WO2010050783A2 - 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2010050783A2
WO2010050783A2 PCT/KR2009/006357 KR2009006357W WO2010050783A2 WO 2010050783 A2 WO2010050783 A2 WO 2010050783A2 KR 2009006357 W KR2009006357 W KR 2009006357W WO 2010050783 A2 WO2010050783 A2 WO 2010050783A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
formula
pharmaceutically acceptable
methanol
eluent
Prior art date
Application number
PCT/KR2009/006357
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2010050783A3 (ko
Inventor
강헌중
노정래
홍정호
박승범
신찬수
이재환
홍준영
김은오
김정아
오상미
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to CN200980143890.9A priority Critical patent/CN102203099B/zh
Priority to JP2011534397A priority patent/JP2012507509A/ja
Priority to BRPI0920764A priority patent/BRPI0920764A2/pt
Priority to EP09823863.7A priority patent/EP2363400B1/en
Priority to US13/126,979 priority patent/US8703813B2/en
Priority to ES09823863T priority patent/ES2423196T3/es
Priority to RU2011121877/04A priority patent/RU2492173C2/ru
Priority to CA2742364A priority patent/CA2742364A1/en
Priority to AU2009310544A priority patent/AU2009310544A1/en
Publication of WO2010050783A2 publication Critical patent/WO2010050783A2/ko
Publication of WO2010050783A3 publication Critical patent/WO2010050783A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having a spirochiral carbon skeleton, a process for its preparation and a pharmaceutical composition comprising the same.
  • adipose tissue has been thought to be a repository of energy for physical activity, as well as a function of protecting and maintaining body temperature, but many recent studies have demonstrated that adipose tissue plays an important role in the physiology and development of the human body. Doing. In particular, it has been found that fat cells release substances that can regulate various physiological activities such as energy balance, blood sugar control, insulin sensitivity, and blood vessel formation, such as adipsin, TNFa, and leptin. It was thought to be the central axis of metabolic regulation.
  • Osteoporosis is a result of the balance of bone formation, that is, bone formation ability by osteoblasts and bone absorption capacity by osteoclasts.
  • the regulation of osteoblast and osteoclast production is known in terms of hormones, external nutrition, and genetic aspects, but many genes that cause direct bone disease are not known.
  • the current method of treatment is to balance bone cells by suppressing the absorption of bone cells.
  • drugs since such drugs have severe side effects or have a slight clinical effect, new concepts of drug development are required. Therefore, many researchers have attempted to develop drugs that can directly promote bone cell formation, ie osteoblast activation, but no new drug has yet been developed that has a good effect.
  • an object of the present invention is to provide a novel compound having excellent adipocyte differentiation inhibitory ability.
  • LXR liver X receptor
  • an object of the present invention is to provide a novel compound that inhibits fat biosynthesis and fat absorption in the liver.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating osteoporosis, fatty liver or obesity comprising the novel compound as an active ingredient.
  • the present invention provides novel compounds of formula (I), their stereoisomers, their enantiomers, their precursors which are hydrolysable in vivo, or their pharmaceutically acceptable salts:
  • W is CO or CHOR
  • One X is N 3 , NHR 2 , OR 2 , SR 2 , SeR 2 Or TeR 2 And R is One And R 2
  • R 2 Are each independently hydrogen, C1 to C8 straight or branched chain alkyl, C2 to C8 alkenyl, C2 to C8 alkynyl, C3 to C8 cycloalkyl, C6 to C20 aryl, C4 to C20 heteroaryl, or
  • Y is O, S or NR 4 Z is a simple bond, NH, O, S, Se or Te
  • R 3 And R 4 Are each independently hydrogen, C1-C8 straight or branched alkyl, C2-C8 alkenyl, C2-C8 alkynyl, C3-C8 cycloalkyl, C6-C20 aryl or C4-C20 heteroaryl
  • M and N are each hydrogen or OH, or non-existent, wherein the carbon connected to M or N forms a single bond
  • step (b) distributing the extract obtained in step (a) using water and methylene chloride, removing the solvent of the organic layer, and then distributing again using a mixed solution of normal hexane, methanol and water;
  • step (c) After removing the solvent of the methanol separation layer obtained in step (b), using a silica as a fixed phase, and using a methanol solution containing or not containing 20% by weight or less of water relative to the total weight of the eluent as eluent Chroma It provides a method for producing a compound of Formula 1 comprising the step of performing a torque rape to obtain an aliquot.
  • the present invention also provides a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient comprising the compound of formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It provides a pharmaceutical composition for treating osteoporosis.
  • the present invention also provides a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient comprising the compound of formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutical composition for treating fatty liver is provided.
  • the present invention also provides a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient comprising the compound of formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It provides a pharmaceutical composition for the treatment of obesity.
  • the present invention also provides a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient comprising the compound of formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It provides a pharmaceutical composition for liver-X-receptor (LXR) antagonist.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient comprising the compound of formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It provides a pharmaceutical composition for liver-X-receptor (LXR) antagonist.
  • LXR liver-X-receptor
  • the compound of Formula 1 of the present invention has a very good osteoblast differentiation ability, it is expected that it can play a significant role in the treatment of osteoporosis.
  • the compound of Formula 1 has a strong antagonistic action against liver-X-receptor (LXR) to inhibit fat biosynthesis and fat absorption in the liver, it is expected that it can be used very effectively in the treatment of fatty liver.
  • LXR liver-X-receptor
  • the compound of Formula 1 since the compound of Formula 1 has excellent adipocyte differentiation inhibitory ability, it is expected that the compound of Formula 1 can be used very effectively for the treatment of obesity.
  • FIG. 1 shows (a) the correlation with hydrogen obtained from the COSY experiment (bold line) and the HMBC correlation (the arrow indicates the correlation of carbon nuclei in the hydrogen nucleus), and (b) the compounds 1 to 4 of the present invention. The structure of the is shown.
  • Figure 2 is a dichroism spectroscopic spectrum of compounds 1 and 2 of the present invention.
  • Figure 3 is a photograph showing the osteoblast differentiation measurement results of the extract fraction 116V of the present invention and compounds 1 to 4 (Test Example 1).
  • RTPCR real-time PCR
  • FIG. 5 shows Western blot data confirming protein expression of TAZ, a osteoblast differentiation marker, through treatment with C3H / 10T1 / 2 cell lines for 6 days with compounds 1 to 4 of the present invention (Western Blot). Example 1).
  • FIG. 6 shows Western blot data confirming protein expression of osteoblast differentiation markers TAZ and Runx2 through Western blot after treatment with C3H / 10T1 / 2 cell lines with Compounds 1 to 4 of the present invention for 6 days. (Test Example 1).
  • Figure 7 is a photograph showing the osteoblast differentiation measurement results of the compound 5 of the present invention carried out in Test Example 1.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of measuring the differentiation inhibitory ability of adipocytes (3T3-L1) of Compound 1 of the present invention carried out in Test Example 2.
  • LXR LXR nuclear receptor of Compound 1 of the present invention carried out in Test Example 3.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring selective activity of various nuclear receptors of Compound 1 of the present invention carried out in Test Example 3.
  • LXR LXR nuclear receptor protein of Compound 1 of the present invention carried out in Test Example 3.
  • Figure 13 is a graph showing the cytotoxicity measurement results for mouse spleen cells of the compound of the present invention carried out in Test Example 4.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring gene expression regulation function in hepatocytes (AML12 and HepG2 cells) of Compound 1 of the present invention carried out in Test Example 5.
  • 15 is a graph showing the weight change between the treatment group and the control group during the administration period in the mouse administration experiment of the compound 1 of the present invention carried out in Test Example 6.
  • 16 is a graph and a photograph showing the results of fatty liver inhibition efficacy in the disease animal model of Compound 1 of the present invention carried out in Test Example 6.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of measuring gene expression regulation efficacy shown by Compound 1 in the animal model of Disease 1 of Compound 1 of the present invention performed in Test Example 6 above.
  • the present invention relates to novel compounds of formula (I), stereoisomers thereof, enantiomers thereof, their precursors hydrolyzable in vivo or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • W is CO or CHOR
  • One X is N 3 , NHR 2 , OR 2 , SR 2 , SeR 2 Or TeR 2 And R is One And R 2
  • R 2 Are each independently hydrogen, C1 to C8 straight or branched chain alkyl, C2 to C8 alkenyl, C2 to C8 alkynyl, C3 to C8 cycloalkyl, C6 to C20 aryl, C4 to C20 heteroaryl, or
  • Y is O, S or NR 4 Z is a simple bond, NH, O, S, Se or Te
  • R 3 And R 4 Are each independently hydrogen, C1-C8 straight or branched alkyl, C2-C8 alkenyl, C2-C8 alkynyl, C3-C8 cycloalkyl, C6-C20 aryl or C4-C20 heteroaryl
  • M and N are each hydrogen, OH, or non-existent, wherein carbon linked to M or N forms a single bond or
  • the compound of Formula 1 may be isolated from an extract of Korean sponge sponge Phorbas sp. (KNUE116) or synthesized using the separated compound as a starting material, and has a novel spiro chiral carbon skeleton. Compound.
  • the compound of Formula 1 significantly promotes osteoblast differentiation, significantly inhibits adipocyte differentiation ability and inhibits adipogenesis and fat absorption in the liver, and therefore will play a role in the treatment of osteoporosis, fatty liver treatment, and obesity treatment. It is expected.
  • X 1 is N 3 , NH 2 , OH, SH, SeH or TeH,
  • X 2 is NH, O, S, Se or Te
  • Z is a simple bond, NH, O, S, Se or Te,
  • R 1 is hydrogen, C 1 -C 8 straight or branched alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 2 -C 8 alkynyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 6 -C 20 aryl, C 4 -C 20 heteroaryl or Is,
  • R 2 , R 3 and R 4 are each independently hydrogen, C 1 -C 8 straight or branched alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 2 -C 8 alkynyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 6 -C 20 aryl Or C4-C20 heteroaryl.
  • W is CO or CHOR
  • One X is N 3 , NHR 2 , OR 2 , SR 2 , SeR 2 Or TeR 2 And R is One And R 2
  • Y is O
  • S or NR 4 Z is a simple bond, NH, O or S
  • R is 3 And R 4
  • M and N are each hydrogen, OH, or non-existent, wherein carbon linked to M or N forms a single bond or a double bond with other carbons, and each carbon has one or less double bonds.
  • More preferred compounds of Formula 1 include W is CO or CHOR 1 , X is N 3 , OR 2 or SR 2 , and R 1 and R 2 are each independently hydrogen, a straight chain of C 1 to C 8 Or branched alkyl, C2 ⁇ C8 alkenyl, C2 ⁇ C8 alkynyl or Wherein Y is O or S, Z is a simple bond, R 3 is selected from hydrogen, C 1 -C 8 straight or branched chain alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, or C 2 -C 8 alkynyl, And N are each hydrogen, OH, or non-existent, wherein a carbon connected to M or N forms a single bond or a double bond with other carbons, and each compound has one or more double bonds. have.
  • the present invention provides a method for preparing the compound of Formula 1.
  • step (b) distributing the extract obtained in step (a) using water and methylene chloride, removing the solvent of the organic layer, and then distributing again using a mixed solution of normal hexane, methanol and water;
  • step (c) After removing the solvent of the methanol separation layer obtained in step (b), using a silica as a fixed phase, and using a methanol solution containing or not containing 20% by weight or less of water relative to the total weight of the eluent as eluent Chroma Performing a torque recipe to obtain an aliquot.
  • the manufacturing method may further comprise the step of purifying the liquid obtained in the step (d) (d) after the step (c).
  • step (a) it is preferable to use a lyophilization method, the drying, it is preferable to use methanol in the alcohol of C1 ⁇ C4. Extraction can be carried out at room temperature, preferably at least 2 hours.
  • the mixed solution of methanol and water preferably contains 60 to 90% by weight of methanol and 10 to 40% by weight of water based on the total weight of the solution.
  • step (c) it is preferable to perform reverse phase flash chromatography, and before using a methanol solution containing or not containing 20% by weight or less of water relative to the total weight as an eluent, It is preferable to perform the chromatography at least once using the mixed solution of methanol as the eluent, starting with the eluent having a high polarity and then the eluent having the low polarity. In particular, it is preferable to use a mixture of water and methanol as the eluent.
  • Purification in the step (d) can be carried out by high performance liquid phase chromatography (reversephased semiprep HPLC), 50 to 80% by weight of acetonitrile (ACN) and 20 to 50% by weight of water as the eluent total weight Preference is given to using a mixture of%.
  • the compounds of Formula 1 of the present invention can be synthesized by a method such as esterification reaction, azide substitution reaction, etherification reaction using the compounds isolated by the above method as a starting material.
  • the present invention also features as a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient a compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It relates to a pharmaceutical composition for the treatment of osteoporosis, fatty liver treatment and obesity treatment.
  • the present invention also features as a pharmaceutically acceptable carrier and active ingredient a compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, an enantiomer thereof, a precursor thereof hydrolyzable in vivo, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It provides a pharmaceutical composition for liver-X-receptor (LXR) antagonist.
  • LXR liver-X-receptor
  • Pharmaceutically acceptable carriers in the pharmaceutical compositions can be used without limitation, those conventionally used in the art as vehicles or media available for pharmaceutical administration.
  • a solvent, a dispersion medium, a filler, an extender, a binder, a humectant, a disintegrant, surfactant, etc. are mentioned.
  • compositions of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, sterile injectable solutions, etc. according to conventional methods. .
  • Preferred dosages of the compounds of formula (1) of the present invention, their stereoisomers, their enantiomers, their hydrolysable precursors or their pharmaceutically acceptable salts in vivo are determined by the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the administration. Depending on the route and duration, it may be appropriately selected by those skilled in the art. For example, from 0.01 mg / kg to 200 mg / kg per day. Administration may be administered once a day or may be divided several times. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • compositions of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like by various routes. All known modes of administration can be applied, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the stationary phase used reversed-phase silica C18 and the eluent was used in the order of low polar solvent starting from high polarity.
  • the sequence is 50% water / 50% methanol, 40% water / 60% methanol, 30% water / 70% methanol, 20% water / 80% methanol, 10% water / 90% methanol, 100% methanol, 100% acetone It was.
  • the osteoblast differentiation ability of each layer was measured and its efficacy was confirmed in 10% water / 90% methanol fraction (116V) and 100% methanol fraction (116VI). Got it.
  • Reverse phased semiprep HPLC was performed to purify the compounds for two aliquots with activity.
  • Compound 1 was isolated in the form of a pale orange oil and high performance peb (FAB) mass spectrometry data ([M + H] + m / z 399.2533) confirmed that the molecular formula of Compound 1 was C 25 H 34 O 4 . Since the characteristic absorption bands by infrared spectrum analysis appeared at 3433 cm 1 and 1680 cm 1 , it was estimated that Compound 1 contained hydroxyl and carbonyl functional groups. In addition, the structure of the compound was characterized by C 13 NMR and HNMR.
  • the absolute stereochemical structure of Compound 1 was determined by far dichroism spectroscopy (CD) analysis.
  • the absolute solid orientation of the chiral centers in cyclohexynone was determined according to Snatzke's sector rule. If the chiral center of carbon number 7 in the cyclohexinone of ring A has an absolute stereoalignment of S , compound 1 shows positive absorption at n ⁇ * transition domain (330 nm 350 nm) of the dichroic spectroscopy spectrum .
  • Compound 1 showed a positive absorption at 330 nm 350 nm, through which the absolute stereoalignment around the compounds 1 to 7 carbon was determined as S (Fig. 2).
  • Compound 1 of the present invention was dissolved in tetrahydrofuran. After the temperature was lowered to 0-5 ° C., diisopropylethylamine and butyryl chloride were sequentially added. After stirring for 1 hour at 0-5 ° C, ethyl acetate and water were added for extraction, and the organic solvent layer was separated and distilled. Compound 5 was obtained by purification by flash column chromatography.
  • C3H / 10T1 / 2 a mouse mesenchymal precursor cell purchased from ATCC, was prepared using DMEM containing 5.958 g / L HEPES, 3.7 g / L sodium bicarbonate, and 10% fetal bovine serum (FBS). (Dulbecco's Modified Eagle Medium) was diluted in medium and cultured in a 24-well dish at a concentration of 4 X 10 4 cells / well for 2 days in the presence of 37 °C, 5% CO 2 .
  • DMEM containing 5.958 g / L HEPES, 3.7 g / L sodium bicarbonate, and 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the fixed cells were washed three times with cold PBS and stained with 40 mM Alizarin Red S staining solution at room temperature for 20 minutes. To selectively observe only the cells differentiated into osteoblasts, the stain was removed and washed three times with distilled water.
  • the aliquots (116V) and aliquots (116VI) extracted from the sponges were dissolved in DMSO solvent and treated at 1, 2.5, 5, 10 and 20 ug / ml in C3H / 10T1 / 2 cell lines, which are mesenchymal precursor cells.
  • Significantly increased osteoblast differentiation was observed in a concentration-dependent manner, and mild cytotoxicity was observed at a concentration of 20 ug / ml.
  • the same experiment was carried out on Compound 1 (1163), Compound 2 (1162), Compound 3 (1161), and Compound 4 (1164), which separated the separation 116V and 116IV purely. Increased osteoblast differentiation was confirmed.
  • the concentrations showing maximum activity differed little by little.
  • Compound 3 (116-1) showed maximum activity at 2.5 ⁇ g / ml, and cytotoxicity was observed at the subsequent concentration.
  • Compound 1 (116-3) showed a markedly increased activity up to a concentration of 10 ⁇ g / ml in a concentration-dependent manner, similar to that of a purely isolated fraction (116V) and showed cytotoxicity at a concentration of 20 ⁇ g / ml. It was.
  • Compound 4 showed maximal activity at a concentration of 5 ⁇ g / ml, and cytotoxicity was observed above that (FIG. 3).
  • C3H / 10T1 / 2 cell lines were treated with compound 1 and compound 4 for 6 days, and then osteoblast differentiation markers (Runx2, Osteocalcin) by real-time PCR (RTPCR). , Msx2, etc.) was found to significantly increase the degree of transcription (Fig. 4).
  • the C3H / 10T1 / 2 cell line was treated with Compound 1 and Compound 4 for 6 days, respectively, and it was confirmed that the protein expression of Runx2 and TAZ was increased through Western blot (FIGS. 5 and 6).
  • the compounds of the present invention can be seen that the quantitative increase through the post-transcriptional control step of the Runx2 and TAZ proteins, thereby promoting the differentiation of osteoblasts.
  • the binding of TAZ and Runx2 was increased through the treatment of the compound, and thus the increase of transcriptional activity through Runx2 was confirmed.
  • Compound 5, which is an ester derivative of Compound 1 (1163) was synthesized to make more bioactive material, and the structure of Compound 5 thus prepared was also identified.
  • Compound 5, which is a derivative of Compound 1 also promotes osteoblast differentiation to a similar extent (FIG. 7). ). Therefore, the compounds of the present invention and their derivatives are expected to play an important role in the treatment of osteoporosis by promoting the differentiation of osteoblasts.
  • the mesenchymal precursor cells of rats purchased from ATCC contain 5.958 g / L HEPES, 3.7 g / L sodium bicarbonate, and 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Differentiation into adipocytes was induced by culturing for 8 days in the presence of. The medium was changed every two days during differentiation.
  • C3H / 10T1 / 2 cell line which induced differentiation into adipocytes, was fixed at 3.7% formaldehyde at room temperature for 30 minutes.
  • the Oil Red O solution dissolved in isopropanol to 0.5% was diluted in distilled water at a ratio of 6: 4, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, aliquoted into fixed cell lines, and stained at room temperature for one hour. The staining solution was removed and washed twice with distilled water to observe only cells differentiated into adipocytes.
  • 116V samples extracted from sponges were dissolved in DMSO solvent and treated with C3H / 10T1 / 2 cell line, mesenchymal progenitor cells at concentrations of 1, 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ g / ml. Cell differentiation was shown. Subsequently, samples of Compound 1 (1163), Compound 2 (1162), Compound 3 (1161), and Compound 4 (1164) obtained by purely separating the 116V and 116VI samples were obtained, and the same experiment was performed. Significantly reduced adipocyte differentiation at the concentration of ⁇ g / ml could be confirmed.
  • the compound 1 (116-3) sample showed a significant ability to inhibit the differentiation of adipocytes compared to other samples even at low concentration (1 ⁇ g / ml). No significant cytotoxicity was observed from each sample during adipocyte differentiation (FIG. 8).
  • Compound 1 showed a very good adipocyte differentiation inhibitory ability in 3T3-L1 cells as a result of efficacy verification (FIG. 9).
  • Test Example 3 Determination of liver-X-receptor (LXR) antagonism and selectivity for novel compounds
  • Animal cell line CV-1 was used for the transfection search.
  • Cells were cultured in DMEM medium in a 37 ° C. cell incubator containing 5% carbon dioxide.
  • the medium contained 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • FBS fetal bovine serum
  • CV-1 cells were seeded at 5,000 cells / well in 96 well plates.
  • the plasmid expressing GAL-hLXR, the plasmid expressing luciferase gene, and the plasmid expressing beta-galactosidase were transfected with Superfect (QIAGEN), a transfection reagent. It was.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • TO901317 was treated to a final concentration of 500 nM.
  • the cells were lysed using a lysis buffer, and luciferase activity was measured by adding luciferin in a luminometer. Beta-galactosidase activity was measured in an ELISA reader after the addition of ONPG reagent. The luciferase levels measured were corrected for beta-galactosidase activity.
  • compound 1 showed IC 50 values of 18.7 and 20.4 nM for LXR ⁇ and ⁇ , respectively (FIG. 10).
  • the activity of various nuclear receptors was measured by the same method in order to measure the selectivity of various nuclear receptors.
  • Compound 1 did not show any activity against other nuclear receptors (FIG. 11).
  • Compound 1 also demonstrated direct binding to LXR protein through Biacore experiments (FIG. 12).
  • Mouse splenocytes were used to measure toxicity in normal cells.
  • Mouse splenocytes were prepared as follows. The spleens were taken from 5-6 week old mice and finely divided, and only suspended splenocytes were filtered through a network having a pore size of 100 ⁇ m. Erythrocytes mixed with splenocytes were lysed using erythrocyte lysis reagents, and the cells were removed by centrifugation to precipitate and wash. Prepared spleen cells are 5 x 10 5 96 well plates were inoculated at the concentration of cells / well. At this time, the compound of formula 1 to be measured for toxicity was treated to splenocytes separated by concentration.
  • Compound 1 is cytotoxic IC against mouse splenocytes 50 The value is 63 ⁇ M was shown to be more than 1,000 times higher than the antagonistic concentration for LXR, showing little cytotoxicity for normal cells (FIG. 13).
  • Test Example 5 Confirmation of gene expression function in hepatocytes for new compounds
  • liver-X-receptor antagonist gene expression control function was confirmed in mouse and human liver cells.
  • hepatocyte AML12 cells and human hepatocyte HepG2 cells were used.
  • AML12 cells were cultured in DMEM medium in a 37 ° C. cell incubator containing 5% carbon dioxide.
  • the medium contained 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin 100 U / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • the medium of 80% grown cells was exchanged with DMEM medium containing no serum, and then TO901317 and the developed liver-X-receptor antagonist were treated in three wells per treatment group.
  • dimethyl sulfoxide was treated to a final concentration of 0.2%
  • TO901317 was treated to a final concentration of 500 nM.
  • Compound 1, developed to know the efficacy of the antagonist was treated alone at a concentration of 1 ⁇ M or with 500 nM TO901317.
  • the total RNA of hepatocytes was extracted using RNeasy total RNA extraction kit (QIAGEN).
  • Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche) was used to synthesize cDNA.
  • CDNA synthesized for real-time polymerase chain reaction was mixed with selective primer and QuantiTech Master Mix (QIAGEN) to ACC1 or Actin gene.
  • QIAGEN QuantiTech Master Mix
  • the polymerase chain reaction was repeated 45 times at 95 degrees 10 seconds, 60 degrees 15 seconds, and 72 degrees 20 seconds. All cDNA samples were subjected to triplicate reactions.
  • the Ct value of each sample was obtained using real-time polymerase chain reaction analysis software.
  • Test Example 6 Determination of Fatty Liver Inhibitory Effect in Experimental Animal Models for New Compounds
  • mice of C57BL / 6 background were fed a general diet and administered the T0901317 substance, which produces fatty liver, to build a fatty liver model. Fatty liver inhibition by Compound 1 was observed by oral administration of this compound.
  • mice fed with only 0.75% carboxymethylcellulose, the drug carrier were used.
  • mice fed with T0901317 substance were used.
  • mice fed with T0901317 substance were used.
  • mice in the negative control group, the positive control group and the treatment group were extracted and RNA was obtained using Trizol.
  • RNA was quantified by using an absorption spectrometer (Nanodrop), cDNA was obtained by RT-PCR method using oligo dT and reverse transcriptase from the same amount of RNA between each group.
  • Real-time polymerase chain reaction was carried out using cDNA as a template to analyze mRNA changes between groups, and primers of a gene involved in fat synthesis and transport of fat into the liver.
  • Compound 1 showed no difference in body weight between the treated group and the control group when administered to mice induced with fatty liver, and showed a very good fatty liver inhibitory effect in experimental animal models (FIGS. 15 and 16).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

본 발명은 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다. 상기 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물은 조골세포 분화능이 우수하며, 비만세포 분화억제능 및 간에서의 지방산 합성 억제능을 가지므로, 골다공증, 지방간 및 비만치료에 획기적인 역할을 할 것으로 기대된다.

Description

스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물
본 발명은 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
최근의 급속한 경제성장과 의학의 발전은 영양과잉 및 노인 인구의 증가를 가져 왔으며, 비만과 이로 인한 지방간 환자의 급격한 증가와 더불어 고령화에 따른 골다공증 환자의 증가를 초래하였다.
오랫동안 지방조직은 신체조직을 보호하고 체온을 유지하는 기능과 더불어 신체 활동을 위한 에너지의 저장소로만 생각되어 왔으나, 최근의 많은 연구 결과들은 지방조직이 인체의 생리나 발생에 있어서도 중요한 역할을 하는 것을 증명하고 있다. 특히, 지방 세포에서 adipsin, TNFa, leptin 등과 같이, 에너지의 균형, 혈당 조절, 인슐린 감수성 조절, 혈관 생성 등 여러 가지 생리 활성을 조절할 수 있는 물질들을 분비한다는 사실이 속속 밝혀짐으로써, 지방 세포를 신체 대사 조절의 중심축으로 생각하게 되었다.
한편, 비만에 의해 심각한 사회적 질환이 야기됨에 따라 지방 세포의 형성을 억제하는 약물의 개발도 활발하게 진행되고 있다. 그러나, 비만으로 인한 비알콜성 지방간 환자의 급격한 증가는 현대인의 건강에 심각한 위협으로 작용하고 있음에도 불구하고 이를 치료하기 위한 효과적인 약물은 아직까지 개발되지 못하고 있다.
골다공증은 뼈 형성의 균형, 즉 조골세포에 의한 뼈 형성능과 파골세포에 의한 뼈 흡수능이 무너져 일어난 결과이다. 조골세포 및 파골세포의 생성 조절은 호르몬, 외부 영양, 유전적 측면에서 이루어진다고 알려져 있으나, 직접적 골질환의 원인이 되는 유전자는 많이 밝혀져 있지 않다.
현재 치료 방법으로 쓰이고 있는 방법은 대부분 뼈세포의 흡수능을 억제함으로써 뼈세포의 균형을 맞추는 방법이다. 그러나 그러한 약물들은 부작용이 심하거나 미미한 임상효과를 나타내므로, 새로운 개념의 약물 개발이 요구되고 있다. 따라서 많은 연구자들이 직접적으로 뼈세포의 형성, 즉 조골세포의 활성화를 촉진할 수 있는 약물들을 개발하려고 시도하고 있으나 아직 좋은 효과를 나타내는 새로운 약물은 개발 되지 않고 있다.
본 발명은,
첫째, 매우 우수한 조골세포의 분화능을 가지는 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
둘째, 뛰어난 지방세포 분화억제능을 가지는 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
셋째, 간X수용체(LXR)에 대한 선택적이고도 우수한 길항 활성을 가지는 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
넷째, 간에서의 지방 생합성 및 지방 흡수를 억제하는 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다섯째, 상기의 신규 화합물을 유효 성분으로 포함하는 골다공증, 지방간 또는 비만 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 신규한 하기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2009006357-appb-I000001
상기 식에서 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, NHR2, OR2, SR2, SeR2 또는 TeR2이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴, C4~C20의 헤테로아릴 또는
Figure PCTKR2009006357-appb-I000002
중에서 선택되며, 상기 Y는 O, S 또는 NR4이고, Z는 단순결합, NH, O, S, Se 또는 Te이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴 또는 C4~C20의 헤테로아릴 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, 또는 OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성된다.
또한, 본 발명은,
(a)해면동물 Phorbas sp.를 잘라서 건조시킨 후, C1~C4의 알코올로 추출하는 단계;
(b)상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 물과 메틸렌클로라이드를 사용하여 분배시킨 후, 유기층의 용매를 제거하고, 다시 노르말 헥산과, 메탄올 및 물의 혼합용액을 사용하여 분배시키는 단계; 및
(c)상기 (b)단계에서 얻은 메탄올 분액층의 용매를 제거한 후, 고정상으로서 실리카를 사용하고, 용리액으로서 용리액 총 중량 대비 20중량% 이하의 물을 포함하거나 포함하지 않는 메탄올 용액을 사용하여 크로마토크래피를 실시하여 분액을 얻는 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 간-X-수용체(LXR) 길항용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 매우 우수한 조골세포의 분화능을 가지므로, 골다공증의 치료에 획기적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물은 간-X-수용체(LXR)에 대하여 강력한 길항 작용을 하여 간에서의 지방 생합성 및 지방 흡수를 억제하므로 지방간 치료에도 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물은 뛰어난 지방세포 분화억제능을 가지므로 비만 치료에도 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 (a)COSY 실험으로부터 얻어진 수소와의 상관성(굵은 선)과 HMBC 상관성(화살표는 수소핵에서 탄소핵과의 상관결합을 표시)을 도시한 것이며, (b)본 발명의 화합물 1~4의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물 1 및 2가 보이는 원이색성 분광스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 추출분액 116V와 화합물 1 내지 4의 조골세포 분화능 측정 결과를 나타낸 사진이다(시험예 1).
도 4는 본 발명의 화합물 1 내지 4로 C3H/10T1/2 세포주를 6일간 처리한 후, 실시간 PCR(RTPCR)을 통하여 조골세포의 분화표지인자들(Runx2, Osteocalcin, Msx2등)의 전사 정도를 확인한 결과를 나타내는 RTPCR데이터이다(시험예 1).
도 5는 본 발명의 화합물 1 내지 4로 C3H/10T1/2 세포주를 6일간 처리한 후, 웨스턴블롯(Western Blot)을 통해서 조골세포 분화표지인자인 TAZ의 단백질 발현을 확인한 웨스턴블롯 데이터이다(시험예 1).
도 6은 본 발명의 화합물 1 내지 4로 C3H/10T1/2 세포주를 6일간 처리한 후, 웨스턴블롯(Western Blot)을 통해서 조골세포 분화표지인자인 TAZ 및 Runx2의 단백질 발현을 확인한 웨스턴블롯 데이터이다(시험예 1).
도 7은 상기 시험예 1에서 실시한 본 발명의 화합물 5의 조골세포 분화능 측정 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 상기 시험예 2에서 실시한 본 발명의 추출분액 116V와 화합물 1 내지 4의 지방세포(C3H/10T1/2) 분화능 측정 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 상기 시험예 2에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 지방세포(3T3-L1) 분화 억제능 측정 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 상기 시험예 3에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 엘엑스알(LXR) 핵수용체의 길항 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 상기 시험예 3에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 각종 핵수용체에 대한 선택활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 상기 시험예 3에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 엘엑스알(LXR) 핵수용체 단백질에 대한 직접 결합 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 시험예 4에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 마우스 비장세포에 대한 세포독성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 상기 시험예 5에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 간세포(AML12 및 HepG2세포)에서의 유전자 발현 조절 기능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 상기 시험예 6에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 마우스 투여 실험에서 투여기간 동안 처리군 및 대조군 간 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 상기 시험예 6에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 질환동물 모델에서의 지방간 억제 효능 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 17은 상기 시험예 6에서 실시한 본 발명의 화합물 1의 질환동물 모델에서의 효능 입증 후, 이 동물모델에서 화합물 1에 의해 나타나는 유전자 발현 조절 효능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 신규한 하기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2009006357-appb-I000003
상기 식에서 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, NHR2, OR2, SR2, SeR2 또는 TeR2이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴, C4~C20의 헤테로아릴 또는
Figure PCTKR2009006357-appb-I000004
중에서 선택되며, 상기 Y는 O, S 또는 NR4이고, Z는 단순결합, NH, O, S, Se 또는 Te이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴 또는 C4~C20의 헤테로아릴 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성된다.
상기 화학식 1의 화합물은 국내에 서식하는 해면동물 Phorbas sp.의 추출물(KNUE116)로부터 분리되거나 상기 분리된 화합물을 출발물질로 하여 합성될 수 있는 것으로서 스파이로키랄(spiro chiral) 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물이다. 상기 화학식 1의 화합물은 조골세포 분화를 획기적으로 촉진하며, 지방 세포 분화능을 현저하게 억제하고 간에서의 지방생성 및 지방 흡수를 억제하므로, 골다공증의 치료, 지방간 치료 및 비만 치료에 획기적인 역할을 할 것으로 기대된다.
상기 화학식 1의 화합물들을 구체적으로 예시하면 다음과 같다:
Figure PCTKR2009006357-appb-I000005
Figure PCTKR2009006357-appb-I000006
상기 화학식들에 있어서,
X1은 N3, NH2, OH, SH, SeH 또는 TeH이며,
X2는 NH, O, S, Se 또는 Te이며,
Z는 단순결합, NH, O, S, Se 또는 Te이며,
R1은 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴, C4~C20의 헤테로아릴 또는
Figure PCTKR2009006357-appb-I000007
이며,
R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴 또는 C4~C20의 헤테로아릴이다.
상기 화학식 1의 화합물 중 더 바람직한 화합물로는 상기 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, NHR2, OR2, SR2, SeR2 또는 TeR2이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐 또는
Figure PCTKR2009006357-appb-I000008
중에서 선택되며, 상기 Y는 O, S 또는 NR4이고, Z는 단순결합, NH, O 또는 S이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐 또는 C2~C8의 알키닐 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성되는 화합물을 들 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물 중 더 더욱 바람직한 화합물로는 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, OR2 또는 SR2 이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐 또는
Figure PCTKR2009006357-appb-I000009
중에서 선택되며, 상기 Y는 O 또는 S이고, Z는 단순결합이고, R3 는 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐 또는 C2~C8의 알키닐 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성되는 화합물을 들 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물들의 좀 더 구체적으로 예시하면 다음과 같다:
Figure PCTKR2009006357-appb-I000010
Figure PCTKR2009006357-appb-I000011
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은,
(a)해면동물 Phorbas sp.를 잘라서 건조시킨 후, C1~C4의 알코올로 추출하는 단계;
(b)상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 물과 메틸렌클로라이드를 사용하여 분배시킨 후, 유기층의 용매를 제거하고, 다시 노르말 헥산과, 메탄올 및 물의 혼합용액을 사용하여 분배시키는 단계; 및
(c)상기 (b)단계에서 얻은 메탄올 분액층의 용매를 제거한 후, 고정상으로서 실리카를 사용하고, 용리액으로서 용리액 총 중량 대비 20중량% 이하의 물을 포함하거나 포함하지 않는 메탄올 용액을 사용하여 크로마토크래피를 실시하여 분액을 얻는 단계를 포함한다.
또한, 상기 제조방법은 상기 (c)단계 후에, (d)상기 (c)단계에서 얻은 분액을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (a)단계에서, 건조는 동결건조 방식을 사용하는 것이 바람직하며, C1~C4의 알코올 중 메탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 추출은 실온에서 수행할 수 있으며, 2시간 이상 실시하는 것이 바람직하다.
상기 (b)단계에서 상기 메탄올과 물의 혼합용액은 용액 총 중량에 대하여 메탄올 60~90중량%와 물 10~40중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 (c)단계에서는 역상의 플래쉬 크로마토크래피를 실시하는 것이 바람직하며, 용리액으로서 총 중량 대비 20중량% 이하의 물을 포함하거나 포함하지 않는 메탄올 용액을 사용하기 전에, 그 보다 극성이 높은 물과 메탄올의 혼합용액을 용리액으로 사용하여, 높은 극성을 갖는 용리액을 시작으로 낮은 극성을 갖는 용리액 순으로 1회 이상 크로마토그래피를 실시하는 하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 용리액으로는 물과 메탄올의 혼합액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (d)단계에서 정제는 고성능 액상 크로마토크래피(reversephased semiprep HPLC)에 의하여 실시할 수 있으며, 용리액으로는 용리액 총 중량에 대하여 아세토나이트릴(ACN) 50~80중량%와 물 20~50중량%의 혼합액을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 화학식 1의 화합물들은 상기와 같은 방법에 의하여 분리된 화합물들을 출발물질로 하여 에스테르화 반응, 아자이드 치환반응, 에테르화 반응 등의 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료, 지방간 치료 및 비만 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 간-X-수용체(LXR) 길항용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물에서 약제학적으로 허용가능한 담체는 약학 투여에 이용가능한 비히클 또는 매체로서 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 용매, 분산매, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 1일 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 기존에 알려진 투여의 모든 방식이 적용될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
실시예 1: 신규 화합물의 분리 및 정제
국내에 서식하는 해면동물 Phorbas sp.를 스킨 스쿠버를 이용하여 채집한 후, 약 10cm 이하의 크기로 절단하여 3일간 동결 건조시켜 건조 중량으로 약 1kg을 준비하였다. 건조 생물에 메탄올 3.0L를 가하여 실온에서 2일간 총 2회 걸쳐 추출하였다. 상기 추출물은 물과 메틸렌클로라이드 용매를 사용하여 분배한 후, 감압 농축에 의해 유기층으로부터 용매를 제거한 후, 다시 노르말 헥산과, 메탄올 85중량% 및 물 15중량%의 혼합용액을 사용하여 분배하였다. 이중 85중량% 메탄올 분액층으로부터 용매를 제거한 후, 약 5g의 분액을 얻었다. 이들 분액을 대상으로 역상 실리카 플래쉬 크로마토크래피를 실시하였다. 이 때 고정상은 역상 실리카 C18을 사용하였고 용리액은 높은 극성을 시작으로 낮은 극성의 용매순으로 사용하였다. 그 순서는 50%물 / 50% 메탄올, 40% 물 /60% 메탄올, 30% 물 / 70% 메탄올, 20% 물 / 80% 메탄올, 10% 물 / 90% 메탄올, 100% 메탄올, 100% 아세톤이었다. 각 층에 해당되는 물질을 대상으로 조골세포 분화 능력을 측정한 결과 10% 물/ 90% 메탄올 분액(116V)과 100% 메탄올 분액(116VI)에서 그 효능을 확인하였으며, 두 분액을 각각 1g 내외로 얻었다.
활성을 가진 두 분액에 대하여 화합물을 정제하기 위하여 역상 반분취 고성능 액상 크로마토크래피(reversephased semiprep HPLC)를 실시하였다. 먼저 분액 116V에 대하여 다음과 같은 조건으로 크로마토그래피를 실시하여 화합물 1, 9 및 10을 얻었다.
[컬럼: YMC ODSC18, 입자 직경: 5㎛, 컬럼의 크기: 250 × 10㎜(길이 × 직경), 용출 속도: 2.0 ㎖/min, 검출기: 굴절율 검출기, 용리액: 65중량% 아세토나이트릴(ACN)과 35중량%의 물 혼합액]
이 분액 50mg을 주사하였을 때 머무름 시간 33분(화합물 1), 15분(화합물 9), 40분(화합물 10) 정도에서 오렌지색 오일형태의 성분이 각각 약 25mg, 1.5mg, 1.0mg로 분리되었다. 다음 분액 116VI에 대해서도 같은 HPLC를 사용하였으나 추가적인 성분을 분리하기 위하여 전개 용매 조건을 달리하였다. 이 경우에는 70중량% 아세토나이트릴과 30중량% 물의 혼합액을 사용하였다. 1회 총 전개 시간은 1시간 30분 가량 소요되었으며 그 중 1시간 10분경, 오렌지색 오일형태의 화합물 2, 1시간 40분경 화합물 3, 마지막으로 1시간 57분경 화합물 4가 분액 5mg 1회 주입하였을 때, 각각 0.5mg, 0.08mg, 0.004mg의 양으로 분리 정제되어 수득되었다.
실시예 2: 신규 화합물의 화학구조 분석
상기 분액 116V와 116VI에서 얻어진 화합물 1-4 그리고 9, 10에 대하여 먼저 수소 핵자기공명 분광기를 측정하여 순도를 점검하고 난 후 다음과 같은 기기를 이용하여 분광학적인 데이터를 얻었다. 먼저 각 화합물에 대한 분자량을 측정하기 위하여 질량분석기(Jeol 사 JMS700 spectrometer)를 이용하였으며, 정밀한 화학구조 분석은 핵자기공명분광기(Varian사의 VNMRS 500 spectrometer)를 활용하여 이루어졌다. 그 외 분자의 자외선 흡수대 및 적외선 흡수대 측정을 위하여 Varian사의 Cary50 과 JACSO사의 FT_IR 4100 spectrometer를 각각 이용하였으며, 평광각은 JASCO사의 P1010 편광기를 사용하였다.
화합물 1은 연한 오렌지색의 오일형태로 분리되었으며 고성능 펩(FAB)질량 분석 데이터([M+H]+ m/z 399.2533)로부터 상기 화합물 1의 분자식이 C25H34O4이라는 것이 확인되었다. 적외선 스펙트럼 분석에 의한 특징적인 흡수대가 3433cm1과 1680cm1에서 나타나므로 상기 화합물 1은 수산기와 카보닐 작용기를 함유하고 있다는 것이 추정되었다. 또한, C13NMR과 HNMR로 화합물의 구조를 규명하였다.
상기 화합물 1에 대한 화학적 이동값은 하기 표 1에 정리하였다.
표 1
Figure PCTKR2009006357-appb-T000001
한편 이 화합물에 대한 상대적인 입체구조를 결정하기 위하여 ROESY 실험을 수행하였다. 특히 4.49ppm과 2.59ppm에 있는 두 수소 간의 NOE로부터 고리 A와 B가 cis 형태로 연결되어 있었으며, 5.28ppm에 있는 수소는 5.54ppm과 2.43ppm의 두 수소와의 NOE 정보로부터 고리 C의 입체적인 배향을 결정할 수 있었다. 마지막으로 16번 탄소에 붙은 수소의 공간적 배향은 인근 수소들 간의 짝결합 상수(11.3, 7.8, 3.4 Hz)로부터 추정 가능하였으며, 또한 19번 메틸 수소가 5번 그리고 6번 수소와의 NOE 관계를 맺고 있으므로 이를 간접적으로 증명하고 있다.
화합물 1의 절대적 입체화학구조는 원이색성 분광스펙트럼(CD) 분석을 통해 결정되었다. 사이클로헥시논 내 키랄 중심의 절대입체배향은 Snatzke의 구역법칙(sector rule)에 따라 결정되었다. 고리 A의 사이클로헥시논에 있는 7번 탄소의 키랄 중심이 S의 절대입체배향을 가질 경우, 화합물 1은 원이색성 분광스펙트럼의 nπ* 전이영영(330 nm 350 nm)에서 양의 흡광을 나타낸다. 화합물 1은 330 nm 350 nm 에서 양의 흡광을 보였으며, 이를 통해 상기 화합물 1 내지 7번 탄소 주위의 절대입체배향을 S로 결정하였다(도 2).
다른 다섯 화합물에 대해서도 위와 같은 방법으로 화학구조를 해석하였다. 세 화합물에 대한 각각의 탄소 NMR 데이터와 수소 NMR 데이터는 하기 표 2 내지 4에 각각 나타내었으며 그 외 물리적 및 분광적 데이터는 표 5에 정리하였다.
표 2
Figure PCTKR2009006357-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2009006357-appb-T000003
표 4
Figure PCTKR2009006357-appb-T000004
표 5
Figure PCTKR2009006357-appb-T000005
실시예 3: 화합물 1의 에스테르화 반응 유도체의 합성
Figure PCTKR2009006357-appb-I000012
본 발명의 화합물 1을 테트라히드로퓨란에 녹였다. 온도를 0~5℃로 낮춘 후, 디이소프로필에틸아민과 뷰티릴클로라이드를 차례로 첨가하였다. 0~5℃에서 1시간 동안 교반한 후, 에틸아세테이트와 물을 첨가하여 추출하고 유기 용매층을 분리하여 증류하였다. 플래쉬 컬럼크로마토그래피(Flash column chromatography)로 정제하여 화합물 5를 얻었다.
화합물 5(C29H41O5)의 [M+H]+ = 469.29
실시예 4: 화합물 1의 아자이드 치환 반응 유도체의 합성
Figure PCTKR2009006357-appb-I000013
본 발명의 화합물 1을 메틸렌클로라이드에 녹인 후, 0~5℃로 온도를 낮추었다. 디ter부틸메틸피리딘과 트리플루오로메탄설포닉 언하이드라이드를 차례로 첨가하고 30분간 교반하였다. 메틸렌클로라이드와 물을 첨가하여 추출한 후 유기 용매층을 분리하여 증류하였다. 용매를 모두 날린 후 디메틸포름아마이드에 다시 녹였다. 소디움아자이드를 첨가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하고, 메틸렌클로라이드를 첨가하여 희석시킨 후 물로 여러 번 세척하였다. 유기 용매층을 분리하여 증류한 후, 플래쉬 컬럼크로마토그래피(Flash column chromatography)로 정제하여 화합물 6을 얻었다.
화합물 6(C25H34N3O3)의 [M+H]+ = 424.26
실시예 5: 화합물 1의 에테르 유도체의 합성
Figure PCTKR2009006357-appb-I000014
본 발명의 화합물 1과 디ter부틸메틸피리딘을 메틸렌클로라이드에 녹였다. 메탄 트리플루오로설포네이트를 첨가한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 날린 후, 플래쉬 컬럼크로마토그래피(Flash column chromatography)로 정제하여 화합물 7을 얻었다.
화합물 7(C26H37O4)의 [M+H]+ = 413.27
실시예 6: 화합물 1의 카보네이트 유도체 합성
Figure PCTKR2009006357-appb-I000015
본 발명의 화합물 1을 메틸렌클로라이드에 녹인 후, 온도를 0~5℃로 낮추었다. 피리딘과 비닐 클로로포메이트를 차례로 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 메틸렌클로라이드로 희석한 후 물로 세척하였다. 유기 용매층을 분리하여 증류한 후, 플래쉬 컬럼크로마토그래피(Flash column chromatography)로 정제하여 화합물 8을 얻었다.
화합물 8(C28H37O6)의 [M+H]+ = 469.26
시험예 1: 신규 화합물에 대한 조골세포 형성능 측정 (Calcium Deposition Assay)
ATCC로부터 구입한 쥐 중간엽 전구 세포인 C3H/10T1/2을 5.958g/L HEPES, 3.7g/L 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate), 10% 소태아혈청(FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 희석하여 24웰 배양접시에 4 X 104 cells/well 의 농도로 하여 37℃, 5% CO2의 존재 하에서 2일 동안 배양하였다. 배양된 세포가 배양접시에 90~100%가 되게 자라면 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 10mM β글리세로인산염(βglycerophosphate), 50μ/ml 아스코르빈산(ascorbic acid)을 첨가하여 37℃, 5% CO2의 존재 하에 6일간 배양하여 조골세포로 분화를 유도하였다. 분화하는 동안 배지는 2일에 한번씩 바꿔주었다. 조골세포로 분화를 유도한 C3H/10T1/2 세포주를 PBS (PhosphateBuffered Saline)로 1회 세척하고 70% 에탄올로 20℃ 에서 한 시간 고정시켰다. 고정이 끝난 세포를 차가운 PBS로 3번 세척해주고 40mM Alizarin Red S 염색용액으로 상온에서 20분간 염색하였다. 조골세포로 분화된 세포들만 선택적으로 관찰하기 위해 염색액을 제거하고 증류수로 3번 세척하였다.
해면에서 추출, 분배한 분액(116V)와 분액(116VI)을 DMSO 용매에 녹인 후 중간엽 전구 세포인 C3H/10T1/2 세포주에 1, 2.5, 5, 10, 20ug/ml 의 농도로 처리한 결과 농도 의존적으로 현저하게 증가된 조골세포 분화능을 보였으며, 20ug/ml 의 농도에서는 약한 세포 독성이 관찰되었다. 이 후 분액 116V와 116IV을 순수하게 분리한 화합물 1(1163), 화합물 2(1162), 화합물 3(1161) 및 화합물 4(1164)에 대하여 동일한 실험을 수행한 결과, 화합물 1, 3 및 4에서 증가된 조골세포 분화능을 확인할 수 있었다. 최대 활성을 나타내는 농도는 조금씩 상이하였다. 화합물 3(116-1) 2.5㎍/㎖에서 최대 활성을 보이며, 이 후의 농도에서는 세포 독성을 관찰할 수 있었다. 화합물 1(116-3)은 순수 분리되지 않은 분액(116V)의 활성과 유사하게 농도 의존적으로 10㎍/㎖의 농도까지 현저하게 증가된 활성을 보였으며 20㎍/㎖의 농도에서 세포독성을 나타내었다. 화합물 4는 5㎍/㎖ 농도에서 최대 활성을 보인 후 그 이상에서는 세포독성이 관찰되었다(도 3). 조골세포 분화능을 보이는 작용 기전에 대한 연구를 위해서 C3H/10T1/2 세포주를 화합물 1 및 화합물 4로 각각 6일간 처리한 후, 실시간 PCR(RTPCR)을 통하여 조골세포의 분화표지인자들(Runx2, Osteocalcin, Msx2등)의 전사 정도가 현저히 증가됨을 규명하였다(도 4). 또한 C3H/10T1/2 세포주를 화합물 1 및 화합물 4로 각각 6일간 처리한 후, 웨스턴블롯(Western Blot)을 통해서 Runx2와 TAZ의 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다(도 5 및 6). 따라서 본 발명의 화합물들은 Runx2와 TAZ 단백질의 전사후 조절단계를 통해서 그 양적 증가가 일어나며, 이를 통해서 조골세포의 분화가 촉진될 수 있음을 알 수 있었다. 또한 이와 더불어 화합물의 처리를 통해서 TAZ와 Runx2의 결합이 증가되고, 이에 따른 Runx2를 매개로 한 전사활성의 증가를 확인할 수 있었다. 보다 생체 활성이 좋은 물질을 만들기 위해서 화합물 1(1163)의 에스테르 유도체인 화합물 5를 합성하였으며, 이렇게 만들어 진 화합물 5의 구조 또한 규명하였다. 나아가 만들어진 유도체의 생리활성(조골세포 분화능)을 칼슘침착분석(calcium deposition assay)을 통해서 확인해 본 결과, 화합물 1의 유도체인 화합물 5도 역시 유사한 정도로 조골세포의 분화를 촉진하는 것으로 확인되었다(도 7). 따라서 본 발명의 화합물 및 이들의 유도체는 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골다공증의 치료에 획기적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.
시험예 2: 신규 화합물에 대한 지방세포 분화 억제능 측정
ATCC로부터 구입한 쥐의 중간엽 전구 세포인 C3H/10T1/2 세포를 5.958g/L HEPES, 3.7g/L 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate), 10% 소태아혈청(FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 희석하여 24웰 배양접시에 4 X 104 cells/well 의 농도로 하여 37℃, 5% CO2의 존재 하에서 2일 동안 배양하였다. 배양된 세포가 배양접시에 90~100%가 되게 자라면 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 5μ/ml 인슐린, 1μM 덱사메타손(dexamethason), 5μM 트로글리타존(troglitazone)을 첨가하여 37℃, 5% CO2의 존재 하에서 8일간 배양하여 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 분화하는 동안 배지는 2일에 한번씩 바꿔주었다. 지방 세포로 분화를 유도한 C3H/10T1/2 세포주를 3.7% 포름알데히드로 상온에서 30분간 고정시켰다. 이소프로판올에 0.5%가 되게 녹인 Oil Red O 용액을 6:4의 비율로 증류수에 희석하여 0.2μm 필터로 여과시켜 고정된 세포주에 분주하고 상온에서 한 시간 동안 염색하였다. 지방 세포로 분화된 세포만을 관찰하기 위해 염색액을 제거하고 증류수로 2번 세척하였다.
해면에서 추출한 116V 시료를 DMSO 용매에 녹인 후, 중간엽 전구 세포인 C3H/10T1/2 세포주에 1, 2.5, 5, 10, 20㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 농도 의존적으로 현저하게 감소된 지방 세포 분화능을 보였다. 이 후 116V 및 116VI 시료를 순수 분리한 화합물 1(1163), 화합물 2(1162), 화합물 3(1161) 및 화합물 4(1164)의 시료를 확보한 후, 동일한 실험을 수행한 결과, 동일하게 10㎍/㎖의 농도에서 현저하게 감소된 지방 세포 분화능을 확인 할 수 있었다. 특히, 화합물 1(116-3) 시료는 저농도(1㎍/㎖) 에서도 다른 시료와 비교해 현저한 지방세포 분화 억제능을 나타내었다. 지방세포 분화과정에서 각 시료로부터 현저한 세포 독성은 관찰되지 않았다(도 8). 화합물 1은 3T3-L1 세포에 대한 효능 검증 결과, 이 세포에서도 매우 우수한 지방세포 분화 억제능을 나타내었다 (도 9).
시험예 3: 신규 화합물에 대한 간-X-수용체(LXR) 길항효능 및 선택성 측정
트랜스펫션 검색에는 동물세포주 CV-1을 이용하였다. 세포는 5% 이산화탄소가 포함된 37℃ 세포 배양기에서 DMEM 배지에 배양되었다. 배지에는 10% 우태아혈청(FBS), 100 U/ml의 페니실린 그리고 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 포함되었다. 실험 첫날 CV-1 세포를 96 웰(well) 플레이트(plate)에 5,000 cells/well로 접종하였다. 둘째 날 접종된 세포에 GAL-hLXR을 발현하는 플라스미드(plasmid), 루시퍼라제 유전자를 발현하는 플라스미드 그리고 베타-갈락토시다제를 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션 시약인 Superfect(QIAGEN)를 이용해 트랜스펙션하였다. 16시간 후, 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹아있는 화학물1을 효능제인 TO901317(2.5 μM))과 함께 트랜스펙션된 세포에 농도별로 처리하였다. 음성대조군으로서는 디메틸설폭시드를 최종농도 1%가 되도록 처리하였고 양성대조군으로서는 TO901317을 최종농도 500 nM이 되도록 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 세포용해시약(lysis buffer)을 이용하여 세포를 용해하였고, 루미노미터(luminometer)에서 루시페린(luciferin)을 첨가하며 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 베타-갈락토시다제 활성은 ONPG 시약을 첨가한 후, 엘라이자 리더(ELISA reader)에서 측정되었다. 측정된 루시퍼라제 수치를 베타-갈락토시다제 활성수치로 보정하였다. 이 실험 결과 화합물 1은 LXRα 및 β에 대해 각각 IC50 값 18.7 및 20.4 nM을 나타내었다(도 10). 또한 다양한 핵수용체에 대한 선택성을 측정하기 위하여 동일한 방법으로 각종 핵수용체에 대한 활성을 측정하였다. 하지만 화합물 1은 다른 핵수용체에 대해서는 전혀 활성을 보이지 않았다(도 11). 또한 화합물 1은 Biacore 실험을 통하여 LXR 단백질에 직접 결합함을 입증하였다(도 12).
시험예 4: 신규 화합물에 대한 세포독성 측정
생쥐의 비장세포를 정상세포에서의 독성을 측정하는데 이용하였다. 생쥐의 비장세포는 다음과 같이 준비되었다. 5~6주령의 생쥐에서 비장을 취하여 곱게 간 후, 100 ㎛의 구멍크기를 갖는 망을 통해 부유된 비장세포만을 걸러내었다. 비장세포와 섞여있는 적혈구는 적혈구 용해시약을 이용해 용해시킨 후, 세포를 원심분리하여 침전시켜 씻는 과정을 통해 제거하였다. 준비된 비장 세포는 5 x 105 cells/well의 농도로 96 웰(well) 플레이트(plate)에 접종되었다. 이때 독성측정을 하고자 하는 화학식 1의 화합물은 농도별로 분리된 비장세포에 처리되었다. 다음 날 16~18시간 동안 배양된 세포에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 시약(Promega)을 처리한 후, 10분 후에 루미노미터(luminometer)에서 세포의 생존율을 측정하였다. 화합물 1은 마우스 비장세포에 대해 세포독성 IC50 값은 63μM을 나타내어 LXR에 대한 길항농도에 비해 1,000배이상 높은 값을 보임으로서 정상세포에 대한 세포독성은 거의 없는 것으로 나타났다(도 13).
시험예 5: 신규 화합물에 대한 간세포에서의 유전자 발현 기능 확인
개발된 간-X-수용체 길항제의 효능을 확인하기 위해 생쥐 및 인간의 간세포에서 유전자발현 조절 기능을 확인하였다. 본 실험에는 생쥐의 간세포인 AML12 세포와 인간 간세포인 HepG2세포가 사용되었다. AML12 세포는 5% 이산화탄소가 포함된 37℃ 세포 배양기에서 DMEM 배지에 배양되었다. 배지에는 10% 우태아혈청(FBS), 100 U/ml의 페니실린 그리고 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 포함되었다. 실험 첫날 AML12 세포를 6 웰(well) 플레이트(plate)에 접종하였다. 둘째 날 80% 정도 자란 세포의 배지를 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환한 후, TO901317과 개발된 간-X-수용체 길항제를 처리군당 3개의 well에 처리하였다. 음성대조군으로는 디메틸설폭시드를 최종농도 0.2%가 되도록 처리하였고 양성대조군으로는 TO901317을 최종농도 500 nM이 되도록 처리하였다. 길항제의 효능을 알기위해 개발된 화합물1을 1 μM의 농도로 단독처리하거나 500 nM의 TO901317과 함께 처리하였다. 18시간 동안 배양한 후 간세포의 전체 RNA를 RNeasy total RNA extraction kit(QIAGEN)을 이용해 추출하였다. 추출된 RNA는 정량하여 cDNA 합성에 각 샘플 당 1 μg씩 사용하였다. cDNA의 합성에는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche)를 이용하였다. 합성된 간세포의 cDNA는 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자 분석이 진행되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응을 위해 합성된 cDNA를 ACC1 또는 Actin 유전자에 선택적인 프라이머와 QuantiTech Master Mix(QIAGEN)를 섞었다. 중합효소 연쇄반응은 95도 10초, 60도 15초, 그리고 72도 20초의 반응을 45번 반복하여 진행하였다. 모든 cDNA 샘플은 triplicate로 반응을 진행하였다. 각 유전자의 처리군당 발현양의 비교를 위해 각 샘플당 Ct값을 실시간 중합효소 연쇄반응 분석 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 각 처리군당 Ct값은 음성대조군의 Ct값과 비교되었고 유전자 발현양의 차이가 계산되었다. 각 처리군당 관심 유전자의 발현양의 차이는 GADPH 유전자 발현양의 차이로 보정되었다. 이 실험 결과, 화합물 1은 지방간 발병의 원인이 되는 지방산 생합성 유전자 SREBP1c, ACC 및 FAS의 발현을 매우 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 14).
시험예 6: 신규 화합물에 대한 실험동물 모델에서 지방간 억제 효능 측정
본 발명에서 개발된 화합물 1의 지방간 억제 효능을 검증하기 위해 C57BL/6 배경의 생쥐에서 실험이 수행되었다. 10주령의 C57BL/6 생쥐를 일반 사료를 먹이면서, 지방간을 발생시키는 T0901317 물질을 투여하여 지방간 모델을 구축하였다. 화합물 1에 의한 지방간 억제 효능은 이 화합물을 경구 투여하여 관찰하였다. 음성대조군으로는 약물전달체인 0.75% 카르복시메틸셀룰로오스만을 먹인 생쥐가 사용되었고, 양성대조군으로는 T0901317 물질만을 먹인 생쥐가 사용되었다. 또한 C57BL/6 생쥐의 간의 유전자 발현을 분석하기 위해, 음성대조군, 양성대조군 및 처리군의 생쥐의 간을 적출하여 Trizol을 이용하여 RNA를 얻었다. 얻어진 RNA는 흡광분광계(Nanodrop)을 이용하여 정량화되었고, 각 그룹간의 동일량의 RNA로부터 oligo dT와 reverse transcriptase를 이용한 RT-PCR 방법을 통해서 cDNA가 얻어졌다. 그룹간의 mRNA 변화를 분석하기 위해 얻어진 cDNA를 template로 하고 지방합성과 간으로 지방 유입에 관련된 유전자(transporter)의 primer를 이용하는 실시간 중합효소 연쇄반응이 수행되었다. 이 실험 결과, 화합물 1은 지방간이 유도된 마우스에 투여시 처리군과 대조군 사이에 체중의 차이는 없었으며, 실험동물모델에서도 매우 우수한 지방간 억제 효능을 나타내었다(도 15 및 16). 또한 유전자 발현을 분석한 결과, 지방간 발병의 원인이 되는 지방산 생합성 유전자와 간으로 지방을 이송하는 트랜스포터의 유전자 발현을 매우 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 17). 따라서 본 발명의 화합물 및 이들 유도체는 알콜성 지방간, 비알콜성 지방간, 바이러스 감염에 의한 지방간의 치료에 매우 획기적인 역할을 할 것으로 기대된다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2009006357-appb-I000016
    상기 식에서 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, NHR2, OR2, SR2, SeR2 또는 TeR2이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴, C4~C20의 헤테로아릴 또는
    Figure PCTKR2009006357-appb-I000017
    중에서 선택되며, 상기 Y는 O, S 또는 NR4이고, Z는 단순결합, NH, O, S, Se 또는 Te이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐, C3~C8의 시클로알킬, C6~C20의 아릴 또는 C4~C20의 헤테로아릴 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, NHR2, OR2, SR2, SeR2 또는 TeR2이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐 또는
    Figure PCTKR2009006357-appb-I000018
    중에서 선택되며, 상기 Y는 O, S 또는 NR4이고, Z는 단순결합, NH, O 또는 S이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐 또는 C2~C8의 알키닐 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성되는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 W는 CO 또는 CHOR1이고, X는 N3, OR2 또는 SR2 이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐, C2~C8의 알키닐 또는
    Figure PCTKR2009006357-appb-I000019
    중에서 선택되며, 상기 Y는 O 또는 S이고, Z는 단순결합이고, R3는 수소, C1~C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C2~C8의 알케닐 또는 C2~C8의 알키닐 중에서 선택되며, M과 N은 각각 수소, OH, 또는 무존재이고, 이 때 M 또는 N에 연결된 탄소는 다른 탄소들과 단일결합 또는 이중 결합을 형성하며, 각 탄소에서 이중결합은 하나 이하로 형성되는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이,
    Figure PCTKR2009006357-appb-I000020
    Figure PCTKR2009006357-appb-I000021
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염.
  5. (a)해면동물 Phorbas sp.를 잘라서 건조시킨 후, C1~C4의 알코올로 추출하는 단계;
    (b)상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 물과 메틸렌클로라이드를 사용하여 분배시킨 후, 유기층의 용매를 제거하고, 다시 노르말 헥산과, 메탄올 및 물의 혼합용액을 사용하여 분배시키는 단계; 및
    (c)상기 (b)단계에서 얻은 메탄올 분액층의 용매를 제거한 후, 고정상으로서 실리카를 사용하고, 용리액으로서 용리액 총 중량 대비 20중량% 이하의 물을 포함하거나 포함하지 않는 메탄올 용액을 사용하여 크로마토크래피를 실시하여 분액을 얻는 단계를 포함하는 청구항 1 의 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 (a)단계에 있어서, 건조는 동결건조 방식을 사용하며, 상기 C1~C4의 알코올로는 메탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 (b)단계에 있어서, 상기 메탄올과 물의 혼합용액은 용액 총 중량에 대하여 메탄올 60~90중량%와 물 10~40중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 (c)단계에 있어서, 용리액으로서 총 중량 대비 20중량% 이하의 물을 포함하거나 포함하지 않는 메탄올 용액을 사용하기 전에, 그 보다 극성이 높은 물과 메탄올의 혼합용액을 용리액으로 사용하여, 높은 극성을 갖는 용리액을 시작으로 낮은 극성을 갖는 용리액 순으로 1회 이상 크로마토그래피를 실시하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 제조방법은 (d)상기 (c)단계에서 얻은 분액을 정제하는 단계를 더 포함하며, 상기 정제는 고성능 액상 크로마토크래피(HPLC)에 의하여 실시하며, 용리액으로는 용리액 총 중량에 대하여 아세토나이트릴(ACN) 50~80중량%와 물 20~50중량%의 혼합액을 사용하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  10. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 청구항 1의 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 약제학적 조성물.
  11. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 청구항 1의 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간 치료용 약제학적 조성물.
  12. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 청구항 1의 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약제학적 조성물.
  13. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 청구항 1의 화학식 1의 화합물, 그의 입체이성질체, 그의 거울상이성질체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 간-X-수용체(LXR) 길항용 약제학적 조성물.
PCT/KR2009/006357 2008-10-31 2009-10-30 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물 WO2010050783A2 (ko)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200980143890.9A CN102203099B (zh) 2008-10-31 2009-10-30 一种具有手性螺环碳架结构的新化合物及其制备方法以及包含该化合物的药物组合物
JP2011534397A JP2012507509A (ja) 2008-10-31 2009-10-30 スピロキラルの炭素骨格を有する新規化合物、その製造方法及びそれを含む薬剤学的組成物
BRPI0920764A BRPI0920764A2 (pt) 2008-10-31 2009-10-30 composto com estrutura de carbono spiro quiral, método de preparação do mesmo, e composição farmacêutica contendo o mesmo
EP09823863.7A EP2363400B1 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Novel compound with spiro chiral carbon backbone, preparation method thereof, and pharmaceutical composition containing the same
US13/126,979 US8703813B2 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Compound with spiro chiral carbon backbone, preparation method thereof, and pharmaceutical composition containing the same
ES09823863T ES2423196T3 (es) 2008-10-31 2009-10-30 Nuevo compuesto con un entramado de carbonos quiral y espiro, método para la preparación del mismo y composición farmacéutica que lo contiene
RU2011121877/04A RU2492173C2 (ru) 2008-10-31 2009-10-30 Новые соединения со спирохиральной углеродной основой, способы их получения и фармацевтические композиции, содержащие такие соединения
CA2742364A CA2742364A1 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Novel compound with spiro chiral carbon backbone, preparation method thereof, and pharmaceutical composition containing the same
AU2009310544A AU2009310544A1 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Novel compound with spiro chiral carbon backbone, preparation method thereof, and pharmaceutical composition containing the same

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20080107821 2008-10-31
KR10-2008-0107821 2008-10-31
KR1020090104124A KR101149878B1 (ko) 2008-10-31 2009-10-30 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물
KR10-2009-0104124 2009-10-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2010050783A2 true WO2010050783A2 (ko) 2010-05-06
WO2010050783A3 WO2010050783A3 (ko) 2010-09-10

Family

ID=42275585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2009/006357 WO2010050783A2 (ko) 2008-10-31 2009-10-30 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8703813B2 (ko)
EP (1) EP2363400B1 (ko)
JP (1) JP2012507509A (ko)
KR (1) KR101149878B1 (ko)
CN (1) CN102203099B (ko)
AU (1) AU2009310544A1 (ko)
BR (1) BRPI0920764A2 (ko)
CA (1) CA2742364A1 (ko)
ES (1) ES2423196T3 (ko)
RU (1) RU2492173C2 (ko)
WO (1) WO2010050783A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2615094A4 (en) * 2010-09-07 2013-09-18 Snu R&Db Foundation SESTERTERPEN COMPOUNDS AND THEIR USE
KR101647507B1 (ko) 2014-10-20 2016-08-10 건국대학교 글로컬산학협력단 정전용량 기반의 혈관삽입형 바이오센서를 이용한 심혈관 질환 진단 데이터 획득 시스템 및 방법
CN104873499B (zh) * 2015-06-11 2017-10-17 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种上调Runx2 转录活性的化合物在防治骨质疏松中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5328929A (en) * 1993-07-02 1994-07-12 Arizona Board Of Regents Isolation and structure of spongistatin 2, spongistatin 3, spongistatin 4 and spongistatin 6
JP3331028B2 (ja) * 1993-11-16 2002-10-07 第一製薬株式会社 スピロ化合物及びその製法
CA2391382A1 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Parker Hughes Institute Phorboxazole derivatives for treating cancer
JP2005035895A (ja) * 2003-07-15 2005-02-10 Institute Of Physical & Chemical Research 高カルシウム血症および骨疾患治療剤
US7485631B2 (en) * 2005-04-21 2009-02-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Phorboxazole compounds and methods of their preparation
JP3988833B2 (ja) * 2006-12-01 2007-10-10 日東電工株式会社 新規セスキテルペン系化合物、その製造方法及び組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None
See also references of EP2363400A4

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009310544A1 (en) 2010-05-06
KR20100048934A (ko) 2010-05-11
CA2742364A1 (en) 2010-05-06
BRPI0920764A2 (pt) 2015-12-22
WO2010050783A3 (ko) 2010-09-10
ES2423196T3 (es) 2013-09-18
CN102203099B (zh) 2014-03-12
JP2012507509A (ja) 2012-03-29
CN102203099A (zh) 2011-09-28
RU2492173C2 (ru) 2013-09-10
RU2011121877A (ru) 2012-12-10
EP2363400A2 (en) 2011-09-07
US20110218240A1 (en) 2011-09-08
EP2363400A4 (en) 2012-04-18
KR101149878B1 (ko) 2012-05-24
EP2363400B1 (en) 2013-06-12
US8703813B2 (en) 2014-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI687423B (zh) 雜環衍生物及其用途（二）
HRP20110437A2 (hr) Derivati rifamicina
US8008346B2 (en) Chemotherapeutic agents for inhibition of protein translation
WO2010050783A2 (ko) 스파이로키랄 탄소 골격을 갖는 신규한 화합물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물
EP1301516A1 (en) Modulators of protein tyrosine phosphatases (ptpases)
CN110746421B (zh) 吲哚单萜类化合物的提取方法及应用
WO2009148287A2 (ko) 오미자로부터 추출한 신규한 α-ISO-CUBEBENE 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 항염증 질환의 예방 및 치료용 조성물
CN106397408B (zh) 5-甲基-2(1h)吡啶酮衍生物及其制备方法和用途
US8933100B2 (en) Paroxetine derivative
WO2019059555A1 (ko) 트리메톡시 페닐 화합물 및 그를 포함하는 발모 또는 육모 촉진용 조성물
EP0947514B1 (en) Novel phenanethridinium derivatives
WO2014175650A1 (ko) 백합나무 수피에서 만성 골수성 백혈병 치료 성분을 추출 분리하는 방법
WO2011074881A2 (ko) 알레르기 질환 감수성 유전자 발현 억제 물질
CZ282473B6 (cs) Bis(fenyl)ethanové deriváty, způsob jejich přípravy a farmaceutická kompozice tyto deriváty obsahující
EP1761262A1 (en) Marine compounds with calcium channel blocking properties for the treatment of cognitive or neurodegenerative diseases
WO2021107730A1 (ko) 화학요법제로써의 합성-바이칼레인-유도체
JP4844955B2 (ja) 抗腫瘍剤
US6291515B1 (en) Use of efomycins
JP2000007673A (ja) 抗マラリア活性を有する新規化合物又はその塩
WO2019039755A2 (ko) 트리메틸 사이클로헥센 화합물을 유효 성분으로 포함하는 발모 또는 육모 촉진용 조성물
WO2016047823A1 (ko) 장구채 추출물 또는 이로부터 분리된 보르네시톨을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물
JPH0366690A (ja) フロ〔３，４―ｃ〕ピリジン誘導体の不斉合成製造法
JP2001527076A (ja) 海綿動物から単離されるアスマリンａ及びｂを含む細胞毒性アルカロイド誘導体
JP2006219456A (ja) 抗バベシア剤および新規ベンズオキサゾリノン誘導体
KR20060087766A (ko) 해면동물로부터 스칼라레인 유사체, 그의 회수방법 및이를 함유하는 의약

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980143890.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09823863

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 848/MUMNP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13126979

Country of ref document: US

Ref document number: 2742364

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011534397

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009310544

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009823863

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009310544

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20091030

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011121877

Country of ref document: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0920764

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110429