WO2010101256A1 - 放線菌由来の耐熱性トランスグルタミナーゼ - Google Patents

放線菌由来の耐熱性トランスグルタミナーゼ Download PDF

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WO2010101256A1
WO2010101256A1 PCT/JP2010/053683 JP2010053683W WO2010101256A1 WO 2010101256 A1 WO2010101256 A1 WO 2010101256A1 JP 2010053683 W JP2010053683 W JP 2010053683W WO 2010101256 A1 WO2010101256 A1 WO 2010101256A1
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mutation
amino acid
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acid sequence
seq
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PCT/JP2010/053683
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基孝 鈴木
雅代 伊達
敬一 横山
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味の素株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Definitions

  • the present invention relates to a mutant protein of actinomycete-derived transglutaminase (TG).
  • Transglutaminase also simply referred to as TG
  • TG is widely used in food processing and the like because it forms a gel-like substance by forming a crosslink between proteins.
  • Mutant TG with improved transglutaminase activity and thermal stability contributes to the reduction of the required amount and can be used in high temperature regions, thus enabling the application of this enzyme to new fields.
  • Transglutaminase is an enzyme that catalyzes an acyl transfer reaction of a ⁇ -carboxamide group in a peptide chain of a protein. When this enzyme is allowed to act on a protein, ⁇ - ( ⁇ -Glu) -Lys cross-linking reaction and substitution reaction to Glu by deamidation of Gln can occur.
  • transglutaminase an animal-derived one and a microorganism-derived one have been known so far. The former is a Ca 2+ -dependent enzyme and is distributed in animal organs, skin, blood and the like.
  • Non-patent document 1 there are guinea pig liver transglutaminase (Non-patent document 1), human epidermal keratinocyte transglutaminase (Non-patent document 2), human blood coagulation factor XIII (Non-patent document 3), and the like.
  • Non-patent document 2 the thing of Ca ⁇ 2+> independent was discovered from the microbe of Streptoberticillium genus. Examples include Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. Cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense, etc. .
  • transglutaminase found in the culture supernatant of a Streptoberticillium mobaraens variant is called MTG (Microbial Transglutaminase).
  • MTG Microbial Transglutaminase
  • Ca 2+ -independent transglutaminase has also been discovered from Streptomyces lydicus NRRL B-3446 (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 As a result of peptide mapping and gene structure analysis, it has been found that the primary structure of transglutaminase produced by these microorganisms has no homology with those derived from animals (Patent Document 2).
  • MTG is a monomeric protein consisting of 331 amino acids and having a molecular weight of about 38,000 (Non-patent Document 4). Since MTG is produced through a purification operation from a culture such as the above fungi, there are problems in terms of supply amount, efficiency, and the like. Attempts have also been made to produce transglutaminase by genetic engineering techniques. Escherichia coli (E.
  • transglutaminase derived from microorganisms such as MTG is independent of Ca 2+ , so it can be used to produce gelled foods such as jelly, yogurt, cheese, or gel cosmetics.
  • Patent Document 6 It is used to improve meat quality (Patent Document 6).
  • it is an enzyme with high industrial applicability, such as being used for the production of heat-stable microcapsule materials and immobilized enzyme carriers.
  • the enzyme reaction conditions for example, in the case of gelled food, if the enzyme reaction time is short, it does not harden. Conversely, if the reaction time is too long, it becomes too hard and does not become a commercial product. Therefore, when MTG is used for the production of gelled foods such as jelly, yogurt, cheese, or gel cosmetics, and for improving meat quality, etc., by adjusting the concentration of substrate and enzyme, reaction temperature, and reaction time, The object is being made.
  • foods and reagents that use MTG are diversified, it may not be possible to produce the target product simply by adjusting the concentration, temperature, time, etc., and the need to modify the enzyme activity of MTG arises. ing.
  • Wild type MTG (wild type MTG means a naturally occurring MTG that has not been altered in amino acid sequence) is known to be stable between about pH 4-10, Although it can be said to be stable over a wide pH range, it is difficult to react under extremely acidic or alkaline conditions. Moreover, the optimum temperature of wild-type MTG is about 50 ° C., and it is difficult to react at an excessively high temperature. Moreover, even at a temperature lower than the optimum temperature, the enzyme activity can be reduced by incubation for a long time. Therefore, if there is a mutant transglutaminase having improved pH stability, thermal stability, etc., it is considered that transglutaminase can be used for a novel purpose.
  • MTG has been mainly used in the food field, but it has been suggested that it can be used in various applications such as fibers, chemical products (photographic films, tanning), feeds, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • Skin tanning is the process of processing / processing animal skins (hide / skin) in multiple steps to make the leather durable and flexible leather. This is done by cross-linking the skin collagen with hexavalent chromium. Hexavalent chromium is harmful and undesirable for release into the environment, so there is a strong demand for the development of alternative methods.
  • transglutaminase for skin tanning, it is disclosed in Patent Document 8 that microbial-derived transglutaminase can be used for skin tanning, but there are no examples of actual action on skin, and it has not yet been put into practical use. . Since cross-linking with hexavalent chromium is carried out at pH 3-4, it would be preferable if transglutaminase can also react at this pH, but MTG is weakly acidic, so actual adaptation is difficult.
  • the thermal stability i.e. heat resistance
  • the reaction is completed in a short time at a high temperature
  • the pH stability is improved
  • the acidic region is used. It is desired to enable the reaction of
  • means for modifying and improving the enzyme activity of transglutaminase include modification of transglutaminase itself, that is, improvement of thermal stability of transglutaminase, improvement of pH stability, and the like.
  • thermal stability it is possible to expect a wider range of applications and an improved reaction rate.
  • pH stability enzyme reaction and storage in a wider pH range will be possible. This will also be advantageous in industrialization.
  • Patent Document 9 discloses a mutant transglutaminase in which a disulfide bond is introduced into a wild type transglutaminase.
  • Patent Document 9 in the sequence of MTG, a) substitution with cysteine at positions 7 and 58, b) substitution of cysteine at positions 46 and 318, c) substitution to cysteine at positions 93 and 112, d) substitution of cysteines at positions 106 and 213; e) substitution of cysteines at positions 160 and 228; f) substitution of cysteines at positions 2 and 282; g) substitution of cysteines at positions 2 and 283; h) a protein having transglutaminase activity having at least one mutation selected from substitution with cysteine at positions 3 and 283, and i) substitution with cysteine at positions 17 and 330, a polynucleotide encoding them, Disclosed is a recombinant vector containing the polynucleotide, a host cell transformed with the vector, a
  • the mutant transglutaminase in which a disulfide bond is introduced into the above MTG shows some improvement in heat resistance and / or pH stability, but in order to withstand the high temperatures used for fiber processing, etc. Improvement is desired.
  • Non-Patent Document 5 describes several MTG mutants, but the heat resistance of these mutants is insufficient for use at high temperatures such as those used in fiber processing and the like.
  • An object of the present invention is to provide a wild type (hereinafter also simply referred to as WT) transglutaminase or a mutant transglutaminase in which a disulfide bond is introduced into WT transglutaminase described in Patent Document 9 (hereinafter simply referred to as “disulfide bond-introduced transglutaminase”). It is to provide a transglutaminase mutant protein having improved heat resistance compared to that of an enzyme, and to enable an enzymatic reaction at a high temperature in a short time.
  • the present inventors have further introduced a mutation into the disulfide bond-introduced transglutaminase gene described in Patent Document 9 to obtain the original disulfide bond-introduced transglutaminase and
  • the present invention has completed the present invention by providing a transglutaminase mutant protein having improved heat resistance.
  • the mutant protein of the present invention enables an enzymatic reaction at a high temperature in a short time, and is suitable for fiber processing, leather tanning and the like.
  • amino acid sequence having a mutation at at least one selected position or (D) in the sequence of (C), a position other than the position corresponding to position 3, 101, 157, 250 or 283 of SEQ ID NO: 2 And amino acid sequences having 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions.
  • a protein having transglutaminase activity and having the following amino acid sequence of A, B, C or D (A) an amino acid sequence having a mutation to cysteine at positions 2 and 282 in SEQ ID NO: 2 and a mutation at at least one position selected from positions 101, 157 and 250; (B) in the sequence of (A), an amino acid sequence having 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions at positions other than 2, 101, 157, 250 or 282; (C) An amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, and 12 or an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12 having 70% or more homology In the amino acid sequence of the protein having transglutaminase activity, there are mutations to cysteine at positions corresponding to positions 2 and 282 of SEQ ID NO: 2, and from positions corresponding to positions 101, 157 and 250.
  • amino acid sequence having a mutation at at least one selected position or (D) in the sequence of (C), a position other than the position corresponding to position 2, 101, 157, 250 or 282 of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequences having 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions are amino acid sequences having 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions.
  • amino acid sequence having a mutation at at least one selected position or (D) in the sequence of (C), a position other than the position corresponding to position 2, 101, 157, 250 or 283 of SEQ ID NO: 2 And amino acid sequences having 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions.
  • a protein having transglutaminase activity and having the following amino acid sequence of A, B, C or D (A) an amino acid sequence having a mutation to cysteine at positions 7 and 58 in SEQ ID NO: 2 and having a mutation at at least one position selected from positions 101, 157 and 250; (B) an amino acid sequence having 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions at positions other than positions 7, 58, 101, 157 or 250 in the sequence of (A); (C) An amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, and 12 or an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12 having 70% or more homology In the amino acid sequence of the protein having transglutaminase activity, there are mutations to cysteine at positions corresponding to positions 7 and 58 of SEQ ID NO: 2, and from positions corresponding to positions 101, 157 and 250.
  • [12] The protein according to any one of [7] to [11] above, further comprising a mutation of arginine at position 208 to leucine, alanine or glutamic acid in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 (1) mutation of arginine at position 208 to tryptophan, (2) mutation of aspartic acid at position 268 to asparagine, (3) Mutation of valine at position 132 to leucine, (4) mutation of arginine at position 238 to methionine, or (5) mutation of glutamic acid at position 249 to lysine
  • the protein according to [8] further comprising: [14] A polynucleotide encoding the protein according to any one of [1] to [13] above.
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide according to [14].
  • [16] A host cell transformed with the recombinant vector according to [15] above.
  • [17] The production of the protein according to any one of [1] to [13] above, wherein the host cell according to [16] is cultured, and a protein having transglutaminase activity is collected. Method.
  • [18] The protein according to any one of [1] to [13] above, the protein produced by the method according to [17] above, or the host cell according to [16] above acting on a substrate protein
  • a method for processing the substrate protein comprising [19] The method described in [18] above, wherein the substrate protein is processed at 40 ° C to 100 ° C.
  • a transglutaminase with further improved heat resistance can be provided by modifying a conventional disulfide bond-introduced transglutaminase (particularly, disulfide bond-introduced MTG). Furthermore, a new product and a new technique can be provided by using transglutaminase with improved heat resistance.
  • FIG. 1 is a graph showing the heat resistance (residual activity) of multiple mutants derived from disulfide bond-introduced transglutaminase.
  • FIG. 2 is a graph showing the heat resistance (residual activity) of the six mutants identified in Example 8.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of heat resistance evaluation of Example 10.
  • FIG. 4A is a graph showing the results of heat resistance evaluation of the mutants listed in Table 6.
  • FIG. 4B is a graph showing the results of heat resistance evaluation of the mutants listed in Table 6.
  • FIG. 4C is a graph showing the results of heat resistance evaluation of the mutants listed in Table 6.
  • FIG. 5 shows the results of heat resistance evaluation in various mutants in which amino acid substitution was performed on R208 of MSS2 ⁇ B.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of heat resistance evaluation of the mutants listed in Table 11.
  • Transglutaminase is widely used for the production of foods such as gelatin, cheese, yogurt, tofu, salmon, ham, sausage, noodles and the like, and for improving meat quality (Japanese Patent Laid-Open No. 64-27471). In addition, it is an enzyme used for various industrial purposes, such as being used in the production of heat-stable microcapsule materials and immobilized enzyme carriers.
  • Transglutaminase catalyzes the acyl transfer reaction of the ⁇ -carboxyamide group of a glutamine residue in the peptide chain of a protein molecule. When the ⁇ -amino group of the lysine residue in the protein molecule acts as an acyl acceptor, an ⁇ - ( ⁇ -Glu) -Lys bond is formed in the protein molecule and between the molecules.
  • Transglutaminase is roughly divided into animal-derived Ca2 + -dependent ones and microorganism-derived Ca2 + -independent ones.
  • TG derived from microorganisms those derived from actinomycetes are known. Examples of the nucleotide sequence and amino acid sequence of TG derived from actinomycetes are shown in the following table.
  • the amino acid sequence of transglutaminase that can be modified to obtain the mutant protein of the present invention is the amino acid sequence 2, 4, 6,
  • the protein having transglutaminase activity is not limited to 8, 10 and 12, and 70%, preferably 80%, more preferably 90%, and particularly preferably SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 If the protein has a homology of 95% or more, most preferably 98% or more, alignment is carried out in the same manner as described later, and the corresponding amino acid residue is identified to mutate to that amino acid residue.
  • homology refers to identity.
  • the homology analysis can be calculated using, for example, default parameters of “Genetyx ver. 7 (Genetyx Corporation)”.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11 or a probe that can be prepared from these sequences.
  • a polynucleotide encoding a protein having transglutaminase activity can also be used for the production of the mutant protein of the present invention.
  • stringent conditions means, for example, nucleotide sequences having high homology, for example, nucleotide sequences having homology of 80, 90, 95, 97, or 99% or more hybridize to each other, and homology is more than that.
  • washing conditions for normal Southern hybridization 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68
  • the conditions include washing once, more preferably 2 to 3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • a partial sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 can also be used.
  • Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence as a primer and a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11 as a template. it can.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • Transglutaminase can be obtained, for example, by subjecting a product expressed and secreted by a microorganism or the like (including a transformant described later) to a process such as separation, recovery, and purification. Moreover, you may use in the state made to express by microorganisms etc.
  • Transglutaminase activity means an activity of forming a bridge between a glutamine residue and a lysine residue in a protein as described above.
  • the transglutaminase activity can be measured in a state expressed in a microorganism or the like in addition to the form of TG separated and purified from a microorganism or the like.
  • Transglutaminase activity can be assayed by the hydroxamate method (J. Biol. Chem., 241, 5518-5525, 1966).
  • the activity unit of transglutaminase in the hydroxamate method is defined as follows. Specifically, the reaction is carried out using benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine and hydroxylamine as substrates, and the resulting hydroxamic acid is converted to an iron complex in the presence of trichloroacetic acid, and the amount is measured at an absorbance of 525 nm. . A calibration curve is prepared from the amount of hydroxamic acid in this way, and the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydroxamate per minute is defined as the transglutaminase activity unit, 1 unit. The details of this measurement method are as already reported (for example, see Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-27471).
  • Wild type transglutaminase TG
  • disulfide bond-introduced transglutaminase in the present specification means an amino acid mutation that can form a disulfide bond (an appropriate spatial position relative to each other) in the amino acid sequence of WT transglutaminase (eg, SEQ ID NO: 2). In which any two amino acid residues are replaced with cysteine residues).
  • this “disulfide bond-introduced transglutaminase” is preferably modified and simple. This is also referred to as “original (or template)” disulfide bond-introduced transglutaminase as required.
  • disulfide bond-introduced transglutaminase examples include those disclosed in the above-mentioned WO2008 / 099898 (Patent Document 9), but are not limited thereto, and have higher heat resistance than WT transglutaminase. It is preferable to use an improved one. In particular, among these, disulfide bond-introduced mutants showing good results with respect to heat resistance, that is, random to the disulfide bond-introduced TG in which amino acids at positions 3 and 283 of SEQ ID NO: 2 are substituted with cysteine.
  • thermostable transglutaminase of the present invention by carrying out mutation introduction will be described in detail.
  • Other disulfide bond-introduced TGs for example, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 or 12, or those homologs at positions 3 and 283 and amino acids at the corresponding positions substituted with cysteine may be used as a template.
  • “improving heat resistance (ie, thermal stability)” means a temperature range in which it is inappropriate to use WT transglutaminase for a long time (eg, about 10 minutes or more).
  • a temperature at which the activity of WT transglutaminase significantly decreases for example, a temperature of about 50 ° C. or higher, preferably about 55 ° C. or higher, preferably about 60 ° C. or higher, more preferably about 65 ° C. or higher, more preferably about 68 ° C. or higher.
  • the enzyme can retain its activity for a longer time.
  • “improving thermostability” means transglutaminase at a temperature within such a range (eg, about 50 ° C., about 55 ° C., about 60 ° C., about 65 ° C., about 68 ° C.) for a long time (eg, , About 1 hour, about 2 hours, about 3 hours) means that the rate of decrease in activity is smaller than that of WT transglutaminase, more preferably the original disulfide bond-introduced transglutaminase.
  • the transglutaminase mutant protein of the present invention is a protein having a residual activity of 1% or more, 3% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more after heating at 65 ° C. for 10 minutes, for example.
  • the transglutaminase mutant protein of the present invention is described in the present specification in comparison with WT transglutaminase or the original disulfide bond-introduced transglutaminase, particularly the original disulfide bond-introduced transglutaminase. It is preferable that the amount of expression is not significantly reduced when expressed by a method such as
  • the transglutaminase mutant protein of the present invention has the amino acid sequence having a mutation at at least one position selected from (A) position 101, position 157 and position 250 in SEQ ID NO: 2, or (B) position 101, position 157 Or a protein having an amino acid sequence having substitution, deletion, addition and / or insertion of 1 to several residues at positions other than position 250. Further, (C) an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, and 12, or an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12 and 70% or more (preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more).
  • amino acid sequence of a protein having transglutaminase activity and having positions 101, 157 and 250 An amino acid sequence having a mutation at at least one position selected from positions corresponding to positions; or (D) in the sequence of (C), positions other than positions corresponding to positions 101, 157 or 250 of SEQ ID NO: 2
  • proteins having amino acid sequences with 1 to several residue substitutions, deletions, additions and / or insertions are also within the scope of the invention.
  • a protein in which an amino acid mutation capable of forming a disulfide (SS) bond is further introduced in the above protein is also within the scope of the present invention.
  • the mutation include, but are not limited to, those disclosed in Patent Document 9.
  • the transglutaminase mutant protein of the present invention has (A) positions 3 and 283 (or positions 2 and 282, positions 2 and 283, positions 7 and 58) in SEQ ID NO: 2.
  • positions 3 and 283 of SEQ ID NO: 2 (or positions 2 and 282, 2 and 283, or in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, and 12, or An amino acid sequence having a mutation to cysteine at a position corresponding to positions 7 and 58) and having a mutation at at least one position selected from positions corresponding to positions 101, 157 and 250
  • amino acid sequence of a protein having transglutaminase activity and having mutations to cysteine at positions corresponding to positions 3 and 283 of SEQ ID NO: 2 and positions 101 and 157
  • amino acid sequence in (B) above is a mutation to cysteine at positions 3 and 283 of SEQ ID NO: 2 (or positions 2 and 282, positions 2 and 283, or positions 7 and 58). And at least one position selected from positions 101, 157 and 250, and in addition to 1 to several residues at the indicated positions and / or other positions. Amino acid sequences having group substitutions, deletions, additions and / or insertions. The same applies to the amino acid sequence (D) above.
  • the position “corresponding” to the above position is obtained by aligning these sequences with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is determined. It is also possible to align the amino acid sequence of a transglutaminase homolog other than those shown in this specification with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to determine the “corresponding” position, and to introduce a mutation at that position. is there. For example, if gaps are introduced when aligning SEQ ID NO: 2 with other sequences, it should be noted that the positions referred to above may shift back and forth. See FIG. 4 of WO2008 / 099898 (Patent Document 9) for the corresponding positions.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information, Basic Local Alignment Search Tool
  • Karlin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)
  • the algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))] Needleman et al., J. Mol.
  • Biol., 48 The algorithm described in 444-453 (1970) [the algorithm is incorporated in the GAP program in the GCG software package], Myers and Miller, CABIOS, 4: The algorithm described in 11-17 (1988) [the algorithm Is incorporated into the ALIGN program (version 2.0) that is part of the CGC sequence alignment software package], Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) algorithm described in [the algorithm is incorporated in the FASTA program in the GCG software package] and the like.
  • MTG Streptomyces mobaraensis-derived transglutaminase
  • an enzyme with transglutaminase activity that has homologous amino acid sequence with this enzyme, or transglutaminase activity that is expected to have a similar three-dimensional structure to this enzyme It is sufficiently possible to modify an enzyme having a structure based on the three-dimensional structure of MTG.
  • amino acid substitution that is effective for modification of substrate specificity is also effective for related enzymes derived from microorganisms such as Streptomyces cinnamonius and Streptomyces rigix (Japanese translation of PCT publication No. 10-504721) It is predicted.
  • the transglutaminase mutant protein of the present invention has positions 3 and 283 (or positions corresponding to them) among the above positions in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 (including homologous sequences).
  • the mutant protein of the present invention may have substitution, deletion, addition and / or insertion of 1 to several residues in addition to these mutations.
  • the mutant protein of the present invention has the above-described properties, as long as its heat resistance is improved as compared with the original disulfide bond-introduced transglutaminase.
  • Mutations may be included in any combination.
  • the amino acid mutation at the above position is preferably an amino acid substitution mutation.
  • mutations to cysteine may be included in only one pair or in combination. Examples of such pairs of mutations to cysteine include, but are not limited to, those disclosed in Patent Document 9.
  • Such proteins can be produced according to methods known in the art.
  • the above-mentioned substitution, deletion, addition and / or insertion is particularly improved in heat resistance compared to the original disulfide bond-introduced transglutaminase. As long as it is, it is not particularly limited.
  • Such mutant proteins have substitutions, deletions, additions and / or insertions of 1 to several residues (1 to 30, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, 3 or 2 residues.
  • any number of Amino acid substitutions, insertions, additions and deletions may be included.
  • substitution with a similar amino acid ie, conservative amino acid substitution
  • substitution with a similar amino acid is preferable.
  • similar amino acids mean amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids ( Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) Amino acids classified into the same group. Examples of conservative amino acid substitutions are well known in the art.
  • transglutaminase mutant protein of the present invention is the mutation of aspartic acid at position 3 to cysteine, mutation at position 101 of serine to proline, mutation at position 157 of glycine to serine, position 250 in SEQ ID NO: 2.
  • the mutation at position 101 to proline and the mutation at position glycine to serine are proteins having two mutations selected from mutations of glycine to arginine at position 250 and having a mutation to another amino acid at the remaining one position.
  • such a protein comprises, in SEQ ID NO: 2, in addition to the mutation of aspartic acid at position 3 to cysteine and the mutation of glycine at position 283 to cysteine, (1) mutation of serine at position 101 to proline Glycine at position 157 to serine, and glycine at position 257, alanine, valine, leucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, lysine, arginine, histidine or aspartic acid (2) glycine at position 157 to serine, glycine at position 250 to arginine, glycine at position 101, alanine, valine, isoleucine, proline, phenylalanine, asparagine, glutamine, Tyrosine, lysine, (3) mutation of serine at position 101 to proline, mutation of glycine at position 250 to arg
  • SEQ ID NO: 2 in addition to mutation of aspartic acid at position 3 to cysteine and mutation of glycine at position 283 to cysteine, mutation of serine at position 101 to proline; glycine at position 157 to alanine, serine or arginine Also preferred are proteins having the following mutations: and glycine at position 250 to alanine, phenylalanine, serine, asparagine or arginine.
  • SEQ ID NO: 2 in addition to the mutation of aspartic acid at position 3 to cysteine and the mutation of glycine at position 283 to cysteine, (1) the mutation of serine at position 101 to proline and the position of 157 Glycine to serine, glycine at position 250 to alanine, phenylalanine, serine, asparagine or arginine; (2) glycine at position 157 to serine and glycine at position 250 to arginine Mutation of serine at position 101 to proline; or (3) mutation of serine at position 101 to proline, mutation of glycine at position 250 to arginine, and mutation of glycine at position 157 to alanine, serine or arginine.
  • a protein in which the arginine residue at position 208 is further mutated is also preferred.
  • this preferred protein include a mutation of aspartic acid at position 3 to cysteine, a mutation at position 101 to proline, a mutation at position 157 to serine, and a arginine at position 250 to glycine.
  • this mutation is preferably a mutation of arginine at position 208 to leucine, alanine or glutamic acid.
  • aspartic acid mutation at position 3 to cysteine mutation at position 101 to proline, mutation at position 157 to serine, mutation at position glycine to arginine and position 283 (1) mutation of arginine at position 208 to tryptophan, (2) mutation of aspartic acid at position 268 to asparagine, and (3) mutation of valine at position 132 to leucine.
  • a protein further comprising (4) a mutation of arginine at position 238 to methionine, or (5) a mutation of glutamic acid at position 249 to lysine may also be a preferred protein of the present invention.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the transglutaminase mutant protein of the present invention (referred to as the polynucleotide of the present invention).
  • a polynucleotide encoding the transglutaminase mutant protein of the present invention referred to as the polynucleotide of the present invention.
  • Such polynucleotides can be obtained using methods known in the art (for example, the methods described herein). Using an appropriate restriction enzyme, this polynucleotide can be inserted into a vector to obtain a recombinant vector.
  • the vector backbone used in the recombinant vector of the present invention is appropriately selected according to its purpose (for example, cloning, protein expression) or a host cell into which this vector is to be introduced, preferably suitable for a microorganism, Can be used.
  • the expression vector comprises a polynucleotide of the invention operably linked to a suitable promoter, preferably a transcription termination signal, ie a terminator, downstream of the polynucleotide of the invention. Includes area.
  • a selection marker gene drug resistance gene, gene complementing an auxotrophic mutation, etc.
  • it may contain a sequence encoding a tag sequence useful for separation and purification of the expressed protein.
  • the vector may be one that is integrated into the genome of the target host cell.
  • Vectors are known transformation techniques such as competent cell method, protoplast method, calcium phosphate coprecipitation method, polyethylene glycol method, lithium method, electroporation method, microinjection method, liposome fusion method, particle gun method, etc. Can be introduced into the subject host cell.
  • the present invention also provides a host cell transformed with such a recombinant vector (hereinafter also referred to as a transformant of the present invention).
  • host cells include prokaryotic cells such as E. coli and actinomycetes, and eukaryotic cells such as yeast. If it is desired to express the protein, the host cell is a host cell that is suitable for the production of the protein and is capable of expressing the mutant protein of the invention in a functional form.
  • the transformant of the present invention can be obtained using the above transformation technique. Any microorganism can be used as a host cell as long as it can be used as long as it is a developed recombinant vector system.
  • Preferred host cells include E. Ecoli, Corynebacterium glutamicum, yeast, Examples include, but are not limited to, Bacillus bacteria and various actinomycetes.
  • the transformant of the present invention can be cultured under conditions usually used in the field.
  • the culture temperature, time, medium composition, pH, stirring conditions, and the like can be appropriately selected depending on the transformant to be cultured.
  • the transglutaminase mutant protein of the present invention is expressed by the transformant of the present invention.
  • the transglutaminase mutant protein may be used by being secreted from the transformant or separated and purified from the transformant, or may be used as it is as a transformant containing the mutant protein. . Separation and purification of the protein can be performed according to a method known per se.
  • transglutaminase mutant protein of the present invention may be expressed as a pro form and then treated with an appropriate protease (eg, subtilisin) to form a mature form, or the pro form and protease may be simultaneously used in the target host cell. It may be expressed to obtain a mature body.
  • an appropriate protease eg, subtilisin
  • the heat resistance of the disulfide bond-introduced transglutaminase in order to further improve the heat resistance of the disulfide bond-introduced transglutaminase, by introducing a random mutation into the disulfide bond-introduced transglutaminase gene, the heat resistance compared to the original disulfide bond-introduced transglutaminase is increased.
  • a transglutaminase mutant protein having improved properties is provided.
  • the introduction of random mutations into the disulfide bond-introduced transglutaminase gene and the primary screening of disulfide bond-introduced transglutaminase mutants can be performed as follows.
  • the sequence of the transglutaminase gene derived from the S. mobaraense DSMZ strain has already been determined (Eur. J. Biochem., 257, 570-576, 1998).
  • E. coli is transformed with the plasmid prepared by ligation, and the resulting colonies are mixed culture and plasmid extraction is performed.
  • YDK010 construction method is described in WO2002 / 081694 constructed from Corynebacterium glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) (WO 2002/081694) is transformed by electroporation with the obtained plasmid.
  • the transformant can be screened by the hydroxamate method (J. Biol. Chem., 241, 5518-5525, 1966).
  • the assay may use 96 wells or test tubes. If a strain into which no mutation has been introduced is used as a control, one having an absorbance equal to or higher than that of the control can be selected.
  • mutation points can be analyzed by confirming the base sequence of the strain obtained by screening. For those with confirmed mutation points, specific activity can be calculated by measuring activity and protein content. The activity and protein amount can be measured by the methods described in the literature (Prot. Exp. Puri., 2002, 26, 329-335).
  • Mutation can be easily introduced by using Stratagene's QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit.
  • the obtained transformant can be cultured and the transglutaminase mutant protein can be separated and purified as follows, for example. Dispense CM2G medium containing kanamycin into test tubes. The transformant is inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. Dispense 50 ml each of MM medium containing kanamycin and CaCO 3 into the Sakaguchi flask, inoculate the preculture, and culture. After centrifugation of the culture solution, the supernatant is filtered and the solvent is replaced with 20 mM phosphate buffer, pH 7.0 using Sephadex G25 (M). Subtilisin is added in an amount of 1/100 of transglutaminase and reacted at 30 ° C.
  • the activated solution is exchanged for cation exchange chromatography equilibration buffer (20 mM acetate buffer, pH 5.5) using Sephadex G25 (M).
  • cation exchange chromatography equilibration buffer (20 mM acetate buffer, pH 5.5) using Sephadex G25 (M).
  • the entire amount is loaded onto a cation exchange column (Resource S 6 ml; manufactured by GE Healthcare Bioscience) that has been sufficiently equilibrated with the same buffer.
  • a cation exchange column Resource S 6 ml; manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • the activity of the fraction and the amount of protein are measured, and the fraction near the peak top, which has almost the same specific activity except for the fraction with low specific activity, is collected.
  • the collected fraction is replaced with 20 mM phosphate buffer, pH 6.0 using Sephadex G25 (M).
  • the resulting sample is diluted to about 1 mg / ml with 20 mM phosphate buffer, pH 6.0, and stored at -80 ° C. until use.
  • the present invention also provides a method for processing a substrate protein using the transglutaminase mutant protein of the present invention or a transformant expressing the protein.
  • the protein that can serve as a substrate for transglutaminase include proteins having glutamine and / or lysine residues accessible to transglutaminase. This method can be used for various applications (fiber processing, leather tanning, etc.) where it is desired to carry out a protein cross-linking reaction in a temperature range where it is inappropriate to use WT transglutaminase or a conventional disulfide bond-introduced transglutaminase. Applicable to.
  • the mutant protein of the present invention has about 40 ° C. to about 100 ° C., preferably about 50 ° C. to about 100 ° C., more preferably about 55 ° C. to about 100 ° C., more preferably about 60 ° C. to about 100 ° C., Even more preferably, it can be used in reactions carried out at about 65 ° C to about 100 ° C.
  • the mutant protein of the present invention is suitable for use in the fiber processing.
  • the MTG gene consists of three regions: a pre-region, a pro region, and a mature region. In order to form a disulfide bond, mutations were introduced into the mature region (about 1000 bp) encoding the MTG active body into which mutations of D3C and G283C were introduced (D3C / G283C) by error-prone PCR.
  • the sequence of the transglutaminase gene from the S. mobaraense DSMZ strain has already been determined (Eur. J.
  • coli JM109 was transformed with the plasmid prepared by ligation to obtain 4500 colonies, and 500 plasmids were extracted together.
  • YDK010 construction method described in WO 2002/081694 constructed from Corynebacterium glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) (WO 2002/081694) was transformed with the plasmid obtained by extraction by electroporation. Then, the transformant was cultured (30 ° C., 24 hours) on a CM2G plate (Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L) containing 25 ⁇ g / ml kanamycin. Electroporation was performed by the method described in the literature (FEMS Microbiol. Lett., 53, 299-303, 1989).
  • Example 2 Primary Screening of Disulfide Bond-Introducing Transglutaminase Mutant 1 ml of CM2G medium (Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L) containing 25 ⁇ g / ml kanamycin Dispense into 96-well deep wells.
  • the transformant (about 10,000 strains) obtained in Example 1 was inoculated and precultured at 1,500 rpm at 30 ° C. for 24 hours.
  • MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 (Glucose 60 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g, MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.01 g, (NH 4 ) 2 Dissolve SO 4 30g, KH 2 PO 4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5 / 1L) into a 96-well deep well, and add 50 ⁇ l of the preculture solution. Passed.
  • DTT was added to a 96-well deep well so that the concentration was 3 mM. After DTT addition, the cells were cultured at 1500 rpm for 43 hours at 30 ° C. The culture solution was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and 200 ⁇ L of the obtained culture supernatant was diluted 5-fold with 20 mM MOPS, pH 7. Subtilisin was added to the diluted solution in an amount of 1/100 of MTG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate MTG. Screening was performed by measuring activity by hydroxamate method.
  • reaction solution 100 ⁇ L of the reaction solution was dispensed into a 96-well deep well, PMSF was added to 1 mM, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution treated with PMSF was heated at 65 ° C. for 10 minutes using a thermal cycler.
  • the activity of the heat-treated reaction solution was measured by the hydroxamate method as described above.
  • the absorbance before and after the heat treatment was comparable to that of the control, and the absorbance before and after the heat treatment 70 strains with the same or higher residual activity were selected.
  • a strain into which a mutation of D3C and G283C has been introduced, and a disulfide bond-introduced transglutaminase (protein) obtained from the strain are also referred to as D3C / G283C, 3/283, or 3-283 for convenience.
  • Example 3 Mutation Point Analysis of Primary Screening Strain Mutation points were analyzed by confirming the base sequence of the strain obtained by screening.
  • the strain obtained by the screening was cultured in CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin at 30 ° C. for 24 hours, and then the plasmid was extracted with QIAprep's QIAprepSpin Miniprep Kit and transformed into E. coli JM109 strain.
  • the transformed E. coli JM109 strain was cultured in LB medium at 37 ° C. for 16 hours, and then the plasmid was extracted in the same manner.
  • ABI PRISM Cycle Sequencing Kit the nucleotide sequence was analyzed according to the method recommended by the supplier. As a result, the presence of mutation points was confirmed in 47 strains, and 30 types of mutants were identified (Table 2).
  • Example 4 Secondary Screening of Disulfide Bond-Introducing Transglutaminase Mutant 3 ml of CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into test tubes. Thirty types of mutants selected in the primary screening were inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 4 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into a test tube, and 50 ⁇ l of the preculture was subcultured. After culturing at 30 ° C. for 5 hours, DTT was added to a concentration of 3 mM. After adding DTT, the cells were cultured at 30 ° C.
  • Example 5 Purification of disulfide bond-introduced transglutaminase enzyme selected in secondary screening CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 3 ml test tubes. Seven types of mutants selected in the secondary screening and the control (3-283) were inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 50 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into the Sakaguchi flask, inoculated with 2.5 ml of the preculture, and cultured at 30 ° C. for 48 hours. After culturing at 30 ° C.
  • DTT was added to a concentration of 3 mM.
  • the cells were cultured at 30 ° C. for 43 hours.
  • the culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes), and subtilisin was added to the obtained culture supernatant in an amount of 1/100 of MTG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate MTG.
  • the activated solution was exchanged with an equilibration buffer (20 mM acetate buffer, pH 5.5) for cation exchange chromatography using Sephadex G25 (M).
  • an equilibration buffer (20 mM acetate buffer, pH 5.5
  • M Sephadex G25
  • the protein fraction in which the NaCl concentration eluted with a linear concentration gradient from 0 to 0.5 M NaCl was eluted at around 200 mM was fractionated using UV absorption at a wavelength of 280 nm as an index.
  • the fraction near the peak top having almost the same specific activity was collected except for the fraction having a low specific activity.
  • the collected fraction was replaced with 20 mM phosphate buffer, pH 6.0 using Sephadex G25 (M). All chromatography was performed at room temperature.
  • Example 6 Evaluation of heat resistance of purified mutant enzyme
  • Eight kinds of purified mutant enzymes were prepared to 0.5 mg / mL. 100 ⁇ L of the enzyme solution was dispensed into a 96-well deep well, PMSF was added to 1 mM, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour. The enzyme solution was heated at 63 ° C., 64.8 ° C., 66.6 ° C., and 68.4 ° C. for 10 minutes using a thermal cycler. A non-heated enzyme solution and 30 ⁇ l of the heat-treated enzyme solution were dispensed into a 96-well, and preheated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • Example 7 Combination of Promising Mutation Points
  • seven types of mutants were selected and seven mutation sites were identified. Multiple mutants were constructed for the purpose of further improving heat resistance by combining them.
  • the mutation was introduced into 4-3-11H identified in Example 3 (MSS2 in Table 5) using the Strakgene II QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit. Whether or not a mutation was introduced was confirmed by analyzing the base sequence in the same manner as described above. The constructed mutants are summarized in Table 5.
  • Example 8 Selection of Promising Multiple Mutant
  • the plasmid constructed in Example 7 was introduced into Corynebacterium by electroporation to prepare a transformant.
  • CM2G medium Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L
  • 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 96-well deep wells in an amount of 1 ml.
  • the transformant was inoculated and precultured at 1,500 rpm at 30 ° C. for 24 hours.
  • MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 Glucose 60 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g, MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.01 g, (NH 4 ) 2 Dissolve SO 4 30g, KH 2 PO 4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5 / 1L) into a 96-well deep well, and add 50 ⁇ l of the preculture solution. Vaccinated.
  • DTT was added to a 96-well deep well so that the concentration was 3 mM. After DTT addition, the cells were cultured at 1500 rpm for 43 hours at 30 ° C. The culture solution was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and 200 ⁇ L of the obtained culture supernatant was diluted 5-fold with 20 mM MOPS, pH 7. Subtilisin was added to the diluted solution in an amount of 1/100 of each TG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate each TG. Screening was performed by measuring activity by hydroxamate method.
  • Example 9 Purification of promising multiple mutant and evaluation of thermostability CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 3 ml test tubes.
  • Six types of mutants identified in Example 8 were inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 50 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into the Sakaguchi flask, and 2.5 ml of the preculture was subcultured. After culturing at 30 ° C. for 5 hours, DTT was added to a concentration of 3 mM. After adding DTT, the cells were cultured at 30 ° C. for 43 hours.
  • the culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes), and subtilisin was added to the obtained culture supernatant in an amount of 1/100 of MTG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate MTG.
  • the activated solution was exchanged with an equilibration buffer (20 mM acetate buffer, pH 5.5) for cation exchange chromatography using Sephadex G25 (M).
  • an equilibration buffer (20 mM acetate buffer, pH 5.5
  • M Sephadex G25
  • the entire amount was loaded onto a cation exchange column (Resource S 6 ml; manufactured by GE Healthcare Bioscience) that was sufficiently equilibrated with the same buffer.
  • the protein fraction in which the NaCl concentration eluted with a linear concentration gradient from 0 to 0.5 M NaCl was eluted in the vicinity of 200 mM with UV absorption at a wavelength of 280 nm as an index was fractionated.
  • the fraction near the peak top having almost the same specific activity was collected except for the fraction having a low specific activity.
  • the collected fraction was replaced with 20 mM phosphate buffer, pH 6.0 using Sephadex G25 (M). All chromatography was performed at room temperature. Six types of purified mutant enzymes were prepared to 0.5 mg / mL.
  • solution A 0.05 M MES, 0.1 M NH 2 OH, 0.03 M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0
  • B solution (1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl 3 .6H 2 O) was dispensed at 50 ⁇ l to each well to stop the reaction, and the absorbance at 525 nm was measured with a plate reader.
  • Example 10 Evaluation of heat resistance of MSS2 ⁇ B by hydroxamate method
  • MSS2 ⁇ B (S101 ⁇ P, G157 ⁇ S, G250 ⁇ R), D3C / G283C, wild-type MTG (following in this example)
  • the temperature dependence of the activity was measured by the hydroxamate method.
  • the enzyme concentration was determined by reverse phase chromatography according to the method described in Protein Expr. Purif. 26 (2002) 329-335.
  • Solution A (0.05M MES, 0.1M NH 2 OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0) preheated at 35 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C for 5 minutes.
  • D3C / G283C showed a maximum activity from 55 ° C to 60 ° C and a specific activity of about 75 U / mg, which was 10 ° C higher than MTG in heat resistance and doubled in specific activity.
  • MSS2 ⁇ B shows a maximum activity from 60 ° C to 65 ° C and a specific activity of about 115 U / mg, which is 5 ° C higher than D3C / G283C and has a specific activity. The maximum value of was improved by about 50%.
  • Example 11 Confirmation of heat resistance improvement effect at introduced mutation site
  • MSS2 ⁇ B S101 ⁇ P, G157 ⁇ S, G250 ⁇ R
  • MSS2 ⁇ B S101 ⁇ P, G157 ⁇ S, G250 ⁇ R
  • amino acid substitution of S101 ⁇ G, A, V, I, P, F, N, Q, Y, K, R, E was performed on D3C / G283C with G157 ⁇ S and G250 ⁇ R introduced.
  • Example 12 Crude purification and thermostability evaluation of mutants subjected to amino acid substitution CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 3 ml test tubes.
  • the mutant prepared in Example 11 was inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 4 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into a test tube, and 0.2 ml of the preculture was subcultured. After culturing at 30 ° C. for 5 hours, DTT was added to a concentration of 3 mM. After adding DTT, the cells were cultured at 30 ° C. for 43 hours.
  • the culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes).
  • the obtained culture supernatant is prepared so that the enzyme concentration is 0.1 to 0.2 mg / mL, then loaded onto a PD-10 column (GE Healthcare), and 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.
  • Crude purification was performed by exchanging with 0. Carefully add sodium hydroxide to 3.0 mL of the roughly purified enzyme solution to pH 6.8-7.0, add 1/100 volume of subtilisin MTG, react at 30 ° C for 16 hours to activate the mutant enzyme did.
  • the activated mutant enzyme solution was diluted 2-fold with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0.
  • MTG gene consists of three regions: pre region, pro region and mature region .
  • mutations of D3C and G283C were introduced (D3C / G283C), and MSS2 ⁇ B (D3C / S101P / G157S / G250R) was introduced to further improve the heat resistance.
  • MSS2 ⁇ B D3C / S101P / G157S / G250R
  • the vector was cut out and dissolved in 60 ⁇ l of ddH 2 O.
  • E. coli JM109 was transformed with the plasmid prepared by ligation to obtain 4500 colonies, and 500 plasmids were extracted together.
  • YDK010 described in Example 1 was transformed by electroporation using the extracted plasmid.
  • the transformant was cultured (30 ° C., 24 hours) on a CM2G plate (Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L) containing 25 ⁇ g / ml kanamycin. Electroporation was performed by the method described in the literature (FEMS Microbiol. Lett., 53, 299-303, 1989).
  • Example 14 Primary screening of MSS2 ⁇ B mutant CMwell G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin (Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L) 96 ml deep well Dispensed into The transformant obtained in Example 13 (about 8200 strains) was inoculated and precultured at 1,500 rpm at 30 ° C. for 24 hours.
  • kanamycin Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L
  • MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 (Glucose 60 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g, MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.01 g, (NH 4 ) 2 Dissolve SO 4 30g, KH 2 PO 4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5 / 1L) into a 96-well deep well, and add 50 ⁇ l of the preculture solution. Passed.
  • DTT was added to a 96-well deep well so that the concentration was 3 mM. After DTT addition, the cells were cultured at 1500 rpm for 43 hours at 30 ° C. The culture solution was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and 200 ⁇ L of the obtained culture supernatant was diluted 5-fold with 20 mM MOPS pH 7. Subtilisin was added to the diluted solution in an amount of 1/100 of MTG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate MTG. Screening was performed by measuring activity by hydroxamate method.
  • reaction solution 100 ⁇ L was dispensed into a 96-well deep well, PMSF was added to 1 mM, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution treated with PMSF was heated at 67 ° C. for 10 minutes using a thermal cycler.
  • the activity of the heat-treated reaction solution was measured by the hydroxamate method as described above. Using MSS2 ⁇ B as a control, 171 strains having the same or higher absorbance before and after the heat treatment and the residual activity derived from the absorbance before and after the heat treatment were selected.
  • Example 15 Mutation Point Analysis of Primary Screening Strain Mutation points were analyzed by confirming the base sequence of the strain obtained by screening.
  • the strain obtained by screening was cultured in CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin at 30 ° C. for 24 hours, and then the plasmid was extracted with QIAprep's QIAprepSpin Miniprep Kit to transform E. coli JM109 strain.
  • the transformed E. coli JM109 strain was cultured in LB medium at 37 ° C. for 16 hours, and then the plasmid was extracted in the same manner.
  • ABI PRISM Cycle Sequencing Kit the nucleotide sequence was analyzed according to the method recommended by the supplier. As a result, 86 types of mutants were identified (Table 7).
  • Example 16 Secondary Screening of MSS2 ⁇ B Mutant 96 ml deep in 1 ml each of CM2G medium (Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L) containing 25 ⁇ g / ml kanamycin Dispense into wells.
  • CM2G medium Glucose 5 g, Polypepton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, DL-Met 0.2 g, pH 7.2 / 1 L
  • 73 types introduced with single mutation or double mutation were inoculated in 8 series and pre-cultured at 1,500 rpm at 30 ° C. for 24 hours.
  • MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 (Glucose 60 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g, MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.01 g, (NH 4 ) 2 Dissolve SO 4 30g, KH 2 PO 4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5 / 1L) into a 96-well deep well, and add 50 ⁇ l of the preculture solution. Passed.
  • DTT was added to a 96-well deep well so that the concentration was 3 mM. After DTT addition, the cells were cultured at 1500 rpm for 43 hours at 30 ° C. The culture solution was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and 200 ⁇ L of the obtained culture supernatant was diluted 5-fold with 20 mM MOPS pH 7. Subtilisin was added to the diluted solution in an amount of 1/100 of MTG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate MTG. Screening was performed by measuring activity by hydroxamate method.
  • Example 17 Purification of MSS2 ⁇ B mutant selected in secondary screening CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 3 ml test tubes. Eight types of mutants selected by the secondary screening and a control (MSS2 ⁇ B) were inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 50 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into the Sakaguchi flask, subcultured 2.5 ml of the preculture, and cultured at 30 ° C. for 48 hours. Passed. After culturing at 30 ° C.
  • DTT was added to a concentration of 3 mM.
  • the cells were cultured at 30 ° C. for 43 hours.
  • the culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes), and subtilisin was added to the obtained culture supernatant in an amount of 1/100 of MTG and reacted at 30 ° C. for 16 hours to activate MTG.
  • the activated solution was exchanged into a cation exchange chromatography equilibration buffer (20 mM sodium acetate buffer, pH 5.5) using Sephadex G25 (M). Next, the entire amount was loaded onto a cation exchange column (Resource S 6 ml; manufactured by GE Healthcare Bioscience) that was sufficiently equilibrated with the same buffer.
  • the protein fraction in which the NaCl concentration eluted with a linear concentration gradient from 0 to 0.5 M NaCl was eluted at around 200 mM was fractionated using UV absorption at a wavelength of 280 nm as an index.
  • the fraction near the peak top having almost the same specific activity was collected except for the fraction having a low specific activity.
  • the collected fraction was replaced with 20 mM phosphate buffer, pH 6.0 using Sephadex G25 (M). All chromatography was performed at room temperature.
  • Example 18 Evaluation of heat resistance of purified mutant enzyme
  • Eight purified mutant enzymes were prepared to 0.1 mg / mL. 100 ⁇ L of the enzyme solution was dispensed into a 96-well deep well, PMSF was added to 1 mM, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour. The enzyme solution was heated at 25 ° C., 67 ° C., and 70 ° C. for 10 minutes using a thermal cycler. 20 ⁇ l of the enzyme solution heat-treated as described above was dispensed into a 96-well, and preheated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • Example 19 Confirmation of Heat Resistance Improvement Effect of R208 From the result of Example 18, it was confirmed that 2-4-11A (R208L) had improved heat resistance than MSS2 ⁇ B.
  • the mutation point R208 ⁇ L introduced into MSS2 ⁇ B was verified by amino acid substitution in order to confirm that this mutation point introduction site contributes to improvement in heat resistance.
  • a mutant in which MSS2 ⁇ B was subjected to amino acid substitution of R208 ⁇ A, L, I, W, N, Y, E was constructed.
  • the mutation was introduced into MSS2 ⁇ B using Stratagene's QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit. Whether or not a mutation was introduced was confirmed by analyzing the base sequence in the same manner as described above.
  • the constructed mutants are summarized in Table 10.
  • the constructed plasmid was introduced into Corynebacterium by electroporation to prepare a transformant.
  • Example 20 Crude purification and thermostability evaluation of mutants subjected to amino acid substitution CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 3 ml test tubes.
  • the mutant prepared in Example 19 was inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 4 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into a test tube, and 0.2 ml of the preculture was subcultured. After culturing at 30 ° C. for 5 hours, DTT was added to a concentration of 3 mM. After adding DTT, the cells were cultured at 30 ° C. for 43 hours.
  • the culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes).
  • the obtained culture supernatant is prepared so that the enzyme concentration is 0.1 to 0.2 mg / mL, then loaded onto a PD-10 column (GE Healthcare), and 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.
  • Crude purification was performed by exchanging with 0. Carefully add sodium hydroxide to 3.0 mL of the roughly purified enzyme solution to pH 6.8-7.0, add 1/100 volume of subtilisin MTG, react at 30 ° C for 16 hours to activate the mutant enzyme did.
  • the activated mutant enzyme solution was diluted 2-fold with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0.
  • Example 21 Combination of Promising Mutation Points From the results of Example 18, it was found that heat resistance was improved when 2-4-11A (R208L) was introduced into MSS2 ⁇ B. Therefore, to produce multiple mutants in which other mutation points extracted in Example 18, ie, V132L, R238M, E249K, D268N were introduced into 2-4-11A (R208L), respectively, to confirm the heat resistance improvement effect I made it.
  • the mutation was introduced into 2-4-11A (R208L) using Stratagene's QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit. Whether or not a mutation was introduced was confirmed by analyzing the base sequence in the same manner as described above. The constructed mutants are summarized in Table 11.
  • Example 22 Evaluation of Heat Resistance of Promising Multiple Mutant
  • the plasmid constructed in Example 21 was introduced into Corynebacterium by electroporation to prepare a transformant.
  • CM2G medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was dispensed into 3 ml test tubes.
  • the produced transformant was inoculated and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • 4 ml each of MM medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 50 g / L CaCO 3 was dispensed into a test tube, and 0.2 ml of the preculture was subcultured. After culturing at 30 ° C. for 5 hours, DTT was added to a concentration of 3 mM.
  • the cells were cultured at 30 ° C. for 43 hours.
  • the culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes).
  • the obtained culture supernatant is prepared so that the enzyme concentration is 0.1 to 0.2 mg / mL, then loaded onto a PD-10 column (GE Healthcare), and 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.
  • Crude purification was performed by exchanging with 0. Carefully add sodium hydroxide to 3.0 mL of the roughly purified enzyme solution to pH 6.8-7.0, add 1/100 volume of subtilisin MTG, react at 30 ° C for 16 hours to activate the mutant enzyme did.
  • the activated mutant enzyme solution was diluted 2-fold with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0.
  • Example 23 Evaluation of pH stability of MSS2 ⁇ B 0.5 to 0.6 mg / ml of MTG and D3C / G283C (3-283) mutant and MSS2 ⁇ B were added to a predetermined buffer (0.1 M glycine buffer pH 3, 0.1 M sodium phosphate buffer pH 12). ), And after maintaining at room temperature for 1 hour, it was diluted 2 times with 0.4M phosphate buffer pH 6 and the activity was measured by the hydroxamate method. The results are shown in Table 12 with the activity at pH 6 being 100%. MSS2 ⁇ B was found to have slightly improved acid resistance at pH 3 and alkali resistance at pH 12 compared to D3C / G283C.
  • transglutaminase with improved heat resistance can be provided by modifying MTG. Furthermore, a new product and a new technique can be provided by using transglutaminase with improved heat resistance.

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Abstract

　本発明は、耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼを提供することを目的とする。具体的には本発明は、ジスルフィド結合が導入された変異体トランスグルタミナーゼに適切な変異を導入することにより得られる、耐熱性がさらに向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供する。

Description

放線菌由来の耐熱性トランスグルタミナーゼ
　本発明は、放線菌由来トランスグルタミナーゼ（TG）の変異体タンパク質に関する。トランスグルタミナーゼ(単にTGともいう)はタンパク質間に架橋結合を形成させることで、ゲル状物質を生じさせるので、食品加工等に幅広く利用されている。トランスグルタミナーゼ活性や熱安定性が向上した変異型TGは必要量の低下に寄与し、高温領域での使用が可能であるため、新しい分野への本酵素の適用を可能にする。
　トランスグルタミナーゼはタンパク質のペプチド鎖内にあるγ-カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素である。本酵素をタンパク質に作用させるとε-（γ-Glu）-Lys架橋形成反応、Glnの脱アミド化によるGluへの置換反応が起こりうる。トランスグルタミナーゼとしては、これまでに動物由来のものと微生物由来のものが知られている。前者は、Ca2+依存性の酵素で、動物の臓器、皮膚、血液などに分布している。例えば、モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ（非特許文献１）、ヒト表皮ケラチン細胞トランスグルタミナーゼ（非特許文献２）、ヒト血液凝固因子XIII（非特許文献３）などがある。後者については、ストレプトベルチシリウム属の菌から、Ca2+非依存性のものが発見されている。例えば、ストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium griseocarneum）IFO 12776、ストレプトベルチシリウム・シナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum）IFO 12852、ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）IFO 13819等が挙げられる。そのうちストレプトベルチシリウム・モバラエンスのvariantの培養上清から見出されたトランスグルタミナーゼをＭＴＧ(Microbial Transglutaminase)と称する。更に、ストレプトマイセス・リジクス (Streptomyces lydicus) NRRL B-3446からも、Ca2+非依存性トランスグルタミナーゼが発見されている（特許文献１）。これらの微生物が生産するトランスグルタミナーゼの一次構造はペプチドマッピング及び遺伝子構造解析の結果、動物由来のものとは相同性を全く持たないことが判明している（特許文献２）。
　MTGは331個のアミノ酸からなる分子量約38,000の単量体タンパク質である（非特許文献４）。MTGは、上記菌類等の培養物から精製操作を経て製造されているため、供給量、効率等の点で問題があった。また、遺伝子工学的手法によるトランスグルタミナーゼの製造も試みられている。エシェリヒア・コリ（E.coli）、酵母等による分泌発現による方法（特許文献３）や、エシェリヒア・コリでMTGを蛋白質封入体として発現させた後、この封入体を蛋白質変性剤で可溶化し、脱変性剤処理を経て再生させることにより活性をもつMTGを生産する方法（特許文献４）、コリネバクテリウム・グルタミカムでMTGを分泌発現する方法（特許文献５）が報告されている。動物由来のトランスグルタミナーゼとは異なり、MTGをはじめとする微生物由来のトランスグルタミナーゼは、Ca2+非依存性であるため、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、あるいはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等に利用されている（特許文献６）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上利用性の高い酵素である。酵素反応条件については、例えば、ゲル化食品の場合、酵素反応時間が短いと固まらず、逆に反応時間が長過ぎると堅くなり過ぎて、商品とならない。そこで、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、あるいはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等にＭＴＧを利用する場合、基質及び酵素の濃度、反応温度、反応時間を調節することによって、目的物を作製している。しかしながら、MTGを利用した食品や試薬などが多岐にわたるにつれて、濃度、温度、時間等を調節するだけでは、目的とする製品を作製できない場合があり、MTGの酵素活性を改質する必要性が生じている。
　野生型MTG(野生型MTGとは、天然に存在し、アミノ酸配列の改変がおこなわれていないMTGを意味する)はpH約4～10の間で安定であることが知られており、比較的幅広いpHで安定と言えるが、極端な酸性やアルカリ性条件下での反応は困難である。また、野生型MTGの至適温度は約50℃であり、あまりに高い温度での反応も困難である。また、この至適温度より低い温度であっても、長時間のインキュベーションによって酵素活性の低下が生じ得る。従って、pH安定性、熱安定性などが向上した変異体トランスグルタミナーゼが存在すれば、トランスグルタミナーゼを新規な用途で使用することが可能になると考えられる。
　MTGはこれまで、主に食品分野で利用されてきたが、繊維、化成品(写真フィルム、皮なめし)、飼料、香粧品、医薬など様々な用途での応用可能性が示唆されている。
　繊維分野では、トランスグルタミナーゼによるウールの改質が知られている。すなわち、ウールをトランスグルタミナーゼで処理することによって、風合いを維持したまま防縮性、抗ピリング性および疎水性を付与できることが知られている(特許文献７)。トランスグルタミナーゼをウールに使用する場合、ケラチンへの反応を高温短時間で実施できると、単位時間あたりの処理量の増大がはかられ、生産効率が向上するので産業上有用であると考えられる。
　皮なめしとは、動物の皮(hide/skin)に、複数の工程からなる処理、加工を施し、皮を、耐久性、柔軟性のある革にする加工のことであるが、この加工は、6価クロムで皮のコラーゲンを架橋することによって行われる。6価クロムは、有害で環境中への放出が好ましくないため、代替法の開発が強く求められている。皮なめしへのトランスグルタミナーゼの利用については、特許文献８で微生物由来トランスグルタミナーゼが皮なめしに使用できることが開示されているが、実際に皮に作用させた実施例はなく、いまだ実用化されていない。6価クロムでの架橋は、pH3～4で行われるので、トランスグルタミナーゼもこのpHで反応することができれば好ましいと思われるが、MTGは酸性に弱いため、実際の適応は困難である。
　以上、繊維加工、皮なめし等の用途の場合、トランスグルタミナーゼの熱安定性(即ち耐熱性)を向上させ、高温短時間で反応を終了させること、また、pH安定性を向上させ、酸性領域での反応を可能とすることが望まれている。
　上記したように、トランスグルタミナーゼの酵素活性を改質、向上させる手段としては、トランスグルタミナーゼ自体の改質、即ち、トランスグルタミナーゼの熱安定性の向上、pH安定性の向上などが挙げられる。例えば、熱安定性を向上させることにより、より適用対象が広がり、反応速度の向上などが期待できる。また、pH安定性を向上させることにより、より広いpH範囲での酵素反応や保存が可能となろう。これは工業化においても有利であろう。
　トランスグルタミナーゼの耐熱性及び／又はpH安定性を改質するためには、トランスグルタミナーゼの変異体を作製し、その活性等を評価し、優良な変異体、即ち耐熱性及び／又はpH安定性が向上した変異体を探し出す必要がある。変異体を作製するには、野生型の遺伝子を操作する必要があり、従って、遺伝子組換えタンパク質が調製可能なことが必要条件となる。MTGの場合は、コリネバクテリウム・グルタミカムを用いての分泌発現系が確立されている(特許文献５)。
　タンパク質の安定性を高めるためには、一般的には、水素結合、静電的相互作用、疎水相互作用などの非共有結合、ジスルフィド結合などの共有結合を導入して、分子内部の疎水性コアのパッキングを強化したり、二次構造のαへリックスを安定化したりするなどの方法、あるいは、タンパク質の構造を不安定化させる因子を除去する方法を用いることができる。ジスルフィド結合の導入によってタンパク質の安定性を向上させるためには、システインを導入するのに適した位置を探索することが必要である。MTGの場合は、ジスルフィド結合の導入により耐熱性及び／又はpH安定性が向上した変異型トランスグルタミナーゼが創出されている(特許文献９)。
　特許文献９には、野生型トランスグルタミナーゼにジスルフィド結合を導入した変異型トランスグルタミナーゼ等が開示されている。例えば、特許文献９には、MTGの配列において、
　ａ）7位及び58位のシステインへの置換、
　ｂ）46位及び318位のシステインへの置換、
　ｃ）93位及び112位のシステインへの置換、
　ｄ）106位及び213位のシステインへの置換、
　ｅ）160位及び228位のシステインへの置換、
　ｆ）2位及び282位のシステインへの置換、
　ｇ）2位及び283位のシステインへの置換、
　ｈ）3位及び283位のシステインへの置換、及び
　ｉ）17位及び330位のシステインへの置換
から選択される少なくとも１の変異を有するトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質、それらをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することを含むトランスグルタミナーゼの製造方法などが開示され、かかる変異型トランスグルタミナーゼを用いる基質タンパク質の加工方法も開示されている。
　しかし、上記MTGにジスルフィド結合を導入した変異型トランスグルタミナーゼではある程度の耐熱性及び／又はpH安定性の向上が見られたものの、繊維加工などに用いられる高温に耐えるためには、耐熱性のさらなる向上が望まれる。
　MTGにジスルフィド結合を導入した変異型トランスグルタミナーゼの酵素活性を改質するためには、その変異体を作製し、その活性等を評価し、更なる優良な変異体を探し出す必要がある。変異体を作製するには、野生型の遺伝子を操作する必要があり、したがって、遺伝子組換え型タンパク質が調製可能なことが必要条件となる。MTGの場合は、コリネバクテリウム・グルタミカムを用いての分泌発現系が確立されている（特許文献５）。
　非特許文献５には、いくつかのMTG変異体が記載されているが、これらの変異体の耐熱性は、繊維加工等に用いられるような高温での使用には不十分である。
特表平10-504721号 欧州特許公開公報0 481 504 A1 特開平5-199883号 特開平6-30771号 WO2002/081694 特開昭64-27471号 特開平3-213574号 米国特許6,849,095号 WO2008/099898
K．Ikura et al. Biochemistry, 27, 2898, 1988 M.A.Phillips et al. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A, 87, 9333, 1990 A. Ichinose et al, Biochemistry, 25, 6900, 1986 T Kanaji et al, Journal of Biological Chemistry. 268, 11565,1993 C. K. Marx et al, Journal of Biotechnology, 136 (3), p.156-162, Sep 2008
　本発明の目的は、野生型(以下単にWTとも略す)トランスグルタミナーゼや特許文献９に記載されたWTトランスグルタミナーゼにジスルフィド結合を導入した変異型トランスグルタミナーゼ(以下単に「ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ」とも呼ぶ)と比較して耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供し、高温で短時間での酵素反応を可能とすることである。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特許文献９に記載されたジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ遺伝子にさらに変異を導入することによって、元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較して耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供し、本発明を完成させるに至った。本発明の変異体タンパク質は、高温で短時間での酵素反応を可能とし、繊維加工、皮なめしなどに好適である。
　本発明を概説すれば、以下に列挙するとおりである。
［１］トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、１０１位、１５７位又は２５０位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の１０１位、１５７位又は２５０位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
［２］下記ａ）～ｄ）から選択される少なくとも１つの変異をさらに有する、上記［１］記載のタンパク質：
　ａ）３位及び２８３位のシステインへの変異、
　ｂ）２位及び２８２位のシステインへの変異、
　ｃ）２位及び２８３位のシステインへの変異、
　ｄ）７位及び５８位のシステインへの変異。
［３］トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、３位及び２８３位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、３位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の３位及び２８３位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の３位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
［４］トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、２位及び２８２位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８２位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の２位及び２８２位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８２位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
［５］トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、２位及び２８３位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の２位及び２８３位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
［６］トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、７位及び５８位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、７位、５８位、１０１位、１５７位又は２５０位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の７位及び５８位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の７位、５８位、１０１位、１５７位又は２５０位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
［７］（Ａ）又は（Ｂ）における配列番号２の１０１位、１５７位及び２５０位、或いは（Ｃ）又は（Ｄ）におけるそれらに対応する位置のアミノ酸変異が、
　１０１位：プロリンへの変異、
　１５７位：アラニン又はセリンへの変異、
　２５０位：アラニン又はアルギニンへの変異
である、上記［３］に記載のタンパク質。
［８］配列番号２において、
３位のアスパラギン酸のシステインへの変異；
１０１位のセリンのプロリンへの変異；
１５７位のグリシンのセリンへの変異；
２５０位のグリシンのアルギニンへの変異；及び
２８３位のグリシンのシステインへの変異
を有する、上記［３］に記載のタンパク質。
［９］配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、以下のいずれかの変異の組合せを有する、上記［３］に記載のタンパク質：
（１）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン又はアスパラギン酸への変異；
（２）１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１０１位のセリンのグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸への変異；または
（３）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１５７位のグリシンのアラニン、バリン、イソロイシン、セリン、アスパラギン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸への変異。
［１０］配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、
１０１位のセリンのプロリンへの変異；
１５７位のグリシンのアラニン、セリンまたはアルギニンへの変異；及び
２５０位のグリシンのアラニン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンまたはアルギニンへの変異；
を有する、上記［３］に記載のタンパク質。
［１１］配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、以下のいずれかの変異の組合せを有する、上記［１０］に記載のタンパク質：
（１）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアラニン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンまたはアルギニンへの変異；
（２）１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１０１位のセリンのプロリンへの変異；または
（３）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１５７位のグリシンのアラニン、セリンまたはアルギニンへの変異。
［１２］配列番号２において、２０８位のアルギニンのロイシン、アラニン又はグルタミン酸への変異をさらに含む、上記［７］～［１１］のいずれか１項に記載のタンパク質。
［１３］配列番号２において、
（１）２０８位のアルギニンのトリプトファンへの変異、
（２）２６８位のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異、
（３）１３２位のバリンのロイシンへの変異、
（４）２３８位のアルギニンのメチオニンへの変異、又は
（５）２４９位のグルタミン酸のリジンへの変異、
をさらに含む、上記［８］に記載のタンパク質。
［１４］上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１５］上記［１４］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［１６］上記［１５］に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
［１７］上記［１６］に記載の宿主細胞を培養し、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
［１８］上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載のタンパク質、上記［１７］に記載の方法によって製造されたタンパク質、又は上記［１６］に記載の宿主細胞を基質タンパク質に作用させる工程を含む、当該基質タンパク質の加工方法。
［１９］基質タンパク質の加工が４０℃～１００℃で行われることを特徴とする、上記［１８］に記載の方法。
　本発明によれば、従来のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ（特に、ジスルフィド結合導入型MTG）の改変によって、耐熱性がさらに向上したトランスグルタミナーゼを提供することができる。更に、耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼを用いることにより、新規製品、及び新規技術を提供することができる。
図１は、ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼから誘導された多重変異体の耐熱性（残存活性）を示すグラフである。 図２は、実施例８で同定された６種の変異体の耐熱性（残存活性）を示すグラフである。 図３は、実施例１０の耐熱性評価の結果を示す図である。 図４Ａは、表６に列挙した変異体における耐熱性評価の結果を示すグラフである。 図４Ｂは、表６に列挙した変異体における耐熱性評価の結果を示すグラフである。 図４Ｃは、表６に列挙した変異体における耐熱性評価の結果を示すグラフである。 図５は、MSS2βBのR208にアミノ酸置換を実施した各種変異体における耐熱性評価の結果を示す図である。 図６は、表１１に列挙した変異体における耐熱性評価の結果を示すグラフである。
　以下、本発明を具体的に説明する。トランスグルタミナーゼは、ゼラチン、チーズ、ヨーグルト、豆腐、蒲鉾、ハム、ソーセージ、麺類などの食品の製造や食肉の肉質改善等に広く利用されている（特開昭64-27471号）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上種々の目的に使用されている酵素である。トランスグルタミナーゼは、タンパク質分子のペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ－カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する。タンパク質分子中のリジン残基のε－アミノ基がアシル受容体として作用するとタンパク質分子中及び分子間においてε－（γ－Glu）－Lys結合が形成される。
　トランスグルタミナーゼは、動物由来のCa2+依存性のものと微生物由来のCa2+非依存性のものとに大別される。微生物由来のTGとしては、放線菌由来のものが知られている。放線菌由来のTGのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の例を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これら以外のトランスグルタミナーゼホモログを用いても、本明細書中に記載される方法に従って、耐熱性が向上した変異体タンパク質を得ることができる。すなわち、トランスグルタミナーゼは、微生物種や株によってその配列が若干異なる場合もあるため、本発明の変異体タンパク質を得るために改変され得るトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列は、上記アミノ酸配列２、４、６、８、１０及び１２に限定されず、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質であれば、配列番号２、４、６、８、１０又は１２と70％、好ましくは80％、更に好ましくは90％、とりわけ好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性を有するタンパク質であれば、後述する方法と同様にしてアラインメントを実施し、対応するアミノ酸残基を特定することによって、当該アミノ酸残基に変異を導入し、本発明の変異体を得ることができる。なお、ここにいう「相同性」とは同一性をいう。
　相同性の解析は、例えば、「Genetyx ver. 7（Genetyx Corporation）」のデフォルトパラメーターを用いて計算することができる。
　さらに、前記配列番号１、３、５、７、９もしくは１１に記載のヌクレオチド配列と相補的な配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた本発明の変異体タンパク質の作成に用いることが出来る。
　ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、相同性が高いヌクレオチド配列同士、例えば80、90、95、97又は99％以上の相同性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1xSSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1xSSC、0.1％SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1xSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2～3回洗浄する条件などが挙げられる。
　プローブとして、配列番号１、３、５、７、９又は１１のヌクレオチド配列の部分配列を用いることもできる。そのようなプローブは、該ヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１、３、５、７、９又は１１のヌクレオチド配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗浄条件としては、50℃、2xSSC、0.1％SDSが挙げられる。
　トランスグルタミナーゼは、例えば微生物等（後述の形質転換体を含む）で発現・分泌されたものを、分離・回収・精製等の工程に付すことによって得ることができる。また、微生物等に発現させた状態で用いてもよい。
　「トランスグルタミナーゼ活性」とは、上記のように、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基との間に架橋を形成する活性を意味する。当該トランスグルタミナーゼ活性は、微生物等から分離・精製したTGの形態の他、微生物等に発現させた状態で測定することもできる。
　トランスグルタミナーゼ活性は、ハイドロキサメート法（J.Biol.Chem., 241, 5518-5525,1966）でアッセイすることができる。
　ハイドロキサメート法におけるトランスグルタミナーゼの活性単位は、次のように定義される。すなわち、ベンジルオキシカルボニル－L－グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロル酢酸存在下で鉄錯体に変換させた後、525 nmの吸光度で、その量を測定する。このようにしてヒドロキサム酸の量より検量線を作製し、1分間に1μモルのハイドロキサメートを生成させる酵素量をトランスグルタミナーゼの活性単位、1ユニットと定義する。この測定法の詳細は既に報告されている通り（例えば、特開昭64-27471号公報等参照）である。
　「WT（野生型）トランスグルタミナーゼ（TG）」とは、アミノ酸配列の変異が導入されていない天然に存在するトランスグルタミナーゼを意味する。
　また、本明細書中でいう「ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ（TG）」とは、WTトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列（配列番号２など）に、ジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸変異（互いに適当な空間位置にある任意の２つのアミノ酸残基の、システイン残基への置換）が導入されたトランスグルタミナーゼを意味する。本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を得るためには、この「ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ」を改変することが好ましく、また簡便である。これは、必要に応じて「元の（或いは鋳型）」ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼとも呼ぶ。また、WTトランスグルタミナーゼを改変することによっても得ることができる。
　このような「ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ」の例としては、上記WO2008/099898（特許文献９）に開示されたものが挙げられるがそれらに限定されず、ＷＴトランスグルタミナーゼと比較して耐熱性が向上したものを用いることが好ましい。本明細書では特に、これらのうち耐熱性に関して好成績を示したジスルフィド結合導入型変異体、即ち配列番号２の３位及び２８３位のアミノ酸がシステインに置換されたジスルフィド結合導入型ＴＧに対してランダム変異導入を行うことにより、本発明の耐熱性トランスグルタミナーゼ（本発明のトランスグルタミナーゼ変異体）を得る工程について詳述するが、これ以外のジスルフィド結合導入型ＴＧ（例、上記配列番号２、４、６、８、１０又は１２、あるいはそれらのホモログの３位及び２８３位並びにそれらに対応する位置のアミノ酸がシステインに置換したもの）を鋳型として用いてもよい。
　本明細書中では、ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼの耐熱性と比較して、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質の耐熱性が「向上」したとき、この変異体タンパク質は本発明の好ましい変異体である。
　本明細書中で、「耐熱性（即ち熱安定性）の向上」とは、長時間（例えば、約10分以上）にわたってWTトランスグルタミナーゼを用いることが不適当な温度範囲（長時間にわたるインキュベーションにより、WTトランスグルタミナーゼの活性が著しく低下する温度）、例えば約50℃以上、好ましくは約55℃以上、好ましくは約60℃以上、より好ましくは約65℃以上、さらに好ましくは約68℃以上の温度でも、酵素がその活性をより長時間保持できるようになることを意味する。即ち、「耐熱性の向上」とは、トランスグルタミナーゼを、このような範囲内の温度（例えば、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約68℃）で長時間（例えば、約1時間、約2時間、約3時間）インキュベートした場合の活性低下の割合が、WTトランスグルタミナーゼ、より好ましくは元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較して小さくなることを意味する。
　本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、例えば６５℃で、１０分間加熱した後に、残存活性が１％以上、３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上あるタンパク質である。
　生産効率の観点からは、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、WTトランスグルタミナーゼ又は元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ、特に元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較して、本明細書中に記載する方法などで発現させた場合にその発現量が著しく低下しないものであることが好ましい。
　本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、配列番号２において、（Ａ）１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；或いは（Ｂ）１０１位、１５７位又は２５０位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、を有するタンパク質である。さらに、（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、とりわけ好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上）の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；或いは（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の１０１位、１５７位又は２５０位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、を有するタンパク質もまた、本発明の範囲内である。
　上記タンパク質において、ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成し得るアミノ酸変異がさらに導入されているタンパク質もまた、本発明の範囲内である。当該変異としては特許文献９に開示されたものが挙げられるがそれらに限定されず、好ましくは、３位及び２８３位のシステインへの置換、２位及び２８２位のシステインへの置換、２位及び２８３位のシステインへの置換又は７位及び５８位のシステインへの置換から選択される少なくとも１つである。
　具体的には、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、配列番号2において、（Ａ）３位及び２８３位（或いは、２位及び２８２位、２位及び２８３位、又は７位及び５８位）にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１つの位置に変異を有するアミノ酸配列；或いは（Ｂ）上記（Ａ）で言及された位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、を有するタンパク質である。さらに、（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列中の、配列番号２の３位及び２８３位（或いは、２位及び２８２位、２位及び２８３位、又は７位及び５８位）に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１つの位置に変異を有するアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と70％以上（好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、とりわけ好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上）の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の３位及び２８３位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１つの位置に変異を有するアミノ酸配列；或いは（Ｄ）（Ｃ）の配列において、上記（Ｃ）で言及された位置以外の位置に、1～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、を有するタンパク質もまた、本発明の範囲内である。
　上記（Ｂ）のアミノ酸配列は、具体的には、配列番号２の３位及び２８３位（或いは、２位及び２８２位、２位及び２８３位、又は７位及び５８位）にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１つの位置に変異を有することに加えて、示された個々の位置及び／又はこれら以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列である。これは、上記（Ｄ）のアミノ酸配列についても同様に当てはまる。
　本明細書において、配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列中の、上記位置に「対応する」位置は、これらの配列と配列番号２のアミノ酸配列とをアラインさせて決定される。また、本明細書中に示されたもの以外のトランスグルタミナーゼホモログのアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列とアラインメントさせて「対応する」位置を決定し、その位置に変異を導入することも可能である。例えば、配列番号２と他の配列とをアラインさせる際にギャップが導入される場合は、上で言及した位置は前後にずれる可能性があることに留意すべきである。対応する位置については、例えばWO2008/099898（特許文献９）の図４を参照のこと。
　アミノ酸配列のアラインメントに使用されるアルゴリズムとしては、NCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］などが挙げられる。
　ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼ（MTG）以外でも、本酵素とアミノ酸配列の相同性が認められるトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素、あるいは、本酵素と類似の立体構造を持つと予想されるトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素の改変を、MTGの立体構造を基に行うことは十分可能である。MTGにおいて、基質特異性等の改変に有効であるアミノ酸置換は、ストレプトマイセス・シナモネウスやストレプトマイセス・リジクス（特表平10-504721号）等の微生物に由来する類縁酵素においても有効であることが予測される。
　好ましくは、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、配列番号２、４、６、８又は１０（相同な配列を含む）において、上記位置のうち３位及び２８３位（或いはそれらに対応する位置）がシステインに変異したタンパク質であり、且つ、３位及び２８３位でのシステイン残基に加えて、１０１位での変異（好ましくはプロリンへの変異）、１５７位での変異（好ましくはアラニン又はセリンへの変異）及び２５０位での変異（好ましくはアラニン又はアルギニンへの変異）（或いはそれらに対応する位置の同様の変異）から選択される変異を含む。本発明の変異体タンパク質は、これらの変異以外に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有していてもよい。
　本発明の変異体タンパク質は、得られるトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有している限り、特に元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較してその耐熱性が向上している限り、上記変異をいずれの組み合わせで含んでもよい。上記位置のアミノ酸変異は、アミノ酸置換変異であることが好ましい。
　また、これらの変異（特に上記３位及び２８３位におけるシステインへの変異）に加えて、システインへの変異を1対だけ又は複数対組み合わせて有していてもよい。このようなシステインへの変異の対としては、特許文献９に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。このようなタンパク質は、当該分野で公知の方法に従って作製できる。
　上述の置換、欠失、付加及び／又は挿入は、得られるトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有している限り、特にその耐熱性が元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較して向上している限り、特に限定されない。このような変異体タンパク質が有する置換、欠失、付加及び／又は挿入の数は、1～数残基（1～30、好ましくは1～15、更に好ましくは1～5、3若しくは2残基）であることが望ましいが、その変異体タンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有している限り、特にその耐熱性が元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較して向上している限り、任意の数のアミノ酸の置換、挿入、付加、欠失を含んでもよい。例えば、この変異が置換の場合、類似アミノ酸による置換（即ち、保存的アミノ酸置換）はタンパク質の機能に影響を与え難いことが予測されるので、類似アミノ酸による置換が好ましい。ここで「類似アミノ酸」とは、物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知である。
　最も好ましい本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異、１０１位のセリンのプロリンへの変異、１５７位のグリシンのセリンへの変異、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異を有するタンパク質である。
　また、配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、１０１位のセリンのプロリンへの変異、１５７位のグリシンのセリンへの変異及び２５０位のグリシンのアルギニンへの変異から選択される２つの変異を有し、残り１つの位置においてまた別のアミノ酸への変異を有するタンパク質も好ましい。好ましくは、このようなタンパク質は、配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、（１）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン又はアスパラギン酸への変異；（２）１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１０１位のセリンのグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸への変異；または（３）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１５７位のグリシンのアラニン、バリン、イソロイシン、セリン、アスパラギン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸への変異、を含むタンパク質である。
　配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、１０１位のセリンのプロリンへの変異；１５７位のグリシンのアラニン、セリンまたはアルギニンへの変異；及び２５０位のグリシンのアラニン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンまたはアルギニンへの変異を有するタンパク質もまた、好ましい。
　より好ましくは、配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、（１）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアラニン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンまたはアルギニンへの変異；（２）１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１０１位のセリンのプロリンへの変異；または（３）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１５７位のグリシンのアラニン、セリンまたはアルギニンへの変異、を含むタンパク質である。
　上に挙げた本発明の好ましいタンパク質において、２０８位のアルギニン残基がさらに変異しているタンパク質もまた好ましい。この好ましいタンパク質の例としては、配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異、１０１位のセリンのプロリンへの変異、１５７位のグリシンのセリンへの変異、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、２０８位のアルギニン残基がさらに変異しているタンパク質が挙げられる。例えばこの変異としては、２０８位のアルギニンの、ロイシン、アラニン又はグルタミン酸への変異が好ましい。
　或いは、配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異、１０１位のセリンのプロリンへの変異、１５７位のグリシンのセリンへの変異、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、（１）２０８位のアルギニンのトリプトファンへの変異、（２）２６８位のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異、（３）１３２位のバリンのロイシンへの変異、（４）２３８位のアルギニンのメチオニンへの変異、又は（５）２４９位のグルタミン酸のリジンへの変異、をさらに含むタンパク質もまた、本発明の好ましいタンパク質であり得る。
　本発明はまた、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチドと呼ぶ）を提供する。このようなポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法（例えば、本明細書中に記載した方法）を用いて取得可能である。適切な制限酵素を用いて、このポリヌクレオチドをベクターに挿入し、組換えベクターを得ることができる。
　本発明の組換えベクターに使用するベクター骨格は、その目的（例えば、クローニング、タンパク質の発現）に応じて、或いはこのベクターを導入すべき宿主細胞、好ましくは微生物に適したものを適宜選択し、使用することができる。この組換えベクターが発現ベクターである場合、この発現ベクターは、適切なプロモーターに機能可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含み、好ましくは本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。また、発現したタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列をコードする配列等を含んでもよい。また、ベクターは、対象宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。
　ベクターは、例えば、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、ポリエチレングリコール法、リチウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、パーティクル・ガン法等の、公知の形質転換技術を用いて、対象宿主細胞内に導入することができる。
　本発明は、このような組換えベクターで形質転換された宿主細胞（以下、本発明の形質転換体ともいう）もまた提供する。宿主細胞としては、大腸菌及び放線菌等の原核細胞並びに酵母等の真核細胞が挙げられる。タンパク質を発現させることを所望する場合、この宿主細胞は、タンパク質の産生に適し、且つ本発明の変異体タンパク質を機能的な形態で発現できる宿主細胞である。本発明の形質転換体は、上記形質転換技術を使用して得ることができる。使用可能な組換えベクター系の開発された微生物であれば、いずれの微生物であっても宿主細胞として利用可能であるが、好ましい宿主細胞としては、E. coli、コリネバクテリウム・グルタミカム、酵母、バチルス属細菌、各種放線菌などが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の形質転換体は、当該分野で通常使用されている条件で培養することができる。例えば、培養の温度、時間、培地組成、pH、攪拌条件などは、培養する形質転換体に応じて適宜選択できる。
　本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、本発明の形質転換体によって発現される。トランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、当該形質転換体から分泌されるか、当該形質転換体から分離・精製して使用してもよく、当該変異体タンパク質を含んだ形質転換体としてそのまま使用してもよい。タンパク質の分離・精製は自体公知の方法に従って実施され得る。
　また、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、プロ体として発現させ、その後適切なプロテアーゼ（例、サチライシン）で処理して成熟体としてもよく、或いはプロ体とプロテアーゼとを対象宿主細胞中で同時に発現させて成熟体を得てもよい。
　本発明においては、ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼの耐熱性をさらに向上させるために、ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ遺伝子にランダム変異を導入することによって、元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼと比較して耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供する。
　ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ遺伝子へのランダム変異の導入とジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ変異体の一次スクリーニングは、以下のように行うことができる。S. mobaraense DSMZ株由来トランスグルタミナーゼ遺伝子の配列は既に決定されている（Eur. J. Biochem.,257, 570-576, 1998）。この配列を参考にして、MTG活性本体をコードしている成熟体領域（約1,000bp）に７位及び58位のシステインへの置換、もしくは２位及び282位のシステインへの置換、もしくは２位及び283位のシステインへの置換、もしくは３位及び283位のシステインへの置換が導入された変異型トランスグルタミナーゼ遺伝子を構築する。このジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ遺伝子に、変異が塩基配列レベルで2から3箇所となるように変異を導入する。変異を導入したPCR産物とMTG発現ベクターpPSPTG11（App. Env. Micro., 2003, 69, 358-366）を制限酵素で処理し、ライゲーションすることにより、pPSPTG11のMTG遺伝子部分を、変異を導入したMTG遺伝子と置換することが容易にできる。ライゲーションによって作成したプラスミドで、E.coliを形質転換し、得られたコロニーをミックスカルチャーし、プラスミド抽出を行う。得られたプラスミドによって、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）（WO 2002 / 081694）から構築したＹＤＫ０１０（構築方法はWO2002/081694に記載）をエレクトロポレーションで形質転換する。
　形質転換体のスクリーニングはハイドロキサメート法（J.Biol.Chem., 241, 5518-5525,1966）で実施できる。アッセイは、96穴ウエルを用いても、試験管を用いてもよい。変異を導入していない株をコントロールとすると、吸光度がコントロールと同等以上のものを選抜することができる。
　また、スクリーニングで得られた株の塩基配列を確認することで、変異点の解析を行うことができる。変異点が確認されたものに関しては、活性、タンパク量を測定することによって、比活性を算出することができる。活性、タンパク量は、文献（Prot. Exp. Puri., 2002, 26, 329-335）記載の方法で測定できる。
　塩基配列を確認することで、高活性となる変異部位を同定した後、複数の変異の入っている変異体が存在していた場合は、変異点を一つだけ導入した変異体を作成し、変異点の活性に及ぼす効果を正確に評価することもできる。また、同定された変異点から複数を選択して多重変異体を作成し、変異点の組み合わせの効果を評価することもできる。変異の導入は、Stratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitなどを用いることによって簡便に行える。
　得られた形質転換体の培養、トランスグルタミナーゼ変異体タンパク質の分離・精製は、例えば以下のように行うことができる。カナマイシンを含むCM2G培地を試験管に分注する。形質転換体を植菌し、30℃、24時間前培養する。カナマイシンとCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液を接種し、培養する。培養液を遠心後、上清をフィルター濾過し、Sephadex G25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液，pH 7.0に置換する。サチライシンをトランスグルタミナーゼの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、トランスグルタミナーゼを活性化する。活性化した溶液を、Sephadex G25(M)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液（20 mM　酢酸緩衝液，pH 5.5）に交換する。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（リソースS　6 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に全量を負荷する。同緩衝液で再平衡化後、波長280nmでのUV吸収を指標に0→0.5 M NaClの直線濃度勾配により溶出される、NaCl濃度が200 mM近辺に溶出してくるタンパク質画分を分画する。画分の活性、タンパク量を測定し、比活性が低い画分を除いた比活性がほぼ同等なピークトップ近傍の画分を回収する。回収した画分をSephadex G25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液, pH 6.0に置換する。得られたサンプルは濃度を20mM リン酸緩衝液, pH 6.0で約1mg/mlに希釈し、使用時まで-80℃で保存する。
　本発明は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質、又は当該タンパク質を発現している形質転換体を使用して、基質タンパク質を加工する方法もまた提供する。トランスグルタミナーゼの基質となり得るタンパク質としては、トランスグルタミナーゼがアクセス可能なグルタミン残基及び／又はリジン残基を有するタンパク質が挙げられる。この方法は、タンパク質の架橋反応を、WTトランスグルタミナーゼ又は従来のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼを用いることが不適当な温度範囲で実施することが所望される種々の用途（繊維加工、皮なめし等）に適用できる。
　例えば、本発明の変異体タンパク質は、約40℃～約100℃、好ましくは約50℃～約100℃、より好ましくは約55℃～約100℃、さらに好ましくは約60℃～約100℃、なおより好ましくは約65℃～約100℃で実施される反応において使用することができる。特に、繊維加工で使用される高温処理は、少なくとも約60℃の温度で実施されるため、本発明の変異体タンパク質は当該繊維加工での使用に適している。
　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１　ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ遺伝子へのランダム変異の導入とジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ変異体のスクリーニングライブラリー構築
　MTG遺伝子は、プレ領域、プロ領域、成熟体領域の三領域からなる。ジスルフィド結合を形成させるためにD3CとG283Cの変異が導入された（D3C/G283C）MTG活性本体をコードしている成熟体領域（約1000bp）にエラープローンPCRにより、変異を導入した。S. mobaraense DSMZ株由来トランスグルタミナーゼ遺伝子の配列は既に決定されている（Eur. J. Biochem., 257, 570-576, 1998）。この配列を参考にして、成熟体領域の上流と下流にそれぞれ、Forward primer （TCCATAGCAATCCAAAGG（配列番号１３））、Reverse primer (GGGCGACCGAGAAGTTTTTTACAAAAGGCA（配列番号１４）)を合成し、下記の反応液組成、条件にて、Genemorph Ver.2(STRATAGENE社製)キットを用いて業者の推奨する方法に従いエラープローンPCRを実施した。反応液組成は、変異が塩基配列レベルで2から3箇所の変異が導入されるように設定した。得られたPCR産物をAppl.Environ.Microbiol., 2003, 69(1), 358-366 記載のプロＭＴＧ発現ベクターpPSPTG11の相当部分と置換するため、BamHIで処理（37℃、2時間）後、EcoO65Iで処理（37℃、2時間）した。ベクターの方は、切り出して60μlのddH2Oに溶かした。PCR産物はエタノール沈殿で精製した。ベクター：PCR産物＝1:5になるように混合したのち、Ligation Solution Kit I(タカラ社製)で16℃、3時間反応させ、ライゲーションさせた。ライゲーションによって作成したプラスミドで、E.coli JM109 を形質転換し、コロニー4500個を得、500個ずつまとめてプラスミド抽出を行った。エレクトロポレーションによって、抽出して得られたプラスミドでコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）（WO 2002 / 081694）から構築したＹＤＫ０１０（構築方法はWO 2002 / 081694に記載）を形質転換し、形質転換体を25μg／mlカナマイシンを含むCM2Gプレート（Glucose 5g, Polypepton 10g, Yeast extract 10g, NaCl 5g, DL-Met 0.2g, pH7.2／1L）で培養（30℃、24時間）した。エレクトロポレーションは、文献（FEMS Microbiol. Lett., 53, 299-303, 1989）記載の方法で実施した。
実施例２　ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ変異体の一次スクリーニング
　25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地（Glucose 5g, Polypepton 10g, Yeast extract 10g, NaCl 5g, DL-Met 0.2g, pH7.2／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注した。実施例１で得られた形質転換体（約10000株）を植菌し、1,500rpmで、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地（Glucose 60g, MgSO4・7H2O 1g, FeSO4・7H2O 0.01g, MnSO4・5H2O 0.01g, (NH4)2SO430g, KH2PO4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注し、前培養液を50μlずつ継代した。1,500rpmで、30℃、5時間培養した後、DTTが 3 mM の濃度になるよう96穴ディープウエルに添加した。DTT添加後、1500rpmで、30℃、43時間培養した。培養液を3000rpmで、4℃、10分間遠心し、得られた培養上清200 μLを20mM MOPS， pH 7で5倍に希釈した。希釈液にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。ハイドロキサメート法で活性を測定することによってスクリーニングを行った。活性測定では、96穴ウエルに、活性化した溶液30μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μlずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μlずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。次に反応液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した反応液をサーマルサイクラーを用いて65℃で、10分間加熱した。加熱処理した反応液を上記と同様、ハイドロキサメート法で活性を測定した。元のジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ変異体（即ち、D3CとG283Cの変異が導入された株）をコントロールとして、加熱処理前後の吸光度がコントロールと同等程度でかつ加熱処理前と加熱処理後の吸光度から導き出される残存活性が同等以上の70株を選抜した。なお、以下D3CとG283Cの変異が導入された株、該株より得られるジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ（タンパク質）を便宜上、D3C/G283C、3/283或いは3-283とも称する。
実施例３　一次スクリーニング株の変異点解析
　スクリーニングで得られた株の塩基配列を確認することで、変異点の解析を行った。スクリーニングで得られた株を25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地で、30℃、24時間培養後、QIAGEN社のQIAprepSpin Miniprep Kitにてプラスミドを抽出し、E.coli JM109株に形質転換した。形質転換したE.coli JM109株をLB培地で、37℃、16時間培養後、同様にプラスミドを抽出した。ABI PRISM Cycle Sequencing Kitを用い、業者の推奨する方法に従い、塩基配列の解析を行った。その結果、47株において変異点の存在が確認され、30種類の変異体が同定された（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４　ジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ変異体の二次スクリーニング
　25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地を３ｍｌずつ試験管に分注した。一次スクリーニングで選抜した変異体30種類を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を４ｍｌずつ試験管に分注し、前培養液50μlずつ継代した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（10,000rpm、10分間）し、得られた培養上清にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。活性化した溶液をPD-10（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、溶媒を20mM MES，pH6.0に置換した。培養液を適宜希釈し、実施例２と同様の方法で二次スクリーニングを行った。加熱処理後のハイドロキサメート活性を測定した結果、7種類の変異体(表３)が、コントロールである3-283と同等かそれ以上の残存活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例５　二次スクリーニングで選抜されたジスルフィド結合導入型トランスグルタミナーゼ酵素の精製
　25μg／mlカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地を３ｍｌ試験管に分注した。二次スクリーニングで選抜された７種類の変異体及びコントロール（3-283）を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液2.5ｍｌを接種し、30℃で48時間培養した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（8,000rpm、10分間）し、得られた培養上清にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。活性化した溶液を、SephadexG25(M)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液（20mM 酢酸緩衝液，pH5.5）に交換した。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（リソースS　6 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に全量を負荷した。同緩衝液で再平衡化後、波長280nmでのUV吸収を指標に0→0.5M NaClの直線濃度勾配により溶出されるNaCl濃度が200 mM近辺に溶出してくるタンパク質画分を分画した。前述の方法で、画分の活性、タンパク量を測定し、比活性が低い画分を除いた比活性がほぼ同等なピークトップ近傍の画分を回収した。回収した画分をSephadexG25(M)を用いて、溶媒を20mM リン酸緩衝液, pH 6.0に置換した。なお、クロマトグラフィーは全て室温で行った。
実施例６　精製変異酵素の耐熱性評価
　精製した8種類の変異酵素を0.5mg/mLになるように調製した。酵素溶液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。酵素溶液をサーマルサイクラーを用いて63℃、64.8℃、66.6℃、68.4℃で、それぞれ10分間加熱した。96穴ウエルに、非加熱の酵素溶液と上記で加熱処理した酵素溶液30μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μlずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μlずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。非加熱の酵素溶液の吸光度の値を100%とし63℃、64.8℃、66.6℃、68.4℃での残存活性を算出した。
　耐熱性評価の結果は、表４にまとめた。66.6℃の条件で7種類すべての変異体で耐熱性が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例７　有望変異点の組み合わせ
　スクリーニングの結果、7種類の変異体が選抜され、7箇所の変異部位が同定された。それらを組み合わせることでさらに耐熱性を向上させることを目的とし、多重変異体を構築した。変異の導入は、実施例１と同様に、Stratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、実施例３で同定された4-3-11H（表５のMSS2）に変異を導入した。変異が導入されているかどうかは、前述の方法と同様に、塩基配列を解析することによって確認した。構築した変異体を表５にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例８　有望多重変異体の選抜
　実施例７で構築したプラスミドを、コリネ菌にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体を作製した。25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地（Glucose 5g, Polypepton 10g, Yeast extract 10g, NaCl 5g, DL-Met 0.2g, pH7.2／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注した。形質転換体を植菌し、1,500rpmで、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地（Glucose 60g, MgSO4・7H2O 1g, FeSO4・7H2O 0.01g, MnSO4・5H2O 0.01g, (NH4)2SO430g, KH2PO4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注し、前培養液を50μlずつ接種した。1,500rpmで、30℃、5時間培養した後、DTTが 3 mM の濃度になるよう96穴ディープウエルに添加した。DTT添加後、1500rpmで、30℃、43時間培養した。培養液を3000rpmで、4℃、10分間遠心し、得られた培養上清200μLを20mM MOPS，pH 7で5倍に希釈した。希釈液にサチライシンを各TGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、各TGを活性化した。ハイドロキサメート法で活性を測定することによってスクリーニングを行った。活性測定では、96穴ウエルに、活性化した溶液30μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μlずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μlずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。次に反応液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した反応液をサーマルサイクラーを用いて67℃で、10分間加熱した。加熱処理した反応液を上記と同様、ハイドロキサメート法で活性を測定した。その結果、コントロール（3-283）に対して酵素活性と発現量が同等以上でかつ残存活性が大幅に向上した変異体が6種類（MSS2αA、MSS2αB、MSS2β、MSS2βA、MSS2βA+1及びMSS2βB）同定された(表５、図1)。
実施例９　有望多重変異体の精製および耐熱性評価
　25μg／mlカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地を３ｍｌ試験管に分注した。実施例８で同定された6種類の変異体を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液2.5ｍｌを継代した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（8,000rpm、10分間）し、得られた培養上清にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。活性化した溶液を、SephadexG25(M)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液（20mM 酢酸緩衝液，pH5.5）に交換した。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（リソースS　6 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に全量を負荷した。同緩衝液で再平衡化後、波長280nmでのUV吸収を指標に0→0.5 M NaClの直線濃度勾配により溶出されるNaCl濃度が200 mM近辺に溶出してくるタンパク質画分を分画した。前述の方法で、画分の活性、タンパク量を測定し、比活性が低い画分を除いた比活性がほぼ同等なピークトップ近傍の画分を回収した。回収した画分をSephadexG25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液, pH 6.0に置換した。なお、クロマトグラフィーは全て室温で行った。精製した６種類の変異酵素を0.5mg/mLになるように調製した。酵素溶液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。酵素溶液をサーマルサイクラーを用いて63.6℃、64.2℃、66.8℃、68.2℃、69.7℃、71.1℃で、それぞれ10分間加熱した。96穴ウエルに、非加熱の酵素溶液と上記で加熱処理した酵素溶液を30μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μlずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μｌずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。非加熱の酵素溶液の吸光度の値を100%として63.6℃、64.2℃、66.8℃、68.2℃、69.7℃、71.1℃での残存活性を算出した。
　耐熱性評価の結果は、図2にまとめた。68.2℃で10分間加熱処理した場合、コントロールである親酵素は失活するが、αA、αB、β、βA、βA+1、βBの6種類とも耐熱性が大幅に向上していることが認められた。
実施例１０　ハイドロキサメート法によるMSS2βBの耐熱性評価
　実施例９記載の方法に従って精製したMSS2βB(S101→P、G157→S、G250→R)、D3C/G283C、野生型MTG(本実施例で以下単にMTGという)を用い、活性の温度依存性をハイドロキサメート法により測定した。酵素濃度は Protein Expr.Purif. 26 (2002) 329-335 記載の方法に従い、逆相クロマトグラフィーによって決定した。あらかじめ35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を試験管に1.0mL分注し、酵素溶液を100μLを加え、各温度で10分間反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を1.0mL分注し、反応を停止させた後、525nmの吸光度を測定した。比活性は Protein Expr.Purif. 26 (2002) 329-335 記載の方法に従い算出した。
　耐熱性評価の結果は、図3にまとめた。MTGは45℃から50℃で活性が極大を示し約45 U/mg の比活性を示した。D3C/G283Cは55℃から60℃で活性が極大を示し約75 U/mg の比活性を示し、MTGを耐熱性で10℃上回り、比活性で2倍となった。MSS2βB(S101→P、G157→S、G250→R) は60℃から65℃で活性が極大を示し約115 U/mg の比活性を示し、D3C/G283Cを耐熱性で5℃上回り、比活性の極大値も50%程度向上した。
実施例11　導入変異点部位の耐熱性向上効果の確認
　上記実験の結果、MSS2βB(S101→P、G157→S、G250→R)がD3C/G283Cより耐熱性が向上していることが認められた。D3C/G283Cに導入した変異点S101→P、G157→S、G250→Rについて、これらの変異点導入部位が耐熱性の向上に寄与することを確認するために、アミノ酸置換による検証を行った。具体的には、G157→S、G250→Rを導入したD3C/G283CにS101→G,A,V,I,P,F,N,Q,Y,K,R,Eのアミノ酸置換を実施した変異体、S101→P、G250→Rを導入したD3C/G283CにG157→A,V,I,S,N,K,R,H,D,Eのアミノ酸置換を実施した変異体、S101→P、G157→Sを導入したD3C/G283CにG250→A,V,L,M,P,F,W,S,T,N,Q,Y,K,R,H,Dのアミノ酸置換を実施した変異体をそれぞれ構築した。アミノ酸置換を実施するための変異の導入は、実施例１と同様に、Stratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、実施例７で同定されたMSS2βBに変異を導入した。変異が導入されているかどうかは、前述の方法と同様に、塩基配列を解析することによって確認した。構築した変異体を表６にまとめた。構築したプラスミドをコリネ菌にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例12　アミノ酸置換を実施した変異体の粗精製および耐熱性評価
　25μg／mlカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地を３ｍｌ試験管に分注した。実施例11で作製した変異体を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を4 ｍｌずつ試験管に分注し、前培養液0.2ｍｌを継代した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（8,000rpm、10分間）した。得られた培養上清を酵素濃度が0.1～0.2mg/mL になるように調製したのち、PD-10カラム（GEヘルスケア社製）に負荷し、室温にて20mM 酢酸ナトリウム緩衝液，pH5.0に交換することで粗精製した。粗精製した酵素溶液3.0mL に対して pH 6.8～7.0になるように水酸化ナトリウムを慎重に加え、サチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、変異酵素を活性化した。活性化した変異酵素溶液を20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0 で2倍希釈した。2倍希釈した酵素溶液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した酵素溶液を、サーマルサイクラーを用いて、25℃、60℃、67℃でそれぞれ10分間加熱した。96穴ウエルに、上記で加熱処理した酵素溶液20μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μLずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μLずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。25℃で加熱した酵素溶液の吸光度の値を100%として60℃、67℃での残存活性を算出した。
　耐熱性評価の結果は、図4にまとめた。S101に対してアミノ酸置換を実施した変異体(G157→S、G250→Rも変異点として導入)、G157に対してアミノ酸置換を実施した変異体(S101→P、G250→Rも変異点として導入)、G250に対してアミノ酸置換を実施した変異体(S101→P、G157→Sも変異点として導入)では、作製したすべての変異体において、67℃で10分間加熱処理した場合の残存活性がコントロールであるD3C/G283Cを上回った（図4(A)、(B)、(C)）。以上の結果より、S101、G157、G250の3点にアミノ酸置換を導入することで、MTGの耐熱性が向上することが明らかとなった。
実施例13　MSS2βBへの変異導入と、得られた変異体（以下、MSS2βB変異体と呼ぶ場合がある）のスクリーニングライブラリー構築
　MTG遺伝子は、プレ領域、プロ領域、成熟体領域の三領域からなる。ジスルフィド結合を形成させるためにD3CとG283Cの変異を導入し（D3C/G283C）、さらに耐熱性を向上させることを目的にS101P、G157S、G250Rの変異を導入したMSS2βB（D3C/S101P/G157S/G250R/G283C）活性本体をコードしている成熟体領域（約1000bp）にエラープローンPCRにより、変異を導入した。成熟体領域の上流と下流にそれぞれ、Forward primer（TCCATAGCAATCCAAAGG（配列番号１３））、Reverse primer(GGGCGACCGAGAAGTTTTTTACAAAAGGCA（配列番号１４）)を合成し、下記の反応液組成、条件にて、Genemorph Ver.2(STRATAGENE社製)キットを用いて業者の推奨する方法に従いエラープローンPCRを実施した。反応液組成は、変異が塩基配列レベルで3箇所程度の変異が導入されるように設定した。得られたPCR産物とベクターpPSPTG11をライゲーションするために、BamHIで処理（37℃、2時間）後、EcoO65Iで処理（37℃、2時間）した。ベクターの方は、切り出して60μlのddH2Oに溶かした。PCR産物はエタノール沈殿で精製した。ベクター：PCR産物＝1:5になるように混合したのち、Ligation Solution Kit I(タカラ社製)で16℃、3時間反応させ、ライゲーションさせた。ライゲーションによって作成したプラスミドで、E.coli JM109 を形質転換し、コロニー4500個を得、500個ずつまとめてプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドを用いてエレクトロポレーションによって実施例1記載のＹＤＫ０１０を形質転換した。形質転換体を25μg／mlカナマイシンを含むCM2Gプレート（Glucose 5g, Polypepton 10g, Yeast extract 10g, NaCl 5g, DL-Met 0.2g, pH7.2／1L）で培養（30℃、24時間）した。エレクトロポレーションは、文献（FEMS Microbiol. Lett., 53, 299-303, 1989）記載の方法で実施した。
実施例14　MSS2βB変異体の一次スクリーニング
　25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地（Glucose 5g, Polypepton 10g, Yeast extract 10g, NaCl 5g, DL-Met 0.2g, pH7.2／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注した。実施例１３で得られた形質転換体（約8200株）を植菌し、1,500rpmで、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地（Glucose 60g, MgSO4・7H2O 1g, FeSO4・7H2O 0.01g, MnSO4・5H2O 0.01g, (NH4)2SO430g, KH2PO4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注し、前培養液を50μlずつ継代した。1,500rpmで、30℃、5時間培養した後、DTTが 3 mM の濃度になるよう96穴ディープウエルに添加した。DTT添加後、1500rpmで、30℃、43時間培養した。培養液を3000rpmで、4℃、10分間遠心し、得られた培養上清200 μLを20mM MOPS pH 7で5倍に希釈した。希釈液にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。ハイドロキサメート法で活性を測定することによってスクリーニングを行った。活性測定では、96穴ウエルに、活性化した溶液30μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μｌずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μｌずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。次に反応液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した反応液を、サーマルサイクラーを用いて、67℃で、10分間加熱した。加熱処理した反応液を上記と同様、ハイドロキサメート法で活性を測定した。MSS2βBをコントロールとして、加熱処理前後の吸光度がコントロールと同等程度でかつ加熱処理前と加熱処理後の吸光度から導き出される残存活性が同等以上の171株を選抜した。
実施例15　一次スクリーニング株の変異点解析
　スクリーニングで得られた株の塩基配列を確認することで、変異点の解析を行った。スクリーニングで得られた株を25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地で、30℃、24時間培養後、QIAGEN社のQIAprepSpin Miniprep Kitにてプラスミドを抽出し、E.coli JM109株を形質転換した。形質転換したE.coli JM109株をLB培地で、37℃、16時間培養後、同様にプラスミドを抽出した。ABI PRISM Cycle Sequencing Kitを用い、業者の推奨する方法に従い、塩基配列の解析を行った。その結果、86種類の変異体が同定された（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例16　MSS2βB変異体の二次スクリーニング
　25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地（Glucose 5g, Polypepton 10g, Yeast extract 10g, NaCl 5g, DL-Met 0.2g, pH7.2／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注した。実施例15で選抜された形質転換体86種類のうち単独変異あるいは2重変異が導入された73種類を8連で植菌し、1,500rpmで、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地（Glucose 60g, MgSO4・7H2O 1g, FeSO4・7H2O 0.01g, MnSO4・5H2O 0.01g, (NH4)2SO4 30g, KH2PO4 1.5g, VB1-HCl 0.45mg, Biotin 0.45mg, DL-Met 0.15g, pH 7.5／1L）を１ｍｌずつ96穴ディープウエルに分注し、前培養液を50μlずつ継代した。1,500rpmで、30℃、5時間培養した後、DTTが 3 mM の濃度になるよう96穴ディープウエルに添加した。DTT添加後、1500rpmで、30℃、43時間培養した。培養液を3000rpmで、4℃、10分間遠心し、得られた培養上清200 μLを20mM MOPS pH 7で5倍に希釈した。希釈液にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。ハイドロキサメート法で活性を測定することによってスクリーニングを行った。活性測定では、96穴ウエルに、活性化した溶液30μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μLずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μLずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。次に反応液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した反応液をサーマルサイクラーを用いて67℃で、10分間加熱した。加熱処理した反応液を上記と同様、ハイドロキサメート法で活性を測定した。加熱処理後のハイドロキサメート活性を測定した結果、8種類の変異体(表8)が、コントロールであるMSS2βBと同等かそれ以上の残存活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例17　二次スクリーニングで選抜されたMSS2βB変異体の精製
　25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地を３ｍｌ試験管に分注した。二次スクリーニングで選抜された8種類の変異体及びコントロール（MSS2βB）を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液2.5ｍｌを継代し、30℃で48時間培養した。継代した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（8,000rpm、10分間）し、得られた培養上清にサチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、MTGを活性化した。活性化した溶液を、SephadexG25(M)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液（20mM 酢酸ナトリウム緩衝液，pH5.5）に交換した。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（リソースS　6 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に全量を負荷した。同緩衝液で再平衡化後、波長280nmでのUV吸収を指標に0→0.5M NaClの直線濃度勾配により溶出されるNaCl濃度が200 mM近辺に溶出してくるタンパク質画分を分画した。前述の方法で、画分の活性、タンパク量を測定し、比活性が低い画分を除いた比活性がほぼ同等なピークトップ近傍の画分を回収した。回収した画分をSephadexG25(M)を用いて、溶媒を20mM リン酸緩衝液, pH 6.0に置換した。なお、クロマトグラフィーは全て室温で行った。
実施例18　精製変異酵素の耐熱性評価
　精製した8種類の変異酵素を0.1mg/mLになるように調製した。酵素溶液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。酵素溶液をサーマルサイクラーを用いて25℃、67℃、70℃で、それぞれ10分間加熱した。96穴ウエルに、上記で加熱処理した酵素溶液を20μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μｌずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μｌずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。25℃で加熱した酵素溶液の吸光度の値を100%とし67℃、70℃での残存活性を算出した。
　耐熱性評価の結果は、表９にまとめた。70℃の条件で2-4-11A(R208L)、5-5-11A(D268N)、9-7-2A(V132L)、11-3-10B(R238M)、12-2-9A(R208W)、12-6-9F(E249K)で耐熱性が向上することが分かった。この中で2-4-11A(R208L)が最も高い残存活性を示した。また、12-2-9A(R208W)がスクリーニングで抽出されていることより、R208に変異を導入することでMSS2βBの耐熱性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例19　R208の耐熱性向上効果の確認
　実施例18の結果より、2-4-11A(R208L)がMSS2βBより耐熱性が向上していることが認められた。MSS2βBに導入した変異点R208→Lについて、この変異点導入部位が耐熱性の向上に寄与することを確認するために、アミノ酸置換による検証を行った。具体的には、MSS2βBにR208→A,L,I,W,N,Y,Eのアミノ酸置換を実施した変異体を構築した。アミノ酸置換を実施するための変異の導入は、実施例１３と同様に、Stratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、MSS2βBに変異を導入した。変異が導入されているかどうかは、前述の方法と同様に、塩基配列を解析することによって確認した。構築した変異体を表10にまとめた。構築したプラスミドを、コリネ菌にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例20　アミノ酸置換を実施した変異体の粗精製および耐熱性評価
　25μg／mlカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地を３ｍｌ試験管に分注した。実施例１９で作製した変異体を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を4 ｍｌずつ試験管に分注し、前培養液0.2ｍｌを継代した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（8,000rpm、10分間）した。得られた培養上清を酵素濃度が0.1～0.2mg/mL になるように調製したのち、PD-10カラム（GEヘルスケア社製）に負荷し、室温にて20mM 酢酸ナトリウム緩衝液，pH5.0に交換することで粗精製した。粗精製した酵素溶液3.0mL に対して pH 6.8～7.0になるように水酸化ナトリウムを慎重に加え、サチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、変異酵素を活性化した。活性化した変異酵素溶液を20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0 で2倍希釈した。2倍希釈した酵素溶液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した酵素溶液を、サーマルサイクラーを用いて、25℃、60℃、67℃でそれぞれ10分間加熱した。96穴ウエルに、上記で加熱処理した酵素溶液20μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μLずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μLずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。25℃で加熱した酵素溶液の吸光度の値を100%として60℃、67℃での残存活性を算出した。
　耐熱性評価の結果は、図5にまとめた。MSS2βBのR208に対してアミノ酸置換を実施した変異体では、R208A、R208L、R208Eの3つのアミノ酸置換を実施すると、67℃で10分間加熱処理した場合の残存活性がコントロールであるMSS2βBを上回った。以上の結果より、R208をAあるいはLあるいはEに置換することで、MSS2βBの耐熱性が向上することが明らかとなった。
実施例21　有望変異点の組み合わせ
　実施例18の結果より、MSS2βB に2-4-11A(R208L)を導入した場合、耐熱性が向上することが分かった。そこで、実施例18で抽出された他の変異点、すなわちV132L、R238M、E249K、D268Nをそれぞれ2-4-11A(R208L)に導入した多重変異体を作製し、耐熱性向上効果を確認することにした。変異の導入は、実施例１３と同様に、Stratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、2-4-11A(R208L)に変異を導入した。変異が導入されているかどうかは、前述の方法と同様に、塩基配列を解析することによって確認した。構築した変異体を表11にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例22　有望多重変異体の耐熱性評価
　実施例21で構築したプラスミドを、コリネ菌にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体を作製した。25μg／mlカナマイシンを含むCM2G培地を３ｍｌ試験管に分注した。作製した形質転換体を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシンと50g/LのCaCO3を含むMM培地を4 ｍｌずつ試験管に分注し、前培養液0.2ｍｌを継代した。30℃、5時間培養した後、DTTが3 mMの濃度になるよう添加した。DTT添加後、30℃、43時間培養した。培養液を遠心（8,000rpm、10分間）した。得られた培養上清を酵素濃度が0.1～0.2mg/mL になるように調製したのち、PD-10カラム（GEヘルスケア社製）に負荷し、室温にて20mM 酢酸ナトリウム緩衝液，pH5.0に交換することで粗精製した。粗精製した酵素溶液3.0mL に対して pH 6.8～7.0になるように水酸化ナトリウムを慎重に加え、サチライシンをMTGの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、変異酵素を活性化した。活性化した変異酵素溶液を20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0 で2倍希釈した。2倍希釈した酵素溶液100μLを96穴ディープウエルに分注し、PMSFを1mMになるように添加し、25℃で、1時間反応させた。PMSF処理した酵素溶液を、サーマルサイクラーを用いて、25℃、60℃、67℃でそれぞれ10分間加熱した。96穴ウエルに、上記で加熱処理した酵素溶液20μlを分注し、あらかじめ37℃で５分間加温した。あらかじめ37℃で５分間加温したA液（0.05M MES, 0.1M NH2OH, 0.03M CBZ-Gln-Gly, pH 6.0）を各ウエルに50μLずつ分注し、37℃、20分反応後、B液（1N HCl, 4% TCA, 1.67% FeCl3・6H2O）を各ウエルに50μLずつ分注し、反応を停止させた後、プレートリーダーにて、525nmの吸光度を測定した。25℃で加熱した酵素溶液の吸光度の値を100%として60℃、67℃での残存活性を算出した。
　耐熱性評価の結果は、図6にまとめた。2-4-11A(R208L)にV132L、R238M、E249K 、D268Nをそれぞれ導入しても耐熱性は向上しなかった。
実施例23　MSS2βBのｐＨ安定性評価
　0.5～0.6 mg/mlのMTG及びD3C/G283C（3-283）変異体及びMSS2βBを所定の緩衝液（0.1Mグリシン緩衝液pH3、0.1M燐酸ナトリウム緩衝液pH12）で４倍に希釈し、室温、１時間保持後、0.4M燐酸緩衝液pH6で２倍に希釈し、ハイドロキサメート法で活性測定した。結果は、ｐＨ６での活性を100％とし、表12に示した。MSS2βBは、D3C/G283Cと比較して、pH３での耐酸性、pH12での耐アルカリ性が若干向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明によれば、MTGの改変によって、耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼを提供することができる。更に、耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼを用いることにより、新規製品、及び新規技術を提供することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２００９－０５３５３７を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含される。また、本明細書中で引用した特許文献及び非特許文献は、引用したことによってその内容の全てが開示されたと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。

Claims (19)

  1. 　トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
    （Ａ）配列番号２において、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
    （Ｂ）（Ａ）の配列において、１０１位、１５７位又は２５０位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
    （Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
    （Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の１０１位、１５７位又は２５０位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
  2. 　下記ａ）～ｄ）から選択される少なくとも１つの変異をさらに有する、請求項１記載のタンパク質：
    　ａ）３位及び２８３位のシステインへの変異、
    　ｂ）２位及び２８２位のシステインへの変異、
    　ｃ）２位及び２８３位のシステインへの変異、
    　ｄ）７位及び５８位のシステインへの変異。
  3. 　トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
    （Ａ）配列番号２において、３位及び２８３位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
    （Ｂ）（Ａ）の配列において、３位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
    （Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の３位及び２８３位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
    （Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の３位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
  4. 　トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
    （Ａ）配列番号２において、２位及び２８２位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
    （Ｂ）（Ａ）の配列において、２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８２位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
    （Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の２位及び２８２位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
    （Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８２位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
  5. 　トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
    （Ａ）配列番号２において、２位及び２８３位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
    （Ｂ）（Ａ）の配列において、２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
    （Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の２位及び２８３位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
    （Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の２位、１０１位、１５７位、２５０位又は２８３位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
  6. 　トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのアミノ酸配列を有するタンパク質：
    （Ａ）配列番号２において、７位及び５８位にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；
    （Ｂ）（Ａ）の配列において、７位、５８位、１０１位、１５７位又は２５０位以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
    （Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２の７位及び５８位に対応する位置にシステインへの変異を有し、且つ、１０１位、１５７位及び２５０位に対応する位置から選択される少なくとも１の位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
    （Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２の７位、５８位、１０１位、１５７位又は２５０位に対応する位置以外の位置に、１～数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
  7. 　（Ａ）又は（Ｂ）における配列番号２の１０１位、１５７位及び２５０位、或いは（Ｃ）又は（Ｄ）におけるそれらに対応する位置のアミノ酸変異が、
    　１０１位：プロリンへの変異、
    　１５７位：アラニン又はセリンへの変異、
    　２５０位：アラニン又はアルギニンへの変異
    である、請求項３に記載のタンパク質。
  8. 　配列番号２において、
    ３位のアスパラギン酸のシステインへの変異；
    １０１位のセリンのプロリンへの変異；
    １５７位のグリシンのセリンへの変異；
    ２５０位のグリシンのアルギニンへの変異；及び
    ２８３位のグリシンのシステインへの変異
    を有する、請求項３に記載のタンパク質。
  9. 　配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、以下のいずれかの変異の組合せを有する、請求項３に記載のタンパク質：
    （１）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン又はアスパラギン酸への変異；
    （２）１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１０１位のセリンのグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸への変異；または
    （３）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１５７位のグリシンのアラニン、バリン、イソロイシン、セリン、アスパラギン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸への変異。
  10. 　配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、
    １０１位のセリンのプロリンへの変異；
    １５７位のグリシンのアラニン、セリンまたはアルギニンへの変異；及び
    ２５０位のグリシンのアラニン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンまたはアルギニンへの変異；
    を有する、請求項３に記載のタンパク質。
  11. 　配列番号２において、３位のアスパラギン酸のシステインへの変異及び２８３位のグリシンのシステインへの変異に加えて、以下のいずれかの変異の組合せを有する、請求項１０に記載のタンパク質：
    （１）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアラニン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンまたはアルギニンへの変異；
    （２）１５７位のグリシンのセリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１０１位のセリンのプロリンへの変異；または
    （３）１０１位のセリンのプロリンへの変異と、２５０位のグリシンのアルギニンへの変異と、１５７位のグリシンのアラニン、セリンまたはアルギニンへの変異。
  12. 　配列番号２において、２０８位のアルギニンのロイシン、アラニン又はグルタミン酸への変異をさらに含む、請求項７～１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  13. 　配列番号２において、
    （１）２０８位のアルギニンのトリプトファンへの変異、
    （２）２６８位のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異、
    （３）１３２位のバリンのロイシンへの変異、
    （４）２３８位のアルギニンのメチオニンへの変異、又は
    （５）２４９位のグルタミン酸のリジンへの変異、
    をさらに含む、請求項８に記載のタンパク質。
  14. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  15. 　請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  16. 　請求項１５に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
  17. 　請求項１６に記載の宿主細胞を培養し、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
  18. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項１７に記載の方法によって製造されたタンパク質、又は請求項１６に記載の宿主細胞を基質タンパク質に作用させる工程を含む、当該基質タンパク質の加工方法。
  19. 　基質タンパク質の加工が４０℃～１００℃で行われることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
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