CN104434900A

CN104434900A - Lca在制备治疗关节炎症或关节软骨及骨质破坏的药物中的应用

Info

Publication number: CN104434900A
Application number: CN201410627462.6A
Authority: CN
Inventors: 韩婷; 林兵; 秦路平; 张巧艳; 郑承剑; 贾敏; 蒋益萍; 徐帆; 陈泠
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-11-10
Also published as: CN104434900B

Abstract

本发明涉及化合物LCA（9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚）在制备治疗关节炎症或关节软骨及骨质破坏的药物中的应用。本发明利用细胞热转移技术证实了化合物LCA在细胞内可与MEK1蛋白和cathepsinK蛋白结合，通过动物试验证实了LCA可改善类风湿性关节炎大鼠症状，以上研究结果表明LCA具有同时抑制免疫炎症和防治骨质破坏的双靶点作用，在类风湿性关节炎、骨关节炎及骨质疏松等疾病的临床治疗中具有广阔的应用前景。

Description

LCA在制备治疗关节炎症或关节软骨及骨质破坏的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及天然产物9,9`-O-di-(E)-feruloyl-meso- 5,5`-dimethoxysecoisolariciresinol （9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚，代号LCA）在制备治疗关节炎症或关节软骨及骨质破坏的药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，仍停留于对炎症及后遗症的治疗，采取综合治疗，多数患者均能得到一定的疗效。现行治疗的目的在于：①控制关节及其它组织的炎症，缓解症状；②保持关节功能和防止畸形；滑膜炎症和关节软骨及骨质破坏是类风湿性关节炎的两大主要病理特征。MEK1（MAPKK1，丝裂原活化蛋白激酶激酶1）是一种可调节多种促炎因子（TNFα，IL-1β和 IL-6等）合成和释放的关键激酶，TNFα，IL-1β和 IL-6对类风湿性关节炎患者的滑膜炎症的反复和持续发挥着重要作用，因此针对该靶点的小分子抑制剂可以有效的抑制类风湿性关节炎动物模型的关节滑膜炎症，并且可以抑制破骨细胞的分化和功能。cathepsin K（组织蛋白酶K）属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族成员，对软骨胞外基质Ⅱ型胶原和Aggrecan均有降解作用，是引起类风湿性关节炎患者关节软骨及骨质破坏的主要蛋白酶之一，以cathepsin K为靶点的小分子抑制剂可用于防治类风湿性关节炎、骨关节炎及骨质疏松等疾病引起的关节软骨及骨质损伤。MEK1和cathepsin K都是类风湿性关节炎治疗的重要靶点，以MEK1为靶点的抗类风湿性关节炎药物ARRY-162目前已经进入III期临床，而以cathepsin K为靶点的药物Balicatib、Relacatib被用于类风湿性关节炎、骨关节炎等疾病的治疗。关节滑膜炎症和骨质破坏是类风湿性关节炎的两个主要病理表现，目前市场上尚无同时抑制免疫炎症和防治骨质破坏双靶点的药物。

9,9`-O-di-(E)-feruloyl-meso- 5,5`-dimethoxysecoisolariciresinol（9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚，代号LCA）是从樟科植物三桠乌药Lindera obtusiloba中分得的化合物[Ki Yong eLe.;Soon-Han Kim.;Eun Ju Jeong.;Jung Hyun Park.;Seung Hyun Kim.;Young Choong Kim.;Sang Hyun Sung. New secoisolariciresinol derivatives from Lindera obtusiloba stems and their neuroprotective activities. Planta Med, 2010, 76(3): 294-297.]，化合物结构式如(I)所示。而目前关于化合物LCA对类风湿性关节炎的治疗作用及机理还未见报道。

细胞热转移技术（cellular thermal shift assay，CETSA）是瑞典Karolinska研究所的研究人员开发出的一种根据药物配体与蛋白结合后的稳定性，直接监控细胞内靶标蛋白的技术。在2013年最新发表于《科学》（Science）杂志上的论文中对这一方法进行了详细描述，其利用了一个概念：当药物分子结合时靶蛋白通常会获得稳定。CETSA被认为是可以直接测定药物有效性的技术，有可能大大推动新药的改良和研发。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚在制备可与细胞中MEK1蛋白和/或cathepsin K蛋白结合的药物中的应用。

所述的细胞为RAW264.7细胞或破骨细胞。

第二方面，化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚在制备治疗关节炎症和/或关节软骨及骨质破坏的药物中的应用。

所述的关节炎症为关节滑膜炎症。

第三方面，化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚在制备治疗类风湿性关节炎、骨关节炎或骨质疏松的药物中的应用。

所述的化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚的结构式如(I)所示：

。

LCA的结构鉴定：白色固体，¹H-NMR（600 MHz, DMSO-d₆, δ/ppm）：7.53（1H×2, d, J=15.9 Hz, H-7``, 7```），7.00（1H×2, dd, J=1.8, 8.2 Hz, H-6``,6```），6.95（1H×2, d, J=1.8 Hz, H-2``, 2```），6.84（1H×2, d, J=8.2 Hz, H-5``,5```），6.23（1H×2, d, J=15.9 Hz, H-8``,8```），6.21（2H×2, s, H-2, 6, 2`,6`），4.40（1H×2, dd, J=5.5, 11.3 Hz H-9b, 9b`），4.14（1H×2, dd, J=5.8, 11.3Hz，H-9a, 9a`），3.86（3H×4, s, H-3, 5, 3`, 5`），3.72（3H×2, s, H-3``,3```），2.67（1H×2, dd, J=7.1, 14.0, Hz, H-7b,7b`），2.63（1H×2, dd, J=7.9, 14.0 Hz, H-7a,7a`），2.10（1H×2, m, H-8,8`）。¹³C-NMR (151 MHz, DMSO-d₆, δ/ppm): 166.64（C-9, 9`），149.36（C-3``, 3```），147.90（C-4``, 4```），147.77（C-2, 2`, 5, 5`），145.04（C-7``, 7```），133.63（C-4, 4`），129.98（C-1``, 1```），125.49（C-6``, 6```），123.12，115.47（C-8``, 8```），114.37（C-5``, 5```），111.17（C-2``, 2```），106.16（C-2, 6, 2`,6`），63.82（C-9, 9`），55.74（C-3, 5, 3`, 5`），55.66（C-3``,3```），40.3（C-8, 8`），34.37（C-7,7`）。ESI-MS (m/z): 775.12 [M+H]⁺。为内消旋体（R，S）。

本发明优点在于：本发明利用细胞热转移技术证实了化合物LCA在细胞内可与MEK1蛋白和cathepsin K蛋白结合，通过动物试验证实了LCA可改善类风湿性关节炎大鼠症状，表明LCA具有同时抑制免疫炎症和防治骨质破坏的双靶点作用，因此可用于治疗关节炎症、关节软骨及骨质破坏，在类风湿性关节炎、骨关节炎及骨质疏松等疾病的临床治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

附图1为LCA对MEK1蛋白的CETSA曲线和等温量效曲线（ITDRF_CETSA）（n=3）。A：CETSA曲线；B：等温量效曲线。

附图2为LCA对cathepsin K蛋白的CETSA曲线和等温量效曲线（ITDRF_CETSA）（n=3）。A：CETSA曲线；B：等温量效曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 化合物LCA的作用靶点研究

对化合物LCA进行靶点作用研究，采用细胞热转移技术（cellular thermal shift assay，CETSA）对化合物与MEK1（RAW264.7 cell）和cathepsin K（Osteoclast）的细胞内结合进行研究。

1 实验方法

1.1破骨细胞诱导

取新生3天SD幼鼠5只，处死后用75%乙醇溶液浸泡5-10 min，在超净台下取下四肢胫骨，用1 mL注射器吸取α-MEM培养基将骨髓腔内的骨髓细胞冲出，收集冲洗液，1200 rpm/min离心10 min，细胞用PBS冲洗2次，即得新鲜骨髓单核细胞。将细胞用含5 ng/mL M-CSF和10%胎牛血清的α-MEM进行培养，细胞浓度为10⁷-10⁹个/mL，37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。将未贴壁细胞转移至离心管中，1200 rpm/min离心10 min。收集底部细胞用50 ng/mL的M-CSF 和10% FBS的α-MEM培养基进行培养。第四天时换50 ng/mL M-CSF和100 ng/mL sRANKL以及10% FBS的α-MEM培养基进行培养，每3天换一次，第6天时（共10天）破骨细胞分化成熟。

1.2 CETSA实验操作

将RAW264.7细胞/诱导的破骨细胞（0.6-1.0×10⁶ cell/mL）接种至12孔板中，加入药物LCA，5% CO₂、37℃孵育 3 h，对照组加入等量的DMSO。收获细胞，PBS冲洗三次后，溶于含有蛋白酶抑制剂的激酶缓冲液（Kinase buffer），使用液氮进行反复冻融破裂细胞，将得到的细胞提取物通过20000 r，4°C离心20分钟后得到可溶性蛋白提取物，将细胞悬液等分成50 μL，分别在不同温度下加热3-10 min，具体的温度通过CETSA预实验确定。然后将细胞提取物再次20000 r，4°C离心20分钟，分离得到上清液，弃去不溶性沉淀。然后取10 μL样品进行酶联免疫吸附测定（ELISA）。ELISA实验最终得到各药物-蛋白孵育作用后的吸光度值。该吸光度值与CETSA最低的药物-蛋白孵育温度直接相关，据此绘制CETSA曲线和等温量效曲线（ITDRF_CETSA）。

2 实验结果

2.1 LCA与MEK1的结合作用

RAW264.7细胞与药物（100 μM）处理后，经过清洗、不同温度（37℃、41℃、45℃、49℃、53℃、57℃、61℃）加热、冷却和裂解，细胞裂解液通过离心得可溶性蛋白，并测定MEK1蛋白的含量，绘制CETSA曲线，见图1中A。温度（53℃）不变，给予不同浓度LCA（1、10、100、1000 μM）进行处理，得到等温量效曲线（ITDRF_CETSA）。由图1中A可知，RAW264.7细胞给予LCA（100 μM）处理并进行梯度加热后，45℃~55℃之间LCA的CETSA曲线发生漂移，表明LCA进入细胞后与MEK1蛋白结合，使其稳定性发生了改变。图1中B ITDRF_CETSA显示，53℃下MEK1蛋白稳定性随着LCA浓度升高（1、10、100、1000 μM）而增加，在100 μM后趋于稳定。CETSA曲线和ITDRF_CETSA结果显示LCA在细胞内可与MEK1蛋白结合，MEK1蛋白是LCA抑制细胞因子合成和抑制破骨细胞分化的作用靶点。

2.2 LCA与cathepsin K的结合作用

破骨细胞可高表达cathepsin K蛋白，故破骨细胞诱导成功后进行CETSA分析，得CETSA曲线和ITDRF_CETSA曲线。图2中A为LCA与cathepsinK蛋白CETSA曲线，结果显示，破骨细胞给予LCA（100 μM）处理后，其cathepsin K CETSA曲线在45℃~55℃间发生了漂移；图2中B ITDRF_CETSA曲线显示，在53℃下，cathepsin K蛋白稳定性随着LCA浓度升高（1、10、100、1000 μM）而增加，在100 μM后趋于稳定。综上所述，CETSA曲线和ITDRF_CETSA曲线结果显示LCA在细胞内可与cathepsin K蛋白结合，cathepsin K为LCA发挥防止骨质破坏的靶点。

由于MEK1和cathepsin K都是类风湿性关节炎治疗的重要靶点，MEK1诱导类风湿性关节炎患者滑膜炎症的反复和持续以及破骨细胞的分化，cathepsin K对软骨胞外基质Ⅱ型胶原和Aggrecan均有降解作用，最终引起关节软骨及骨质破坏或损伤。

实施例2 化合物LCA治疗类风湿性关节炎的动物试验

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar大鼠，雌性，7-8周龄，体重160-180g，2只/笼，分笼饲养，大鼠自由饮水及进食，室温25±1℃，动物适应性饲养5天后进行实验。

1.2 主要试剂

LCA注射剂：化合物LCA 为根据现有技术分离获得，使用30%丙二醇溶剂配制成15mg/ml浓度的注射剂，4℃冰箱保存备用。

MTX注射剂：规格5mg/支，批准文号H20080251，Ebewe Pharma Ges.m.b.H.Nfg.KG。

牛II型胶原蛋白，购于Chondrex, Inc.公司；冰醋酸购于北京化学试剂公司；完全弗式佐剂、不完全弗式佐剂购于美国sigma公司；丙酮购于上海丹炼贸易有限公司；聚甲基丙烯酸酯购于东莞市凯杰塑胶原料有限公司；甲苯胺蓝购于上海生工。

2 实验方法

2.1 类风湿性关节炎动物模型的建立

2.1.1牛II型胶原的乳化

(1)配制乙酸溶液：溶解无水冰醋酸于灭菌用水，配制0.05mol/L的乙酸；

(2)配制胶原溶液：向牛II型胶原中加0.05mol/L的乙酸溶液，使胶原溶液终浓度为4mg/ml，放入4℃冰箱中避光搅拌过夜；

(3)配制胶原乳剂：将4mg/ml胶原溶液与CFA等体积乳化（注射器法，冰上操作），使胶原终浓度为2mg/ml，用于初次免疫；将4mg/ml胶原溶液与IFA等体积乳化，使胶原终浓度为2mg/ml，用于激发免疫。

2.1.2大鼠免疫方法

(1)初次免疫：用2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠（0.3ml/只），于每只大鼠尾根部皮下注射0.12ml胶原乳剂（含胶原240μg）；

(2)激发免疫：初次免疫后第7天于大鼠臀背部两侧各皮下注射0.03ml胶原乳剂（共含胶原120μg）。

2.1.3模型评价

(1)观察关节形态

发病大鼠肿胀关节主要出现于双下肢踝关节和足趾各关节，通过观察大鼠关节形态的变化判断发病情况。初次免疫后第12天，造模大鼠后肢踝关节及趾间关节开始出现肿胀，肿胀以踝关节为中心，肿胀部位皮肤发红甚至发紫，患肢皮肤温度较健侧增高。

(2)关节炎症评分

大鼠关节炎症程度评价采用评分法（0～4分），分级评分及表现见表1。炎症评分≥2分即造模成功大鼠，可随机入组用于后续实验。

表1 大鼠四肢关节炎症评分及表现

2.2 LCA对CIA大鼠关节炎症的抑制作用

2.2.1 分组情况

灭菌水组10只，即对照组；MTX组10只；LCA组10只。

2.2.2 给药方法及剂量

灭菌水组：灭菌用水3ml/只/天，灌胃；

MTX组：MTX（3mg/kg)，腹腔注射；

LCA组：LCA注射剂（3mg/kg），腹腔注射。

2.2.3 关节炎症判定方法

从治疗的第1天开始，隔天按表1所示记录关节炎分数，每只大鼠的关节炎分数为双下肢评分的总和，共记录28天。

2.2.4 体重与足掌厚度的测量

治疗期间，治疗前、后使用电子秤将每只大鼠进行秤重，记录、分析；每周使用游标卡尺测量双后足的足掌厚度，第一次测量点，用记号笔在足背标记，后几次测量同一点，记录均数并分析。

2.2.5 统计学处理

采用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，数据符合正态分布，按照均数±标准差表示，若各治疗组方差齐，采用LSD-t检验进行组间的两两比较；单独两组样本均数比较时，若方差齐，采用t-text，若方差不齐，改用t'检验，P＜0.05时有统计学意义。

2.3 LCA抑制CIA大鼠局部骨破坏的作用

2.3.1 分组情况

灭菌水组10只，即对照组；MTX组10只；LCA组10只。

2.3.2 给药方法及剂量

灭菌水组：灭菌用水3ml/只/天，灌胃；

MTX组：MTX（3mg/kg），腹腔注射。

LCA组：LCA注射剂（3mg/kg），腹腔注射。

2.3.3 关节破坏程度检查方法

治疗4周后，处死大鼠取胫骨上段去除软组织，浸入丙酮中固定，行Micro-CT扫描，比较各组治疗后胫骨上段骨破坏及胫骨上段骨骺线下1~4mm间次级松质骨骨小梁变化。

2.3.4 大鼠左侧股骨及第五腰椎骨生物力学的检查方法

(1)治疗4周后，处死大鼠取左侧股骨全长及第五腰椎去除软组织，2小时内行骨生物力学检查，比较各组治疗后股骨及第五腰椎的生物力学的变化。

(2)处死大鼠取左侧股骨全长及第五腰椎去除软组织，修整椎体上下关节面，使上下关节面保持平行。取完标本后予以0.9%生理盐水纱布包裹标本，2小时内行骨生物力学检查，比较各组治疗后股骨及第五腰椎的生物力学的变化。测试室温控制于37℃，股骨干参数的取股骨干的中点的前后径及左右径平均值为直径，跨距为2cm，加载速率为2mm/min。股骨测试时均为同一方向，股骨头朝上，股骨小结节远端和股骨髁上分别为二点置于测试仪上，股骨干的中点为受力点。腰椎参数分别取：1、椎体前后径和左右径的平均值；2、椎体的高度；加载速率为2mm/min。股骨三点弯曲实验以股骨断裂为实验终点，腰椎压缩实验以椎体被压缩1/3为实验终点。

2.3.5 统计学处理

采用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，数据符合正态分布，按照均数±标准差表示，若各治疗组方差齐，采用单因素的方差分析及LSD-t检验进行组间的两两比较；单独两组样本均数比较时，若方差齐，采用t-text，若方差不齐，改用t'检验，P＜0.05时有统计学意义。

3 实验结果

3.1 LCA对CIA大鼠关节炎症的抑制作用

3.1.1 关节炎症评分变化

对治疗第1天实验数据进行统计分析，结果表明，在治疗第1天，各治疗组炎症平均分值均在4.5分左右，任何两组之间比较均没有统计学差异，说明在治疗之初各治疗组平均炎症分值相当。

将隔日记录的关节炎症分值结果绘制成关节炎症分值曲线，发现在治疗前7天，各治疗组都经历了一个炎症上升的阶段，在第2周左右各治疗组对CIA大鼠关节炎症分值出现较大的变化。MTX组和LCA组的炎症评分快速下降，对照组的炎症评分仍然较高。

对治疗第28天实验数据进行统计分析，结果如表2所示。治疗28天后，与灭菌水治疗比较，LCA组（P<0.01）、MTX组（P<0.01）炎症平均分值显著降低。LCA组与MTX组的炎症平均分值无明显统计学差异，但LCA组评分低于MTX组。以上结果说明化合物LCA对CIA大鼠炎症具有明显抑制作用，与MTX的抑制作用基本相当。

表2 治疗第28天各治疗组大鼠关节炎症评分比较

3.1.2 足掌厚度与体重变化

在治疗前1天，各治疗组大鼠足掌厚度并无统计学意义。在治疗第2周，LCA组、MTX组足掌厚度明显减小。治疗第28天，相比灭菌水组，LCA组（P<0.01）与MTX组（P<0.01）均能抑制足掌的肿胀，且LCA组与MTX组比较有统计学意义（P<0.05）（见表3）。

表3 治疗第28天各治疗组大鼠足掌厚度比较

治疗前、后对各组大鼠进行秤重，相比灭菌水组，各组治疗前及治疗后均无统计学意义。

3.2 LCA抑制CIA大鼠局部骨破坏的作用

3.2.1 胫骨上段矢状面松质骨变化比较

药物治疗4周后，取各治疗组大鼠胫骨上段行Micro-CT扫描，得到胫骨上段矢状面图，从CT图中可以看出，灭菌水组大鼠胫骨平台前方出现塌陷，骨骺线向前倾斜，骨骺线下1~4mm间的次级松质骨骨小梁稀少凌乱，相反LCA组及MTX组大鼠胫骨平台均保持正常结构形态，骨骺线呈蝶形、清晰可见，骨骺线下1~4mm间的次级松质骨骨小梁数量明显多于灭菌水组，骨小梁沿竖直应力方向排列较整齐。

3.2.2 骨生物力学参数比较

各治疗组大鼠股骨三点弯曲实验及腰椎压缩实验比较见表4。在治疗4周后，经统计分析后发现，在腰椎压缩实验中，与灭菌水组相比较，LCA组（P＜0.05）及MTX组（P＜0.05）均有统计学差异，LCA组与MTX组相比也无统计学差异。在股骨三点弯曲实验中，与灭菌水组相比较，LCA组（P＜0.001）及MTX组（P＜0.001）均有统计学差异，LCA组与MTX组相比无统计学差异。表明化合物LCA对于松质骨强度和皮质骨强度具有明显改善的作用。

表4 各治疗组大鼠股骨三点弯曲实验及腰椎压缩实验比较

综上所述，化合物LCA对CIA大鼠关节炎症具有明显抑制作用，且能明显提高骨生物力学参数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚在制备可与细胞中MEK1蛋白和/或cathepsin K蛋白结合的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细胞为RAW264.7细胞或破骨细胞。

3.化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚在制备治疗关节炎症和/或关节软骨及骨质破坏的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的关节炎症为关节滑膜炎症。

5.化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚在制备治疗类风湿性关节炎、骨关节炎或骨质疏松的药物中的应用。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述的化合物9,9`-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5`-二甲氧基开环异落叶松树脂酚的结构式如(I)所示：

。