WO2010041746A1 - ピロリ菌増殖抑制剤 - Google Patents

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pylori
helicobacter pylori
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中山淳
白井孝
山ノ井孝
藤田雅也
森昌子
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財団法人野口研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a H. pylori growth inhibitor containing an N-acetylglucosamine ⁇ -linked sugar derivative that suppresses the growth of H. pylori that causes peptic ulcer, gastric cancer and the like.
  • Helicobacter pylori is a causative bacterium that causes peptic ulcer and chronic gastritis (Non-patent document 1, Non-patent document 2), and is estimated to be infected in half of the world population.
  • Helicobacter pylori is inhabited in the surface mucus secreted from the surface layer of the gastric mucosa, but not in the glandular mucus secreted from the mucosa or the deep mucosa.
  • This glandular mucus characteristically contains a GlcNAc ⁇ 1 ⁇ 4Gal ⁇ residue-containing O-glycan sugar chain having an N-acetylglucosamine ⁇ residue ( ⁇ GlcNAc residue) and a galactose residue (Gal residue). Therefore, it was suggested that this sugar chain may protect the gastric mucosa from infection with H. pylori.
  • the present inventors have found that a glycoprotein sugar chain to which a core biantennary O-glucan having an ⁇ GlcNAc residue at the non-reducing end is bound suppresses the growth of Helicobacter pylori. It has been clarified that it is an enzyme activity inhibition of glucosylcholesterol synthase (CHL ⁇ GcT) (Non-patent Document 3) possessed only by H. pylori (Non-patent Document 4).
  • CHL ⁇ GcT glucosylcholesterol synthase
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 4
  • Helicobacter pylori requires a glycosyl cholesterol component (CGL) for its growth, but because it cannot synthesize CGL itself, it ingests cholesterol from the outside world, adds glucose near the cell membrane of the fungus, and builds a cell wall.
  • glycoprotein sugar chain of O-glycan having such ⁇ GlcNAc residue has the property of inhibiting the construction of this cell wall, and therefore it can be expected to be applied as a growth inhibitor specific for H. pylori. It is a complex, high-molecular-weight glycoprotein sugar chain, and it must be prepared through complicated multi-steps under uncontrollable reaction conditions, and requires huge costs and large-scale production facilities, which is not practical.
  • Patent Document 1 discloses a Helicobacter pylori binding substance that is an oligosaccharide having a Gal ⁇ 3GlcNAc structure.
  • this substance is a polysaccharide and has a complicated structure, it must be prepared through multiple steps, and it cannot be easily prepared in large quantities.
  • the current treatment method for H. pylori infection is not based on these sugar chains, but is mainly sterilized by the combined use of one kind of proton pump inhibitor and two kinds of antibiotics.
  • Three-drug combination therapy has a problem in that resistant bacteria appear and recur, or side effects appear.
  • N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative has an excellent growth inhibitory effect against Helicobacter pylori and have already filed an application for Patent Document 2.
  • the present invention was made to solve the above-mentioned problems, contains a compound that specifically inhibits the growth of Helicobacter pylori, does not give rise to resistant bacteria, and is safe to eat and drink for a long time,
  • An object of the present invention is to provide a H. pylori growth inhibitor that can be easily produced in large quantities and can be used in foods and drinks and pharmaceutical preparations.
  • the present inventors have found that the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative has an even better H. pylori growth inhibitory effect than the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative, The present invention has been completed.
  • the H. pylori growth inhibitor which has been made to achieve the above object and is described in claim 1, has the following chemical formula (1): GlcNAc1- ⁇ -OY (1) (In the formula (1), Y represents an alkyl group, an alkoxyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aralkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, a carboxyl group, or an alkoxycarbonyl group) It contains a minyl ⁇ -linked monosaccharide derivative.
  • GlcNAc represents an N-acetylglucosaminyl group.
  • the food and drink according to claim 2 is characterized by containing the H. pylori growth inhibitor according to claim 1.
  • a pharmaceutical preparation according to claim 3 is characterized by containing the H. pylori growth inhibitor according to claim 1.
  • the H. pylori growth inhibitor containing the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative of the present invention inhibits the growth of H. pylori because the monosaccharide derivative inhibits glucosyl cholesterol synthase (CHL ⁇ GcT), It acts on the antibacterial. Even if this monosaccharide derivative is administered to humans, there is no fear of appearance of resistant bacteria as in the case of antibiotic administration. Since this monosaccharide derivative is a low molecular weight glucose derivative and does not have a complicated chemical structure, it can be easily produced and is suitable for mass industrial production.
  • the H. pylori growth inhibitor containing the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative has excellent anti-H. Pylori activity because this monosaccharide derivative inhibits the cell wall construction of H. pylori and suppresses the growth of H. pylori.
  • the H-pylori growth inhibitor which uses this N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative alone or in combination with antibiotics, can completely remove H. pylori from the stomach, or develop chronic gastritis / peptic ulcer -It can prevent the recurrence of gastric diseases such as gastric cancer and gastric malignant lymphoma.
  • N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative is present in the living body and specifically inhibits the growth of Helicobacter pylori, this growth inhibitor is highly safe for the human body. Is. Furthermore, N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivatives, especially ethyl ⁇ -N-acetylglucosaminide (GlcNAc1- ⁇ -O-Et), are contained in yeast extracts that are widely used as food additives. It has been confirmed that it is a safe food material based on eating experience, and can be used for products that are eaten and taken repeatedly for a long period of time with peace of mind.
  • GlcNAc1- ⁇ -O-Et ethyl ⁇ -N-acetylglucosaminide
  • the food and drink containing the H. pylori growth inhibitor of the present invention is useful for reducing, curing or preventing stomach diseases. Since the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative exhibits a strong H. pylori growth inhibitory action, an excellent anti-H. Pylori action can be obtained just by adding a small amount of H. pylori growth inhibitor to foods and drinks.
  • the pharmaceutical preparation containing the Helicobacter pylori growth inhibitor of the present invention is used for treatment, symptom relief, or prevention of gastric diseases such as chronic gastritis and gastric ulcers derived from Helicobacter pylori.
  • gastric diseases such as chronic gastritis and gastric ulcers derived from Helicobacter pylori.
  • this N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative expresses a strong H. pylori growth inhibitory action, it exhibits an excellent anti-H. Pylori action just by taking a small amount of this pharmaceutical preparation, no side effects appear, Useful for healing gastric diseases with medical treatment.
  • FIG. 2 is a graph showing the anti-H. Pylori action of a H. pylori growth inhibitor containing an N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative (GlcNAc1- ⁇ -O-Et) to which the present invention is applied. It is a graph which shows the anti- H. pylori action by N-acetylglucosamine (GlcNAc) of the application outside the present invention. It is a graph which shows the anti- H. pylori effect
  • FIG. 2 is a graph showing the anti-pylori action of an N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative (GlcNAc1- ⁇ -O-Et) outside the scope of the present invention.
  • 4 is a graph showing changes in body weight of gerbils with and without administration of an N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative (GlcNAc1- ⁇ -O-Et) not applied to the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the number of Helicobacter pylori colonies caused by the stomach of a gerbil with or without administration of an N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative (GlcNAc1- ⁇ -O-Et) not applied to the present invention.
  • the H. pylori growth inhibitor of the present invention contains an N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative and is an active ingredient in food additives and pharmaceutical preparations.
  • This N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative is represented by GlcNAc1- ⁇ -O—Y as shown in the above formula (1), and Y is an alkyl group, alkoxyl group, alkenyl group having 1 to 27 carbon atoms, An alkynyl group, an aralkyl group such as benzyl, an aryl group such as phenyl, a heteroaryl group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, a cholesterol group, and the like, and an N-acetylglucosaminyl (GlcNAc) group is ⁇ Has a combined structure.
  • the Helicobacter pylori growth inhibitor is an ethyl group-containing compound (GlcNAc1- ⁇ -O-Et) (Iwahara S, et al., Bioscience, biotechnology, which has been reported to exist in yeast extract as a food additive. Technology, and biochemistry (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry), 1993, Vol. 57, No. 10, p. 1779-1780) are preferred.
  • N-acetylglucosamine ⁇ -linked monosaccharide derivatives such as GlcNAc1- ⁇ -O-Et alone have an excellent growth inhibitory effect against H. pylori.
  • a culture solution having a concentration of 5 mM or more of this monosaccharide derivative coexists with H. pylori, growth of H. pylori is suppressed to 50% or less.
  • growth is suppressed to 5% or less.
  • This monosaccharide derivative is stable in the culture solution and does not decompose for several hours even in the stomach.
  • this N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative can be easily obtained by a one-step synthesis method, so that it can be produced on a large scale. Is possible.
  • this monosaccharide derivative is an aliphatic hydrocarbon group-substituted product of N-acetylglucosaminyl and is particularly stable because the substitution site is an ether bond.
  • this aliphatic hydrocarbon group such as an alkyl group is a very safe residue. Since this monosaccharide derivative has no residues harmful to the human body, its safety is particularly high and it can be included in foods and drinks and pharmaceutical preparations.
  • N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivatives are used as H. pylori growth inhibitors. These sugar derivatives may be used singly or in combination, and one of proton pump inhibitors such as lansoprazole and omeprazole and antibiotics such as amoxicillin and clarithromycin. Two types may be used in combination.
  • the H. pylori growth inhibitor containing these N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivatives is used as a food and drink additive to be added to food and drink.
  • the food and drink include foods such as dairy products such as yogurt and beverages such as water, cocoa and juice.
  • the food or drink preferably contains 0.02 to 1%, preferably 0.1 to 1%, of an N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative as an active ingredient for inhibiting H. pylori growth.
  • These foods and drinks are more preferably taken continuously, since the effect of suppressing the growth of Helicobacter pylori is enhanced and digestive diseases such as gastric diseases such as chronic gastritis can be prevented.
  • This H. pylori growth inhibitor is also used as a medicinal ingredient to be contained in a pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparation may be a tablet, capsule, granule, pill, emulsion, powder, syrup, solution, or injection.
  • Such pharmaceutical preparations may contain pharmaceutical ingredients such as excipients, distilled water and physiological saline, and other pharmaceutical ingredients. It is more preferable to take these pharmaceutical preparations once or continuously, since the effect of suppressing the growth of Helicobacter pylori is enhanced and digestive diseases such as gastric diseases such as chronic gastritis can be cured or alleviated.
  • the following is an example of synthesizing the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked sugar derivative of the present invention and preparing a Helicobacter pylori growth inhibitor and the like.
  • Example 1 (1.1 Chemical synthesis of GlcNAc1- ⁇ -O-Et (2)) Ethoxy 2-acetamido-2-deoxy-N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminide (GlcNAc1- ⁇ -O) which is an example of the N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivative of the chemical formula (1) to which the present invention is applied -Et (2)) will be described in detail. This derivative is synthesized as shown in chemical reaction formula (3) below.
  • N-acetyl-D-glucosamine (3.0131 g, 13.62 mmol) was placed in a 200 ml eggplant type flask, dissolved in EtOH (50.0 ml) into which HCl gas was blown, and a calcium chloride tube was attached and stirred at room temperature.
  • the reaction was confirmed by thin layer chromatography (TLC) (developing solvent: chloroform / methanol (3: 1)). After 17 hours, NaHCO 3 was added for neutralization, and then the inorganic substance was filtered through Celite. After concentration, pink crystals were precipitated. This was separated by flash silica gel column chromatography to obtain 2.4 g of ⁇ isomer and 0.6 g of ⁇ isomer as white crystals (yield: ⁇ isomer 75%, ⁇ isomer 19%).
  • a Helicobacter pylori inhibitor containing this GlcNAc1- ⁇ -O-Et (2) was prepared, and its biological effectiveness was evaluated as follows.
  • Example 2 (2.1 Preparation of H. pylori growth inhibitor containing GlcNAc1- ⁇ -O-Et (2) and confirmation of its anti-H. Pylori action: in vitro)
  • the effect of GlcNAc1- ⁇ -O-Et on H. pylori was confirmed by the following procedure.
  • Helicobacter pylori (ATCC 43504) cryopreserved in Brucella broth culture solution at ⁇ 80 ° C. was shaken in the same culture solution containing horse serum 10% (3 mL) at 35 ° C. and CO 2 15% for 40 hours. After observing the movement of the bacteria under a microscope, H. pylori which was a non-coccoid type was obtained.
  • OD (absorbance) 600 nm was measured, diluted to 4 ⁇ 10 7 in Mueller Hinton culture solution containing horse serum 5.5%, and a total of 3 mL was shaken and cultured at 35 ° C. and CO 2 15% for 24 hours. It checked with the back microscope and it was set as the culture liquid containing the Helicobacter pylori used for the test for confirming the effect of the said compound (bacteria concentration; 2 * 10 ⁇ 7 > / mL).
  • Mueller Hinton culture solutions containing 5% horse serum 6.25 mM, 12.5 mM, 25 mM, 50 mM and 100 mM of the above-mentioned GlcNAc1- ⁇ -O-Et and containing no H.
  • pylori were prepared. After adding and mixing with each culture medium containing H. pylori at a volume ratio of 1: 1 (total volume 100 ⁇ L, on 96-well plate), the cells were cultured at 35 ° C. and CO 2 15% for 96 hours. After culturing for a certain period of time, the concentration of the proliferated bacteria was measured at OD 600 nm, and the growth control effect was estimated by comparing the addition of the compound with the negative control without addition of the compound (control: cont in FIG. 1).
  • GlcNAc1- ⁇ -O-Et is a main body expressing the activity of inhibiting Helicobacter pylori growth, and its degradation product does not exhibit the activity of inhibiting Helicobacter pylori growth.
  • Example 3 (3.1 Preparation of H. pylori growth inhibitor containing GlcNAc1- ⁇ -O-Et (2) and confirmation of its anti-H. Pylori action: in vivo)
  • the antibacterial activity of GlcNAc derivatives against Helicobacter pylori was examined in vivo using a test system for oral infection of gerbils with Helicobacter pylori.
  • test substance As a test substance, an N-acetylglucosamine derivative (GlcNAc1- ⁇ -O-Et) was used at a concentration shown in the following group constitution.
  • Example 3 (Comparative Example 3) Instead of using 300 mg / kg / day of GlcNAc1- ⁇ -O-Et instead of 300 mg / kg / day of GlcNAc1- ⁇ -O-Et in Example 1 (see Table 1), In the same manner as in Example 2, the growth inhibitory effect, body weight change, general symptom observation, bacterial count measurement (number of colonies) were performed, and statistical processing was similarly performed. The result of the growth inhibitory effect is shown in FIG. 6, the result of the weight change is shown in FIG. 7, and the result of the bacterial count measurement is shown in FIG.
  • GlcNAc1- ⁇ -O-Et showed almost no H. pylori growth inhibitory effect in vitro compared to GlcNAc1- ⁇ -O-Et. Further, as apparent from FIG. 7, no significant difference in body weight increase was observed between the H. pylori growth inhibitor-administered group containing GlcNAc1- ⁇ -O-Et and the non-administered control group. No abnormalities of general symptoms were observed. As is apparent from FIG.
  • the Helicobacter pylori growth inhibitor can also be used as a food or drink or pharmaceutical preparation for inhibiting Helicobacter pylori growth.
  • N-acetylglucosaminyl ⁇ -linked monosaccharide derivatives are completely different from conventional antibiotics and exhibit antibacterial activity against H. pylori by a mechanism that suppresses the proliferation activity essential for the growth of all H. pylori. Useful as a fungicide.
  • the H. pylori growth inhibitor containing these sugar derivatives is useful as a supplement or a food or drink additive.
  • the food / beverage products containing the Helicobacter pylori growth inhibitor are useful as a functional food / beverage product and a health food / beverage product.
  • the pharmaceutical preparation containing the Helicobacter pylori growth inhibitor is useful as a medicine to reduce, cure or prevent gastrointestinal diseases caused by Helicobacter pylori, especially gastric diseases such as gastritis, gastric ulcer and duodenal ulcer. It is.

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Abstract

　特異的にピロリ菌増殖を抑制する化合物を含有し、耐性菌を生じさせず、長期間飲食又は服用しても安全であって、大量かつ簡便に製造でき、飲食品や医薬製剤に用いることができるピロリ菌増殖抑制剤を提供する。 　ピロリ菌増殖抑制剤は、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｙ　・・・（１） （式（１）中、Ｙは、アルキル基、アルコキシル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基を示す）で表されるＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有しているものである。

Description

ピロリ菌増殖抑制剤
　本発明は、消化性潰瘍や胃癌等の原因となるピロリ菌の増殖を抑制するＮ－アセチルグルコサミンβ結合糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤に関するものである。
　ヘリコバクターピロリ菌（Helicobacter　pylori）は、消化性潰瘍や慢性胃炎を発症させる原因菌であり（非特許文献１、非特許文献２）、世界人口の半数に感染しているものと推察されている。
　ピロリ菌は、胃粘膜の表層から分泌される表層粘液内に棲息しているが、粘膜中ないし粘膜深層から分泌される腺粘液中に棲息していない。この腺粘液は、Ｎ－アセチルグルコサミンα残基（αＧｌｃＮＡｃ残基）とガラクトース残基（Ｇａｌ残基）とを有するＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ－グリカンの糖鎖を特徴的に含んでいる。そのため、この糖鎖は、胃粘膜をピロリ菌感染から防御しているという可能性が、示唆されていた。
　本発明者らは、αＧｌｃＮＡｃ残基を非還元末端に有するコア２分岐型Ｏ－グルカンが結合した糖蛋白質糖鎖がピロリ菌の増殖を抑制することを見出し、さらに、この増殖抑制が、ヘリコバクター類(ピロリ菌を含む)のみが有するグルコシルコレステロール合成酵素(ＣＨＬαＧｃＴ)（非特許文献３）の酵素活性阻害であることを明らかにしている（非特許文献４）。ピロリ菌は、その増殖のためにグリコシルコレステロール成分（ＣＧＬ）を必須とするが、自らＣＧＬを合成できないため、外界からコレステロールを摂取し、菌の細胞膜付近でグルコースを付加して細胞壁を構築していると、考えられている。従ってこのようなαＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ－グリカンの糖蛋白質糖鎖は、この細胞壁の構築を阻害する性質があると推察されるから、ピロリ菌特異的な増殖抑制剤としての応用が期待できるが、複雑で高分子量の糖蛋白質糖鎖であり、制御し難い反応条件で煩雑な多工程を経て調製しなければならないうえ、莫大なコストと大掛かりな製造設備を必要とし、実用的ではない。
　また、特許文献１にＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造を有するオリゴ糖であるヘリコバクターピロリ結合性物質が開示されている。しかしこの物質は、多糖であって構造が複雑なため、多工程を経て調製しなければならないうえ、大量かつ簡便に調製できない。
　一方、現在のピロリ菌感染の治療法は、これらの糖鎖を用いたものではなく、１種類のプロトンポンプ阻害薬と２種類の抗生物質との３剤併用による除菌が中心である。３剤併用療法では、耐性菌が出現して再発したり、副作用が発現したりするという問題を有する。
　昨今の飲食品や医薬製剤に対して、特に健康保全性・安全性に関心が高まる中、安心して継続して飲食したり服用したりできる簡易な構造のピロリ菌増殖抑制剤の開発が、望まれていた。
　本発明者らは、Ｎ-アセチルグルコサミニルα結合単糖誘導体がピロリ菌に対して優れた増殖抑制効果を有していることを見出して、既に特許文献２の出願をしている。
　さらに優れたピロリ菌増殖抑制剤の開発が望まれる。
マーシャル　ビージェー（Marshall　BJ）ら、ランセット（Lancet）、1984年、第Ｉ巻、p.1311-1315 ピーク　アールエム　ジュニア（Peek　RM　Jr）ら、ネイチャー　レビューズ　キャンサー（Nature　Reviews　Cancer）、2002年、第2巻、p.28-37. ヒライ　ワイ（Hirai　Y）ら、ジャーナル　オヴ　バクテリオロジー（Journal　of　Bacteriology）、1995年、第177巻、p.5327-5333. カワクボ　エム（Kawakubo　M）ら、サイエンス（Science）、2004年、第305巻、p.1003-1006. 特表２００３－５１７０１５号公報 国際公開第２００８／０８４５６１号パンフレット
　本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、特異的にピロリ菌増殖を抑制する化合物を含有し、耐性菌を生じさせず、長期間飲食又は服用しても安全であって、大量かつ簡便に製造でき、飲食品や医薬製剤に用いることができるピロリ菌増殖抑制剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、Ｎ-アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体が、Ｎ-アセチルグルコサミニルα結合単糖誘導体よりもさらに優れたピロリ菌増殖抑制効果を有していることを見出して、本発明を完成した。
　前記の目的を達成するためになされたもので特許請求の範囲の請求項１に記載されたピロリ菌増殖抑制剤は、下記化学式（１）
　　　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｙ　　　・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、アルキル基、アルコキシル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基を示す）で表されるＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有していることを特徴とする。
　なお、化学式（１）中、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミニル基を示す。
　請求項２に記載の飲食品は、請求項１に記載のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいることを特徴とする。
　請求項３に記載の医薬製剤は、請求項１に記載のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいることを特徴とする。
　本発明のＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、その単糖誘導体がグルコシルコレステロール合成酵素（ＣＨＬαＧｃＴ）を阻害しピロリ菌の増殖を抑制するので、ピロリ菌に対して抗菌的に作用するというものである。この単糖誘導体をヒトに投与しても、抗生物質投与時のような耐性菌出現の恐れがない。この単糖誘導体は、低分子量のグルコース誘導体であって複雑な化学構造でないから、簡便に製造でき、大量の工業的生産に適している。
　Ｎ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、この単糖誘導体がピロリ菌の細胞壁構築を阻害してピロリ菌の増殖を抑制するので、優れた抗ピロリ菌活性の薬効を示す。
　このＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を単独で使用し、または抗生物質等と併用したピロリ菌増殖抑制剤は、ピロリ菌を胃内から完全に除去したり、慢性胃炎・消化性潰瘍・胃癌・胃悪性リンパ腫等の胃疾患の再発を防止したりすることができる。
　また、このＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体が、生体に存在するものであり、特異的にピロリ菌の増殖を抑制するものであるから、この増殖抑制剤は人体に対する安全性が高いものである。さらに、Ｎ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体、中でもエチルβ－Ｎ－アセチルグルコサミニド(ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ)は、食品添加物として広範に利用されている酵母エキス中に含有されていることが確かめられており、食経験上、安全な食材であることが明らかなことから、安心して、長期間、繰返し飲食や服用をする製品に用いることができる。
　本発明のピロリ菌増殖抑制剤を含有する飲食品は、胃疾患を軽減したり治癒したり予防したりするのに有用である。そのＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するから、飲食品にピロリ菌増殖抑制剤を少量添加するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏する。
　本発明のピロリ菌増殖抑制剤を含有する医薬製剤は、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患の治療・症状緩和・予防に用いられる。また、このＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するので、この医薬製剤を少量服用するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏し、副作用が発現せず、内科的治療で胃疾患を治癒するのに、有用である。
本発明を適用するＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体(ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ)を含有するピロリ菌増殖抑制剤による抗ピロリ菌作用を示すグラフである。 本発明の適用外のＮ－アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)による抗ピロリ菌作用を示すグラフである。 本発明の適用外のエタノールによる抗ピロリ菌作用を示すグラフである。 本発明を適用するＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体(ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ)を含有するピロリ菌増殖抑制剤の投与の有無の場合のスナネズミの体重変化を示すグラフである。 本発明を適用するＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体(ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ)を含有するピロリ菌増殖抑制剤の投与の有無によるスナネズミの摘出胃に起因するピロリ菌コロニー数を示すグラフである。 本発明の適用外のＮ－アセチルグルコサミニルα結合単糖誘導体(ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔ)による抗ピロリ菌作用を示すグラフである。 本発明の適用外のＮ－アセチルグルコサミニルα結合単糖誘導体(ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔ)の投与の有無の場合のスナネズミの体重変化を示すグラフである。 本発明の適用外のＮ－アセチルグルコサミニルα結合単糖誘導体(ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔ)の投与の有無によるスナネズミの摘出胃に起因するピロリ菌コロニー数を示すグラフである。
発明を実施するための好ましい形態
　以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
　本発明のピロリ菌増殖抑制剤は、Ｎ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有するもので、食品添加物や医薬製剤の有効成分となるものである。このＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体は、前記式（１）のとおりＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｙで示され、Ｙが、炭素数１～２７のアルキル基やアルコキシル基やアルケニル基やアルキニル基、ベンジルのようなアラルキル基、フェニルのようなアリール基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、コレステロール基等であるというもので、Ｎ－アセチルグルコサミニル(ＧｌｃＮＡｃ)基がβで結合した構造を持っている。
　また、ピロリ菌増殖抑制剤は、食品添加物として酵母エキス中に存在する報告がなされているエチル基を有する化合物(ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ)（イワハラ（Iwahara　S）他、バイオサイエンス,バイオテクノロジー,アンド　バイオケミストリー（Bioscience,　Biotechnology,　and　Biochemistry）、1993年、第57巻、第10号、p.1779-1780）が好ましい。
　Ｎ－アセチルグルコサミンβ結合単糖誘導体、例えばＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔは、単独でもピロリ菌に対して優れた増殖抑制効果を有している。この単糖誘導体の５ｍＭ以上の濃度の培養液がピロリ菌と共存している場合、ピロリ菌の増殖を５０％以下に抑える。特に２０ｍＭ以上の濃度の培養液では、増殖を５％以下に抑える。この単糖誘導体は、培養液中で安定であり、また胃内でも、数時間は分解しないものである。
　このＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体、特にＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔは、単糖であることに加えて、１段階の合成方法で簡便に得ることができるので、大規模な製造を可能とする。さらにこの単糖誘導体は、Ｎ－アセチルグルコサミニルの脂肪族炭化水素基置換体であって、その置換部位がエーテル結合であるので、とりわけ安定である。また、アルキル基のようなこの脂肪族炭化水素基は極めて安全な残基である。この単糖誘導体は、人体に有害な残基がないために、その安全性がとりわけ高く飲食品や医薬製剤に含ませることが可能なものである。
　これらのＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体は、ピロリ菌増殖抑制剤として用いられる。これらの糖誘導体は、単独で用いられてもよく、複数を混合して用いてもよく、またランソプラゾールやオメプラゾールのようなプロトンポンプ阻害薬の１種とアモキシシリンおよびクラリスロマイシンのような抗生物質の２種とを併用してもよい。
　これらのＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、飲食品に添加する飲食品添加剤として用いられる。飲食品として、ヨーグルト等の乳製品のような食品、水やココアやジュースのような飲料品が挙げられる。飲食品には、Ｎ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体をピロリ菌増殖抑制有効成分として０．０２～１％好ましくは０．１～１％含有していることが好ましい。これら飲食品は、継続して摂取するものであると、ピロリ菌増殖抑制効果が高まり、慢性胃炎のような胃疾患等の消化性疾患の予防をすることができるので、一層好ましい。
　このピロリ菌増殖抑制剤は、医薬製剤に含有させる薬効成分としても用いられる。医薬製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、乳剤、散剤、シロップ剤、液剤、又は注射剤であってもよい。このような医薬製剤は、賦形剤、蒸留水、生理食塩水等の製剤成分や、別な医薬成分を含んでいてもよい。これら医薬製剤を単回服用、又は継続服用すると、ピロリ菌増殖抑制効果が高まり、慢性胃炎のような胃疾患等の消化性疾患を治癒又は症状軽減をすることができるので、一層好ましい。
　以下に、本発明のＮ－アセチルグルコサミニルβ結合糖誘導体を合成し、ピロリ菌増殖抑制剤等を調製した例を示す。
（実施例１）
　(1.1　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)の化学合成）
　本発明を適用する前記化学式（１）のＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体の一例であるエトキシ２‐アセトアミド‐２-デオキシ-Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド（ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ（２））について詳細に説明する。この誘導体は、下記化学反応式（３）のようにして合成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン３．０１３１ｇ（１３．６２ｍｍｏｌ）を２００ｍｌナス型フラスコに入れ、ＨＣｌガスを吹き込んだＥｔＯＨ（５０．０ｍｌ）に溶解させ、塩化カルシウム管を取り付け室温で攪拌させた。反応の確認は、薄層クロマトグラフ(ＴＬＣ)(展開溶媒　クロロホルム／メタノール(３：１))で行った。１７時間後、ＮａＨＣＯ３を加え中和した後、無機物をセライト濾過し、濃縮後ピンク色の結晶が析出した。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離することで、α体２．４ｇ、β体０．６ｇをそれぞれ白色結晶として（収率：α体７５％、β体１９％）得た。
　(1.2　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)の同定)
　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)であるβ体生成物の確認は、６００ＭＨｚ－核磁気共鳴スペクトル法(ＮＭＲ)にて行った。
１Ｈ－ＮＭＲ(600MHz,　D2O);δ　1.03(1H,　dd,　J=6.9,　7.6Hz　-CH2CH 3),　1.91(1H,　s,　COCH 3),　3.30(1H,　dd,　J=6.9,　9.6Hz,　H-4),　3.31-3.34(1H,　m,　H-5),　3.40(1H,　dd,　J=8.2,　10.3Hz,　H-3),　3.52-3.56(2H,　m,　H-2　and　H-6a),　3.62(1H,　dd,　J=5.5,　12.4Hz,　CH2aCH3),　3.74-3.80(2H,　m,　H-6b　and　CH2bCH3),　4.41(1H,　d,　J=8.9Hz,　H-1)
１３Ｃ－ＮＭＲ(150MHz,　D2O);δ　15.3(-CH2 CH3),　23.2(CH3CO),　56.7(C-2),　61.9(-CH2CH3),　67.3(C-6),　71.0(C-5),　75.1(C-3),　77.0(C-4),　101.8(C-1),　175.7(CH3 CO)
　この分光学的データは、このβ体生成物がＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)であることを支持する。
　このＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)を含有するピロリ菌抑制剤を調製し、その生物学的有効性評価について、以下のようにして検討した。
（実施例２）
　(2.1　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)を含有するピロリ菌増殖抑制剤の調製、及びその抗ピロリ菌作用の確認：in　vitro)
　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔのピロリ菌への効果を以下の手順で確認した。－８０℃でブルセラブロス培養液中に凍結保存されているピロリ菌(ＡＴＣＣ　４３５０４)を、ウマ血清１０％入り同培養液中（３ｍＬ）で３５℃、ＣＯ２１５％で４０時間震盪培養し、顕微鏡下で菌の動きを観察した後、非コッコイド型であるピロリ菌を得た。ＯＤ（吸光度）６００ｎｍを測定し、ウマ血清５．５％入りミューラーヒントン培養液に菌数４×１０７になるように希釈し、計３ｍＬを３５℃、ＣＯ２１５％で２４時間震盪培養した後顕微鏡で確認し、上記化合物の効果を確認するための試験に用いるピロリ菌含有培養液（菌濃度；２×１０７／ｍＬ）とした。一方、上記のＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの６．２５ｍＭ，１２．５ｍＭ，２５ｍＭ，５０ｍＭ及び１００ｍＭのウマ血清５％入りであってピロリ菌を含有しないミューラーヒントン培養液をそれぞれ作製し、これらをそれぞれのピロリ菌含有培養液に体積比１：１（全容積１００μＬ、９６ｗｅｌｌプレート上）で添加、混和した後、３５℃、ＣＯ２１５％で、９６時間培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、化合物を添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図１中のコントロール：ｃｏｎｔ）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。
　(2.2　in　vitroでのピロリ菌の増殖抑制の結果)
　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔを用いた結果を図１に示す。図１から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔを２５～５０ｍＭ以上添加した場合、ピロリ菌の増殖が５０％以上阻害されることが示された。
　(2.3　in　vitroでのＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの分解の結果)
　培養開始から３日後のピロリ菌含有培養液に含まれているＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔについて所定量を高速液体クロマトグラフィーで測定し、予め作成した所定量の各種濃度とそれの高速液体クロマトグラムの面積とによる検量線から、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの濃度を換算した結果、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの初期濃度の６％が消失していた。このことから、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔのうちの６％が、ＧｌｃＮＡｃとエタノール(ＥｔＯＨ)とに分解したことが分かった。
（比較例１）
　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの分解産物であるＧｌｃＮＡｃが、ピロリ菌の増殖抑制効果を有しないことを確認するため、実施例２のＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－ＥｔをＧｌｃＮＡｃに変更した以外は、実施例２と同様の手順でピロリ菌を培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、ＧｌｃＮＡｃを添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図２中のコントロール：ｃｏｎｔ）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。
　ＧｌｃＮＡｃを用いた結果を図２に示す。図２から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔが分解して生じたＧｌｃＮＡｃは、５０ｍＭもの極高濃度にしても、ピロリ菌の増殖抑制効果がないことが示された。
（比較例２）
　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの分解産物であるエタノールが、ピロリ菌の増殖抑制効果を有しないことを確認するため、実施例２のＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔをエタノールの１．２５容量％（２１４ｍＭ）、２.５容量％（４２８ｍＭ）、５容量％（８５６ｍＭ）に変更した以外は実施例２と同様の手順でピロリ菌を培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、エタノールを添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図３中のコントロール：ｃｏｎｔ）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。
　エタノールを用いた結果を図３に示す。図３から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔが分解して生じたエタノールは、５容量％もの極高濃度にしなければ、ピロリ菌の増殖抑制効果がないことが示された。
　したがって、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔがピロリ菌増殖抑制の活性発現本体であり、その分解産物はピロリ菌増殖抑制の活性を発現しないことが示された。
（実施例３）
　(3.1　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)を含有するピロリ菌増殖抑制剤の調製、及びその抗ピロリ菌作用の確認：in　vivo)
　スナネズミのヘリコバクターピロリ菌経口感染の試験系を用い、ＧｌｃＮＡｃ誘導体のヘリコバクターピロリ菌に対する抗菌作用をin　vivoで検討した。
　(3.2(1)　実験動物）
　九動吉冨（株）より４週齢で購入した雄性スナネズミ（ＳＰＦ）を２３日間予備飼育して実験に供した。スナネズミは予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％の感染動物飼育室（照明時間７時～１９時、換気回数１８回／時）で飼育した。スナネズミは２～３匹／ケージとし、飲水は精製水を、飼料は粉末飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業(株)製）を、それぞれ自由に与えた。また、スナネズミは色素（ピクリン酸溶液）塗布法で個体識別した。
　(3.2(2)　感染菌株および菌液の調製）
　感染菌株としてヘリコバクターピロリの標準菌株（ＡＴＣＣ　４３５０４株）を使用した。保存菌株に１０％ウマ血清（大日本住友製薬(株)製）を含むブレイン－ハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（日水製薬(株)製）を加えて復元し、同培地中で３７℃の微好気条件下（微好気培養装置使用）で３日間培養し、約５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度とした。
　(3.2(3)　ヘリコバクターピロリの感染方法）
　ヘリコバクターピロリ感染の２４時間前より感染４時間後まで絶食した。この絶食したスナネズミにヘリコバクターピロリ培養液の１．０ｍｌ（目標）を経口投与した（５×１０６ＣＦＵ／ａｎｉｍａｌ目標）。なお、感染日を第０日とする。
　(3.2(4)　被験物質の調製および投与）
　被験物質としてＮ－アセチルグルコサミン誘導体（ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ）を下記群構成に示した濃度で用いた。
　(3.2(5)　群構成）
　動物数：１０匹／群
　投与方法：混餌
　投与量：粉末飼料へ０．３％混合
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　(3.3　検査項目)
　(3.3(1)　体重)
　感染日を第０日とし、第１，３，６，１０，１３，１７，２０，２４および２６日に、体重計で測定した。その結果を図４に示す。
　(3.3(2)　一般症状)
　一般症状の変化を毎日観察した。
　(3.3(3)　菌数測定（コロニー数）)
　各群１０匹から胃を摘出しリン酸緩衝液（ＰＢＳ－）５ｍｌを含む遠心管に入れ、ポリトロンホモジナイザーで均質化した。そのホモジネート０．１ｍｌをポアＶｉヘリコ－Ｓ寒天培地（栄研化学(株)製）に塗抹し前培養と同様な３７℃の微好気条件で７日間以上培養後、形成された紫色のコロニーを計数した。
　(3.4　統計処理)
　体重およびコロニー数は群毎の平均値±標準誤差を算出した。対照群に対する各群の統計的有意差を検定するため、解析ソフト(エクセル統計２００６，社会情報サービス)を用いＢａｒｔｌｅｔｔ検定で等分散性を確認した後、Ｄｕｎｎｅｔｔ法で各群を比較した。等分散性が確認できなかった場合は、値を対数変換して同様にＤｕｎｎｅｔｔ法で各群を比較した。いずれの場合もｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意であるとする。その結果を図５に示す。
　(3.5　in　vivoでの結果)
　ピロリ菌生育が環境に相当左右されることから、ピロリ菌増殖抑制剤投与群と、非投与である対照群との相対比較を行う必要がある。図４から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ（２）を含有するピロリ菌増殖抑制剤投与群と、非投与である対照群とで、体重の増加に有意差は認められず、外見上の一般症状の異常も認められなかった。図５(a)から明らかな通り、図４の体重変化と表１の推定投与量から算出したＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに相当する一日当りの投与量２０ｍｇ／ｄａｙが、対照群に比べ、ピロリ菌数を１／２～１／３に低減させていることを見出した。一方、同図(a)に示すように、各群で数匹の異常に高いピロリ残存菌数を持つ個体があったため、危険度は高いがこれらの値をはずれ値として考え、スミルノフ・グラブス検定によって、はずれ値を除外すると、図５(ｂ)のようにＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔ(２)を含有するピロリ菌増殖抑制剤投与群が、対照群に比べて１／６に抑えていることがわかった。
（比較例３）
　実施例１のＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔの投与量３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（表１参照）に代えて、ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔを３００、又は１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ用いたこと以外は、実施例２と同様にして、増殖抑制効果、体重変化、一般症状観察、菌数測定（コロニー数）を行い、同様に統計処理した。増殖抑制効果の結果を図６に示し、体重変化の結果を図７に示し、菌数測定の結果を図８に示す。
　図６から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔには、ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｅｔに比べ、in　vitroで、殆どピロリ菌増殖抑制効果は認められなかった。また、図７から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔを含有するピロリ菌増殖抑制剤投与群と、非投与である対照群とで、体重の増加に有意差は認められず、外見上の一般症状の異常も認められなかった。図８から明らかな通り、in　vivoで、ＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔの低投与量の３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが、対照群と有意差が無かったが、それより遥かに高投与量のＧｌｃＮＡｃ１－α－Ｏ－Ｅｔの１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙでようやく、対照群と有意差が認められ、対照群に比べ、ピロリ菌数を１／３に抑えていた。
　従って、ピロリ菌増殖抑制剤は、ピロリ菌増殖抑制飲食品や医薬製剤としても、用いられることが示された。
　Ｎ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体は、従来の抗生物質とは全く異なり、あらゆるピロリ菌の生育に必須の増殖活動を抑制するという機序でピロリ菌に対する抗菌作用を示すから、抗ピロリ菌剤として有用である。
　これらの糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、サプリメントや飲食品添加物として有用である。またそのピロリ菌増殖抑制剤を含有する飲食品は、機能性飲食品や健康飲食品として有用である。そのピロリ菌増殖抑制剤を含有する医薬製剤は、ピロリ菌に起因する消化器系疾患、特に胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍のような胃疾患を軽減したり治癒したり予防したりする医薬品として、有用である。

Claims (3)

  1. 　下記化学式（１）
    　　　ＧｌｃＮＡｃ１－β－Ｏ－Ｙ　　　・・・（１）
    （式（１）中、Ｙは、アルキル基、アルコキシル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基を示す）で表されるＮ－アセチルグルコサミニルβ結合単糖誘導体を含有していることを特徴とするピロリ菌増殖抑制剤。
  2. 　請求項１に記載のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいることを特徴とする飲食品。
  3. 　請求項１に記載のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいることを特徴とする医薬製剤。
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