WO2009133302A1 - Dispositif et procede d'analyse exaltee d'un echantillon de particules - Google Patents

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WO2009133302A1
WO2009133302A1 PCT/FR2009/000432 FR2009000432W WO2009133302A1 WO 2009133302 A1 WO2009133302 A1 WO 2009133302A1 FR 2009000432 W FR2009000432 W FR 2009000432W WO 2009133302 A1 WO2009133302 A1 WO 2009133302A1
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light beam
analysis device
sample
excitation light
focusing
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PCT/FR2009/000432
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Hervé RIGNEAULT
Jérôme WENGER
Davy Gerard
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Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs -
Universite Paul Cezanne Marseille Iii
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Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for exalted analysis of a sample of particles.
  • the present invention relates to the field of devices for analyzing luminescent or optically diffusing particles.
  • a device for analyzing a sample of particles in solution comprising a microscopy system, said microscopy system comprising means for supporting said sample, illumination means capable of emitting a beam excitation light, focusing means of said excitation light beam at a focusing point at the sample and spatial filtering means able to define a volume of analysis around the focusing point.
  • Such a device is intended to be used in any type of optical analysis application on particles having a luminescence or diffusion marking, that is to say having a determined response in luminescence or diffusion to excitatory light.
  • the particles to be analyzed are molecules or molecular assemblies, for example molecular complexes, nanocrystals or nanobeads, and have dimensions smaller than the wavelength of the light emitted by the illumination means. It finds particularly its application in the field of the detection of fluorescent molecules in solution, and more particularly in fluorescence correlation spectroscopy. It also finds an application in biological tests and more specifically the microarray DNA or protein test.
  • the state of the art in this field comprises analysis devices comprising a confocal microscopy system.
  • a system aims to analyze a sample, for example particles in solution, luminescent or optically diffusing.
  • the system comprises a laser source emitting a laser beam at a given wavelength, a dichroic mirror, a microscope objective having a very high magnification and numerical aperture, optical imaging means, spatial filtering means and a detector.
  • the laser beam is made convergent by the objective into a focusing point located at the level of the analysis volume that one wishes to analyze.
  • the light of the focused laser beam is then absorbed by the particles and then reemitted at a wavelength greater than that of the laser beam and then directed to the detector level.
  • the optical imaging means are arranged so as to combine the focusing point of the laser beam with the detector.
  • the spatial filtering means make it possible to delimit an analysis volume and thus obtain a spatial resolution of less than one micrometer.
  • They comprise an opening disposed upstream of the detector, in a plane conjugated to the focal plane of the microscope objective. In this way, only the photons located in a volume around the focusing point of the laser beam participate in the formation of the image at the detector.
  • a correlator is connected to the detector in order to analyze the temporal fluctuations of the fluorescent light emitted by the analysis volume, so as to perform detection by spectroscopy.
  • fluorescence correlation FCS
  • the fluorescence as well as the temporal fluctuations thereof are thus analyzed.
  • These fluctuations are directly related to the diffusion of fluophores through the volume of analysis.
  • the autocorrelation function of the detected luminous intensity makes it possible to have access to the photophysical parameters of the emitters as well as to the average number of molecules detected. At long times, this function gives information on the average residence time - the diffusion time - of the molecules and their diffusion mode through the analysis volume.
  • Such a device makes it possible to benefit from a large opening in order to collect the maximum of light and therefore of fluorescence, as well as to reduce the volume of analysis and consequently to reduce the diffusion noise in the solution. Nevertheless, for an application where it is desired to have an analysis resolution on a single molecule, such a device has several drawbacks. Indeed, the diffraction phenomena set a fundamental limit to the size of the focal spot of the laser, and therefore to the size of the analysis volume. These phenomena lead to limitations on the count rate per molecule at fixed power and on the maximum concentration for the detection of single molecules, since one seeks to analyze only one molecule per volume of analysis.
  • a device for measuring a sample by correlation spectroscopy comprises a confocal microscope comprising an optical focusing system whose field defines a collection volume - or analysis volume - means capable of producing a beam of light. excitation and directing it on the sample through the microscope, means for detecting the intensity of the luminous flux produced by the interaction of the excitation beam on the sample and collected by the microscope, as well as means signal processing produced by the detection means.
  • This device also comprises a photonic structure increasing the collected luminous flux, placed at the focus of the optical microscope focusing system and forming interference fringes in the collection volume.
  • This photonic structure may be for example a dielectric mirror resistant to water and consisting of a stack of layers of very small optical thickness. It is placed at the focus of the optical focusing system of the microscope to form interference fringes in the collection volume.
  • the implementation of this structure makes it possible, on the one hand, to significantly increase the signal collected per molecule and, on the other hand, to solve the problem of defining the collection volume.
  • the disadvantage of this solution lies in the difficulty of obtaining a sufficient rejection of the noise induced by the reflection of the excitation beam on the mirror and the parasitic luminescence induced in the mirror.
  • the maximum reduction The volume of analysis that can be obtained is about 3, which does not bring a substantial gain in practical applications.
  • the object of the present invention is to remedy these technical problems by allowing the significant reduction of the analysis volume so that it contains only a quantity of molecules up to unit and by the implementation of means of exaltation of both the excitation light beam and the collection of emitted luminescence.
  • These excitation means are arranged in such a way as to make the focal field defined by the excitation light beam at the level of the sample more intense and more condensed, this field being capable of reaching dimensions smaller than the diffraction limit, which allows the analysis on a volume lower than the femtolitre and thus likely to contain only one molecule in solutions of high concentrations (higher than 10 nanomolar).
  • the approach of the solution consisted in implementing nanophotonic emission devices - called “photonic jet” - in order to reduce the focal field defined by the excitation light beam at the level of the sample and to increase the collection efficiency of the emitted light.
  • the state of the art of this type of device comprises a microbead disposed in the path of a collimated beam in order to focus this beam. This confers on said beam a small divergence, as well as an invariance along its axis, with respect to a normal beam, capable of diffracting significantly over a small area.
  • This type of device is therefore apparently not compatible with use on a highly focused light beam path, such as the excitation light beam of a microscopy analysis device, rendered converging at a focusing point.
  • the study of the behavior of the excitation light beam crossing in part such a nanophotonic emission device, as well as its implementation have made it possible to demonstrate a significant reduction in the volume of analysis on the sample.
  • the subject of the invention is an analysis device of the above-mentioned type in which, in addition to the features already mentioned, the microscopy system also comprises means for exalting said excitation light beam, said means exaltation having a strictly positive focus and a refractive index greater than the refractive index of said sample, at least a portion of said enhancement means being disposed in the path of said excitation light beam downstream of said support means and upstream of said focus point, at least a portion of said enhancement means not being integral with the support means.
  • the exaltation means thus implemented make it possible to over-focus the excitation light beam into a zone of smaller dimensions than the initial analysis volume. Indeed, the portion of the incident light beam passing through the exaltation means converges in a zone adjacent to said enhancement means, this area being made narrower by the focal length and the refractive index of said exciting means. The part of the light beam that does not pass through the said means of exaltation will interfere with the part that went through them according to a phenomenon of destructive interference. Most of the light intensity of the incident beam is thus concentrated in a volume of longitudinal dimension of the order of half the wavelength and axial dimension of the order of the wavelength, therefore of dimensions less than the diffraction limit.
  • the response light beam produced in response to the interaction of the excitation light beam on the sample and collected by the focusing means , is privilegedly directed in one or more specific directions of space.
  • the particles will emit light in a privileged way towards the means of exaltation because its refractive index is the largest.
  • an even higher light response flow will be collected and detected, which also allows to exalt also the collection of emitted luminescence.
  • the analysis device thus constituted by the combination of the excitation means with a conventional microscopy system comprising spatial filtering means, thus makes it possible to significantly reduce the volume of analysis at the level of the sample to analyze single molecules, while concentrating the excitation light beam in this volume so as to benefit from a signal collection per molecule sufficient for analysis, for example for correlation spectroscopy applications.
  • the microstructured interface defined by the means of exaltation can be simple to manufacture and extended on a large scale.
  • at least part of the exaltation means is integral with the support means.
  • the portion of the integral extinguishing means of the support means is constituted by a projection on said support means, said projection having a strictly positive curvature.
  • the part of the non-integral exaltation means of the support means comprises at least one microlens, the part of the non-integral exaltation means of the support means comprises at least one microdrop, and
  • the part of the non-integral exaltation means of the support means comprises at least one microbead.
  • the (or) microbead (s) has a diameter substantially between 1 and 5 micrometers. This makes it possible to optimally focus the light intensity of the excitation light beam in a small analysis volume. In order to optimally optimize the dimensions of the analysis volume, it is expected that the (or) microbead (s) has a diameter substantially equal to 2 micrometers.
  • the exaltation means are axially centered on the axis of the excitation light beam
  • the exaltation means are centered longitudinally on the focusing point of the excitation light beam.
  • the means of exaltation are covered at least in part by at least a thin metallic layer.
  • the microscopy system also comprises means for detecting the intensity of the response light beam produced in response to the interaction of the excitation light beam on the sample and collected by the focusing means. This makes it possible to perform measurements only on the analysis volume, by measuring the luminous intensity received by the detection means in response to the excitation of the particles of the sample contained in the analysis volume.
  • the microscopy system also comprises signal processing means provided by the detection means. This allows measurements not only of light response, but also temporal fluctuations of this light response, giving access to a significantly larger number of information on the particles contained in the sample.
  • the support means consist of a glass substrate.
  • the illumination means consist of a laser source. Upstream of the focusing means, there is thus a collimated, monochromatic excitation light beam of good optical wavefront quality.
  • the focusing means it is expected that they consist of a high numerical aperture objective (typically greater than 0.7).
  • a second embodiment of said focusing means it is expected that they consist of a low numerical aperture lens (typically less than 0.7).
  • the focusing means it is expected that they consist of a high numerical aperture objective (typically greater than 0.7).
  • a second embodiment of said focusing means it is expected that they consist of a low numerical aperture lens (typically less than 0.7).
  • the microscopy system is confocal, the spatial filtering means comprising an opening of variable size. This makes it possible to adjust the size of the analysis volume, which in combination with the exaltation means, allows the significant reduction of the analysis volume.
  • the excitation means of the excitation light beam are arranged in parallel. This makes it possible to have a volume of analysis covering a large but thin surface. Detection can then be done with a sensor comprising a plurality of pixels.
  • the present invention also relates to a method for analyzing a sample of particles in solution by an analysis device comprising a microscopy system, said microscopy system comprising means for supporting said sample, illumination means capable of emitting an excitation light beam, focusing means of said excitation light beam at a focusing point at the sample and spatial filtering means able to define a volume of analysis around the focusing point, characterized in that that: at least a part of said excitation light beam is exalted downstream of said support means and upstream of said focusing point by a strictly convergent focusing and a refraction index greater than the refractive index of said sample, at least a part of which is not integral with said support means, and the intensity of the light beam of response is measured e as a function of time, said response light beam being derived from the interaction of the excitation light beam with the sample at the level of the analysis volume.
  • FIG. 1 a diagram of a fluorescence correlation spectroscopy analysis device according to a first embodiment of the invention
  • FIGS. 2A to 2D various embodiments of the excitation means according to FIG. invention
  • FIG. 3 is a diagram of a fluorescence correlation spectroscopy analysis device according to a second embodiment of the invention.
  • focusing point of the excitation light beam is meant the point of focus of the beam when no part of the beam passes through at least a portion of the excitation means.
  • it may be said, for example, of some of the means of exaltation that it is arranged upstream of the focusing point of the excitation light beam, so as to understand that the center of this portion of the excitation means is disposed upstream of the beam focusing point if There was no means of exaltation.
  • FIG. 1 represents a diagram of a fluorescence correlation spectroscopy analysis device according to a first embodiment of the invention.
  • the analysis device aims to analyze a sample 2.
  • This sample can be a liquid medium, gaseous, or a biological object containing particles to be analyzed.
  • the particles to be analyzed are molecules or molecular assemblies, for example molecular complexes, nanocrystals or nanobeads, and have dimensions smaller than the wavelength of the light emitted by the illumination means.
  • the analysis device comprises a confocal microscopy system 1.
  • This system is an arrangement comprising support means 3, illumination 4, focusing 5, dichroic separation 6, spatial filtering 7, detection 8, treatment 9 and exaltation 14.
  • the support means 3 consist of a glass substrate.
  • This substrate may be a microscope slide having a thickness of between 100 and 200 microns.
  • This substrate supports the sample 2, which is advantageously enclosed in a sealed box whose side walls are formed by self-adhesive wedges of thickness between 50 and 100 microns and resistant to water. The substrate is thus disposed at the top of said sealed box.
  • the illumination means 4 emit an excitation light beam 10.
  • This beam 10 is collimated at the output of the illumination means 4.
  • These means advantageously consist of a laser.
  • the laser may be a diode-pumped solid laser operating at a wavelength of 488 nanometers or a helium-neon laser operating at a wavelength of 633 nanometers.
  • the excitation light beam 10 is directed towards the dichroic separation means 6.
  • These means 6 are advantageously constituted by a dichroic filter of the notch type. This filter is chosen so that its cut-off wavelength and its bandwidth make it possible to reflect the excitation light beam 10 and to transmit the response light beam 11.
  • the wavelength of the response beam 11 is indeed higher than that of the excitation beam 10 since the particles are fluorescent.
  • the light response is expected at 670 nanometers, which imposes a cut-off wavelength of the dichroic filter of the order of 640 nanometers.
  • This filter is also chosen so as to have a maximum transmission factor for the wavelength of the response beam 11.
  • the dichroic filter is arranged at 45 ° of the incident excitation beam 10.
  • the dichroic filter can thus direct, after reflection on the dichroic separation means 6, the excitation light beam 10 to the focusing means 5.
  • These means 5 are able to direct the beam towards a focusing point 12 on the sample 2 through the confocal microscopy system 1.
  • These means 5 are for that purpose constituted of an objective or a lens.
  • the focusing means 5 consist of a microscope objective.
  • This objective is for example an apochromatic objective having a magnification of 40x and a numerical aperture of 1, 2.
  • This high numerical aperture makes it possible to collect an optimal light intensity in response to the excitation by the light beam 10. The focusing and collection efficiency are then made optimal.
  • the focusing means 5 consist of a lens.
  • This type of focusing means has a low numerical aperture, which does not make it possible to optimally exploit the additional effect obtained by the excitement means 14. Nevertheless, for a lower cost than a microscope objective, the low efficiency of focusing and collection are compensated by the means of exaltation 14.
  • the focused excitation light beam 10 thus interacts with particles in solution in sample 2 according to a fluorescence phenomenon.
  • each excited particle will emit fluorescence a light response at a wavelength greater than that of the excitation beam 10.
  • Part of this light response is then collected by the focusing means 5 so as to form a light beam of answer 11.
  • This response light beam 11 is sent to the detection means 8 through the respective focus 5, dichroic separation 6 and spatial filtering means 7.
  • the cutoff wavelength of the dichroic filter is indeed chosen so as to transmitting the response light beam 11, whose wavelength is greater than that of the excitation beam 10.
  • the spatial filtering means further comprise a set of lenses 7 ' and 7 '"enabling the focal plane of the focusing means 5 to be combined with the capture plane of the detection means 8.
  • the spatial filtering means 7 also comprise an aperture 7 "of adjustable size, which opening is disposed along the axis 15 of the response light beam 11. It is optically conjugated with the focusing point 12 of the focusing means 5. It allows selecting a detection volume - or spatial filtering volume - around the focusing point 12, since light rays not coming from this spatial filtering volume do not pass through the opening 7 ". The dimensions of the detection zone are all the shorter as those of the opening 7 "are also so.
  • the assembly 7 consisting of elements 7 ', 7" and 7' "thus forms a pinhole having a variable opening 7 placed in an intermediate image plane so that the microscopy system conjugates the focusing point 12 of the excitation beam 10 with the variable aperture 7 "of the pinhole camera.
  • the spatial filtering means 7 do not comprise an opening 7 ", they may in fact be made up of other elements that make it possible to carry out spatial filtering, and the microscopy system thus implemented does not is more of a confocal type, these elements can be for example:
  • the detection means their surface being small, of the order of a few tens of micrometers in diameter, or - the excitation beam itself, in the case of a two-photon excitation.
  • the detection means 8 make it possible to measure the intensity of the response light flux 11 produced by the interaction of the excitation beam 10 on the sample 2 and collected by the microscopy system 1.
  • these means 8 comprise electron amplification photodetectors.
  • These photodetectors are advantageously photodiodes operating in avalanche or cascade - APD (avalanche photodiode, or "avalanche photodiode” in the Anglo-Saxon language). These photodetectors may also be photomultipliers.
  • these detection means 8 comprise photodetectors with optical amplification, cooled CCD or CMOS cameras, for example with liquid air or Peltier element.
  • These detection means 8 can operate in two reading modes.
  • the detection is carried out according to a continuous regime, where the optical signal emitted by the targets is detected by integrating the signal for each pixel or group of pixels - in the case where the detection means comprise several pixels - of the detector. Radiometric measurements are then also possible between several pixels or groups of pixels.
  • the detection is carried out according to a time regime where the detector integrates the signal over short time ranges with respect to the process to be analyzed. The information is then given by the analysis of this temporal trace.
  • the signal from these detection means 8 is sent to the signal processing means 9.
  • These means 9 advantageously comprise a counter and a correlator that allows to digitally process the received data.
  • the counter realizes the recording of the value of the received fluorescence luminous intensity and the correlator performs the temporal analysis of the fluctuations of the received fluorescence luminous intensity. This analysis can be done at short and long times so as to obtain additional information on the particles in solution in sample 2.
  • the autocorrelation function of the detected light intensity makes it possible to access the photophysical parameters of the emitters as well as the average number of molecules detected. At long times, this function gives information on the average residence time - diffusion time - of the molecules and their mode of diffusion through the spatial filtering volume.
  • the excitation means 14 make it possible to modify the shape of the excitation light beam 10 so as to exalt the luminous flux and thus concentrate it in an analysis volume of smaller dimensions.
  • the excitation means 14 are arranged in the path of the excitation light beam downstream of the support means 3 and upstream of the focusing point 12.
  • exaltation means 14 have a strictly positive focal length and a refractive index greater than the refractive index of said sample 2. Under these conditions, the portion of the incident light beam 10 which passes through the excitation means 14 converges in a zone adjacent to said enhancement means 14. This zone is made narrower because their focal length is strictly positive and their refractive index is greater than that of the solution in the sample 2. The portion of the light beam 10 that does not pass through said means of exaltation 14 will interfere with the part that has passed through them according to a phenomenon of destructive interference.
  • Most of the light intensity of the incident beam 10 is thus concentrated in a volume of longitudinal dimension of the order of half the wavelength and axial dimension of the order of the wavelength, so smaller than the diffraction limit, which makes it possible to reach a volume of analysis less than one-tenth of femtoliter.
  • the response light beam 11 is directed in a privileged manner so that the light or re-emitted towards the means of exaltation 14.
  • the excitation means 14 thus constitute a microstructured interface between the support means 3 and the focusing point 12 of the excitation beam 10, so as to reduce the dimensions of the analysis volume to be detected and to concentrate a luminous intensity thereon. superior to that without means of exaltation.
  • the exaltation means 14 have micrometric dimensions, of the order of 1 to 5 micrometers, and a high refractive index, of the order of 1, 4 to 1, 6.
  • the exaltation means 14 are not integral with the support means 3, are at least partially integral with said support means 3, or are entirely integral with said support means 3.
  • the exaltation means 14 are integral with the support means 3.
  • the exaltation means thus consist of a projection 14 'on the support means 3.
  • This projection presents a strictly positive curvature so that the focal length of the thus constituted means of exaltation is strictly positive.
  • the exaltation means 14 are not integral with the support means 3.
  • the microstructured interface thus constituted of the exaltation means 14 can be manufactured by dispersing said means 14 on the glass substrate of the support means 3.
  • the enhancement means 14 "consist of a convergent microlens.
  • This lens of micrometric dimensions, advantageously has a high focal length so as to best focus the light flux from the excitation beam 10 in an area as close as possible to the lens, this area is thus all the more isolated from the rest of the sample 2 where other particles are likely to be excited.
  • the exaltation means 14 "consist of a microdrop: the focal length of this micrometric drop advantageously has a high curvature in order to best concentrate the light flux from the beam excitation 10 in an area as close as possible to the drop.
  • the excitation means 14 preferably consist of a microbead.
  • This microbead is a dielectric ball of high refractive index and micrometric dimensions.
  • This ball may be made for example of latex or polystyrene, whose index is 1, 6 and which also has the advantage of being more flexible than the glass so as not to be damaged during the manufacture of the microstructured interface.
  • the microbead has the advantage of have very high curvatures, which makes it possible to optimally focus the light intensity of the excitation beam in a small analysis volume
  • the diameter of a microbead is between 1 and 5 micrometers, and preferably of 2 micrometers.
  • the exaltation means 14 may comprise both an integral part 14 'and a non-integral part 14 "of the support means 3.
  • said enhancement means 14 are advantageously axially centered on the axis 15 of the excitation light beam 10. They are also advantageously centered longitudinally on the focusing point 12 of the excitation light beam 10. These centering means of excitation 14 with respect to the excitation light beam 10 make it possible to exalt said beam 10 optimally.
  • the exciting means 14 are covered at least in part with at least one thin metal layer.
  • the metal used for this layer is a metal selected from aluminum and noble metals, such as gold, silver, copper and nickel.
  • the thickness of this layer is advantageously less than or equal to 30 nanometers in order to avoid having a too opaque layer which significantly reduces the transmission of the microscopy system.
  • This thin metal layer may be for example a gold layer, of thickness equal to 20 nanometers, covering entirely or partially the means of exaltation.
  • FIG. 3 represents a diagram of a fluorescence correlation spectroscopy analysis device according to a second embodiment of the invention.
  • the confocal microscopy system comprises:
  • a helium-neon laser source emitting at 633 nanometers, for which a light response resulting from an interaction with fluorescent molecules is expected at 670 nanometers
  • a diode-pumped solid laser source emitting at 488 nanometers, for which a light response resulting from an interaction with fluorescent molecules is expected at 520 nanometers
  • a conventional microscopy device comprising a microscope objective 23 and a lamella of glass 24 carrying a sample 25 containing the particles in solution
  • a second band-stop dichroic filter 27 around 488 nanometers a pinhole camera 28 comprising an adjustable opening and two lenses arranged so as to spatially filter a detection volume around the focusing point of the beams coming from the two laser sources 20 and 21 ,
  • a third high-pass dichroic filter 29 whose cut-off wavelength is between 520 and 670 nanometers so as to separate the fluorescent light responses resulting from the interaction of the particles with each of the laser sources 20 and 21,
  • a separator cube 34 two avalanche photodiodes 35 and 36 respectively preceded by filters 37 and 38 for measuring the intensity of the fluorescence luminous flux at 670 nanometers collected by the microscopy system, and
  • the spectroscopy device 30 makes it possible to analyze the spectral composition of the light over a spectral range of 500 to 700 nanometers for an excitation wavelength of 488 nanometers.
  • the intensity of the emitted light is measured by a detector 31, which may be single-channel, for example of the photomultiplier type, or multichannel, for example of the CCD type. It is advantageously associated with the device 30 a high-pass filter 32 and a notch filter so as to improve the quality of the signal transmitted to the detector 31.
  • Such an analysis device combining a fluorescence correlation spectroscopy analysis and a Raman spectroscopy analysis, thus makes it possible to obtain not only statistical and temporal information on the particles in solution, but also information on particles taken individually.
  • the excitation means 14 of the excitation light beam 10 may be arranged in parallel.
  • An exemplary embodiment is a microbead carpet disposed against the glass substrate 3. This microstructured microbead assembly makes it possible to obtain a large and thin surface analysis volume. Detection can also be done with a multi-pixel CCD or CMOS sensor.
  • the particles to be analyzed can also have properties of chemiluminescence, bioluminescence, diffusion (Rayleigh or Hyper-Rayleigh), vibrational spectroscopy (spontaneous or stimulated Raman), thermal emissivity or reflection (case of granulometric studies). .

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution, ledit dispositif comportant un système de microscopie (1), ledit système de microscopie (1) comportant des moyens de support (3) dudit échantillon (2), des moyens d'illumination (4) aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation (10), des moyens de focalisation (5) dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en un point de focalisation (12) au niveau de l'échantillon (2) et des moyens de filtrage spatial (7) aptes à définir autour du point de focalisation (12) un volume d'analyse (13), caractérisé en ce que ledit système de microscopie (1) comporte également des moyens d'exaltation (14) dudit faisceau lumineux d'excitation (10), lesdits moyens d'exaltation (14) présentant une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon (2), une partie au moins desdits moyens d'exaltation (14) étant disposés sur le trajet dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en aval desdits moyens de support (3) et en amont dudit point de focalisation (12), et en ce qu'au moins une partie (14") des moyens d'exaltation (14) n'est pas solidaire des moyens de support (3). La présente invention concerne également un procédé d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution par un tel dispositif d'analyse.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE D'ANALYSE EXALTEE D'UN ECHANTILLON DE
PARTICULES
La présente invention concerne un dispositif et un procédé d'analyse exaltée d'un échantillon de particules.
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte au domaine des dispositifs d'analyse de particules luminescentes ou optiquement diffusantes.
Elle se rapporte plus particulièrement à un dispositif d'analyse d'un échantillon de particules en solution, ledit dispositif comportant un système de microscopie, ledit système de microscopie comportant des moyens de support dudit échantillon, des moyens d'illumination aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation, des moyens de focalisation dudit faisceau lumineux d'excitation en un point de focalisation au niveau de l'échantillon et des moyens de filtrage spatial aptes à définir autour du point de focalisation un volume d'analyse.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
Un tel dispositif vise à être utilisé dans tout type d'application d'analyse optique sur des particules ayant un marquage de luminescence ou de diffusion, c'est-à-dire possédant une réponse déterminée en luminescence ou diffusion à une lumière excitatrice. Les particules à analyser sont des molécules ou des assemblages moléculaires, par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles, et présentent des dimensions inférieures à la longueur d'onde de la lumière émise par les moyens d'illumination. Il trouve en particulier son application dans le domaine de la détection de molécules fluorescentes en solution, et plus particulièrement en spectroscopie de corrélation de fluorescence. Il trouve également une application dans les tests biologiques et plus précisément le test de biopuces à ADN ou à protéine.
L'état de la technique dans ce domaine comporte des dispositifs d'analyse comprenant un système de microscopie confocale. Un tel système vise à analyser un échantillon, par exemple des particules en solution, luminescentes ou optiquement diffusantes. Dans le cas par exemple de l'analyse de particules fluorescentes, le système comprend une source laser émettant un faisceau laser à une longueur d'onde donnée, un miroir dichroïque, un objectif de microscope présentant un grandissement et une ouverture numérique très élevés, des moyens d'imagerie optique, des moyens de filtrage spatial et un détecteur. Le faisceau laser est rendu convergeant par l'objectif en un point de focalisation situé au niveau du volume d'analyse que l'on souhaite analyser. La lumière du faisceau laser focalisé est alors absorbée par les particules puis réémise à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau laser pour être ensuite dirigée jusqu'au niveau du détecteur. Les moyens d'imagerie optique sont agencés de sorte à conjuguer le point de focalisation du faisceau laser avec le détecteur.
Les moyens de filtrage spatial permettent de délimiter un volume d'analyse et d'obtenir ainsi une résolution spatiale inférieure au micromètre. Pour cela, ils comprennent une ouverture disposé en amont du détecteur, dans un plan conjugué au plan focal de l'objectif de microscope. De cette manière, seuls les photons situés dans un volume autour du point de focalisation du faisceau laser participent à la formation de l'image au niveau du détecteur.
Afin d'obtenir un nombre important d'informations sur des particules fluorescentes en solution, un corrélateur est relié au détecteur afin d'analyser les fluctuations temporelles de la lumière fluorescente émise par le volume d'analyse, de sorte à réaliser une détection par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). La fluorescence ainsi que les fluctuations temporelles de celle-ci sont ainsi analysées. Ces fluctuations sont directement reliées à la diffusion des fluophores au travers du volume d'analyse. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen - le temps de diffusion - des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d'analyse.
Un tel dispositif permet de bénéficier d'une ouverture importante afin de collecter le maximum de lumière et donc de fluorescence, ainsi que de réduire le volume d'analyse et par conséquent de diminuer le bruit par diffusion dans la solution. Néanmoins, pour une application où l'on souhaite une résolution d'analyse sur une molécule unique, un tel dispositif présente plusieurs inconvénients. En effet, les phénomènes de diffraction fixent une limite fondamentale à la dimension de la tâche focale du laser, et donc à la dimension du volume d'analyse. Ces phénomènes entraînent des limitations sur le taux de comptage par molécule à puissance fixée et sur la concentration maximale permettant la détection de molécules uniques, dans la mesure où l'on ne cherche à analyser qu'une molécule par volume d'analyse. De plus, la réduction du bruit de fond - dû à la contribution des diffusions de Rayleigh et de Raman - est limitée puisque ce bruit de fond est proportionnel aux dimensions du volume d'analyse. Ces inconvénients rendent de tels dispositifs peu adaptés en vue de l'analyse de molécules uniques dans des solutions de fortes concentrations (supérieures à une dizaine de nanomolaires).
Une solution est décrite dans le document de brevet FR 2 827 959 afin de résoudre le problème de la définition du volume d'analyse. Dans ce document, un dispositif de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation comprend un microscope confocal comportant un système optique de focalisation dont le champ définit un volume de collection - ou volume d'analyse -, des moyens aptes à produire un faisceau d'excitation et à le diriger sur l'échantillon au travers du microscope, des moyens de détection de l'intensité du flux lumineux produit par l'interaction du faisceau d'excitation sur l'échantillon et collecté par le microscope, ainsi que des moyens de traitement du signal produit par les moyens de détection. Ce dispositif comporte également une structure photonique augmentant le flux lumineux collecté, placé au foyer du système optique de focalisation du microscope et formant des franges d'interférence dans le volume de collection. Cette structure photonique peut être par exemple un miroir diélectrique résistant à l'eau et constitué d'un empilement de couches de très faible épaisseur optique. Elle est placée au foyer du système optique de focalisation du microscope pour former des franges d'interférence dans le volume de collection. La mise en œuvre de cette structure permet, d'une part, une augmentation significative du signal collecté par molécule et, d'autre part, de résoudre le problème de la définition du volume de collection. L'inconvénient de cette solution réside dans la difficulté d'obtenir une réjection suffisante du bruit induit par la reflexion du faisceau d'excitation sur le miroir et par la luminescence parasite induite dans le miroir. De plus, la réduction maximale du volume d'analyse qu'il est possible d'obtenir est d'environ 3, ce qui n'apporte pas un gain substantiel dans les applications pratiques.
D'autres solutions pour améliorer la résolution de ces dispositifs d'analyse pourraient être envisagées. En particulier, de sorte à amplifier la puissance lumineuse reçue par le détecteur, il peut être envisagé d'augmenter la puissance du faisceau laser, mais cela risque de photodétruire la molécule. Une autre option est d'augmenter l'ouverture numérique de l'objectif de microscope, mais cela est rendu difficile dans la mesure où la technologie des objectifs de microscope est très avancée et ne rencontre plus d'augmentation nette de l'ouverture numérique. De sorte également à limiter les conséquences du phénomène de diffraction, une solution peut consister à utiliser une source laser de plus courte longueur d'onde, mais une telle augmentation est limitée au niveau de l'excitation laser. Une autre solution peut mettre en œuvre un moyen de support de plus grand indice de réfraction, par exemple en diamant, mais de tels matériaux engendrent des coûts importants et sont difficiles à usiner. D'autres solutions sont envisageables, comme l'emploi de microscopes à sondes de champ proche ou de déplétion stimulée de la luminescence, mais ces techniques sont difficiles à mettre en oeuvre et engendrent des coûts importants.
Ainsi, aucune solution de l'état de la technique ne permet de détecter efficacement des molécules individualisées dans des solutions de fortes concentrations en assurant une simplicité d'usage et un faible coût d'opération et de maintenance.
OBJET DE L'INVENTION Le but de la présente invention est de remédier à ces problèmes techniques, en permettant la diminution significative du volume d'analyse de sorte à ce qu'il ne contienne qu'une quantité de molécules allant jusqu'à l'unité et par la mise en oeuvre de moyens d'exaltation à la fois du faisceau lumineux d'excitation et de la collection de la luminescence émise. Ces moyens d'exaltation sont disposés de sorte à rendre plus intense et plus condensé le champ focal défini par le faisceau lumineux d'excitation au niveau de l'échantillon, ce champ étant susceptible d'atteindre des dimensions inférieures à la limite de diffraction, ce qui permet l'analyse sur un volume inférieur au femtolitre et donc susceptible de ne contenir qu'une seule molécule dans des solutions de concentrations élevées (supérieures à 10 nanomolaires).
L'approche de la solution a consisté à mettre en œuvre des dispositifs d'émission nanophotonique - dits « à jet photonique » - en vue de diminuer le champ focal défini par le faisceau lumineux d'excitation au niveau de l'échantillon et augmenter l'efficacité de collection de la lumière émise. L'état de l'art de ce type de dispositif comporte une microbille disposée sur le trajet d'un faisceau collimaté afin de focaliser ce faisceau. Ceci confère audit faisceau une faible divergence, ainsi qu'une invariance suivant son axe, par rapport à un faisceau normal, susceptible de diffracter de manière importante sur une faible étendue. Ce type de dispositif n'est donc apparemment pas compatible avec une utilisation sur un trajet de faisceau lumineux fortement focalisé, tel que le faisceau lumineux d'excitation d'un dispositif d'analyse par microscopie, rendu convergeant en un point de focalisation. Or l'étude du comportement du faisceau lumineux d'excitation traversant en partie un tel dispositif d'émission nanophotonique, ainsi que sa mise en oeuvre, ont alors permis de mettre en évidence une réduction significative du volume d'analyse sur l'échantillon.
Dans ce but, l'invention a pour objet un dispositif d'analyse du type mentionné ci- dessus dans lequel, outre les caractéristiques déjà mentionnées, le système de microscopie comporte également des moyens d'exaltation dudit faisceau lumineux d'excitation, lesdits moyens d'exaltation présentant une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon, une partie au moins desdits moyens d'exaltation étant disposés sur le trajet dudit faisceau lumineux d'excitation en aval desdits moyens de support et en amont dudit point de focalisation, au moins une partie desdits moyens d'exaltation n'étant pas solidaire des moyens de support.
Les moyens d'exaltation ainsi mis en œuvre permettent de sur-focaliser le faisceau lumineux d'excitation en une zone de plus petites dimensions que le volume d'analyse initial. En effet, la partie du faisceau lumineux incident qui traverse les moyens d'exaltation converge dans une zone limitrophe desdits moyens d'exaltation, cette zone étant rendue plus étroite par la focale et l'indice de réfraction desdits moyens d'exaltation. La partie du faisceau lumineux qui ne traverse pas lesdits moyens d'exaltation va interférer avec la partie que les a traversé selon un phénomène d'interférence destructive. L'essentiel de l'intensité lumineuse du faisceau incident est ainsi concentré dans un volume de dimension longitudinale de l'ordre de la moitié de la longueur d'onde et de dimension axiale de l'ordre de la longueur d'onde, donc de dimensions inférieures à la limite de diffraction.
De plus, du fait de la valeur de l'indice de réfraction des moyens d'exaltation, le faisceau lumineux de réponse, produit en réponse à l'interaction du faisceau lumineux d'excitation sur l'échantillon et collecté par les moyens de focalisation, est dirigé de manière privilégiée dans une ou des directions spécifiques de l'espace. En effet, les particules vont réémettre de la lumière de manière privilégiée vers les moyens d'exaltation parce que son indice de réfraction est le plus grand. Ainsi un flux lumineux de réponse d'autant plus important sera collecté puis détecté, ce qui permet donc d'exalter également la collection de la luminescence émise.
Le dispositif d'analyse selon l'invention, ainsi constitué de la combinaison des moyens d'exaltation avec un système classique de microscopie comportant des moyens de filtrage spatial, permet donc de réduire de manière significative le volume d'analyse au niveau de l'échantillon afin d'analyser des molécules uniques, tout en concentrant le faisceau lumineux d'excitation dans ce volume de sorte à bénéficier d'une collection de signal par molécule suffisante pour une analyse, par exemple pour des applications de spectroscopie par corrélation. Par ailleurs, l'interface microstructurée définie par les moyens d'exaltation peut être simple à fabriquer et étendue à grande échelle. Dans un mode de mise en œuvre de l'invention, au moins une partie des moyens d'exaltation est solidaire des moyens de support. Dans ce cas, il peut être prévu que la partie des moyens d'exaltation solidaire des moyens de support soit constituée d'une saillie sur lesdits moyens de support, ladite saillie présentant une courbure strictement positive.
II peut être prévu plusieurs modes de réalisation des moyens d'exaltation parmi lesquels :
- la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support comprend au moins une microlentille, - la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support comprend au moins une microgoutte, et
- la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support comprend au moins une microbille.
Dans le cas où la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support est constituée d'une microbille, il est avantageusement prévu que la (ou les) microbille(s) présente un diamètre sensiblement entre 1 et 5 micromètres. Cela permet de concentrer de manière optimale l'intensité lumineuse du faisceau lumineux d'excitation dans un volume d'analyse de faibles dimensions. De façon à optimiser au mieux les dimensions du volume d'analyse, il est prévu que la (ou les) microbille(s) présente un diamètre sensiblement égal à 2 micromètres.
Dans des modes de réalisation préférentiels visant à améliorer l'intensité lumineuse du faisceau lumineux d'excitation dans un volume d'analyse de faibles dimensions, il est prévu que :
- les moyens d'exaltation soient centrés axialement sur l'axe du faisceau lumineux d'excitation, et
- les moyens d'exaltation soient centrés longitudinalement sur le point de focalisation du faisceau lumineux d'excitation.
Dans un mode de réalisation avantageux visant à exalter davantage l'émission optique tout en n'affectant que très peu la transmission du fait de sa faible épaisseur, il est prévu que les moyens d'exaltation soient recouverts au moins en partie d'au moins une fine couche métallique.
Préférentiellement, le système de microscopie comporte également des moyens de détection de l'intensité du faisceau lumineux de réponse produit en réponse à l'interaction du faisceau lumineux d'excitation sur l'échantillon et collecté par les moyens de focalisation. Cela permet d'effectuer des mesures seulement sur le volume d'analyse, par mesure de l'intensité lumineuse reçue par les moyens de détection en réponse à l'excitation des particules de l'échantillon contenues dans le volume d'analyse. Préféreπtiellement, le système de microscopie comporte également des moyens de traitement du signal fourni par les moyens de détection. Cela permet de réaliser des mesures non seulement de réponse lumineuse, mais également des fluctuations temporelles de cette réponse lumineuse, ce qui donne l'accès à un nombre significativement plus important d'informations sur les particules contenues dans l'échantillon.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de support sont constitués d'un substrat de verre.
Préférentiellement, les moyens d'illumination sont constitués d'une source laser. En amont des moyens de focalisation, on dispose ainsi d'un faisceau lumineux d'excitation collimaté, monochromatique et de bonne qualité de front d'onde optique.
Selon un premier mode de réalisation des moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'un objectif de forte ouverture numérique (typiquement supérieure à 0,7). Selon un deuxième mode de réalisation desdits moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'une lentille de faible ouverture numérique (typiquement inférieure à 0,7).
Selon un premier mode de réalisation des moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'un objectif de forte ouverture numérique (typiquement supérieure à 0,7). Selon un deuxième mode de réalisation desdits moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'une lentille de faible ouverture numérique (typiquement inférieure à 0,7).
Préférentiellement, le système de microscopie est confocal, les moyens de filtrage spatial comprenant une ouverture de dimension variable. Cela permet de régler la dimension du volume d'analyse, qui en combinaison avec les moyens d'exaltation, permet la réduction significative du volume d'analyse.
Préférentiellement, les moyens d'exaltation du faisceau lumineux d'excitation sont disposés en parallèle. Cela permet de disposer d'un volume d'analyse couvrant une surface large mais de faible épaisseur. La détection peut alors se faire avec un capteur comprenant une pluralité de pixels.
La présente invention concerne également un procédé d'analyse d'un échantillon de particules en solution par un dispositif d'analyse comportant un système de microscopie, ledit système de microscopie comportant des moyens de support dudit échantillon, des moyens d'illumination aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation, des moyens de focalisation dudit faisceau lumineux d'excitation en un point de focalisation au niveau de l'échantillon et des moyens de filtrage spatial aptes à définir autour du point de focalisation un volume d'analyse, caractérisé en ce que : - au moins une partie dudit faisceau lumineux d'excitation est exalté en aval desdits moyens de support et en amont dudit point de focalisation par une focalisation strictement convergente et une réfraction d'indice supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon, dont au moins une partie n'est pas solidaire desdits moyens de support, et - l'intensité du faisceau lumineux de réponse est mesurée en fonction du temps, ledit faisceau lumineux de réponse étant issu de l'interaction du faisceau lumineux d'excitation avec l'échantillon au niveau du volume d'analyse.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple non limitatif de réalisation, accompagnée de figures représentant respectivement :
- la figure 1 , un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un premier mode de réalisation de l'invention, - les figures 2A à 2D, différents mode de réalisation des moyens d'exaltation selon l'invention, et
- la figure 3, un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.
EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS On entendra par point de focalisation du faisceau lumineux d'excitation le point de focalisation du faisceau lorsque aucune partie du faisceau ne traverse au moins une partie des moyens d'exaltation. Ainsi il pourra être dit, par exemple, d'une partie des moyens d'exaltation qu'elle est disposée en amont du point de focalisation du faisceau lumineux d'excitation, de sorte à comprendre que le centre de cette partie des moyens d'exaltation est disposée en amont du point de focalisation du faisceau s'il n'y avait pas de moyens d'exaltation.
La figure 1 représente un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un premier mode de réalisation de l'invention.
Le dispositif d'analyse vise à analyser un échantillon 2. Cet échantillon peut être un milieu liquide, gazeux, ou un objet biologique contenant des particules à analyser. Les particules à analyser sont des molécules ou des assemblages moléculaires, par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles, et présentent des dimensions inférieures à la longueur d'onde de la lumière émise par les moyens d'illumination.
Le dispositif d'analyse comprend un système de microscopie confocale 1. Ce système est un arrangement comportant des moyens de support 3, d'illumination 4, de focalisation 5, de séparation dichroïque 6, de filtrage spatial 7, de détection 8, de traitement 9 et d'exaltation 14.
Les moyens de support 3 sont constitués d'un substrat de verre. Ce substrat peut être une lamelle de microscope d'épaisseur comprise entre 100 et 200 micromètres. Ce substrat supporte l'échantillon 2, qui est avantageusement enfermé dans une boîte étanche dont les parois latérales sont formées par des cales autocollantes d'épaisseur comprise entre 50 et 100 micromètres et résistantes à l'eau. Le substrat est ainsi disposé au sommet de ladite boîte étanche.
Les moyens d'illumination 4 émettent un faisceau lumineux d'excitation 10. Ce faisceau 10 est collimaté en sortie des moyens d'illumination 4. Ces moyens sont avantageusement constitués d'un laser. Selon différents modes de réalisation, le laser peut être un laser solide pompé par diode opérant à une longueur d'onde de 488 nanomètres ou un laser hélium-néon opérant à une longueur d'onde de 633 nanomètres. Le faisceau lumineux d'excitation 10 est dirigé vers les moyens de séparation dichroïque 6. Ces moyens 6 sont avantageusement constitués d'une filtre dichroïque de type coupe-bande. Ce filtre est choisi de sorte que sa longueur d'onde de coupure et sa largeur de bande permettent de réfléchir le faisceau lumineux d'excitation 10 et de transmettre le faisceau lumineux de réponse 11. La longueur d'onde du faisceau de réponse 11 est en effet supérieur à celle du faisceau d'excitation 10 puisque les particules sont fluorescentes. Dans le cas par exemple de molécules Alexa 647 excités à 633 nanomètres, la réponse lumineuse est attendue à 670 nanomètres, ce qui impose un longueur d'onde de coupure du filtre dichroïque de l'ordre de 640 nanomètres. Ce filtre est également choisi de sorte à posséder un facteur de transmission maximal pour la longueur d'onde du faisceau de réponse 11.
Avantageusement, le filtre dichroïque est disposé à 45° du faisceau incident d'excitation 10. Le filtre dichroïque peut ainsi diriger, après réflexion sur les moyens de séparation dichroïque 6, le faisceau lumineux d'excitation 10 vers les moyens de focalisation 5. Ces moyens 5 sont aptes à diriger le faisceau vers un point de focalisation 12 sur l'échantillon 2 au travers du système de microscopie confocale 1. Ces moyens 5 sont pour cela constitués d'un objectif ou d'une lentille.
De manière avantageuse, et comme illustré en figure 1 , les moyens de focalisation 5 sont constitués d'un objectif de microscope. Cet objectif est par exemple un objectif apochromatique présentant un grandissement de 4Ox et une ouverture numérique de 1 ,2. Cette ouverture numérique élevée permet de collecter une intensité lumineuse optimale en réponse à l'excitation par le faisceau lumineux 10. L'efficacité de focalisation et de collection sont alors rendues optimales.
Dans un autre mode de réalisation, les moyens de focalisation 5 sont constitués d'une lentille. Ce type de moyen de focalisation présente une ouverture numérique peu élevée, ce qui ne permet pas d'exploiter de manière optimale l'effet supplémentaire obtenu par les moyens d'exaltation 14. Néanmoins, pour un coût moindre qu'un objectif de microscope, la faible efficacité de focalisation et de collection sont compensés par les moyens d'exaltation 14.
Le faisceau lumineux d'excitation 10 ainsi focalisé interagit avec des particules en solution dans l'échantillon 2 selon un phénomène de fluorescence. Ainsi chaque particule excitée va émettre par fluorescence une réponse lumineuse à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau d'excitation 10. Une partie de cette réponse lumineuse est alors collectée par les moyens de focalisation 5 de sorte à former un faisceau lumineux de réponse 11.
Ce faisceau lumineux de réponse 11 est envoyé vers les moyens de détection 8 au travers des moyens respectivement de focalisation 5, de séparation dichroïque 6 et de filtrage spatial 7. La longueur d'onde de coupure du filtre dichroïque est en effet choisie de sorte à transmettre le faisceau lumineux de réponse 11 , dont la longueur d'onde est supérieure à celle du faisceau d'excitation 10. Afin de réaliser la détection du faisceau de réponse 11, les moyens de filtrage spatial comprennent en outre un ensemble de lentilles 7' et 7'" permettant de conjuguer le plan focal des moyens de focalisation 5 avec le plan de captation des moyens de détection 8.
Les moyens de filtrage spatial 7 comprennent également une ouverture 7" de dimension réglable. Cette ouverture est disposée suivant l'axe 15 du faisceau lumineux de réponse 11. Elle est conjugué optiquement avec le point de focalisation 12 des moyens de focalisation 5. Elle permet de sélectionner un volume de détection - ou volume de filtrage spatial - autour du point de focalisation 12, puisque des rayons lumineux ne provenant pas de ce volume de filtrage spatial ne traversent pas l'ouverture 7". Les dimensions de la zone de détection sont d'autant plus courtes que celles de l'ouverture 7" le sont également. L'ensemble 7 constitué des éléments 7', 7" et 7'" forme ainsi un sténopé ayant une ouverture variable 7" placée dans un plan intermédiaire image de sorte que le système de microscopie conjugue le point de focalisation 12 du faisceau d'excitation 10 avec l'ouverture variable 7" du sténopé.
Dans d'autres modes de réalisation, les moyens de filtrage spatial 7 ne comprennent pas d'ouverture 7". Ils peuvent en effet être constitués d'autres éléments permettant de réaliser un filtrage spatial. Le système de microscopie ainsi mis en œuvre n'est alors plus de type confocal. Ces éléments peuvent être par exemple :
- un trou dans une plaque métallique,
- une fibre optique, dont le diamètre de cœur fixe l'ouverture utile,
- les moyens de détection, leur surface étant petite, de l'ordre de quelques dizaines de micromètres de diamètre, ou - le faisceau d'excitation lui-même, dans le cas d'une excitation à deux photons.
Dans le cas d'une excitation par fluorescence à deux photons, celle-ci met en œuvre l'absorption simultanée de deux photons pompe pour exciter la molécule. Elle est moins efficace que la fluorescence à un photon, mais dans la mesure où elle dépend quadratiquement de l'intensité d'excitation, seul un volume très petit autour du point de focalisation est apte à contribuer efficacement au signal. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire d'utiliser de filtrage de type confocal.
Les moyens de détection 8 permettent la mesure de l'intensité du flux lumineux de réponse 11 produit par l'interaction du faisceau d'excitation 10 sur l'échantillon 2 et collecté par le système de microscopie 1. Dans un mode de réalisation particulier, ces moyens 8 comprennent des photodétecteurs à amplification d'électrons. Ces photodétecteurs sont avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanche ou de cascade - APD (photodiode à avalanche, soit « avalanche photodiode » en langue anglo-saxonne). Ces photodétecteurs peuvent également être des photomultiplicateurs. Selon d'autres modes de réalisation particuliers, ces moyens de détection 8 comprennent des photodétecteurs à amplification optique, des caméras CCD ou CMOS refroidies, par exemple à air liquide ou élément Peltier.
Ces moyens de détection 8 peuvent fonctionner selon deux modes de lecture. Selon un premier mode de mise en œuvre de l'invention, la détection s'effectue suivant un régime continu, où le signal optique émis par les cibles est détecté en intégrant le signal pour chaque pixel ou groupe de pixels - dans le cas où les moyens de détection comportent plusieurs pixels - du détecteur. Des mesures radiométriques sont alors également possibles entre plusieurs pixels ou groupes de pixels. Selon un deuxième mode de mise en œuvre de l'invention, la détection s'effectue suivant un régime temporel où le détecteur intègre le signal sur des plages temporelles courtes par rapport au processus à analyser. L'information est alors donnée par l'analyse de cette trace temporelle.
Le signal issu de ces moyens de détection 8 est envoyé vers des moyens de traitement 9 du signal. Ces moyens 9 comprennent avantageusement un compteur et un corrélateur qui permet de traiter numériquement les données reçues. En particulier, le compteur réalise l'enregistrement de la valeur de l'intensité lumineuse de fluorescence reçue et le corrélateur réalise l'analyse temporelle des fluctuations de l'intensité lumineuse de fluorescence reçue. Cette analyse peut se faire aux temps courts et aux temps longs de sorte à obtenir des informations complémentaires sur les particules en solution dans l'échantillon 2. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen - temps de diffusion - des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume de filtrage spatial.
Les moyens d'exaltation 14 permettent de modifier la forme du faisceau lumineux d'excitation 10 de sorte à exalter le flux lumineux et ainsi le concentrer dans un volume d'analyse de plus petites dimensions. Pour cela, les moyens d'exaltation 14 sont disposés sur le trajet du faisceau lumineux d'excitation en aval des moyens de support 3 et en amont du point de focalisation 12.
Ces moyens d'exaltation 14 présentent une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon 2. Dans ces conditions, la partie du faisceau lumineux incident 10 qui traverse les moyens d'exaltation 14 converge dans une zone limitrophe desdits moyens d'exaltation 14. Cette zone est rendue plus étroite car leur focale est strictement positive et leur indice de réfraction est supérieur à celui de la solution dans l'échantillon 2. La partie du faisceau lumineux 10 qui ne traverse pas lesdits moyens d'exaltation 14 va interférer avec la partie que les a traversé selon un phénomène d'interférence destructive. L'essentiel de l'intensité lumineuse du faisceau incident 10 est ainsi concentré dans un volume de dimension longitudinale de l'ordre de la moitié de la longueur d'onde et de dimension axiale de l'ordre de la longueur d'onde, donc de dimensions inférieures à la limite de diffraction, ce qui permet d'atteindre un volume d'analyse inférieur au dixième de femtolitre.
De plus, leur indice de réfraction étant supérieur à celui de l'échantillon 2, le faisceau lumineux de réponse 11 est dirigé de manière privilégiée de sorte à ce que la lumière soit réémise vers les moyens d'exaltation 14. Ainsi un flux lumineux de réponse 11 d'autant plus important sera collecté puis détecté. Les moyens d'exaltation 14 constituent ainsi une interface microstructurée entre les moyens de support 3 et le point de focalisation 12 du faisceau d'excitation 10, de sorte à diminuer les dimensions du volume d'analyse à détecter et à y concentrer une intensité lumineuse supérieure à celle sans moyens d'exaltation.
Les moyens d'exaltation 14 présentent des dimensions micrométriques, de l'ordre de 1 à 5 micromètres, et un indice de réfraction élevé, de l'ordre de 1 ,4 à 1 ,6.
Selon différents mode de réalisation particuliers, les moyens d'exaltation 14 ne sont pas solidaires des moyens de support 3, sont au moins en partie solidaires desdits moyens de support 3, ou sont entièrement solidaires desdits moyens de support 3.
Selon le mode de réalisation illustré par la figure 2A, les moyens d'exaltation 14 sont solidaire des moyens de support 3. Les moyens d'exaltation sont ainsi constitués d'une saillie 14' sur les moyens de support 3. Cette saillie présente une courbure strictement positive de sorte que la focale des moyens d'exaltation ainsi constitués soit strictement positive. Selon les modes de réalisation illustrés par les figures 2B à 2D, les moyens d'exaltation 14 ne sont pas solidaires des moyens de support 3. L'interface microstructurée ainsi constituée des moyens d'exaltation 14 peut être fabriquée par dispersion desdits moyens 14 sur le substrat de verre des moyens de support 3.
En référence à la figure 2B, les moyens d'exaltation 14" sont constitués d'une microlentille convergente. Cette lentille, de dimensions micrométriques, présente avantageusement une focale élevée de sorte de concentrer au mieux le flux lumineux issu du faisceau d'excitation 10 dans une zone la plus proche possible de la lentille. Cette zone est ainsi d'autant plus isolée du reste de l'échantillon 2 où d'autres particules sont susceptibles d'être excitées.
En référence à la figure 2C, les moyens d'exaltation 14" sont constitués d'une microgoutte. La focale de cette goutte micrométrique présente avantageusement une courbure élevée afin de concentrer au mieux le flux lumineux issu du faisceau d'excitation 10 dans une zone la plus proche possible de la goutte.
En référence à la figure 2D, les moyens d'exaltation 14" sont préférentiellement constitués d'une microbille. Cette microbille est un bille diélectrique d'indice de réfraction élevée et de dimensions micrométriques. Cette bille peut être par exemple réalisée en latex ou en polystyrène, dont l'indice vaut 1 ,6 et qui présente également l'avantage d'être plus souple que le verre de sorte à ne pas subir de détérioration lors de la fabrication de l'interface microstructurée. La microbille présente l'avantage de disposer de courbures très élevées, ce qui permet de concentrer de manière optimale l'intensité lumineuse du faisceau d'excitation dans un volume d'analyse de faibles dimensions. Le diamètre d'une microbille est situé entre 1 et 5 micromètres, et préférentiellement de 2 micromètres.
Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de ces moyens d'exaltation illustrées par les figures 2A à 2D, en particulier par la combinaison des exemples de réalisation ci-dessus, sans pour autant sortir du cadre du brevet. Plus particulièrement, les moyens d'exaltation 14 peuvent comprendre à la fois une partie solidaire 14' et une partie non solidaire 14" des moyens de support 3.
Pour chacun des modes de réalisation des moyens d'exaltation 14 décrits ci-dessus ainsi que pour toute combinaison possible de ceux-ci, lesdits moyens d'exaltation 14 sont avantageusement centrés axialement sur l'axe 15 du faisceau lumineux d'excitation 10. Ils sont également avantageusement centrés longitudinalement sur le point de focalisation 12 du faisceau lumineux d'excitation 10. Ces centrages des moyens d'exaltation 14 par rapport au faisceau lumineux d'excitation 10 permettent d'exalter ledit faisceau 10 de manière optimale.
De manière préférentielle et aux fins d'exalter davantage l'émission optique, les moyens d'exaltation 14 sont recouverts au moins en partie d'au moins une fine couche métallique. Le métal utilisé pour cette couche est un métal choisi parmi l'aluminium et des métaux nobles, tels que l'or, l'argent, le cuivre et le nickel. L'épaisseur de cette couche est avantageusement inférieur ou égal à 30 nanomètres afin d'éviter de disposer d'une couche trop opaque qui diminuerait significativement la transmission du système de microscopie. Cette fine couche métallique peut être par exemple une couche en or, d'épaisseur égale à 20 nanomètres, recouvrant entièrement ou partiellement les moyens d'exaltation.
La figure 3 représente un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.
Dans ce mode de réalisation visant à réaliser en même temps une analyse par spectroscopie par corrélation de fluorescence et une analyse par spectroscopie Raman, le système de microscopie confocale comprend :
- une source laser hélium-néon 20 émettant à 633 nanomètres, pour lequel une réponse lumineuse issue d'une interaction avec des molécules fluorescentes est attendue à 670 nanomètres,
- une source laser solide pompée par diode 21 émettant à 488 nanomètres, pour lequel une réponse lumineuse issue d'une interaction avec des molécules fluorescentes est attendue à 520 nanomètres, - un dispositif de microscopie classique 22 comportant un objectif de microscope 23 et une lamelle de verre 24 supportant un échantillon 25 contenant les particules en solution,
- un premier filtre dichroïque 26 coupe-bande autour de 633 nanomètres,
- un deuxième filtre dichroïque 27 coupe-bande autour de 488 nanomètres, - un sténopé 28 comportant une ouverture réglable et deux lentilles disposées de sorte à filtrer spatialement un volume de détection autour du point de focalisation des faisceaux issus des deux sources lasers 20 et 21 ,
- un troisième filtre dichroïque 29 passe-haut dont la longueur d'onde de coupure est située entre 520 et 670 nanomètres de sorte à séparer les réponses lumineuses en fluorescence issues de l'interaction des particules avec chacune des sources lasers 20 et 21 ,
- un dispositif de spectroscopie Raman 30 pour l'analyse de la fluorescence des particules excitées à 488 nanomètres,
- un cube séparateur 34, - deux photodiodes à avalanche 35 et 36 précédées respectivement de filtres 37 et 38 pour mesurer l'intensité du flux lumineux de fluorescence à 670 nanomètres collecté par le système de microscopie, et
- un compteur 39 et un corrélateur 40 permettant de mesurer les fluctuations temporelles de l'intensité lumineuse de fluorescence à 633 nanomètres. Le dispositif de spectroscopie 30 permet d'analyser la composition spectrale de la lumière sur une plage spectrale de 500 à 700 nanomètres pour une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres. L'intensité de la lumière émise est mesurée par un détecteur 31 , qui peut être monocanal, par exemple de type photomultiplicateur, ou multicanaux, par exemple de type CCD. Il est avantageusement adjoint au dispositif 30 un filtre passe-haut 32 et un filtre coupe-bande de façon à améliorer la qualité de signal transmis au détecteur 31.
Un tel dispositif d'analyse selon l'invention, combinant une analyse par spectroscopie par corrélation de fluorescence et une analyse par spectroscopie Raman, permet ainsi d'obtenir non seulement des informations statistiques et temporelles sur les particules en solution, mais également des informations sur des particules prises de manière individuelle.
La combinaison décrite ci-dessus des moyens d'exaltation et d'un système de microscopie confocale classique, selon l'un quelconque des modes de réalisation décrits ci-dessus, permet de diminuer le volume d'analyse et d'exalter la détection. Un régime de détection de forte efficacité où des particules individuelles sont détectées peut ainsi être envisagé. Ce régime permet d'obtenir des informations à l'échelle de la molécule individuelle qui ne sont pas accessibles par des mesures d'ensemble - dynamique temporelle et répartition statistique des réactions. Cela offre de nouveaux moyens d'étude et de diagnostic, notamment pour des applications d'analyse d'associations moléculaires, permanentes ou transitoires.
Les modes de réalisation précédemment décrits de la présente invention sont donnés à titre d'exemples et ne sont nullement limitatifs. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention, en particulier avec l'évolution des technologies, sans pour autant sortir du cadre du brevet.
Ainsi, les moyens d'exaltation 14 du faisceau lumineux d'excitation 10 peuvent être disposés en parallèle. Un exemple de réalisation est un tapis de microbilles disposé contre le substrat de verre 3. Cet ensemble microstructuré de microbilles permet d'obtenir un volume d'analyse de surface large et de faible épaisseur. La détection peut alors également se faire avec un capteur multipixels CCD ou CMOS.
Egalement, les particules à analyser peuvent également avoir des propriétés de chemiluminescence, de bioluminescence, de diffusion (Rayleigh ou Hyper-Rayleigh), de spectroscopie vibrationnelle (Raman spontanée ou stimulée), d'émissivité thermique ou de réflexion (cas des études granulométriques).

Claims

REVENDICATIONS
1 - Dispositif d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution, ledit dispositif comportant un système de microscopie (1), ledit système de microscopie (1) comportant des moyens de support (3) dudit échantillon (2), des moyens d'illumination (4) aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation (10), des moyens de focalisation (5) dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en un point de focalisation (12) au niveau de l'échantillon (2) et des moyens de filtrage spatial (7) aptes à définir autour du point de focalisation (12) un volume d'analyse (13), caractérisé en ce que ledit système de microscopie (1 ) comporte également des moyens d'exaltation (14) dudit faisceau lumineux d'excitation (10), lesdits moyens d'exaltation (14) présentant une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon (2), en ce qu'une partie au moins desdits moyens d'exaltation (14) est disposée sur le trajet dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en aval desdits moyens de support (3) et en amont dudit point de focalisation (12), et en ce qu'au moins une partie (14") des moyens d'exaltation (14) n'est pas solidaire des moyens de support (3).
2 - Dispositif d'analyse selon la revendication 1 , dans lequel au moins une partie (14') des moyens d'exaltation (14) est solidaire des moyens de support (3).
3 - Dispositif d'analyse selon la revendication 2, dans lequel la partie (14') des moyens d'exaltation (14) solidaire des moyens de support (3) est constituée d'une saillie sur lesdits moyens de support (3), ladite saillie présentant une courbure stricte- ment positive.
4 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la partie (14") des moyens d'exaltation (14) non solidaire des moyens de support (3) comprend au moins une microlentille.
5 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la partie (14") des moyens d'exaltation (14) non solidaire des moyens de support (3) comprend au moins une microgoutte. 6 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la partie (14") des moyens d'exaltation (14) non solidaire des moyens de support (3) comprend au moins une microbille.
7 - Dispositif d'analyse selon la revendication 6, dans lequel la (ou les) microbille(s) présente un diamètre sensiblement entre 1 et 5 micromètres.
8 - Dispositif d'analyse selon la revendication 7, dans lequel la (ou les) microbille(s) présente un diamètre sensiblement égal à 2 micromètres.
9 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) sont centrés axialement sur l'axe (15) du faisceau lumineux d'excitation (10).
10 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) sont centrés longitudinalement sur le point de focalisation (12) du faisceau lumineux d'excitation (10).
11 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) sont recouverts au moins en partie d'au moins une fine couche métallique.
12 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système de microscopie (1) comporte également des moyens de détection (8) de l'intensité du faisceau lumineux de réponse (11) produit en réponse à l'interaction du faisceau lumineux d'excitation (10) sur l'échantillon (2) et collecté par les moyens de focalisation (5).
13 - Dispositif d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel le système de microscopie (1) comporte également des moyens de traitement (9) du signal fourni par les moyens de détection (8).
14 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens de support (3) sont constitués d'un substrat de verre. 15 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'illumination (4) sont constitués d'une source laser.
16 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel les moyens de focalisation (5) sont constitués d'un objectif.
17 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel les moyens de focalisation (5) sont constitués d'une lentille.
18 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système de microscopie (1) est confocal, les moyens de filtrage spatial (7) comprenant une ouverture (7") de dimension variable.
19 - Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précé- dentés, dans lequel les moyens d'exaltation (14) du faisceau lumineux d'excitation
(10) sont disposés en parallèle.
20 - Procédé d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution par un dispositif d'analyse comportant un système de microscopie (1), ledit système de micros- copie (1) comportant des moyens de support (3) dudit échantillon (2), des moyens d'illumination (4) aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation (10), des moyens de focalisation (5) dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en un point de focalisation (12) au niveau de l'échantillon (2) et des moyens de filtrage spatial (7) aptes à définir autour du point de focalisation (12) un volume d'analyse (13), caractérisé en ce que :
- au moins une partie dudit faisceau lumineux d'excitation (10) est exalté en aval desdits moyens de support (3) et en amont dudit point de focalisation (12) par une focalisation strictement convergente et une réfraction d'indice supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon (2), dont au moins une partie (14") n'est pas solidaire desdits moyens de support (3), et
- l'intensité du faisceau lumineux de réponse (11 ) est mesurée en fonction du temps, ledit faisceau lumineux de réponse (11) étant issu de l'interaction du faisceau lumineux d'excitation (10) avec l'échantillon (2) au niveau du volume d'analyse (13).
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