WO2014175650A1 - 백합나무 수피에서 만성 골수성 백혈병 치료 성분을 추출 분리하는 방법 - Google Patents

백합나무 수피에서 만성 골수성 백혈병 치료 성분을 추출 분리하는 방법 Download PDF

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황일경
김영선
주미정
강수진
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Definitions

  • the present invention provides a method for extracting and separating components useful for the treatment of chronic myelogenous leukemia, comprising epi-Tulipinolide and costunolide extracted from the bark of a lily tree.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for chronic myelogenous leukemia, which contains epi-tulipinide and costunolide obtained as main components.
  • Lily tree (Liriodendron tulipifera L., Yellow-poplar) is a deciduous broad-leaved tree belonging to the Magnoliaceae, and it has been reported that the extract of the bark of the lily contains various compounds such as alkaloids, sesquiterpins and lignans.
  • Lily tree extracts include sesquiterpine lactones such as costuolides, tulipinolides, epi-tulipinolides, epi-tulipdienolides, and gamma-liriodenolides. have.
  • the parthenolides have been found to have anti-inflammatory or anti-cancer effects through the nuclear transcription factors NF- ⁇ B, p21 and cyclin D1, and especially LC-, a synthetic derivative of patenolide and patenolide.
  • 1 dimethylamino-parthenolide
  • Chronic myeloid leukemia is a myeloproliferative disease in which myeloid leukocytes in the bone marrow proliferate uncontrolled and accumulate in the blood.
  • the types of leukemia are divided into acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, and chronic lymphocytic leukemia.
  • Chronic myeloid leukemia which accounts for about 15-20% of adult leukemia, is caused by the Philadelphia chromosome (Ph) and is caused by excessive proliferation of abnormal cells in the bone marrow.
  • the Philadelphia chromosome is a BCR-ABL fusion gene that is generated by translocation of the ABL gene of chromosome 9 and the BCR gene of chromosome 22, respectively.
  • This abnormal fusion gene is involved in the synthesis of carcinogenic protein P210 by expressing a fusion protein with tyrosine kinase activity.
  • the synthesized P210 protein inhibits cell death of myeloid progenitor cells and eventually leads to abnormal proliferation of bone marrow proliferation. It causes a temper.
  • Imatinib (trade name: Gleevec) is a tyrosine kinase inhibitor of first-generation BCR-ABL and has been used for a long time as a primary treatment for myeloid leukemia.
  • problems such as the development of patients resistant to imatinib. come.
  • Epi-tulipinoid the main component of the lily extract, has shown effective effects on Imatinib, the first generation of chronic myelogenous leukemia (CML), and chronic myelogenous leukemia resistant to the second generation.
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • the inventors of the present invention have confirmed that this may be an effective and excellent third generation therapeutic for chronic myelogenous leukemia (CML).
  • the present inventors also attempted to extract and purify the pharmacologically active ingredient effective against chronic myelogenous leukemia, such as epi-tulipinoid and costunolide, from the bark of the bark.
  • chronic myelogenous leukemia such as epi-tulipinoid and costunolide
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • the present inventors showed resistance to chronic myeloid leukemia (CML) first generation therapeutic agents imatinib and second generation therapeutic agents through various extracting solvents through epi-tulipinide, which is the main component of 3-5 years old lily extract or lily extract.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • epi-tulipinide which is the main component of 3-5 years old lily extract or lily extract.
  • the object of the present invention is 1) adding 1 to 2 parts by weight of ethyl acetate as an extraction solvent with respect to 1 part by weight of shredded bark of bark and extracting 0.5 to 10 parts by weight of butanol to the ethyl acetate layer and butanol layer. Removing the butanol layer after layer separation and concentrating under reduced pressure to obtain a crude extract; And 2) adding C1 to C3 lower alcohol aqueous solution and n-hexane to the obtained crude extract, removing the oil-soluble component and the water-insoluble substance dissolved in the n-hexane layer, and then obtaining and separating the lower alcohol aqueous solution layer to epi-tulipi.
  • Separation and purification of the nolide and costunolide with high purity Separation method for producing chronic myelogenous leukemia therapeutic agent comprising epi-tulipinoid and costunolide from the bark of the bark consisting of Chronic myelogenous leukemia therapeutic isolates contain 20-50% by weight of epi-tulipinlide and 5-20% by weight of costunolide and the extraction is performed by cold, percolation, ultrasound, warming or reflux.
  • a component of the treatment for chronic myelogenous leukemia, comprising epi-tulipinoid and costunoid as active ingredients To provide a method of manufacturing the same.
  • step 2 water is added to the lower alcohol aqueous solution layer obtained in step 2) to prepare a lower concentration aqueous alcohol solution, and further comprising the step of separating and purifying the dichloromethane layer by adding dichloromethane.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing chronic myelogenous leukemia, which comprises the epi-tulipinoid and costunolide as an active ingredient and includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the effects of the present invention are active from lily bark to provide an effective treatment for chronic myeloid leukemia caused by the mutant T315I modified gene of imatinib, a first-generation treatment of chronic myelogenous leukemia (CML), and BCR-ABL, which is resistant to second-generation treatments. It is to provide a method for the isolation of a chronic myelogenous leukemia therapeutic agent containing epi-tulipinlide and costunolide as a component.
  • Figure 1 shows the liquid chromatograph of the lily extract extracted from Preparation Example 1 confirming the presence of epi-tulipinlide and costunolide.
  • Figure 2 shows the liquid chromatograph of the lily extract extracted from Preparation Comparative Example 1 to confirm the presence of epi-tulipinlide and costunolide.
  • FIG. 3 shows the structure of epi-tulipinolide separated from the lily extract prepared in Preparation Example 1 by liquid chromatography through 1H NMR spectrum.
  • the present invention provides a method for the isolation and preparation of a chronic myelogenous leukemia therapeutic agent showing effective suppression of chronic myelogenous leukemia by the mutant 'T315I' variant gene of 'BCR-ABL', which is a cause of chronic myeloid leukemia.
  • the present invention is to be separated and purified after extracting the 3-5 years old lily bark using an ethyl acetate solvent, the extract contains epi-tulipinolide and costunolide representative representative components. Accordingly, the present invention provides a method for the isolation and preparation of a therapeutic agent for chronic myelogenous leukemia containing epi-tulipinlide and costunolide.
  • the present invention is a mutant T315I modified gene of the BCR / ABL mutant BCR / ABL that the active ingredient, such as the lily extract or epi-tulipinlide resistant to imatinib (brand name: Gleevec) and the second generation of chronic myelogenous leukemia It shows effective inhibition against chronic myelogenous leukemia by the lily extract or epi-tulipinide substance suggests the possibility of use as an effective therapeutic agent as the third generation of chronic myelogenous leukemia.
  • the active ingredient such as the lily extract or epi-tulipinlide resistant to imatinib (brand name: Gleevec)
  • imatinib brand name: Gleevec
  • the present invention uses ethyl acetate as an extraction solvent to provide a method for the isolation and preparation of a therapeutic agent for chronic myelogenous leukemia containing epi-tulipinoid and costunolide having pharmacological activity effective for chronic myelogenous leukemia.
  • the chronic myelogenous leukemia therapeutic agent contains epi-tulipinide and costunolide as active ingredients.
  • the bark extract of the present invention has various pharmacological components, and representative indicator components include epi-tulipinoid and costunolide.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing chronic myelogenous leukemia, which contains epi-tulipinoid and costunolide, which are one of the components of the bark extract, as active ingredients.
  • the present invention is (1) extracting the bark of the lily of the valley using ethyl acetate as an extraction solvent, and adding butanol to remove the butanol soluble component to prepare a crude extract (step 1), (2) (1) Purifying the crude extract obtained in the step provides a method for the separation and preparation of a chronic myelogenous leukemia therapeutic agent comprising a separation and purification step (step 2) to produce a high-purity extract with a high content of the indicator components.
  • step 1 the bark of the lily tree is cut and neutralized, followed by primary extraction with an ethyl acetate extract solvent, butanol is added to the extract to separate the ethyl acetate layer and the butanol layer, and the butanol layer is removed and concentrated under reduced pressure. It is a step of obtaining.
  • step 2 after adding C1 to C3 lower alcohol aqueous solution and n-hexane to the crude extract obtained in step 1, removing the oil-soluble component and the water-insoluble substance dissolved in the n-hexane layer, the lower alcohol aqueous solution layer was obtained and separated. It is a step of separating and purifying the epi-tulipinlide and costunolide of the present invention with high purity.
  • water is added to the lower alcohol aqueous solution layer to make a lower concentration aqueous alcohol solution and fractionated with ethyl acetate to separate and refine the epi-tulipinoid and costunolide dissolved in the ethyl acetate layer with higher purity.
  • water is added to the lower alcohol aqueous solution layer to make a lower concentration aqueous alcohol solution and fractionated with ethyl acetate to separate and refine the epi-tulipinoid and costunolide dissolved in the ethyl acetate layer with higher purity.
  • the lily tree used in the present invention was collected from the perennial forest located in Gangjin-gun, Jeollanam-do, Korea. After cutting or demineralizing the collected wood, an extractant of 10-20 times the weight of the sample was added thereto, and the extract obtained by extracting at room temperature or 50 ° C. for 24 to 96 hours was concentrated under reduced pressure and dried to obtain the extract of the present invention.
  • the present invention is a method for efficiently extracting or purifying epi-tulipinolides and costunolides of the following structures which are index components of the bark extract of the lily tree.
  • epi-tulipinlide and costunolide were detected at about 31 minutes and about 36 minutes, respectively.
  • the presence of epi-tulipinlide and costunolide is required to purchase the standard of epi-tulipinolide and costunolide and inject the two samples into high-performance liquid chromatography and then outflow. The retention time was confirmed to coincide with each other.
  • the molecular weight of each component was investigated for the extract of the bark of the lily of the valley.
  • the molecular weight of epi-tulipinlide was 290, and the molecular weight of costunolide was found to be 232.
  • epi-tulipinolide was also confirmed by NMR spectroscopy.
  • the presence of costunolide was also confirmed by comparison with HPLC by purchasing a costunolide standard.
  • the instrument used for LC-MS analysis was performed using Waters' LC-MS analysis instrument, and the analysis conditions were reverse phase column. Sample concentration capacity was analyzed at 2 microliters, flow rate 0.3mL / min, PDA ultraviolet wavelength was measured at 200 ⁇ 500nm. Detailed HPLC mobile phase gradient conditions are shown in Table 2.
  • the lily bark extract according to the production method of the present invention contains 40-50% by weight of epi-tulipinoid and 10-20% by weight of costunolide, and the extraction method is cold, percolation, ultrasonic, It is also possible to extract by the method of warming or reflux.
  • Comparative Examples 1 to 3 the lily bark extract prepared according to the preparation method of the present invention showed an epi-tulipinoid content of 44 to 47% by weight.
  • the tunolide content was 12 to 16% by weight.
  • the lily bark extract prepared according to the Comparative Comparative Example method showed an amount of epi-tulipinoid 8 to 23% by weight, and 2 to 6% by weight of costunoid.

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Abstract

본 발명은 1) 세절된 백합나무 수피에 에틸아세테이트를 첨가하여 1차 추출하고, 추출액에 부탄올을 가하여 에틸아세테이트층과 부탄올층을 층분리 시킨 후 부탄올층을 제거하고 감압 농축시켜 조 추출물을 수득하는 단계; 및 2) 수득된 조 추출물에 C1~C3 저급 알코올 수용액 및 n-헥산을 가한 후 n-헥산층에 용해된 유지성분과 수불용성 물질을 제거한 후, 저급 알코올 수용액층을 수득 분리하여 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 고순도로 분리 정제하는 단계;로 이루어진 만성 골수성 백혈병 원인 유전자인 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이로 알려진 T315I의 성장을 효과적으로 억제하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공하는 것이다.

Description

백합나무 수피에서 만성 골수성 백혈병 치료 성분을 추출 분리하는 방법
본 발명은 백합나무 수피에서 추출된 에피-튤리피놀라이드(epi-Tulipinolide)와 코스튜놀라이드(costunolide)를 유효 성분으로 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료에 유용한 성분을 추출 분리하는 방법 및 그 방법에 따라 수득된 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 주성분으로 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료제에 관한 것이다.
백합나무 (Liriodendron tulipifera L., Yellow-poplar)는 목련과 (Magnoliaceae)에 속하는 낙엽 활엽 교목으로서, 백합나무 수피 추출물에는 알칼로이드, 세스퀴터핀 및 리그난계 등의 다양한 화합물이 함유되었음이 보고 되어있다.
백합나무 추출물에는 코스튜놀라이드, 튤리피놀라이드, 에피-튤리피놀라이드, 에피-튤립디에놀라이드, 및 감마-리리오데놀라이드(gamma-liriodenolide)등과 같은 세스퀴터핀 락톤류가 포함되어 있다.
이들 세스퀴터핀 락톤 가운데 파테놀라이드는 핵 전사인자 NF-κB, p21 및 cyclin D1 등을 매개하여 항염증 또는 항암 효과를 나타내는 물질로 밝혀져 왔으며 특히 파테놀라이드와 파테놀라이드의 합성 유도체인 LC-1 (dimethylamino-parthenolide)은 핵 전사인자 NF-κB 활동 억제를 통하여 세포예정사를 유도하여 급성 골수성 백혈병에 항암 효과를 나타내는 것으로 보고되었다.
만성 골수성 백혈병은 골수 내에 골수성 백혈세포들이 통제되지 않고 증식하여 혈액 내 축척되는 골수증식성 질환이다. 백혈병의 종류는 크게 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병으로 나뉜다.
성인 백혈병의 약 15~20%를 차지하고 있는 만성 골수성 백혈병의 경우, 필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome; Ph)에 의해 발병되며 골수 내 비정상적인 세포가 과도하게 증식하여 생기는 질환이다. 필라델피아 염색체는 9번 염색체의 ABL 유전자와 22번 염색체의 BCR 유전자가 각각 절단된 후 서로 전위가 되어 생성되는 BCR-ABL 융합유전자이다.
이 비정상적인 융합유전자는 타이로신 카이네이즈 활성을 갖는 융합단백질을 발현시킴으로써 발암단백질 P210 합성에 관여하며, 합성된 P210단백질은 골수구 전구세포들의 세포예정사를 억제하여 결국 이들 세포의 비정상적인 증식에 이르게하여 골수증식성질환을 초래한다.
이매티닙(Imatinib)(상품명 : 글리벡)은 1세대 BCR-ABL의 타이로신 카이네이즈 억제제로 골수성 백혈병의 1차 치료제로 오랫동안 각광을 받고 사용되었으나, 이매티닙에 내성을 갖는 환자들이 생기는 등의 문제가 발생되어 왔다.
다행히 다사티닙(Dasatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 보수티닙(Bosutinib) 등의 이매티닙 내성을 극복한 2세대 치료제들이 개발되어 보다 효과적이고 다양한 약물 치료제에 기대를 갖게 되었으나, 최근 BCR-ABL 의 돌연변이 T315I 변형유전자가 발생함에 따라 이들 2세대 약물도 더 이상의 치료 효과를 보지 못하게 되어, 1세대 치료제와 2세대 치료제에 저항 또는 내성의 원인이 되는 돌연변이 ‘T315I’ 변형 유전자 억제에 효과적인 3세대 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
이에 대해 백합나무 추출물의 주성분인 에피-튤리피놀라이드가 만성 골수성 백혈병 (CML) 1세대 치료제인 이매티닙(Imatinib)과 2세대 치료제에 저항성을 지닌 만성 골수성 백혈병에 효과적인 치료 효과를 나타냄으로서 이들 물질이 만성 골수성 백혈병 (CML)에 효과적이고 우수한 3세대 치료제가 될 수 있음을 본 발명자들의 최근 연구에서 확인하였다.
또한 본 발명자들은 이를 위해 백합나무 수피로부터 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드와 같은 만성 골수성 백혈병에 효과적인 약리활성 성분의 추출 분리 정제를 시도하였다.
한편 위장질환 치료에 유효한 성분으로 백합나무 수피로부터 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 추출하는 방법은 본 출원인에 의해 대한민국 특허등록 제10-1353306호 '백합나무 수피에서 위장 질환 치료 성분을 추출하는 방법'으로 등록되어 있다.
따라서 본 발명자들은 다양한 추출 용매를 통하여 3~5년생 백합나무 수피 추출물 또는 백합나무 수피 추출물의 주성분인 에피-튤리피놀라이드를 통해 만성 골수성 백혈병 (CML) 1세대 치료제인 이매티닙과 2세대 치료제에 저항성을 보이는 BCR-ABL 의 돌연변이 T315I 변형 유전자에 의한 만성 골수성 백혈병에 효과적인 치료제 개발을 위해 백합나무 수피로부터 활성성분으로 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명자들은 다양한 추출 용매를 통하여 3~5년생 백합나무 추출물 또는 백합나무 추출물의 주성분인 에피-튤리피놀라이드를 통해 만성 골수성 백혈병 (CML) 1세대 치료제인 이매티닙과 2세대 치료제에 저항성을 보이는 BCR-ABL 의 돌연변이 T315I 변형 유전자에 의한 만성 골수성 백혈병에 효과적인 치료제 개발을 위해 백합나무 수피로부터 활성성분으로 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 1) 세절된 백합나무 수피 1 중량부에 대해 추출 용매로서 에틸아세테이트 2~20 중량부를 첨가하여 1차 추출하고, 추출액에 부탄올 0.5~10 중량부를 가하여 에틸아세테이트층과 부탄올층을 층분리 시킨 후 부탄올층을 제거하고 감압 농축시켜 조 추출물을 수득하는 단계; 및 2) 수득된 조 추출물에 C1~C3 저급 알코올 수용액 및 n-헥산을 가한 후 n-헥산층에 용해된 유지성분과 수불용성 물질을 제거한 후, 저급 알코올 수용액층을 수득 분리하여 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 고순도로 분리 정제하는 단계;로 이루어진 백합나무 수피로부터 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 활성성분으로 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법에 있어서, 상기 만성 골수성 백혈병 치료제 분리물은 20~50 중량% 함량의 에피-튤리피놀라이드와 5~20 중량% 함량의 코스튜놀라이드를 함유하고 상기 추출은 냉침, 퍼콜레이션, 초음파, 온침 또는 환류의 방법으로 추출하는 것을 특징으로 하는 백합나무 수피로부터 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 활성성분으로 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공하는 것이다.
이때 상기 단계 2)에서 수득된 저급 알코올 수용액층에 다시 물을 가하여 저농도 저급 알코올 수용액을 제조한 후, 디클로로메탄을 첨가하여 디클로로메탄 층을 분리 건조 정제시키는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법에 따라 수득된 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 주성분으로 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 유효성분으로 상기 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 효과는 만성 골수성 백혈병 (CML) 1세대 치료제인 이매티닙과 2세대 치료제에 저항성을 보이는 BCR-ABL 의 돌연변이 T315I 변형 유전자에 의한 만성 골수성 백혈병에 효과적인 치료제를 제공하기 위해 백합나무 수피로부터 활성성분으로 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 제조실시예 1에서 수득된 백합나무 추출 분리물의 액체 크로마토그래프를 나타낸 것으로 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드의 존재를 확인한 것이다.
도 2는 제조비교예 1에서 수득된 백합나무 추출 분리물의 액체 크로마토그래프를 나타낸 것으로 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드의 존재를 확인한 것이다.
도 3은 제조실시예 1에서 제조된 백합나무 추출물에서 액체 크로마토그래프를 통하여 분리한 에피-튤리피놀라이드의 구조를 1H NMR 스펙트럼을 통하여 확인한 것이다.
본 발명은 만성 골수성 백혈병의 원인 유전자인 'BCR-ABL'의 돌연변이 'T315I' 변형유전자에 의한 만성 골수성 백혈병에 효과적인 억제를 보인 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 3~5년생 백합나무 수피를 에틸아세테이트 용매를 사용하여 추출한 후 분리 정제한 것으로서, 추출물에는 대표적인 지표 성분인 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유하는 것이다. 따라서 본 발명은 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유한 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백합나무 추출물 또는 에피-튤리피놀라이드와 같은 유효성분이 만성 골수성 백혈병 1세대 치료제인 이매티닙(상품명 : 글리벡)과 2세대 치료제에 저항성을 보이는 BCR/ABL의 돌연변이 T315I 변형 유전자에 의한 만성 골수성 백혈병에 효과적인 억제를 보여 상기 백합나무 추출물 또는 에피-튤리피놀라이드 물질이 만성 골수성 백혈병 3세대 약물로써 효과적인 치료제로 사용 가능성을 제시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 에틸아세테이트를 추출 용매로 사용하여 만성 골수성 백혈병에 효과적인 약리활성을 지닌 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드가 함유된 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 만성 골수성 백혈병 치료제 내에는 유효성분으로 에피-튤리피놀라이드, 코스튜놀라이드를 함유한다. 본 발명의 백합나무 수피 추출물에는 다양한 약리 성분이 있으며, 대표적인 지표 성분은 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드가 있다.
또한, 본 발명은 상기 백합나무 수피 추출물의 성분 중 하나인 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 유효성분으로 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 백합나무 수피를 추출 용매인 에틸아세테이트를 사용하여 1차 추출하고 부탄올을 가하여 부탄올 용해성 성분을 제거시켜 조 추출물을 제조하는 단계(단계 1), (2) 상기 (1) 단계에서 얻어진 조 추출물을 정제하여 지표성분들의 함량을 높인 고순도 추출물을 제조하는 분리 정제단계(단계 2)를 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1은 백합나무 수피를 세절~중말화 한 후 에틸아세테이트 추출용매로 1차 추출하고, 추출액에 부탄올을 가하여 에틸아세테이트층과 부탄올층을 층분리 시킨 후 부탄올층을 제거하고 감압 농축시켜 조 추출물을 수득하는 단계이다.
상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻어진 조 추출물에 C1~C3 저급 알코올 수용액 및 n-헥산을 가한 후 n-헥산 층에 용해된 유지성분과 수불용성 물질을 제거한 후, 저급 알코올 수용액 층을 수득 분리하여 본 발명의 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 고순도로 분리 정제하는 단계이다.
또한 필요시 상기 저급 알코올 수용액 층에 물을 가하여 저농도의 저급 알코올 수용액으로 만든 후 이를 에틸아세테이트로 분획시켜 에틸아세테이트 층에 용해된 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 더욱 고순도로 분리 정제할 수 있다.
본 발명에 사용된 백합나무는 대한민국 전라남도 강진군에 소재한 초당림에서 채취하였다. 채취한 나무를 세절 또는 중말화한 후 시료 중량의 10 내지 20배 분량의 추출용매를 가하여 실온 또는 50℃에서 24 내지 96시간 추출하여 얻은 추출액을 감압 농축, 건조하여 본 발명의 추출물을 얻었다.
본 발명은 백합나무 수피 추출물 중 지표성분인 하기 구조의 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 효율적으로 추출 또는 정제할 수 있는 제조방법 이다.
Figure PCTKR2014003540-appb-I000001
상기 제조된 백합나무 수피 추출물은 WATERS사의 Alliance e2695 system 고성능 액체 크로마토그래피법(HPLC)에 의하여 에피-튤리피놀라이드(체류시간 = ~31분)와 코스튜놀라이드(체류시간 = ~36분)의 존재를 확인하였고 함량을 측정하였다. 분석조건은 역상 컬럼 Kromasil C18 컬럼을 사용하여 시료 농도 5mg/mL로 자외선 파장 215nm에서 측정하였으며(유속: 1.0ml/min), 이동상으로는 물과 메탄올의 시간에 따른 하기 그래디언트 조건을 사용하였다(표 1).
표 1 HPLC 분석 이동상 그래디언트 조건
체류 시간 (분) 물 (%) 메탄올 (%)
0 98 2
10 50 50
60 0 100
70 0 100
80 98 2
상기 표 1과 같은 그래디언트 조건하에 분석한 결과, 주성분인 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드는 각각 약 31분과 약 36분에서 검출되었다. 여러 성분들 중 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 존재는 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 표준품을 구입하여서 고성능 액체 크로마토그래피에 두 시료를 주입하고 나서 유출할 때까지 요하는 체류 시간(retention time)이 서로 일치함으로 확인하였다.
에피-튤리피놀라이드의 입체화학은 비선광도(specific rotation)를 측정한 결과 문헌에서 보고된 에피-튤리피놀라이드의 값([α]D=+76)과 백합나무에서 추출 분리하여 측정된 에피-튤리피놀라이드의 실제 값([α]D=+74)이 일치하여 입체화학적으로 에피-튤리피놀라이드임이 확인되었다.
백합나무 수피 추출물을 LC-MS를 이용하여 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 비롯한 각 성분들의 분자량을 조사하였다. 에피-튤리피놀라이드 분자량은 290, 코스튜놀라이드의 분자량은 232로 확인하였다. 다른 성분 Ridentin(mw=264) 그리고 디아세틸리피페롤라이드(mw=264)로 추정되는 성분도 확인되었다.
또한 NMR 분광학적 분석법에 의해 에피-튤리피놀라이드의 구조 역시 확인하였다. 코스튜놀라이드의 존재 역시 코스튜놀라이드 표준품을 구입하여 HPLC로 비교 분석하여 존재를 확인하였다.
LC-MS 분석에 사용된 기기는 Waters사의 LC-MS 분석 기기를 사용하였고 분석 조건은 역상 컬럼을 사용하였다. 시료 농도 용량은 2 마이크로리터, 유속은 0.3mL/분으로 분석하였으며, PDA 자외선 파장은 200~500nm에서 측정하였다. 자세한 HPLC 이동상의 그래디언트 조건은 표 2와 같다.
표 2 LC-MS 그래디언트 조건
시간 (분) 물 (%) ACN (%)
0 85 15
10 30 70
60 0 100
70 0 100
이때 본 발명의 제조 방법에 따른 백합나무 수피 추출물은 에피-튤리피놀라이드 40~50 중량%와 코스튜놀라이드 10~20 중량%를 함유하고 있으며, 상기 추출 방법은 냉침, 퍼콜레이션, 초음파, 온침 또는 환류의 방법으로 추출하는 것도 가능하다.
(제조실시예 1) 에틸아세테이트 용매를 사용한 추출물의 제조
1. 용매 추출 공정
세절한 3~5년생 백합나무 수피 200g을 에틸아세테이트 2000ml로 상온에서 24시간 진탕배양하여 추출하고 추출여액을 감압 농축 여과시킨 후 에틸아세테이트 1차 추출액을 수득하고, 수득된 1차 추출액에 부탄올 500ml를 가하여 상온에서 2~4시간 추출시킨 후 부탄올층을 분리 제거시켜 부탄올에 용해된 성분을 제거시킨 후 감압 농축시켜 조 추출물 12.54g을 수득하였다.
2. 정제 공정
수득된 조 추출물 12.54g에 70% 에탄올 200ml에 용해시킨 후 n-헥산 200ml를 가하여 진탕 분획한 다음 70% 에탄올층을 수득하고 상기 에탄올층을 분리시켜 감압 농축 동결 건조시킨 후 추출물 2.75g을 얻었다. 추출물 중에 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 함량을 HPLC와 LC-MS를 통하여 정량 분석시켜 에피-튤리피놀라이드 함량 44.1중량%, 코스튜놀라이드 함량은 15.6 중량%임을 확인하였다.
(제조실시예 2) 에틸아세테이트 용매를 사용한 추출물의 제조
1. 용매 추출 공정
세절한 3~5년생 백합나무 수피 200g을 에틸아세테이트 2000ml로 상온에서 72시간 진탕배양하여 추출하고 추출여액을 감압 농축 여과시킨 후 에틸아세테이트 1차 추출액을 수득하고, 수득된 1차 추출액에 부탄올 500ml를 가하여 상온에서 2~4시간 추출시킨 후 부탄올층을 분리 제거시켜 부탄올에 용해된 성분을 제거시킨 후 감압 농축시켜 조 추출물 13.72g을 수득하였다.
2. 정제 공정
수득된 조 추출물 13.72g에 70% 에탄올 200ml에 용해시킨 후 n-헥산 200ml를 가하여 진탕 분획한 다음 70% 에탄올층을 수득하고 상기 에탄올층을 분리시켜 감압 농축 동결 건조시킨 후 추출물 2.98g을 얻었다. 추출물 중에 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 함량을 HPLC와 LC-MS를 통하여 정량 분석시켜 에피-튤리피놀라이드 함량 46.2중량%, 코스튜놀라이드 함량은 12.0중량%임을 확인하였다.
(제조실시예 3) 에틸아세테이트 용매를 사용한 추출물의 제조
1. 용매 추출 공정
세절한 3~5년생 백합나무 수피 200g을 망치로 분쇄시킨 후 에틸아세테이트 2000ml로 상온에서 96시간 진탕배양하여 추출하고 추출여액을 감압 농축 여과시킨 후 에틸아세테이트 1차 추출액을 수득하고, 수득된 1차 추출액에 부탄올 500ml를 가하여 상온에서 2~4시간 추출시킨 후 부탄올층을 분리 제거시켜 부탄올에 용해된 성분을 제거시킨 후 감압 농축시켜 조 추출물 25.71g을 수득하였다.
2. 정제 공정
수득된 조 추출물 25.71g에 70% 에탄올 200ml에 용해시킨 후 n-헥산 200ml를 가하여 진탕 분획한 다음 70% 에탄올층을 수득하고 상기 에탄올층을 분리시켜 감압 농축 동결 건조시킨 후 추출물 3.84g을 얻었다. 추출물 중에 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 함량을 HPLC와 LC-MS를 통하여 정량 분석시켜 에피-튤리피놀라이드 함량 47.0중량%, 코스튜놀라이드 함량은 15.4중량%임을 확인하였다.
(제조비교예 1) 클로로포름 용매를 사용한 추출물의 제조
1. 용매 추출 공정
세절한 3~5년생 백합나무 수피 200g을 망치로 분쇄시킨 후 클로로포름 2000ml로 상온에서 24시간 진탕배양하여 추출하고 추출여액을 감압 농축 여과시킨 후 에틸아세테이트 1차 추출액을 수득하고, 수득된 1차 추출액에 부탄올 500ml를 가하여 상온에서 2~4시간 추출시킨 후 부탄올층을 분리 제거시켜 부탄올에 용해된 성분을 제거시킨 후 감압 농축시켜 조 추출물 10.43g을 수득하였다.
2. 정제 공정
수득된 조 추출물 10.43g에 70% 에탄올 200ml에 용해시킨 후 n-헥산 200ml를 가하여 진탕 분획한 다음 70% 에탄올층을 수득하고 상기 에탄올층을 분리시켜 감압 농축 동결 건조시킨 후 추출물 1.92g을 얻었다. 추출물 중에 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 함량을 HPLC와 LC-MS를 통하여 정량 분석시켜 에피-튤리피놀라이드 함량 22.1중량%, 코스튜놀라이드 함량은 5.2중량%임을 확인하였다.
(제조비교예 2) 주정 용매를 사용한 추출물의 제조
1. 용매 추출 공정
세절한 3~5년생 백합나무 수피 200g을 주정 2000ml로 상온에서 24시간 진탕배양하여 추출하고 추출여액을 감압 농축 여과시킨 후 에틸아세테이트 1차 추출액을 수득하고, 수득된 1차 추출액에 부탄올 500ml를 가하여 상온에서 2~4시간 추출시킨 후 부탄올층을 분리 제거시켜 부탄올에 용해된 성분을 제거시킨 후 감압 농축 시켜 조 추출물 19.5g을 수득하였다.
2. 정제 공정
수득된 조 추출물 19.5g에 70% 에탄올 200ml에 용해시킨 후 n-헥산 200ml를 가하여 진탕 분획한 다음 70% 에탄올층을 수득하고 상기 에탄올층을 분리시켜 감압 농축 동결 건조시킨 후 추출물 2.65g을 얻었다. 추출물 중에 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 함량을 HPLC와 LC-MS를 통하여 정량 분석시켜 에피-튤리피놀라이드 함량 15.4중량%, 코스튜놀라이드 함량은 3.7중량%임을 확인하였다.
(제조비교예 3) 주정/물(1:1) 혼합 용매를 사용한 추출물의 제조
1. 용매 추출 공정
세절한 3~5년생 백합나무 수피 200g을 망치로 분쇄시킨 후 주정/물(1:1) 혼합 용매 2000ml로 상온에서 24시간 진탕배양하여 추출하고 추출여액을 감압 농축 여과시킨 후 에틸아세테이트 1차 추출액을 수득하고, 수득된 1차 추출액에 부탄올 500ml를 가하여 상온에서 2~4시간 추출시킨 후 부탄올층을 분리 제거시켜 부탄올에 용해된 성분을 제거시킨 후 감압 농축시켜 조 추출물 25.17g을 수득하였다.
2. 정제 공정
수득된 조 추출물 25.17g에 70% 에탄올 200ml에 용해시킨 후 n-헥산 200ml를 가하여 진탕 분획한 다음 70% 에탄올층을 수득하고 상기 에탄올층을 분리시켜 감압 농축 동결 건조시킨 후 추출물 1.75g을 얻었다. 추출물 중에 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드의 함량을 HPLC와 LC-MS를 통하여 정량 분석시켜 에피-튤리피놀라이드 함량 8.8중량%, 코스튜놀라이드 함량은 2.7중량%임을 확인하였다.
표 3 백합나무 추출물에서의 성분함량 (중량%)
에피-튤리피놀라이드 코스튜놀라이드
제조실시예 1 44.1% 15.6%
제조실시예 2 46.2% 12.0%
제조실시예 3 47.0% 15.4%
제조비교예 1 22.1% 5.2%
제조비교예 2 15.4% 3.7%
제조비교예 3 8.8% 2.7%
상기 제조실시예 1~3, 제조비교예 1~3에 나타난 바와 같이 제조실시예의 방법에 따라 제조된 백합나무 수피 추출물은 에피-튤리피놀라이드의 함량이 44~47중량%를 나타내었으며, 코스튜놀라이드 함량의 경우 12~16중량%를 나타내었다. 한편 제조 비교예 방법에 따라 제조된 백합나무 수피 추출물은 에피-튤리피놀라이드의 함량이 8~23중량%를 나타내었으며, 코스튜놀라이드 함량의 경우 2~6중량%를 나타내었다.
이는 추출용매의 차이에 근거한 것으로 에틸아세테이트가 백합나무로부터 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 가장 높은 함량으로 추출할 수 있음을 확인한 것이다.

Claims (4)

1) 세절된 백합나무 수피 1 중량부에 대해 추출 용매로서 에틸아세테이트 2~20 중량부를 첨가하여 1차 추출하고, 추출액에 부탄올 0.5~10 중량부를 가하여 에틸아세테이트층과 부탄올층을 층분리 시킨 후 부탄올층을 제거하고 감압 농축시켜 조 추출물을 수득하는 단계; 및
2) 수득된 조 추출물에 C1~C3 저급 알코올 수용액 및 n-헥산을 가한 후 n-헥산층에 용해된 유지성분과 수불용성 물질을 제거한 후, 저급 알코올 수용액층을 수득 분리하여 에피-튤리피놀라이드와 코스튜놀라이드를 고순도로 분리 정제하는 단계;
로 이루어진 백합나무 수피로부터 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 활성성분으로 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법에 있어서,
상기 만성 골수성 백혈병 치료제 분리물은 20~50 중량% 함량의 에피-튤리피놀라이드와 5~20 중량% 함량의 코스튜놀라이드를 함유하고 상기 추출은 냉침, 퍼콜레이션, 초음파, 온침 또는 환류의 방법으로 추출하는 것을 특징으로 하는 백합나무 수피로부터 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 활성성분으로 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)에서 수득된 저급 알코올 수용액층에 다시 물을 가하여 저농도 저급 알코올 수용액을 제조한 후, 디클로로메탄을 첨가하여 디클로로메탄 층을 분리 건조 정제시키는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 만성 골수성 백혈병 치료제의 분리 제조방법
제 1항 또는 제 2항의 방법에 따라 수득된 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 주성분으로 함유하는 만성 골수성 백혈병 치료제
유효성분으로 제 3항의 에피-튤리피놀라이드 및 코스튜놀라이드를 함유하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 만성 골수성 백혈병 치료 또는 예방용 약학적 조성물
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