend für mehrere Tröpfchen-Bewegungspfade 22A auf dem Mikrochip 2OA, 2OB, 2OC verwendet werden. Vorzugsweise auf demselben Mikrochip findet danach eine Teilung der interessierenden Flüssigkeitströpfchen bei 32A statt. Die Teiltröpfchen F1, F2 werden nachfolgend einzeln bei 3OC analysiert und nachfolgend in einer weiteren Restpartikelsenke 40'; 50' gesammelt oder abgeführt, wenn sie nicht interessieren, der weiteren Behandlung zugeführt, wenn sie interessieren, also z.B. min- destens ein Zielpartikel enthalten. Die Tröpfchenteilung wird vorzugsweise auf demselben Mikrochip 2OA durchgeführt, auf dem sich auch die erste Restpartikelsenke 40, 50 befindet.
Der zweite Analyseschritt findet bei dem dargestellten und insofern bevorzugten Ausführungsbeispiel nach Fig. 4 auf veränderten Tröpfchen-Bewegungspfaden statt, nämlich solchen, bei denen die Elektroden 22' der geringeren Tröpfchengröße entsprechend kleiner sind. In dem Beispiel nach Fig. 4 sind die Flächen der Elektroden 22' des Mikrochips 2OB etwa % so groß wie die Flächen der Elektroden 22 des Mikrochips 2OA und etwa vier mal so groß wie die Flächen der Elektroden 22' des Mikrochips 2OC. Für die Weiterbehandlung wird ein weiteres Mikrochipmodul 2OB verwendet, dass die kleineren Elektroden 22' aufweist. Durch diese Verkleinerung der Elektrodengröße wird eine (überlagerte) Kaskadierung erreicht, in dem die Bewegungspfade von einem Modul zum nächsten jeweils etwa verdoppelt werden. Auf diese Weise kann eine Vereinzelung von Zielpartikeln schrittweise erfolgen.
Zudem können die Elektroden auch in gleicher Größe ausgeführt und zu kleineren und größeren Elektrodenflächen zusammengeschaltet werden. Die Form der resultierenden Flächen kann quadratisch, rechteckig oder auch rund sein. Auf diese Weise könnten die Elektrodenflächen auf dem Substrat an jeder Stelle an die jeweilige Tröpfchengrösse angepasst werden.
Wenn die Tröpfchengröße aufgrund mehrfacher Tröpfchenteilung so gering wird, dass der Tröpfchentransport und/oder die in den Tröpfchen enthaltenden Zielparti- kel unter der geringen Flüssigkeitsmenge leiden, können partikelfreie Flüssigkeitströpfchen FO mit einem partikelenthaltenden Flüssigkeitströpfchen F vereint werden.
Die Flüssigkeitströpfchen können, insbesondere auf den Mikrochip, gekühlt, er- wärmt oder begast werden, um optimale Bedingungen für die Zielpartikel zu schaffen. Weiter ist es möglich, Ziel- oder Restpartikel enthaltende Flüssigkeitströpfchen entlang einer „Warteschleife" zu bewegen oder sie in eine vorangehende Stufe zurück zuführen. Letzteres ist für die Feinsortierung auf Mikrochip 2OC für interessierende Tröpfchen mittels entsprechender Bewegungspfade 22G und 22H verwirklicht.
Die Architektur der DMF-Chips zur Behandlung der biologischen Objekte wird vorzugsweise modular ausgestaltet. Dies ermöglicht nicht nur einen hohen Grad an Parallelisierung der generierten Tröpfchen, sondern gestattet auch die Übergabe von Tröpfchen zwischen den Pfadenden benachbarter Module, so dass weitere Behandlungsschritte sich unmittelbar anschließen können. Einzelnen Modulen können unterschiedliche Aufgaben zugeordnet werden, etwa weil auf den vorangehenden Modulen gewisse Behandlungsschritte nicht oder nicht mehr Platz finden. Ebenso ist es möglich, Module zu verwenden, die dreidimensionale Bewegungspfade ermöglichen, so dass Flüssigkeitströpfchen in unterschiedlichen, insbesonde- re parallelen Ebenen behandelt und auch von einer Ebene in eine andere Ebene transportiert werden können.
BEZUGSZEICHENLISTE:
2 Behälter 3OA erste Analyseposition
3A, B, ... Ports 3OB zweite Analyseposition
Zwischenbehälter 3OC dritte Analyseposition
11 Tröpfchen-Quellen 32A Tröpfchen-Teilungsposition 0 DMF-Mikrochip 40 Tröpfchensenke OA DMF-Mikrochip 40' Tröpfchensenke OB DMF-Mikrochip 40" Tröpfchensenke OC DMF-Mikrochip 40'" Tröpfchensenke 1 Tröpfchen-Bewegungs-Ebene 41 Tröpfchen-Auffangbehälter 2 Elektroden 50 Tröpfchen-Weitergabeposition 2' Elektroden 50' Tröpfchen-Weitergabeposition 2" Elektroden 50" Tröpfchen-Weitergabeposition 2A Tröpfchen-Bewegungspfade 50'" Tröpfchen-Weitergabeposition 2B Tröpfchen-Bewegungspfade 60 Steuerungselektronik 2C Tröpfchen-Bewegungspfade 2D Tröpfchen-Bewegungspfade A Zielpartikel 2E Tröpfchen-Bewegungspfade B Restpartikel 2F Tröpfchen-Bewegungspfade F Flüssigkeitströfchen 2G Tröpfchen-Bewegungspfade F1 Teiltröpfchen 2H Tröpfchen-Bewegungspfade F2 Teiltröpfchen 3 erstes Pfadende FO partikelfreie Flüssigkeitströpf- 4 zweites Pfadende chen 5 drittes Pfadende

Claims

ANSPRÜCHE:
1. Verfahren zum Behandeln, insbesondere zur stufenweisen Analyse und /oder Sortierung, einer Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, sich voneinander unterscheidenden, insbesondere biologischen, vorzugsweise einzelnen Objekten unter Verwendung mindestens eines Substrates und einer elektronischen, insbesondere digitalen mikrofluidischen Steuerung oder Schaltung, die eine digitale mikrofluidische Tröpfchen-Bewegung ermöglicht,
dadurch gekennzeichnet,
dass Flüssigkeitströpfchen geeigneter Zusammensetzung aus Ziel- und Restpartikeln generiert werden,
dass jedes Flüssigkeitströpfchen in einer ersten Analyseposition auf das Vorhandensein mindestens eines Ziel- oder Restpartikels untersucht wird,
dass Flüssigkeitströpfchen ohne Zielpartikel nachfolgend über eine Restpar- tikelsenke von dem Substrat entfernt werden und
dass Flüssigkeitströpfchen mit mindestens einem Zielpartikel oder einer vorgegebenen Mindestzahl an Zielpartikeln mittels des Substrates einer zweiten Behandlungsstufe zugeführt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sich ein DMF- Chip mit seinen Kanälen oder Bahnen für den Tröpfchentransport direkt an die jeweiligen Ports des Vorratsbehältnisses anschließt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitströpfchen entlang einer der Tröpfchen-Bewegungsbahnen auf dem Substrat in eine Weitergabeposition an einem Pfadende (Übergabepunkt) navigiert werden, an dem das Tröpfchen an eine weitere Behandlungsstufe abgegeben wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass für den Transport von Flüssigkeitströpfchen mehrere DMF-Chip-Module am
Ende von Pfaden für interessierende und/oder nicht interessierende Flüssigkeitströpfchen an einander angedockt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass am Ende von Pfaden für interessierende und/oder nicht interessierende Flüssigkeitströpfchen die Flüssigkeitströpfchen an ein weiteres DMF-Chip-Modul übergeben werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl von biologischen Objekten in einem Flüssigkeitströpfchen derart gewählt wird, dass die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins eines Ziel- partikels in dem Tröpfchen vergleichsweise gering ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Flüssigkeitströpfchen mit nicht interessierenden Populationen nach der De- tektion auf direktem Wege und ohne Kreuzung mit Bewegungspfaden für interessierende Flüssigkeitströpfchen der Restpartikelsenke zugeführt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass, insbesondere auf demselben Mikrochip, nach einem Sortierschritt eine
Teilung der interessierenden Flüssigkeitströpfchen stattfindet und die einzelnen Teiltröpfchen nachfolgend analysiert und nachfolgend in einer weiteren Restpartikelsenke gesammelt oder abgeführt werden, wenn sie nicht interessieren und der weiteren Behandlung zugeführt, wenn sie interessieren.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Tröpfchen-Teilungsschritt ein weiterer Analyseschritt auf veränderten Tröpfchen- Bewegungspfaden stattfindet, insbesondere auf solchen, bei denen die E- lektroden der geringeren Tröpfchengröße entsprechend kleiner sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Partikel enthaltende mit partikelfreien Flüssigkeitströpfchen auf dem DMF-
Chip vereint werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Ziel- oder Restpartikel enthaltende Flüssigkeitströpfchen entlang einer „Warteschleife" bewegt oder sie in eine vorangehende Stufe zurückgeführt werden.
12. Vorrichtung zum Behandeln, insbesondere zur stufenweisen Analyse und/oder Sortierung einer Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, sich voneinander unterscheidenden, insbesondere biologischen, vorzugsweise einzelnen Objekten unter Verwendung mindestens eines Substrates und einer elektronischen, insbesondere digitalen mikrofluidischen Steuerung oder Schaltung, die eine digitale mikrofluidische Tröpfchen-Bewegung ermöglicht,
mit einem Mikrochip (20)
mit einer Tröpfchen-Bewegungs-Ebene (21) mit Pfaden (22A), entlang derer Flüssigkeitströpfchen (F) wahlweise in vorgebbare unterschiedliche Positio- nen bewegbar sind
mit einer oder mehreren Tröpfchen-Quelle/n (11) und der Zahl der Tröpfchen-Quellen entsprechenden ersten Pfadenden (23)
mit mindestens einer ersten Analyseposition (30A) je Pfad (22A), mit mindestens einer Tröpfchensenke (40) an mindestens einem zweiten Pfadende (24),
mit mindestens einer Tröpfchen-Weitergabeposition (50) an mindestens ei- nem dritten Pfadende (25) sowie
mit einer Steuerungselektronik (60) zum Bewegen eines Flüssigkeitströpfchens zum zweiten oder dritten Pfadende hin, abhängig von einer in der Analyseposition (30) festgestellten Partikel-Population in diesem Flüssig- keitströpfchen (F).
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere mo- dulare DMF-Mikrochips aneinander angedockt sind und an beiderseitigen Enden von Tröpfchen-Bewegungspfaden (22A, 22B, 22C) Tröpfchen- Weitergabestellen zwischen den DMF-Modulen bilden.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass ineinander übergehende Tröpfchen-Bewegungspfade unterschiedlich breit sind, insbesondere nachfolgende Tröpfchen-Bewegungspfade etwa halb so breit wie vorausgehende Tröpfchen-Bewegungspfade sind.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Tröpfchensenken (40) jeweils zwischen benachbarten Tröpfchen- Bewegungspfaden (22A) angeordnet sind.
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