WO2010095642A1 - 有用物質の製造方法 - Google Patents

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WO2010095642A1
WO2010095642A1 PCT/JP2010/052341 JP2010052341W WO2010095642A1 WO 2010095642 A1 WO2010095642 A1 WO 2010095642A1 JP 2010052341 W JP2010052341 W JP 2010052341W WO 2010095642 A1 WO2010095642 A1 WO 2010095642A1
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protein
oxygen
seq
dna
amino acid
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PCT/JP2010/052341
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English (en)
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正人 池田
誠記 竹野
敏 三橋
Original Assignee
国立大学法人信州大学
協和発酵バイオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a useful substance using a microorganism transformed with a DNA encoding a protein having an activity of improving the growth of a microorganism requiring high concentration oxygen at low concentration oxygen.
  • Non-Patent Document 1 genes that are related to oxygen utilization and oxygen stress resistance have been found on the genome of Corynebacterium glutamicum. For example, genes related to the respiratory chain have been clarified (see Non-Patent Document 1). Further, sigB gene (see Non-Patent Document 2) and sigD gene (see Patent Document 1) is a sigma factor of RNA polymerase, or glbO gene (see Patent Document 2) hemoglobin-like have been found. Furthermore, a gene group ( nrdHIE and nrdF ) related to ribonucleotide reductase has been identified (see Non-Patent Document 3). Such gene information is disclosed in a published patent publication (see Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a useful substance using a microorganism transformed with a recombinant DNA containing a DNA encoding a protein having an activity complementary to the high oxygen concentration requirement of the microorganism. is there.
  • the present invention relates to the following (1) to (3).
  • a transformant obtained by transforming a microorganism having the ability to produce a useful substance with a DNA encoding a protein having an activity of improving the growth of a microorganism requiring high concentration oxygen at low concentration oxygen A method for producing a useful substance comprising culturing in a medium, producing and accumulating a useful substance in the culture, and collecting the useful substance from the culture.
  • the protein according to any one of [1] to [6] below, wherein the protein having an activity to improve the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentration oxygen is the protein according to any one of [1] to [6] below: Manufacturing method.
  • a protein having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11 [2] Represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of improving the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentrations of oxygen
  • SEQ ID NO: 1 Consisting of an amino acid sequence represented by any one of 3, 5, 7, 9, and 11 having an amino acid sequence of 80% or more of homology or identity, and a microorganism having high oxygen demand at low concentration oxygen
  • a protein having an activity to improve growth [4] a protein selected from a protein consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13, 15, 17 and 19 [5] SEQ ID NOs: 13, 15, 17 and The amino acid sequence represented by any one of 19 is selected from proteins consisting of amino acid sequences in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and improves the growth
  • DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 and 11 [2] DNA consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12 [3] Hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12, and requires high concentration oxygen DNA encoding a protein having an activity to improve the growth of low-grade microorganisms at low concentrations of oxygen [4] DNA encoding a protein selected from a protein consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13, 15, 17 and 19 [5] DNA selected from DNA consisting of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 20 [6] Selected from DNAs that hybridize under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 20, and require high
  • a method for producing a useful substance using a transformant transformed with a DNA encoding a protein having an activity for improving the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentration oxygen be able to.
  • a DNA encoding a protein having the activity of improving the growth of microorganisms having the ability to produce useful substances with a high concentration of oxygen-requiring microorganisms at a low concentration of oxygen As a transformant used in the production method of the present invention, a DNA encoding a protein having the activity of improving the growth of microorganisms having the ability to produce useful substances with a high concentration of oxygen-requiring microorganisms at a low concentration of oxygen. Any microorganism may be used as long as it is a transformant obtained by transforming with.
  • microorganisms include bacteria belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Escherichia, Serratia, Bacillus, Pseudomonas or Streptomyces.
  • Corynebacterium as the microorganisms belonging to the genus Corynebacterium aceto A Sid Fi Lamb (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870 such as Corynebacterium aceto A Sid Fi lamb, Corynebacterium aceto glutamicum (Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806, etc.
  • Corynebacterium carunae such as Corynebacterium callunae ATCC15991, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC13060, Corynebacterium glutamicum ATCC13826, Corynebacterium callunae bacterium glutamicum ATCC14020, Corynebacterium ⁇ ATCC13869, etc.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium Hakyurisu (Corynebacterium herc ulis) ATCC13868 such as Corynebacterium Hakyurisu, Corynebacterium Ririamu (Corynebacterium lilium) ATCC15990 such as Corynebacterium Ririamu, Corynebacterium Merasekora (Corynebacterium melassecola) ATCC17965 such as Corynebacterium Merasekora, Corynebacterium -Microorganisms belonging to Corynebacterium thermoaminogenes and the like such as Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 and other Brevibacterium immariophilum Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 and other Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14068.
  • um Imari office lamb Brevibacterium Rozeamu (Brevibacterium roseum) ATCC13825 such as Brevibacterium Rozeamu of, is a microorganism belonging to the Brevibacterium Chiogenitarisu (Brevibacterium thiogenitalis) Brevibacterium Chiogenitarisu such as ATCC19240 and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Microbacterium include microbacterium ammoniaphilum such as Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354.
  • the useful substance that can be produced according to the present invention may be any industrially useful substance that can be produced by microorganisms belonging to coryneform bacteria, such as amino acids, nucleic acids, vitamins, and various enzymes.
  • Examples include proteins, peptides such as glutathione, sugars such as xylose, sugar alcohols such as xylitol, alcohols such as ethanol, organic acids such as lactic acid and succinic acid, lipids, and the like, preferably amino acids, nucleic acids and vitamins, particularly preferably Is an amino acid.
  • Amino acids include L-alanine, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-asparagine, L-aspartic acid, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-leucine, L-valine, L-isoleucine , L-proline, L-histidine, L-arginine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-serine, L-cysteine, L-3-hydroxyproline, L-4-hydroxyproline, etc.
  • nucleic acids include inosine, guanosine, inosinic acid, guanylic acid, and examples of vitamins include riboflavin, thiamine, and ascorbic acid.
  • microorganisms are “requiring high oxygen concentration” to mean low oxygen concentration conditions [0.5% to atmospheric conditions (about 21%), such as 0.5%, 1%, %, 3%, 6%, 9%, etc.], even if the microorganism cannot grow, the growth rate is usually 50% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less of the wild type strain. It means that it has declined.
  • the above low-concentration oxygen conditions can be set by using, for example, an oxygen absorbent and a dedicated sealed container sold for simple culture of anaerobic bacteria and microaerobic bacteria.
  • an oxygen absorbent ("Aneropack series” manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.)
  • a plate medium and an anaerobic indicator are placed in a sealed container and cultured.
  • carbon sources include glucose, fructose, sucrose, maltose, sugars such as starch hydrolysate, alcohols such as ethanol, acetic acid, lactic acid, And organic acids such as succinic acid.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate and other inorganic and organic ammonium salts, urea, other nitrogen-containing compounds, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean hydrolysate And nitrogen-containing organic substances such as
  • inorganic salts include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, sodium chloride, magnesium sulfate, and calcium carbonate.
  • micronutrient sources such as biotin and thiamine may be contained as necessary. These micronutrient sources can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean hydrolysate, and casamino acid.
  • the microorganism By culturing the microorganism at 20 to 42 ° C., preferably 30 to 40 ° C. for 1 to 6 days under the above low concentration oxygen conditions, and comparing the growth rate with the wild type strain, the microorganism has a high concentration oxygen requirement. The presence or absence can be examined.
  • microorganisms requiring high concentration of oxygen include Corynebacterium glutamicum OX-3, OX-96, OX-109, OX-112, OX-119 and OX-150. it can.
  • a protein having an activity of improving the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentrations of oxygen is obtained by transforming a microorganism requiring high concentrations of oxygen with DNA encoding the protein.
  • a protein that allows or improves the growth of microorganisms under low oxygen concentration conditions is obtained by transforming a microorganism requiring high concentrations of oxygen with DNA encoding the protein.
  • proteins include the following proteins.
  • a protein having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11 [2] Represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11 A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of improving the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentrations of oxygen [3] SEQ ID NO: 1 Consisting of an amino acid sequence represented by any one of 3, 5, 7, 9, and 11 having an amino acid sequence of 80% or more of homology or identity, and a microorganism having high oxygen demand at low concentration oxygen A protein having an activity to improve growth [4] a protein selected from a protein consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13, 15, 17 and 19 [5] SEQ ID NOs: 13, 15, 17 and The amino acid sequence represented by any one of 19 is selected from proteins consisting of amino acid sequences in which one or more amino acids are deleted, substituted
  • each of the proteins [1] to [6] may express only one type of protein, or may simultaneously express two or more types of proteins to improve growth at low concentration oxygen.
  • the proteins [1] to [3] are proteins represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9 or mutants thereof (proteins in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, or 80 % Or more homologous / identical proteins) may be expressed alone, or two or more proteins may be expressed in combination.
  • the proteins of [4] to [6] may be expressed alone or in combination of the proteins represented by SEQ ID NOs: 13, 15, 17, and 19, or two or more thereof (eg, three or more types).
  • four types of proteins may be expressed in combination to improve growth at low concentration oxygen.
  • the DNAs [1] to [6] may each express only one type of DNA, or may simultaneously express DNAs encoding two or more types of proteins to improve growth at low concentration oxygen. Also good.
  • the DNAs of [1] to [3] hybridize under the stringent conditions with the DNAs represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10 and have growth-improving activity at low concentrations of oxygen.
  • the DNA encoding the protein may be expressed alone, or the DNA encoding two or more (eg, three or more or four) proteins may be expressed in combination.
  • the DNAs [4] to [6] are hybridized under stringent conditions with the DNAs represented by SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 20, and have growth-improving activity at low concentrations of oxygen.
  • the DNA encoding the protein may be expressed alone, or two or more (eg, three or more or four) proteins may be expressed in combination to improve growth at low concentrations of oxygen.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an activity to improve the growth of low concentration oxygen in microorganisms requiring high concentration oxygen, such as coryneform bacteria, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter referred to as Current Protocols in Molecular Biology), Nucleic Acids Research, 10 , 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-described site-directed mutagenesis method, 1 to several tens, The number is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1, 2, 3, 4 or 5.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 one or more amino acids are deleted, substituted or added means any position in the same sequence. In which one or more amino acids may be deleted, substituted or added.
  • amino acid positions at which amino acids can be deleted or added include the N-terminal side and the C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19. One to several amino acids on the side can be mentioned.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanine, tyrosine
  • SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 , 15, 17 or 19 having a homology or identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more. It is desirable to have homology or identity.
  • Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • PSI-Blast or PHI-Blast can be used to perform an iterated search that detects the positional relationship (Id.) Between molecules and the relationship between molecules that share a common pattern.
  • the default parameters of the respective programs can be used. See http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • a protein having an activity of improving the growth of microorganisms at low concentrations of oxygen indicates that the growth rate of the coryneform bacterium requiring high concentration oxygen expressing the protein under the above-mentioned conditions of low concentration oxygen is 80 times that of the wild type strain. % Or more, preferably 90% or more.
  • the fact that the proteins [4] to [6] have the activity of improving the growth at low concentrations of oxygen indicates that the proteins encoding the proteins [4] to [6] are transformed with DNA.
  • the ribonucleotide reductase activity of the obtained microorganism is compared with the wild type strain of the microorganism by the method described in Microbiology, 145 , 1595 (1999), and the ribonucleotide reductase activity of the microorganism is improved compared to the wild type strain. Can also be confirmed.
  • DNA for transforming the microorganism used in the production method of the present invention examples include the following DNAs [7] to [12].
  • DNA encoding a protein having an activity to improve the growth of low-grade microorganisms at low concentrations of oxygen [10] DNA encoding a protein selected from a protein consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13, 15, 17 and 19 [11] DNA selected from DNA consisting of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 20 [12] Selected from DNAs that hybridize under stringent conditions with
  • hybridize means that DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA under specific conditions. Accordingly, the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or has a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. May be.
  • Examples of DNA used as a probe include DNA of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, but may be DNA of at least 10 bases, preferably 15 bases or more. .
  • the above stringent conditions include, for example, a DNA-immobilized filter and probe DNA, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). ), Incubated in a solution containing 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA overnight at 42 ° C., for example, in a 0.2 ⁇ SSC solution at about 65 ° C. Conditions for washing the filter can be raised, but lower stringent conditions can also be used.
  • Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the formamide concentration, the lower the stringency), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • low stringent conditions for example, 6 ⁇ SSCE (20 ⁇ SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate overnight at 37 ° C in a solution containing SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, then wash with 50 ° C 1x SSC, 0.1% SDS solution.
  • examples of lower stringent conditions include conditions in which hybridization is performed using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-described low stringency conditions and then washed.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • DNAs that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions include SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA described above. , 12, 14, 16, 18 or 20 at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • DNA having a base sequence having sex or identity can be mentioned.
  • the fact that the DNA that hybridizes with the above-described DNA under stringent conditions encodes a protein having an activity of improving the growth of microorganisms at low concentrations of oxygen means that microorganisms requiring high concentrations of oxygen are used as hosts.
  • the growth rate of the transformant obtained by introducing the DNA under the above-mentioned low concentration oxygen conditions can be confirmed to be 80% or more, preferably 90% or more of the wild type strain.
  • DNA for transforming the microorganism used in the production method of the present invention is, for example, a chromosomal DNA prepared from a microorganism belonging to coryneform bacteria according to the method of Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72 , 619 (1963)] as a template. It can be obtained by PCR using a primer DNA designed and synthesized based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20.
  • chromosomal DNA is prepared from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain or ATCC31833 strain, and represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or 20 using the DNA as a template.
  • the DNA of the present invention can be obtained by PCR using DNA having the sequences of the 5 ′ end and 3 ′ end regions of each base sequence as a primer set.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20 are Cgl0807, Cgl0600, Cgl1427, Cgl1102 in the nucleotide sequences represented by NCBI GenBank accession No. BA000036, respectively. , Cgl2859, Cgl2857, Cgl2525, Cgl2530, Cgl2531, and Cgl2532.
  • Cgl0807, Cgl0600, Cgl1427, Cgl1102, Cgl2859, Cgl2857, Cgl2525, Cgl2530, Cgl2531, and Cgl2532 are NCgl0773, NCgl0575, NCgl1372, NCgl1057, NC2761, NC2 Corresponds to NCgl2443, NCgl2444, and NCgl2445.
  • the DNA nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 with respect to various gene sequence databases is preferably 85% or more. Is a sequence having a homology or identity of 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more, and based on the base sequence obtained by the search,
  • the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention can also be obtained from the chromosomal DNA, cDNA library or the like of an organism having a base sequence by the method described above.
  • the base sequence of DNA is determined by a commonly used base sequence analysis method such as dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 , 5463 (1977)], 373A DNA sequencer (manufactured by Perkin Elmer), etc. It can be determined by analyzing using a base sequence analyzer.
  • the full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • a vector that can autonomously replicate in a microorganism or that can be integrated into a chromosome and that contains a promoter at a position where the DNA to be transformed can be transcribed is preferably used.
  • the recombinant DNA having the DNA of the present invention can autonomously replicate in the prokaryote, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, a transcription termination It is preferably a recombinant DNA composed of a sequence. A gene that controls the promoter may also be included.
  • pCG1 JP 57-134500
  • pCG2 JP 58-35197
  • pCG4 JP 57-183799
  • pCG11 57 134500
  • pCG116 pCE54
  • pCB101 all disclosed in JP-A-58-105999
  • pCE51, pCE52, pCE53 [all are Molecular and General Genetics, 196 , 175 (1984)] and the like are preferably used.
  • the recombinant DNA obtained by incorporating the DNA of the present invention into a vector is preferably composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence.
  • a gene that controls the promoter may also be included.
  • any promoter can be used as long as it functions in a host cell (coryneform bacterium).
  • trp promoter P trp
  • lac promoter P L promoter
  • P R promoter can be mentioned promoters derived from such T7 promoter, E. coli or phage, or the like.
  • P trp promoters P trp ⁇ 2
  • tac promoter tac promoter
  • lacT7 promoter let I promoter and P54-6 promoter for expression in microorganisms belonging to the genus Corynebacterium [Appl. Artificially designed and modified promoters such as Microbiol. Biotechnol., 53 , 674-679 (2000)] can also be used.
  • the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required, but it is preferable that the transcription termination sequence is located immediately below the structural gene.
  • any method that can introduce DNA into a microorganism can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 , 2110 ( 1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electroporation method [Nucleic Acids Res., 16 , 6127 (1988)] and the like.
  • DNA encoding a protein having an activity to improve the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentrations of oxygen may be incorporated into the chromosome of coryneform bacteria, or introduced into coryneform bacteria as a plasmid and used as a transformant. Also good.
  • DNA derived from coryneform bacteria is preferably used as a DNA encoding a protein having an activity of improving the growth of microorganisms requiring high concentration oxygen at low concentration oxygen.
  • microorganisms used as a host are those that have the ability to produce useful substances such as amino acids and nucleic acids
  • the resulting transformants can be used as they are for the production of useful substances.
  • a product that does not have the production ability it can also be obtained by breeding a wild strain by a known method.
  • A a method for mitigating or releasing at least one of the mechanisms controlling biosynthesis of useful substances;
  • B a method for enhancing expression of at least one enzyme involved in biosynthesis of useful substances,
  • C a method of increasing at least one copy number of an enzyme gene involved in biosynthesis of a useful substance,
  • D a method of weakening or blocking at least one metabolic pathway that branches from a biosynthetic pathway of a useful substance to a metabolite other than the useful substance, and (e) a degree of resistance of the useful substance to an analog compared to a wild type strain
  • the above known methods can be used alone or in combination.
  • the production of the useful substance is performed by collecting the useful substance produced and accumulated in the culture obtained by culturing the transformant used in the production method of the present invention in the medium.
  • the culture of the transformant used in the production method of the present invention is carried out by a normal culture method for culturing microorganisms, but it is preferable to use optimum conditions depending on the useful substance to be produced.
  • the same carbon medium, nitrogen source, inorganic salt, and other additives as the medium for determining the requirement for high-concentration oxygen can be used as the medium for culturing the transformant.
  • the transformant is cultured under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 20 ° C. to 42 ° C., preferably 30 ° C. to 40 ° C.
  • the pH in the medium is preferably maintained at 5-9.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • the culture period is usually 1 to 6 days. Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture
  • antibiotics such as an ampicillin and a tetracycline
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium.
  • Useful substances produced and accumulated in the culture can be recovered by removing precipitates such as cells and using a known method such as activated carbon treatment or ion exchange resin treatment.
  • ATCC31833 strain Corynebacterium glutamicum ATCC31833 strain (hereinafter also simply referred to as ATCC31833 strain) was mutated with nitrosoguanidine by a conventional method.
  • ATCC31833 strain after treatment is applied to BY agar medium (medium containing normal broth 20 g, yeast extract 5 g, Inagar S-7 12 g in 1 liter of water, adjusted to pH 7.2 with aqueous sodium hydroxide)
  • the cells were cultured under atmospheric conditions (21% oxygen concentration) and 0.5% oxygen concentration.
  • the oxygen concentration was set according to the manual using Aneropack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.).
  • a strain whose growth was worse than that in atmospheric conditions under an oxygen concentration of 0.5%, or a strain that could not grow was selected as a high concentration oxygen demanding strain. From these selected strains, 6 mutant strains were selected as representative strains, and OX-3 strain, OX-96 strain, OX-109 strain, OX-112 strain, OX-119 strain, OX-150 strain, respectively. Named.
  • the cells were cultured for 2 days at 30 ° C. using BY agar medium under various oxygen concentration conditions shown in Table 1.
  • Table 6 shows the growth of these six strains at various concentrations of oxygen. In Table 1, ++ indicates those with good growth, + indicates those with poor growth, and-indicates those without growth.
  • the OX-3, OX-96, OX-109, OX-112, OX-119 and OX-150 strains require higher oxygen concentrations than the parent ATCC31833 strain. Showed sex.
  • Chromosomal DNA of ATCC31833 strain and plasmid pCSEK20 were each digested with EcoRI, and both digests were ligated using a ligation kit.
  • the chromosomal DNA of ATCC31833 strain and plasmid pCS299P [Appl. Microbiol. Biotech., 63 , 592 (2004)] were each digested with BamHI, and both digests were ligated with a ligation kit.
  • the high concentration oxygen-requiring strain obtained in (1) ie, OX-3 strain, OX-96 strain, OX-109 strain, OX-112 strain, The OX-119 and OX-150 strains were transformed according to the method described in JP-A-6-169785.
  • the various plasmid DNAs obtained were cleaved with each restriction enzyme and analyzed. As a result, a 1.9 Kb EcoRI cleavage fragment was recovered as a DNA fragment for restoring the high concentration oxygen requirement of the OX-3 strain, and a 2.1 Kb BamHI cleavage fragment was prepared as a DNA fragment for restoring the high concentration oxygen requirement of the OX-96 strain.
  • OX-109 strain a 3.2 Kb EcoRI-cleaved fragment as a DNA fragment for restoring high oxygen demand
  • OX-112 strain a 1.1 Kb EcoRI-cleaved fragment as a DNA fragment for restoring high oxygen demand -119 Kb BamHI cleavage fragment and 3.2 Kb BamHI cleavage fragment as DNA fragments to restore high oxygen demand of strain 119, and 4.4 Kb of DNA fragment to restore high oxygen demand of strain OX-150 Each EcoRI fragment was obtained.
  • the plasmid containing the 1.9 Kb EcoRI fragment thus obtained was pEco1.9, the plasmid containing the 2.1 Kb BamHI fragment was pBam2.1, the plasmid containing the 3.2 Kb EcoRI fragment was pEco3.2, 1.1.
  • the plasmid containing the Kb EcoRI fragment is pEco1.1
  • the plasmid containing the 1.8 Kb BamHI fragment is pBam1.8
  • the plasmid containing the 3.2 Kb BamHI fragment is pBam3.2
  • the plasmid was named pEco4.4.
  • Cgl0807 was present in the 1.9 Kb EcoRI fragment contained in pEco1.9.
  • Cgl1101 and Cgl1102 were present in the 2.1 Kb BamHI fragment contained in pBam2.1.
  • Cgl2859 and Cgl2861 were present in the 3.2 Kb EcoRI fragment contained in pEco3.2.
  • Cgl0600 was present in the 1.1 Kb EcoRI fragment contained in pEco1.1.
  • Cgl1427 was present in the 1.8 Kb BamHI fragment contained in pBam1.8.
  • Cgl2857 and Cgl2858 were present in the 3.2 Kb BamHI fragment contained in pBam3.2.
  • Four genes, Cgl2530, Cgl2531, Cgl2532, and Cgl2533 were present in the 4.4 Kb EcoRI fragment contained in pEco4.4.
  • amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl0807 gene that complements the high concentration oxygen requirement of the OX-3 strain is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl0600 gene complementary to the high concentration oxygen requirement of the OX-112 strain is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl1427 gene that complements the high concentration oxygen requirement of the OX-119 strain is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the plasmid pCgl1102 containing only the Cgl1102 gene was found to be highly soluble in OX-96 strain. The oxygen demand was restored.
  • the plasmid pCgl1102 was obtained by subjecting a 0.5 Kb DNA fragment obtained by PCR using the plasmid pBam2.1 as a template and DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 22 and the vector pCS299P to BamHI It is a plasmid obtained by treating with restriction enzyme and ligating the two.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl1102 gene is shown in SEQ ID NO: 7, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • plasmid pCgl2859 containing only the Cgl2859 gene was found to be High oxygen demand was restored.
  • the plasmid pCgl2859 is a plasmid obtained by excising and removing Cgl2861 from the plasmid pEco3.2 with BamHI and ligating it again.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl2859 gene is shown in SEQ ID NO: 9, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • plasmid pCgl2857 containing only the Cgl2857 gene was The oxygen demand was restored.
  • the plasmid pCgl2857 was obtained by performing PCR using the plasmid pBam3.2 as a template and the DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 23 and 24 as primers and a vector pCS299P obtained by PCR using BamHI. It is a plasmid obtained by treating with restriction enzyme and ligating the two.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl2857 gene is shown in SEQ ID NO: 11, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the plasmid pHIE containing the Cgl2530, Cgl2531 and Cgl2532 genes was found to be OX-150.
  • the high oxygen demand of the strain was restored.
  • the plasmid pHIE is a 3.8 Kb DNA fragment obtained by PCR using the chromosomal DNA of the ATCC31833 strain as a template and DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 25 and 26 as primers and the vector pCS299P. This is a plasmid obtained by treating with restriction enzyme with KpnI and ligating both.
  • plasmid pHIEF containing these 4 genes and examining the ability to recover the high oxygen demand of OX-150 strain, plasmid pHIEF containing all 4 types has higher complementation ability than plasmid pHIE containing only 3 types showed that.
  • PHIEF is a 1.6 Kb DNA fragment obtained by PCR using the chromosomal DNA of the plasmid ATCC31833 strain as a template and DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 27 and 28 as primers, and the plasmid pHIE. It is a plasmid obtained by treating with restriction enzyme and ligating the two.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl2525 gene is shown in SEQ ID NO: 13, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl2530 gene is shown in SEQ ID NO: 15, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl2531 gene is shown in SEQ ID NO: 17, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of the Cgl2532 gene is shown in SEQ ID NO: 19, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • OX-150 / pHIEF strains obtained by introducing plasmid pHIEF into the OX-119 / pCgl2857 strain, OX-150 strain, and OX-150 strain obtained by introducing plasmid pCgl2857 are shown in Table 2.
  • the cells were cultured at 30 ° C. for 2 days using BY agar medium. The results are shown in Table 2. In Table 2, ++ indicates those with good growth, + indicates those with poor growth, and-indicates those without growth.
  • L-lysine producing bacteria were transformed according to the method described in JP-A-6-169785.
  • As an L-lysine-producing bacterium Corynebacterium glutamicum AHP-3 strain (FERM BP-7382) with a clear genetic trait was used.
  • Corynebacterium glutamicum AHP-3 strain is composed of amino acid substitution mutation Val59Ala in homoserine dehydrogenase gene ( hom ) on the chromosome of wild strain ATCC13032 of Corynebacterium glutamicum, amino acid substitution mutation Thr331Ile in aspartokinase gene ( lysC ), and pyruvate.
  • This strain has the amino acid substitution mutation Pro458Ser in the carboxylase gene ( pyc ).
  • Plasmid DNA was isolated from each transformed strain that became resistant to kanamycin according to the vector preparation method described in JP-A-6-169785. By analyzing cleavage of these plasmids with various restriction enzymes, it was confirmed that each transformant possessed each plasmid.
  • the L-lysine production test of each of these transformed strains and the parent strain was performed by test tube culture as follows. 1 platinum culture medium cultured at 30 ° C. for 24 hours in BY agar medium (medium extract 7 g, peptone 10 g, sodium chloride 3 g, yeast extract 5 g, bacto agar 15 g in 1 L water, adjusted to pH 7.2) Inoculate a large test tube containing 5 ml of seed medium (medium containing 20 g glucose, 7 g meat extract, 10 g peptone, 3 g sodium chloride, 5 g yeast extract in 1 L water and adjusting to pH 7.2 and adding 10 g calcium carbonate) Then, the cells were cultured at 30 ° C. for 13 hours.
  • BY agar medium medium extract 7 g, peptone 10 g, sodium chloride 3 g, yeast extract 5 g, bacto agar 15 g in 1 L water, adjusted to pH 7.2
  • seed medium medium containing 20 g glucose, 7
  • a method for producing a useful substance using a transformant transformed with a DNA encoding a protein having an activity to restore high oxygen demand of microorganisms having high oxygen demand can do.
  • SEQ ID NO: 21 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 22—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 23—Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 24—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 25—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 26—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 27—Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 28—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA

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Abstract

本発明は、有用物質を生産する能力を有する微生物を、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法を提供する。

Description

有用物質の製造方法
　本発明は、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
　アミノ酸やヌクレオチド等、有用物質の好気的発酵では多量の酸素が必要とされる。酸素が不足すると、目的物の代わりに有害な有機酸が蓄積してしまうという問題点がある。このため、培養中の培地中における溶存酸素を一定レベル以上に維持することが重要である。このような課題に対して、酸素供給効率の高い発酵槽や酸素富化膜が開発されているが、これらの装置を導入するためには多額のコストがかかる。そこで、培養中に高レベルの溶存酸素量を必要としない微生物が求められている。
　コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム上には、酸素利用や酸素ストレス抵抗性に関わると類推される遺伝子が多種、見出されている。たとえば、呼吸鎖に関わる遺伝子が明らかにされている（非特許文献１参照）。また、RNAポリメラーゼのシグマ因子であるsigB遺伝子（非特許文献２参照）やsigD遺伝子（特許文献１参照）、あるいはヘモグロビン様のglbO遺伝子（特許文献２参照）が見出されている。さらに、リボヌクオチドレダクターゼに関わる遺伝子群(nrdHIEおよびnrdF)が同定されている（非特許文献３参照）。これらの遺伝子情報は、公開特許公報（特許文献３参照）に開示されている。
　しかし、これらの遺伝子の発現強化が微生物の要求する溶存酸素レベルに与える影響やアミノ酸生産性に与える影響は明らかにされていない。
米国特許第6890744号 米国特許第6759218号 特開2002-191370
J. Biotechnol., 104, 129(2003) BMC Genomics, 8, 4(2007) Microbiology, 145, 1595(1999)
　本発明の目的は、微生物の高濃度酸素要求性を相補する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物を用いた有用物質の製造方法を提供することにある。
本発明は以下の（１）～（３）に関する。
（１）　有用物質を生産する能力を有する微生物を、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（２）　高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［６］のいずれかに記載の蛋白質である、（１）記載の製造法。
［１］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
［３］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
［４］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれる蛋白質
［５］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
［６］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
（３）　高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］～［６］のいずれかに記載のＤＮＡである、（１）または（２）記載の製造法。
［１］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ　
［２］配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３］配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１４、１６、１８および２０のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡより選ばれるＤＮＡ
［６］配列番号１４、１６、１８および２０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡより選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　本発明によれば、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を用いた有用物質の製造方法を提供することができる。
　本発明の製造方法に用いられる形質転換体としては、有用物質を生産する能力を有する微生物を、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体であれば、いずれの微生物であってもよい。
　そのような微生物としては具体的には、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する細菌をあげることができ、好ましくはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物、特に好ましくはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
　コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870等のコリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806等のコリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)ATCC15991等のコリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13060、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13826、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14020、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13869等のコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis) ATCC13868等のコリネバクテリウム・ハーキュリス、コリネバクテリウム・リリアム(Corynebacterium lilium) ATCC15990等のコリネバクテリウム・リリアム、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola) ATCC17965等のコリネバクテリウム・メラセコラ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)ATCC9244等のコリネバクテリウム・サーモアミノゲネス等に属する微生物があげられる。
　ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066等のブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068等のブレビバクテリウム・イマリオフィラム、ブレビバクテリウム・ローゼアム(Brevibacterium roseum) ATCC13825等のブレビバクテリウム・ローゼアム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis) ATCC19240等のブレビバクテリウム・チオゲニタリス等に属する微生物があげられる。
　ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354等のミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等をあげることができる。
　本発明により製造することができる有用物質としては、コリネ型細菌に属する微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、アミノ酸、核酸、ビタミン、各種酵素等のタンパク質、グルタチオン等のペプチド、キシロース等の糖、キシリトール等の糖アルコール、エタノール等のアルコール、乳酸、コハク酸等の有機酸および脂質等をあげることができ、好ましくはアミノ酸、核酸およびビタミン、特に好ましくはアミノ酸があげられる。
　アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－３－ヒドロキシプロリン、Ｌ－４－ヒドロキシプロリン等があげられ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸等があげられ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸等があげられる。
　本発明において微生物が「高濃度酸素要求性である」とは、野生型の微生物が生育可能な低濃度酸素条件[０.５％～大気条件（約２１％）、たとえば０.５％、１％、３％、６％、９％など]において該微生物は生育できないか、または生育できたとしても生育速度が野生型株の通常５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に低下していることをいう。
　上記の低濃度酸素条件は、例えば、嫌気性菌や微好気性菌の簡易培養用に販売されている酸素吸収剤および専用密閉容器を用いて設定することができる。この方法では、密閉容器の中に酸素吸収剤（三菱ガス化学株式会社製「アネロパックシリーズ」）、プレート培地、および嫌気指示薬を入れて培養する。メーカーのマニュアルに従い、酸素吸収剤の量を調節することにより、数段階の低濃度酸素条件を構築することができる。
　微生物が高濃度酸素要求性であるか否かを判定する培地において、炭素源としては、グルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類があげられる。
　窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物があげられる。
　無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等があげられる。
　その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を含有してもよい。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
　上記の低濃度酸素条件で、微生物を２０～４２℃、好ましくは３０℃～４０℃で１～６日間培養し、生育速度を野生株と比較することで、該微生物の高濃度酸素要求性の有無を調べることができる。
　高濃度酸素要求性の微生物としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムOX-3株、OX-96株、OX-109株、OX-112株、OX-119株およびOX-150株をあげることができる。
　本発明において、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質とは、該蛋白質をコードするＤＮＡで高濃度酸素要求性の微生物を形質転換した場合に、該微生物の低濃度酸素条件での生育が可能ないし向上するような蛋白質をいう。
　このような蛋白質としては、例えば以下の蛋白質があげられる。
［１］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
［３］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
［４］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれる蛋白質
［５］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
［６］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
　なお、［１］～［６］の蛋白質は、各々１種のみの蛋白質を発現させてもよく、２種以上のタンパク質を同時に発現させて低濃度酸素での生育を向上させてもよい。例えば［１］～［３］のタンパク質は、配列番号１，３，５，７，９で表されるタンパク質或いはこれらの変異体（１以上のアミノ酸が欠失・置換・付加したタンパク質、或いは８０％以上の相同性／同一性を有するタンパク質）を単独で発現させてもよく、２種以上のタンパク質を組み合わせて発現させてもよい。同様に、［４］～［６］のタンパク質は、配列番号１３，１５，１７，１９で表されるタンパク質或いはこれらの変異体を単独で発現させてもよく、２種以上（例えば３種以上または４種）のタンパク質を組み合わせて発現させて、低濃度酸素での生育を向上させてもよい。
　また、［１］～［６］のＤＮＡは、各々１種のみのＤＮＡを発現させてもよく、２種以上のタンパク質をコードするＤＮＡを同時に発現させて低濃度酸素での生育を向上させてもよい。例えば［１］～［３］のＤＮＡは、配列番号２，４，６，８，１０で表されるＤＮＡ或いはこれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、低濃度酸素での生育向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単独で発現させてもよく、２種以上（例えば３種以上または４種）のタンパク質をコードするＤＮＡを組み合わせて発現させてもよい。同様に、［４］～［６］のＤＮＡは、配列番号１４，１６，１８，２０で表されるＤＮＡ或いはこれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、低濃度酸素での生育向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単独で発現させてもよく、２種以上（例えば３種以上または４種）のタンパク質を組み合わせて発現させて、低濃度酸素での生育を向上させてもよい。
　上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物、例えばコリネ型細菌の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）に部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１，２，３，４または５個である。
　配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
　アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１～数個のアミノ酸をあげることができる。
　欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどがあげられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　また、本発明の製造法において、蛋白質が高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有するためには、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９で表されるアミノ酸配列との相同性ないし同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有していることが望ましい。
　アミノ酸配列や塩基配列の相同性ないし同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
　微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質であることは、該蛋白質を発現させた高濃度酸素要求性のコリネ型細菌の上記低濃度酸素条件における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となるまで回復することで確認できる。
　また、上記［４］～［６］の蛋白質が、低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質であることは、［４］～［６］の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物の、リボヌクレオチドレダクターゼ活性をMicrobiology, 145, 1595 (1999)記載の方法により該微生物の野生型株と比較し、該微生物が野生型株に比べてリボヌクレオチドレダクターゼ活性が向上していることによっても確認することができる。
　本発明の製造方法に用いる微生物を形質転換するＤＮＡとしては、以下の[７]～[１２]のＤＮＡがあげられる。
［７］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ　
［８］配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
［９］配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［１０］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡ
［１１］配列番号１４、１６、１８および２０のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡより選ばれるＤＮＡ
［１２］配列番号１４、１６、１８および２０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡより選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
　ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の条件下で特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press (Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
　上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、高濃度酸素要求性の微生物を宿主とし、該ＤＮＡを導入して得られる形質転換体の上記低濃度酸素条件における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となることで確認できる。
　本発明の製造方法で用いる微生物を形質転換するＤＮＡは、例えばコリネ型細菌に属する微生物から斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕に従い調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表される塩基配列に基づき設計、合成したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲにより取得することができる。
　例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株またはATCC31833株から染色体ＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表されるそれぞれの塩基配列の５’末端および３’末端領域の配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより本発明のＤＮＡを取得することができる。
　取得できる具体的なＤＮＡとしては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
　配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０で表される塩基配列は、NCBI GenBank accession No. BA000036に示される塩基配列中でそれぞれCgl0807、Cgl0600、Cgl1427、Cgl1102、Cgl2859、Cgl2857、Cgl2525、Cgl2530、Cgl2531、およびCgl2532として公開されている。
　またCgl0807、Cgl0600、Cgl1427、Cgl1102、Cgl2859、Cgl2857、Cgl2525、Cgl2530、Cgl2531、およびCgl2532はそれぞれ、GenBank accession No. NC_003450で示される塩基配列中のNCgl0773、NCgl0575、NCgl1372、NCgl1057、NCgl2761、NCgl2760、NCgl2438、NCgl2443、NCgl2444、およびNCgl2445と対応している。
　また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成する方法等によっても取得することができる。
　また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
　ＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 74, 5463 (1977)]、373A・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
　取得したＤＮＡをそのまま、または必要に応じてコリネ型細菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製し、さらに必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片とし、コリネ型細菌に適した発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換え体ＤＮＡを調製する。
　ベクターとしては、微生物において自律複製可能または染色体中への組み込みが可能で、形質転換するＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好ましく用いられる。
　細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　例えば、コリネ型細菌を宿主細胞として用いる場合は、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等が好適に用いられる。
　ベクターに本発明のＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　プロモーターとしては、宿主細胞(コリネ型細菌)中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（P trp ）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターやコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］のように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば６～18塩基）に調節されていることが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列が配置されていることが好ましい。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、微生物へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
　高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネ型細菌の染色体に組み込んでもよく、プラスミドとしてコリネ型細菌に導入して形質転換体としてもよい。また、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネ型細菌由来のＤＮＡが好ましく使用される。
　なお、宿主として用いる微生物として、アミノ酸、核酸等の有用物質の生産能を有しているものを用いた場合、得られる形質転換体は、そのまま有用物質の製造に用いることができるが、有用物質の生産能を有していないものを用いた場合においては、公知の方法により野生株を育種することによっても取得することができる。該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
　上記（ａ）～（ｅ）の具体的な方法は、例えば、有用物質がアミノ酸である場合には、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol.遺伝子、110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem. , 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を育種し、取得することができる。
　さらに上記（ａ）～（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成する能力を有する微生物の育種方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)　section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田　浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の育種方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産する能力を有する微生物を育種することができる。
　有用物質の製造は、本発明の製造法で用いる形質転換体を培地に培養して得られる培養物中に生成蓄積した有用物質を採取することにより行う。
　本発明の製造法で用いる形質転換体の培養は、微生物を培養するための通常の培養法によって行うが、製造する有用物質により最適な条件とすることが好ましい。
　形質転換体の培養のための培地の炭素源、窒素源、無機塩、その他の添加剤は、高濃度酸素要求性を判定するための培地と同じものを使用できる。
　形質転換体の培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２０℃～４２℃であり、３０℃～４０℃が好ましい。培地中のｐＨは、５～９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
　培養期間は通常１～６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　培養物中に生成、蓄積した有用物質は、菌体などの沈殿物を除去し、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより回収することができる。
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株（以下、単にATCC31833株ともいう）を常法によりニトロソグアニジンで変異処理した。処理後のATCC31833株をＢＹ寒天培地（普通ブイヨン 20 g、酵母エキス 5 g、伊那寒天S-7 12 gを水1リットルに含み、水酸化ナトリウム水溶液によりpHを7.2に調整した培地）に塗布し、大気条件(濃度酸素21%)と酸素濃度0.5%条件で培養した。酸素濃度はアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社製）を用い、マニュアルに従い設定した。レプリカ法により、酸素濃度0.5%条件では大気条件に比べて生育が悪化する株、あるいは生育できない株を高濃度酸素要求性株として選択した。これらの選択株の中から、６種の変異株を代表株として選抜し、それぞれOX-3株、OX-96株、OX-109株、OX-112株、OX-119株、OX-150株と命名した。第１表に示す種々の酸素濃度条件で、ＢＹ寒天培地を用いて30℃で２日間培養した。これら６株の各濃度酸素での生育を第１表に示す。なお、第1表中、＋＋は生育良好なもの、＋は生育不良なもの、-は生育しないものをそれぞれ示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　第１表に示すとおり、OX-3株、OX-96株、OX-109株、OX-112株、OX-119株およびOX-150株は、親株であるATCC31833株に比べて高濃度酸素要求性を示した。
（２）ATCC31833株の染色体ＤＮＡを、特開平6-169785記載の方法に準じて調製した。
　ATCC31833株の染色体ＤＮＡとプラスミドpCSEK20（WO01/021774）を各々EcoRIで切断し、両切断物をライゲーションキットにより連結した。一方、ATCC31833株の染色体ＤＮＡとプラスミドpCS299P[Appl. Microbiol. Biotech., 63, 592 (2004)]を各々BamHIで切断し、両切断物をライゲーションキットにより連結した。
　このようにして構築した２種類のゲノムライブラリを用いて、（１）で得た高濃度酸素要求性株、すなわち、OX-3株、OX-96株、OX-109株、OX-112株、OX-119株およびOX-150株を、特開平6-169785記載の方法に従って形質転換した。
　得られた形質転換体の中から、カナマイシン20μg/mlを含有するＢＹ寒天培地において酸素濃度0.5%条件で生育可能な株を、高濃度酸素要求性が回復した形質転換株として選択した。選択した形質転換株から、特開平6-169785記載のベクターの調製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。　
　得られた各種プラスミドＤＮＡを各制限酵素で切断し、解析した。その結果、OX-3株の高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片として1.9KbのEcoRI切断断片を、OX-96株の高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片として2.1KbのBamHI切断断片を、OX-109株の高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片として3.2KbのEcoRI切断断片を、OX-112株の高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片として1.1KbのEcoRI切断断片を、OX-119株の高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片として1.8KbのBamHI切断断片と3.2KbのBamHI切断断片を、そしてOX-150株の高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片として4.4KbのEcoRI切断断片をそれぞれ取得した。このようにして得られた1.9KbのEcoRI断片を含有するプラスミドをpEco1.9、2.1KbのBamHI断片を含有するプラスミドをpBam2.1、3.2KbのEcoRI断片を含有するプラスミドをpEco3.2、1.1KbのEcoRI断片を含有するプラスミドをpEco1.1、1.8KbのBamHI断片を含有するプラスミドをpBam1.8、3.2KbのBamHI断片を含有するプラスミドをpBam3.2、そして4.4KbのEcoRI断片を含有するプラスミドをpEco4.4と命名した。
　pEco1.9、pBam2.1、pEco3.2、pEco1.1、pBam1.8、pBam3.2およびpEco4.4に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を常法により決定した。
　決定した塩基配列を、コリネバクテリウム・グルタミカムの全ゲノム情報（NCBI GenBank Accession No. BA000036）に基づいて解析した結果、pEco1.9が含有する1.9KbのEcoRI断片にはCgl0807が存在していた。pBam2.1が含有する2.1KbのBamHI断片にはCgl1101およびCgl1102が存在していた。pEco3.2が含有する3.2KbのEcoRI断片にはCgl2859およびCgl2861が存在していた。pEco1.1が含有する1.1KbのEcoRI断片にはCgl0600が存在していた。pBam1.8が含有する1.8KbのBamHI断片にはCgl1427が存在していた。pBam3.2が含有する3.2KbのBamHI断片にはCgl2857およびCgl2858が存在していた。pEco4.4が含有する4.4KbのEcoRI断片にはCgl2530、Cgl2531、Cgl2532およびCgl2533の４つの遺伝子が存在していた。
　OX-3株の高濃度酸素要求性を相補するCgl0807遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。
　OX-112株の高濃度酸素要求性を相補するCgl0600遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に示す。
　OX-119株の高濃度酸素要求性を相補するCgl1427遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号５に、塩基配列を配列番号６に示す。
　一方、pBam2.1から種々のＤＮＡ断片を常法によりサブクローニングしてOX-96株の高濃度酸素要求性の回復能を調べた結果、Cgl1102遺伝子のみを含有するプラスミドpCgl1102がOX-96株の高濃度酸素要求性を回復させた。なお、プラスミドpCgl1102は、プラスミドpBam2.1を鋳型とし、配列番号２１および２２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行って得られた0.5KbのＤＮＡ断片およびベクターpCS299PをBamHIで制限酵素処理し、両者を連結して得られたプラスミドである。Cgl1102遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号７に、塩基配列を配列番号８に示す。
　同様に、pEco3.2から種々のＤＮＡ断片を常法によりサブクローニングしてOX-109株の高濃度酸素要求性の回復能を調べた結果、Cgl2859遺伝子のみを含有するプラスミドpCgl2859がOX-109株の高濃度酸素要求性を回復させた。なお、プラスミドpCgl2859は、プラスミドpEco3.2からBamHIによりCgl2861を切り出して除去し、再び連結して得られたプラスミドである。Cgl2859遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号９に、塩基配列を配列番号１０に示す。
　また、pBam3.2から種々のＤＮＡ断片を常法によりサブクローニングしてOX-119株の高濃度酸素要求性の回復能を調べた結果、Cgl2857遺伝子のみを含有するプラスミドpCgl2857がOX-119株の高濃度酸素要求性を回復させた。なお、プラスミドpCgl2857は、プラスミドpBam3.2を鋳型とし、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行って得られた1.4KbのＤＮＡ断片およびベクターpCS299PをBamHIで制限酵素処理し、両者を連結して得られたプラスミドである。Cgl2857遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１１に、塩基配列を配列番号１２に示す。
　さらに、pEco4.4から種々のＤＮＡ断片を常法によりサブクローニングしてOX-150株の高濃度酸素要求性の回復能を調べた結果、Cgl2530、Cgl2531およびCgl2532遺伝子を含有するプラスミドpHIEがOX-150株の高濃度酸素要求性を回復させた。なお、プラスミドpHIEは、ATCC31833株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行って得られた3.8KbのＤＮＡ断片およびベクターpCS299PをKpnIで制限酵素処理し、両者を連結して得られたプラスミドである。
　これら3遺伝子はリボヌクレオチドレダクターゼ関連タンパク質でCgl2525も同酵素の構成因子であることが報告されている[Microbiology, 145, 1595 (1999)]。それら4遺伝子を含むプラスミドpHIEFを構築してOX-150株の高濃度酸素要求性の回復能を調べた結果、4種全てを含むプラスミドpHIEFの方が3種のみ含むプラスミドpHIEよりも高い相補能を示した。なお、pHIEFはプラスミドATCC31833株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７および２８で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行って得られた1.6KbのＤＮＡ断片およびプラスミドpHIEをBamHIで制限酵素処理し、両者を連結して得られたプラスミドである。
　Cgl2525遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１３に、塩基配列を配列番号１４に示す。Cgl2530遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に、塩基配列を配列番号１６に示す。Cgl2531遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１７に、塩基配列を配列番号１８に示す。Cgl2532遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１９に、塩基配列を配列番号２０に示す。
　（３）OX-3株、OX-3株にプラスミドpEco1.9を導入して得られたOX-3/pEco1.9株、OX-96株、OX-96株にプラスミドpCgl1102を導入して得られたOX-96/pCgl1102株、OX-109株、OX-109株にプラスミドpCgl2859を導入して得られたOX-109/pCgl2859株、OX-112株、OX-112株にプラスミドpEco1.1を導入して得られたOX-112/pEco1.1株、OX-119株、OX-119株にプラスミドpBam1.8を導入して得られたOX-119/pBam1.8株、OX-119株にプラスミドpCgl2857を導入して得られたOX-119/pCgl2857株、OX-150株、OX-150株にプラスミドpHIEFを導入して得られたOX-150/pHIEF株を、第２表に示す種々の酸素濃度条件で、ＢＹ寒天培地を用いて30℃で２日間培養した。結果を第２表に示す。なお、第２表中、＋＋は生育良好なもの、＋は生育不良なもの、-は生育しないものをそれぞれ示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　第２表に示すとおり、OX-3/pEco1.9株、OX-96/pCgl1102株、OX-109/pCgl2859株、OX-112/pEco1.1株、OX-119/pBam1.8株、OX-119/pCgl2857株およびOX-150/pHIEF株では、それぞれの宿主株と比較して高濃度酸素要求性が回復していた。
　実施例１で取得したプラスミドpEco1.9、pCgl1102、pCgl2859、pEco1.1、pBam1.8、pCgl2857およびpHIEFを用い、特開平6-169785記載の方法に従ってL-リジン生産菌を形質転換した。L-リジン生産菌としては、遺伝形質が明らかなコリネバクテリウム グルタミカムAHP-3株（FERM BP-7382）を用いた。コリネバクテリウム グルタミカムAHP-3株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株ATCC13032の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子(hom)にアミノ酸置換変異Val59Ala、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)にアミノ酸置換変異Thr331Ile、およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(pyc)にアミノ酸置換変異Pro458Serを有する菌株である。カナマイシンに耐性となった各形質転換株から特開平6-169785記載のベクターの調製方法に従ってプラスミドDNAを単離した。これらのプラスミドの各種制限酵素での切断解析により、各形質転換株が各々のプラスミドを保有することを確認した。
　これら各形質転換株と親株のL-リジン生産試験を試験管培養により次のように行った。BY寒天培地（肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム3g、酵母エキス 5g、バクトアガー 15ｇを水1Lに含み、pH7.2に調整した培地）で30℃、24時間培養した培養菌体１白金を、種培地（グルコース 20g、肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム3g、酵母エキス 5gを水１Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）5mlを含む太型試験管に植菌して30℃で13時間培養した。この種培養液 0.5mlを本培養培地（グルコース 50g、コーン・スティープ・リカー 10g、硫酸アンモニウム 45g、尿素2g、リン酸二水素カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、ビオチン 0.3mgを水1Lに含みpH7.0に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 7mlを含む太型試験管に接種し、30℃で72時間振とう培養した。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。結果を第３表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　第３表から明らかなように、本発明の遺伝子を含むプラスミドを導入したAHP-3株では、L-リジンの生産効率は親株AHP-3に比べ有意に向上していた。
　本発明によれば、高濃度酸素要求性の微生物の高濃度酸素要求性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を用いた有用物質の製造方法を提供することができる。
配列番号２１－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (3)

  1. 有用物質を生産する能力を有する微生物を、高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
  2. 高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［６］のいずれかに記載の蛋白質である、請求項１記載の製造法。
    ［１］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
    ［２］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
    ［３］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
    ［４］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれる蛋白質
    ［５］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質
    ［６］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質。
  3. 高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］～［６］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１または２記載の製造法。
    ［１］配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ　
    ［２］配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［３］配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［４］配列番号１３、１５、１７および１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［５］配列番号１４、１６、１８および２０のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡより選ばれるＤＮＡ
    ［６］配列番号１４、１６、１８および２０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡより選ばれ、かつ高濃度酸素要求性の微生物の低濃度酸素での生育を向上させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
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