WO2011086290A1 - Procede et systeme d'analyse moleculaire a commutation de mesures d'imagerie et de spectroscopie - Google Patents

Procede et systeme d'analyse moleculaire a commutation de mesures d'imagerie et de spectroscopie Download PDF

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WO2011086290A1
WO2011086290A1 PCT/FR2010/052862 FR2010052862W WO2011086290A1 WO 2011086290 A1 WO2011086290 A1 WO 2011086290A1 FR 2010052862 W FR2010052862 W FR 2010052862W WO 2011086290 A1 WO2011086290 A1 WO 2011086290A1
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WO
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molecules
data
fluorescence
correlated
correlation
Prior art date
Application number
PCT/FR2010/052862
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Inventor
Corentin Spriet
Laurent Heliot
Jacques Barbillat
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs
Universite Lille 1 - Sciences Et Technologies
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Publication date
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    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths

Definitions

  • the present invention relates to the field of observation and in situ measurement of biophysical data in relation to a set of molecules within a living cell or animal, such as, for example, diffusion constants, local and molecular interactions at short and long distances.
  • a confocal microscopy device provided with illumination means arranged to excite the molecules
  • a device for correlated imaging of the spectrum and of the fluorescence life time emitted by the excited molecules a device for correlated imaging of the spectrum and of the fluorescence life time emitted by the excited molecules.
  • a step of acquiring correlated spectrum and life time images of the fluorescence emitted by the excited molecules a step of acquiring correlated spectrum and life time images of the fluorescence emitted by the excited molecules.
  • SLIM This system, called “SLIM”, works to combine simultaneous measurements of fluorescence spectrum and fluorescence life time in each region of a studied cell. In this way, it makes possible the use of fluorescence emission spectrum information and fluorescence lifetime, acquired simultaneously, so as to obtain complementary information on the molecules and their environment. This information, taken individually, can not in fact quantify completes the characteristics of the fluorophores considered, because of their dependence on several parameters (the molecular environment, the experimental conditions and the complexity of interpretation).
  • the system described in this publication proposes simultaneous measurements of life time on at least sixteen spectral bands, directly connected to a confocal microscope by two-photon excitation. These measurements can be performed by means of a 32-anode detector.
  • the disclosed system comprises a laser scanning microscope equipped with a spectrograph, a sixteen channel multi-mode photomultiplier and a time-correlated multidimensional photon counter. The excitation of the molecules is carried out using a sapphire titanium laser or a laser diode.
  • This limitation therefore poses the problem of obtaining a greater number of information from a single device.
  • FLIM fluorescence life time imaging microscopy
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy systems.
  • FCCS fluorescence cross correlation spectroscopy
  • FLIM systems are described, for example, in US 2007/018116 A1 and US 2007/197894 A1.
  • a light source generates a beam capable of exciting molecules.
  • the fluorescence emitted back by these molecules passes through a confocal microscope in order to be detected by a fast photomultiplier (picosecond) operating in the photon counting regime.
  • FCS and FCCS systems are described, for example, in patent document FR 2 827 959.
  • an excitation laser beam is made converging by a microscope objective into a focusing point situated at the level of particles that it is desired to analyze, these particles being in solution on an optically passive substrate.
  • the light of the focused laser beam is absorbed by the particles, then re-emitted at a wavelength greater than that of the laser beam and then directed at the detector via the optical conjugator.
  • a correlator is connected to the detector in order to analyze the temporal fluctuations of the fluorescent light emitted by the analysis volume, so as to perform detection by spectroscopy.
  • fluorescence correlation FCS
  • FCS fluorescence correlation
  • These temporal fluctuations are directly related to the diffusion of fluophores through the volume of analysis.
  • the autocorrelation function of the detected luminous intensity makes it possible to have access to the photophysical parameters of the emitters as well as to the average number of molecules detected. At long times, this function gives information on the average residence time - the diffusion time - of the molecules and their diffusion mode through the analysis volume.
  • the correlator can thus provide autocorrelation data, cross correlation data or a combination of these data.
  • the devices SLIM, FLIM, FCS and FCCS are provided for the same adaptation position of the microscope, which requires removing one of these devices to replace it with another and / or change a part in the device coupling (for example a filter cube to switch from FLIM to FCS).
  • the dynamics and molecular interactions analyzes can be performed only sequentially, device by device, which limits the combination and correlation of these different data, including the creation of functional models integrating these data. This disadvantage is all the more significant in studies requiring a vision that is both dynamic and topological of the phenomena studied.
  • An object of the invention is therefore to allow, with a single system, the combination and the correlation of data from a correlated fluorescence and fluorescence life imaging device (SLIM) and a device fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • SLIM correlated fluorescence and fluorescence life imaging device
  • FCS device fluorescence correlation spectroscopy
  • a fluorescence correlation spectroscopy device emitted by the excited molecules, able to switch with the correlated imaging device so as to simultaneously perform correlated imaging and spectroscopy measurements
  • control device arranged so that the data coming from the correlated imaging device participate in the adjustment of the data coming from the correlation spectroscopy device.
  • the control device makes it possible to adjust the FCS data, for example by integrating the SLIM data with the FCS representation model.
  • the system according to the invention thus makes it possible to obtain more precise measurements.
  • the modular design of this system has the advantage of facilitating its manufacture and maintenance, particularly in the case of replacing a defective module with a new module.
  • the fluorescence correlation spectroscopy device is preferably provided with at least two spectroscopy channels arranged so as to produce a fluorescence correlation spectroscopy device and a fluorescence correlation device. fluorescence cross correlation spectroscopy. Indeed, this type of measurement provides access to other parameters concerning the particles to be analyzed.
  • the spectroscopy channels comprise optical fibers, which allows optimal guidance of the light that must be directed to the devices considered.
  • the correlated imaging (spectrum and fluorescence life time emitted by the excited molecules) device is combined with a fluorescence life time imaging device under a microscope.
  • This new device allows a measurement of data on a single spectral band, but with a higher resolution, which thus makes it possible to obtain certain temporal information previously chosen more precisely.
  • the switching between the correlation spectroscopy and correlated imaging devices is performed by means of a coupler.
  • This coupling means may for example be in the form of a multi-position switch, each position providing several light fluxes, in different proportions, towards the imaging and spectroscopy devices included in the system.
  • the coupler is advantageously provided with a splitter sensitive to the polarization of the beam from the confocal microscopy device. In this way, it is possible to make different types of measurements on the different polarizations of the input beam.
  • the device for correlated imaging (spectrum and life time the fluorescence emitted by the excited molecules) is arranged to collect spectral and temporal data relating to the molecular interactions.
  • This device thus makes it possible to determine the presence or absence of molecular interactions within the sample to be analyzed. Depending on the result of this determination, it is possible to trigger appropriate measurements, depending on the information that you wish to obtain, such as an FCS, FCCS or FLIM measurement.
  • the adjustment of the data from the fluorescence correlation spectroscopy device consists of adjusting the representation model of the fluorescence emission of the molecules.
  • the confocal microscopy device is provided with illumination means arranged to emit a light beam for excitation of the molecules. These excited molecules are thus able to generate fluorescence back.
  • all the devices of the system according to the invention are motorized and controlled remotely, which allows better handling by a user.
  • the invention also relates to a method of molecular analysis as described above, further comprising:
  • This method has the same advantages as the molecular analysis system according to the invention, namely the possibility of obtaining complementary data simultaneously, with a view to combining / correlating them to subsequently deduce additional information and / or more on dynamics and molecular interactions.
  • the spectroscopic acquisition step is carried out on at least two spectroscopy channels arranged so as to allow a fluorescence correlation and a fluorescence cross-correlation, which makes it possible to access other parameters relating to the particles. to analyze.
  • the data collected during the step of acquisition of correlated images (SLIM) are preferentially processed so as to determine the presence possible molecular interactions.
  • the data collected during the spectroscopic acquisition step are processed by cross-correlation so as to determine the level of independence of the molecules.
  • the data collected during the correlated image acquisition step are processed so as to determine the proportions of interacting molecules and the distance between the interacting molecules.
  • the adjustment of the data collected during the spectroscopic acquisition step is made from the proportions of molecules in interaction and the distance between the previously determined interacting molecules.
  • the data collected during the spectroscopic acquisition step are processed so as to determine the concentrations of donors and acceptors of an interaction, as well as the constant of common diffusion to donors and acceptors of an interaction.
  • FIG. 1 an overall diagram of a molecular analysis system according to a particular embodiment of the invention
  • FIG. 2 a diagram of a confocal microscope integrated in the molecular analysis system according to the invention
  • FIG. 3 a diagram of a coupler integrated in the system according to the invention
  • FIG. 4 a diagram of a device combining FCS and FCCS measurements, integrated in the system according to the invention
  • FIG. 5 a diagram of SLIM and FLIM measuring devices, integrated into the system according to the invention
  • FIG. 6 a diagram illustrating a molecular analysis method according to a particular embodiment of the invention.
  • the system according to the invention aims at analyzing a sample in a medium.
  • This sample may be a liquid medium, a gas, or a biological object containing particles to be analyzed.
  • the particles to be analyzed may be molecules or molecular assemblies, such as, for example, molecular complexes, nanocrystals or nanobeads.
  • FIG. 1 shows a molecular analysis system 1 according to one particular embodiment of the invention, integrating in a modular manner:
  • FCS 5 (which may optionally be replaced by a device combining autocorrelation and cross-correlation of fluorescence 6, as described with reference to FIG. 4),
  • FIG. 2 An example of a confocal microscope is described in FIG. 2. It further comprises illumination means 20, dichroic separation means 21, focusing means 22, support means 23, and spatial filtering means 24.
  • the illumination means 20 generate a collimated excitation light beam 25.
  • These means consist of a pulsed laser source, for example an infrared femtosecond pulsed laser source (tunable Titanium-Sapphire type).
  • the excitation light beam 25 is directed towards the means of dichroic separation 21, preferably consisting of a dichroic band-stop type filter, arranged at 45 ° of the incident excitation beam 25. It may also be useful to add scanning means (not shown), for example a scanner .
  • the focusing means 22 consist of a microscope objective, for example an apochromatic objective having a magnification of 40x and a numerical aperture of 1, 2.
  • the support means 23 consist of a glass substrate, for example a microscope slide. They support the sample 2, advantageously enclosed in a sealed box whose walls are resistant to water.
  • the focussed excitation light beam 25 thus interacts with particles in solution in the sample placed on the support means 23, according to a fluorescence phenomenon. Each excited particle will emit fluorescence a light response at a wavelength greater than that of the excitation beam 25. Part of this light response is then collected by the focusing means 22 so as to form a light beam response 26.
  • This response light beam 26 is sent towards the coupling device 3 through the respective focusing means 22, dichroic separation 21 spatial filtering 24 (by means of a confocal hole), and possibly scanning (not shown) .
  • the spatial filtering means 24 comprise a set of lenses making it possible to combine the focal plane of the focusing means 22 with the plane of the sensor of each of the detection means included in each of the SLIM devices. , FLIM, FCS and FCCS. These spatial filtering means 24 also comprise an aperture of adjustable size, arranged along the axis of the light beam 26. It is optically conjugated with the focusing point of the focusing means 22. It makes it possible to select a detection volume around this point. point of focus.
  • FIG. 3 An example of a coupler 3 is described in FIG. 3. It further comprises an attachment flange 30, a first achromatic doublet 31, a first three-position switch 32, 33 and 34, a second two-position switch 36 and 37 and finally, a second achromatic doublet 35.
  • the fixing flange 30 is arranged at the exit of the microscope 2.
  • the first achromatic doublet 31 is mounted on an XY flex plate and a slide for XYZ positioning. Its focal length and diameter can be respectively equal to 125 mm and 12.7 mm. It is arranged so as to collimate the beam (diverging) from the confocal hole (spatial filtering means 24) and to adapt the opening between the microscope 2 and the spectrograph of the SLIM module 7 (or the sensor of the FCS / FCCS module 6 ).
  • a manual switch receives the collimated beam.
  • the aim is to direct at different positions different beam proportions to direct them separately, on the one hand, to the FCS / FCCS 6 module and, on the other hand, to the SLIM 7 and FLIM 8 modules. is able to work according to three positions 32, 33 and 34:
  • the first position 32 of the switch is empty, so that 0% of the flow is directed to the FCS / FCCS module and 100% to the FLIM and SLIM modules,
  • the second position 33 of the switch comprises a plane mirror, inclined at 45 ° with respect to the optical axis of the microscope 2, of dimensions 15 mm by 15 mm, so that 100% of the flux is directed at 90 ° towards the module FCS / FCCS and 0% to SLIM and FLIM modules, and
  • the third position 34 of the switch comprises a splitter cube (possibly polarizing), of dimensions 10 mm by 10 mm, so that 50% of the flux is directed at 90 ° towards the FCS / FCCS module (horizontal polarization) and 50% towards the SLIM and FLIM modules (vertical polarization). In this way, it can be determined whether 0%, 50% or 100% of the flow is directed to the FCS / FCCS module, the rest being directed to the FLIM and SLIM modules.
  • a splitter cube possibly polarizing
  • the beam directed to the SLIM 7 and FLIM 8 modules passes first through the second manual switch.
  • the aim is to direct at each position two different proportions of the beam to direct them separately, on the one hand, to the SLIM module 7 and, on the other hand, to the FLIM module 8. For this, it is able to work according to two positions 36 and 37:
  • the first position 36 of the switch is empty, so that 0% of the flow is directed to the FLIM module and 100% to the SLIM module,
  • the second position 37 of the switch comprises a plane mirror, inclined at 45 ° with respect to the optical axis of the microscope 2, of dimensions 15 mm by 15 mm, so that 100% of the flux is directed at 90 ° towards the module FLIM and 0% to SLIM modules.
  • the beam directed towards the SLIM module 7 then passes through the second achromatic doublet 35, mounted on an XY flex plate and a slide for XYZ positioning. Its focal length and its diameter can be respectively equal to 24 mm and 1 1, 5 mm. It is arranged so as to focus the beam (collimated) from the first doublet 31 on the input port of the spectrograph SLIM module 7. This beam then enters the module 6.
  • the coupler 3 thus serves to adapt the opening beams leaving the confocal microscope 2 (via the confocal hole) to that of the measuring device used for SLiM measurements.
  • FCS / FCCS An example of an autocorrelation and cross-correlation fluorescence spectroscopy device (FCS / FCCS) 6 is described in FIG. 4. It further comprises a separator 60, two optical fibers 62 and 65, two injection means 61 and 64 of FIG. light in these fibers, and two fast detectors 63 and 66.
  • the separator 60 separates the beam from the coupler 3 between two sub-beams of equal intensity, separated by an angle equal to 90 °.
  • this separator can be replaced by a dichroic separator element, possibly sensitive to polarization.
  • measurements may be made as a function of the wavelength or will make it possible to carry out fluorescence anisotropy measurements.
  • the two spectroscopic channels, to which the two sub-beams are directed, are structurally identical. Also, only the first channel will be described below.
  • This first channel comprises a lens 61 for injecting the sub-beam into the optical fiber 62, the latter being arranged so as to direct the light towards a fast detector APD 62.
  • the second channel comprises the same elements, denoted 64, 65 and 66.
  • the fluxes measured by the two fast detectors 63 and 66 are then transmitted in the form of an electrical signal to the control device 9.
  • FCS module 5 able to perform only autocorrelation and no cross-correlation of fluorescence, it suffices to adapt the module 6 by eliminating the dichroic mirror 60 and a spectroscopy channel. , so that there remains only one spectroscopic channel, provided with elements 61, 62 and 63 (or 64, 65 and 66).
  • SLIM correlated Fluorescence Life Cytometry and Fluorescence Emission Spectroscopy
  • FLIM Fluorescence Life Imaging Microscopy
  • the SLIM module 7 comprises an inlet orifice 70 (an adjustable diaphragm, for example between 0.5 mm and 7 mm), as well as a plane mirror, of dimensions 25 mm by 25 mm, in order to return the beam towards the network 72 of the spectrograph.
  • an inlet orifice 70 an adjustable diaphragm, for example between 0.5 mm and 7 mm
  • a plane mirror of dimensions 25 mm by 25 mm
  • the grating 72 is a concave holographic grating, of dimensions 52 mm by 52 mm, pitch 372 lines / mm, focal length 166 mm, arranged on a kinematic mount (of type trait-point-plane) adjustable in rotation in order to allow orient the features.
  • a kinematic mount of type trait-point-plane
  • a detector 73 is finally arranged so as to collect at least a portion of the diffracted light flux on the network 72. It is a fast multichannel detector (of the order of 200 picoseconds of FWHM), for example a multi-mode photomultiplier. (16 anodes of dimensions 0.8 mm by 16 mm), arranged on a kinematic mount (of type trait-point-plane) adjustable in rotation.
  • the FLIM module 6 comprises an interchangeable band pass filter and a detector 80, for example a fast photomultiplier (less than 50 picoseconds of FWHM).
  • This system thus makes the coupling to three independent detection devices (the modules 6, 7 and 8), in light flux proportions that can be adjustable. Simultaneous measurement by several independent detection devices is thus made possible by this system according to the invention.
  • Figure 6 a diagram illustrating a molecular analysis method according to a particular embodiment of the invention.
  • the squares represent steps of measurement or analysis, the lozenges of the determination steps, the octagons of the data, the arrows in solid lines the succession of the steps and the dashed arrows the use of data for the implementation of steps.
  • This method relates to the implementation and execution of a molecular analysis system according to the invention, comprising in particular SLIM and FCS / FCCS detection modules. It can also be complemented by single-band spectral (FLIM) measurements to obtain information from the SLIM (multi-band spectral band) with greater accuracy. This is the information at the level of the spectral band in common between the SLIM and FLIM measurements. This quantifiable information includes short-range interactions, diffusion, concentration, and belonging to the same complex.
  • FLIM single-band spectral
  • This method also aims to correlate the data from the SLIM and FCS / FCCS modules.
  • the proposed correlation strategy is based on different modes of light observation in order to produce functional models of the biological events studied. To achieve this, the different measurements are made simultaneously on the same region of the object.
  • SLIM measurements make it possible to know if an interaction takes place between the two molecules studied, including in complex environments. If no molecular interaction is observed, an FCCS measurement makes it possible to know if the two molecules are independent or if they belong to the same complex. If a molecular interaction is observed, two-channel FCS measurements are made (one channel for the interaction donor, one channel for the acceptor). In this case, at least a fraction of the two proteins has the same diffusion constants.
  • FCS 1 and FCS 2 represent single-channel FCS measurements: FCS 1 for the first channel, FCS 2 for the second channel.
  • FCS 1 and FCS 2 measurements will correspond to measurements on the donor and on the acceptor of the molecular interaction respectively, which will make it possible to determine several data relating to the nature of the molecular interaction.
  • these two-channel measurements may allow cross-correlation calculations (between FCS 1 and FCS 2) or separate autocorrelation calculations (one autocorrelation for FCS 1, one for FCS 2).
  • These measurement steps provide SLIM data (101), FCS data (103) and FCS data (105).
  • step 106 the SLIM data (step 106) that has just been measured is analyzed.
  • the purpose of this first analysis is to determine (step 107) the possible presence of molecular interactions.
  • the FCCS data analysis (step 108), determined from the FCS 1 (103) and FCS 2 (105) data measured on both channels of FCS simultaneously.
  • the purpose of this analysis is to determine (step 109) whether or not the molecules (which were judged to have no interaction at step 107) are independent. In the positive, it is considered as new data (1 10) that the molecules are members of the same complex. If not, it is considered as new data (1 1 1) that there is no link between the molecules.
  • step 109 After the determination of step 109, the process is complete and it is concluded as to the lack of molecular interactions and the eventual independence of the molecules.
  • step 107 If it is determined the presence of interactions in step 107, the analysis of SLIM data (step 1 12) and data FCS 1 and FCS 2 (step 1 13) is then carried out.
  • a second analysis of the SLIM data from step 1 12 makes it possible to obtain new data among which the percentage of molecules in interaction (1 17) and the distance between the molecules in interaction (1 18).
  • FCS 1 and FCS 2 data from step 1 13 also leads to new data, among which the concentration 1 (1 14), the concentration 2 (1 15) and the diffusion constant common to FCS. 1 and FCS 2 (1 16). It suits here to note that the concentration 1 corresponds to the concentration of the molecule studied at the channel FCS 1, therefore the molecule considered as donor of the interaction, while the concentration 2 corresponds to that of the molecule considered acceptor of the interaction.
  • step 1 12 the adjustment is carried out (step 1).
  • step 1 14 to 1 16 data from analysis of FCS 1 and FCS 2 data.
  • step 1 19 the data 1 17 and 1 18 are used to adjust the data 1 14 to 1 16, so as to improve their accuracy and subsequently improve the accuracy of the transmission representation model by fluorescence of the molecules.
  • step 1 19 After the adjustment of step 1 19, the process is finished and it is concluded as to the presence of molecular interactions, as to the number of free molecules and of molecules in interaction, possibly as to the average distance between molecules, as to the integration of molecules into a complex, as well as some information about the interaction.

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Abstract

L'invention se rapporte à un système d'analyse moléculaire (1), comprenantun dispositif de microscopie confocale (2) muni de moyens d'illumination (20) agencés pour exciter les molécules, et un dispositif d'imageries corrélées (7) de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées. Ce système comprend en outre un dispositif de spectroscopie par corrélation (5;6) de la fluorescence émise par les molécules excitées, apte à commuter avec le dispositif d'imageries corrélées (7) de sorte à réaliser de manière simultanée des mesures d'imageries corrélées et de spectroscopie, ainsi qu'un dispositif de contrôle (8) agencé de sorte que les données issues de ce dispositif d'imageries corrélées (7) participent à l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation (5;6). L'invention se rapporte également à un procédé d'analyse moléculaire mettant en œuvre un tel système (1).

Description

PROCEDE ET SYSTEME D'ANALYSE MOLECULAIRE A COMMUTATION DE MESURES D'IMAGERIE ET DE SPECTROSCOPIE
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte au domaine de l'observation et de la mesure in situ de données biophysiques en rapport à un ensemble de molécules au sein d'une cellule ou d'un animal vivant, comme par exemple des constantes de diffusion, des concentrations locales et des interactions moléculaires à courtes et longues distances.
Elle se rapporte en particulier à un système d'analyse moléculaire comprenant :
- un dispositif de microscopie confocale muni de moyens d'illumination agencés pour exciter les molécules, et
- un dispositif d'imageries corrélées de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées.
Elle se rapporte également à un procédé d'analyse moléculaire comprenant :
- une étape d'excitation des molécules, et
- une étape d'acquisition d'images corrélées de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
Un système disposant d'une partie des ces propriétés est décrit dans la publication « Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells » (Spriet et al. ; Microscopy Research and Technique ; Vol. 70 ; Issue 2 ; pp. 85-94 ; 2007), qui enseigne la réalisation d'un système de mesures corrélées de spectre et de temps de vie de fluorescence.
Ce système, dit « SLIM », fonctionne de manière à combiner des mesures simultanées de spectre de fluorescence et de temps de vie de fluorescence dans chaque région d'une cellule étudiée. De la sorte, il rend possible l'utilisation d'informations de spectre d'émission de fluorescence et de temps de vie de fluorescence, acquises de manière simultanée, de façon à obtenir des informations complémentaires sur les molécules et leur environnement. Ces informations, prises individuellement, ne peuvent en effet quantifier de façon complète les caractéristiques des fluorophores considérés, du fait de leur dépendance à plusieurs paramètres (l'environnement moléculaire, les conditions expérimentales et la complexité d'interprétation).
Plus précisément, le système décrit dans cette publication propose des mesures simultanées de temps de vie sur au moins seize bandes spectrales, directement reliées à un microscope confocal par excitation à deux photons. Ces mesures peuvent être réalisées au moyen d'un détecteur à 32 anodes.
Dans la publication « SLIM: a new method for molecular imaging » (Ruck et al. ; Microscopy Research and Technique ; Vol. 70 ; Issue 5 ; pp. 485-492), l'imagerie corrélée de spectre et de temps de vie de fluorescence est utilisée pour l'analyse de cellules ADN, ARN, ou de marqueurs rhodamine 123 (marqueur des mitochondries). Pour cela, le système divulgué comporte un microscope à balayage laser, muni d'un spectrographe, d'un photomultiplicateur multianode à seize canaux et d'un compteur de photon multidimensionnel à corrélation temporelle. L'excitation des molécules est réalisée au moyen d'un laser titane saphir ou d'une diode laser.
Un tel système ne permet cependant d'obtenir qu'un nombre limité d'informations sur les interactions moléculaires dans le milieu étudié, dans la mesure où le nombre de données qu'il est susceptible d'acquérir est lui-même limité.
Cette limitation pose donc le problème de l'obtention d'un nombre plus important d'informations à partir d'un unique appareil.
Il est en effet connu d'utiliser d'autres systèmes de mesure pour obtenir d'autres informations sur les interactions moléculaires, comme par exemple les systèmes de microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM), de spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS) et de spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence (FCCS).
Des systèmes FLIM sont par exemple décrits dans les documents de brevet US 2007/0181 16 A1 et US 2007/197894 A1 . Une source lumineuse y génère un faisceau apte à exciter des molécules. La fluorescence émise en retour par ces molécules traverse un microscope confocal afin d'être détectée par un photomultiplicateur rapide (picoseconde) fonctionnant en régime de comptage de photons. Des systèmes FCS et FCCS sont, quant à eux, décrits par exemple dans le document de brevet FR 2 827 959. Dans chaque cas, un faisceau laser d'excitation est rendu convergeant par un objectif de microscope en un point de focalisation situé au niveau des particules que l'on souhaite analyser, ces particules étant en solution sur un substrat passif du point de vue optique. La lumière du faisceau laser focalisé est absorbée par les particules, puis réémise à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau laser pour être ensuite dirigée sur le détecteur via le dispositif de conjugaison optique.
Afin d'obtenir un nombre important d'informations sur des particules fluorescentes en solution, un corrélateur est relié au détecteur afin d'analyser les fluctuations temporelles de la lumière fluorescente émise par le volume d'analyse, de sorte à réaliser une détection par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Ces fluctuations temporelles sont directement reliées à la diffusion des fluophores au travers du volume d'analyse. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen - le temps de diffusion - des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d'analyse. Le corrélateur peut ainsi fournir des données d'autocorrélation, de corrélation croisée ou une combinaison de ces données.
Afin d'obtenir des informations issues de ces différents dispositifs avec un unique appareil, il se pose le problème du couplage de ceux-ci. Ce couplage s'avère d'autant plus intéressant que la combinaison de données SLIM et FCS permettrait d'aboutir à de nouvelles informations sur les interactions moléculaires, qui n'étaient jusqu'alors jamais accessibles.
Dans l'état de la technique, ce problème est résolu d'un point de vue structurel par l'adjonction de ces dispositifs à un unique microscope confocal, par l'intermédiaire d'un dispositif de couplage.
Or, les dispositifs SLIM, FLIM, FCS et FCCS sont prévus pour une même position d'adaptation du microscope, ce qui nécessite de retirer l'un de ces dispositifs pour le remplacer par un autre et/ou de changer une pièce dans le dispositif de couplage (par exemple un cube filtre pour passer de FLIM à FCS). Dans ces conditions, les analyses de dynamique et d'interactions moléculaires ne peuvent être réalisées que de manière séquentielle, dispositif par dispositif, ce qui limite la combinaison et la corrélation de ces différentes données, notamment par la création de modèles fonctionnels intégrant ces données. Cet inconvénient est d'autant plus significatif lors d'études nécessitant une vision à la fois dynamique et topologique des phénomènes étudiés.
Par ailleurs, la question du couplage de ces dispositifs rejoint celle du couplage des données issues de ceux-ci, afin d'obtenir, d'une part, des nouvelles données complémentaires et, d'autre part, des données déjà connues mais avec une plus grande précision.
OBJET DE L'INVENTION
Un but de l'invention est donc de permettre, avec un unique système, la combinaison et la corrélation de données issus d'un dispositif d'imageries corrélées de spectre et de temps de vie de fluorescence (SLIM) et d'un dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS).
Ce problème est résolu selon l'invention par un système d'analyse moléculaire tel que décrit précédemment, comprenant en outre :
- un dispositif de spectroscopie par corrélation de la fluorescence émise par les molécules excitées, apte à commuter avec le dispositif d'imageries corrélées de sorte à réaliser de manière simultanée des mesures d'imageries corrélées et de spectroscopie, et
- un dispositif de contrôle agencé de sorte que les données issues du dispositif d'imageries corrélées participent à l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation.
Grâce à la combinaison d'un système d'analyse moléculaire de l'art antérieur avec ces dispositifs de spectroscopie par corrélation de fluorescence et de contrôle, il est possible de réaliser simultanément des mesures SLIM et FCS et, ensuite, d'exploiter ces données qui ont été acquises sur la même base temporelle. En particulier, le dispositif de contrôle permet d'ajuster les données FCS, par exemple en intégrant les données SLIM au modèle de représentation de FCS. Ainsi constitué, le système selon l'invention permet donc l'obtention de mesure plus précises. En outre, la conception modulaire de ce système présente l'avantage de faciliter sa fabrication et sa maintenance, notamment dans le cas du remplacement d'un module défectueux par un nouveau module.
En vue de disposer d'informations complémentaires avec cet unique système, le dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence est de préférence muni d'au moins deux canaux de spectroscopie agencés de sorte à réaliser un dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence et un dispositif de spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence. En effet, ce type de mesure permet d'accéder à d'autres paramètres concernant les particules à analyser.
Dans ce dernier cas, selon un mode de réalisation particulier, les canaux de spectroscopie comportent des fibres optiques, ce qui permet un guidage optimal de la lumière qui doit être dirige vers les dispositifs considérés.
De préférence, le dispositif d'imageries corrélées (de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées) est combiné à un dispositif d'imagerie de temps de vie de fluorescence sous microscope. Ce nouveau dispositif (FLIM), permet une mesure de données sur une seule bande spectrale, mais avec une résolution plus élevée, ce qui permet donc d'obtenir certaines informations temporelles préalablement choisies de manière plus précise.
De préférence, la commutation entre les dispositifs de spectroscopie par corrélation et d'imageries corrélées est réalisée au moyen d'un coupleur. Ce moyen de couplage peut se présenter par exemple sous la forme d'un commutateur à plusieurs positions, chaque position fournissant plusieurs flux lumineux, dans différentes proportions, en direction des dispositifs d'imagerie et de spectroscopie compris dans le système. On rend ainsi possible à tout instant le choix des dispositifs dont on souhaite qu'il procède à une analyse de molécules. Dans ce dernier cas, le coupleur est avantageusement muni d'une séparatrice sensible à la polarisation du faisceau issu du dispositif de microscopie confocale. De la sorte, il est possible de faire des mesures de types différents sur les différentes polarisations du faisceau d'entrée. En particulier, il est possible d'attaquer le spectrographe du module SLiM avec une polarisation optimale et d'utiliser le reste de la lumière pour d'autres mesures, optimisant alors l'efficacité globale de collection du système.
De préférence, le dispositif d'imageries corrélées (de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées) est agencé pour recueillir des données spectrales et temporelles relatives aux interactions moléculaires. Ce dispositif permet ainsi de déterminer la présence ou non d'interactions moléculaires au sein de l'échantillon à analyser. En fonction du résultat de cette détermination, il est possible de déclencher des mesures adéquates, en fonction des informations que l'on souhaite en retirer, comme par exemple une mesure FCS, FCCS ou FLIM.
Selon un mode de réalisation particulier, l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence consiste à ajuster le modèle de représentation de l'émission par fluorescence des molécules.
Selon un mode de réalisation avantageux, le dispositif de microscopie confocale est muni de moyens d'illumination agencés pour émettre un faisceau lumineux d'excitation des molécules. Ces molécules excitées sont ainsi aptes à générer de la fluorescence en retour.
De préférence, tous les dispositifs du système selon l'invention sont motorisés et pilotés à distance, ce qui permet une meilleure manipulation par un utilisateur. L'invention concerne également un procédé d'analyse moléculaire tel que décrit précédemment, comprenant en outre :
- une étape de d'acquisition spectroscopique par corrélation de la fluorescence émise par les molécules excitées, simultanée à l'étape d'acquisition d'images corrélées, et
- une étape de contrôle des données recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées de sorte qu'elles participent à l'ajustement des données recueillies lors de ladite étape d'acquisition spectroscopique.
Ce procédé présente les mêmes avantages que le système d'analyse moléculaire selon l'invention, à savoir la possibilité d'obtenir des données complémentaires de manière simultanée, en vue de les combiner/corréler pour en déduire ensuite des informations complémentaires et/ou plus précises sur la dynamique et les interactions moléculaires.
De préférence, l'étape d'acquisition spectroscopique s'opère sur au moins deux canaux de spectroscopie agencés de sorte à permettre une corrélation de fluorescence et une corrélation croisée de fluorescence, ce qui permet d'accéder à d'autres paramètres concernant les particules à analyser. Aux fins de conditionner la mesure par les dispositifs du système autres que le dispositif SLIM à la présence d'interactions, les données recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées (SLIM) sont préférentiellement traitées de manière à déterminer la présence éventuelle d'interactions moléculaires.
En l'absence d'interactions moléculaires, il peut être prévu que les données recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique soient traitées par corrélation croisée de manière à déterminer le niveau d'indépendance des molécules.
En présence d'interactions moléculaires, il peut être prévu que les données recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées soient traitées de manière à déterminer les proportions de molécules en interaction et la distance entre les molécules en interaction.
Dans ce dernier cas, l'ajustement des données recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique est réalisée à partir des proportions de molécules en interaction et de la distance entre les molécules en interaction préalablement déterminées.
Toujours en présence d'interactions moléculaires, il peut être enfin prévu que les données recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique soient traitées de manière à déterminer les concentrations de donneurs et d'accepteurs d'une interaction, ainsi que la constante de diffusion commune aux donneurs et accepteurs d'une interaction.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'exemples non limitatifs de réalisation, accompagnée de figures représentant respectivement :
- la figure 1 , un schéma d'ensemble d'un système d'analyse moléculaire selon un mode de réalisation particulier de l'invention,
- la figure 2, un schéma d'un microscope confocal intégré au système d'analyse moléculaire selon l'invention,
- la figure 3, un schéma d'un coupleur intégré au système selon l'invention,
- la figure 4, un schéma d'un dispositif combinant des mesures FCS et FCCS, intégré au système selon l'invention, - la figure 5, un schéma de dispositifs de mesure SLIM et FLIM, intégrés au système selon l'invention, et
- la figure 6, un diagramme illustrant un procédé d'analyse moléculaire selon un mode de réalisation particulier de l'invention.
Pour une meilleure lisibilité, sur ces figures, des références numériques identiques se rapportent à des éléments techniques similaires.
EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
Le système selon l'invention vise à analyser un échantillon dans un milieu. Cet échantillon peut être un milieu liquide, gazeux, ou un objet biologique contenant des particules à analyser. Les particules à analyser peuvent être des molécules ou des assemblages moléculaires, comme par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles.
On a représenté sur la figure 1 un système d'analyse moléculaire 1 selon un mode de réalisation particulier de l'invention, intégrant de manière modulaire :
- un dispositif de microscopie confocale 2,
- un dispositif de couplage 3,
- un dispositif de spectrosopie par corrélation de fluorescence FCS 5 (qui peut éventuellement être remplacé par un dispositif combinant autocorrélation et corrélation croisée de fluorescence 6, tel que décrit en référence à la figure 4),
- un dispositif de microscopie par imageries corrélées de temps de vie de fluorescence et de spectre d'émission de fluorescence 7,
- un dispositif de microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence FLIM 8, et
- un dispositif de contrôle 9.
Un exemple de microscope confocal est décrit à la figure 2. Il comprend en outre des moyens d'illumination 20, de séparation dichroïque 21 , de focalisation 22, de support 23 et de filtrage spatial 24.
Les moyens d'illumination 20 génèrent un faisceau lumineux d'excitation collimaté 25. Ces moyens sont constitués d'une source laser puisée, par exemple une source laser impulsionnelle femtoseconde infrarouge (type Titane-Saphir accordable). Le faisceau lumineux d'excitation 25 est dirigé vers les moyens de séparation dichroïque 21 , avantageusement constitués d'une filtre dichroïque de type coupe-bande, disposé à 45° du faisceau incident d'excitation 25. Il peut également être utile d'adjoindre des moyens de balayage (non représentés), par exemple un scanner.
Les moyens de focalisation 22 sont constitués d'un objectif de microscope, par exemple un objectif apochromatique présentant un grandissement de 40x et une ouverture numérique de 1 ,2.
Les moyens de support 23 sont constitués d'un substrat de verre, par exemple une lamelle de microscope. Ils supportent l'échantillon 2, avantageusement enfermé dans une boîte étanche dont les parois sont résistantes à l'eau.
Le faisceau lumineux d'excitation 25 ainsi focalisé interagit avec des particules en solution dans l'échantillon disposé sur les moyens de support 23, selon un phénomène de fluorescence. Chaque particule excitée va émettre par fluorescence une réponse lumineuse à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau d'excitation 25. Une partie de cette réponse lumineuse est alors collectée par les moyens de focalisation 22 de sorte à former un faisceau lumineux de réponse 26.
Ce faisceau lumineux de réponse 26 est envoyé en direction du dispositif de couplage 3 au travers des moyens respectivement de focalisation 22, de séparation dichroïque 21 de filtrage spatial 24 (au moyen d'un trou confocal), et éventuellement de balayage (non représentés).
Afin de réaliser la détection du faisceau de réponse 26, les moyens de filtrage spatial 24 comprennent un ensemble de lentilles permettant de conjuguer le plan focal des moyens de focalisation 22 avec le plan du capteur de chacun des moyens de détection compris dans chacun des dispositifs SLIM, FLIM, FCS et FCCS. Ces moyens de filtrage spatial 24 comprennent également une ouverture de dimension réglable, disposée suivant l'axe du faisceau lumineux 26. Elle est conjuguée optiquement avec le point de focalisation des moyens de focalisation 22. Elle permet de sélectionner un volume de détection autour de ce point de focalisation.
Un exemple de coupleur 3 est décrit à la figure 3. Il comprend en outre une bride de fixation 30, un premier doublet achromatique 31 , un premier commutateur à trois positions 32, 33 et 34, un second commutateur à deux positions 36 et 37 et enfin, un second doublet achromatique 35.
La bride de fixation 30 est disposée à la sortie du microscope 2.
Le premier doublet achromatique 31 est monté sur platine à flexion XY et glissière pour positionnement XYZ. Sa focale et son diamètre peuvent être respectivement égaux à 125 mm et 12,7 mm. Il est disposé de sorte à collimater le faisceau (divergent) issu du trou confocal (des moyens de filtrage spatial 24) et adapter l'ouverture entre le microscope 2 et le spectrographe du module SLIM 7 (ou le capteur du module FCS/FCCS 6).
Un commutateur manuel reçoit le faisceau collimaté. Le but est de diriger à chaque position des proportions différentes du faisceau pour les diriger séparément, d'une part, vers le module FCS/FCCS 6 et, d'autre part, vers les modules SLIM 7 et FLIM 8. Pour cela, il est apte à travailler selon trois positions 32, 33 et 34 :
- la première position 32 du commutateur est vide, si bien que 0% du flux est dirigé vers le module FCS/FCCS et 100% vers les modules FLIM et SLIM,
- la seconde position 33 du commutateur comporte un miroir plan, incliné à 45° par rapport à l'axe optique du microscope 2, de dimensions 15 mm par 15 mm, si bien que 100% du flux est dirigé à 90° vers le module FCS/FCCS et 0% vers les modules SLIM et FLIM, et
- la troisième position 34 du commutateur comporte un cube séparateur (éventuellement polarisant), de dimensions 10 mm par 10 mm, si bien que 50% du flux est dirigé à 90° vers le module FCS/FCCS (polarisation horizontale) et 50% vers les modules SLIM et FLIM (polarisation verticale). De la sorte, il peut être déterminé si 0%, 50% ou 100% du flux est dirigé vers le module FCS/FCCS, le reste étant dirigé vers les modules FLIM et SLIM. L'homme du métier notera ici qu'il est possible de réaliser des commutateurs avec un nombre différent de positions sans pour autant sortir du cadre de l'invention.
Le faisceau dirigé vers les modules SLIM 7 et FLIM 8 traverse d'abord le second commutateur manuel. Le but est de diriger à chaque position deux proportions différentes du faisceau pour les diriger séparément, d'une part, vers le module SLIM 7 et, d'autre part, vers le module FLIM 8. Pour cela, il est apte à travailler selon deux positions 36 et 37 :
- la première position 36 du commutateur est vide, si bien que 0% du flux est dirigé vers le module FLIM et 100% vers le module SLIM,
- la seconde position 37 du commutateur comporte un miroir plan, incliné à 45° par rapport à l'axe optique du microscope 2, de dimensions 15 mm par 15 mm, si bien que 100% du flux est dirigé à 90° vers le module FLIM et 0% vers les modules SLIM.
Le faisceau dirigé vers le module SLIM 7 traverse ensuite le second doublet achromatique 35, monté sur platine à flexion XY et glissière pour positionnement XYZ. Sa focale et son diamètre peuvent être respectivement égaux à 24 mm et 1 1 ,5 mm. Il est disposé de sorte à focaliser le faisceau (collimaté) provenant du premier doublet 31 sur l'orifice d'entrée du spectrographe du module SLIM 7. Ce faisceau pénètre ensuite le module 6.
Grâce au premier doublet 31 (qui collimaté le faisceau 26 issu du trou confocal) et au second doublet 35 (qui refocalise le signal sur l'orifice d'entrée du spectrographe du module 7), le coupleur 3 sert ainsi à adapter l'ouverture des faisceaux sortant du microscope confocal 2 (via le trou confocal) à celle du dispositif de mesure utilisé pour les mesures de SLiM.
Un exemple de dispositif de spectroscopie par autocorrélation et corrélation croisée de fluorescence (FCS/FCCS) 6 est décrit à la figure 4. Il comprend en outre une séparatrice 60, deux fibres optiques 62 et 65, deux moyens d'injection 61 et 64 de la lumière dans ces fibres, et deux détecteurs rapides 63 et 66.
La séparatrice 60 sépare le faisceau issu du coupleur 3 entre deux sous-faisceaux d'égale intensité, séparés d'un angle égal à 90°. Selon une autre variante de mise en œuvre, cette séparatrice peut être remplacé par un élément séparateur dichroïque, éventuellement sensible à la polarisation. Selon cette variante, des mesures pourront être réalisées en fonction de la longueur d'onde ou permettront de réaliser des mesures d'anisotropie de fluorescence.
Les deux canaux de spectroscopie, vers lesquels sont dirigés les deux sous- faisceaux, sont structurellement identiques. Aussi, seul le premier canal sera décrit ci-après. Ce premier canal comporte une lentille 61 pour l'injection du sous- faisceau dans la fibre optique 62, cette dernière étant agencée de sorte à diriger la lumière vers un détecteur rapide APD 62. Le second canal comprend les mêmes éléments, notés 64, 65 et 66.
Les flux mesurés par les deux détecteurs rapides 63 et 66 sont ensuite transmis sous forme de signal électrique au dispositif de contrôle 9.
L'homme du métier notera que pour réaliser un module FCS 5, apte à réaliser seulement de l'autocorrélation et pas de corrélation croisée de fluorescence, il lui suffit d'adapter le module 6 en supprimant le miroir dichroïque 60 et un canal de spectroscopie, de sorte qu'il ne reste qu'un seul canal spectroscopique, muni des éléments 61 , 62 et 63 (ou 64, 65 et 66).
Des exemples d'un dispositif de microscopie par imageries corrélées de temps de vie de fluorescence et de spectre d'émission de fluorescence (SLIM) 7 et d'un dispositif de microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM) 8 sont décrit plus particulièrement à la figure 5.
Le module SLIM 7 comporte un orifice d'entrée 70 (un diaphragme ajustable, par exemple entre 0,5 mm et 7 mm), ainsi qu'un miroir plan, de dimensions 25 mm par 25 mm, afin de renvoyer le faisceau vers le réseau 72 du spectrographe.
Le réseau 72 est un réseau holographique concave, de dimensions 52 mm par 52 mm, de pas 372 traits/mm, de focale 166 mm, disposé sur une monture cinématique (de type trait-point-plan) réglable en rotation afin de permettre d'orienter les traits. Ainsi, les seuls éléments optiques du module 7 sont le miroir 71 et le réseau 72, ce qui limite les pertes de photons.
Un détecteur 73 est enfin disposé de sorte à collecter au moins une partie du flux lumineux diffracté sur le réseau 72. Il s'agit d'un détecteur multicanaux rapide (de l'ordre de 200 picosecondes de FWHM), par exemple un photomultiplicateur multianodes (16 anodes de dimensions 0,8 mm par 16 mm), disposé sur une monture cinématique (de type trait-point-plan) ajustable en rotation.
Le module FLIM 6 comporte un filtre passe bande interchangeable et un détecteur 80, par exemple un photomultiplicateur rapide (inférieur à 50 picosecondes de FWHM).
Ce système rend ainsi le couplage vers trois dispositifs de détection indépendants (les modules 6, 7 et 8), dans des proportions de flux lumineux qui peuvent être réglables. La mesure simultanée par plusieurs dispositifs de détection indépendants est donc rendue possible par ce système selon l'invention.
Enfin, on a représenté sur la figure 6 un diagramme illustrant un procédé d'analyse moléculaire selon un mode de réalisation particulier de l'invention. Dans cette figure, les carrés représentent des étapes de mesure ou d'analyse, les losanges des étapes de détermination, les octogones des données, les flèches en traits pleins la succession des étapes et les flèches en pointillés l'utilisation de données pour la mise en œuvre d'étapes.
Ce procédé vise la mise en œuvre et l'exécution d'un système d'analyse moléculaire selon l'invention, comprenant en particulier des modules de détection SLIM et FCS/FCCS. Il peut également être complété par des mesures FLIM (à une seule bande spectrale), dans le but d'obtenir des informations issues du SLIM (à plusieurs bandes spectrales) avec une plus grande précision. Il s'agit en l'état des informations au niveau de la bande spectrale en commun entre les mesures SLIM et FLIM. Parmi ces informations quantifiables, on note les interactions à courte distance, la diffusion, la concentration et l'appartenance à un même complexe.
Ce procédé vise en outre la corrélation des données issues des modules SLIM et FCS/FCCS. Pour cela, la stratégie de corrélation proposée s'appuie sur différents modes d'observation de la lumière afin de réaliser des modèles fonctionnels des événements biologiques étudiés. Pour y parvenir, les différentes mesures se font de façon simultanée sur la même région de l'objet.
Cette stratégie de corrélation se décompose de la façon suivante. Des mesures SLIM permettent de savoir si une interaction a lieu entre les deux molécules étudiées, y compris dans des milieux complexes. Si aucune interaction moléculaire n'est observée, une mesure FCCS permet de savoir si les deux molécules sont indépendantes ou si elles appartiennent à un même complexe. Si une interaction moléculaire est observée, on réalise des mesures de FCS à deux canaux (un canal pour le donneur de l'interaction, un canal pour l'accepteur). Dans ce cas, au moins une fraction des deux protéines a les mêmes constantes de diffusion. Cette information permet ensuite de réaliser un ajustement global par partie des données de FCS (afin de stabiliser les résultats), de déterminer le temps de diffusion des protéines en interaction, et de déterminer avec précision la distance mais également la concentration des molécules en interaction (le SLIM donne accès à la distance et la proportion des molécules, alors que la FCS donne accès aux concentrations de molécules marquées).
Plus précisément, en référence à la figure 6, on procède simultanément à des mesures SLIM (étape 100), FCS 1 (étape 102) et FCS 2 (étape 104). Ces étapes de mesure FCS 1 et FCS 2 représentent des mesures de FCS à un canal : FCS 1 pour le premier canal, FCS 2 pour le second. En l'espèce, les mesures FCS 1 et FCS 2 correspondront à des mesures respectivement sur le donneur et sur l'accepteur de l'interaction moléculaire, ce qui permettra de déterminer plusieurs données relatives à la nature de l'interaction moléculaire.
Par la suite, ces mesures à deux canaux pourront permettre des calculs de corrélation croisée (entre FCS 1 et FCS 2) ou des calculs d'autocorrélation distincts (une autocorrélation pour FCS 1 , une pour FCS 2). Ces étapes de mesures permettent de disposer de données SLIM (101 ), de données FCS 1 (103) et de données FCS 2 (105).
Par la suite, il est procédé à l'analyse des données SLIM (étape 106) qui viennent d'être mesurées. Le but de cette première analyse est de déterminer (étape 107) la présence éventuelle d'interactions moléculaires.
S'il est déterminé l'absence d'interactions lors de l'étape 107, on procède à l'analyse de données FCCS (étape 108), déterminées à partir des données FCS 1 (103) et FCS 2 (105) mesurées sur les deux canaux de FCS simultanément. Le but de cette analyse est de déterminer (étape 109) si les molécules (qui ont été jugées sans interaction à l'étape 107) sont ou non indépendantes. Dans la positive, il est considéré comme nouvelle donnée (1 10) le fait que les molécules sont membres du même complexe. Dans la négative, il est considéré comme nouvelle donnée (1 1 1 ) le fait qu'il n'y a pas de lien entre les molécules.
Après la détermination de l'étape 109, le procédé est terminé et il est conclu quant à l'absence d'interactions moléculaires et l'indépendance éventuelle des molécules.
S'il est déterminé la présence d'interactions lors de l'étape 107, on procède alors conjointement aux analyses des données SLIM (étape 1 12) et des données FCS 1 et FCS 2 (étape 1 13).
Une deuxième analyse des données SLIM de l'étape 1 12 permet d'aboutir à de nouvelles données parmi lesquelles le pourcentage de molécules en interaction (1 17) et la distance entre les molécules en interaction (1 18).
L'analyse des données FCS 1 et FCS 2 de l'étape 1 13 permet également d'aboutir à de nouvelles données parmi lesquelles la concentration 1 (1 14), la concentration 2 (1 15) et la constante de diffusion commune à FCS 1 et FCS 2 (1 16). Il convient ici de noter que la concentration 1 correspond à la concentration de la molécule étudiée au niveau du canal FCS 1 , donc la molécule considérée comme donneur de l'interaction, tandis que la concentration 2 correspond à celle de la molécule considérée comme accepteur de l'interaction.
A partir de ces données 1 14, 1 15 et 1 16, il est possible de construire un modèle de représentation de l'émission par fluorescence des molécules excitées.
Enfin, suite aux analyses conjointes des données SLIM (étape 1 12) et des données FCS 1 et FCS 2 (étape 1 13) et à la détermination des paramètres 1 14 à 1 18, il est procédé à l'ajustement (étape 1 19) des données 1 14 à 1 16 (issues de l'analyse des données de FCS 1 et FCS 2). Lors de cette étape 1 19, les données 1 17 et 1 18 sont utilisées afin d'ajuster les données 1 14 à 1 16, de sorte à améliorer leur précision et par la suite d'améliorer la précision du modèle de représentation de émission par fluorescence des molécules.
Après l'ajustement de l'étape 1 19, le procédé est terminé et il est conclu quant à la présence d'interactions moléculaires, quant au nombre de molécules libres et de molécules en interaction, éventuellement quant à la distance moyenne entre molécules, quant à l'intégration des molécules dans un complexe, ainsi que quant à certaines informations relatives à l'interaction.
Il est clair pour l'homme du métier que le nombre d'informations déterminées grâce au procédé selon l'invention, ainsi que la précision de ces informations, ne saurait résulter de la mesure sur un seul module (SLIM ou FCS) et de l'analyse des données mesurées sur ce module. En effet, d'une part, les différents modules mis en œuvre se combinent en vue de réaliser des mesures simultanées, dont il est possible d'extraire de nouvelles informations, du fait de la base temporelle communes à toutes ces mesures. D'autre part, l'analyse conjointe des données issues de tous ces modules permet d'en déduire de nouvelles informations et par ailleurs d'ajuster certaines données relative à l'interaction.
Le système et le procédé selon l'invention, décrits ci-dessus, permettent donc d'affiner la connaissance sur la dynamique et les interactions moléculaires, y compris en milieu biologique complexe, par l'obtention d'un plus grand nombre d'informations et l'amélioration de la précision de ces dernières.
Les modes de réalisation précédemment décrits de la présente invention sont donnés à titre d'exemples et ne sont nullement limitatifs. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention sans pour autant sortir du cadre du brevet.

Claims
REVENDICATIONS
Système d'analyse moléculaire (1 ), comprenant :
- un dispositif de microscopie confocale (2) muni de moyens d'illumination (20) agencés pour exciter les molécules, et
- un dispositif d'imageries corrélées (7) de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées,
caractérisé en ce qu'il comprend en outre :
- un dispositif de spectroscopie par corrélation (5;6) de la fluorescence émise par les molécules excitées, apte à commuter avec le dispositif d'imageries corrélées (7) de sorte à réaliser de manière simultanée des mesures d'imageries corrélées et de spectroscopie, et
- un dispositif de contrôle (8) agencé de sorte que les données issues dudit dispositif d'imageries corrélées (7) participent à l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation (5;6).
Système d'analyse (1 ) selon la revendication 1 , dans lequel le dispositif de spectroscopie par corrélation (5;6) de fluorescence est muni d'au moins deux canaux de spectroscopie (61 ,62,63;64,65,66) agencés de sorte à réaliser un dispositif de spectroscopie par corrélation
(5) de fluorescence et un dispositif de spectroscopie par corrélation croisée
(6) de fluorescence. Système d'analyse (1 ) selon la revendication 2, dans lequel les canaux de spectroscopie (61 ,62,63;64,65,66) comportent des fibres optiques (62,65). Système d'analyse (1 ) selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le dispositif d'imageries corrélées (7) est combiné à un dispositif d'imagerie (8) de temps de vie de fluorescence sous microscope.
Système d'analyse (1 ) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la commutation entre les dispositifs de spectroscopie par corrélation (5;6) et d'imageries corrélées (7) est réalisée au moyen d'un coupleur (3). Système d'analyse (1 ) selon la revendication 5, dans lequel le coupleur (3) est muni d'une séparatrice sensible à la polarisation du faisceau issu du dispositif de microscopie confocale (2).
7. Système d'analyse (1 ) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le dispositif d'imageries corrélées (7) est agencé pour recueillir des données spectrales et temporelles relatives aux interactions moléculaires.
8. Système d'analyse (1 ) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation (5;6) consiste à ajuster le modèle de représentation de l'émission par fluorescence des molécules.
9. Système d'analyse (1 ) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le dispositif de microscopie confocale (2) est muni de moyens d'illumination (20) agencés pour émettre un faisceau lumineux d'excitation des molécules.
10. Système d'analyse (1 ) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel tous les dispositifs (2,3,5,6,7,8,9) sont motorisés et pilotés à distance.
1 1 . Procédé d'analyse moléculaire comprenant :
- une étape d'excitation des molécules,
- une étape d'acquisition (100) d'images corrélées de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :
- une étape de d'acquisition spectroscopique (102,104) par corrélation de la fluorescence émise par les molécules excitées, simultanée à l'étape d'acquisition (100) d'images corrélées, et
- une étape de contrôle (106,107,108,109,1 12,1 13,1 19) des données (101 ,1 17,1 18) recueillies lors de ladite étape d'acquisition (100) d'images corrélées de sorte qu'elles participent à l'ajustement des données (103,105,1 14,1 15,1 16) recueillies lors de ladite étape d'acquisition spectroscopique (102,104).
12. Procédé d'analyse selon la revendication 1 1 , dans lequel l'étape de d'acquisition spectroscopique (102,104) s'opère sur au moins deux canaux de spectroscopie agencés de sorte à permettre une corrélation de fluorescence et une corrélation croisée de fluorescence.
13. Procédé d'analyse selon la revendication 1 1 ou 12, dans lequel les données (101 ) recueillies lors de ladite étape d'acquisition (100) d'images corrélées sont traitées de manière à déterminer (107) la présence éventuelle d'interactions moléculaires.
14. Procédé d'analyse selon la revendication 13, en dépendance de la revendication 12, dans lequel, en l'absence d'interactions moléculaires, les données (103,105) recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique (102,104) sont traitées par corrélation croisée (108) de manière à déterminer (109) le niveau d'indépendance (1 10,1 1 1 ) des molécules.
15. Procédé d'analyse selon la revendication 13 ou 14, dans lequel, en présence d'interactions moléculaires, les données (103,105) recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées (100) sont traitées de manière à déterminer les proportions de molécules en interaction (1 17) et la distance entre les molécules en interaction (1 18).
16. Procédé d'analyse selon la revendication 15, dans lequel l'ajustement des données (103,105,1 14,1 15,1 16) recueillies lors de ladite étape d'acquisition spectroscopique (102,104) est réalisée à partir des proportions de molécules en interaction (1 17) et de la distance entre les molécules en interaction (1 18) préalablement déterminées.
17. Procédé d'analyse selon l'une des revendications 13 à 16, en dépendance de la revendication 1 1 , dans lequel, en présence d'interactions moléculaires, les données (103,105) recueillies lors de l'étape d'acquisition spectro-scopique (102,104) sont traitées de manière à déterminer les concentrations (1 14,1 15) de donneurs et accepteurs d'une interaction, ainsi que la constante de diffusion (1 16) commune aux donneurs et accepteurs d'une interaction.
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