WO2010071230A1 - 細胞特異的能動集積性を有する光線力学療法剤 - Google Patents

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cancer
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上田政和
荒井恒憲
松田祐子
石原一彦
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学校法人慶應義塾
国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to photodynamic therapy, comprising a structural unit and a hydrophobic monomer based on 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (hereinafter abbreviated as MPC) containing a photosensitizer and having an antibody against a cell-specific antigen on the surface.
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • the present invention relates to a photodynamic therapeutic agent comprising a copolymer having a structural unit based thereon.
  • Photodynamic therapy is a less invasive therapy that takes into account functional preservation and uses a photochemical reaction by photosensitivity that shows accumulation in cancer and laser light, and is safe and effective. Can be enforced. In addition, it has the advantages that it can be repeatedly performed compared to radiation and the like and has no toxicity as an anticancer agent, and is expected as a new minimally invasive treatment. Molecularly, when the cancerous part is irradiated with a laser beam, the accumulated tumor-affinity photosensitizer increases the energy level in the molecule from the singlet state of the ground state and is converted to an excited triplet state.
  • the photosensitizer When this state is reached, the photosensitizer is photoactivated, and the active triplet oxygen ( 3 O 2 ) is converted to a highly active singlet by direct generation of active free radicals or indirect intramolecular energy conversion. Convert to oxygen ( 1 O 2 ).
  • 3 O 2 active triplet oxygen
  • both drugs are known to be taken up into tumor tissues approximately four times as much as normal tissues.
  • photofrin laser irradiation is performed about 48 hours after administration, and when resafylline is used, laser irradiation is performed about 4 hours after administration.
  • water absorption has a wavelength up to around 200 nm and longer than around 700 nm.
  • Absorption of oxyhemoglobin has bimodal peaks in the vicinity of 400 nm and 600 nm.
  • the influence of the tissue derived from the living body is the smallest in the vicinity of 650 to 700 nm, and the development of a photosensitive substance having an absorption edge in a long wavelength region is desired with the aim of treating deeper lesions.
  • Absorption of photofrin is 630 nm, and resafylin is 664 nm.
  • verteporfin has an absorption of 690 nm and can be said to be more suitable (see Patent Documents 1 to 3).
  • Verteporfin is also a photosensitive substance and is used for the treatment of age-related macular degeneration under the trade name Bisdyne (registered trademark) (NOVARTIS), but its application to cancer is currently not approved.
  • NOVARTIS Bisdyne (registered trademark)
  • Visdyne mild to moderate complement activity was observed at a concentration of 10 ⁇ g / ml in an in vitro test using human blood, and significant complement activation was observed at a concentration of 100 ⁇ g / ml or more. Yes. Large doses cannot be administered because the risk of anaphylactic reaction due to complement activation cannot be excluded.
  • a photosensitive substance for a photodynamic therapeutic agent is encapsulated in a liposome (see Patent Documents 4 and 5).
  • An object of the present invention is to provide a photodynamic therapeutic agent that can reach cancer tissue at a low concentration by active targeting that is unlikely to cause complications associated with photodynamic therapy such as photosensitivity.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for reducing the expression of anaphylactic reaction, which is a complication when verteporfin is used as a photosensitizer, and sun sensitivity, which is a complication that occurs in photodynamic therapy (PDT). went.
  • the present inventors include a photosensitive substance in a polymer which is a copolymer having a constitutional unit based on MPC and a constitutional unit based on a hydrophobic monomer, and is specifically expressed on cancer cells on the surface.
  • a polymer composed of hydrophilic MPC, hydrophobic n-butyl methacrylate (MBA) and p-nitrophenyloxycarbonylethylene glycol methacrylate (MEONP) having an active ester was used.
  • the polymer is referred to as PMBN (poly [2-methacryloylethylphosphoryl choline (MPC) -co-n-butyl methyl acrylate (BMA) -co-p-nitrophenyl carbonyl poly (ethylene) PET).
  • PMBN poly [2-methacryloylethylphosphoryl choline (MPC) -co-n-butyl methyl acrylate (BMA) -co-p-nitrophenyl carbonyl poly (ethylene) PET.
  • the polymer has an active ester and can be conjugated to a protein.
  • Protein-bound PMBN (MPC polymer) encapsulating verteporfin is administered intravenously and accumulates in the cancerous part by antigen-antibody reaction or ligand receptor reaction. As a result, the maximum effect with a smaller dose can be expected, and therefore it seems to be effective in reducing or shortening sun sensitivity.
  • verteporfin has a long absorption wavelength of 690 nm, it can be expected to be applied to cancer deeper than advanced gastric cancer, advanced colorectal cancer, advanced lung cancer, brain tumor, and advanced cancer.
  • PMBN (MPC polymer) in which an antibody specific to a cancer antigen is bound selectively reaches the cancer site, the dose can be reduced and the expression of anaphylactic reaction can be suppressed.
  • the present invention is as follows.
  • a cancer cell-specific high molecular weight polymer compound comprising a photosensitizer for photodynamic therapy and having an antibody against the cancer cell-specific antigen bound to the surface.
  • the cancer cell-specific polymer compound according to [5], wherein the monomer compound containing an active ester group is p-nitrophenyloxycarbonylethylene glycol methacrylate.
  • Molecular polymer compound [8] The cancer cell-specific polymer compound according to any one of [1] to [7], wherein an antibody against a cancer cell-specific antigen is bound via an active ester group of a monomer compound containing an active ester group .
  • a photodynamic therapy agent comprising the cancer cell-specific high molecular polymer compound according to any one of [1] to [9].
  • the photodynamic therapeutic agent according to [10] which is an intravenous injection preparation.
  • a monomer compound containing MPC, n-butyl methacrylate and an active ester group is mixed to produce PMBN (MPC polymer), and then mixed with an antibody against a cancer cell-specific antigen, and p-nitrophenyloxycarbonyl Photodynamics, comprising binding the antibody to an active ester group of ethylene glycol methacrylate, further mixing a photosensitizer for photodynamic therapy, and encapsulating the photosensitizer for photodynamic therapy in PMBN (MPC polymer).
  • a method for producing a therapeutic agent [13] The method for producing a photodynamic therapeutic agent according to [12], wherein the monomer compound containing an active ester group is p-nitrophenyloxycarbonylethylene glycol methacrylate. [14] The method for producing a photodynamic therapeutic agent according to [12] or [13], wherein the antibody against the cancer cell-specific antigen is selected from the group consisting of an anti-EGFR antibody, an anti-EpCAM antibody, and an anti-c-erbB-2 antibody. [15] The method for producing a photodynamic therapeutic agent according to any one of [12] to [14], wherein the photosensitizer for photodynamic therapy is verteporfin.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2008-321500 which is the basis of the priority of the present application.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of examination of verteporfin-PMBN (MPC polymer) tissue distribution using an epithelioid cancer model.
  • FIG. 1A shows the results of PMBN (MPC polymer) conjugated with anti-EGFR antibody
  • FIG. 1B shows the results of MPC polymer not conjugated with anti-EGFR antibody.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of examination of verteporfin-PMBN (MPC polymer) / laser treatment using a human epidermoid cancer model.
  • FIG. 3 shows the results of an uptake test for verteporfin PMBN (MPC polymer) using cultured cells.
  • FIG. 1A shows the results of PMBN (MPC polymer) conjugated with anti-EGFR antibody
  • FIG. 1B shows the results of MPC polymer not conjugated with anti-EGFR antibody.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of examination of verteporfin-PMBN (MPC polymer) / laser treatment using a human epi
  • FIG. 4 shows the results of laser treatment using verteporfin-PMBN (MPC polymer) with or without antibody binding using a human colorectal cancer model.
  • FIG. 5 is a graph showing the results (mouse survival rate) of verteporfin-PMBN (MPC polymer) laser treatment using a human epidermoid cancer model.
  • FIG. 6 shows one hour after the polymer containing visdyne, verteporfin (no antibody) (Ab ( ⁇ ) verteporfin-PMBN) and the polymer containing verteporfin (with antibody) (Ab (+) verteporfin-PMBN). It is a figure which shows the uptake
  • FIG. 7 is a diagram showing accumulation of a polymer containing bisdyne and verteporfin (with antibody) (Ab (+) verteporfin-PMBN) in a tumor.
  • a polymer that forms a liposome or a liposome-like aggregate can be used.
  • Liposomes usually mean closed vesicles having lipid layers such as phospholipids and glycolipids assembled in a membrane.
  • Known liposomes can be used as the liposome of the present invention.
  • the lipid constituting the liposome of the present invention include phosphatidylcholines, phosphatidylethanolamines, phosphatidic acids, long-chain alkyl phosphates, gangliosides, glycolipids, and phosphatidylglycerols.
  • Cholesterols and the like, and phosphatidylcholines include dimyristoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearoyl phosphatidylcholine and the like
  • phosphatidylethanolamines include Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, distearoyl phosphatidylethanolamine, and the like
  • phosphatidic acids and long chain alkyl phosphates include Examples include stoyl phosphatidic acid, dipalmitoyl phosphatidic acid, distearoyl phosphatidic acid, and dicetyl phosphoric acid.
  • gangliosides examples include ganglioside GM1, ganglioside GD1a, ganglioside GT1b, and the like.
  • Galactosylceramide, glucosylceramide, lactosylceramide, phosphatide, globoside, etc., and phosphatidylglycerols include dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, etc.
  • phosphatidic acids, long-chain alkyl phosphates, gangliosides, glycolipids, and cholesterols have the effect of increasing liposome stability.
  • Liposomes can be produced by known methods such as a thin film method, reverse layer evaporation method, ethanol injection method, dehydration-rehydration method, ultrasonic irradiation method, extrusion method, French press method, homogenization method and the like. However, among these, it is also possible to adjust the particle size of the liposome using an ultrasonic irradiation method, an extrusion method, a French press method, a homogenization method, or the like.
  • the average particle size of the liposome of the present invention is 30 to 500 nm, preferably 50 to 300 nm, more preferably 70 to 150 nm.
  • a polymer having a structural unit based on MPC and a structural unit based on a hydrophobic monomer is referred to as PMBN or MPC polymer.
  • the polymer has a hydrophobic unit and a hydrophilic unit, and has a characteristic that water solubility can be maintained by the hydrophilic unit while being bonded to a hydrophobic substance such as verteporfin by the hydrophobic unit.
  • PMBN MPC polymer
  • MPC is represented by the following formula (1).
  • Hydrophobic monomers copolymerized with MPC include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, dodecyl (meth) acrylate, cetyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, cyclohexyl
  • monoalkyl (meth) acrylates such as (meth) acrylate and 2-ethylhexyl (meth) acrylate
  • reactive functional group-containing (meth) acrylates such as glycidyl (meth) acrylate and (meth) acryloyloxyethyltrimethoxysilane; 2 -Urethane-modified (meth) acrylate diethy
  • the hydrophobic monomer is preferably an alkyl (meth) acrylate represented by the formula (2), and more preferably n-butyl methacrylate (BMA).
  • R 1 is H or CH 3
  • R 2 is H or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms.
  • the hydrophobic monomer used in the present invention two or more of the above hydrophobic monomers may be mixed and used.
  • a copolymer any form of a random copolymer and a block copolymer may be sufficient, and a random copolymer is preferable.
  • the constituent molar ratio of MPC and hydrophobic monomer is 20/80 to 95/5, preferably 30/70 to 80/20. If the MPC is less than 20 mol%, the solubility of the resulting copolymer in water will be low, and if it exceeds 95 mol%, the resolubility of the composition containing the MPC polymer will be poor, such being undesirable.
  • the weight average molecular weight of the copolymer used in the present invention is preferably 1000 to 5000000, more preferably 10,000 to 500000.
  • the copolymer may be prepared by using a known method such as solution polymerization, bulk polymerization, emulsion polymerization, suspension polymerization, etc., and the polymerization system with an inert gas such as nitrogen or argon as necessary. It can be prepared by a method of substitution and radical polymerization under conditions of a polymerization temperature of 10 to 100 ° C. and a polymerization time of 10 minutes to 48 hours. In the polymerization, a polymerization initiator can be used.
  • redox accelerators may be used as the polymerization initiator.
  • the amount of the polymerization initiator used is preferably 0.01 to 20 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the monomer composition.
  • the produced copolymer can be purified by a general purification method such as reprecipitation method, dialysis method, ultrafiltration method or the like.
  • the polymer of the present invention needs to have a functional group for binding an antibody against a cancer cell-specific antigen to the surface.
  • the functional group include an active ester group.
  • the “active ester group” refers to an ester group that has an electron withdrawing group with high acidity in one substituent of the ester group and is activated for a nucleophilic reaction.
  • the active ester group examples include a p-nitrophenyl active ester group, an N-hydroxysuccinimide active ester group, a phthalic acid imide active ester group, a 5-norbornene-2, and 3-dicarboximide active ester group.
  • a p-nitrophenyl active ester group or an N-hydroxysuccinimide active ester group is preferable, and a p-nitrophenyl active ester group is particularly preferable.
  • a monomer compound containing an active ester group may be mixed and copolymerized during the polymerization reaction.
  • Examples of the compound containing an active ester group include the following formula (3): [Wherein, d is 0.01 to 0.30 (preferably 0.01 to 0.20), and p is an integer of 1 to 10. ] And a polymer derived from a structural unit represented by (p-nitrophenyloxycarbonyloxyethylene methacrylate (MEONP)).
  • the copolymer of the above formula (1) or (2) is further polymerized so as to contain the monomer structural unit of the above formula (3) to produce a copolymer. That's fine.
  • the value of d represents the ratio of the number of structural units of the above formula (3) to the total number of monomer structural units constituting the copolymer.
  • the type of cancer that expresses the cancer cell-specific antigen is not limited, for example, brain / nerve tumor, skin cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, lymphoma / leukemia, colon cancer, pancreatic cancer, anal / rectal cancer, esophageal cancer, uterus
  • Examples include cancer, breast cancer, adrenal cancer, renal cancer, renal pelvic and ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, urethral cancer, penile cancer, testicular cancer, bone and osteosarcoma, leiomyoma, rhabdomyosarcoma, mesothelioma and the like.
  • antigens specific to tumor cells expressed on the surface of cancer cells include EGFR (epidermal growth factor), EpCAM, c-erbB-2, CCR5, CD19, HER-3, HER-4, PSMA, CEA , ⁇ hCG, CD20, CD33, CD30, CCR8, TNF- ⁇ precursor, STEAP, mesothelin, A33 antigen, prostate stem cell antigen (PSCA), Ly-6, CD63 and the like.
  • EGFR, EpCAM, and c-erbB-2 are preferable.
  • EGFR is expressed in squamous cell carcinoma cells
  • EpCAM is widely expressed in cancer cells
  • c-erbB-2 is expressed in adenocarcinoma.
  • antibodies against these cancer cell-specific antigens are bound to the surface and directed to cancer cells by active targeting. That is, it has cell-specific active accumulation properties.
  • the antibody can be prepared by a known method, and is preferably a monoclonal antibody.
  • an active ester group of a polymer and an amino group of an amino acid constituting the antibody may be bonded to PMBN (MPC polymer) by a covalent bond.
  • the antibody may be bound to the polymer by mixing the polymer and the antibody in a buffer solution such as a phosphate buffer. The reaction may be performed, for example, at 3 to 37 ° C. for 1 to 24 hours.
  • the mixing ratio of the high molecular polymer and the antibody is not limited.
  • 0.1 to 5 mg of the antibody may be mixed with 10 mg of the high molecular polymer.
  • the amount of bound antibody can be determined as follows. Upon antibody binding, the released p-nitrophenol is absorbed by ultraviolet light at 400 nm due to the reaction with the amino group of the antibody, and by measuring this, the approximate amount of binding can be quantified. In addition, after separating unreacted antibody by dialysis or the like, the amount of binding can be determined by directly quantifying the antibody. Furthermore, an approximate amount of binding can be determined by separation by liquid chromatography in a state including unreacted antibodies.
  • the polymer of the present invention contains a fat-soluble (hydrophobic) PDT therapeutic photosensitizer.
  • the fat-soluble photosensitizer binds to the hydrophobic portion of the polymer.
  • the polymer becomes a particulate substance including the fat-soluble photosensitive substance.
  • the fat-soluble PDT therapeutic photosensitizer include porphyrins such as protoporphyrin and benzoporphyrin, and verteporfin. Moreover, you may mix and use these chemical
  • PMBN MPC polymer
  • the present invention relates to a tumor cell-specific high molecular weight polymer compound containing a photosensitizer for photodynamic therapy and having an antibody against a cancer cell specific antigen bound to the surface, wherein the high molecular weight polymer is a constituent unit based on MPC and hydrophobic
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment which is a photodynamic therapeutic agent containing the cancer cell specific high molecular weight polymer compound which is a copolymer which has a structural unit based on a sex monomer.
  • the pharmaceutical composition is dissolved in an appropriate buffer such as physiological saline or phosphate buffered salt solution, and pharmaceutically acceptable additives are added as necessary.
  • additives include solubilizing agents such as organic solvents, pH adjusters such as acids and bases, stabilizers such as ascorbic acid, excipients such as glucose, and isotonic agents such as sodium chloride.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be systemically administered to a subject to be treated by intravenous injection in advance, but may be locally administered to a specific cancer tissue site.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is not limited.
  • the pharmaceutical composition prepared in several ⁇ g / ml to several mg / ml in the amount of photosensitizer for photodynamic therapy can be administered in several ⁇ l to several ml or directly targeted What is necessary is just to administer by injection
  • the administration method is not limited, and may be administered by intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, oral administration or the like. Of these, intravenous injection is preferable.
  • the photodynamic therapy agent of the present invention can reach a cancer tissue by active targeting even when injected intravenously, and can exert a therapeutic effect on cancer. That is, the photodynamic therapeutic agent of the present invention is preferably an intravenous injection preparation.
  • an antibody against a cancer cell-specific antigen of a high molecular polymer is directed to the cancer cell, binds to the cancer cell, and in some cases is taken into the cancer cell, and is photosensitive in the cancer cell. The substance is released and the photosensitive substance accumulates in the cancer cells.
  • a photosensitive substance is released around the cancer cell, and the photosensitive substance accumulates around the cancer cell.
  • the subject is irradiated with light to perform photodynamic therapy.
  • the light to irradiate can be suitably determined according to the photosensitive substance used. That is, light having an absorption wavelength of the photosensitive substance may be irradiated.
  • the photosensitive substance is verteporfin
  • light having a wavelength of 690 nm may be administered
  • photosensitivity light having a wavelength of 630 nm may be administered.
  • Examples of the light to be administered include light emitted from a semiconductor laser, a dye laser, and the like.
  • an Nd—YAG (yttrium, aluminum, garnet) laser, a CO 2 laser, an argon die laser, an excimer laser, or the like can be used.
  • the whole body of the subject may be irradiated with light, or a catheter including an optical fiber may be inserted into the body through a blood vessel or the like, and light may be irradiated locally to the affected area of the tumor through the optical fiber.
  • the photodynamic therapy agent of the present invention is added to a case where cancer remains in the submucosa, that is, a case where the mucosal resection is positive, for example, in an initial mucosal cancer in which the cancerous portion of the mucosa has been removed by endoscopic surgery Useful as a therapy.
  • ultrasound may be irradiated instead of irradiating light.
  • a photosensitive substance such as verteporfin
  • ultrasonic waves may be irradiated toward the tumor affected area.
  • the intensity of ultrasonic waves is 0.1 to 10 W / cm 2 , preferably 1 to 5 W / cm 2
  • the irradiation time of ultrasonic waves is several seconds to several hundred seconds.
  • MPC polymer MPC hydrophobic n-butyl methacrylate (MBA) and p-nitrophenyloxycarbonylethylene glycol methacrylate (MEONP) with active ester were mixed at a molar ratio of 60/20/20, and further as a polymerization initiator
  • MCA hydrophobic n-butyl methacrylate
  • MEONP p-nitrophenyloxycarbonylethylene glycol methacrylate
  • a reprecipitation method and a membrane dialysis method were used for purification of the polymer.
  • 10 mg of the obtained polymer was dissolved in PBS to which 1 mg of anti-EGFR antibody (528, ATCC registration number: HB8509)) was added to a final volume of 5 ml, and reacted at 4 ° C. overnight. Thereafter, 100 ⁇ l of 20 mg / ml verteporfin was added to obtain PMBN (MPC polymer) encapsulating verteporfin and having an anti-EGFR antibody bound to the surface.
  • PMBN MPC polymer
  • FIG. 1A shows the results of PMBN (MPC polymer) conjugated with anti-EGFR antibody
  • FIG. 1B shows the results of PMBN (MPC polymer) not conjugated with anti-EGFR antibody.
  • the MPC polymer not bound to the anti-EGFR antibody was hardly taken into the tumor tissue, but the MPC polymer bound to the anti-EGFR antibody was taken up in a large amount into the tumor tissue.
  • verteporfin-PMBN (MPC polymer) / laser treatment using human epidermoid cancer model 1 ⁇ 10 7 human epidermoid carcinoma cells A431 were subcutaneously administered to 6-week-old BALB / c nude mice.
  • 300 ⁇ l of verteporfin-PMBN (MPC polymer) prepared in Example 1 was intravenously injected.
  • laser irradiation at 75 J / cm 2 was performed with a 640 nm Fiber Coupled LD model (SONY), and then the tumor diameter was measured.
  • SONY Fiber Coupled LD model
  • an MPC polymer to which an anti-EGFR antibody was bound and an MPC polymer to which an anti-EGFR antibody was not bound were used.
  • the results are shown in FIG. In FIG. 2, the control represents a nude mouse that was not administered with PMBN (MPC polymer).
  • PMBN MPC polymer
  • the tumor volume grew over time.
  • PMBN MPC polymer
  • the tumor volume increased little compared to the control, but a certain increase was observed.
  • the MPC polymer conjugated with the anti-EGFR antibody was administered, the tumor volume was hardly increased. Observation of uptake of verteporfin A431 was seeded on a 24-well dish for culture and allowed to adhere for about 24 hours.
  • FIG. 3 shows a fluorescence observation image.
  • “Ab (+)” is a result when an MPC polymer to which an anti-EGFR antibody is bound is administered
  • “Ab ( ⁇ )” is a result when an MPC polymer that does not bind an anti-EGFR antibody is administered.
  • FIG. 3 shows cell images when A431 cells were contacted with verteporfin MPC polymer for 10 minutes, 20 minutes, and 30 minutes, respectively, as shown in Fig. 3.
  • PMBN MPC polymer
  • FIG. 4 shows the results when MPC polymer with or without anti-EGFR antibody was administered. As shown in FIG. 4, when the human colon cancer cell WiDr, which is a low EGFR expression strain, was used, the therapeutic effect of the MPC polymer to which the anti-EGFR antibody was bound was not observed.
  • FIG. 5 shows the results of mouse survival rates.
  • “Ab (+)” and “Ab ( ⁇ )” show the results of PMBN (MPC polymer) bound with anti-EGFR antibody and polymer not bound with anti-EGFR antibody, respectively.
  • NC represents a control not administered with PMBN (MPC polymer).
  • the survival rate was improved in mice administered with PMBN (MPC polymer) conjugated with anti-EGFR antibody.
  • PMBN antibody-bound PMBN
  • MPC polymer bisdyne The distribution of PMBN (MPC polymer) in tissue was examined by the following method. 1 ⁇ 10 7 human epidermoid carcinoma cells A431 were subcutaneously administered to 6-week-old BALB / c nude mice, and PMBN containing verteporfin prepared in Example 1 was used when the subcutaneous tumors grew to about 5 mm in diameter. (MPC polymer) 300 ⁇ l was injected intravenously and the tissue was collected.
  • the collected tissue was weighed and then lyophilized, N, N-dimethylformamide was added to the tissue, the tissue was homogenized, verteporfin was eluted, the absorbance was measured at OD686 nm, and the uptake amount was calculated.
  • the drugs used were bisdyne, a polymer containing verteporfin (without antibody) (Ab (-) verteporfin-PMBN), a polymer containing verteporfin (with antibody) (Ab (+) verteporfin-PMBN), these was taken up into normal tissues (skin and muscle) and accumulated in tumors.
  • Bisdyne is a therapeutic agent for age-related macular degeneration.
  • FIGS. 6 and 7 show skin uptake after 1 hour
  • FIG. 7 shows tumor accumulation over time.
  • FIG. 6 when the same amount of verteporfin was administered, the use of a polymer containing verteporfin suppressed the uptake into the skin by half compared with visdyne regardless of the presence or absence of antibodies. Yes. As a result, photosensitivity is unlikely to occur. This is considered to be because the particle size when compared with visdyne is as large as 40 to 60 nm without antibody and 100 to 120 nm with antibody.
  • FIG. 6 shows skin uptake after 1 hour
  • FIG. 7 shows tumor accumulation over time.
  • the photodynamic therapeutic agent of the present invention contains a photosensitive substance, and an antibody specific to an antigen specifically expressed on the surface of a cancer cell is bound to the surface. Therefore, even when the photodynamic therapy agent is systemically administered by intravenous injection, the photosensitive substance can efficiently reach the cancer tissue with a small dose by active targeting. When the photodynamic therapy agent of the present invention is used for the treatment of cancer, sun-sensitive complications are less likely to occur. Further, when verteporfin is used as a photosensitive substance, the dose can be reduced and the concentration in the body can be kept low, so that the risk of inducing an anaphylactic reaction is reduced. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

本発明は、日光過敏症等の光線力学療法に伴う合併症を起こしにくいアクティブターゲッティングにより低濃度で癌組織に到達し得る光線力学的療法剤の提供を目的としてなされた光線力学療法用光感受性物質を含み、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した癌細胞特異的高分子ポリマー化合物である。

Description

細胞特異的能動集積性を有する光線力学療法剤
　本発明は、光線力学的治療に関し、光感受性物質を含み、表面に細胞特異的抗原に対する抗体を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと略記）に基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体からなる光線力学療法剤に関する。
　光線力学的治療法（ＰＤＴ）とは、癌に集積性を示す光感受性物質とレーザー光照射による光化学反応を利用し、機能温存を考慮に入れた侵襲の少ない治療法で、安全にかつ有効に施行できる。また、放射線等に比して繰り返し施行可能であること、抗癌剤のように毒性もないという利点があり、新しい低侵襲治療として期待されている。
　分子学的には、レーザー光線を癌部に照射すると、集積した腫瘍親和性光感受性物質は基底状態の一重項状態から分子内のエネルギーレベルが上昇し、励起状態の三重項状態に変換される。この状態に達すると、光感受性物質は光活性化され、直接的な活性フリーラジカルの生成、あるいは間接的な分子内エネルギー変換によって基底状態の三重項酸素（３Ｏ２）を高活性の一重項酸素（１Ｏ２）へ変換させる。これら２つの光活性化反応は同時に起こり、どちらの生成体とも直接細胞を傷害する作用を示す。
　現在日本では、光線力学的治療剤として、フォトフリンとレザフィリンという２つの薬が認可されており、どちらの薬も腫瘍組織には正常組織のおよそ４倍取り込まれることが知られている。フォトフリンを用いた場合は投与の約４８時間後、レザフィリンを用いた場合は投与の約４時間後にレーザー照射を行う。正常組織は癌組織と比べて早い時間に薬が排泄されるので、この時間差を利用して腫瘍を選択的に治療する。フォトフリンを使用したＰＤＴは微少浸潤気管支内非小細胞性肺癌、部分的または完全閉塞の食道癌、他の肺腫瘍、中皮腫、バレット食道の早期食道癌、皮膚癌、乳癌、結腸直腸癌、婦人科悪性腫瘍等に応用されている。しかし、合併症として日光過敏症があり、このためフォトフリンで投与後２~３週間、レザフィリンで約１週間は直射日光を避けるなど、遮光が必要である。
　また、体内の構成成分では、水の吸収が２００ｎｍ付近までと７００ｎｍ付近より長波長にある。酸化ヘモグロビンの吸収は、４００ｎｍ、６００ｎｍ付近に二峰性のピークがある。もっとも生体由来の組織の影響が少ないのは６５０~７００ｎｍ近辺であり、より深部病変の治療を目指し、長波長領域での吸収端を有する光感受性物質の開発が望まれている。フォトフリンの吸収は６３０ｎｍ、レザフィリンは６６４ｎｍである。一方、ベルテポルフィンは吸収が６９０ｎｍにあり、より適していると言える（特許文献１~３を参照）。ベルテポルフィンも光感受性物質であり商品名ビスダイン（登録商標）（ＮＯＶＡＲＴＩＳ）として加齢黄斑変性症の治療に利用されているが、癌への応用は現在のところ認可されていない。しかし、ビスダインではヒトの血液を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験において、１０μｇ／ｍｌの濃度で軽度~中等度の補体活性が認められ、１００μｇ／ｍｌ以上の濃度で有意な補体活性化が認められている。補体活性化によるアナフィラキシー反応発現の危険性を排除できない為、大量投与はできない。
　光線力学的治療法において、光線力学的治療剤のための光感受性物質をリポソームに内包させて投与することが報告されていた（特許文献４及び５を参照）。しかしながら、現在までに、これらのリポソーム製剤を実際に静脈投与により生体に投与し、アクティブターゲッティングにより細胞特異的に癌組織に到達し、癌の光線力学的治療に成功したという報告はない。
　一方、生体適合性の高いポリマーとして、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である水溶性ポリマーが開発されている（特許文献６及び７を参照）。該ポリマーは、現在では発明以降すでに１０年以上経過し、医療用材（人工膵臓、人工腎臓、人工心臓など）の構成医療材料として広く利用されており、安全性や安定性などは証明されている。このポリマーは、疎水性と親水性のユニットを有する。
特表２００６−５０７３０７号公報 特表２００７−５２２１３７号公報 特表２００８−５０１７２７号公報 特開２００６−５６８０７号公報 特開２００７−２７７２１８号公報 特開２００３−１３７８１６号公報 特開２００４−１７５７５２号公報
　本発明は日光過敏症等の光線力学療法に伴う合併症を起こしにくいアクティブターゲッティングにより低濃度で癌組織に到達し得る光線力学的療法剤の提供を目的とする。
　本発明者らは、光線力学的療法（ＰＤＴ）において生じる合併症である日光過敏症、及び光感受性物質としてベルテポルフィンを用いた場合の合併症であるアナフィラキシー反応発現を低減させる方法について鋭意検討を行った。本発明者らは、その結果、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体であるポリマーに光感受性物質を内包させ、表面に癌細胞に特異的に発現する抗原に対する抗体を結合させたものを光線力学的療法に用いてみた。
　具体的には、親水性のＭＰＣ、疎水性のｎ−ブチルメタクリレート（ＭＢＡ）及び活性エステルを持つｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）とで構成されているポリマーを使用した。本発明においては、該ポリマーをＰＭＢＮ（ｐｏｌｙ［２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）−ｃｏ−ｎ−ｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＢＭＡ）−ｃｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ　ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＭＥＯＮＰ）］）あるいはＭＰＣポリマーという。該ポリマーは活性エステルを持ち、タンパク質と結合させることができる。タンパク質が結合し、ベルテポルフィンを内包したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）は静脈内投与され、抗原抗体反応又はリガンドレセプター反応により癌部に集積する。そのことにより、より少ない投与量での最大の効果が期待できる為、日光過敏症の軽減又は短縮に効果があると思われる。また、ベルテポルフィンは吸収波長が６９０ｎｍと長いため、進行胃癌、進行大腸癌、進行肺癌、脳腫瘍などより深部にある癌や進行した癌にも応用が期待できる。さらに、癌抗原に特異的な抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）は、選択的に癌部に到達するため、投与量も少なくて済み、アナフィラキシー反応の発現も抑えられる。
　タンパク質結合ベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を使ったＰＤＴは、治療後の組織機能の低下や侵襲が少なく、また治療後の副作用に対する処置も短くて済むため、患者のＱＯＬを高くする治療法として期待できる。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　光線力学療法用光感受性物質を含み、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［２］　高分子ポリマーがＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である［１］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［３］　高分子ポリマーがＭＰＣとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体である［２］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［４］　高分子ポリマーがリポソーム又はリポソーム様の高分子会合体である［１］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［５］　さらに、活性エステル基を含有するモノマー化合物を含む［１］~［４］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［６］　活性エステル基を含有するモノマー化合物がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである［５］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［７］　癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体からなる群から選択される、［１］~［６］のいずれかの癌細特異的高分子ポリマー化合物。
［８］　癌細胞特異的抗原に対する抗体が活性エステル基を含有するモノマー化合物の活性エステル基を介して結合している、［１］~［７］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［９］　光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである［１］~［８］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［１０］　［１］~［９］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物を含む、光線力学療法剤。
［１１］　静脈注射製剤である、［１０］の光線力学療法剤。
［１２］　ＭＰＣ、ｎ−ブチルメタクリレート及び活性エステル基を含有するモノマー化合物を混合し、ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を製造し、次いで、癌細胞特異的抗原に対する抗体と混合し、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートの活性エステル基に前記抗体を結合させ、さらに、光線力学療法用光感受性物質を混合し、ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）に該光線力学療法用光感受性物質を内包させることを含む、光線力学療法剤の製造方法。
［１３］　活性エステル基を含有するモノマー化合物がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである［１２］の光線力学療法剤の製造方法。
［１４］　癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体からなる群から選択される、［１２］又は［１３］の光線力学療法剤の製造方法。
［１５］　光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである［１２］~［１４］のいずれかの光線力学療法剤の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−３２１５００号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）組織内分布の検討の結果を示す図である。図１Ａは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の結果を示し、図１Ｂは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーの結果を示す。
　図２は、ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討の結果を示す図である。
　図３は、培養細胞を用いたベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の取込み試験の結果を示す図である。
　図４は、ヒト大腸癌モデルを用いた抗体を結合したか又はしないベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いたレーザー治療の結果を示す図である。
　図５は、ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討の結果（マウス生存率）を示す図である。
　図６は、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体なし）（Ａｂ（−）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）およびベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）の１時間後の皮膚への取り込みを示す図である。
　図７は、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）の腫瘍への集積を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明はリポソーム又はリポソーム様の会合体を形成するポリマーを用いることができる。
　リポソームは、通常、膜状に集合したリン脂質、糖脂質等の脂質層を有する閉鎖小胞を意味する。本発明のリポソームとしては公知のリポソームを用いることができる。本発明のリポソームが構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が挙げられ、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が挙げられ、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が挙げられ、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が挙げられ、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が挙げられる。このうち、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有する。リポソームは、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等の公知の方法により製造することができるが、このうち、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明のリポソームの平均粒径は３０~５００ｎｍ、好ましくは５０~３００ｎｍ、さらに好ましくは７０~１５０ｎｍである。
　上記のように、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する高分子ポリマーをＰＭＢＮまたはＭＰＣポリマーという。該ポリマーは、疎水性のユニット及び親水性のユニットを有し、疎水性のユニットでベルテポルフィン等の疎水性物質と結合しつつ、親水性のユニットにより水溶性を維持できるという特徴を有する。ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）は、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有し、ＭＰＣと疎水性単量体との構成モル比が２０／８０~９５／５であり、好ましくは３０／７０~８０／２０であ。ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）については、特開２００４−１７５７５２号公報に記載されており、該公報の記載に基づいて製造することができる。
　ＭＰＣは、下記の式（１）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　ＭＰＣと共重合させる疎水性単量体としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート等の各種モノアルキル（メタ）アクリレート；グリシジル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメトキシシラン等の反応性官能基含有（メタ）アクリレート；２−（メタ）アクリロイルオキシエチルブチルウレタン、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルベンジルウレタン、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフェニルウレタン等のウレタン変性（メタ）アクリレートジエチルフマレート、アクリロニトリル等が挙げられる。この中でも疎水性単量体としては、式（２）で表されるアルキル（メタ）アクリレートが好ましく、さらに、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ２はＨまたは炭素数１から１８のアルキル基である。］
　また、本発明に用いる疎水性単量体としては前記の疎水性単量体の２種以上を混合して用いてもよい。
　共重合体としては、ランダム共重合体、ブロック共重合体のいずれの形態でもよく、ランダム共重合体が好ましい。
　本発明に用いる共重合体において、ＭＰＣと疎水性単量体との構成モル比が２０／８０~９５／５であり、好ましくは３０／７０~８０／２０である。ＭＰＣが２０モル％未満では得られる共重合体の水への溶解性が低くなり、９５モル％を超えるとＭＰＣポリマーを含む組成物の再溶解性が悪くなるので好ましくない。
　本発明に用いる共重合体の重量平均分子量は、好ましくは１０００~５００００００、より好ましくは１００００~５０００００である。
　前記共重合体は、前記単量体を、公知の溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合等の方法を用いて、必要に応じて重合系を不活性ガス、例えば、窒素、アルゴンで置換し、通常重合温度１０~１００℃、重合時間１０分間~４８時間の条件でラジカル重合させる方法等により調製することができる。重合にあたっては重合開始剤を用いることができ、重合開始剤としては、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビスイソブチルアミド二水和物、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート（商品名「パーブチルＮＤ」、日油（株）製）又はこれらの混合物等を用いることができる。前記重合開始剤には各種レドックス系の促進剤を用いてもよい。重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００重量部に対して０．０１~２０重量部が好ましい。生成した共重合体、再沈澱法、透析法、限外濾過法など一般的な精製法により精製することができる。
　さらに、本発明の高分子ポリマーは、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体を結合させるための官能基を有している必要がある。官能基としては、例えば活性エステル基が挙げられる。「活性エステル基」とは、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有しており求核反応に対して活性化されたエステル基をいう。活性エステル基としては、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられる。この中でも、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、特にｐ−ニトロフェニル活性エステル基が好ましい。本発明の高分子ポリマーを製造する際に、重合反応の際に活性エステル基を含有するモノマー化合物を混合し、共重合すればよい。
　活性エステル基を含有する化合物としては、例えば、下記式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
［式中、ｄは０．０１~０．３０（好ましくは０．０１~０．２０）であり、ｐは１~１０の整数を表す。］
で表される構成単位（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルオキシエチレンメタクリレート（ＭＥＯＮＰ））由来のポリマーが挙げられる。本発明の高分子ポリマーを製造する際に、上記式（１）又は（２）の共重合体に、さらに上記式（３）のモノマー構成単位を含有するよう重合させて共重合体を製造すればよい。上記式中、ｄの値は、共重合体を構成する全モノマー構成単位数に対する上記式（３）の構成単位数の比を示す。
　癌細胞特異的抗原が発現する癌の種類は限定されず、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。
　癌細胞の表面に発現する腫瘍細胞に特異的な抗原としては、例えば、ＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子）、ＥｐＣＡＭ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、ＣＤ６３等が挙げられる。この中でもＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ及びｃ−ｅｒｂＢ−２が好ましい。ＥＧＦＲは扁平上皮癌細胞に発現し、ＥｐＣＡＭは広く癌細胞に発現し、ｃ−ｅｒｂＢ−２は腺癌に発現する。
　本発明の高分子ポリマーは、これらの癌細胞特異的抗原に対する抗体が表面に結合しており、アクティブターゲティングにより癌細胞を指向する。すなわち、細胞特異的能動集積性を有する。
　抗体は、公知の方法で作製することができ、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体は、高分子ポリマーの活性エステル基と抗体を構成するアミノ酸のアミノ基を共有結合によりＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）に結合させればよい。抗体の高分子ポリマーへの結合は、リン酸緩衝液等の緩衝液中で、高分子ポリマーと抗体を混合させればよい。反応は、例えば３~３７℃で１時間~２４時間行えばよい。高分子ポリマーと抗体との混合比は限定されないが、例えば、高分子ポリマー１０ｍｇに対して、抗体を０．１~５ｍｇ混合すればよい。結合した抗体量は以下のようにして決定することができる。抗体結合の際に、抗体のアミノ基との反応により、リリースされるｐ−ニトロフェノールは紫外線４００ｎｍに吸収を持ち、これを測定すればおおよその結合量を数値化することができる。また、透析等によって未反応の抗体を分離した後に、抗体を直接定量することで結合量を求めることができる。さらに、未反応の抗体も含めた状態で、液体クロマトグラフィーによって分離することでおおよその結合量を求めることができる。
　さらに、本発明の高分子ポリマーは、脂溶性（疎水性）のＰＤＴ治療用光感受性物質を含む。脂溶性の光感受性物質は、高分子ポリマーの疎水性部分と結合する。脂溶性の光感受性物質が高分子ポリマーの疎水性部分に結合することにより、高分子ポリマーは脂溶性の光感受性物質を内包した粒子状物質となる。
　脂溶性のＰＤＴ治療用光感受性物質としては、プロトポルフィリン、ベンゾポルフィリン等のポルフィリン類、ベルテポルフィン等が挙げられる。また、これらの薬剤を混合して用いてもよい。この中でも、ベルテポルフィンが好ましい。本発明において、ベルテポルフィンを含み、抗体が表面に結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を，
例えばＡｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）と呼ぶ。
　本発明は、光線力学的治療用光感受性物質を含み、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した腫瘍細胞特異的高分子ポリマー化合物であって、高分子ポリマーがＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である癌細胞特異的高分子ポリマー化合物を含む光線力学療法剤である癌治療用医薬組成物を含む。該医薬組成物は、生理食塩水、リン酸緩衝塩溶液等の適当な緩衝液に溶解させ、必要に応じて医薬的に許容できる添加物を添加する。添加物としては、有機溶媒等の溶解補助剤、酸、塩基等のｐＨ調整剤、アスコルビン酸等の安定剤、グルコース等の賦形剤、塩化ナトリウム等の等張化剤などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、あらかじめ静脈注射により治療を受けようとする被験体に全身投与すればよいが、特定の癌組織部位に局所投与してもよい。医薬組成物の投与量は限定されず、例えば光線力学的治療用光感受性物質量で数μｇ／ｍｌ~数ｍｇ／ｍｌに調製した医薬組成物を数μｌ~数ｍｌ投与するか、又は直接標的部位に注入等により投与すればよい。投与方法は、限定されず、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与等により投与すればよい。この中でも静脈注射が好ましい。本発明の光線力学療法剤は、静脈注射した場合でも、アクティブターゲティングにより癌組織に到達し、癌の治療効果を発揮し得る。すなわち、本発明の光線力学療法剤は、好ましくは静脈注射製剤である。
　本発明の医薬組成物を投与すると、高分子ポリマーの癌細胞特異的抗原に対する抗体が癌細胞を指向し、癌細胞に結合し、ある場合は癌細胞中に取り込まれ、癌細胞中で光感受性物質を放出し、光感受性物質が癌細胞内に集積する。また、ある場合は癌細胞の周囲で光感受性物質を放出し、光感受性物質が癌細胞の周囲に集積する。
　医薬組成物の投与後、０．５時間~７２時間後に被験体に光を照射し、光線力学的治療を行う。照射する光は、用いた光感受性物質に応じて適宜決定することができる。すなわち、光感受性物質の吸収波長の波長を有する光を照射すればよい。例えば、光感受性物質がベルテポルフィンの場合、６９０ｎｍの波長の光を、フォトフリンの場合、６３０ｎｍの波長の光を投与すればよい。投与する光としては、例えば半導体レーザー、色素レーザー等が発する光が挙げられる。具体的には、Ｎｄ−ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）レーザー、ＣＯ２レーザー、アルゴン・ダイ・レーザー、エキシマ・レーザー等を用いることができる。被験体の全身に光を照射してもよいし、光ファイバーを含むカテーテルを血管等を通じて体内に挿入し、光ファイバーを通じて、腫瘍患部に局所的に光を照射してもよい。
　本発明の光線力学療法剤は、例えば、内視鏡手術により粘膜の癌部を切除した粘膜の初期癌において、粘膜下に癌が残っている症例、すなわち、粘膜切除術断端陽性例に対する追加療法として有用である。
　さらに、本発明の医薬組成物を投与した後に、光を照射する代わりに、超音波を照射してもよい。ベルテポルフィン等の光感受性物質に超音波を照射することにより、フリーラジカルが発生し、癌細胞の増殖を抑えることができる。超音波は体内の深部に到達するので、深部の癌の治療に有用である。例えば、本発明の医薬組成物を生体に投与した後、腫瘍患部に向け超音波を照射すればよい。限定されないが、超音波の強さは０．１~１０Ｗ／ｃｍ２、好ましくは１~５Ｗ／ｃｍ２であり、超音波の照射時間は数秒から数百秒である。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　ベルテポルフィン封入ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の作製
ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
　０．０１ｍｏｌのエチレングリコールモノメタクリレートを２０ｍＬのクロロホルムに溶解させ、−３０℃まで冷却した。溶液を−３０℃に保ち、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート及び０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン及びクロロホルム２０ｍＬの均一溶液を滴下した。−３０℃にて１時間反応させ、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。次いで、反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。
ＭＰＣポリマーの作製
　ＭＰＣ、疎水性のｎ−ブチルメタクリレート（ＭＢＡ）及び活性エステルを持つｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をモル比６０／２０／２０で混合し、さらに重合開始剤としてＡＩＢＮを用い、エタノールで希釈し、反応系をアルゴンで置換した後、６０℃にて５時間反応させ、共重合体を作製した。ポリマーの精製には、再沈殿法と膜透析法を用いた。
　得られたポリマー１０ｍｇを１ｍｇの抗ＥＧＦＲ抗体（５２８、ＡＴＣＣ登録番号：ＨＢ８５０９））を加えたＰＢＳでｆｉｎａｌ　５ｍｌになるように溶解し、４℃一晩反応させた。その後、２０ｍｇ／ｍｌベルテポルフィン１００μｌを加え、ベルテポルフィンが内包され、表面に抗ＥＧＦＲ抗体が結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を得た。
　類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）組織内分布の検討
　１×１０７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与した。皮下腫瘍が直径５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィンを含むＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射し、組織を採取した。採取した組織を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。凍結乾燥組織にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え組織をホモジナイズし、ベルテポルフィンを溶出させた後ＯＤ６８６ｎｍで吸光度を測定、取り込み量を算出した。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーと抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いた。
　結果を図１に示す。図１Ａは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の結果を示し、図１Ｂは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の結果を示す。図１に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーは腫瘍組織にはほとんど取り込まれなかったが、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーは腫瘍組織に大量に取り込まれた。
　ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討
　１ｘ１０７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与した。皮下腫瘍が５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射した。静脈注射１時間後に６４０ｎｍＦｉｂｅｒ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ＬＤ　ｍｏｄｅｌ（ＳＯＮＹ）にて７５Ｊ／ｃｍ２のレーザー照射を行い、その後腫瘍径を測定した。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーと抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーを用いた。
　図２に結果を示す。図２中、コントロールは、ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与しなかったヌードマウスを示す。図２に示すように、コントロールでは腫瘍容積は経時的に増殖した。抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与した場合には、コントロールに比較すると腫瘍容積の増加は少なかったが、ある程度の増加が認められた。抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーを投与した場合は、腫瘍容積の増加はほとんど認められなかった。
ベルテポルフィンの取込みの観察
　培養用２４ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈにＡ４３１をまき、接着するまで約２４時間おいた。
　１ｍｌの培地中に抗体あり、あるいはなしのベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）１００μｌを加え、１０分、２０分及び３０分後にＰＢＳで３回洗浄し、新しい培地を加えたのち１時間後に共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ−ＳＰ５を用い、励起４８８ｎｍ、蛍光６５０−７００ｎｍにて観察した。
　図３に蛍光観察像を示す。図３中、「Ａｂ（＋）」は、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーを投与した場合の結果、「Ａｂ（−）］は、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーを投与した場合の結果を示す。それぞれ、１０分、２０分及び３０分間Ａ４３１細胞とベルテポルフィンＭＰＣポリマーを接触させた場合の細胞像を示す。図３に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いた場合に、蛍光が強く染色され、ベルテポルフィンが大量に取り込まれた。
比較例１　ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いたベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討
　ＥＧＦＲ低発現の株であるヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いて検討を行った。
　１ｘ１０７個のヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に打った。
　皮下腫瘍が５ｍｍ程度になった際に実施例１で作製したベルテポルフィンＭＰＣポリマー３００μｌを静脈注射した。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）と抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーを用いた。
　静脈注射１時間後に６４０ｎｍＦｉｂｅｒ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ＬＤ　ｍｏｄｅｌ（ＳＯＮＹ）にて７５Ｊ／ｃｍ２のレーザー照射を行い、腫瘍径を測定した。
　図４に抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたか、又は結合させないＭＰＣポリマーを投与した場合の結果を示す。
　図４に示すように、ＥＧＦＲ低発現株である、ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いた場合は、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーの治療効果は認められなかった。
　ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討（生存率の検討）
　１ｘ１０７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与した。皮下腫瘍が５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射した。静脈注射１時間後に６４０ｎｍＦｉｂｅｒ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ＬＤ　ｍｏｄｅｌ（ＳＯＮＹ）にて７５Ｊ／ｃｍ２のレーザー照射を行い、その後マウスの生存率を経時的にモニタした。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーと抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いた。
　図５にマウスの生存率の結果を示す。図５中「Ａｂ（＋）」及び「Ａｂ（−）」は、それぞれ、抗ＥＧＦＲ抗体を結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）及び抗ＥＧＦＲ抗体を結合しないポリマーの結果を示す。また、ＮＣはＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与しないコントロールを示す。図５に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体を結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与したマウスで生存率が改善された。
　抗体を結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）とビスダインとの効果の比較
　以下の方法でＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の組織内分布を検討した。
　１×１０７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与し、皮下腫瘍が直径５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィンを含むＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射し、組織を採取した。採取した組織の重量を測定した後凍結乾燥し、組織にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え組織をホモジナイズし、ベルテポルフィンを溶出させた後ＯＤ６８６ｎｍで吸光度を測定、取り込み量を算出した。
　用いた薬剤は、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体なし）（Ａｂ（−）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）であり、これらの正常組織（皮膚・筋肉）への取り込み及び腫瘍への集積を調べた。ビスダインは加齢黄斑変性症に対する治療薬で成分・含量１バイアル中ベルテポルフィン１５ｍｇ、添加物として乳糖６９０ｍｇ、エッグホスファチジルグリセロール４８．７５ｍｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン７０．５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビン酸０．１５ｍｇ、ジブチルヒドロキシトルエン０．０１５ｍｇを加えて疎水性のベルテポルフィンを可溶化したものである。なお、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体なし）（Ａｂ（−）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）の効果の比較実験においては、ベルテポルフィンの使用量を合わせた。
　結果を図６および７に示す、図６は、１時間後の皮膚への取り込みを、図７は経時的な腫瘍への集積を示す。
　図６に示すように、同量のベルテポルフィンを投与した場合、ベルテポルフィンを含むポリマーを用いることにより、抗体の有る無しに拘らず、皮膚への取り込みがビスダインと比較して半分に抑えられている。この結果、光過敏症が起こりにくくなると考えられる。これは、ビスダインと比べた場合の粒径が、抗体なしで４０~６０ｎｍ、抗体ありで１００~１２０ｎｍと大きくなっているためだと考えられる。
　また、図７に示す腫瘍への集積の結果からわかるように、ＥＧＦＲ高発現のＡ４３１細胞に対する取り込みはビスダインとベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）で高く、一方、ＥＧＦＲ陰性のＨ６９細胞ではベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）は、ほとんど取り込まれていなかった。この結果は、腫瘍への取り込み、集積はＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ；特定のサイズを持った粒子が血管壁の隙間を通過し、腫瘍に蓄積すること）効果ではなく、抗体によるものであることを示す。
　腫瘍（Ａ４３１）への取り込みと正常組織への取り込みの比を計算すると、腫瘍への取り込み／皮膚への取り込みの比は、ビスダインを用いた場合には３０分後で４．２４であるのに対し、Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮを用いた場合は３０分後で５０．００、１時間後ではビスダインを用いた場合が５．９６であるのに対し、Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮを用いた場合は７．２６と高くなっていた。
　本発明の光線力学療法剤は、光感受性物質を内包し、表面に、癌細胞の表面に特異的に発現する抗原に特異的な抗体が結合している。そのため、光線力学療法剤を静脈注射により全身投与する場合でも、アクティブターゲティングにより少ない投与量で効率的に癌組織に光感受性物質を到達させることができる。本発明の光線力学療法剤を癌の治療に用いた場合、日光感受性の合併症が起こりにくくなる。また、光感受性物質としてベルテポルフィンを用いた場合、投与量を少なくすることができ、体内濃度も低く維持できるため、アナフィラキシー反応を誘発するおそれも少なくなる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (15)

  1. 　光線力学療法用光感受性物質を含み、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  2. 　高分子ポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下ＭＰＣと略記）に基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である請求項１記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  3. 　高分子ポリマーがＭＰＣとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体である請求項２記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  4. 　高分子ポリマーがリポソーム又はリポソーム様の高分子会合体である請求項１記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  5. 　さらに、活性エステル基を含有するモノマー化合物を含む請求項１~４のいずれか１項に記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  6. 　活性エステル基を含有するモノマー化合物がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである請求項５記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  7. 　癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体からなる群から選択される、請求項１~６のいずれか１項に記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  8. 　癌細胞特異的抗原に対する抗体が活性エステル基を含有するモノマー化合物の活性エステル基を介して結合している、請求項１~７のいずれか１項に記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  9. 　光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである請求項１~８のいずれか１項に記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
  10. 　請求項１~９のいずれか１項に記載の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物を含む、光線力学療法剤。
  11. 　静脈注射製剤である、請求項１０記載の光線力学療法剤。
  12. 　ＭＰＣ、ｎ−ブチルメタクリレート及び活性エステル基を含有するモノマー化合物を混合し、ＭＰＣポリマーを製造し、次いで、癌細胞特異的抗原に対する抗体と混合し、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートの活性エステル基に前記抗体を結合させ、さらに、光線力学療法用光感受性物質を混合し、ＭＰＣポリマーに該光線力学療法用光感受性物質を内包させることを含む、光線力学療法剤の製造方法。
  13. 　活性エステル基を含有するモノマー化合物がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである請求項１２記載の光線力学療法剤の製造方法。
  14. 　癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の光線力学療法剤の製造方法。
  15. 　光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである請求項１２~１４のいずれか１項に記載の光線力学療法剤の製造方法。
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