KR20090089187A

KR20090089187A - 세코이소라리시레시놀 유도체 및 이를 유효성분으로 하는항암제

Info

Publication number: KR20090089187A
Application number: KR1020080014602A
Authority: KR
Inventors: 문석식; 기선호
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2008-02-18
Filing date: 2008-02-18
Publication date: 2009-08-21
Also published as: KR100933770B1

Abstract

본 발명은 암세포에 대한 강한 세포독성과 세포내의 액틴 사이토스켈리톤(cytoskeleton)의 고분자화를 억제하는 효능을 갖고 있는 신규 구조의 세코이소라리시레시놀(secoisolariciresinol) 유도체와 이 화합물을 유효성분으로 하는 항암제에 관한 것이다.

세코이소라리시레시놀 유도체, 하늘타리(Trichosanthes kirilowii), 하늘타린(hanultarin), 항암, 세포독성, 액틴 고분자화 억제

Description

세코이소라리시레시놀 유도체 및 이를 유효성분으로 하는 항암제{Derivatives of secoisolariciresinol, and anticancer agent containing the same as active ingredient}

액틴은 사이토스켈리톤 (cytoskeleton)의 주요성분으로서 세포의 성장, 분열, 신호전달, 세포-세포 응집, 상처치유 과정 등의 영역에서 중요한 기능을 한다. 액틴 단량체가 액틴 필라멘트로 고분자화 되는 과정에서 액틴 연관 단백질이 많이 관련되어 있다. 이 액틴 필라멘트들이 붙거나 떨어지는 과정 속에서, 세포의 모양이 바뀌거나 세포분열, 세포접합 등이 이루어진다. 이런 역할을 하는 액틴과 그 연관 단백질들은 암치료물질 개발의 주요 목표가 되고 있다 [Jordan, M. A.; Wilsont, L. Curr. Opin. Cell Biol. 1998, 10, 123-130; Giganti, A.; Friederich, E. Prog. Cell Cycle Res. 2003, 5, 511-525]. 이러한 추세에 따라 액틴과 상호작용하는 세포독성 천연물들이 최근에 많이 보고되고 있다. 라트룬클린 A(latrunculin A), 자스플라키놀라이드(jasplakinolide), 스윙홀라이드 A(swinholide A), 펙티노톡신(pectenotoxins) 등의 물질을 예로 들 수 있다 [Allingham, S. V. A.; Raymen, I. Cell Mol. Life Science. 2006, 63, 2119-2134; Fenteany, G.; S. Curr. Top. Med. Chem. 2003, 3, 593-616; Spector, I.; Braet, F.; Shochet, N. R.; Bubb, M. R. Microsc. Res. Tech. 1999, 47, 18-37].

한약재로서 잘 알려져 있는 하늘타리 (Trichosanthes kirilowii) 식물은 다년생 덩굴성 초목으로 우리나라 남부지방과 중부지방의 구릉지나 숲 가장자리에 자생한다. 한방에서는 하늘타리의 뿌리를 '과루근', '괄루근' 또는 '천화분'이라 하고, 하늘타리 열매를 '토과실'이라 하고, 하늘타리 씨앗을 '괄루인'이라 한다. 또한, 한방에서는 하늘타리의 열매와 뿌리를 타박상, 어혈, 황달, 피부병 등의 약재로 주로 사용하고 있고, 씨앗은 거담, 진해, 진통, 항소염제로서 주로 사용하고 있다 [김태정, 한국의 자생식물. 4권; 서울대출판부, 1996; p 172]. 이처럼 하늘타리의 열매와 뿌리는 민간에서 오랫동안 사용되어 오고 있으나, 각 부위별 성분 및 생리활성에 관한 보고는 아직 미흡한 실정이다.

한편, 본 발명자들은 하늘타리(Trichosanthes kirilowii)가 항암 효능이 있다는 민간 약효를 바탕으로, 하늘타리 열매(토과실)로부터 플라본 계열 물질을 분리하여 보고한바 있다 [Rahman, Md. Aziz Abdur and Moon, Surk-Sik. Bull. Korean Chem. Soc. 2007, 28 (8), 1261-1264]

본 발명은 하늘타리 씨앗(괄루인)을 유기용매로 추출 및 분획하여 신규 구조의 세코이소라리시레시놀(secoisolariciresinol) 유도체를 얻었고, 이렇게 얻은 신규 유도체가 인간 폐암 세포주 A549, 흑색종양 세포주 Sk-Me-2에 대하여 강한 세포독성을 보임을 확인하고, 각질 세포주 HaCaT 세포에서 액틴 사이토스켈리톤의 고분자화를 억제하는 효능도 확인하여 항암제로서 유효함을 알게됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규 구조의 세코이소라리시레시놀(secoisolariciresinol) 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 신규 세코이소라리시레시놀 유도체를 항암제로 사용하는 의약적 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하늘타리 씨앗(괄루인)으로부터 상기한 신규 세코이소라리시레시놀 유도체 중의 한 화합물인 하늘타린 (hanultarin; (-)-(2R,3R)-1-O-feruloylsecoisolariciresinol)을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 세 코이소라리시레시놀 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 그 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서, R₁, R₂, 및 R₃은 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체는 우수한 암세포독성과 세포의 사이토스켈리톤 성분인 액틴의 고분자화 억제 효능을 나타내므로, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체가 유효 활성성분으로 함유된 항암제를 그 특징으로 한다. 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체의 사용에 의한 항암 치료는, 암세포를 죽임으로써 치료하는 방법과 암세포의 성장에서 액틴의 고분자화를 억제함으로써 얻게 되는 암세포의 소멸을 수반하는 치료방법을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체에 있어, R₁, R₂, 및 R₃가 각각 메틸기인 화합물 일명, 하늘타린 (hanultarin)은 하늘타리 씨앗으로부터 용매추출, 실리카겔 컬럼크로마토그래피 및 C18 역상 HPLC를 수행하여 분리 수득하는 방법을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 4-톨루엔설폰산, 글루투론산, 엠본산, 글루탐산, 또는 아스파트산 등을 사용할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체에 있어, 치환기 R₁, R₂, 및 R₃은 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다. 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체로서 바람직하기로는 치환기 R₁, R₂, 및 R₃가 각각 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 및 이소부틸 중에서 선택된 알킬인 화합물이다. 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체로서 특히 바람직하기로는 치환기 R₁, R₂, 및 R₃가 각각 메틸기인 화합물이다. 본 발명에서는 치환기 R₁, R₂, 및 R₃가 각각 메틸기인 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체를 하늘타리 씨앗으로부터 분리하여, '하늘타린 (hanultarin)'으로 명명하였다. 따라서, 본 발명에 따른 세코이소라리시레 시놀 유도체 중에서, '하늘타린 (hanultarin)'은 천연물로서 수득할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체는 유기합성 분야에 종사하는 통상의 전문가라면 공지된 유기합성법에 의해서도 쉽게 합성이 가능하다. 예를 들면, 1-할로-2,3-비스(3,4-디하이드록시벤질)부탄-4-올과 페루로익 에시드(feruloic acid)를 원료물질로 사용하여 결합반응 및 알킬 치환반응을 수행하여 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체를 합성할 수 있다. 또한, 목적 화합물에 적합하게 사용되는 원료물질의 변형도 업자 수준에서는 자명한 것이다.

본 발명은 천연물로서 하늘타린 (hanultarin)을 하늘타리 씨앗으로부터 분리하는 방법도 권리범위로 포함하는 바, 천연물로서 하늘타린 (hanultarin)을 수즉하는 분리방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 하늘타리 씨앗(골루인)을 잘게 부순 분쇄물을 유기용매로 추출한다. 상기 추출에 사용하는 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 펜탄올, 헥산올을 포함하는 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜, 에틸아세테이트 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 또는 혼합용매를 사용할 수 있다. 추출에 사용되는 알콜은 무수 알콜 또는 물이 1 내지 80 부피%, 바람직하기로는 30 내지 60 부피% 범위로 포함된 수용성 알콜을 사용할 수 있다. 상기한 유기용매를 사용한 추출은 1회 내지 수십 회 반복 수행할 수도 있으며, 이렇게 추출하여 얻은 추출액을 모아서 감압 조건에서 농축하면 갈색 점성 액체를 얻게 된다.

그런 다음, 상기에서 수득한 용매 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알콜에 녹인 후에 헥산으로 추출하여, 알콜층을 수득 농축한다. 상기 추출물을 용해시키는데 사용되는 알콜은 무수 알콜 또는 물이 1 내지 80 부피%, 바람직하기로는 30 내지 60 부피% 범위로 포함된 수용성 알콜을 사용할 수 있다. 헥산으로 알콜 용액을 추출하는 과정 역시 1회 내지 수 십회 반복 수행할 수도 있다. 알콜 용액층을 분리하여 감압 조건에서 농축하면 갈색 액체를 얻게 된다.

그런 다음, 상기에서 얻은 농축물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피하여 활성 분획을 수득한다. 예를 들면, 용출액으로 메틸렌클로라이드, 메탄올 및 물의 혼합물을 단계별로 극성을 증가시키면서 1차 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행한다. 1차 실리카겔 컬럼크로마토그래피에서는 용출액으로서 메틸렌클로라이드/메탄올/물의 혼합 부피비 100:0:0 내지 90:9.5:0.5 범위 내에서 극성을 증가시키면서 수행할 수 있다. 그런 다음, 용출액으로 헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올의 혼합물을 사용하여 단계별로 극성을 증가시키면서 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행한다. 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피에서는 용출액으로서 헥산/에틸아세테이트의 혼합 부피비를 8:2 내지 1:9 범위 내에서 극성을 증가시키면서 수행할 수 있다.

그런 다음, 상기 실리카겔 컬럼크로마토그래피하여 얻은 활성 분획을 C18 역상 고압 액체 크로마토그라피(HPLC)하여 R₁=R₂=R₃= 메틸기인 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체를 수득하였다. 용출액으로는 수용성 아세토 니트릴을 사용하였으며, 구체적으로는 물이 1 내지 70 부피%, 바람직하기로는 30 내지 60 부피% 범위 포함된 수용성 아세토니트릴 또는 수용성 알콜을 사용할 수 있다.

상기한 바와 같은 일련의 추출 및 분획과정을 수행하여 얻은 활성물질의 구조 분석을 위해서는, 질량분석, 적외선 분광분석, 자외선 분광분석, 수소 핵자기공명 분석, 탄소 핵자기공명 분석 등을 수행하였다. 보다 상세한 분석결과는 하기 실시예 2에서 설명하도록 하겠다.

한편, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 함유되고, 여기에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제를 포함하여 이루어진 약학조성물을 권리범위로 포함한다. 이러한 약학 조성물은 항암제로 사용되어 유효한 약효를 나타내므로, 본 발명은 상기한 약학 조성물을 항암제로 사용하는 의약적 용도 역시 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 담체, 부형제, 희석제는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 것으로, 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산 염, 젤라틴, 인산칼슘염, 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 등을 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 이 있다. 또한, 본 발명의 항암제가 포유동물에 투여된 후에 활성성분이 신속방출, 서방출 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 제형화 할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 제제로 제형화하여 경구, 경피, 피하, 정맥내 또는 근육내를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 화합물은 전분 또는 락토오스를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제조된다. 또한, 비경구 제제는 예를 들면, 정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관내를 통하여 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해서는 무균의 수용액 형태로서 사용하는 것이 가장 바람직하며, 이때 상기 용액은 혈액과의 등장성을 갖기 위하여 다른 물질들(예를 들면 염(salt) 또는 만니톨, 글루코오스와 같은 단당류)를 함유할 수도 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 일반적으로 0.01 내지 400 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 괄루인으로부터 하늘타린 (hanultarin)의 분리

하늘타리 씨앗(괄루인) 10 Kg을 잘게 부수어서 80% 수용성 메탄올(20 L)에 담그고 실온에서 1주일 두었다. 우러난 수용성 메탄올 부분을 따라내고, 남은 찌꺼기를 에틸 아세테이트(18 L), 에틸아세테이트-헥산(6:1, 14 L)으로 같은 방법으로 우려냈다. 모든 우린 액을 합하여 감압 하에서 농축하여 갈색의 점성 액체 (2.6 Kg)를 얻었다. 이 액체를 30% 수용성 메탄올(1.4 L)에 녹인 후에 헥산 (1.2 L)로 10회 추출하였다. 남은 수용성 메탄올 부분을 농축하여 갈색의 액상 부분 (101 g)을 얻었다. 이것을 다시 물과 메틸렌클로라이드 (1:1, 2.4 L)에 최대한 녹여서 이 중에 메틸렌클로라이드 부분(30 g)을 실리카겔 컬럼크로마토그라피하였다(silica gel 60, 70-230 mesh, Merck, 50 id × 220 mm). 용출액으로 메틸렌클로라이드, 메탄올 및 물의 혼합물을 단계별로 극성이 증가하도록 하여(부피비를 100:0:0 → 90:9.5:0.5 v/v/v를 변화시키면서) 총 14개의 분획을 얻었다. 이 중에서 효능을 보인 분획 4 (6.9 g, R_f= 0.4∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물, 90:9.5:0.5 v/v/v)을 다시 실리카겔 컬럼크로마토그라피(용리액: 헥산 /에틸아세테이트= 8/2 → 1/9 v/v)하여 8개의 분획을 얻었다. 이 중에서 분획 7 (2.9 g, R_f= 0.5∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물 = 90:9.5:0.5 v/v/v)을 다시 C18 역상 중압 액체 크로마토그라피 (30-100% 수용성 메탄올, 220 min, 8 mL/min)하여 8개의 분획으로 나누었다.

그 중에서 분획 3 (254 mg, R_f= 0.5∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물, 90:9.5:0.5 v/v/v)을 C18 역상 HPLC (Senshu pak, Pegasil ODS, 20 id x 250 mm, 30-40% 수용성 아세토니트릴, 75 분, 7 mL/min, UV 225 nm)하여 피노레시놀 (pinoresinol, 18.3 mg, R_t 31.2 min) 및 4-케토피노레시놀 (4-ketopinoresinol, 6.32 mg, R_t 36.6 min)를 얻었다.

그리고, 분획 4 (354 mg, R_f= 0.5∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물, 90:9.5:0.5 v/v/v)를 C18 HPLC (30-60% 수용성 아세토니트릴, 60 min, 7 mL/min, UV 225 nm)하여 세코이소라리시레시놀 (secoisolariciresinol, 8.5 mg, R_t 25.2 min)과 옅은 갈색의 점성 액체로 하늘타린 (hanultarin, 28 mg, R_t 37.2 min)를 얻었다.

한편 분획 5 (350 mg, R_f= 0.5∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물, 90:9.5:0.5 v/v/v)를 HPLC (25-70% 수용성 아세토니트릴, 50 min, 7 mL/min, UV 225 nm)하여 2,3-디페루로일 세코이소라리시레시놀 (2,3- diferuloylsecoisolariciresinol, 40 mg, R_t 33.6 min)를 얻었다.

실시예 2: 하늘타린(hanultarin)의 화학구조 규명

상기 실시예 1의 분리방법에 의해 얻은 하늘타린(hanultarin)의 화학구조 규명을 위해 하기와 같은 분광분석을 실시하였다. 그리고, 도 1 내지 4에는 하늘타린(hanultarin)의 질량(mass) 분석 스펙트럼, 적외선(IR) 분광 스펙트럼, 수소 핵자기공명(¹H NMR) 스펙트럼, 탄소 핵자기공명(¹³C NMR) 스펙트럼을 각각 첨부하였다.

질량 분석 스펙트럼에 의하면 하늘타린(hanultarin)의 질량은 538로 측정되었다 (HRTOFMS [M+H]⁺ : m/z 539.2294; 이론값, 539.2281). 이로부터 분자식은 C₃₀H₃₄O₉이다. 자외선(UV) 분광 스펙트럼 결과, 메탄올에서 최대흡수값은 326, 288, 및 204 nm에서 관찰되었다. 적외선(IR) 분광 스펙트럼에서 보여지는 특성 피크는 다음과 같다: 히드록시 그룹 (3409 cm^-1), 에스터 (1702 cm^-1), 이중결합 (1637 cm^-1), 및 방향족성 고리 (1602, 1513 cm^-1). ¹H NMR과 ¹³C NMR 스펙트럼으로부터 두개의 이중결합성 수소[δ 7.56 (1H, J = 16 Hz) 및 6.35 (1H, J = 16 Hz)], 방향족성 수소[δ 7.05 (1H, dd, J = 8.4, 1.6 Hz), 6.81 (1H, d, J = 8.4 Hz), 및 7.17 (1H, d, J = 1.6 Hz)] 및 메톡시 수소[δ 3.88 (3H, s)]가 관찰되었다.

상기한 자료로부터 하늘타린(hanultarin)의 화학구조 일부가 페루로일(feruloyl; 4-hydroxy-3-methoxyphenylcinnamoy) 그룹을 포함하고 있음을 알 수 있다. 나머지 구조 부분에서 여러 쌍의 방향족 고리형 수소[δ 6.55 (1H, dd, J = 7.6, 1.6 Hz)와 6.664 (1H, d, J = 7.6 Hz); 6.62 (1H, d, J = 1.6 Hz) 와 6.54 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 6.662 (1H, d, J = 8.0 Hz) 및 6.58 (1H, d, J = 1.6 Hz)], 두 개의 메톡시 수소[δ 3.71(3H, s) 및 3.7(3H, s)]이 존재하는 것으로 보아서, 두개의 4-히드록시-3-메톡시페닐 그룹이 존재하는 것을 알아냈다. 추가하여, 메틸렌 수소[δ 2.71 (2H, dd, J = 14.0, 7.2 Hz) 및 2.61 (2H, dd, J = 13.2, 8.0 Hz)], 두 개의 메틴 수소[δ 2.24 (m), 및 1.97 (m)], 두 쌍의 메틸렌 수소[δ 4.33 (1H, dd, J = 11.2, 6.0 Hz), 4.10 (1H, dd, J = 11.2, 6.4 Hz), 3.53 (1H, dd, J = 11.2, 6.8 Hz) 및 3.67 (1H, dd, J = 11.2, 6.0 Hz)]이 관찰되었다. 이런 자료의 분석결과로부터 하늘타린(hanultarin)은 두개의 1,3,4-삼중치환 방향성 고리, -CH₂-CH(CH₂O-)-CH(CH₂O-)-CH₂- 부분을 포함하는 것을 알아냈다. 이런 부분 구조들은 HMBC 스펙트럼의 해석으로 연결시켰다.

이상의 분석 결과를 종합해 보면, 상기 실시예 1에서 분리한 하늘타린(hanultarin)의 화학구조는 하기 화학식 1a로 표시되고, 그 화합물 명은 1-o-페루로일세코이소라리시레시놀(1-o-feruloylsecoisolariciresinol) 임을 규명할 수 있었다. 분리한 하늘타린(hanultarin)의 광학활성도는 -19.7 (c 0.36, 메탄올)로서, 이미 알려진 유사 물질인 (-)-(2R,3R)-세코이소라리시레시놀((-)-(2R,3R)- secoisolariciresinol)가 (-)의 값을 가지므로, 이 하늘타린의 입체탄소에서의 입체구조는 동일한 것으로 판단된다.

본 실시예 2에서 측정한 하늘타린(hanultarin)의 분광학적 분석자료는 다음과 같다 : 옅은 갈색 점성 액체; 광학활성도 -19.7°(c 0.36, 메탄올); HRTOFMS [M+H]+ m/z: 539.2294 (계산값: 539.2281), 분자식 C₃₀H₃₄O₉+H); 자외선 스펙트럼 (ν_max, MeOH) 326, 288, 204; 적외선 스펙트럼 (KBr): 최대흡수 주파수 3409, 2950, 1702, 1637, 1602, 1513 1467, 1429, 1387, 1244, 1210, 1157, 1023 cm^-1; ¹H NMR 및 ¹³C NMR (CD₃OD)은 하기 표 1 참조.

[제제화]

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 다음은 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제제 1 : 정제(직접 가압)

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 만들었다.

제제 2 : 정제(습식 조립)

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 만들었다.

제제 3 : 분말과 캡슐제

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

제제 4 : 주사제

활성성분으로서 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

[실험예]

실험예 1. 하늘타린의 암세포독성 측정

본 발명이 분리한 하늘타린의 암세포주 A549, SK-Mel-2 및 B16F1에 대한 암세포독성 측정은 SRB (colorimetric sulforhodamine B) 방법을 이용하였다 [Skehan, P.; Storeng, R.; Scudiero, D.; Monks, A.; McMahon, J.; Vistica, D.; Warren, J.T.; Bokesch, H.; Kenney, S.; Boyd, M.R. J. Natl . Cancer Inst . 1990, 82, 1107; Rahman, Md. Aziz Abdur, Cho, Soon-Chang, Song, Junsik, Mun, Hyeong-Tae, Moon, Surk-Sik. Planta Medica, 2007, 73, 1089-1094].

각 세포주의 세포밀도는 사람의 폐암 세포주 A-549, 사람의 색종양암 세포주 SK-MEL-2, 쥐의 흑색 종양암 세포주 B16-F1의 경우에 각각 1× 10⁵, 1× 10⁵, 2× 10⁴ cells/mL을 사용하였다. 지수적으로 증식하는 세포주를 들어서 배지 100 mL (RPMI-1640)를 96-well 플레이트의 각 방에 넣었다. 35 ℃, 5% CO₂ 환경 하에서 24 시간 배양한 후에, 세포배양액에 배지 100 mL (RPMI-1640)에 2배씩 묽힌 시료들을 넣어주었다. 시료를 포함하는 배양액을 48 시간 같은 조건에서 배양하였다. 세포들은 50% 트리클로로아세트산(CCl₃COOH)으로 고정하고, 30 분 동안 SRB 염색약으로 염색하였다. 결합하지 않은 염색약은 1% 아세트산으로 씻어냈다. 단백질과 결합한 염색약은 10 mM tris base (pH 10.5)로 5 분 동안 우려냈다. 세포주 증식 억제 농도는 520 nm에서 마이크로플레이트 측정기 (Tecan, Salzburg, Austria)에서 측정하였다.

실험 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2의 결과에 의하면, 하늘타린은 항암제로 사용되고 있는 시스플라틴보다 페암 세포주에 3배, 흑색종앙세포주에 1.6배로 강한 효능을 보임을 알 수 있다.

실험예 2. 하늘타린의 액틴 고분자화 억제 효과

세포의 액틴 고분자화 반응을 잘 관찰하기 위하여 세포가 상대적으로 크고 미세소관과 액틴을 잘 관찰할 수 있는 각질 세포주 HaCaT를 대상으로 실시하였다(Boukemp, P.B.; Petrussevska, R.T; Breitkreutz, D.; Hornung, J. Markham, A.; Fusenig, N.E. J. Cell Biol. 1988, 106, 761). 각질 세포주 HaCaT는 10% FBS를 포함하는 DMEM 배양액에서 배양하였다. 세포에 시료를 넣고 밤새 배양한 후에 면역형광분석법을 실시하여 액틴의 변화를 관찰하였다. 이렇게 하늘타린으로 처리한 세포들을 얼음으로 식힌 PBS 용액으로 씻은 후에, 4% 포름알데히드로 고정하였다. 그 다음에 세포는 일차 및 2차 항체로 배양하였다. 미세소관은 항미세소관 항체 (Sigma, St Louis, MO)로 처리하였고, 액틴은 형광 팔모이딘 (Sigma)으로 처리하였다. 염색된 세포는 형광현미경(Axioscope, Zeiss, Germany)으로 분석하였다. 형광이미지는 Photometrics digital camera (Roper Scientific, Trenton, NJ)로 찍어 도 5로서 첨부하였다. 비교화합물로서 하늘타린과 유사한 화학구조를 갖는 2,3-디페루로일세코이소라리시레시놀을 사용하였다.

도 5a는 HaCaT 세포를 IC₅₀ 농도(사이토칼라신 D: 1 μg/mL, 하늘타린: 3.5 μg/mL, 비교화합물: 12 μg/mL)의 시료로 처리한 결과이다. 도 5b는 HaCaT cells을 여러 가지 농도의 하늘타린 시료로 처리하였을 때의 세포를 관찰한 결과이다.

도 5a에 의하면, 하늘타린으로 세포를 처리했을 때 농도에 비례하여 액틴 사이토스켈리톤은 덩어리 같은 구조로 변했는데 반하여, 비교화합물(2,3-디페루로일세코이소라리시레시놀)으로 세포를 처리했을 때는 액틴에 별다른 영향을 주지 못하였다). 도 5b에 의하면, 하늘타린의 처리 농도가 매우 높으면(12 μg/mL) 액틴이 모두 파괴되어 버렸는데, 이것은 액틴의 고분자화를 억제하는 것으로 잘 알려진 사이토칼라신 D의 경우에 나타나는 현상과 비슷한 것이다. 하늘타린을 세포독성이 없는 낮은 농도 (1 내지 3 μg/mL)로 처리했을 때도 액틴의 고분자화를 억제하였으며, 세포와 세포가 접촉하는 부분에서 분리를 야기하였다(도 5b, 3.0 μg/mL에서 화살표 부분). 이것은 세포가 죽을 때 나타나는 현상이다. 결론적으로 하늘타린은 액틴의 고분자화를 억제함으로써, 세포를 죽게 만드는 기작을 나타낸다고 볼 수 있다. 이런 효능은 하늘타린과 유사한 화학구조를 갖는 비교화합물(2,3-디페루로일세코이소라리시레시놀)에서는 관측되지 않는 차별화된 효능이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명이 특징으로 하는 상기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체는 신규 화합물로서 우수한 암세포독성을 지니고 있으며, 세포의 성장과 분열, 세포-세포 응집에 관여하는 세포내의 액틴의 고분자화를 억제함으로써 암 관련 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 하늘타린의 질량분석 스펙트럼이다.

도 2는 하늘타린의 적외선분광 스펙트럼이다.

도 3은 하늘타린의 ¹H 핵자기공명 스펙트럼이다.

도 4는 하늘타린의 ¹³C 핵자기공명 스펙트럼이다.

도 5a 및 5b는 면역형광법으로 분석한 하늘타린의 액틴 고분자화 억제 효과를 확인한 사진으로,

도 5a는 HaCaT 세포를 IC₅₀ 농도의 시료로 처리한 결과 (사이토칼라신 D: 1 μg/mL; 비교물질: 12 μg/mL; 하늘타린: 3.5 μg/mL)이고,

도 5b는 HaCaT cells을 여러 가지 농도의 하늘타린 시료로 처리하였을 때의 세포를 관찰한 결과이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 세코이소라리시레시놀 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 :

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁, R₂, 및 R₃은 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다.
청구항 1에 있어서, 상기 R₁, R₂, 및 R₃은 각각 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 및 이소부틸 중에서 선택된 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 1에 있어서, 상기 R₁, R₂, 및 R₃은 각각 메틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 청구항 1 내지 3 중에서 선택된 어느 한 항에서 정의된 세코이소라리시레시놀 유도체가 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 항암제.
하늘타리 씨앗 분쇄물을 탄소수 1 내지 6의 알콜, 에틸아세테이트 및 헥산으로 이루어진 유기용매 군으로부터 선택된 단일 또는 혼합용매로 추출하는 과정 ;

상기 용매 추출물을 탄소수 1 내지 6의 알콜에 녹인 후에 헥산으로 추출하고 알콜층을 수득 농축하는 과정 ;

상기 농축물을 1차 실리카겔 컬럼크로마토그래피하여, 활성분획 (R_f= 0.4∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물, 90:9.5:0.5 v/v/v)를 얻는 과정 ;

상기에서 얻은 활성분획을 2차 실리카겔 컬럼크로마토그라피하여, 활성분획 (R_f= 0.5∼0.6, 용리액: 메틸렌클로라이드/메탄올/물, 90:9.5:0.5 v/v/v)을 얻는 과정 ; 및

상기 2차 실리카겔 컬럼크로마토그라피하여 얻은 활성분획을 C18 역상 고압 액체 크로마토그라피하여, 하기 화학식 1a로 표시되는 1-O-페루로일세코이소라리시레시놀 (R_t = 37.2 min, 30-60% 수용성 아세토니트릴, 60 min, 7 mL/min, UV 225 nm)을 얻는 과정이

포함되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연물로서 세코이소라리시레시놀 유도체의 분리방법.

[화학식 1a]
청구항 5에서, 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 및 이소부탄올 중에서 선택 사용하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
청구항 5에서, 상기 알콜은 무수 알콜 또는 물이 1 내지 80 부피% 범위로 포함된 수용성 알콜인 것을 특징으로 하는 분리방법.