WO2009122047A1 - Procede et dispositif de mesure quantitative a haute cadence de cibles biomoleculaires presentes sur ou dans un support d'analyse biologique - Google Patents

Procede et dispositif de mesure quantitative a haute cadence de cibles biomoleculaires presentes sur ou dans un support d'analyse biologique Download PDF

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WO2009122047A1
WO2009122047A1 PCT/FR2009/000300 FR2009000300W WO2009122047A1 WO 2009122047 A1 WO2009122047 A1 WO 2009122047A1 FR 2009000300 W FR2009000300 W FR 2009000300W WO 2009122047 A1 WO2009122047 A1 WO 2009122047A1
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WO
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plasma
support
targets
beams
quantified
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PCT/FR2009/000300
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Nicolas Ugolin
Denis Menut
Julien Le Meur
Nadine Coulon
Sylvie Chevillard
Emilie Bosc
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Commissariat A L'energie Atomique
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/71—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited
    • G01N21/718—Laser microanalysis, i.e. with formation of sample plasma
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to a method of high-speed quantitative measurement of biomolecular targets on the surface or in the thickness of a biological analysis plane support, and a device for implementing this method.
  • the invention is particularly applicable to the quantitative measurement of nucleic acids or unlabeled proteins segregated on the surface or in the thickness of a preferably planar biological analysis support, such as a biochip, for example with a matrix probes, a transfer membrane, an electrophoresis or chromatography gel or a support of glass or polyimide (eg Kapton®), without limitation.
  • Laser-induced breakdown spectroscopy (“Laser-induced breakdown spectroscopy” or “LIBS”) is a very powerful method for determining the elemental composition of the surface of a material.
  • This composition is obtained by measuring the emission lines originating from the atoms or ions constituting a transient plasma induced on the surface of the material by a laser beam, and the elemental analysis of this surface can be obtained by sweeping it by a laser source performing successive shots in a regular grid, so as to map the surface of this material. With each laser firing, the emission spectrum of the desired chemical elements is recorded, as well as the focus coordinates of the beam on the surface of the material. It is then possible to reconstruct a point-to-point image of the surface of the material at a selected wavelength corresponding to a specific chemical element. If a calibration method is applied, the intensity variations of the image obtained by mapping indicate the abundance of this element on the surface of the material.
  • a major disadvantage of this technique is that the very high number of laser shots necessary to perform a mapping to high resolution of the surface (resolution between 300 nm and 1 ⁇ m), involves analysis times of several hours or even several days, as soon as the analyzed surface exceeds a few square millimeters. This slow acquisition of the image makes LIBS inapplicable as a method of analysis for a large number of applications in biology, and more particularly for genomics and proteomics.
  • Biochips In the field of genomics, biochips represent a major revolution in molecular biology techniques over the past decade. By allowing the simultaneous study of the level of expression of several hundred or even thousands of genes, they make it possible to understand the impact of a disease or a stress (eg resulting from a radiation, a pollution or taking a drug) at the level of the complete genome of an individual. These techniques become more and more used in modern biology. Biochips fall into two broad families, including microfluidic chips and probe matrix chips. The latter are organized into "spot” matrices or measurement points, and are generally obtained by depositing or synthesizing, at precise coordinates on a passive support, molecular probes formed of biopolymers such as DNA, proteins or proteins. antibodies, for example. These probe matrix biochips enable the identification of the targets present in a biological sample when these targets hybridize specifically at each "spot" of probes.
  • probe array biochips has a number of major limitations, including: - the high steric hindrance of fluorescent markers, which sporadically alters recognition between probes and probes; targets and thus leads to numerous measurement artifacts that reduce the reproducibility of the experiments;
  • Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ie a polymerase chain reaction after reverse transcription of a ribonucleic acid into complementary DNA
  • improvement of detection which is penalized by the absence of quantitative measurement for a real comparison between the targets, by the limitation of the number of targets to be analyzed (well below a low complexity biochip) and by a high cost of implementation;
  • non-marking biochips which are based on the detection of the target by impedance measurement or by surface plasmon resonance (SPR or Surface Plasmon Resonance), and which have been described in particular in David F et al., Bioscience Bioelectron. 2005, in Li CM et al., Front Biosci. 2005 or Macanovic A. et al., Nucleic Acid Research 2004, but which do not allow a quantification of the number of targets, are problematic to achieve high density chips and involve, for both the impedance measurement technique and the SPR technique, measurement artifacts due to the variable size and conformation of the targets.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Coupled Plasma i.e. induced plasma coupled mass spectrometry
  • PNA Protein Nucleic Acid
  • US-A-2006/0105354 discloses a method of real-time quantification of a multitude of labeled nucleic acid targets which have bound to the surface of a probe matrix type biochip, including in particular the emission of an excitation laser beam on the surface of the matrix and the measurement of the light emission of the hybridized targets in response to this excitation beam.
  • Two-dimensional (2D) electrophoresis techniques are the most commonly used parallel analysis techniques for the analysis of protein mixtures. These techniques consist of migrating a mixture of proteins in a gel, successively following two orthogonal directions, according to different physicochemical criteria (e.g., chromatography or electrophoresis).
  • the proteins are then separated according to their affinity to a solvent, their electrical charge, their mass, their shape, their modification, etc., and after having been pigmented by a fluorescent pigment or not, the proteins are identified according to their position or stain on the 2D gels compared to the migrations obtained in a reference gel.
  • the highlighting of the post-translational modifications is for the moment very heavy to realize.
  • the "LIBS” technique represents an alternative for the analysis without prior labeling of segregated biomolecules on all types of supports (eg membrane, gel, plastic support for example in Kapton®, silicon support), these supports being the main types used. in biological analyzes.
  • the method of analysis of a biological product by "LIBS” consists in assaying a constituent chemical element of the target biomolecule previously isolated, segregated or purified on a chromatography, electrophoresis, membrane or biochip support.
  • the main technological lock of a "LIBS" analysis is the slowness of the process, which greatly limits the use of this technique in biology.
  • the analysis supports in biology often make several square centimeters of surface. Imaging, at a resolution of 10 microns, for example, of a 1 cm 2 analysis support thus requires 1,000,000 contiguous laser shots to be fired, one shot per position. Of course, this number is to be multiplied by the number of shots to be made per position, if the molecule to be analyzed is in the thickness of the support, such as it produces for the electrophoresis gels for example.
  • An object of the present invention is to provide a method for high-speed quantitative measurement of biomolecular targets, in particular proteins, present on or in a biological analysis support, which overcomes all of the aforementioned drawbacks.
  • the measuring method comprises the following steps: a) the measurement points of the support are scanned by moving, focusing and superimposing on each measurement point of this support at least two laser beams by crossings simultaneous of these beams, to extract a hot and confined plasma comprising at least one chemical element to be quantified present in said targets and at least one other chemical element exogenous to these targets and present in known quantity on or in this support, b) detects and analyzes, for each of these measurement points, emission light lines of each plasma that correspond to the or each element to be quantified and to the or each exogenous element, by measuring the respective intensities of these lines, then c) the calibration of the lines of the or each element to be quantified establishing a correlation between the intensities of the lines specific to this element to be quantified and the concentrations of the latter in mixtures in known proportions of the or each element to be quantified and the or each exogenous element, the concentration in each measurement point of the or each element to be quantified or of a group incorporating it within these targets
  • the method according to the invention thus makes it possible to "scan" (ie analyze in one sweep) quickly and efficiently all the measuring points of the biochip, while being independent of a variation of the power setting of the lasers and of the sensitivity of the detection of an acquisition to the other, thanks to the presence of an internal reference corresponding to the exogenous element, and to deduce from the above-mentioned step c) the number of atoms of the desired element in each measuring point, to deduce the number of targets at the observed coordinate, all in less than
  • read time number of reads / acquisition time
  • said biomolecular targets are immobilized before step a) at the surface or in the thickness of the biological analysis support, which is preferably substantially plane and is chosen from the group consisting of biochips, transfer membranes, substrates made of silicon, polyimide (eg Kapton®) and glass, and electrophoresis and chromatography gels.
  • this support is formed of a biochip comprising on its surface a matrix of native probes, hybridized or complexed by said targets, this matrix comprising a multitude of said measuring points each comprising a plurality of probes, and the or each chemical element to be quantified being present in these targets and, optionally, further in these probes.
  • exogenous element when the element to be quantified is both in the probe and in the target, said exogenous element makes it possible to deduce the amount of signal that comes from the probe and the amount of signal that comes from the target.
  • This exogenous element provides an internal calibration that allows the signal to be readjusted to the calibration curves, whatever the signal attenuation due to the setting of the device.
  • this measurement method further comprises a subsequent step of obtaining one or more images representative of the concentration of the or each element to be quantified or of the or each exogenous element, the intensity each pixel or each of the three colors R, G, B of the latter within the image being representative of the intensity of the line of the corresponding element observed.
  • the image thus obtained makes it possible to map the abundance of the or each element to be quantified or exogenous on or in the analysis support.
  • the mapping of the thickness of the analysis support is obtained by successive shots in one and the same position, the signals obtained being either accumulated or analyzed separately to carry out a z-mapping of the support, either averaged or sliced.
  • the number of successive shots depends in particular on the desired depth of analysis and the physicochemical properties of the support material.
  • the immobilization prior to step a) of the target molecule is obtained, either directly by an interaction with the material constituting the support or a retention in the molecular mesh of the support. or indirectly by an interaction with a ligand (probe) attached to or in the support.
  • probe / target interactions one can for example quote:
  • a target hybridization between a target and a probe of nucleic acid or similar type (eg PNA, LNA), protein / protein interactions between a target and a protein probe such as ligand / receptor, antibody / fixed antigen,
  • a probe of nucleic acid or similar type eg PNA, LNA
  • protein / protein interactions between a target and a protein probe such as ligand / receptor, antibody / fixed antigen
  • nucleic acid / metal ion or any other free molecule
  • each laser beam used in step a) is emitted in the infrared-visible-ultraviolet range according to a pulse of duration between 1 fs and 100 ns, with a frequency of between 600 Hz and 1 GHz and energy included. between 0.05 mW and 1 kW.
  • each laser beam is emitted in the ultraviolet at a wavelength of 266 nm or 193 nm, using, for example, the harmonics of an Nd: YAG laser (yttrium garnet laser). neodymium doped aluminum), and according to a pulse of less than 10 ns duration preferably equal to 5 ns.
  • Nd: YAG laser yttrium garnet laser
  • neodymium doped aluminum neodymium doped aluminum
  • the laser beams used in step a) can be emitted at different wavelengths, for example in the ultraviolet at a wavelength of 266 nm and in the visible at 532 nm, again according to a pulse of less than 10 ns duration and preferably equal to 5 ns.
  • said beams may advantageously be shaped in step a) in a scanning head, in such a way that:
  • these beams are reflected tangentially on a pyramid of reference to at least one reflection stage to give collinear beams at the output of this pyramid; these collinear beams pass through an afocal optical system, such as a beam-reducing telescope, which reduces respective diameters of these beams, and the distances separating them mutually, then that
  • said collinear reduced beams can be focused and crossed on each measuring point of said support by two rotating optical mirrors disks respectively in horizontal and vertical directions and preferably by a deflection periscope coupled to these disks.
  • the superposition by crossing of the laser beams generates in step a) a power density at each measurement point advantageously greater than 0.5 GW.cm -2 , for obtaining by vaporization of a hot plasma which has a lifetime of about 2 ⁇ s
  • a single crossing of two laser beams can be used to ablate each measuring point, with a surface area of between 1 ⁇ m 2 and 10 000 ⁇ m 2.
  • the scanning of the whole measuring points, according to a fixed pitch, can thus be achieved by preferably ellipsoidal mirrors which move, focus and cross the beams on the surface to be analyzed.
  • each confined plasma is associated with at least one activation agent formed of a plasmogenic gas, such as argon, helium, nitrogen or a mixture of these gases.
  • a plasmogenic gas such as argon, helium, nitrogen or a mixture of these gases.
  • the extracted plasmas are respectively confined optically in integration chambers of the light emitted by the corresponding plasma, each of which has a reflecting side wall and which are each provided with at least one optical fiber for acquiring the light accumulated in this chamber, so that each plasma does not interfere with the other measurement points to be analyzed.
  • step a) the biological analysis support is subjected to a relative movement with respect to optical confinement chambers at the same time that said laser beams are crossed, and these chambers are preferably then guided above said support which remains fixed.
  • mutual overlapping of the respective optical apertures of the acquisition optical fibers can be used by staggering them above said support, to cover the entire surface to be analyzed of the latter without relative displacement of these chambers relative to said support.
  • said optical confinement chambers of the extracted plasmas are themselves housed in a closed enclosure which contains the support, which is filled with the plasmogenic gas and whose at least the upper face is transparent to the plasma. or each excitation wavelength of the laser beams and at the wavelengths of acquisition of the light generated by this plasma. According to this second mode, it will be noted that it is possible to move said laser beams simultaneously in relative movement with respect to said support.
  • the technique of laser-induced optical emission spectroscopy (abbreviated "Laser Induced Breakdown Spectroscopy”) for the implementation of steps a) to c is advantageously used.
  • Laser Induced Breakdown Spectroscopy abbreviated "Laser Induced Breakdown Spectroscopy”
  • LIF laser-induced fluorescence
  • the plasmas can be generated by X-ray radiation of parallel rays, the source of which is preferably a femtosecond or even nanosecond X-ray laser clocked between 5 Hz and several kHz.
  • the convergence of X-rays is obtained using mirrors (parabolic, ellipsoidal, concave) capable of reflecting X-rays, such as mirrors consisting of a silicon wafer covered by alternating layers of chromium and scandium.
  • the incidence of the radiation is preferably grazing on the surface of the mirror (ie a radiation almost parallel to its surface), in order to allow an important reflection.
  • the device equipped with such an X-ray source allows an analysis of the X-ray fluorescence of the segregated samples on the surface or in the thickness of the biological analysis support. Indeed, by these X-rays, the material - and especially the phosphorus - contained in the samples re-emits energy in the form, among others, of X-rays and other types of electromagnetic radiation; it is X-ray fluorescence or X-ray secondary emission.
  • the analysis and the mapping of this X-ray fluorescence or of these other radiations make it possible to carry out a rapid and semi-quantitative mapping of the sample on the surface of the support.
  • This rapid analysis may allow for example to define the areas to be analyzed more finely by the technique "LIBS".
  • the acquisition of the X-ray fluorescence can be carried out by using X-ray-doped doped polymer optical fibers in the device.
  • the doping agents used can be x-ray luminescent compounds, and their introduction into the optical fiber transforms the X-ray radiation. in a radiation conductible by the fiber.
  • This same principle can be used for the selective acquisition of the emission lines of the targeted elements in the plasma, by introducing into the optical fibers of acquisition a chemiluminescent, fluorescent doping element, etc., which is excitable only at the length of waves of the targeted line and which re-emits at a wavelength on the one hand absent from the spectrum of the plasma and on the other hand well conducted by the fiber considered.
  • said biomolecular targets are chosen from the group consisting of unlabeled nucleic acids, proteins, peptides, polypeptides, polynucleotides such as DNA and sugars. It should be noted that it is generally possible to use as a target any other biological compound that can be characterized by such an element intrinsic to its structure or strongly binding thereto.
  • these probes are chosen from the group consisting of nucleic acids, nucleic acid peptides (“PNA”), acids locked nucleotides (“LNAs”), ribonucleic ethers ("RNAs”), antibodies, hemi-antibodies, hemi-antibodies coupled with nucleic acids and protein receptors. It should be noted that any other biological compound that can specifically bind to a target and can be immobilized on an analysis support can generally be used as a probe.
  • said or each exogenous element (i.e. does not exist in the target structure) is deposited in known quantity on the analysis support, either homogeneously or specifically with the probes.
  • these exogenous elements are either included in compounds that will be grafted onto the support together with the probes in known proportions, or directly implanted in the structure of the probe by atomic substitution or strong interaction.
  • the exogenous elements may be included in a molecular matrix facilitating the formation of the plasma (ie substance with high optical absorbance for the excitation wavelength and low ablation energy), this matrix being homogeneously deposited on the surface of the biological analysis support.
  • PNA PNA probes
  • concentrations of the targets are very low.
  • PNA do not contain phosphorus, and more generally no atom having an emission line of 253 nm, 194 nm or 203 nm allows to increase the detection sensitivity by completely eliminating the signal of the probe.
  • said or each chemical element to be quantified may be chosen from the group consisting of phosphorus, sulfur, iodine, nitrogen, oxygen and carbon.
  • nucleic acids or phosphorylated proteins are used as targets, and the phosphorus present in these targets is used as an element to be quantified for detection in the plasma, in step b).
  • Atomic and ionic emission lines of phosphorus are detected in step b) at a value wavelength which is selected from the group consisting of 138 ⁇ 3 nm, 148 ⁇ 3 nm, 154 ⁇ 3 nm, 167 ⁇ 3 nm, 177 ⁇ 3 nm, 190 ⁇ 3 nm, 193 ⁇ 3 nm, 203 ⁇ 3 nm, 213 ⁇ 3 nm and 253 ⁇ 3 nm, and which is preferably 203 ⁇ 3 nm.
  • nucleic acids or proteins are used as targets and probes, and sulfur and iodine are used respectively in said targets and probes as an element to be quantified for detection in the plasma, in step b), of atomic and ionic emission lines of sulfur and iodine.
  • the sulfur emission lines are detected in step b) at a value wavelength which is selected from the group consisting of 167 ⁇ 3 nm, 181 ⁇ 3 nm, 190 ⁇ 3 nm, 199 ⁇ 3 nm, 415 ⁇ 3 nm, 458 ⁇ 3 nm, 922 ⁇ 3 nm, 942 ⁇ 3 nm, 968 ⁇ 3 nm and which is preferably 415 ⁇ 3 nm, and the emission lines of iodine at a wavelength of value which is selected from the group consisting of 150 ⁇ 3 nm, 161 ⁇ 3 nm, 170 ⁇ 3 nm, 178 ⁇ 3 nm, 183 ⁇ 3 nm, 511 ⁇ 3 nm, 661 ⁇ 3 nm, 740 ⁇ 3 nm, 746 ⁇ 3 nm, 804 ⁇ 3 nm, 839 ⁇ 3 nm, 902 ⁇ 3 n
  • chlorine or bromine is advantageously used as an exogenous element for said targets and said probes, for the detection in the plasma at step b) of atomic and ionic emission lines of the sulfur and iodine, respectively, to remove the indeterminacy of the signals generated by these probes as well as by these targets.
  • the emission lines of bromine at a wavelength of value selected from the group consisting of 154 ⁇ 3 nm, 158 ⁇ 3 nm, 163 ⁇ 3 nm, 614 ⁇ 3 nm, 635 ⁇ 3 nm, 655 ⁇ 3 nm, 663 ⁇ 3 nm, 751 ⁇ 3 nm, 780 ⁇ 3 nm, 793 ⁇ 3 nm, 798 ⁇ 3 nm, 813 ⁇ 3 nm, 827 ⁇ 3 nm, 844 ⁇ 3 nm, 889 ⁇ 3 nm, 916 ⁇ 3 nm nm and 926 ⁇ 3 nm.
  • DNA is used for said targets and in that the element to be quantified is a cation bound to these targets and selected from the group consisting of sodium, magnesium and potassium for detection.
  • the plasma in step b), atomic and ionic emission lines of phosphorus. In this case, it is detected in step b):
  • the emission lines of sodium at a wavelength of value selected from the group consisting of 268 ⁇ 3 nm, 285 ⁇ 3 nm, 291 ⁇ 3 nm, 292 ⁇ 3 nm, 298 ⁇ 3 nm, 314 ⁇ 3 nm; nm, 321 ⁇ 3 nm, 325 ⁇ 3 nm, 330 ⁇ 3 nm, 353 ⁇ 3 nm, 363 ⁇ 3 nm, 449 ⁇ 3 nm, 466 ⁇ 3 nm, 497 ⁇ 3 nm, 569 ⁇ 3 nm, 589 ⁇ 3 nm nm, 616 ⁇ 3 nm and 819 ⁇ 3 nm; or
  • the emission lines of magnesium at a wavelength of value selected from the group consisting of 285 ⁇ 3 nm, 880 ⁇ 3 nm, 309 ⁇ 3 nm, 333 ⁇ 3 nm, 383 ⁇ 3 nm, 457 ⁇ 3 nm; nm, 473 ⁇ 3 nm, 518 ⁇ 3 nm, 552 ⁇ 3 nm, 571 ⁇ 3 nm, 925 ⁇ 3 nm, 964 ⁇ 3 nm and 941 ⁇ 3 nm; or
  • the emission lines of potassium at a wavelength of value selected from the group consisting of 404 ⁇ 3 nm, 535 ⁇ 3 nm, 580 ⁇ 3 nm, 693 ⁇ 3 nm, 766 ⁇ 3 nm, 769 ⁇ 3 nm, 825 ⁇ 3 nm, 850 ⁇ 3 nm, 890 ⁇ 3 nm and 959 ⁇ 3 nm.
  • the nitrogen and / or the carbon and / or the oxygen present in said targets and said probes are advantageously used as element (s) to be quantified for detection.
  • step b) atomic emission lines of nitrogen and / or carbon and / or oxygen to evaluate the quantity of targets and probes on said support, which contains neither carbon, neither nitrogen nor oxygen. In this case, it is detected in step b):
  • the lines of emission of nitrogen at a wavelength of value which is selected from the group consisting of 174 ⁇ 3 nm, 575 ⁇ 3 nm, 744 ⁇ 3 nm, 821 ⁇ 3 nm, 859 ⁇ 3 nm , 865 ⁇ 3 nm, 871 ⁇ 3 nm, 938 ⁇ 3 nm and 870 ⁇ 3 nm, and which is preferably 575 ⁇ 3 nm;
  • the carbon emission lines at a wavelength of value which is selected from the group consisting of 156 ⁇ 3 nm, 165 ⁇ 3 nm, 175 ⁇ 3 nm, 193 ⁇ 3 nm, 247 ⁇ 3 nm, 538 ⁇ 3 nm, 600 ⁇ 3 nm, 711 ⁇ 3 nm, 833 ⁇ 3 nm, 908 ⁇ 3 nm, 911 ⁇ 3 nm, 965 ⁇ 3 nm and 940 ⁇ 3 nm, and which is preferably 600 ⁇ 3 nm; and or
  • the oxygen emission lines at a value wavelength which is selected from the group consisting of 615 ⁇ 3 nm, 645 ⁇ 3 nm, 700 ⁇ 3 nm, 725 ⁇ 3 nm, 777 ⁇ 3 nm , 822 ⁇ 3 nm, 844 ⁇ 3 nm and 926 ⁇ 3 nm, and which is preferably 615 ⁇ 3 nm.
  • this method (i) of double laser pulse it can be implemented with two other crossed beams for the second pulse (power, frequency, wavelength), of the same nature as those of the first pulses. Indeed, given the lifetime of about 2 ⁇ s of the plasma, the latter is optically analyzable from about 100 ns after its formation (end of black body type radiation and emergence of the desired atomic and ionic lines).
  • This second laser pulse shortly before its extinction, makes it possible to extend the life of the plasma and to amplify the emission emitted. It is advantageous to choose a wavelength characteristic of the atom for which the target atom (s) have a strong absorption or emission. It is thus possible to increase the light emission of the ions and / or the targeted atoms (in this case phosphorus), by exalting their own fluorescence by this second laser pulse.
  • ablation of material on the surface of the biological analysis support and the formation of the plasma can be decoupled.
  • a first UV laser pulse ablates part of the surface of the biochip and expels it above it, then a second pulse advantageously using a femtosecond laser at a frequency of 600 Hz to 1 GHz creates the plasma and generates the characteristic emission of its constituents.
  • a third pulse can then be used to exalt the fluorescence of the targeted compounds.
  • the method according to the invention thus makes it possible to detect biomolecular targets efficiently, quickly and without marking, in particular from the fluorescence of the constituent atoms of the nucleic acid molecules after the emission of a plasma.
  • the aforementioned calibration of the targets is necessarily carried out via standardization of their respective sizes.
  • a device according to the invention for implementing the aforementioned quantitative measurement method comprises:
  • a support of biological analysis preferably substantially planar, such as a biochip for example with matrix of probes, a transfer membrane or an electrophoresis gel or of chromatography,
  • a plasma generation unit which comprises means for focusing and superimposing on each measurement point at least two laser beams by simultaneously crossing these beams on this support in order to extract a hot plasma containing at least one chemical element to be quantified, such as that the phosphorus, which is present in the targets, these means for focusing and superimposing the beams comprising a scanning head adapted to shape collinearly and a mirror system arranged at the output of this head which cooperates with optical discs rotary mirrors for deflecting the beams towards the support so as to scan the measuring points of the latter,
  • a spectrography unit which is connected to these confinement means by acquisition optical fibers opening into said confinement means, and which is adapted to detect and analyze the emission light lines of the extracted plasma for each measurement point, such that the concentration in each measuring point of said one or more element (s) to be quantified from one of the intensities of these lines and from calibration curves is determined.
  • said means for focusing and superimposing the beams can essentially comprise:
  • said scanning head which comprises:
  • an inverted return pyramid comprising at least one stage designed to reflect tangentially incident beams emitted by several laser sources so as to make them collinear at the output of this pyramid, and
  • an afocal optical system arranged below the top of this pyramid, preferably a beam-reducing telescope, designed to receive these collinear beams by reducing their diameters and the distances separating them mutually, and
  • said system of planar, parabolic or ellipsoidal mirrors which cooperates with said rotating mirror optical disks in horizontal and vertical directions and, preferably, which furthermore cooperates with a deflection periscope coupled to these disks so that the collinear beams reduced by this afocal system are focused and crossed on each measuring point.
  • said confinement means are able to optically confine each extracted plasma and comprise a plurality of open chambers which are each delimited by a lateral wall arranged perpendicularly to said support, the internal face of this wall being able to reflect the light accumulated in this chamber and in particular the wavelengths of the lines of said chemical elements to be quantified, and at least one of said acquisition optical fibers passing through this wall.
  • said means of optical confinement of each plasma can comprising a plurality of adjacent rings for integrating the light emitted by said plasma, said lateral wall being of substantially circular cross-section, the free end of several of said acquisition fibers opening inside the chamber formed by each ring through openings in said wall.
  • said means of optical confinement of each plasma can comprise a plurality of integration chambers of the light emitted by this plasma, said lateral wall of each chamber being of substantially shaped section. equilateral triangle and these chambers being two by two contiguous by one of their sides each being provided with said acquisition fibers in each of their three vertices.
  • means for relative displacement of the chambers with respect to the support such as sliding rails of said chambers equipped with electromagnets, are advantageously provided to cover the entire surface to be analyzed of the support.
  • said means of optical confinement of each plasma can comprise a plurality of integration chambers of the light emitted by this plasma which are equipped with at least two sets of fibers. acquisition arranged staggered, the respective optical apertures are able to cover by mutual overlap the entire surface to be analyzed said carrier.
  • the device according to the invention then does not use relative displacement of the optical confinement chambers with respect to the analysis support.
  • said optical confinement chambers of the extracted plasmas are themselves housed in a closed enclosure which contains the support and which is filled with a plasmogenic gas such as argon, helium, nitrogen or a mixture of these gases, at least the upper face of this chamber being transparent to the or each excitation wavelength of the laser beams and to the acquisition wavelengths of the light generated by this plasma, this chamber being equipped with a plasma gas filling valve and an air purge valve.
  • a plasmogenic gas such as argon, helium, nitrogen or a mixture of these gases
  • the biological analysis support used in connection with the device according to the invention is preferably formed of a biochip comprising on its surface a matrix of native probes, hybridized or complexed by said targets, this matrix comprising a multitude said measuring points each comprising a plurality of said probes and said or each chemical element to be quantified being present in these targets and, optionally, further in these probes.
  • said spectrography unit comprises at least one photomultiplier type spectrograph, and an optical filter that is only transparent at the desired wavelength can be arranged between each optical acquisition fiber and said spectrograph.
  • the spectrography unit comprises at least one photomultiplier type detector.
  • a photomultiplier type detector for the detection of plasma emission lines, a camera type "CCD” or “CCD” intensified ("Charge Coupled Device", ie device coupled with charge) or a "galette” of micro-channels.
  • an optical filter which is only transparent at the desired wavelength can be arranged between each optical acquisition fiber and the spectrograph.
  • each of the optical acquisition fibers from the optical confinement means ie each "mother” fiber
  • each "mother” fiber is divided into as many fibers as there are wavelengths of elements to be observed.
  • Each "mother” fiber is disposed in a beam opposite a detector which may be a photosensitive cell such as a photomultiplier ("PM" abbreviated), a "Channel Tron", a "slab” of micro-channels, etc.
  • An optical filter selecting only the desired wavelength can be interposed between each optical fiber acquisition and the detector, to inject the light into the latter.
  • a suitable lens can be glued at the output of each optical fiber.
  • these filters can advantageously be replaced by diffraction gratings.
  • Figure 1 is a schematic side view of a plasma generating unit which is included in a quantitative measuring device according to the invention and which is illustrated in connection with a biological analysis medium incorporating the 2 is a schematic view, partly in section and in perspective, of an optical return pyramid included in a laser scanning head of the plasma generating unit of FIG. 1,
  • FIG. is a schematic perspective view of a simplified variant of the deflection pyramid according to FIG. 2
  • FIG. 4 is a diagrammatic part view 1 of the analysis support of FIG.
  • FIG. 1 which is surmounted by means of optical confinement of the plasmas respectively generated at various measurement points, according to an example of a first embodiment of the invention
  • FIG. 6 is a diagrammatic view in vertical section according to a variant of FIG. 5 of one of these means of optical confinement arranged above the analysis support
  • FIG. 7 is a schematic view in vertical section according to another variant of FIG. 5 of such optical confinement means
  • FIG. 8 is a schematic view in vertical section.
  • FIG. 9 is a partial schematic view from above of the analysis support of FIG.
  • FIG. 10 is a partial schematic view from above. of the analysis support of FIG. 1 surmounted by means of optical confinement of the plasmas according to another example of this first embodiment of the invention
  • FIG. 11 is a partial schematic view from above of the analysis support of FIG. 1 surmounted optical confinement means according to the example of Figure 9, further illustrating control members of the displacement of these confinement means relative to this support in a given position
  • Figure 12 is a view similar to Figure 11 showing these control members of the displacement of the confinement means in another operating position
  • FIG. 13 is a schematic side view of the analysis support of FIG. 1 which is housed in a Plasma confinement means according to a second embodiment of the invention, which enclosure is illustrated with a portion of the adjacent plasma generating unit.
  • the quantitative measuring device 1 according to the invention of biomolecular targets comprises:
  • a plasma generation unit 3 which comprises means 4 for focusing and superimposing on each measurement point at least two laser beams by simultaneously crossing these beams on this support 2 to extract a hot plasma P (visible in Figures 5 and 13) containing at least one chemical element to quantify present in these targets, means of confinement 5 of each plasma P extracted by this unit 3, arranged above the support 2 (see FIG. 4 and following), and
  • the focusing means 4 of the laser beams F on each measurement point essentially comprise, with reference to FIG. 1:
  • a scanning head 7 which is able to shape these bundles F collinearly and which comprises:
  • an inverted return pyramid 8 comprising at least one stage 8a designed to tangentially reflect incident F beams emitted by several laser sources 9 so as to make them collinear at the output of this pyramid 8 via high quality aluminum mirrors 8b, and
  • an afocal optical system 10 arranged below the top of this pyramid 8, preferably a beam-reducing telescope, which is designed to receive these collinear beams F 'by reducing their respective diameters and the distances separating them mutually, and
  • a system of planar, parabolic or ellipsoidal mirrors 11 which is arranged at the output of the scanning head 7 and which cooperates with rotating optical discs 12 and 13 with mirrors 12a and 13a which deviate them in horizontal and vertical directions, and preferably which furthermore cooperates with a deflection periscope 14 coupled to these disks 12 and 13 so that the Collinear bundles F 'reduced by this afocal system 10 are focused and crossed on each measurement point.
  • This scanning head 7 is used as follows.
  • the different laser beams F (two in number in the example of FIG. 1) are reflected tangentially on the high-quality mirrors 8b of the return pyramid 8 which ensure their collinearity, for any angle of the direction of incidence. of these bundles F
  • this angle is equal to 90 °.
  • the reference pyramid 8, 8 ' may have a single stage 8a (FIG. 3) using, for example, four distinct laser sources 9, or several stages 8a that can typically be up to five (FIG. 2) using in this case for example a maximum of one hundred laser sources 9 in parallel.
  • the increase in the number of sources 9 makes it possible in particular to increase the resolution of the scan, with a greater spatial coverage of the beams on the scanning zone.
  • bundles F 'with a diameter of 2 mm and spaced 2.5 mm at the exit of the pyramid 8 are reduced, at the output of the telescope 10, to a diameter of 500 microns and a spacing of 500 microns.
  • the measuring device 1 furthermore comprises a system of electronic control (not shown) for precisely controlling and controlling the rotational speeds of these optical discs 12 and 13.
  • each mirror 12a, 13a is indeed positioned uniquely on the rotating discs 12 and 13 in terms of angle of inclination, so as to converge the different beams F "on a well localized area of support 2.
  • the distance between the two rotating discs 12 and 13 is preferably reduced by adding the deflection periscope 14 which adds two additional reflections on the path of the beams.
  • the focusing of the different beams F "on the support 2 can be ensured by the afocal system 10, by playing in particular on the spacing of the optics, by parabolic mirrors which are positioned on the vertical rotating optical disk 13 located at the exit of the head 7, by an auxiliary system composed of lenses and / or focusing mirrors at the exit of the scanning head 7, playing on the inclination of the mirrors of the pyramid to make the beams F 'intended to cross slightly collinear.
  • only the beams of each group to be crossed on the medium 2 will be collinear, so that only the collinear beams of each group converge in one. same point of support 2.
  • each laser beam F " is focused on the surface to be analyzed of the support 2 by the mirrors of the head
  • each beam has a density of power or irradiance at the surface of each measuring point which is greater than 0.5 GW.cm '2 which is sufficient for obtaining by vaporisation a hot plasma P with a lifetime of approximately 2 ⁇ s, so general to a power threshold per unit area greater than the ablation threshold of the support material.
  • FIGS. 4 to 12 illustrate examples of structures that can be used for the optical confinement means 5, 5 ', 5 "of each generated plasma P, so that it does not interfere with the other measurement points to be analyzed, before simultaneous detection emission lines of the plasma P corresponding to each beam crossing
  • the optical analysis of the plasma P generated point by point on the surface of the biological analysis support 2 makes it possible to reconstitute an image at each measurement point the quantity of atoms of the element analyzed, allowing to deduce the number of targets according to the abundance of the element in the raw formula of the target.
  • the emission lines of the plasma P generated at each measurement point may, for example, be picked up by a plurality of optical acquisition fibers 6 (at least three optical fibers 6), the respective free ends of which are arranged. regularly on a circular ring 5 of 1 to 20 cm in diameter and reduced in height which is designed to optically isolate the plasma P.
  • the inner face of the side wall 5a, 5b, 5c of this ring 5 is a concave mirror (see FIGS. 5 and 6), multi-faceted (see FIG. 7), plane (FIG. 8), ellipsoidal or even parabolic, provided that it is capable of reflecting the wavelengths of the lines of the elements of interest by forming thus a ring of integration of the emitted light.
  • the curvatures or inclinations of the mirrors are preferably designed to converge the light on the opposite inner face of the ring 5.
  • each acquisition fiber 6 may be capped with a set of suitable lenses, such as a fiber collimator, to correctly inject the radiation emitted by the plasma P into the spectrography unit, the fields respectively seen by the fibers 6 and capped with corrective lenses, or optical apertures, overlapping each other to form a surface comparable to a circle (or to a polygon inscribed in a circle), ie an optical circle 16.
  • suitable lenses such as a fiber collimator
  • each plasma P is generated in this optical circle 16, which is such that the cumulative optical path of the light of the plasma P to the fibers 6 is constant regardless of the position of the plasma P in this circle 16.
  • the chambers 5 'of optical confinement of the sma P each have an equilateral triangle shape and each have the same type of internal side wall face 5a 'as the aforementioned rings 5.
  • At the three vertices of each triangle 5 'three optical acquisition fibers 6' are respectively arranged, each with an optical opening greater than or equal to 60 °, so as to capture the direct light of the corresponding plasma P and that which is reflected on the walls of the triangle 5 '.
  • This method makes it possible to scan the entire surface to be analyzed by the crossed laser beams with, for example, a pitch of 10 ⁇ m which corresponds to the zone ablated at each laser pulse, the optical confinement chambers 5, 5 'allowing the acquisition simultaneous multiple plasmas P.
  • these optical confinement chambers 5 ' can slide along guides or rails 17 via support members 17a of the latter arranged on each side of the analysis support 2, under the control of two electromagnets 18 which are arranged outside and on either side of the support 2 and which alternately attract these chambers 5, 5 ', respectively in association with two metal stops 17b for these electromagnets 18.
  • the surface of the support 2 is analyzed without relative displacement of the optical confinement chambers 5 "with respect to the support 2, staggering the acquisition optical fibers 6" laterally on the one hand. and second of the support 2.
  • the set of respective optical openings of the acquisition fibers 6 "encompasses the entire surface of the support 2.
  • a slight cover 19 of the optical openings of the optical fibers 6" laterally on either side of the support 2 thus allows the analysis of the surfaces located above the limits of these optical openings.
  • the support 2 to be analyzed as well as the above-mentioned means 5, 5 'of optical confinement (in this example constituted by the rings 5) are all arranged in a closed enclosure 20 , at least the upper face 21 of which is provided transparent to the excitation wavelengths of the laser beams and to the acquisition wavelengths of the light generated by this plasma P.
  • the chamber is filled with a plasmogenic gas (e.g. argon / nitrogen, helium) through a filling valve 23, these valves 22 and 23 being mounted in the lower support surface 24 of the enclosure 20.
  • a plasmogenic gas e.g. argon / nitrogen, helium
  • an optical confinement unit is provided by generated plasma.
  • the areas of the support 2 masked by this unit can be analyzed after a relative translation of these areas within the optical confinement unit, such as the above-mentioned circle 5 or optical triangle 5 '.

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif et un procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur d'un support plan d'analyse biologique. Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) on focalise et superpose sur chaque point de mesure de ce support au moins deux faisceaux laser (F") par croisements simultanés de ces faisceaux, pour en extraire un plasma chaud (P) confiné comprenant un élément chimique à quantifier présent dans les cibles et un autre élément chimique exogène aux cibles et présent en quantité connue sur ce support, b) on détecte et analyse, pour chaque point de mesure, des raies lumineuses d'émission de chaque plasma qui correspondent à l'élément à quantifier et à l'élément exogène, en mesurant les intensités de ces raies, puis c) on détermine, via un étalonnage préalable des raies de l'élément à quantifier établissant une corrélation entre les intensités des raies propres à cet élément et les concentrations de ce dernier dans des mélanges en proportions connues de l'élément à quantifier et de l'élément exogène, la concentration dans chaque point de mesure de l'élément à quantifier.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE QUANTITATIVE A HAUTE CADENCE DE CIBLES BIOMOLECULAIRES PRESENTES SUR OU DANS UN SUPPORT D'ANALYSE BIOLOGIQUE
La présente invention concerne un procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur d'un support plan d'analyse biologique, et un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention s'applique notamment à la mesure quantitative d'acides nucléiques ou de protéines non marqués ségrégués à la surface ou dans l'épaisseur d'un support d'analyse biologique de préférence plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de transfert, un gel d'électrophorèse ou de chromatographie ou un support en verre ou en polyimide (e.g. en Kapton®), à titre non limitatif.
La technique de spectroscopie d'émission optique induite par laser (« Laser-induced breakdown spectroscopy » en anglais ou « LIBS ») est une méthode très puissante pour déterminer la composition élémentaire de la surface d'un matériau. Cette composition est obtenue en mesurant les raies d'émission provenant des atomes ou des ions constitutifs d'un plasma transitoire induit à la surface du matériau par un faisceau laser, et l'analyse élémentaire de cette surface peut être obtenue en balayant celle-ci par une source laser effectuant des tirs successifs selon une grille régulière, de manière à cartographier la surface de ce matériau. A chaque tir laser, le spectre d'émission des éléments chimiques recherchés est enregistré, ainsi que les coordonnées de focalisation du faisceau à la surface du matériau. Il est alors possible de reconstituer une image point à point de la surface du matériau à une longueur d'onde sélectionnée correspondant à un élément chimique déterminé. Si une méthode de calibration est appliquée, les variations d'intensité de l'image obtenue par cartographie indiquent l'abondance de cet élément à la surface du matériau.
Toutefois, un inconvénient majeur de cette technique est que le nombre très élevé de tirs laser nécessaires pour réaliser une cartographie à haute résolution de la surface (résolution comprise entre 300 nm et 1 μm), implique des temps d'analyse de plusieurs heures voire de plusieurs jours, dès que la surface analysée excède quelques millimètres carrés. Cette lenteur de l'acquisition de l'image rend la « LIBS » inapplicable comme méthode d'analyse pour un grand nombre d'applications en biologie, et plus particulièrement pour la génomique et la protéomique.
Dans le domaine de la génomique, les biopuces représentent une révolution majeure dans les techniques de biologie moléculaire de ces dix dernières années. En permettant l'étude simultanée du niveau d'expression de plusieurs centaines, voire de plusieurs milliers de gènes, elles permettent d'appréhender l'impact d'une maladie ou d'un stress (e.g. résultant d'une radiation, d'une pollution ou de la prise d'un médicament) au niveau du génome complet d'un individu. Ces techniques deviennent ainsi de plus en plus utilisées en biologie moderne. Les biopuces se répartissent en deux grandes familles, comprenant les puces microfluidiques et les puces à matrices de sondes. Ces dernières sont organisées en matrices de « spots » ou points de mesure, et elles sont généralement obtenues en déposant ou en synthétisant à des coordonnées précises sur un support passif des sondes moléculaires formées de biopolymères tels que de l'ADN, des protéines ou des anticorps, par exemple. Ces biopuces à matrices de sondes permettent d'identifier les cibles présentes dans un échantillon biologique lorsque ces cibles viennent s'hybrider spécifiquement au niveau de chaque « spot » de sondes.
Il existe, d'une part, les biopuces à haute complexité (plus de 5000 spots) pour les études pan-génomiques et, d'autre part, les biopuces à basse et à moyenne complexité, qui sont dédiées à une thématique donnée (e.g. tests thérapeutiques, détecteur biologique).
La technologie actuelle des biopuces à matrices de sondes présente un certain nombre de limitations majeures, notamment : - le fort encombrement stérique des marqueurs fluorescents, qui modifie de façon sporadique la reconnaissance entre les sondes et les cibles et entraîne ainsi de nombreux artefacts de mesure diminuant la reproductibilité des expériences ;
- l'absence de mesure quantitative, qui interdit de comparer les niveaux d'expression entre deux cibles différentes ; et - le coût élevé de cette technologie actuelle, tant en production qu'en mise en œuvre.
C'est la raison pour laquelle plusieurs alternatives à cette technologie ont été développées récemment, avec en particulier : - les technologies « RT PCR » en carte microfluidique
(« Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction », soit une amplification en chaîne par polymérisase après transcription inverse d'un acide ribonucléique en ADN complémentaire), qui permettent d'amplifier jusqu'à 386 cibles différentes en parallèle, avec une simplification de la mise en œuvre et une amélioration de la détection qui sont toutefois pénalisées par l'absence de mesure quantitative pour une réelle comparaison entre les cibles, par la limitation du nombre de cibles à analyser (bien en dessous d'une biopuce de basse complexité) et par un coût élevé de mise en œuvre ;
- les biopuces sur film « Nylon », basées sur l'hybridation des cibles dans un grand volume et un marquage en chimiluminescence, qui procurent également une mise en œuvre simplifiée et une détection améliorée, mais qui sont néanmoins pénalisées par l'absence de mesure quantitative, le grand volume de réaction requis (limitant pour les analyses d'échantillons de faible concentration) et les coûts très élevés de production et de mise en œuvre ; et
- de nouveaux concepts de biopuces sans marquage, qui sont basés sur la détection de la cible par mesure de l'impédance ou par la résonance plasmonique de surface (« SPR » ou « Surface Plasmon Résonance »), et qui ont été notamment décrits dans David F et al., Bioscience Bioelectron. 2005, dans Li C. M. et al., Front Biosci. 2005 ou dans Macanovic A. et al., Nucleic Acid Research 2004, mais qui ne permettent pas une quantification du nombre de cibles, posent problème pour réaliser des puces à haute densité et impliquent, tant pour la technique de mesure de l'impédance que pour la technique« SPR », des artefacts de mesure dus aux tailles et aux conformations variables des cibles.
Des procédés de spectrométrie « ICP » (« Inductively
Coupled Plasma », i.e. spectrométrie de masse couplée à un plasma induit) ont également été mis au point, cf. Inchul Yang et al., Analytical Biochemistry (2004), vol.335, 150-161 ou Heinrich F. Arlinghaus et al., Analytical Chemistry (1997), vol.69, n°18, 3747-3753, procédés qui permettent de doser le phosphore contenu dans un acide nucléique pour estimer par exemple le taux d'hybridation de celui-ci sur une biopuce à « PNA » (« Peptide Nucleic Acid », i.e. acides nucléiques peptides).
Toutefois, il apparaît que l'utilisation de la spectrométrie de masse pour doser le phosphore à partir d'un plasma généré à la surface d'une biopuce est une méthode lente (prenant typiquement plusieurs heures pour 1 cm2 sur la biopuce), et que l'instrumentation nécessaire à sa mise en oeuvre est coûteuse. De plus, il est à noter que cette technique de spectrométrie « ICP » n'est pas quantitative, car elle ne fournit que la quantité brute de nucléotides hybrides, sans pouvoir différencier entre la taille et le nombre des biomolécules.
Le document de Brevet US-A-2006/0105354 présente une méthode de quantification en temps réel d'une multitude de cibles formées d'acides nucléiques marqués et qui se sont liées à la surface d'une biopuce de type à matrice de sondes, comprenant notamment l'émission d'un faisceau laser d'excitation à la surface de la matrice et la mesure de l'émission lumineuse des cibles hybridées en réponse à ce faisceau d'excitation.
Un inconvénient majeur de cette méthode est qu'elle n'est pas non plus quantitative au sens indiqué ci-dessus, et qu'elle requiert en outre la présence de molécules marquées liées aux molécules cibles. Dans le domaine de la protéomique, le problème posé se complique encore. En effet, en plus d'identifier, dans un extrait cellulaire, les protéines présentes ainsi que leurs concentrations, il est nécessaire _
d'identifier leurs modifications post-traductionnelles. En effet, l'activité d'une protéine est très souvent déterminée par ses modifications post- traductionnelles. Parmi les modifications possibles, les phosphorylations sont sans doute les plus importantes biologiquement. Les techniques d'électrophorèse à deux dimensions (2D) sont les techniques d'analyses parallèles les plus utilisées pour l'analyse de mélanges de protéines. Ces techniques consistent à faire migrer un mélange de protéines dans un gel, successivement suivant deux directions orthogonales, en fonction de critères physico-chimiques différents (e.g. chromatographie ou électrophorèse). Les protéines sont alors séparées selon leur affinité à un solvant, leur charge électrique, leur masse, leur forme, leur modification, etc., et après avoir été pigmentées par un pigment fluorescent ou non, les protéines sont identifiées en fonction de leur position ou tache sur les gels 2D par rapport aux migrations obtenues dans un gel référence. Pour mettre en évidence les modifications post-traductionnelles, notamment les phosphorylations, il est nécessaire de réaliser l'analyse de chaque tache du gel. Différentes méthodes d'analyses sont possibles, telles que la spectrométrie de masse, la RMN, les marquages immunologiques, la technique « ICP », par exemple. La mise en évidence des modifications post-traductionnelles est pour l'instant très lourde à réaliser.
Depuis quelques années, des biopuces à anticorps sont disponibles sur le marché pour l'analyse d'extraits protéiques. Ces biopuces permettent d'analyser en parallèle l'expression de plusieurs centaines de gènes sous leur forme protéine dès lors qu'il existe des anticorps spécifiques pour les protéines souhaitées. Toutefois, cette technologie est limitée par la nécessité de marquer les protéines. Malheureusement, les chromophores utilisés pour le marquage modifient de manière aléatoire l'affinité des protéines pour leur anticorps. D'autre part, le marquage étant également aléatoire, les résultats sont difficilement interprétables et difficilement comparables entre différentes expériences. Pour évaluer par cette technique, par exemple avec le taux de modifications post-traductionnelles d'une protéine donnée entre deux conditions ou deux types cellulaires, il est nécessaire de disposer de deux anticorps reconnaissant de manière exclusive chacune des formes de la protéine. Ceci, en plus d'être coûteux, est techniquement très difficile à obtenir. La technique « LIBS » représente une alternative pour l'analyse sans marquage préalable des biomolécules ségréguées sur tous les types de supports (e.g. membrane, gel, support plastique par exemple en Kapton®, support en silicium), ces supports étant les principaux types utilisés dans les analyses biologiques. La méthode d'analyse d'un produit biologique par « LIBS » consiste à doser un élément chimique constitutif de la biomolécule cible préalablement isolée, ségréguée ou purifiée sur un support de chromatographie, d'électrophorèse, une membrane, ou une biopuce.
Comme indiqué précédemment, le principal verrou technologique d'une analyse par « LIBS » est la lenteur du procédé, ce qui limite fortement l'utilisation de cette technique en biologie. En effet, les supports d'analyse en biologie font souvent plusieurs centimètres carrés de surface. L'imagerie, à une résolution de 10 microns par exemple, d'un support d'analyse de 1 cm2 nécessite ainsi de réaliser 1 000 000 de tirs laser jointifs, à raison d'un tir par position. Bien entendu, ce nombre est à multiplier par le nombre de tirs à effectuer par position, si la molécule à analyser se trouve dans l'épaisseur du support, tel que cela ce produit pour les gels d'électrophorèse par exemple.
Pour réaliser cette analyse en 1 seconde, il est nécessaire de disposer d'un laser UV de type méga Hertz avec une énergie suffisante pour induire un plasma sur le support à chaque tir (énergie typiquement supérieure à 60 micro joules par impulsion). Pour réaliser cette analyse en 1 minute, il est nécessaire d'avoir un laser UV avec une fréquence égale à 600 kilo Hertz et une énergie suffisante pour induire un plasma sur le support à chaque tir (également supérieure à 60 micro joules par impulsion). Ce problème peut être minimisé en réalisant des tirs non jointifs en contrepartie d'une dégradation de la résolution. Toutefois la fréquence reste élevée, même pour une image très dégradée. II est possible d'utiliser des lasers avec des longueurs d'onde plus grandes par exemple autour de 532 nm, du fait que ces lasers présentent généralement de plus grandes fréquences et de plus grandes énergies. Toutefois, en s'éloignant des UV lointains (266 nm), l'énergie nécessaire pour obtenir un plasma analysable augmente, et par exemple les lasers à 532 nm - d'énergie suffisante - ont des fréquences voisines des lasers UV lointains, ce qui pose alors le même problème que pour le domaine UV lointains.
Un but de la présente invention est de proposer un procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires, en particulier des protéines, présentes sur ou dans un support d'analyse biologique, qui remédie à l'ensemble des inconvénients précités.
A cet effet, le procédé de mesure selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) on réalise un balayage des points de mesure du support en déplaçant, focalisant et superposant sur chaque point de mesure de ce support au moins deux faisceaux laser par croisements simultanés de ces faisceaux, pour en extraire un plasma chaud et confiné comprenant au moins un élément chimique à quantifier présent dans lesdites cibles et au moins un autre élément chimique exogène à ces cibles et présent en quantité connue sur ou dans ce support, b) on détecte et l'on analyse, pour chacun de ces points de mesure, des raies lumineuses d'émission de chaque plasma qui correspondent au ou à chaque élément à quantifier et au ou à chaque élément exogène, en mesurant les intensités respectives de ces raies, puis c) on détermine, via un étalonnage préalable des raies du ou de chaque élément à quantifier établissant une corrélation entre les intensités des raies propres à cet élément à quantifier et les concentrations de ce dernier dans des mélanges en proportions connues du ou de chaque élément à quantifier et du ou de chaque élément exogène, la concentration dans chaque point de mesure du ou de chaque élément à quantifier ou d'un groupe l'incorporant au sein de ces cibles.
Le procédé selon l'invention permet ainsi de « scanner » (i.e. analyser en un balayage) rapidement et efficacement l'ensemble des points de mesure de la biopuce, tout en étant indépendant d'une variation du réglage de la puissance des lasers et de la sensibilité de la détection d'une acquisition à l'autre, grâce à la présence d'une référence interne correspondant à l'élément exogène, et de déduire de l'étape c) précitée le nombre d'atomes de l'élément recherché dans chaque point de mesure, pour en déduire le nombre de cibles à la coordonnée observée, le tout en moins de
1/1000 seconde par point de lecture en moyenne (temps de lecture = nombre de lectures / temps d'acquisition).
On notera que cette focalisation en un même point du support de plusieurs faisceaux laser qui est réalisée à l'étape a) permet d'additionner leurs énergies respectives afin de générer un plasma spectralement analysable.
On notera également que la corrélation utilisée à l'étape c) entre intensités de raies y et concentration x pour l'élément exogène ou pour l'élément à quantifier, est avantageusement de type linéaire (i.e. une relation de proportionnalité, à une constante affine près, selon l'équation y = ax + b).
Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on immobilise préalablement à l'étape a) lesdites cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur du support d'analyse biologique, lequel est de préférence sensiblement plan et est choisi dans le groupe constitué par les biopuces, les membranes de transfert, les substrats en silicium, en polyimide (e.g. en Kapton®) et en verre, et les gels d'électrophorèse et de chromatographie.
Avantageusement, ce support est formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité de sondes, et le ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans ces cibles et, optionnellement, en outre dans ces sondes.
On notera que quand l'élément à quantifier se trouve à la fois dans la sonde et dans la cible, ledit élément exogène permet de déduire la quantité de signal qui provient de la sonde et la quantité de signal qui provient de la cible. Cet élément exogène fournit une calibration interne qui permet de recaler le signal aux courbes de calibration, quelles que soient les atténuations de signal dues au réglage de l'appareil.
Selon une autre caractéristique de l'invention, ce procédé de mesure comprend en outre une étape ultérieure d'obtention d'une ou plusieurs images représentatives de la concentration du ou de chaque élément à quantifier ou du ou de chaque élément exogène, l'intensité de chaque pixel ou bien de chacune des trois couleurs R, G, B de ce dernier au sein de l'image étant représentative de l'intensité de la raie de l'élément correspondant observé.
L'image ainsi obtenue permet ainsi de cartographier l'abondance du ou de chaque élément à quantifier ou exogène sur ou dans le support d'analyse. La cartographie de l'épaisseur du support d'analyse est obtenue par des tirs successifs en une même position, les signaux obtenus étant soit accumulés, soit analysés séparément pour réaliser une cartographie en z du support, soit moyennée soit en tranche. Le nombre de tirs successifs dépend notamment de la profondeur d'analyse souhaitée et des propriétés physicochimiques du matériau du support.
Dans le cas précité d'une biopuce à matrice de sondes, l'immobilisation préalablement à l'étape a) de la molécule cible est obtenue, soit directement par une interaction avec le matériau constituant le support ou une rétention dans le maillage moléculaire du support, soit indirectement par une interaction avec un ligand (sonde) fixé sur ou dans le support. A titre de telles interactions sondes / cibles, on peut par exemple citer :
- l'hybridation entre une cible et une sonde de type acide nucléique ou assimilé (e.g. PNA, LNA), - les interactions protéine/protéine entre une cible et une sonde de type protéine telle que ligand/récepteur, anticorps/antigène fixé,
- des interactions mixtes acide nucléique ou assimilé / protéine, - des interactions de type acide nucléique / métal, ion ou toute autre molécule libre, ou
- des interactions de type protéine / ion ou toute autre molécule libre.
De préférence, chaque faisceau laser utilisé à l'étape a) est émis dans la gamme infrarouge - visible - ultraviolet selon une impulsion de durée comprise entre 1 fs et 100 ns, avec une fréquence comprise entre 600 Hz et 1 GHz et une énergie comprise entre 0,05 mW et 1 kW.
A titre encore plus préférentiel, chaque faisceau laser est émis dans l'ultraviolet à une longueur d'onde de 266 nm ou 193 nm, en utilisant par exemple les harmoniques d'un laser Nd : YAG (laser à grenat d'yttrium et d'aluminium dopé au néodyme), et selon une impulsion de durée inférieure à 10 ns préférentiellement égale à 5 ns.
En variante, les faisceaux laser utilisés dans l'étape a) peuvent être émis à des longueurs d'onde différentes, par exemple dans l'ultraviolet à une longueur d'onde de 266 nm et dans le visible à 532 nm, toujours selon une impulsion de durée inférieure à 10 ns et préférentiellement égale à 5 ns.
Selon une autre caractéristique de l'invention, lesdits faisceaux peuvent avantageusement être mis en forme à l'étape a) dans une tête de balayage, de telle manière que :
- ces faisceaux se réfléchissent tangentiellement sur une pyramide de renvoi à au moins un étage de réflexion pour donner en sortie de cette pyramide des faisceaux colinéaires, - ces faisceaux colinéaires passent à travers un système optique afocal, tel qu'un télescope réducteur de faisceaux, qui réduit les diamètres respectifs de ces faisceaux, et les distances les séparant mutuellement, puis que
- ces faisceaux colinéaires réduits soient ensuite focalisés et croisés sur chaque point de mesure par des miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux agencés en sortie de ladite tête de balayage.
Avantageusement, lesdits faisceaux colinéaires réduits peuvent être focalisés et croisés sur chaque point de mesure dudit support par deux disques optiques rotatifs à miroirs les déviant respectivement dans des directions horizontale et verticale et de préférence par un périscope de déviation couplé à ces disques.
On notera que la superposition par croisements des faisceaux laser génère à l'étape a) une densité de puissance en chaque point de mesure avantageusement supérieure à 0,5 GW.cm"2, pour l'obtention par vaporisation d'un plasma chaud qui présente une durée de vie d'environ 2 μs. Avantageusement, un croisement unique de deux faisceaux laser peut être utilisé pour ablater chaque point de mesure, d'une surface comprise entre 1 μm2 et 10 000 μm2. Le balayage de la totalité des points de mesure, selon un pas fixe, peut être ainsi réalisé par des miroirs de préférence ellipsoïdaux qui déplacent, focalisent et croisent les faisceaux sur la surface à analyser.
De préférence, on adjoint à chaque plasma confiné au moins un agent d'activation formé d'un gaz plasmogène, tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz.
Selon un premier mode préférentiel de réalisation de l'invention, les plasmas extraits sont respectivement confinés optiquement dans des chambres d'intégration de la lumière émise par le plasma correspondant qui présentent chacune une paroi latérale réfléchissante et qui sont chacune munies d'au moins une fibre optique d'acquisition de la lumière accumulée dans cette chambre, de telle sorte que chaque plasma n'interfère pas avec les autres points de mesure à analyser.
Conformément à ce premier mode, on soumet lors de l'étape a) le support d'analyse biologique à un mouvement relatif par rapport aux chambres de confinement optique en même temps que l'on fait se croiser lesdits faisceaux laser, et ces chambres sont de préférence alors guidées au- dessus dudit support qui reste fixe. En variante, on peut utiliser un chevauchement mutuel des ouvertures optiques respectives des fibres optiques d'acquisition en les agençant en quinconce au-dessus dudit support, pour couvrir toute la surface à analyser de ce dernier sans déplacement relatif de ces chambres par rapport audit support.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, lesdites chambres de confinement optique des plasmas extraits sont elles-mêmes logées dans une enceinte close qui contient le support, qui est remplie du gaz plasmogène et dont au moins la face supérieure est transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma. Conformément à ce second mode, on notera qu'il est possible de déplacer lesdits faisceaux laser simultanément en mouvement relatif par rapport audit support.
Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on utilise avantageusement la technique de spectroscopie d'émission optique induite par laser (« LIBS » en abrégé pour « Laser Induced Breakdown Spectroscopy ») pour la mise en œuvre des étapes a) à c) et, de préférence, on utilise en parallèle la technique de fluorescence induite par laser (« LIF » en abrégé pour « Laser Induced Fluorescence ») pour ces mêmes étapes.
Selon une autre caractéristique de l'invention, on peut générer les plasmas grâce à un rayonnement X de rayons parallèles, dont la source est préférentiellement un laser à rayons X femtoseconde voire nanoseconde cadencé entre 5 Hz et plusieurs kHz. La convergence du rayonnement X est obtenue à l'aide de miroirs (paraboliques, ellipsoïdaux, concaves) capables de réfléchir les rayons X, tels que des miroirs constitués d'une plaque de silicium recouverte par des couches alternées de chrome et de scandium. L'incidence du rayonnement est de préférence rasante à la surface du miroir (i.e. un rayonnement presque parallèle à sa surface), afin de permettre une réflexion importante. En plus de l'analyse du plasma, le dispositif équipé d'une telle source de rayons X permet une analyse de la fluorescence X des échantillons ségrégués à la surface ou dans l'épaisseur du support d'analyse biologique. En effet, de par ces rayons X, la matière - et notamment le phosphore - contenue dans les échantillons réémet de l'énergie sous la forme entre autres de rayons X et d'autres types de rayonnements électromagnétiques ; il s'agit de la fluorescence X ou émission secondaire de rayons X.
L'analyse et la cartographie de cette fluorescence X ou de ces autres rayonnements permettent de réaliser une cartographie rapide et semi-quantitative de l'échantillon à la surface du support. Cette analyse rapide peut permettre par exemple de définir les zones à analyser plus finement par la technique « LIBS ». L'acquisition de la fluorescence X peut être réalisée en utilisant dans le dispositif des fibres optiques en polymère dopé sensible aux rayons X. Les agents dopants utilisés peuvent être des composées luminescents sous rayons X, et leur introduction dans la fibre optique transforme le rayonnement X en un rayonnement conductible par la fibre.
On peut utiliser ce même principe pour l'acquisition sélective des raies d'émissions des éléments ciblées dans le plasma, en introduisant dans les fibres optiques d'acquisition un élément dopant chimioluminescent, fluorescent, etc., qui est excitable uniquement à la longueur d'ondes de la raie ciblée et qui réémet à une longueur d'onde d'une part absente du spectre du plasma et d'autre part bien conduite par la fibre considérée.
Avantageusement, lesdites cibles biomoléculaires sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques non marqués, les protéines, les peptides, les polypeptides, les polynucléotides tels que de l'ADN et les sucres. On notera que l'on peut d'une manière générale utiliser à titre de cible tout autre composé biologique pouvant être caractérisé par un tel élément intrinsèque à sa structure ou se liant fortement à cette dernière. Dans le cas préférentiel d'un support de type biopuce à matrice de sondes, ces sondes sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques, les acides nucléiques peptides (« PNA »), les acides nucléiques verrouillés (« LNA »), les éthers ribonucléiques (« ERN »), les anticorps, les hémi-anticorps, les hémi-anticorps couplés avec des acides nucléiques et des récepteurs protéiques. On notera que l'on peut d'une manière générale utiliser à titre de sonde tout autre composé biologique pouvant se lier spécifiquement à une cible et pouvant être immobilisé sur un support d'analyse.
Avantageusement, ledit ou chaque élément exogène (i.e. n'existant pas dans la structure des cibles) est déposé en quantité connue sur le support d'analyse, soit de manière homogène, soit spécifiquement avec les sondes. Lorsqu'ils sont déposés avec les sondes, ces éléments exogènes sont soit inclus dans des composés qui seront greffés sur le support conjointement aux sondes dans des proportions connues, soit directement implantés dans la structure de la sonde par substitution atomique ou interaction forte. Dans un mode encore plus avantageux, les éléments exogènes peuvent être inclus dans une matrice moléculaire facilitant la formation du plasma (i.e. substance à forte absorbance optique pour la longueur d'onde d'excitation et à faible énergie d'ablation), cette matrice étant déposée de manière homogène à la surface du support d'analyse biologique.
Il peut être avantageux d'utiliser des sondes « PNA », notamment lorsque les concentrations des cibles sont très faibles. En effet, l'affinité très élevée des « PNA » pour les acides nucléiques permet de piéger toutes les cibles de type oligonucléotides présentes dans le milieu à analyser.
De plus, comme les « PNA » sont capables de se fixer spontanément à une surface d'or par leur extrémité COOH ou NH, ces molécules « PNA » sont particulièrement avantageuses pour des dépôts de sondes sur un support plastique de biopuce (e.g. en polyimide Kapton®) recouvert d'une couche d'or de quelques microns d'épaisseur.
Le fait que les « PNA » ne contiennent pas de phosphore, et plus généralement aucun atome ayant une raie d'émission propre à 253 nm, à 194 nm ou 203 nm permet d'augmenter la sensibilité de détection en éliminant totalement le signal de la sonde. W
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Selon une autre caractéristique de l'invention, ledit ou chaque élément chimique à quantifier peut être choisi dans le groupe constitué par le phosphore, le soufre, l'iode, l'azote, l'oxygène et le carbone.
Avantageusement, l'on utilise à titre de cibles des acides nucléiques ou des protéines phosphorylées, et l'on utilise le phosphore présent dans ces cibles à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore. Dans ce cas, l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du phosphore à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 138 ± 3 nm, 148 ± 3 nm, 154 ± 3 nm, 167 ± 3 nm, 177 ± 3 nm, 190 ± 3 nm, 193 ± 3 nm, 203 ± 3 nm, 213 ± 3 nm et 253 ± 3 nm, et qui est de préférence de 203 ± 3 nm.
Egalement avantageusement, l'on utilise des acides nucléiques ou des protéines à titre de cibles et de sondes, et l'on utilise le soufre et l'iode respectivement dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode. Dans ces deux cas, l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du soufre à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 167 ± 3 nm, 181 ± 3 nm, 190 ± 3 nm, 199 ± 3 nm, 415 ± 3 nm, 458 ± 3 nm, 922 ± 3 nm, 942 ± 3 nm, 968 ± 3 nm et qui est de préférence de 415 ± 3 nm, et les raies d'émission de l'iode à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 150 ± 3 nm, 161 ± 3 nm, 170 ± 3 nm, 178 ± 3 nm, 183 ± 3 nm, 511 ± 3 nm, 661 ± 3 nm, 740 ± 3 nm, 746 ± 3 nm, 804 ± 3 nm, 839 ± 3 nm, 902 ± 3 nm, 905 ± 3 nm, 911 ± 3 nm et 973 ± 3 nm et qui est de préférence de 511 ± 3 nm.
Egalement dans ces deux dernier cas, l'on utilise avantageusement le chlore ou le brome à titre d'élément exogène auxdites cibles et auxdites sondes, pour la détection dans le plasma à l'étape b) de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode, respectivement, pour lever l'indétermination des signaux générés tant par ces sondes que par ces cibles. On alors détecte à l'étape b) : - les raies d'émission du chlore à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 35 ± 3 nm, 386 ± 3 nm, 413 ± 3 nm, 479 ± 3 nm, 490 ± 3 nm, 499 ± 3 nm, 507 ± 3 nm, 521 ± 3 nm, 539 ± 3 nm, 542 ± 3 nm, 774 ± 3 nm, 725 ± 3 nm, 741 ± 3 nm, 754 ± 3 nm, 822 ± 3 nm, 833 ± 3 nm, 837 ± 3 nm, 842 ± 3 nm, 858 ± 3 nm, 868 ± 3 nm, 894 ± 3 nm, 912 ± 3 nm, 919 ± 3 nm,928 ± 3 nm, 945 ± 3 nm et 959 ± 3 nm ; ou bien
- les raies d'émission du brome à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 154 ± 3 nm, 158 ± 3 nm, 163 ± 3 nm, 614 ± 3 nm, 635 ± 3 nm, 655 ± 3 nm, 663 ± 3 nm, 751 ± 3 nm, 780 ± 3 nm, 793 ± 3 nm, 798 ± 3 nm, 813 ± 3 nm, 827 ± 3 nm, 844 ± 3 nm, 889 ± 3 nm, 916 ± 3 nm et 926 ± 3 nm.
l'on utilise pour lesdites cibles de l'ADN et en ce que l'on utilise à titre d'élément à quantifier un cation lié à ces cibles et choisi dans le groupe constitué par le sodium, le magnésium et le potassium pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore. Dans ce cas, l'on détecte à l'étape b) :
- les raies d'émission du sodium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 268 ± 3 nm, 285 ± 3 nm, 291 ± 3 nm, 292 ± 3 nm, 298 ± 3 nm, 314 ± 3 nm, 321 ± 3 nm, 325 ± 3 nm, 330 ± 3 nm, 353 ± 3 nm, 363 ± 3 nm, 449 ± 3 nm, 466 ± 3 nm, 497 ± 3 nm, 569 ± 3 nm, 589 ± 3 nm, 616 ± 3 nm et 819 ± 3 nm ; ou
- les raies d'émission du magnésium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 285 ± 3 nm, 880 ± 3 nm, 309 ± 3 nm, 333 ± 3 nm, 383 ± 3 nm, 457 ± 3 nm, 473 ± 3 nm, 518 ± 3 nm, 552 ± 3 nm, 571 ± 3 nm, 925 ± 3 nm, 964 ± 3 nm et 941 ± 3 nm ; ou encore
- les raies d'émission du potassium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 404 ± 3 nm, 535 ± 3 nm, 580 ± 3 nm, 693 ± 3 nm, 766 ± 3 nm, 769 ± 3 nm, 825 ± 3 nm, 850 ± 3 nm, 890 ± 3 nm et 959 ± 3 nm. Selon une variante de l'invention, l'on utilise avantageusement l'azote et/ou le carbone et/ou l'oxygène présent(s) dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément(s) à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), des raies d'émission atomiques de l'azote et/ou du carbone et/ou de l'oxygène pour évaluer la quantité de cibles et de sondes sur ledit support, lequel ne contient ni carbone, ni azote, ni oxygène. Dans ce cas, l'on détecte à l'étape b) :
- les raies d'émission de l'azote à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 174 ± 3 nm, 575 ± 3 nm, 744 ± 3 nm, 821 ± 3 nm, 859 ± 3 nm, 865 ± 3 nm, 871 ± 3 nm, 938 ± 3 nm et 870 ± 3 nm, et qui est de préférence de 575 ± 3 nm ;
- les raies d'émission du carbone à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 156 ± 3 nm, 165 ± 3 nm, 175 ± 3 nm, 193 ± 3 nm, 247 ± 3 nm, 538 ± 3 nm, 600 ± 3 nm, 711 ± 3 nm, 833 ± 3 nm, 908 ± 3 nm, 911 + 3 nm, 965 ± 3 nm et 940 ± 3 nm, et qui est de préférence de 600 ± 3 nm ; et/ou
- les raies d'émission de l'oxygène à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 615 ± 3 nm, 645 ± 3 nm, 700 ± 3 nm, 725 ± 3 nm, 777 ± 3 nm, 822 ± 3 nm, 844 ± 3 nm et 926 ± 3 nm, et qui est de préférence de 615 ± 3 nm.
On notera que l'azote et/ou le carbone et/ou l'oxygène présent(s) dans toutes les cibles et sondes biologiques à titre d'élément(s) à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), des raies d'émission atomiques de ces éléments, permet(tent) ainsi d'évaluer la quantité de matériel global (i.e. sondes + cibles) présent sur le support, à la condition précitée que ce support ne contienne pas de carbone, d'azote ni d'oxygène.
Afin d'améliorer les limites de détection, on peut avantageusement : (i) mettre en œuvre la technique « LIBS » en effectuant une double impulsion laser de type « double puise LIBS », et/ou (ii) utiliser cette technique « LIBS » en parallèle avec la technique « LIF » (i.e. une combinaison « LIBS-LIF »), et/ou
(iii) soumettre le plasma confiné et/ou la surface du matériau à un rayonnement de micro-ondes capable d'échauffer les molécules polaires que sont les biomolécules.
Via ces trois méthodes préférentielles (i), (ii) et (iii), on parvient notamment à induire plus facilement chaque plasma et à augmenter l'intensité et la durée de vie des raies d'émission atomiques des éléments visés, ceci permettant d'obtenir un meilleur rapport signal sur bruit et d'abaisser ainsi d'un facteur au moins égal à dix le seuil de détection dudit élément à quantifier et donc des cibles dont il est issu.
Concernant spécifiquement cette méthode (i) de double impulsion laser, elle peut être mise en œuvre avec deux autres faisceaux croisés pour l'impulsion seconde (puissance, fréquence, longueur d'onde), de même nature que ceux des impulsions premières. En effet, compte tenu de la durée de vie d'environ 2 μs du plasma, ce dernier est optiquement analysable à partir de 100 ns environ après sa formation (fin du rayonnement de type corps noir et émergence des raies atomiques et ioniques recherchées).
Cette seconde impulsion laser, peu de temps avant son extinction, permet de prolonger la durée de vie du plasma et d'amplifier l'émission émise. On choisit avantageusement une longueur d'onde caractéristique de l'atome pour laquelle le ou les atome(s) visés ont une forte absorption ou émission. Il est ainsi possible d'augmenter l'émission lumineuse des ions et/ou des atomes ciblés (en l'occurrence le phosphore), en exaltant leur fluorescence propre par cette seconde impulsion laser.
Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, l'ablation de matière à la surface du support d'analyse biologique et la formation du plasma peuvent être découplées. Dans ce cas, une première impulsion laser UV ablate une partie de la surface de la biopuce et l'expulse au-dessus de celle-ci, puis une seconde impulsion utilisant avantageusement un laser de type femtoseconde à une fréquence de 600 Hz à 1 GHz crée le plasma et génère l'émission caractéristique de ses constituants. Eventuellement, une troisième impulsion peut être ensuite utilisée pour exalter la fluorescence des composés ciblés.
Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter efficacement, rapidement et sans marquage des cibles biomoléculaires, notamment à partir de la fluorescence des atomes constitutifs des molécules d'acides nucléiques après l'émission d'un plasma. Pour disposer d'une mesure véritablement quantitative de ces molécules d'acides nucléiques, on procède nécessairement à la calibration précitée des cibles via une normalisation de leurs tailles respectives.
Un dispositif selon l'invention pour la mise en œuvre du procédé de mesure quantitative précité comporte :
- un support d'analyse biologique de préférence sensiblement plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de transfert ou un gel d'électrophorèse ou de chromatographie,
- une unité de génération de plasma qui comprend des moyens pour focaliser et superposer sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser par croisement simultané de ces faisceaux sur ce support pour en extraire un plasma chaud contenant au moins un élément chimique à quantifier, tel que le phosphore, qui est présent dans les cibles, ces moyens pour focaliser et superposer les faisceaux comportant une tête de balayage apte à les mettre en forme de manière colinéaire et un système de miroirs agencé en sortie de cette tête qui coopère avec des disques optiques rotatifs à miroirs pour dévier les faisceaux vers le support de sorte à balayer les points de mesure de ce dernier,
- des moyens de confinement optique de chaque plasma extrait par cette unité de génération de plasma, agencés au-dessus de ce support, et
- une unité de spectrographie qui est reliée à ces moyens de confinement par des fibres optiques d'acquisition débouchant dans lesdits moyens de confinement, et qui est adaptée pour détecter et analyser des raies lumineuses d'émission du plasma extrait pour chaque point de mesure, de telle sorte que l'on détermine la concentration dans chaque point de mesure dudit ou desdits élément(s) à quantifier à partir de l'une des intensités de ces raies et à partir de courbes de calibration.
Selon une autre caractéristique de l'invention, lesdits moyens pour focaliser et superposer les faisceaux peuvent comprendre essentiellement :
- ladite tête de balayage qui comporte :
* une pyramide de renvoi retournée comprenant au moins un étage conçu pour réfléchir tangentiellement des faisceaux incidents émis par plusieurs sources laser de sorte à les rendre colinéaires en sortie de cette pyramide, et
* un système optique afocal agencé en dessous du sommet de cette pyramide, de préférence un télescope réducteur de faisceaux, conçu pour recevoir ces faisceaux colinéaires en réduisant leurs diamètres et les distances les séparant mutuellement, et
- ledit système de miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux qui coopère avec lesdits disques optiques rotatifs à miroirs les déviant dans des directions horizontale et verticale et, de préférence, qui coopère en outre avec un périscope de déviation couplé à ces disques pour que les faisceaux colinéaires réduits par ce système afocal soient focalisés et croisés sur chaque point de mesure.
Selon le premier mode précité de réalisation de l'invention, lesdits moyens de confinement sont aptes à confiner optiquement chaque plasma extrait et comportent une pluralité de chambres ouvertes qui sont chacune délimitées par une paroi latérale agencée perpendiculairement audit support, la face interne de cette paroi étant apte à réfléchir la lumière accumulée dans cette chambre et en particulier les longueurs d'onde des raies desdits éléments chimiques à quantifier, et au moins l'une desdites fibres optiques d'acquisition traversant cette paroi.
Selon un premier exemple de ce premier mode de l'invention, lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma peuvent comprendre une pluralité d'anneaux adjacents d'intégration de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale étant de section sensiblement circulaire, l'extrémité libre de plusieurs desdites fibres d'acquisition débouchant à l'intérieur de la chambre formée par chaque anneau par des orifices ménagés dans ladite paroi.
Selon un second exemple de ce premier mode de l'invention, lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma peuvent comprendre une pluralité de chambres d'intégration de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale de chaque chambre étant de section sensiblement en forme de triangle équilatéral et ces chambres étant deux à deux contiguës par l'un de leurs côtés en étant chacune pourvues desdites fibres d'acquisition en chacun de leurs trois sommets.
Conformément à ces premier et second exemples, des moyens de déplacement relatif des chambres par rapport au support, tels que des rails de coulissement desdites chambres équipés d'électroaimants, sont avantageusement prévus pour couvrir toute la surface à analyser du support.
Selon un troisième exemple de ce premier mode de l'invention, lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma peuvent comprendre une pluralité de chambres d'intégration de la lumière émise par ce plasma qui sont équipées d'au moins deux séries de fibres d'acquisition disposées en quinconce, dont les ouvertures optiques respectives sont aptes à couvrir par chevauchement mutuel toute la surface à analyser dudit support.
Dans ce troisième exemple, le dispositif selon l'invention n'utilise alors pas de déplacement relatif des chambres de confinement optique par rapport au support d'analyse.
Selon le second mode précité de réalisation de l'invention, lesdites chambres de confinement optique des plasmas extraits sont elles- mêmes logées dans une enceinte close qui contient le support et qui est remplie d'un gaz plasmogène tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz, au moins la face supérieure de cette enceinte étant transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma, cette enceinte étant équipée d'une valve de remplissage en gaz plasmogène et d'une valve de purge d'air.
Comme indiqué précédemment, le support d'analyse biologique utilisé en relation avec le dispositif selon l'invention est de préférence formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité desdites sondes et ledit ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans ces cibles et, optionnellement, en outre dans ces sondes.
Selon une autre caractéristique de l'invention, ladite unité de spectrographie comprend au moins un spectrographe de type photomultiplicateur, et un filtre optique transparent uniquement à la longueur d'onde souhaitée peut être agencé entre chaque fibre optique d'acquisition et ledit spectrographe.
Selon une autre caractéristique préférentielle de l'invention, l'unité de spectrographie comprend au moins un détecteur de type photomultiplicateur. On notera toutefois que l'on pourrait également utiliser, pour la détection des raies d'émission du plasma, une caméra de type « CCD » ou « CCD » intensifiée (« Charge Coupled Device », i.e. dispositif à couplage de charge) ou bien une « galette » de micro-canaux.
Egalement à titre préférentiel, un filtre optique transparent uniquement à la longueur d'onde souhaitée peut être agencé entre chaque fibre optique d'acquisition et le spectrographe. Dans un mode de réalisation préférentiel, chacune des fibres optiques d'acquisition provenant des moyens de confinement optique (i.e. chaque fibre « mère ») se divise en autant de fibres qu'il y a de longueurs d'onde d'éléments à observer. Chaque fibre « mère » est disposée dans un faisceau en vis-à-vis d'un détecteur qui peut être une cellule photosensible telle qu'un photomultiplicateur (« PM » en abrégé), un « Channel Tron », une « galette » de micro-canaux, etc. Un filtre optique ne sélectionnant que la longueur d'onde souhaitée peut être intercalé entre chaque fibre optique d'acquisition et le détecteur, pour injecter la lumière dans ce dernier. De plus, une lentille adéquate peut être collée en sortie de chaque fibre optique.
D'une manière générale, on notera que ces filtres peuvent être avantageusement remplacés par des réseaux de diffraction.
Les caractéristiques précitées de la présente invention, ainsi que d'autres, seront mieux comprises à la lecture de la description suivante de plusieurs exemples de réalisation de l'invention, donnés à titre illustratif et non limitatif, ladite description étant réalisée en relation avec les dessins joints, parmi lesquels : la figure 1 est une vue latérale schématique d'une unité de génération de plasma qui est incluse dans un dispositif de mesure quantitative selon l'invention et qui est illustrée en relation avec un support d'analyse biologique incorporant les cibles biomoléculaires à quantifier, la figure 2 est une vue schématique, partiellement en coupe et en perspective, d'une pyramide de renvoi optique incluse dans une tête de balayage laser de l'unité de génération de plasma de la figure 1 , la figure 3 est une vue schématique en perspective d'une variante simplifiée de la pyramide de renvoi selon la figure 2, la figure 4 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 qui est surmonté de moyens de confinement optique des plasmas respectivement générés en divers points de mesure, selon un exemple d'un premier mode de réalisation de l'invention, la figure 5 est une vue schématique en section verticale selon le plan de coupe V-V de la figure 4 de l'un de ces moyens de confinement, la figure 6 est une vue schématique en section verticale selon une variante de la figure 5 de l'un de ces moyens de confinement optique agencé au-dessus du support d'analyse, la figure 7 est une vue schématique en section verticale selon une autre variante de la figure 5 d'un tel moyen de confinement optique, la figure 8 est une vue schématique en section vertical-e selon une autre variante de la figure 5 d'un tel moyen de confinement optique, la figure 9 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 surmonté de moyens de confinement optique des plasmas selon un autre exemple de ce premier mode de l'invention, la figure 10 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 surmonté de moyens de confinement optique des plasmas selon un autre exemple de ce premier mode de l'invention, la figure 11 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 surmonté des moyens de confinement optique selon l'exemple de la figure 9, illustrant en outre des organes de commande du déplacement de ces moyens de confinement par rapport à ce support dans une position donnée, la figure 12 est une vue analogue à la figure 11 montrant ces organes de commande du déplacement des moyens de confinement dans une autre position de fonctionnement, et la figure 13 est une vue latérale schématique du support d'analyse de la figure 1 qui est logé dans des moyens de confinement des plasmas selon un second mode de réalisation de l'invention, laquelle enceinte est illustrée avec une partie de l'unité de génération de plasma adjacente.
Le dispositif de mesure quantitative 1 selon l'invention de cibles biomoléculaires comporte :
- un support d'analyse biologique 2 de préférence sensiblement plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de transfert ou un gel d'électrophorèse ou de chromatographie, - une unité de génération de plasma 3 (voir figure 1) qui comprend des moyens 4 pour focaliser et superposer sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser par croisement simultané de ces faisceaux sur ce support 2 pour en extraire un plasma chaud P (visible aux figures 5 et 13) contenant au moins un élément chimique à quantifier présent dans ces cibles, - des moyens de confinement 5 de chaque plasma P extrait par cette unité 3, agencés au-dessus du support 2 (voir figures 4 et suivantes), et
- une unité de spectrographie (non illustrée) qui est reliée à ces moyens de confinement 5, 5', 5" par des fibres optiques d'acquisition 6,
6', 6" (visibles aux figures 4 et suivantes) débouchant dans ces moyens de confinement 5, 5', 5", et qui est adaptée pour détecter et analyser des raies lumineuses d'émission du plasma P extrait pour chaque point de mesure, de telle sorte que l'on détermine la concentration dans chaque point de mesure de l'élément à quantifier à partir de l'une des intensités de ces raies et à partir de courbes de calibration.
Les moyens de focalisation 4 des faisceaux laser F sur chaque point de mesure comprennent essentiellement, en référence à la figure 1 :
- une tête de balayage 7 qui est apte à mettre en forme ces faisceaux F de manière colinéaire et qui comporte :
* une pyramide de renvoi 8 retournée comprenant au moins un étage 8a conçu pour réfléchir tangentiellement des faisceaux F incidents émis par plusieurs sources laser 9 de sorte à les rendre colinéaires en sortie de cette pyramide 8 via des miroirs de haute qualité en aluminium 8b, et
* un système optique afocal 10 agencé en dessous du sommet de cette pyramide 8, de préférence un télescope réducteur de faisceaux, qui est conçu pour recevoir ces faisceaux colinéaires F' en réduisant leurs diamètres respectifs et les distances les séparant mutuellement, et
- un système de miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux 11 qui est agencé en sortie de la tête de balayage 7 et qui coopère avec des disques optiques rotatifs 12 et 13 à miroirs 12a et 13a les déviant dans des directions horizontale et verticale et, de préférence, qui coopère en outre avec un périscope de déviation 14 couplé à ces disques 12 et 13 pour que les faisceaux colinéaires F' réduits par ce système afocal 10 soient focalisés et croisés sur chaque point de mesure.
On utilise cette tête de balayage 7 comme suit.
Les différents faisceaux laser F (au nombre de deux dans l'exemple de la figure 1) se réfléchissent tangentiellement sur les miroirs 8b de haute qualité de la pyramide de renvoi 8 qui assurent leur colinéarité, pour un angle quelconque de la direction d'incidence de ces faisceaux F
(préférentiellement, cet angle est égal à 90°).
Comme illustré aux figures 2 et 3, la pyramide de renvoi 8, 8' peut présenter un unique étage 8a (figure 3) en utilisant par exemple quatre sources laser 9 distinctes, ou bien plusieurs étages 8a pouvant aller typiquement jusqu'à cinq (figure 2) en utilisant dans ce cas par exemple un maximum de cent sources laser 9 en parallèle.
Il est à noter que l'augmentation du nombre de sources 9 permet en particulier d'augmenter la résolution du balayage, avec une couverture spatiale plus importante des faisceaux sur la zone de balayage.
En sortie de la pyramide 8, les faisceaux colinéaires F' passent à travers le télescope 10 réducteur de faisceaux, constitué d'un système de lentilles multiples superposées réduisant le diamètre et l'éloignement mutuel de ces faisceaux colinéaires F'. Par exemple, des faisceaux F' d'un diamètre de 2 mm et espacés de 2,5 mm en sortie de la pyramide 8 sont réduits, en sortie du télescope 10, à un diamètre de 500 μm et un espacement de 500 μm.
Ces faisceaux colinéaires F' une fois réduits sont ensuite balayés sur le support d'analyse 2 par les deux disques optiques rotatifs à horizontaux 12 et verticaux 13 à miroirs 12a et 13a (« ORD » pour « optical rotating dise ») assurant respectivement des déviations horizontales et verticales des faisceaux, ainsi que le périscope de déviation 14. Ces disques optiques 12 et 13 peuvent être suivant les besoins de type monopiste ou multipistes (i.e. avec une ou plusieurs rangées concentriques de miroirs), en fonction du nombre de sources 9, de l'encombrement, de la résolution, etc. Le dispositif de mesure 1 selon l'invention comprend en outre un système de commande électronique (non illustré) pour piloter et contrôler précisément les vitesses de rotation de ces disques optiques 12 et 13.
On notera que la réduction du motif optique des faisceaux laser F' par le télescope 10 permet de faire se réfléchir tous ces faisceaux F' sur le seul miroir 12a du disque rotatif horizontal 12 et le seul miroir 13a du disque rotatif vertical 13, afin de les faire converger vers un point identique à la surface du support 2. Chaque miroir 12a, 13a est en effet positionné de façon unique sur les disques rotatifs 12 et 13 en termes d'angle d'inclinaison, de manière à faire converger les différents faisceaux F" sur une zone bien localisée du support 2.
Pour des raisons d'encombrement, la distance entre les deux disques rotatifs 12 et 13 est de préférence réduite par l'ajout du périscope de déviation 14 qui ajoute deux réflexions supplémentaires sur le parcours des faisceaux. La focalisation des différents faisceaux F" sur le support 2 peut être assurée par le système afocal 10, en jouant notamment sur l'écartement des optiques, par des miroirs paraboliques qui sont positionnés sur le disque optique rotatif vertical 13 situé en sortie de la tête de balayage 7, par un système annexe composé de lentilles et/ou de miroirs de focalisation en sortie de la tête de balayage 7, en jouant sur l'inclinaison des miroirs de la pyramide pour rendre les faisceaux F' destinés à se croiser légèrement non colinéaires.
Dans certains modes de réalisation, avec une configuration utilisant des groupes d'au moins deux faisceaux, seuls les faisceaux de chaque groupe destinés à être croisés sur le support 2 seront colinéaires, de telle manière que seuls les faisceaux colinéaires de chaque groupe convergent en un même point du support 2.
A la sortie de cette tête de balayage 7, chaque faisceau laser F" est focalisé sur la surface à analyser du support 2 par les miroirs de la tête
7 et les faisceaux sont croisés en au moins un point de mesure de cette surface. Le croisement de chaque faisceau présente une densité de puissance ou irradiance à la surface de chaque point de mesure qui est supérieure à 0,5 GW.cm'2 qui est suffisante pour l'obtention par vaporisation d'un plasma chaud P à durée de vie d'environ 2 μs, de manière générale à un seuil de puissance par unité de surface supérieur au seuil d'ablation du matériau du support.
A ces très hautes densités d'énergie, une partie du matériau de chaque point de mesure est en effet éjectée de la surface à analyser par vaporisation et ce plasma chaud P, très lumineux et à durée de vie très courte, est ainsi généré. Ce matériau ablaté sous forme de plasma P est dissocié en ses divers constituants atomiques et ioniques et, à la fin de chaque impulsion laser, ce plasma P se refroidit rapidement. Durant cette période, les atomes et les ions excités émettent des radiations lumineuses qui leur sont caractéristiques, du fait de leur retour à des niveaux d'énergies plus bas.
Les figures 4 à 12 illustrent des exemples de structures utilisables pour les moyens de confinement optique 5, 5', 5" de chaque plasma P généré, pour qu'il n'interfère pas avec les autres points de mesure à analyser, avant détection simultanée des raies d'émissions du plasma P correspondant à chaque croisement de faisceaux. Comme indiqué précédemment, l'analyse optique du plasma P généré point par point à la surface du support d'analyse biologique 2 permet de reconstituer une image en chaque point de mesure de la quantité d'atomes de l'élément analysé, permettant d'en déduire le nombre de cibles en fonction de l'abondance de l'élément dans la formule brute de la cible.
Comme illustré à la figure 4, les raies d'émission du plasma P généré en chaque point de mesure peuvent par exemple être captées par plusieurs fibres optiques d'acquisition 6 (au moins trois fibres optiques 6), dont les extrémités libres respectives sont disposées régulièrement sur un anneau circulaire 5 de 1 à 20 cm de diamètre et de hauteur réduite qui est conçu pour isoler optiquement ce plasma P. La face interne de la paroi latérale 5a, 5b, 5c de cet anneau 5 constitue un miroir pouvant être concave (voir figures 5 et 6), à multiples facettes (voir figure 7), plan (figure 8), ellipsoïdal ou même parabolique, pourvu qu'il soit capable de réfléchir les longueurs d'onde des raies des éléments d'intérêt en formant ainsi un anneau d'intégration de la lumière émise. Les courbures ou inclinaisons des miroirs sont préférentiellement conçues pour faire converger la lumière sur la face intérieure opposée de l'anneau 5.
L'anneau 5 est percé à intervalles réguliers d'orifices 5d sur sa paroi latérale 5a, 5b, 5c (e.g. cylindrique dans l'exemple de la figure 5) pour recevoir les fibres optiques d'acquisition 6. En raison de son ouverture numérique, chaque fibre d'acquisition 6 peut être coiffée d'un jeu de lentilles adéquates, tel qu'un collimateur de fibre, pour injecter correctement les rayonnements émis par le plasma P dans l'unité de spectrographie, les champs respectivement vus par les fibres 6 ainsi coiffées de lentilles correctrices, ou ouvertures optiques, se recouvrant mutuellement pour former une surface assimilable à un cercle (ou à un polygone inscrit dans un cercle), i.e. un cercle optique 16. Chaque plasma P est généré dans ce cercle optique 16, qui est tel que le chemin optique cumulé de la lumière du plasma P vers les fibres 6 est constant quelle que soit la position du plasma P dans ce cercle 16. Dans la variante de la figure 9, les chambres 5' de confinement optique du plasma P ont chacune une forme de triangle équilatéral et présentent chacune le même type de face interne de paroi latérale 5a' que les anneaux 5 précités. Aux trois sommets de chaque triangle 5' sont respectivement disposées trois fibres optiques d'acquisition 6' avec pour chacune une ouverture optique supérieure ou égale à 60°, de manière à capter la lumière directe du plasma P correspondant et celle qui se réfléchit sur les parois du triangle 5'. On peut avantageusement agencer une série de tels triangles équilatéraux 5' de manière à décrire un parallélogramme englobant toute la surface du support 2. Ainsi, les faisceaux laser, croisés, converges et déplacés par les miroirs précités, balayent avec le pas souhaité l'ensemble de chaque cercle optique 16 selon la figure 4 ou de chaque triangle optique 5' selon la figure 9, générant en chaque point un plasma P dont la lumière est captée par l'ensemble des fibres d'acquisition 6, 6' associées. On notera que la lumière cumulée qui est capturée par les fibres 6 de chaque cercle optique 16 ou celles 6' de chaque triangle optique 5' a une intensité indépendante de la position du plasma P dans ce cercle 16 ou triangle optique 5', respectivement.
Ce procédé permet le balayage de toute la surface à analyser par les faisceaux laser croisés avec, par exemple, un pas de 10 μm qui correspond à la zone ablatée à chaque impulsion laser, les chambres de confinement optique 5, 5' permettant l'acquisition simultanée de plusieurs plasmas P.
Pour permettre l'analyse des surfaces à l'aplomb des parois 5a, 5b, 5c ou 5a' de ces chambres de confinement optique 5, 5', il est nécessaire de réaliser un déplacement relatif du support d'analyse biologique 2 par rapport à ces chambres 5, 5' qui, de préférence, est réalisé en déplaçant ces dernières par rapport au support d'analyse 2 qui reste fixe.
Comme illustré aux figures 11 et 12 ces chambres de confinement optique 5' (dans cet exemple triangulaires) peuvent coulisser le long de guides ou de rails 17 via des organes de support 17a de ces derniers agencés de chaque côté du support d'analyse 2, sous la commande de deux électroaimants 18 qui sont disposés à l'extérieur et de part et d'autre du support 2 et qui attirent alternativement ces chambres 5, 5', respectivement en association avec deux butées métalliques 17b pour ces électroaimants 18.
Dans la variante de la figure 10, on procède à une analyse de la surface du support 2 sans déplacement relatif des chambres de confinement optique 5" par rapport au support 2, en disposant en quinconce des fibres optiques d'acquisition 6" latéralement de part et d'autre du support 2. De par cette disposition, l'ensemble des ouvertures optiques respectives des fibres d'acquisition 6" englobe la totalité de la surface du support 2. Un léger recouvrement 19 des ouvertures optiques des fibres optiques 6" latéralement de part et d'autre du support 2 permet ainsi l'analyse des surfaces situées à l'aplomb des limites de ces ouvertures optiques. Selon un autre mode de réalisation de l'invention illustré à la figure 13, le support 2 à analyser ainsi que les moyens 5, 5' précités de confinement optique (dans cet exemple constitués des anneaux 5) sont tous disposés dans une enceinte 20 close, dont au moins la face supérieure 21 est prévue transparente aux longueurs d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma P.
L'air contenu dans cette chambre 5 est vidé grâce à une valve de purge d'air
22, puis la chambre est emplie d'un gaz plasmogène (e.g. argon/azote, hélium) grâce à une valve de remplissage 23, ces valves 22 et 23 étant montées dans la face inférieure de support 24 de l'enceinte 20.
En conclusion, on notera que l'analyse optique du plasma P généré point par point à la surface du support 2 permet de reconstituer une image de la quantité d'atomes de l'élément recherché en chaque point de mesure.
En utilisant plus de deux lasers, il est en outre possible de générer simultanément plusieurs plasmas P sur le support biologique 2 à analyser. Dans ces conditions, une unité de confinement optique est prévue par plasma généré. Les zones du support 2 masquées par cette unité peuvent être analysées après une translation relative de ces zones à l'intérieur de l'unité de confinement optique, telle que le cercle 5 ou le triangle optique 5' précités.
On notera que les géométries décrites pour la cartographie par « LIBS » des supports d'analyse biologique, sont également applicables aux cartographies par « LIBS » de surfaces relativement planes comprenant des supports non biologiques (minéraux ou organiques) à analyser.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires, en particulier des protéines, présentes sur ou dans un support d'analyse biologique (2), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on réalise un balayage des points de mesure du support en déplaçant, focalisant et superposant sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser (F") par croisements simultanés de ces faisceaux pour en extraire un plasma chaud (P) confiné comprenant au moins un élément chimique à quantifier présent dans lesdites cibles et au moins un autre élément chimique exogène à ces cibles et présent en quantité connue sur ou dans ce support, b) on détecte et l'on analyse, pour chacun de ces points de mesure, des raies lumineuses d'émission de chaque plasma qui correspondent au ou à chaque élément à quantifier et au ou à chaque élément exogène, en mesurant les intensités respectives de ces raies, puis c) on détermine, via un étalonnage préalable des raies du ou de chaque élément à quantifier établissant une corrélation entre les intensités des raies propres à cet élément à quantifier et les concentrations de ce dernier dans des mélanges en proportions connues du ou de chaque élément à quantifier et du ou de chaque élément exogène, la concentration dans chaque point de mesure du ou de chaque élément à quantifier ou d'un groupe l'incorporant au sein de ces cibles.
2) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape ultérieure d'obtention d'une image représentative de la concentration dudit ou de chaque élément à quantifier ou dudit ou de chaque élément exogène, l'intensité de chaque pixel ou bien de chacune des trois couleurs de ce dernier au sein de cette image étant représentative de l'intensité de la raie de l'élément correspondant observé. 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que chacun desdits faisceaux laser (F) utilisés à l'étape a) est émis dans la gamme infrarouge - visible - ultraviolet selon une impulsion de durée comprise entre 1 fs et 100 ns, avec une fréquence comprise entre 600 Hz et 1 GHz et une énergie comprise entre 0,05 mW et 1 kW.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits faisceaux laser (F) sont émis selon une impulsion de durée inférieure à 10 ns et de préférence égale à 5 ns, par exemple soit dans le domaine ultraviolet à une même longueur d'onde de 266 nm ou de 193 nm, soit dans l'ultraviolet à 266 nm et dans le visible à 532 nm.
5) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits faisceaux (F") sont mis en forme à l'étape a) dans une tête de balayage (7), de telle manière que :
- ces faisceaux se réfléchissent tangentiellement sur une pyramide de renvoi (8) à au moins un étage de réflexion (8a) pour donner en sortie de cette pyramide des faisceaux colinéaires (F'),
- ces faisceaux colinéaires passent à travers un système optique afocal (10), tel qu'un télescope réducteur de faisceaux, qui réduit les diamètres respectifs de ces faisceaux et les distances les séparant mutuellement, puis que
- ces faisceaux colinéaires réduits soient ensuite focalisés et croisés sur chaque point de mesure par des miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux (11) agencés en sortie de ladite tête de balayage.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits faisceaux colinéaires (F') réduits sont focalisés et croisés sur chaque point de mesure dudit support (2) par deux disques optiques rotatifs (12 et 13) à miroirs (12a et 13a) les déviant respectivement dans des directions horizontale et verticale et de préférence par un périscope de déviation (14) couplé à ces disques. 7) Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la superposition par croisements desdits faisceaux laser (F") mise en œuvre à l'étape a) génère une densité de puissance en chaque point de mesure qui est supérieure à 0,5 GW.cnrf2, pour l'obtention par vaporisation de chaque plasma chaud (P) qui présente une durée de vie d'environ 2 μs.
8) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on adjoint à chaque plasma (P) confiné au moins un agent d'activation formé d'un gaz plasmogène, tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz.
9) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits plasmas (P) extraits sont respectivement confinés optiquement dans des chambres (5, 5', 5") d'intégration de la lumière émise par le plasma correspondant qui présentent chacune une paroi latérale (5a, 5b, 5c, 5a') réfléchissante et qui sont chacune munies d'au moins une fibre optique d'acquisition (6, 6', 6") de la lumière accumulée dans cette chambre, de telle sorte que chaque plasma n'interfère pas avec les autres points de mesure à analyser.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on soumet lors de l'étape a) ledit support d'analyse biologique (2) à un mouvement relatif par rapport aux chambres de confinement optique (5, 5'), lesquelles sont de préférence guidées au-dessus dudit support qui reste fixe, en même temps que l'on fait se croiser lesdits faisceaux laser (F").
11) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on utilise un chevauchement mutuel (19) des ouvertures optiques respectives desdites fibres optiques d'acquisition (6"), en agençant ces dernières en quinconce au-dessus du support (2) pour couvrir toute la surface à analyser de ce dernier sans déplacement relatif de ces chambres (5") par rapport audit support.
12) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdites chambres de confinement optique (5') des plasmas (P) extraits sont elles-mêmes logées dans une enceinte close (20) qui contient ledit support (2), qui est remplie dudit gaz plasmogène et dont au moins la face supérieure (21) est transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation desdits faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma.
13) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise la technique de spectroscopie d'émission optique induite par laser (« LIBS ») pour la mise en oeuvre des étapes a) à c), de préférence avec l'utilisation en parallèle de la technique de fluorescence induite par laser (« LIF »).
14) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cibles biomoléculaires sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques non marqués, les protéines, les peptides, les polypeptides, les polynucléotides tels que de I1ADN et les sucres.
15) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on immobilise préalablement à l'étape a) lesdites cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur dudit support (2), lequel est sensiblement plan et est choisi dans le groupe constitué par les biopuces, les membranes de transfert, les substrats en silicium, en polyimide et en verre, et les gels d'électrophorèse et de chromatographie.
16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit support d'analyse biologique (2) est formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité desdites sondes et ledit ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans lesdites cibles et, optionnellement, en outre dans lesdites sondes.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que lesdites sondes sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques, les acides nucléiques peptides (« PNA »), les acides nucléiques verrouillés (« LNA »), les éthers ribonucléiques (« ERN »), les anticorps, les hémi-anticorps, les hémi-anticorps couplés avec des acides nucléiques et des récepteurs protéiques.
18) Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que l'on immobilise préalablement à l'étape a) lesdites cibles biomoléculaires par des interactions sondes / cibles qui sont :
- toutes deux à base de protéines, telles que des interactions ligand / récepteur ou anticorps / antigène fixé, ou
- des interactions mixtes acide nucléique ou assimilé / protéine, ou bien
- des interactions de type acide nucléique / métal, ion ou toute autre molécule libre, ou encore
- des interactions de type protéine / ion ou toute autre molécule libre.
19) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on dépose de manière homogène ledit ou chaque élément exogène en quantité connue sur ledit support d'analyse (2).
20) Procédé selon une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que l'on dépose ledit ou chaque élément exogène en quantité connue sur ledit support d'analyse (2) spécifiquement avec lesdites sondes, cet élément exogène étant soit inclus dans des composés greffés sur ce support conjointement aux sondes dans des proportions connues, soit directement implantés dans la structure de chaque sonde par substitution atomique ou interaction forte.
21) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit ou chaque élément chimique à quantifier est choisi dans le groupe constitué par le phosphore, le soufre, l'iode, l'azote, l'oxygène et le carbone.
22) Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que l'on utilise à titre de cibles des acides nucléiques ou des protéines phosphorylées, et en ce que l'on utilise le phosphore présent dans ces cibles à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore.
23) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du phosphore à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 138 + 3 nm, 148 ± 3 nm, 154 ± 3 nm, 167 ± 3 nm, 177 ± 3 nm, 190 ± 3 nm, 193 ± 3 nm, 203 ± 3 nm, 213 ± 3 nm et 253 ± 3 nm, et qui est de préférence de 203 ± 3 nm.
24) Procédé selon une des revendications 16 à 18 et selon une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'on utilise des acides nucléiques, par exemple marqués au soufre ou à l'iode, ou des protéines à titre de cibles et de sondes, et en ce que l'on utilise le soufre et l'iode respectivement dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma (P), à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode.
25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du soufre à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 167 ± 3 nm, 181 ± 3 nm, 190 ± 3 nm, 199 ± 3 nm, 415 ± 3 nm, 458 ± 3 nm, 922 ± 3 nm, 942 ± 3 nm, 968 ± 3 nm et qui est de préférence de 415 ± 3 nm, et les raies d'émission de l'iode à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 150 ± 3 nm, 161 ± 3 nm, 170 ± 3 nm, 178 ± 3 nm, 183 ± 3 nm, 511 ± 3 nm, 661 ± 3 nm, 740 ± 3 nm, 746 ± 3 nm, 804 ± 3 nm, 839 ± 3 nm, 902 ± 3 nm, 905 ± 3 nm, 911 ± 3 nm et 973 ± 3 nm et qui est de préférence de 511 ± 3 nm.
26) Procédé selon la revendication 24 ou 25, caractérisé en ce que l'on utilise le chlore ou le brome à titre d'élément exogène auxdites cibles et auxdites sondes, pour la détection dans le plasma (P) à l'étape b) de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode, respectivement, pour lever l'indétermination des signaux générés tant par ces sondes que par ces cibles.
27) Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) :
- les raies d'émission du chlore à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 35 ± 3 nm, 386 ± 3 nm, 413 ± 3 nm, 479 ± 3 nm, 490 ± 3 nm, 499 ± 3 nm, 507 ± 3 nm, 521 ± 3 nm, 539 ± 3 nm, 542 ± 3 nm, 774 ± 3 nm, 725 ± 3 nm, 741 ± 3 nm, 754 ± 3 nm, 822 ± 3 nm, 833 ± 3 nm, 837 ± 3 nm, 842 ± 3 nm, 858 ± 3 nm, 868 ± 3 nm, 894 ± 3 nm, 912 ± 3 nm, 919 + 3 nm,928 ± 3 nm, 945 ± 3 nm et 959 ± 3 nm ; ou bien - les raies d'émission du brome à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 154 ± 3 nm, 158 ± 3 nm, 163 ± 3 nm, 614 ± 3 nm, 635 ± 3 nm, 655 ± 3 nm, 663 ± 3 nm, 751 ± 3 nm, 780 ± 3 nm, 793 ± 3 nm, 798 ± 3 nm, 813 ± 3 nm, 827 ± 3 nm, 844 ± 3 nm, 889 ± 3 nm, 916 ± 3 nm et 926 ± 3 nm.
28) Procédé selon la revendication 14 et selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que l'on utilise pour lesdites cibles de l'ADN et en ce que l'on utilise à titre d'élément à quantifier un cation lié à ces cibles et choisi dans le groupe constitué par le sodium, le magnésium et le potassium pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore.
29) Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) :
- les raies d'émission du sodium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 268 ± 3 nm, 285 ± 3 nm, 291 ± 3 nm, 292 ± 3 nm, 298 ± 3 nm, 314 ± 3 nm, 321 ± 3 nm, 325 ± 3 nm, 330 ± 3 nm, 353 ± 3 nm, 363 ± 3 nm, 449 ± 3 nm, 466 ± 3 nm, 497 ± 3 nm, 569 ± 3 nm, 589 ± 3 nm, 616 ± 3 nm et 819 ± 3 nm ; ou
- les raies d'émission du magnésium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 285 ± 3 nm, 880 ± 3 nm, 309 ± 3 nm, 333 ± 3 nm, 383 ± 3 nm, 457 ± 3 nm, 473 ± 3 nm, 518 ± 3 nm, 552 ± 3 nm, 571 ± 3 nm, 925 ± 3 nm, 964 ± 3 nm et 941 ± 3 nm ; ou encore
- les raies d'émission du potassium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 404 ± 3 nm, 535 ± 3 nm, 580 ± 3 nm, 693 ± 3 nm, 766 ± 3 nm, 769 ± 3 nm, 825 ± 3 nm, 850 ± 3 nm, 890 ± 3 nm et 959 ± 3 nm.
30) Procédé selon une des revendications 16 à 18 et selon une des revendications 21 à 29, caractérisé en ce que l'on utilise l'azote et/ou le carbone et/ou l'oxygène présent(s) dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément(s) à quantifier pour la détection dans le plasma (P), à l'étape b), des raies d'émission atomiques de l'azote et/ou du carbone et/ou de l'oxygène pour évaluer la quantité de cibles et de sondes sur ledit support (2), lequel ne contient ni carbone, ni azote, ni oxygène.
31) Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) : - les raies d'émission de l'azote à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 174 ± 3 nm, 575 ± 3 nm, 744 ± 3 nm, 821 ± 3 nm, 859 ± 3 nm, 865 ± 3 nm, 871 ± 3 nm, 938 ± 3 nm et 870 ± 3 nm, et qui est de préférence de 575 ± 3 nm ; - les raies d'émission du carbone à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 156 + 3 nm, 165 ± 3 nm, 175 ± 3 nm, 193 ± 3 nm, 247 ± 3 nm, 538 ± 3 nm, 600 ± 3 nm, 711 ± 3 nm, 833 ± 3 nm, 908 ± 3 nm, 911 ± 3 nm, 965 ± 3 nm et 940 ± 3 nm, et qui est de préférence de 600 ± 3 nm ; et/ou - les raies d'émission de l'oxygène à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 615 ± 3 nm, 645 ± 3 nm, 700 ± 3 nm, 725 ± 3 nm, 777 ± 3 nm, 822 ± 3 nm, 844 ± 3 nm et 926 ± 3 nm, et qui est de préférence de 615 ± 3 nm.
32) Dispositif (1) pour la mise en œuvre d'un procédé de mesure quantitative selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte :
- un support d'analyse biologique (2) de préférence sensiblement plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de transfert ou un gel d'électrophorèse ou de chromatographie,
- une unité de génération de plasma (3) qui comprend des moyens (4) pour focaliser et superposer sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser (F") par croisement simultané de ces faisceaux sur ce support pour en extraire un plasma chaud (P) contenant au moins un élément chimique à quantifier, tel que le phosphore, qui est présent dans lesdites cibles, ces moyens pour focaliser et superposer les faisceaux comportant une tête de balayage (7) apte à les mettre en forme de manière colinéaire et un système de miroirs (11) agencé en sortie de cette tête qui coopère avec des disques optiques rotatifs (12 et 13) à miroirs (12a et 13a) pour dévier les faisceaux vers le support de sorte à balayer les points de mesure de ce dernier, - des moyens de confinement optique (5, 5', 5") de chaque plasma extrait par cette unité de génération de plasma, qui sont agencés au- dessus de ce support, et
- une unité de spectrographie qui est reliée à ces moyens de confinement par des fibres optiques d'acquisition (6, 6', 6") débouchant dans lesdits moyens de confinement, et qui est adaptée pour détecter et analyser des raies lumineuses d'émission du plasma extrait pour chaque point de mesure, de telle sorte que l'on détermine la concentration dans chaque point de mesure dudit ou desdits élément(s) à quantifier à partir de l'une des intensités de ces raies et à partir de courbes de calibration.
33) Dispositif (1) selon la revendication 32, caractérisé en ce que lesdits moyens (4) pour focaliser et superposer par croisement sur ledit support (2) les faisceaux laser (F") sur chaque point de mesure comprennent essentiellement :
- ladite tête de balayage (7) qui comporte :
* une pyramide de renvoi (8) retournée comprenant au moins un étage (8a) conçu pour réfléchir tangentiellement des faisceaux incidents (F) émis par plusieurs sources laser (9) de sorte à les rendre colinéaires en sortie de cette pyramide, et
* un système optique afocal (10) agencé en dessous du sommet de cette pyramide, de préférence un télescope réducteur de faisceaux, qui est conçu pour recevoir ces faisceaux colinéaires (F') en réduisant leurs diamètres respectifs et les distances les séparant mutuellement, et
- ledit système de miroirs (11) plans, paraboliques ou ellipsoïdaux qui coopère avec lesdits disques optiques rotatifs (12 et 13) à miroirs (12a et 13a) les déviant dans des directions horizontale et verticale et, de préférence, qui coopère en outre avec un périscope de déviation (14) couplé à ces disques pour que les faisceaux colinéaires réduits par ce système afocal soient focalisés et croisés sur chaque point de mesure. 34) Dispositif (1) selon la revendication 32 ou 33, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optiques (5, 5', 5") sont aptes à confiner optiquement chaque plasma (P) extrait et comportent une pluralité de chambres ouvertes qui sont chacune délimitées par une paroi latérale (5a, 5b, 5c, 5a') agencée perpendiculairement audit support (2), la face interne de cette paroi étant apte à réfléchir la lumière accumulée dans cette chambre et en particulier les longueurs d'onde des raies desdits éléments chimiques à quantifier, et au moins l'une desdites fibres optiques d'acquisition (6, 6', 6") traversant cette paroi.
35) Dispositif (1) selon la revendication 34, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma (P) comprennent une pluralité d'anneaux (5) adjacents d'intégration de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale (5a, 5b, 5c) étant de section sensiblement circulaire, l'extrémité libre de plusieurs desdites fibres d'acquisition (6) débouchant à l'intérieur de la chambre formée par chaque anneau par des orifices (5d) ménagés dans ladite paroi, des moyens de déplacement relatif de ces chambres par rapport au support (2), tels que des rails de coulissement (17) des chambres équipés d'électroaimants (18), étant prévus pour couvrir toute la surface à analyser dudit support.
36) Dispositif (1) selon la revendication 34, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma (P) comprennent une pluralité de chambres d'intégration (5') de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale (5a1) de chaque chambre étant de section sensiblement en forme de triangle équilatéral et ces chambres étant deux à deux contiguës par l'un de leurs côtés en étant chacune pourvues desdites fibres d'acquisition (6') en chacun de leurs trois sommets, des moyens de déplacement relatif des chambres par rapport au support (2), tels que des rails de coulissement (17) desdites chambres équipés d'électroaimants (18), étant prévus pour couvrir toute la surface à analyser dudit support. 37) Dispositif (1) selon la revendication 34, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma (P) comprennent une pluralité de chambres d'intégration (5") de la lumière émise par ce plasma qui sont équipées d'au moins deux séries de fibres d'acquisition (6") disposées en quinconce, dont les ouvertures optiques respectives sont aptes à couvrir par chevauchement mutuel (19) toute la surface à analyser dudit support (2), sans déplacement relatif de ces chambres par rapport à ce dernier.
38) Dispositif (1) selon une des revendications 32 à 36, caractérisé en ce que lesdites chambres de confinement optique (51) des plasmas extraits (P) sont elles-mêmes logées dans une enceinte close (20) qui contient ledit support (2) et qui est remplie d'un gaz plasmogène tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz, au moins la face supérieure (21) de cette enceinte étant transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma, cette enceinte étant équipée d'une valve de remplissage (23) en gaz plasmogène et d'une valve de purge d'air (22).
39) Dispositif (1) selon une des revendications 32 à 38, caractérisé en ce que ladite unité de spectrographie comprend au moins un spectrographe de type cellule photosensible et en ce qu'un réseau de diffraction ou au moins un filtre optique transparent uniquement à la longueur d'onde souhaitée est agencé entre chaque fibre optique d'acquisition (6, 6', 6") et ledit spectrographe.
40) Dispositif (1) selon une des revendications 32 à 39, caractérisé en ce que ledit support d'analyse biologique (2) est formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité desdites sondes et ledit ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans lesdites cibles et, optionnellement, en outre dans lesdites sondes.
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