WO2009119890A1 - Ｄｎａメチル化測定方法 - Google Patents

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WO2009119890A1
WO2009119890A1 PCT/JP2009/056782 JP2009056782W WO2009119890A1 WO 2009119890 A1 WO2009119890 A1 WO 2009119890A1 JP 2009056782 W JP2009056782 W JP 2009056782W WO 2009119890 A1 WO2009119890 A1 WO 2009119890A1
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dna
stranded
region
base sequence
primer
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PCT/JP2009/056782
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冨ヶ原祥隆
佐藤日出夫
樽井弘和
Original Assignee
住友化学株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen.
  • methylation in the target DNA region in the genomic DNA is performed.
  • There are methods for measuring the content of DN A eg Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11; 22 (15): 2990-7, and Proc Natl Acad Sci US A. 1 997 Mar 18; 94 (6): 2284 -See 9).
  • this measurement method first, it is necessary to extract DNA containing the target DNA region from genomic DNA-derived DNA samples, and the extraction operation is complicated.
  • a method for measuring the content of methylated DNA in the target region of the extracted DNA for example, (1) After modifying the DNA with sulfite, etc., DNA synthesis by DNA polymerase can be performed.
  • a method for amplifying a target region by subjecting it to a polymerase chain reaction hereinafter, also referred to as PCR.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a method for amplifying a target region by providing the information is known. In any of these methods, it takes time to modify DNA for detection of methylation and subsequent purification of the product, preparation of a reaction system for PCR, confirmation of DNA amplification, and the like. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for easily measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen.
  • the following inventions are provided. [Invention 1]
  • a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen A method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen
  • the single-stranded DNA selected in the second step is used as a saddle, and the single-stranded DNA is double-stranded by extending the primer once using the single-stranded immobilized oligonucleotide as a primer.
  • the process has a process (pre-process) for separating the stretched double-stranded DNA obtained in the third process into a single-stranded state.
  • step A A DNA in a single-stranded state selected in the first step, using the single-stranded immobilized oligonucleotide as a primer, and extending the primer once to form a DNA in the single-stranded state Step A2 in which DNA is elongated as double-stranded DNA, step A (this step) having:
  • the stretched double-stranded DNA obtained in each of the above steps can be separated into a single-stranded state and then turned back to detect methylated DNA in the target DNA region.
  • the single-stranded DNA positive strand
  • the target DNA region is not included.
  • a step of adding a single-stranded oligonucleotide (negative strand) that is in a free state into the reaction system (additional previous step), and
  • Step C 1 The DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, the single-stranded oligonucleotide (negative strand) is used as a primer, and the primer is extended once, thereby Step C, which includes Step C 2 for extending DNA in a double-stranded state as double-stranded DNA (this step)
  • An unfolded double-stranded DNA which is an undigested product obtained through the third step and the pre-addition step, is formed without an amethylated CpG pair at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • Step C 1 The DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, the single-stranded oligonucleotide (negative strand) is used as a primer, and the primer is extended once, thereby Step C, which has Step C2 to extend DNA in a double-stranded state as double-stranded DNA (this step)
  • a method for measuring a methylation ratio which further comprises the following two processes.
  • the fifth step of amplifying the DNA of the target DNA region (total amount of methylated DNA and unmethylated DNA) to a detectable amount and quantifying the amount of amplified DNA; as well as,
  • Inventions 1 to 3 wherein the DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site. 9. The method according to any one of 9.
  • Digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme for masking consisting of a single-stranded DNA (positive chain) containing the target DNA region and a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme
  • the first (A) step for producing a single-stranded DNA in which the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme is protected by mixing with an oligonucleotide, and the one selected in the first (A) step The method according to any one of Inventions 1 to 11, which is a digestion treatment comprising the first step (B) of digesting a double-stranded DNA with a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme having a recognition cleavage site in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological sample.
  • a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological specimen A method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological specimen
  • the process has a process (pre-process) for once separating the stretched double-stranded DNA obtained in the third process into a single-stranded state.
  • Step A 1 for selecting the DNA in the single-stranded state by base pairing the generated single-stranded DNA (positive strand) with the forward primer (negative strand).
  • a DNA in the single-stranded state selected in Step A 1 is in a saddle shape, and the primer for the forward direction is used as an extension primer, and the primer is extended once, thereby being in the single-stranded state.
  • a step A (this step) having a step A2 for extending the DNA as double-stranded DNA; and
  • each step of the fourth step is repeated in the target DNA region by repeating the elongated double-stranded DNA obtained in each step and separating it into a single-stranded state.
  • the single-stranded immobilized oligonucleotide is a single-stranded immobilized oligonucleotide in which the 5 or 3 ′ end is immobilized.
  • the single-stranded DNA positive strand
  • the target DNA region is not included.
  • the method according to invention 15 or 16 wherein base pairing is carried out in a reaction system containing a divalent cation when base-pairing with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a complementary base sequence.
  • a method for measuring a methylation ratio which further comprises the following two steps as the steps of the method according to the invention 15 or 16.
  • Invention 15 wherein the DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of genomic DNA as a recognition cleavage site. Or the method according to 16.
  • a digestion treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme consists of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the method according to the invention 15 or 16 which is a digestion treatment comprising the step (B) of digesting the strand DNA with a methylation sensitive restriction enzyme.
  • methylation sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme having a recognition cleavage site in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological specimen.
  • FIG 1 shows that, in the examples, the prepared samples are labeled “A (no treatment)” and “B (fo treatment)”.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis of 2% agarose gel on the amplified product.
  • the “biological specimen” in the present invention for example, a cell lysate, a tissue lysate (herein, tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.) or in mammals, Biological samples such as body fluids such as plasma, serum and lymph, body secretions (urine, milk, etc.) and genomic DNA obtained by extraction from these biological samples can be mentioned.
  • the biological specimen may contain, for example, a microorganism or a virus. Therefore, the “genomic DNA” in the present invention includes not only the genomic DNA of the biological specimen itself but also the genomic DNA of microorganisms and viruses contained in the biological specimen. Baby When the sample derived from a milk animal is blood, the use of the present invention in a periodic health examination or a simple test can be expected.
  • DNA may be extracted using a commercially available DNA extraction kit.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a normal method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (derived from cancer cells such as stomach cancer cells) Analysis of cancer cells such as gastric cancer cells, avoiding blood cell-derived DNA, and detecting cancer cells such as gastric cancer cells and tissues containing them Sensitivity can be improved.
  • the genomic DNA-derived DNA sample may be a DNA sample that has been purified in advance by a predetermined method. Normally, there are four types of bases that make up a gene (genomic DNA). Among these bases, it is known that only cytosine is methylated. Such DNA methylation modification is based on the nucleotide sequence shown by 5, -CG-3 '(C represents cytosine). , G represents guanine.Hereafter, the base sequence may be written as “CpG”.) It is limited to cytosine. The site that is methylated in cytosine is position 5.
  • methylated DNA in the present invention means DNA produced by such methyli modification.
  • the “CpG pair” in the present invention means a double-stranded oligonucleotide formed by base pairing of a base sequence represented by CpG and a complementary CpG.
  • the “target DNA region” in the present invention (hereinafter sometimes referred to as a target region) is a DNA region to be examined for the presence or absence of methylation of cytosine contained in the region. And at least one recognition site for a methylation sensitive restriction enzyme. For example, Lysy 1 oxidase ⁇ HRAS-like suppressor N bA305P22. 2.
  • the nucleotide sequence comprising two or more include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the Lysyl oxidase gene derived from human and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 16001 to 18661 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AF270645).
  • the ATG codon that encodes the amino terminal methionine of Lysyl oxidase protein derived from human is represented by nucleotide numbers 2031 to 2033.
  • the nucleotide sequence of the above exon 1 is represented by nucleotide number 1957-2661.
  • the cytosine in G exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, base numbers 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661, Cite cytosine such as 1682, 1686, 16 96, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795 etc. Can do.
  • the useful protein gene is an HRAS-like suppressor gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the HRAS-like suppressor gene derived from human and a promoter region located 5 'upstream thereof can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 172001 to 173953 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC068162) can be mentioned. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence of exon 1 of the human-derived HRAS-like suppress or gene is represented by base numbers 1743-1953.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, base numbers 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 1405, 1409, 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449, 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1479, 1483, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 1513, 1518, 1520
  • the cytosine indicated by etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is bA305P22.2.1 gene
  • it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing at least one base sequence is a genomic DNA base sequence containing exon 1 of human-derived bA305P22.2.1 gene and its 5, promoter region located upstream. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 13001 to 13889 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL121673) can be mentioned. Sequence number In the nucleotide sequence shown in Fig.
  • the ATG codon that encodes the methionine at the amino terminal of the human-derived bA305P22.2.1 protein is shown in nucleotide numbers 849 to 851, and the nucleotide sequence of exon 1 is It is shown in base numbers 663-889.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, base numbers 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427 , 446, 465, 472, 486, and the like.
  • the useful protein gene is a Gamma filamin gene
  • it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • Examples of the base sequence including one or more base sequences include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the Gamma filamin gene derived from human and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 63528 to 64390 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC074373) can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the Gamma filamin protein derived from human is shown in base numbers 572 to 574.
  • the base sequence of exon 1 is Base numbers 463 to 863.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, base numbers 329, 333, 337, 350, 353, 360, 363, 370, 379, 382, 384, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 505
  • the cytosine shown by etc. can be mention
  • the useful protein gene is a HAND1 gene
  • Examples of the base sequence containing one or more include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the HAND1 gene derived from human and the promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, And a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (corresponding to a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 243 03 to 26500 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026688).
  • the ATG codon encoding the amino acid at the amino terminal of the HAND1 protein derived from human is represented by nucleotide numbers 1656 to 1658, and the nucleotide sequence of exon 1 is Base numbers 1400 to 2198 are shown.
  • the cytosine for example, shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methyline frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, the base numbers 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, 1272, Examples include cytosine represented by 1292, 1305, 1307, 1.3 16, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434, and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is the Homologue of RIKEN 2210016F16 gene, it is represented by CG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences should be the genomic DNA sequence that contains exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene, its 5, promoter region located upstream. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 (the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 157056 to 159000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AL354733) It corresponds to the complementary base sequence of the column. ).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene is represented by nucleotide numbers 1392 to 1945.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methyline frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, the base numbers 1172, 1175, 1180, 1183, 1189, 1204, 1209, 1267, 1271, Examples include 1278, 1281, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378, 1392, 1402, 1433, 1436, 1438, and the like.
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is Examples of the nucleotide sequence containing one or more include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the FLJ32130 gene derived from human and its 5, promoter region located upstream. More specifically, And a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (corresponding to a complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 2379 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC002310).
  • the ATG codon encoding the methionine at the amino acid end of the FLJ32130 protein derived from human is represented by nucleotide numbers 2136 to 2138, and the nucleotide sequence considered to be exon 1 is Base numbers 2136 to 2379 are shown.
  • Cytosine in pG shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, base numbers 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1795, 1814, 1894 , 1911, 19
  • the cytosine shown by 15, 1925, 1940, 1955, 1968 etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is a PPARG angiopoietin-related protein gene
  • the C p present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences indicated by G is the nucleotide sequence of genomic DNA containing human-derived PPARG angiopoietin-related protein gene etason 1 and the 5 'upstream promoter region. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino acid methionine at the amino terminal of the human-derived PPARG angiopoietin-related protein protein is represented by the base numbers 717 to 719.
  • the base sequence of the 5 ′ side part is shown in base numbers 1957 to 2661.
  • the cytosine in the middle shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, 'base numbers 35, 43, 51, 54, 75, 85, 107, 127, 129 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251, 258, and the like.
  • the useful protein gene is a Thrombomodulin gene
  • the nucleotide sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of a Thrombomodulin gene derived from human and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned.
  • a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (corresponding to a base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471).
  • SEQ ID NO: 9 the amino terminus of human-derived Thrombomodulin protein
  • the ATG codon that encodes the end methionine is shown in nucleotide numbers 2590 to 2592
  • the base sequence of exon 1 is shown in nucleotide numbers 2048 to 6096.
  • the cytosine in G exhibits a high methylation frequency (ie, hyperraethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, the base numbers 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, 1598, 1601 1621, 1632, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, 1698, 1710, 1724, 1726, 1756, and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is p53-responsive gene 2 gene, it is indicated by CG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • Examples of the base sequence containing one or more base sequences include the genomic DNA base sequence containing exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene and its 5, promoter region located upstream. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 113501 to 116000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009471). Can be given. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, the base sequence of exon 1 of the human-derived p53-responsive gene 2 gene is represented by base numbers 1558 to 1808.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is high in, for example, cancer cells such as knee cancer cells], methylation frequency (ie, high methyl Indicates hypermethylation). More specifically, as cytosine having a high methyl baboon frequency in popliteal cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, 1351 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 and the like.
  • Fibrillin gene Is a base sequence containing one or more base sequences represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, non-translation region or translation region (coding region) of the fibrillin gene derived from human.
  • the base sequence of genomic DNA containing 1 and 5 and its upstream promoter region can be raised.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (Genbank Accession No. AC113387) It corresponds to a complementary sequence of the base sequence indicated by base numbers 118801 to 121000 of the base sequence described.
  • the base sequence of exon 1 of Fibrillin 2 gene derived from human is represented by base numbers 1091 to 1345.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 is, for example, a high methylation frequency (ie, hypermethylati (hypermethylati) in cancer cells such as spleen cancer cells). on)). More specifically, cytosine having a high methylation frequency in the spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, the base numbers 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843, and the like.
  • the useful protein gene is a Neurofilaments gene
  • the base represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence including one or more sequences include the genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of the neurofilaments gene derived from human and its five promoter region located upstream.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 28001 to 30000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AF106564) can be used. .
  • nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilaments gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694.
  • cytosine in the nucleotide sequence represented by C p G present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 2 has a high methylation frequency (that is, ⁇ methylation state ( hypermethylation)).
  • cytosine having a high methylation frequency in a spleen cancer cell includes, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 5 44, 546, 563, 566, 572, 580, etc. Can do.
  • C p present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) Contains one or more base sequences indicated by G 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 J can include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the disintegrin and metalloproteinase doma in 23 gene derived from baboon and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 (corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 21001 to 23300 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009225).
  • nucleotide sequence of exon 1 of the disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene derived from baboon is shown in nucleotide numbers 1194 to 1630 in the base sequence IJ represented by SEQ ID NO: 13.
  • cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in cancer cells such as spleen cancer cells).
  • cytosine with high methylation frequency in knee cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, the base numbers 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026, 1028, 1031, 1035, 1041, 1043, 1045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1093, 1096, 1106, 11 12, 1120, 1124, 1126 etc. I can give you.
  • the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more base sequences shown in is a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 (the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 75001 to 78000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009800) Equivalent to. ). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, the base sequence of exon 1 of the G protein-coupled receptor 7 gene derived from human is represented by base numbers 1666 to 2652.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 is, for example, a high methylation frequency (ie, hypermethylated state) in cancer cells such as presumptive cancer cells. (Hypermethylation)). More specifically, cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 in the base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, 1560 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 and the like.
  • a useful protein gene is a G-protein coupled somatostatin and angiotensin—like peptide receptor interferon 3 ⁇ 4 :, a promoter region, a promoter region, an untranslated region or a translated region ( As a base sequence including one or more base sequences represented by CG existing in the base sequence of the coding region), human G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor gene exon 1 and its 5, the nucleotide sequence of genomic DNA containing an upstream promoter region can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 (described in Genbank Accession No.
  • ⁇ cytosine with high methylation frequency in cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 in the base number 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, 514,
  • the cytosine shown by 522, 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 etc. can be mentioned.
  • a useful protein gene is Solute carrier family 6 neurotranslator transporter noradrenalin member 2
  • a base sequence containing one or more base sequences represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is a human-derived base sequence.
  • Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 Regression 1 The base sequence of genomic DNA containing 5 children, exon 1 and its 5 upstream promoter region. And a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 (corresponding to a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 78801 to 81000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026802). Base ⁇ shown in SEQ ID NO: 16 1 In J, the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene is represented by nucleotide numbers 1479 to 1804.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by C p G present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 is highly methylated (ie, hypermethylated in a cancer cell such as a premature cancer cell). )) More specifically, as cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, the base numbers 1002, 1010, 1019, 1021, 1051, 1056, 1061, Examples include cytosine represented by 1063, 1080, 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184, and the like.
  • “(amplified methylated DNA in the target DNA region to a detectable amount) and the amount of amplified DNA” refers to the genome contained in the biological specimen. This means the amount of methylated DNA in the target region in DNA after amplification itself, that is, the amount determined in the fourth step of the present invention. For example, when the biological specimen is 1 mL of serum, it means the amount of DNA amplified based on the methylated DNA contained in 1 mL of serum.
  • the “methylation ratio” means the genomic DNA contained in a biological specimen.
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is digested with a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • “Methylation-sensitive restriction enzyme” means, for example, a restriction enzyme that does not digest a recognition sequence containing methylated cytosine but can only digest a recognition sequence containing cytosine that is not methylated. . That is, in the case of DNA in which cytosine contained in a recognition sequence that can be originally recognized by a methylation-sensitive restriction enzyme is methylated, even if the methylation-sensitive restriction enzyme is allowed to act on the DNA, the D NA is not cut. On the other hand, in the case where the cytosine contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme is not methylated, the methylation-sensitive restriction enzyme can be allowed to act on the DNA.
  • the DNA is cleaved.
  • a methylation sensitive enzyme include HpaII, BstUI, Narl, SacII, Hhal and the like.
  • the methylation sensitive restriction enzyme has already been clarified by Gruenbaum et al. (Nucleic Acid Research, 9, 2509-2515).
  • a primer pair capable of amplifying the DNA containing the cytosine to be analyzed as a recognition sequence is used.
  • performing PCR to examine the presence or absence of DNA amplification (amplified product).
  • an amplification product is obtained.
  • the ratio of cytosine to be analyzed can be measured. That is, if the genomic DNA contained in the biological specimen is methylated, the methylation sensitive restriction enzyme is contained in the biological specimen by utilizing the property that it does not cleave the methylated DNA. Susceptibility to methylation in genomic DNA It is possible to distinguish whether cytosine in the CpG pair existing in the restriction enzyme recognition site was methylated or not.
  • the restriction on the genomic DNA contained in the biological sample is performed. If cytosine in at least one CpG pair present in the enzyme recognition site is not methylated, PCR amplification products will not be obtained, but they will be contained in biological samples. If cytosine in all C p G pairs existing in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme in genomic DNA has been methylated, PCR amplification products can be obtained.
  • the genomic DNA contained in the biological specimen is genomic DNA derived from a mammal
  • the first step may be performed as follows. Optimal 10X buffer (330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM K0Ac, lOOmM for mammalian genomic DNA
  • a digestion treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme consists of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the methylation sensitivity by mixing with nucleotides. Digestion of the single-stranded DNA selected in the first (A) step and the first (A) step with a methyl enzyme-sensitive restriction enzyme to produce a single-stranded DNA in which the recognition site of the sex restriction enzyme is protected It may be a digestion process comprising the first step (B).
  • the “masking oligonucleotide” is an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme and contained in the target DNA region in single-stranded DNA. Complementary base pairing with at least one (or all) of the recognition sequences of methylation-sensitive restriction enzymes in several locations forms a duplex (ie, the two locations are duplicated). In a single-stranded state, the methylation-sensitive restriction enzyme based only on double-stranded DNA can be digested with the above site, and when the sample is single-stranded DNA, single-stranded DNA is used.
  • Digestible methyl babies sensitive restriction enzyme Metal methyl babies sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA can also digest double-stranded DNA, and its digestion efficiency is higher for double-stranded DNA than for single-stranded DNA
  • Oligonucleotide for improving the digestion efficiency of the site, and a double strand of a single-stranded DNA containing the target region of DN A and a single-stranded immobilized oligonucleotide An oligonucleotide that does not inhibit strand formation.
  • the masking oligonucleotide is an oligonucleotide that cannot be used for the reaction of extending the extension primer using the reverse primer (positive strand) described later as an extension primer and the masking oligonucleotide (negative strand) as a saddle type.
  • the base length is preferably 8 to 200 bases.
  • One or more masking oligonucleotides may be mixed with genomic DNA-derived DNA trials. When multiple types are used, many of the recognition sites for the methylation-sensitive restriction enzyme of single-stranded DNA containing the target DNA region become double-stranded, and the methylation-sensitive restriction enzyme DNA described later Can be minimized.
  • the masking oligonucleotide is digested if it is not methylated but not methylated among the recognition sequences of methylation-sensitive restriction enzymes in several locations contained in the target DNA region. It is particularly useful to design and use according to the desired location (for example, 100% methylated in patients with disease and 100% methylated in healthy subjects).
  • DNA fragmentation As a concern in the digestion treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme in the first step, there is a possibility that a recognition sequence containing cytosine that has not been methylated cannot be completely digested (so-called “DNA fragmentation”). . When such a concern becomes a problem, if there are many recognition sites for the methylation-sensitive restriction enzyme, “DNA fragmentation” can be minimized. It has one or more recognition sites for methylation-sensitive restriction enzymes, and the more recognition sites, the better. In the present invention or the method for measuring a methylation ratio described later, “a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen” force. One preferred embodiment is that it is a treated DNA sample.
  • digestion treatment is performed by directly using a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site for genomic DNA-derived DNA samples contained in biological samples. May be implemented.
  • a general restriction enzyme treatment method may be used as a digestion method with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site.
  • This method is useful for eliminating the “DNA residue” as described above.
  • a method for digesting a sample derived from genomic DNA contained in a biological sample with a methylation-sensitive restriction enzyme the same method as described above may be used when the biological sample is genomic DNA itself.
  • methylation sensitivity of a large excess of methylation sensitive restriction enzyme for example, 500 times (10U) or more of 25 ng of DNA Perform digestion with sensitive restriction enzymes Just do it.
  • Genomic DNA basically exists as double-stranded DNA.
  • methylation-sensitive restriction enzymes that can digest single strands (eg, Hhal), but also methylation-sensitive restriction enzymes that can digest double-stranded DNA (eg, Hpall, BstUI, Narl). s SacII, Hhal, etc.) can be used.
  • a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region is obtained from the digested DNA sample obtained in the first step, and the single-stranded DNA (positive strand) is obtained.
  • Single-stranded immobilized oligonucleotide is a part of the 3 ′ end of single-stranded DN A (positive strand) containing the target DN A region (not including the target DN A region). ) Is a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence that is complementary to the above (hereinafter also referred to as the present immobilized oligonucleotide).
  • This immobilized oligonucleotide is used to select single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region from a DNA DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen.
  • This fixed oligonucleotide is preferably 5 to 50 bases in length.
  • the 5 ′ terminal side of this immobilized oligonucleotide can be immobilized with the carrier, while the 3 ′ terminal side thereof is changed from the 5 ′ terminal to the 3 ′ terminal by the third step and step A 2 described later. It may be in a free state so as to allow a single extension reaction that proceeds once.
  • the present immobilized oligonucleotide may be immobilized with a carrier at the 5 ′ or 3 ′ end. “What can be immobilized on a carrier” means a single-stranded DN containing the target DNA region.
  • the immobilized oligonucleotide is immobilized on a carrier when A (positive strand) is selected.
  • A positive strand
  • the immobilized oligonucleotide even if it is immobilized by binding of the present immobilized oligonucleotide and carrier
  • an oligonucleotide having a base sequence (hereinafter sometimes referred to as the present oligonucleotide) may be immobilized on a carrier according to a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit / device. (Binding to solid phase).
  • the resulting biotinylated oligonucleotide is coated with streptavidin (eg, a streptavidin-coated PCR tube, streptavidin-coated).
  • streptavidin eg, a streptavidin-coated PCR tube, streptavidin-coated.
  • magnetic beads For example, magnetic beads
  • a molecule having an active functional group such as an amino group, an aldehyde group, or a thiol group was covalently bonded to the 5, terminal side of the oligonucleotide, and then the surface was activated with a silane cutting agent or the like.
  • a method of covalently bonding to a support made of glass, silica or heat-resistant plastic through a spacer such as five triglycerides connected in series, a cross-linker or the like is also included.
  • the immobilized oligonucleotide is a piotinylated oligonucleotide
  • a DNA sample derived from a genomic DNA contained in a biological specimen is subjected to base pairing between a buffering buffer and biotinylated oligonucleotide (the single-stranded DNA (positive strand) and this immobilized oligonucleotide). Thereafter, the mixture is obtained by adding the present immobilized oligonucleotide and the carrier, so that the mixture is freed at this stage). The resulting mixture is then double-stranded DNA containing the target DNA region present in the genomic DNA-derived DNA sample contained in the biological specimen.
  • the base pairing between the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and the piotinylated oligonucleotide is referred to as biotinylated oligonucleotide.
  • This is performed prior to fixation with the streptavidin-coated support, but this order does not matter. That is, for example, by adding a DNA sample derived from a genomic DNA contained in a biological specimen to a pyotinylated oligonucleotide immobilized on a support coated with streptavidin, a mixture is obtained.
  • This operation is important in order to remove unfixed DNA or DNA floating in a solution digested with the restriction enzymes described below from the reaction solution. If these operations are insufficient, the DNA suspended in the reaction solution will be in the shape of a bowl, and an unexpected amplification product will be obtained in the amplification reaction. In order to avoid non-specific binding between the support and DNA in biological samples, a large amount of DNA having a completely different base sequence from the target region (eg, rat DNA in the case of human biological samples) To the biological specimen and perform the above operation.
  • the target region eg, rat DNA in the case of human biological samples
  • a single-stranded DN A (positive strand) containing the target DN A region and a part of the 3 ′ end of the single-stranded DN A (provided that the target DN A
  • the base pairing is performed with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence that is complementary to the base sequence in a reaction system containing a divalent cation.
  • the divalent cation is a magnesium ion.
  • the “reaction system containing a divalent cation” refers to an annealing buffer used for base pairing the single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide. It means the reaction system such as those containing a divalent cation, specifically, for example, magnesite Information & Technology-ion components and salts (e.g., M g OA c 2, MgC l 2 , etc.) 1 mM ⁇ 60 OmM It is better to be included at a concentration of In the third step, the single-stranded DNA selected in the second step is used as a saddle shape, the single-stranded immobilized oligonucleotide is used as a primer, and the primer is extended once, whereby the single-stranded DNA is doubled.
  • magnesite Information & Technology-ion components and salts e.g., M g OA c 2, MgC l 2 , etc.
  • an extension reaction may be performed using DNA polymerase.
  • the third step may be performed as follows.
  • the single-stranded DNA containing the target DNA region selected in the second step is sterilized with ultrapure water (17.85 / L), optimal 10 X buffer (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3, 500 mM) KC1, 15 mM MgCl 2 ) 3 ⁇ l 2 mM dNTP 3 ⁇ re 5 Betaine is added, then AmpliTaq (1 type of DNA polymerase 5 U / i L) is added to the mixture in a volume of 0.15 ⁇ L. Incubate for 2 hours at 37 ° C. Thereafter, the incubated solution is removed by pipetting or decantation, and then the TE buffer is added in an amount approximately equal to the volume of the biological specimen, and the TE buffer is removed by pipetting or decanting.
  • optimal 10 X buffer (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3, 500 mM) KC1, 15 mM MgCl 2 ) 3 ⁇ l 2 mM dNTP 3 ⁇ re
  • TE buffer that is approximately equal to the volume of the biological sample.
  • the TE puffer can be removed by pipetting or decanting.
  • magnetic beads coated with streptavidin after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decantation, and then add TE buffer equivalent to the volume of the biological specimen. Add and then remove the TE buffer by pipetting or decanting. Subsequently, the remaining solution is removed and washed (DNA purification) by performing such an operation several times.
  • the third step has a step of separating the single-stranded DNA selected in the second step from the immobilized oligonucleotide and temporarily separating it into a single-stranded state, and is a single-stranded state generated.
  • a step of separating the single-stranded DNA selected in the second step from the immobilized oligonucleotide and temporarily separating it into a single-stranded state, and is a single-stranded state generated.
  • DNA (positive strand) as a mirror type
  • the optimum 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KC1, 15mM MgC12) to a 3 mu Les 2 mM dNTPs and 3 ⁇ Les 5 ⁇ betaine Chikara ⁇ E, then to the mixture
  • AmpliTaq (1 type of DNA polymerase: 5 U / ⁇ L) to the surface, add sterile ultrapure water to make the volume 30 ⁇ , and incubate at 37 ° C for 2 hours.
  • the third step may be performed independently of the fourth step, or may be performed continuously with the PCR reaction performed in the fourth step.
  • the stretched double-stranded DNA obtained in the third step (not including the methylated C pG pair at the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme)
  • a process of separating the elongated double-stranded DNA) into a single-stranded state (previous process), and as this process
  • the single-stranded DNA is selected by base pairing the generated single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide (negative strand).
  • a step A (this step) having a step A 2 to extend and form the single-stranded DN A as a double-stranded DN A, and
  • an extended double-stranded DNA that is an undigested product obtained in the third step (the methylation at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme) is performed.
  • the stretched double-stranded DNA that does not contain the CpG pair in the state is once separated into a single-stranded state.
  • an unfolded double-stranded DNA that is an undigested product obtained in the third step an extension that does not contain the CpG pair in the methylation sensitive restriction enzyme recognition site.
  • Add the aeration buffer to the double-stranded DNA to obtain a mixture.
  • the resulting mixture is then heated at 95 ° C. for several minutes.
  • the single-stranded immobilized oligonucleotide (negative strand) Tm value is about 10 to 20 ° C lower! /, Cool quickly to temperature, and keep at that temperature for several minutes.
  • the DNA in the single-stranded state selected in (i) above is used as a saddle type, the single-stranded immobilized oligonucleotide is used as a primer, and the primer is extended once, thereby the single-stranded state
  • This DNA is elongated to form double-stranded DNA (ie, step A2 in step A).
  • it may be carried out in accordance with the following description or the operation method in the extension reaction in the second step of the present invention described above.
  • each step of the fourth step is repeated after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state (for example, step A).
  • step B the methylated DNA in the target DNA region is amplified to a detectable amount, and the amount of amplified DNA is quantified.
  • a target DNA region ie, a target region
  • PCR a method for amplifying a target DNA region after digestion with a methylation sensitive restriction enzyme.
  • an immobilized oligonucleotide can be used as a primer on one side, so that only the other primer is added and PCR is performed to obtain an amplification product. It will be fixed. In this case, if a primer previously labeled with fluorescence or the like is used and the label is used as an index, the presence or absence of an amplification product can be evaluated without performing a cumbersome operation such as electrophoresis.
  • the PCR reaction solution for example, the DNA obtained in the third step of the present invention was added with 0.15 1 of a 50 ⁇ primer solution, 2.5 mM of 2 NTP dNTPs, 10 ⁇ buffer solution (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3).
  • the reaction may be carried out by adding an appropriate amount of betaine, DMSO, etc. at times.
  • the above reaction solution is kept at 95 ° C. for 10 minutes, then at 95 ° C. for 30 seconds, then at 55 to 65 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 30 seconds.
  • One condition is that the temperature is maintained for 30 to 40 cycles.
  • the resulting amplified product is detected. For example, if a pre-labeled primer is used, the same washing and purification procedure as before is used. After implementation, the amount of fluorescent label immobilized can be measured.
  • PCR when PCR is performed using a normal unlabeled primer, detection is performed by annealing the colloidal gold particles, probes labeled with fluorescence, etc., and measuring the amount of the probe bound to the target region. can do.
  • real-time PCR may be used to obtain the amount of amplification product with higher accuracy.
  • Real-time PCR is a method of monitoring PCR in real time and analyzing the obtained motor results by force kinetics. For example, high-precision quantification that can detect even a slight difference of about twice the gene amount. This method is known as the PCR method.
  • Examples of the real-time PCR method include a method using a probe such as a saddle type-dependent nucleic acid polymerase probe, and a method using an intercalator such as Cyber Green. Commercially available equipment and kits for real-time PCR may be used.
  • the detection is not particularly limited, and can be detected by any known method. In these methods, operations up to detection can be performed without changing the reaction vessel.
  • a biotinylated oligonucleotide having the same base sequence as the immobilized oligonucleotide is used as a primer on one side, or a new biotinylated oligonucleotide is designed on the 3 'end side from the immobilized oligonucleotide and used as a primer on one side.
  • the complementary region can be used to amplify the target region.
  • the amplification product obtained is fixed if there is a support coated with streptavidin. For example, when PCR is performed in a streptavidin-coated PCR tube, it is fixed in the tube. Therefore, as described above, amplification products can be easily detected by using labeled primers.
  • the solution containing the amplification product obtained by PCR is transferred to a container where the streptavidin-coated support is present, and the amplification product is immobilized.
  • the detection may be performed as described above.
  • the complementary primer that amplifies the target region must be a primer that can amplify a target region that has one or more methylation-sensitive restriction enzyme recognition sites and does not include that recognition site. The reason for this is as follows.
  • the target region may be amplified by PCR after annealing with the base.
  • a part of the 3 ′ end of the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region (provided that the target DN A It does not include the region.) It additionally has a step of adding a single-stranded oligonucleotide (negative strand) having a base sequence complementary to) to the reaction system (pre-addition step). Including such variants.
  • Each of the fourth steps of the present invention further includes the following one step.
  • step C1 Base pairing the generated single-stranded DNA (positive strand) with the single-stranded oligonucleotide (negative strand) added to the reaction system in the previous step above. And step C1 for selecting the DNA in the single-stranded state,
  • Step C 1 The single-stranded DNA selected in Step C 1 is used as a saddle, the single-stranded oligonucleotide (negative strand) is used as a primer, and the primer is extended once.
  • Step C 2 which includes the step C 2 for extending the single-stranded DNA as a double-stranded DNA to the C 2 step (this step)
  • a step of adding a single-stranded oligonucleotide (negative strand) that is in a free state into the reaction system pre-addition step
  • the resulting undigested double-stranded DNA that is formed by extension double-stranded DNA that is formed by extension that does not contain the CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the method further comprises the following one step (hereinafter sometimes referred to as the present methylation ratio measuring method).
  • Step C 1 The DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, the single-stranded oligonucleotide (negative strand) is used as a primer, and the primer is extended once, thereby Step C, which has Step C2 to extend DNA in a double-stranded state as double-stranded DNA (this step)
  • Step C which has Step C2 to extend DNA in a double-stranded state as double-stranded DNA
  • a single-stranded DN containing the above-mentioned target DNA region is used.
  • the single-stranded oligonucleotide (negative strand) added to the reaction system in the pre-addition step is a part of the 3 ′ end of single-stranded DNA (depleted, Does not include the intended DNA area.
  • a 5 ′ end is a single-stranded oligonucleotide in a free state having the same base sequence as that of the single-stranded immobilized oligonucleotide
  • the base sequence may be the same as the single-stranded immobilized oligonucleotide, or may be a short base sequence, or a long sequence.
  • the reverse primer positive strand
  • the single-stranded oligonucleotide negative strand
  • an extension primer is used.
  • the immobilized oligonucleotide is used as a primer on one side and PCR is performed by adding only the other primer when increasing the target region.
  • PCR is performed by adding only the other primer when increasing the target region.
  • other methods for example, for detecting the target product.
  • PCR may be performed by adding a pair of primers. After performing such PCR, determine the amount of amplified product obtained.
  • the fourth step has repeated steps.
  • the “generated single-stranded DNA (positive strand)” in the first step A 1 means the operation of the first step 4 and the second and subsequent steps. In both operations of the fourth step, this means “generated“ free ”single-stranded DNA (positive strand)”.
  • the generated single-stranded DNA (negative strand) j is defined as both in the first step of the fourth step and in the second and subsequent steps of the fourth step.” This means the “fixed” single-stranded DNA (positive strand) j that is generated, but if the fourth step additionally has a C step, the first step of the fourth step is performed.
  • Step A Means “generated“ fixed ”single-stranded state (DNA) (positive strand)”, while in the second and subsequent rounds of the fourth step, “generated“ fixed ”single-stranded "DNA (positive strand)” in the state and “NA (positive strand) in the generated 'free” single strand state "
  • the “stretched double-stranded DNA” obtained in each step of the fourth step is the same as that in the operation of the first and fourth steps.
  • ⁇ In the recognition site of the methine leihi sensitive restriction enzyme, it means a double-stranded DNAJ formed by extension that does not contain an ammethyl CpG pair.
  • step B in both the first step of the fourth step and the second and subsequent steps of the fourth step, all of the recognition sites for the methyli-sensitive restriction enzyme are in an amethyl state. It means “extended double-stranded DNA that is a C p G pair”.
  • the fourth step further includes a C step.
  • the “generated single-stranded DNA (positive strand)” in the C1 step is the same as the first step of the fourth step. In both the operation and the repetitive operations of the fourth step after the second round, this means “the generated“ free ”single-stranded state of DNA (positive chain)”.
  • the present efforts include a methylation ratio measuring method (that is, the methylation ratio measuring method of the present invention) characterized in that it further includes the following two steps as the steps of the present invention.
  • the present invention (including the modified method) is performed without performing the third step of the present invention (including the modified method). 4), the DNA of the target DNA region (the total amount of methylated DNA and unmethylated DNA) is amplified to a detectable amount, The fifth step of quantifying the amount of amplified DNA;
  • the amount of DNA quantified by the fourth step of the present invention (including the modified method), and The sixth step of calculating the ratio of methylated DNA in the target DNA region based on the difference obtained by comparing with the amount of DNA quantified in the step
  • the methylation ratio measuring method is as follows: It can be used in situations like this.
  • abnormal DNA methylation occurs in various diseases (for example, cancer), and it is considered possible to measure the degree of various diseases by detecting this abnormal DNA methylation.
  • there is a DNA region that is 100% methylated in genomic DNA contained in a biological specimen derived from a disease and if the DNA region is subjected to the present invention or the methylation ratio measurement method of the present invention, the DNA region is measured.
  • the amount of methylated DNA increases.
  • the DNA region that has a low methylation ratio in genomic DNA contained in a biological specimen of a healthy subject and a high methyloi sputum percentage in genomic DNA contained in a biological specimen of a diseased patient.
  • the amount of methylated DNA is close to 0 in the case of a healthy person, while in the case of a patient with a disease. Since the value is significantly higher than that in healthy subjects, the “degree of disease” can be determined based on the difference in this value.
  • the “degree of disease” here is the same as the meaning generally used in the field, and specifically, for example, when the biological specimen is a cell, it means the malignancy of the cell. For example, when the biological specimen is a tissue, it means the abundance of diseased cells in the tissue. Furthermore, when the biological specimen is plasma / serum, it means the probability that the individual has a disease. Therefore, the present invention or the present methylation ratio measuring method makes it possible to diagnose various diseases by examining methylation abnormality. Restrictions that can be used in various methods for measuring the amount of methylated DNA in the target region and measuring the methylation ratio in the present invention or the methyli cocoon ratio measurement method of the present invention Enzymes, primers or probes are useful as reagents in detection kits.
  • the present invention also provides a detection kit containing these restriction enzymes, primers or probes as reagents, and a detection chip in which these primers or probes are immobilized on a carrier.
  • methylation ratio measuring method includes use in the form of a detection chip or a detection chip as described above using the substantial principle of the method.
  • L TE buffer solution was prepared.
  • Group A (untreated group): 10 X buffer solution (330raM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) 5 IL and 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 5 ⁇ L were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 ⁇ L.
  • 10 X buffer solution 330raM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • 10 XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • ⁇ group (digestion treatment group with H pa II): In the oligonucleotide solution prepared above, 12 U of Hpa II and 10 X buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9 optimal for Hpall and HhaI) Add 5 ⁇ L of 660 mM thigh c, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and 5 L of 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterile ultrapure water to the mixture to reduce the volume. 50 L.
  • 10 XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group C Additional oligonucleotide for masking + digestion with Hpa II: In the oligonucleotide solution prepared above, 12 U of Hp all and 10 X buffer (330 mM) optimal for Hp all and H ha I Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol (5), 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 5 ⁇ L, and masking oligo consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 5 pmo 1 of nucleotide MA was added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to adjust the volume to 50 ⁇ L. '
  • Bio_GPR7-2176R 5,-GCACGACGAGTGTGACGATC -3 '(SEQ ID NO: 20) 5 terminal Piotin for each 50 L of each digested solution of the obtained methylated oligonucleotide or unmethylated oligonucleotide 1 / L of labeled oligonucleotide solution was added and heated at 95 ° C for 5 minutes. After that, it was quickly cooled to 50 ° C and kept at that temperature for 5 minutes. Next, this was kept at 37 ° C. for 5 minutes and then returned to room temperature. Next, the mixture prepared as described above was added to a PCR tube coated with streptavidin, and this was further incubated at 37 ° C for 5 minutes.
  • methylation in the target DNA region (GPR 7-20 79-2 1 76, SEQ ID NO: 23, methylated cytosine is also represented by C) is performed. Amplified DNA. > Oligonucleotide primers designed for PCR>
  • PR1 5'-GCACGACGAGTGTGACGATC-3 '(SEQ ID NO: 22) 2009/056782
  • GPR7-2079-2176 5,-GTTGGCCACTGCGGAGTCGCC GGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3 (SEQ ID NO: 23)
  • each of the solutions prepared to be 3 ⁇ of the primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 and the primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 on the vertical DNA was used. Shito, and the each 2 mM dNTPs 5 J uL, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KC1, 15mM MgCl 2, 0.01% Gelatin) and 5, heat resistance DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 511 teeth 0 Then, 10 L of a 5N betaine aqueous solution was mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the liquid volume 50 W L. The reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, and then incubated at 95 ° C for 30 seconds, followed by 59 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 45 seconds for one cycle. PCR was performed under the same conditions.
  • Oligonucleotide of target DNA region (GPR7-2079-2176, methylated cytosine is also represented by C)

Abstract

本発明は、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。

Description

明細書
DNAメチル化測定方法 技術分野
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけ るメチル化された D N Aの含量を測定する方法等に関する。 背景技術
生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域における DN Aの メチルイ匕状態を評価するための方法としては、 例えば、 ゲノム DNA中の目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aの含量を測定する方法がある （例えば、 Nu cleic Acids Res. 1994 Aug 11 ;22 (15) :2990- 7、 及び Proc Natl Acad Sci U S A. 1 997 Mar 18 ;94 (6) :2284- 9参照） 。 当該測定方法では、 まず、 ゲノム DNA由来の D N A試料から、 目的とする DN A領域を含む DNAを抽出する必要があり、 抽出操作 が煩雑である。
また、 抽出された DNAの目的領域におけるメチル化された D N Aの含量を測定す る方法としては、 例えば、 （1) 亜硫酸塩等を用いて当該 DNAを修飾した後、 DN Aポリメラーゼによる DNA合成の連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction；以下、 PCRと記すこともある。 ） に供することにより目的領域を増幅する方法、 （2) メ チル化感受性制限酵素を用いて当該 DN Aを消化した後、 PCRに供することにより 、 目的領域を増幅する方法等が知られている。 これらのいずれの方法とも、 メチル化 の検出のための DNAの修飾及びその後の生成物の精製、 P C Rのための反応系の調 製、 DN Aの増幅の確認等に手間を要する。 発明の開示
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DN A領域におけ るメチル化された D N Aの含量を簡便に測定する方法等を提供することを目的とする 即ち、 本発明は、 以下のような発明を提供するものである。 [発明 1 ]
生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域におけるメチル化 された D N Aの含量を測定する方法であって、
( 1 ) 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料をメチル化感受性制限 酵素による消化処理を行う第一工程、
(2) 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料から目的とする DN A領域 を含む一本鎖 DN A (正鎖） を取得し、 該一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNA の 3， 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DN A領域を含まない。 ） に対して相補 性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させること により、 前記一本鎖 DN Aを選択する第二工程、
(3) 第二工程で選択された一本鎖 DNAを铸型として、 前記一本鎖固定化オリゴヌ クレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより、 前記一 本鎖 DNAを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる第三工程、 及び、
(4) 下記の各本工程の前工程として、 第三工程で得られた伸長形成された二本鎖 D N Aを一本鎖状態に一旦分離する工程 （前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオ チド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である DN Aを選択す る第 A1工程と、
第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを鎳型として、 前記一本鎖固定化 オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより 、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 A 2工程と、 を有する第 A工程 （本工程） と、
(b) ,生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を鍀型として、 前記一本鎖状態であ る DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記目 的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配列 （負鎖） の 3 ' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） に対して相補性のある塩 基配列 （正鎖） を有するプライマー （リバース用プライマー） を伸長プライマーとし て、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記一本鎖; ^態である DNAを' 二本鎖 DN Aとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
更に前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N Aを一本鎖状態にー且分離 した後、 操り返すことにより、 前記目的とする DNA領域におけるメチルイ匕された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの量を定量する第四工程、 を有することを特徴とする方法。
[発明 2]
第二工程において目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DN A領域を含まない。 ) に対して 相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させる 際に、 二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させる発明 1に記載の方法。
[発明 3]
二価陽イオンがマグネシウムイオンである発明 2に記載の方法。
[発明 4]
第四工程の前工程の前に、
前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DN A領域を含まない。 ) に対して相補性のある塩基配列を有し且つ 遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加 前工程） を追加的に有し、 且つ、
第四工程の各本工程として、 下記の 1つの工程を更に追加的に有する方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記追加前工程で反応系 内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である D N Aを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記一本鎖 オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 C 2 工程とを有する第 C工程 （本工程）
[発明 5]
第四工程の前工程の後に、 前記目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性のある塩基配列を有し且つ 遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加 前工程） を追加的に有し、 且つ、
第三工程及び前記追加前工程を経て得られた未消化物である伸長形成された二本鎖 DNA (前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含ま ない伸長形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程 ) を有し、 且つ、
第四工程の各本工程として、 下記の 1つの工程を更に追加的に有する方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記追加前工程で反応系 内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である D N Aを選択する第 C 1工程と、
( i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記一本鎖 オリゴヌクレオチド (負鎖) をプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 C 2 工程とを有する第 C工程 (本工程)
[発明 6]
発明 1〜5のいずれか一に記載の方法の工程として、 下記の 2つの工程を更に追加 的に有するメチル化割合の測定方法。
(5) 発明 1〜5のいずれか一に記載の方法の第一工程を行うことなく、 発明 1〜5 のいずれか一に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、 前記目 的とする DNA領域の DNA (メチル化された DN A及びメチルされていない DN A の総量） を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する第五ェ 程、 及び、
(6) 発明 1〜5のいずれか一に記載の第四工程により定量された DNAの量と、 第 五工程により定量された DNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前 記目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aの割合を算出する第六工程 [発明 7] 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿である発明 1〜 6のいずれか一に記載の 方法。
[発明 8]
生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液である発明 1〜 6のいずれか一に記載の 方法。
[発明 9]
生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液である発明 1〜 6のいずれか一に記載 の方法。
[発明 10]
生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 該ゲノム DNAが有す る目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DN A試料である発明 1〜 9のいずれか一に記載の方法。
[発明 1 1 ]
生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製されてなる D N A試料である発明 1〜 10のいずれか一に記載の方法。
[発明 12]
メチル化感受性制限酵素による消化処理が、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列 からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、 該メチル化感受 性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DNAを生成させる第一 （A) 工程と 、 第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理す る第一 （B) 工程とからなる消化処理である発明 1〜1 1のいずれか一に記載の方法
[発明 13]
メチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目的と する DN A領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である発明 1〜12のいずれか 一に記載の方法。
[発明 14] メチル化感受性制限酵素が、 Hpall又は Hhalである発明 1〜 13のいずれか一に記 載の方法。
[発明 1 5]
生物由来検体に含まれるゲノム DN Aが有する目的とする DNA領域におけるメチ ル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
( 1 ) 生物由来検体に含まれるゲノム D N A,由来の D N A試料をメチル化感受性制限 酵素による消化処理を行う第一工程、
(2) 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料から目的とする DN A領域 を含む一本鎖 DN A (正鎖） を取得し、 該一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNA の一部に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを 塩基対合させることにより、 前記の一本鎖 DN Aを選択する第二工程、
( 3 ) 第二工程で選択された一本鎖 D N Aを一本鎖状態に一旦分離する工程を有し、 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） を鎵型として、 前記目的とする DNA領域 の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配列 （負鎖） を有するフォーワード用プライマーを伸長プ ライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより、 前記一本鎖 DNAを二 本鎖 DN Aとして伸長形成させる第三工程、 及び、
(4) 下記各本工程の前工程として、 第三工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN Aを一本鎖状態に一旦分離する工程 （前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記フォーワード用プライマー （ 負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である DNAを選択する第 A 1工程と、 第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを錶型として、 前記フォ 一ワード用プライマーを伸長プライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させること により、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 A 2ェ 程とを有する第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記一本鎖状態であ る DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記目 的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配列 （負鎖） の 3 ' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性のある 塩基配列 （正鎖） を有するリバース用プライマーを伸長プライマーとして、 該伸長プ ライマーを 1回伸長させることにより、 前記一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN A として伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
更に第四工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DNAを 一本鎖状態にー且分離した後、 繰り返すことにより、 前記目的とする DNA領域にお けるメチルイ匕された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの量 を定量する第四工程、
を有することを特徴とする方法。
[発明 16〕
一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが、 5， 或いは 3' 末端が固定化されてなる一本 鎖固定化オリゴヌクレオチドである発明 15に記載の方法。
[発明 1 7]
第二工程において目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DN A領域を含まない。 ) に対して 相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させる 際に、 二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させる発明 15又は 16に記載の 方法。
[発明 18]
発明 15又は 16に記載の方法の工程として、 下記の 2つの工程を更に追加的に有 するメチル化割合の測定方法。
(5) 発明 15又は 16に記載の方法の第一工程を行うことなく、 発明 1〜5のいず れか一に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、 前記目的とす る DNA領域の DNA (メチルイ匕された DNA及ぴメチルされていない DNAの総量 ) を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する第五工程、 及 ぴ、
(6) 発明 15又は 16に記載の第四工程により定量された DNAの量と、 第五工程 により定量された DNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的 とする D N A領域におけるメチル化された D N Aの割合を算出する第六工程
[発明 1 9]
生物由来検体が、 哺轧動物の血清又は血漿である発明 1 5又は 1 6に記載の方法。
[発明 20]
生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液である発明 1 5又は 16に記載の方法。
[発明 21]
生物由来検体が、 細胞溶解液又は,袓織溶解液である発钥 1 5又は 16に記載の方法 [発明 22]
生物由来検体に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料が、 該ゲノム DN Aが有す る目的とする DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DNA試料である発明 15又は 16に記載の方法。
[発明 23]
生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製されてなる D N A試料である発明 15又は 16に記載の方法。
[発明 24] '
メチル化感受性制限酵素による消化処理が、 目的とする D N A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列 からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、 該メチル化感受 性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DN Aを生成させる第一 （A) 工程と 第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する 第一 （B) 工程とからなる消化処理である発明 15又は 16に記載の方法。
[発明 25]
メチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目的と する DNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である発明 1 5又は 16に記載 の方法。
[発明 26] メチルイヒ感受性制限酵素が、 Hpall又は Hhalである発明 1 5又は 1 6に記載の方法
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例において、 調製されたサンプルに、 「A (無処理） 」 、 「B (
Hpall処理） 」 又は 「C (マスキング用オリゴヌクレオチド添加 +HpaII処理） 」 のい ずれかの処理を施し、 配列番号 7で示された塩基配列からなる領域における D N Aを P C Rにて増幅し、 得られた増幅産物を 2 %ァガロースゲル電気泳動した結果を示し た図である。
図中の一番左のレーンから、 Hpallの認識配列がメチル化されているメチル化オリ ゴヌクレオチド GPR7 - 2079- 2176/98mer- M(7) (M) の 「A」 処理が施されたサンプル 、 Hpallの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチ KGPR7- 2079- 2176/98mer - UM (U) の 「A」 処理が施されたサンプル、 Hpallの認識配列がメ チル化されているメチル化ォリゴヌクレオチド GPR7- 2079- 2176/98mer- M(7) (M) の 「B」 処理が施されたサンプル、 Hpallの認識配列がメチル化されていないアンメチ ル化オリゴヌクレオチド GPR7- 2079- 2176/98mer_UM (U) の 「B」 処理が施されたサ ンプル、 Hpallの認識配列がメチル化されているメチル化ォリゴヌクレオチド GPR7 - 2079-2176/98mer-M (7) (M) の 「C」 処理が施されたサンプル、 及び Hpallの認識配 列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7 - 2079 - 2176/98mer- UM (U) の 「C」 処理が施されたサンプルでの結果を示している。 発明を実施するための形態
本発明における 「生物由来検体」 としては、 例えば、 細胞溶解液、 組織溶解液 （こ こでの組織とは、 血液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ） 若しくは、 哺乳動物 においては、 血漿、 血清、 リンパ液等の体液、 体分泌物 （尿や乳汁等） 等の生体試料 及ぴこれら生体試料から抽出して得られたゲノム D N Aを挙げることができる。 前記 生物由来検体は、 例えば、 微生物やウィルスを含んでいる可能性がある。 従って、 本 発明における 「ゲノム D NA」 とは、 生物由来検体自身のゲノム D NAに留まらず、 生物由来検体に含まれる微生物やウィルスのゲノム D N Aをも含んだものである。 哺 乳動物由来の検体が血液である場合には、 定期健康診断や簡便な検査等での本発明の 利用が期待できる。
ゲノム DNAを哺乳動物由来の検体から得るには、 例えば、 市販の DNA抽出用キ ット等を用いて DNAを抽出すればよい。 血液を検体として用いる場合には、 血液か ら通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、 調製された血漿又は血清を検体として 、 その中に含まれる遊離 DNA (胃癌細胞等の癌細胞由来の DNAが含まれる） を分 析すると、 血球由来の D N Aを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来の D N Aを解析するこ とができ、 胃癌細胞等の癌細胞、 それを含む組織等を検出する感度を向上させること ができる。
前記ゲノム DN A由来の DN A試料は、 所定の方法により予め精製されてなる DN A試料であってもよい。 通常、 遺伝子 (ゲノム DNA) を構成する塩基は 4種類である。 これらの塩基のう ち、 シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、 このような DNAの メチル化修飾は、 5， -CG- 3 ' で示される塩基配列 （Cはシトシンを表し、 Gは グァニンを表す。 以下、 当該塩基配列を 「CpG」 と記すこともある。 ） 中のシトシ ンに限られている。 シトシンにおいてメチルイ匕される部位は、 その 5位である。 細胞 分裂に先立つ DNA複製に際して、 複製直後は铸型鎖の 「CpG」 中のシトシンのみ がメチルイ匕された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の 「C pG」 中のシトシンもメチル化される。 従って、 DN Aのメチル化の状態は、 DNA 複製後も、 新しい 2組の DNAにそのまま引き継がれることになる。 本発明における 「メチル化された DNA」 とは、 このようなメチルイ匕修飾により生じた DN Aを意味 するものである。
本発明における 「CpG対」 とは、 CpGで示される塩基配列と、 これに相補する Cp Gが塩基対合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。 本発明における 「目的とする DNA領域」 （以下、 目的領域と記すこともある。 ） は、 当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べようとする DNA領域であつ て、 少なくとも 1種類のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有する。 例えば、 Lysy 1 oxidase^ HRAS - like suppressor N bA305P22. 2. 1、 Gamma filamin、 H細 1、 Homolog ue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein, Thromb omodulin、 p53 -: responsive gene 2、 Fibrillin2 Neurofilament 3、 disintegrin and metal loproteinase domain 23、 G protein-coupled receptor 7、 G - protein couple d somatostatin and angiotensin-like peptide receptor ^ Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrena丄 in member 2等の 用タンノ ク貧退 子 のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に 存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンを一つ以上含む D N Aの領域等を挙 げることができる。 具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が Lysyl oxidase遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来 の Lysyl oxidase遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域 とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番 号 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF270645に記載される塩基配列の 塩基番号 16001〜18661で示される塩基配列に相当する。 ） が挙げられる。 配列番号 1 で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Lysyl oxidaseタンパク質のァミノ末端 のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2031〜2033に示されており、 上記 ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 配列番号 1で示され る塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシ トシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチルイヒ頻度 （即ち、 高メチル 化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル 化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列において、 塩基番号 1539、 1560、 1574、 1600、 1623、 1635、 1644、 1654、 1661、 1682、 1686、 16 96、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795等で示されるシトシンを挙げること ができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が HRAS- like suppressor遺伝子であ る場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の HRAS-like suppressor遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置する プロモータ一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具 体的には、 配列番号 2で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC068162に記載 される塩基配列の塩基番号 172001〜173953で示される塩基配列に相当する。 ） があげ られる。 配列番号 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HRAS- like suppress or遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1743〜1953に示されている。 配列番号 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわ け配列番号 2で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチノレイ匕頻度 （即ち 、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞にお いてメチルイ匕頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 2で示される塩基配列 において、 塩基番号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 1405、 1409 、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1479、 14 83、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520等で示されるシ トシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 bA305P22. 2. 1遺伝子である場合 には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト 由来の bA305P22. 2. 1遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領 域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列 番号 3で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AL121673に記載される塩基配列 の塩基番号 13001〜13889で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 3で示される塩基配列においては、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1タンパク質のァミノ末端 のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 849〜851に示されており、 上記ェ クソン 1の塩基配列は、 塩基番号 663〜889に示されている。 配列番号 3で示される塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 3で 示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシ ンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状 態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻 度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 3で示される塩基配列において、 塩基 番号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486等で示さ れるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Gamma filamin遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の Gamma filamin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 4で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC074373に記載される塩基 配列の塩基番号 63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげ られる。 配列番号 4で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Gamma filaminタン パク質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 572〜574に示 されており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 463〜863に示されている。 配列 番号 4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 と りわけ配列番号 4で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在す る C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （ 即ち、 高メチノレ化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞 においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 4で示される塩基 配列において、 塩基番号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363、 370、 379、 382、 384 、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474、 486、 490、 503、 505 等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 HAND1遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中 に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の HAND1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれ るゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 5で示さ れる塩基配列 （Genbank Accession No. AC026688に記載される塩基配列の塩基番号 243 03〜26500で示される塩基配列の相捕的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 5で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の HAND1タンパク質のァミノ末端のメチ ォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 1656〜1658に示されており、 上記ェクソ ン 1の塩基配列は、 塩基番号 1400〜2198に示されている。 配列番号 5で示される塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 5で示 される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C G中のシトシン は、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチルイヒ頻度 が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 5で示される塩基配列において、 塩基番 号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272、 1292、 1305、 1307、 1.3 16、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434等で示されるシトシンをあげることができ る。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Homologue of RIKEN 2210016F1 6遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーデ ィング領域） の塩基配列中に存在する C Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基 配列としては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム ,D NAの塩基配列をあ げることができ、 より具体的には、 配列番号 6で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. AL354733に記載される塩基配列の塩基番号 157056〜 159000で示される塩基配 列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 6で示される塩基配列に おいては、 ヒ ト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1の塩基配 列は、 塩基番号 1392〜1945に示されている。 配列番号 6で示される塩基配列中に存在 する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 6で示される塩基配 列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethy lation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチルイヒ頻度が高いシトシ ンとしては、 例えば、 配列番号 6で示される塩基配列において、 塩基番号 1172、 1175 、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1332、 13 34、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438等で示さ れるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 FLJ32130遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来 の FLJ32130遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含 まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 7で 示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC002310に記載される塩基配列の塩基番 号 1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列 番号 7で示される塩基配列においては、 ヒト由来の FLJ32130タンパク質のアミノ酸末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2136〜2138に示されており、 上 記ェクソン 1と考えられる塩基配列は、 塩基番号 2136〜2379に示されている。 配列番 号 7で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とり わけ配列番号 7で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチルイヒ頻度 （即 ち、 高メチル化状態 （hypermethy lation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞に おいてメチルイ匕頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 7で示される塩基配 列において、 塩基番号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 1911、 19 15、 1925、 1940、 1955、 1968等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 PPARG angiopoietin- related p rotein遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む 塩基配列としては、 ヒト由来の PPARG angiopoietin- related protein遺伝子のエタソ ン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基 配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 8で示される塩基配列があげら れる。 配列番号 8で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の PPARG angiopoietin- r elated proteinタンパク質のァミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩 基番号 717〜719に示されており、 上記ェクソン 1の 5 ' 側部分の塩基配列は、 塩基番 号 1957〜2661に示されている。 配列番号 8で示される塩基配列中に存在する C p Gで 示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 8で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の 癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を 示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチルイ匕頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 8で示される塩基配列において、 '塩基番号 35、 43、 51、 54、 75、 85 、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258等で示されるシトシン をあげることができる。 また具体的には例えば 有用タンパク質遺伝子が、 Thrombomodulin遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の Thrombomodulin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 9で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF495471に記載される塩基 配列の塩基番号 1〜6096で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 9で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Thrombomodulinタンパク質のアミノ末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2590〜2592に示されており、 上 記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 2048〜6096に示されている。 配列番号 9で示さ れる塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番 号 9で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中の シトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチ ル化状態 （hyperraethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチ ル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 9で示される塩基配列において 、 塩基番号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595、 1598、 1601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1724、 1726、 1756等で示される シトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 p53 - responsive gene 2遺伝子 である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領 域） の塩基配列中に存在する C Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53 - responsive gene 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位 置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 0で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC00947 1に記載される塩基配列の塩基番号 113501〜 116000で示される塩基配列の相補的配列 に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 0で示される塩基配列においては、 ヒト由 来の p53 - responsive gene 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1558〜1808 に示されている。 配列番号 1 0で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩 基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高]/、メチル化頻度 （ 即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 膝 ϋ癌細 胞においてメチルイヒ頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 0で示される 塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 13 57、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Fibrillin遺伝子である場合に は、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配 列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由 来の Fibrillin遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域と が含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC113387に記載される塩基配列の 塩基番号 118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられ る。 配列番号 1 1で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Fibrillin2遺伝子のェ クソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1091〜1345に示されている。 配列番号 1 1で示され る塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 薛臓癌 細胞等の癌細胞において高いメチルイヒ頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylati on) ) を示す。 さらに具体的には、 藤臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシン としては、 例えば、 配列番号 1 1で示される塩基配列において、 塩基番号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843等で示される シトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Neurofilaments遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の Neurofilaments遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 2で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF106564に記載される塩 基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があ げられる。 配列番号 1 2で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Neurofilaments 遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 614〜1694に示されている。 配列番号 1 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、 例え ば、 瞎臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 髙メチル化状態 （hype rmethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 睦臓癌細胞においてメチル化頻度が高 ぃシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 2で示される塩基配列において、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 5 44、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 disintegrin and metal loprote inase domain 23遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻 訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一 つ以上含む ¾基酉己歹1 Jとしては、 ヒ卜由来の disintegrin and metalloproteinase doma in 23遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれ るゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 3で示 される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009225に記載される塩基配列の塩基番号 2 1001〜23300で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 3で示さ れる塩基酉己歹 IJにおレヽては、 ヒ卜由来の disintegrin and metalloproteinase domain 2 3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1194〜1630に示されている。 配列番号 1 3で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例え ば、 瞎臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hype rmethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓癌細胞においてメチル化頻度が高 ぃシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 3で示される塩基配列において、 塩基番号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 1043 、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106、 11 12、 1120、 1124、 1126等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G protein-coupled receptor 7 遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディ ング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配 列としては、 ヒト由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげる ことができ、 より具体的には、 配列番号 1 4で示される塩基配列 （Genbank Accessio n No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基配列に 相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 4で示される塩基配列においては、 ヒト由来 の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1666〜 2652に示されている。 配列番号 1 4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示され る塩基配列中のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチルイ匕頻 度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 藤臓 癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 4で示さ れる塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560 、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で示されるシトシンをあげる ことができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G- protein coupled somatostat in and angiotensin— like peptide receptor遣 fe十 ある ¾合に ¾:、 そのプロモータ 一領域、 のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 配列中に存在する C Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト 由来の G - protein coupled somatostatin and angiotensin - like peptide receptor退 伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 5で示される塩 基配列 （Genbank Accession No. AC008971に記載される塩基配列の塩基番号 57001〜60 000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 5で 示される塩基配歹 IJにおレヽては、 ヒ卜由来の G- protein coupled somatostatin and ang iotensin- like peptide receptor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 776〜2 632に示されている。 配列番号 1 5で示される塩基配列中に存在する C p Gで示され る塩基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻 度 （即ち、 髙メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 麵 癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 5で示さ れる塩基配列において、 塩基番号 470、 472、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 5 40、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612等で示されるシトシンをあげることができ る。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Solute carrier family 6 neur otransraitter transporter noradrenalin member 2遺伝ナ ζ？ある ¾r合には、 そのフロ モーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在す る C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Solute c arrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2退1：5子のェ クソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの 塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 6で示される塩基配列 （ Genbank Accession No. AC026802に記載される塩基配列の塩基番号 78801〜81000で示 される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 6で示される 塩基 歹1 Jにおいては、 ヒト由来の Solute carrier family 6 neurotransmitter trans porter noradrenalin member 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1479〜18 04に示されている。 配列番号 1 6で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される 塩基配列中のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 瞎臓癌 細胞においてメチルイ匕頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 6で示され る塩基配列において、 塩基番号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184等で示されるシトシンをあげるこ とができる。 本発明における 「 （目的とする D NA領域におけるメチルイ匕された D NAを検出可 能な量になるまで増幅し、 ） 増幅さ'れた D N Aの量」 とは、 生物由来検体に含まれる ゲノム D NA中の目的領域におけるメチルイ匕された D N Aの増幅後の量そのもの、 即 ち、 本発明の第四工程で求めた量を意味するものである。 例えば、 生物由来検体が 1 m Lの血清であった場合には、 血清 1 m L中に含まれる前記メチル化された D N Aに 基づいて增幅された D N Aの量を意味する。 本発明における 「メチル化割合」 とは、 生物由来検体に含まれるゲノム D NA中の 目的とする D NA領域におけるメチル化された D N Aの増幅後の量とメチルイヒされて いない D N Aの増幅後の量との合計量で、 メチル化された D NAの増幅後の量を除し た数値を意味するものである。 第一工程において、 生物由来検体に含まれるゲノム D N A由来の D NA試料をメチ ル化感受性制限酵素による消化処理を行う。
「メチル化感受性制限酵素」 とは、 例えば、 メチル化されたシトシンを含む認識配 列を消化せず、 メチルイ匕されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することの できる制限酵素等を意味する。 即ち、 メチル化感受性制限酵素が本来認識することが できる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されている D N Aの場合には、 該メチ ル化感受性制限酵素を該 D N Aに作用させても、 該 D NAは切断されない。 これに対 して、 メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシト シンがメチル化されていない D N Aの場合には、 該メチル化感受性制限酵素を該 D N Aに作用させれば、 該 D NAは切断される。 このようなメチル化感受性酵素の具体的 な例としては、 例えば、 HpaII、 BstUI、 Narl、 SacII、 Hhal等を挙げることができる 。 尚、 前記メチル化感受性制限酵素は、 すでに Gruenbaumらにより明らかにされてい る （Nucleic Acid Research, 9、 2509 - 2515) 。 該メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、 具体的には例 えば、 前記 D N Aを铸型とし、 解析対象とするシトシンを認識配列に含む D N Aを増 幅可能なプライマー対を用いて P C Rを行い、 D NAの増幅 （増幅産物） の有無を調 ベる方法を挙げることができる。 解析対象とするシトシンがメチル化されている場合 には、 増幅産物が得られる。 一方、 解析対象とするシトシンがメチル化されていない 場合には、 増幅産物が得られない。 このようにして、 増幅された D NAの量を比較す ることにより、 解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することが できる。 即ち、 生物由来検体に含まれるゲノム D NAがメチル化されていれば、 前記 メチル化感受性制限酵素はメチル化された D NAを切断しないという特性を利用する ことにより、 前記生物由来検体に含まれるゲノム D NAにおける前記メチル化感受性 制限酵素の認識部位の中に存在している C p G対におけるシトシンがメチル化されて いたか否かを区別することができる。 言い換えれば、 生物由来検体に含まれるゲノム D N Aにおける前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくと も 1つの C p G対におけるシトシンがメチル '化されていないのであれば、 当該認識部 位を有する D N Aは前記メチルイヒ感受性制限酵素で消化処理されると、 該メチル化感 受性制限酵素により切断される。 また、 生物由来検体に含まれるゲノム D NAにおけ る前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全ての C p G対におけ るシトシンがメチル化されていたのであれば、 当該認識部位を有する D N Aは該メチ ル化感受性制限酵素により切断されない。 従って、 消化処理を実施した後、 後述のよ うに、 前記目的とする D NA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いた P C Rを実 施することにより、 生物由来検体に含まれるゲノム D N Aにおける前記制限酵素の認 識部位の中に存在している少なくとも 1つの C p G対におけるシトシンがメチル化さ れていないのであれば、 P C Rによる増幅産物は得られず、 一方、 生物由来検体に含 まれるゲノム D N Aにおける前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在して いる全ての C p G対におけるシトシンがメチルイヒされていたのであれば、 P C Rによ る増幅産物が得られることになる。 第一工程は、 具体的には例えば、 生物由来検体に含まれるゲノム D N Aが哺乳類由 来のゲノム D N Aの場合には、 以下のように実施すればよい。 哺乳類由来のゲノム D NAに、 最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris-Acetate pH 7. 9、 660mM K0Ac、 lOOmM
MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 3 lmg/mL BSA水溶?夜を 3 μ L、 メチノレ化感受个生 制限酵素 Hpall又は Hhal (101]/ し） 等を夫々 1. 5 L加え、 次いで該混合物に滅菌超純 水を加えて液量を 30 // Lとし、 37°Cで 1時間〜 3時間インキュベーションすればよい
メチル化感受性制限酵素による消化処理が、 目的とする D N A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列 からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、 該メチル化感受 性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DNAを生成させる第一 （A) 工程と 、 第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DN Aをメチルイヒ感受性制限酵素で消化処理す る第一 （B) 工程とからなる消化処理であってもよい。
この場合、 「マスキング用オリゴヌクレオチド」 とは、 メチル化感受性制限酵素の 認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、 一本鎖 DNA中の目的とする DN A領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認 識配列のうち、 少なくとも 1箇所 （全ての個所でも良い） と相補的に塩基対合するこ とで二本鎖を形成し （即ち、 前記箇所を二本鎖状態にして） 、 二本鎖 DN Aのみを基 質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、 また、 試料が一 本鎖 DNAである場合、 一本鎖 DN Aを消化できるメチルイヒ感受性制限酵素 （一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖 D N Aも消化でき、 その消化効 率は、 二本鎖 DNAに対する方が一本鎖 DNAに対するよりも高い） での前記箇所の 消化効率を向上させることができるようにするためのォリゴヌクレオチドであり、 且 つ、 目的とする領域の DN Aを含む一本鎖 DN Aと一本鎖固定化オリゴヌクレオチド との二本鎖の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。 また、 該マスキング 用オリゴヌクレオチドは、 後述のリバース用プライマー （正鎖） を伸長プライマーと して、 該マスキング用オリゴヌクレオチド （負鎖） を铸型として、 伸長プライマーを 伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。 尚、 塩基長 としては、 8〜200塩基長が望ましい。
ゲノム DNA由来の DNA試科に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、 1種類でもよく複数種類でも良い。 複数種類を用いると、 目的とする DNA領域を含 む一本鎖 D N Aのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、 メ チル化感受性制限酵素での、 後述の 「DNAの切れ残し」 を最小限に抑えることがで きる。 マスキング用オリゴヌクレオチドは、 例えば、 目的とする DNA領域に含まれ る数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、 メチル化している場合には 消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所 （例えば、 疾患患者検体では 100%メチルイ匕されており、 健常者検体では 100%メチルイ匕されていない箇所等） に応じ て設計し、 これを使用することが特に有用である。 尚、 第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、 メチルイ匕されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない （所謂 「DNA の切れ残し」 ) 虞を挙げることができる。 このような虞が問題となる場合には、 メチ ル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、 「DNAの切れ残し」 を最小限に 抑えることができるので、 目的とする DNA領域としては、 メチル化感受性制限酵素 の認識部位を 1つ以上有しており、 その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられ る。 本発明又は後述のメチル化割合測定方法において、 「生物由来検体に含まれるゲノ ム DNA由来の DNA試料」 力 該ゲノム DNAが有する目的とする DNA領域を認 識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DNA試料であることを好ま しい態様の一つとして挙げることができる。 ここで、 生物由来検体に含まれるゲノム DN Aの消化物を固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、 短い鎳型 DN Aの 方がより選択され易く、 また、 PCRで目的領域を増幅する場合にも、 錶型 DNAが 短い方がよいと考えられるので、 目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限 酵素を生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料に直接使用し消化処理 を実施してもよい。 尚、 目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素によ り消化処理する方法としては、 一般的な制限酵素処理法を用いればよい。 これらの好 ましい態様は、 生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理してお くことにより、 メチノレイ匕量を精度良く求めることができるためである。 該方法は、 上 記のような 「DNAの切れ残し」 を無くすのに有用である。 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の試料をメチル化感受性制限酵素により 消化する方法としては、 生物由来検体がゲノム DNA自体の場合には前記方法と同様 な方法でよく、 生物由来検体が組織溶解液、 細胞溶解液等の場合には前記方法と同様 な方法に準じて、 大過剰のメチル化感受性制限酵素、 例えば、 25ngの DNA量に対し て 500倍量 （10U) 又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施す ればよい。 ゲノム DNAは、 基本的には二本鎖 DNAとして存在している。 したがつ て、 本操作においては、 一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 Hhal ) だけでなく、 二本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 Hpall 、 BstUI、 Narls SacII、 Hhal等） を用いることができる。 第二工程において、 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料から目的と する DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） を取得し、 該一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DNA領域を含まない。 ） · に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対 合させることにより、 前記一本鎖 DN Aを選択する。
「一本鎖固定ィヒオリゴヌクレオチド」 は、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （伹し、 前記目的とする DN A領域を含まない。 ） に対 して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチド （以下、 本固定 化ォリゴヌクレオチドと記すこともある。 ) である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料から、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を選択するために用 いられる。 本固定ィ匕オリゴヌクレオチドは、 5〜 50塩基長であることが好ましい。 本固定化オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側は、 担体と固定化され得るものであり、 一方その 3， 末端側は、 後述する第三工程及び第 A 2工程により 5 ' 末端から 3 ' 末 端に向かつて進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であってもよい。 または、 本固定化オリゴヌクレオチドは、 5' 或いは 3' 末端が担体と固定化され てもよい。 「担体と固定化され得るもの」 とは、 前記目的とする DNA領域を含む一本鎖 DN
A (正鎖） を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定化されていれば よく、 （1) 該一本鎖 DNA (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオチドとの塩基対合前 に、 本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定ィ匕されるものであっても よく、 また （2 ) 該一本鎖 D NA (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオチドとの塩基対 合後に、 本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定ィ匕されるものであつ でもよい。
このような構造を得るには、 目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N A (正鎖） の 3 ' 末端の一部 （但し、 前記目的とする D N A領域を含まない。 ) に対して相補性で ある塩基配列を有するオリゴヌクレオチド （以下、 本オリゴヌクレオチドと記すこと もある。 ） の 5 ' 末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット ·装置等に 従い、 担体に固定すればよい （固相への結合） 。 具体的には例えば、 本オリゴヌタレ 才チドの 5 ' 末端をピオチン化した後、 得られたビォチン化オリゴヌクレオチドをス トレプトァビジンで被覆した支持体 （例えば、 ス トレプトァビジンで被覆した P C R チューブ、 ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等） に固定する方法を挙げるこ とができる。
また、 本オリゴヌクレオチドの 5， 末端側に、 アミノ基、 アルデヒド基、 チオール 基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、 これを表面がシランカツプリン グ剤等で活性化させたガラス、 シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、 例 えば、 トリグリセリ ドを 5個直列に連結したもの等のスぺーサ一、 クロスリンカ一等 を介して共有結合させる方法も挙げられる。 またさらに、 ガラス若しくはシリコン製 の支持体の上で直接、 本オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側から化学合成させる方法も 挙げられる。 第二工程は、 具体的には例えば、 本固定化オリゴヌクレオチドがピオチン化オリゴ ヌクレオチドの場合には、
( a ) まず、 生物由来検体に含まれるゲノム D N A由来の D N A試料に、 ァユーリン グバッファ一及びビォチン化ォリゴヌクレオチド (該一本鎖 D N A (正鎖) と本固定 化ォリゴヌクレオチドとの塩基対合後に、 本固定化ォリゴヌクレオチドと担体との結 合により固定ィ匕されるものであるために、 現段階では遊離状態にあるもの） を添加す ることにより、 混合物を得る。 次いで、 得られた混合物を、 生物由来検体に含まれる ゲノム D N A由来の D N A試料に存在する目的とする D N A領域を含む二本鎖 D N A を一本鎖にするために、 95°Cで数分間加熱する。 その後、 ピオチン化オリゴヌクレ ォチドとの二本鎖を形成させるために、 ビォチン化オリゴヌクレオチドの Tm値の約 10〜 20 °C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保温する。
(b) その後、 室温に戻す。
(c) ストレプトアビジンで被覆した支持体に、 上記 （b) で得られた混合物を添加 し、 さらに、 これを 37 °Cで数分間保温することにより、 ピオチン化ォリゴヌクレオ チドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
前述の如く、 上記 （a) 〜 (c) では、 前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と、 ピオチン化オリゴヌクレオチドとの塩基対合を、 ビォチン化オリゴ ヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前に実施してい るが、 この順番は、 どちらが先でも構わない。 即ち、 例えば、 ストレプトアビジンで 被覆した支持体に固定化されたピオチン化オリゴヌクレオチドに、 生物由来検体に含 まれるゲノム DNA由来の DNA試料を添加することにより混合物を得て、 得られた 混合物を生物由来検体に含まれるゲノム DN A由来の DNA試料に存在する目的とす る DNA領域を含む二本鎖 DNAを一本鎖にするために、 95 °Cで数分間加熱し、 そ の後ピオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、 ピオチン化オリ ゴヌクレオチドの Tm値の約 10〜20°C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で 数分間保温してもよい。
(d) このようにしてピオチン化ォリゴヌクレオチドをストレプトァビジンで被覆し た支持体に固定した後、 残溶液の除去及び洗浄 （DNA精製） を行う。
より具体的には例えば、 ストレプトアビジンで被覆した P CRチューブを使用する 場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、 こ れに生物由来検体の容量と略等量の T Eバッファーを添カ卩し、 その後該 T Eバッファ —をピベッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。 またストレプトァ ビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、 磁石によりビーズを固定した後、 まず溶液をピぺッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、 生物由来検体 の容量と略等量の T Eバッファーを添加し、 その後該 T Eバッファーをピぺッティン グ又はデカンテーションにより取り除けばよい。 56782
29 次いで、 このような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗浄 （DN A精製） を行う。
該操作は、 固定ィヒされていない DNA、 又は、 後述の制限酵素で消化された溶液中 に浮遊している DNA、 を反応溶液から取り除くため、 重要である。 これら操作が不 十分であれば、 反応溶液中に浮遊している DNAが铸型となり、 増幅反応で予期せぬ 増幅産物が得られることとなる。 支持体と生物由来検体中 D N Aとの非特異的結合を 避けるためには、 目的領域とはまったく異なる塩基配列を有する DNA (例えば、 ヒ トの生物由来検体の場合は、 ラット DNA等） を大量に生物由来検体に添加し、 上記 の操作を実施すればよい。 第二工程における好ましい態様としては、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 該一本鎖 DN Aの 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DN A領域 を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオ チドとを塩基対合させる際に、 二価陽ィオンを含有する反応系中で塩基対合させるこ とを挙げることができる。 より好ましくは、 二価陽イオンがマグネシウムイオンであ ることが挙げられる。 ここで 「二価陽イオンを含有する反応系」 とは、 前記一本鎖 D NA (正鎖） と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させるために用い られるアニーリングバッファ一中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、 具体的には例えば、 マグネシゥムイオンを構成要素とする塩 （例えば、 M g O A c 2 、 MgC l 2等） を 1 mM〜60 OmMの濃度で含まれることがよい。 第三工程において、 第二工程で選択された一本鎖 DNAを錶型として、 前記一本鎖 固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させること により、 前記一本鎖 DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる。 この場合、 該一本 鎖 DNAを錶型として、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるためには、 DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を実 施すればよい。 第三工程は、 具体的には例えば、 本固定化オリゴヌクレオチドがピオチン化オリゴ ヌクレオチドの場合には、 以下のように実施すればよい。
第二工程で選択された前記目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N Aに、 滅菌超純 水を 17. 85 / L、 最適な 1 0 X緩衝液 （lOOmM Tris - HC1 pH 8. 3、 500mM KC1、 15mM MgCl2 ) を 3 μレ 2mM dNTPを 3 ^レ 5 ベタインを 加え、 次いで該混合物に AmpliTaq (D N Aポリメラーゼの 1種 ·· 5U/ i L) を 0. 15 μ Lカ卩えて液量を 30 μ Lとし、 37°Cで 2時間インキュベーションする。 その後、 インキュベーションされた溶液をピ ペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、 これに生物由来検体の容量 と略等量の T Eバッファーを添カロし、 該 T Eバッファーをピベッティング又はデカン テーシヨンにより取り除けばよい。
より具体的には例えば、 ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブを使用する 場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、 こ れに生物由来検体の容量と略等量の T Eバッファーを添加し、 その後該 T Eパッファ ーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。 またストレプトァ ビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、 磁石によりビーズを固定した後、 まず溶液をピベッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、 生物由来検体 の容量と略等量の T Eバッファーを添加し、 その後該 T Eバッファーをピぺッティン グ又はデカンテーシヨンにより取り除けばよレ、。 次いで、 このような操作を数回実施 することにより、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。 また、 第三工程は、 第二工程で選択された一本鎖 D N Aを固定ィ匕オリゴヌクレオチ ドから分離して一本鎖状態に一旦分離する工程を有し、 生成した一本鎖状態である D N A (正鎖） を鏡型として、 前記目的とする D N A領域の塩基配列 （正鎖） の 3 ' 末 端より更に 3 ' 末端側に位置する部分塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配 歹 IJ (負鎖） を有するフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、 該プライマ 一を 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖 D NAを二本鎖 D NAとして伸長形成 させる工程であってもよレ、。
この場合の方法としては、 具体的に例えば、 二本鎖 D NAを一本鎖にするために、 95 °Cで数分間加熱すればよい。 さらに、 フォーワード用プライマーを添加した後、 フォーヮード用プライマーの Tm値の約 10〜20°C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保温し、 前記の生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） とフォー ワード用プライマーとの二本鎖を形成させる。 生成した二本鎖 DNAの溶液に、 最適 な 10 X緩衝液 （lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgC12) を 3μレ 2mM dNTPを 3μレ 5Ν ベタインを 力卩ぇ、 次いで当該混合物に AmpliTaq (DNAポリメ ラーゼの 1種： 5U/ μ L) を 0. カ卩え、 滅菌超純水を加えて液量を 30 ^しとし、 37°C で 2時間ィンキュベーシヨンする。
なお、 第三工程は、 第四工程と独立に実施しても良いし、 第四工程で実施される P CR反応と連続して実施しても構わない。 第四工程において、 下記の各本工程の前工程として、 第三工程で得られた伸長形成 されたニ本鎖 D N A (前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C pG対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 ( 前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオ チド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である DNAを選択す る第 A 1工程と、 第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DN Aを鍀型として、 前 記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長さ せることにより、 前記一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる 第 A 2工程とを有する第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記一本鎖状態であ る DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記目 的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3 ' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性であ る塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマー） を伸長プライ マーとして、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、 さらに第四工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 D N A を一本鎖状態にー且分離した後、 繰り返すことにより、 前記目的とする D N A領域に おけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの 量を定量する。 第四工程では、 まず、 下記の各本工程の前工程として、 第三工程で得られた未消化 物である伸長形成された二本鎖 D N A (前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にァ ンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D N A) を一本鎖状態に一 旦分離する。 具体的には例えば、 第三工程で得られた未消化物である伸長形成された 二本鎖 D N A (前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対 を含まない伸長形成された二本鎖 D NA) に、 ァエーリングバッファーを添加するこ とにより、 混合物を得る。 次いで、 得られた混合物を 9 5 °Cで数分間加熱する。
その後、 本工程として、
(i)生成した一本鎖状態である D N A (正鎖） を、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオ チド （負鎖） にアニーリングさせるために、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド （ 負鎖） の T m値の約 1 0〜 2 0 °C低!/、温度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保 温する。
(ii)その後、 室温に戻す。 （第 A工程における第 A 1工程）
(ili)上記（i)で選択された一本鎖状態である D N Aを錶型として、 前記一本鎖固定化 オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより 、 前記一本鎖状態である D NAを二本鎖 D NAとして伸長形成させる （即ち、 第 Aェ 程における第 A 2工程） 。 具体的には例えば、 後述の説明や前述の本発明の第二工程 における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した一本鎖状態である D NA (負鎖） を錄型として、 前記一本鎖状態である D NA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記目的 とする D NA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 (負鎖） の 3 ' 末端よりさらに 3 ' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である 塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマー） ） を伸長プライ マー （リバース用プライマー） として、 該伸長プライマーを 1回伸長させることによ り、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる （即ち、 第 B 工程） 。 具体的には例えば、 上記（iii)と同様に、 後述の説明や前述の本発明の第二 工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(V)さらに第四工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 D NAを一本鎖状態にー且分離した後、 繰り返すこと （例えば、 第 A工程及び第 B工程 ) により、 前記目的とする DNA領域におけるメチルイヒされた DNAを検出可能な量 になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する。 具体的には例えば、 上記と同 様に、 後述の説明や前述の本発明の第四工程における前工程、 第 A工程及ぴ第 B工程 での操作方法等に準じて実施すればよい。 メチル化感受性制限酵素による消化処理の後に目的とする D N A領域 （即ち、 目的 領域） を増幅する方法としては、 例えば、 PCRを用いることができる。 目的領域を 増幅する際に、 片側のプライマーとして固定化オリゴヌクレオチドを用いることがで きるので、 もう一方のプライマーのみ添カ卩して PCRを行うことにより、 増幅産物が 得られ、 その増幅産物も固定ィヒされることとなる。 この際、 予め蛍光等で標識された プライマーを使用してその標識を指標とすれば、 電気泳動等の煩わしい操作を実施せ ずに増幅産物の有無を評価できる。 PCR反応液としては、 例えば、 本発明の第三ェ 程で得た DNAに、 50μΜのプライマーの溶液を 0.15 1と、 2mM dNTPを 2.5ズ 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris - HC1 pH 8.3、 500mM KC1、 20mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 2.5 μ 1と、 AmpliTaq Gold (耐熱性 DNAポリメラーゼの一種： 5ϋ/μ1)を 0.2 μ 1とを混 合し、 これに滅菌超純水を加えて液董を 25μ 1とした反応液を挙げることができる。
目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域) は、 GCリッチな塩基配列が多いため、 時に、 ベタイン、 DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。 反応条件としては 、 例えば、 前記ような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 55〜65°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 30〜40サイクル 行う条件があげられる。 かかる PCRを行った後、 得られた增幅産物を検出する。 例 えば、 予め標識されたプライマーを使用した場合には、 先と同様の洗浄'精製操作を 実施後、 固定ィヒされた蛍光標識体の量を測定することができる。 また、 標識されてい ない通常のプライマ一を用いた P C Rを実施した場合は、 金コロイド粒子、 蛍光等で 標識したプローブ等をアニーリングさせ、 目的領域に結合した該プローブの量を測定 することにより検出することができる。 また、 増幅産物の量をより精度よく求めるに は、 例えば、 リアルタイム P C R法を用いればよい。 リアルタイム P C R法とは、 P C Rをリアルタイムでモニターし、 得られたモェター結果を力イネティックス分析す る方法であり、 例えば、 遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出で きる高精度の定量 P C R法として知られる方法である。 該リアルタイム P C R法には 、 例えば、 鍚型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、 サイバ 一グリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。 リアルタ ィム P C R法のための装置及ぴキットは市販されるものを利用してもよい。 以上の如 く、 検出については特に限定されることはなく、 これまでに周知のあらゆる方法によ る検出が可能である。 これら方法では、 反応容器を移し換えることなく検出までの操 作が可能となる。 さらに、 固定化ォリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のビォチン化ォリゴヌクレオチ ドを片側のプライマー、 又は、 固定化オリゴヌクレオチドより、 3 ' 端側に新しいビ ォチン化オリゴヌクレオチドを設計しそれを片側のプライマーとし、 その相補側ブラ イマ一を用いて、 目的領域を増幅することもできる。 この場合、 得られた増幅産物は 、 ストレプトアビジンで被覆した支持体があれば固定ィヒされるので、 例えば、 ストレ プトアビジンコート P C Rチューブで P C Rを実施した場合には、 チューブ内に固定 されるため、 上記の通り、 標識されたプライマーを用いれば、 増幅産物の検出が容易 である。 また、 先の固定化オリゴヌクレオチドが共有結合等による固定化の場合であ れば、 P C Rで得られた増幅産物を含む溶液をストレプトアビジン被覆支持体が存在 する容器に移し、 増幅産物を固定化することが可能である。 検出については、 上述の 通り実施すればよい。 目的領域を増幅する相補側のプライマーは、 メチル化感受性制 限酵素の認識部位を 1つ以上有する目的領域を増幅でき、 かつ、 その認識部位を含ま ないプライマーでなければいけない。 この理由は、 以下の通りである。 選択及ぴ 1回 伸長反応で得られた二本鎖 DNAの固定化オリゴヌクレオチド側の DNA鎖 （新生鎖 ) の一番 3， 端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位のみがメチルイ匕されていない 場合には、 その部分だけがメチル化感受性制限酵素で消化されることになる。 消化後 、 前述のように洗浄操作を行っても、 新生鎖で言う 3' 端の一部だけを失った二本鎖 DNAが固定化されたままの状態で存在する。 相補側のプライマーが、 この一番 3' 端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位を含んでいた場合には、 該プライマーの 3 ' 端側の数塩基が、 新生鎖の 3' 端の数塩基とアニーリングし、 その結果、 目的領域 が P C Rにより増幅する可能性があるからである。 本発明は、 第四工程の前工程の前又は後において、 前記目的とする DN A領域を含 む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DN A領域を含ま ない。 ） に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌク レオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有するような 変法を含む。
即ち、
(変法 1 )
本発明の第四工程の前工程の前に、
前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前 記目的とする DNA領域を含まない。 ) に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊 離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前 工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明の第四工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有すること を特徴とする方法。
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを鍀型として、 前記一本鎖 オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる第 C 2 工程とを有する第 C工程 （本工程）
(変法 2)
本発明の第四工程の前工程の後に、
前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前 記目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊 離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前 工程） を追加的に有し、 且つ、 第三工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化 物である伸長形成された二本鎖 DNA (前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にァ ンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一 且分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、
本発明の第四工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有すること を特徴とする方法 （以下、 本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。 ）
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添カ卩された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより
、 前記一本鎖状態である D N Aを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記一本鎖 オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 C 2 工程とを有する第 C工程 （本工程） 該変法では、 外部から 「前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前記目的とする DNA領域を含まない。 ) に対して相補性で ある塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） 」 を反応 系内に添加すること等により、 第四工程における前述の目的とする DN A領域の増幅 効率を容易に向上させることが可能となる。 なお、 追加前工程で反応系内に添加され る一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） は、 一本鎖 DN Aの 3' 末端の一部 （伹し、 前 記目的とする D NA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列であって、 5 ' 末端が、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じである塩基配列を有する遊離 状態である一本鎖ォリゴヌクレオチドであれば、 前記一本鎖固定化ォリゴヌクレオチ ドと同じ塩基配列であっても、 又は、 短い塩基配列であっても、 或いは、 長い配列で あっても良い。 ただし、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドよりも長い配列の場合 には、 前記リバース用プライマー （正鎖） を伸長プライマーとし、 該一本鎖オリゴヌ クレオチド （負鎖） を铸型として、 伸長プライマーを伸長させる反応に利用できない 遊離状態である一本鎖ォリゴヌクレオチドでなければならない。 目的領域を增幅する際に、 片側のプライマーとして固定化オリゴヌクレオチドを用 いて、 もう一方のプライマーのみ添加して P C Rを行う例を前記したが、 目的産物の 検出のために他の方法 （例えば、 P C Rで得られた各々の増幅産物の量を比較するこ とができる分析方法) を実施するのであれば、 上記の如く、 目的領域を增幅する際に 、 固定ィヒオリゴヌクレオチドを一方 （片側） のプライマーとして使用せず、 一対のプ ライマーを添加して P C Rを実施してもよい。 かかる P C Rを行った後、 得られた増 幅産物の量を求める。 第四工程は繰り返し工程を有するが、 例えば、 第 A 1工程における 「生成した一本 鎖状態である D N A (正鎖） 」 とは、 第 1回目の第四工程の操作及び第 2回目以降の 第四工程の繰り返し操作の両操作において 「生成した 『遊離の』一本鎖状態である D N A (正鎖） 」 を意味することになる。
また、 第 B工程における 「生成した一本鎖状態である D N A (負鎖） j とは、 第 1 回目の第四工程の操作及び第 2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において 「生成した 『固定の』一本鎖状態である D N A (正鎖） j を意味する。 但し、 第四ェ 程がさらに追加的に C工程を有する場合には、 第 1回目の第四工程の操作において 「 生成した『固定の』一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 を意味し、 一方、 第 2回目以 降の第四工程の繰り返し操作において 「生成した 『固定の』一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 と 「生成した 『遊離の』一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 との両者を意 味することになる また、 第四工程の各本工程で得られた 「伸長形成された二本鎖 DNA」 とは、 第 A 工程の場合には、 第 1·回目の第四工程の操作において 「前記メチノレイヒ感受性制限酵素 の認識部位に、 アンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 DNAJ を意味し、 一方、 第 2回目以降の第四工程の繰り返し操作において 「前記メチル化感 受性制限酵素の認識部位に、 アンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二 本鎖 DNA」 と 「前記メチル化感受性制限酵素の認識部位に、 アンメチル状態の Cp G対を含む伸長形成された二本鎖 DNA」 との両者を意味することになる。 第 B工程 の場合には、 第 1回目の第四工程の操作及び第 2回目以降の第四工程の繰り返し操作 の両操作において 「前記メチルイ匕感受性制限酵素の認識部位では全てがアンメチル状 態の C p G対である伸長形成された二本鎖 DNA」 を意味することになる。
尚、 第四工程がさらに追加的に C工程を有する場合にも同様である。 また、 第四工程がさらに追加的に C工程を有する場合において、 第 C 1工程におけ る 「生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） 」 とは、 第 1回目の第四工程の操作及 ぴ第 2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において 「生成した 『遊離の』一 本鎖状態である DN A (正鎖） 」 を意味することになる。 また本努明は、 本発明の工程として、 下記の 2つの工程をさらに追加的に有するこ とを特徴とするメチル化割合の測定方法 （即ち、 本発明メチル化割合測定方法） を含 む。
(5) 本発明 （前記変法を含む） の第一工程及び第二工程を行った後、 本発明 （前記 変法を含む） の第三工程を行うことなく、 本発明 （前記変法を含む） の第四工程を行 うことにより、 前記目的とする DN A領域の DN A (メチル化された D N A及ぴメチ ルされていない DNAの総量） を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNA の量を定量する第五工程、 及ぴ、
(6) 本発明 （前記変法を含む） の第四工程により定量された DNAの量と、 第五ェ 程により定量された D N Aの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目 的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aの割合を算出する第六工程 該メチル化割合測定方法は、 下記のような場面において利用すればょレ、。
各種疾患 （例えば、 癌） において D N Aのメチル化異常が起こることが知られてお り、 この D N Aメチル化異常を検出することにより、 各種疾患の度合いを測定するこ とが可能と考えられている。 例えば、 疾患由来の生物由来検体に含まれるゲノム D N Aにおいて 100%メチル化されている D NA領域があり、 その D NA領域について本 発明又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、 測定されるメチル化された D N Aの量は多くなり、 例えば、 疾患由来の生物由来検体に含まれるゲノム D NAにおい て 100%メチル化されていない D N A領域があり、 その D NA領域について本発明又は 本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、 測定されるメチル化された D N Aの量は ほぼ 0に近い値となるであろう。 また、 例えば、 健常者の生物由来検体に含まれるゲ ノム D NAにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体に含まれるゲノ ム D NAにおいてメチルイ匕割合が高い D NA領域があり、 その D NA領域について、 本発明又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、 健常者の場合にはメチル化さ れた D N Aの量は 0に近い値を示し、 一方、 疾患患者の場合には健常者の場合におけ る値よりも有意に高い値を示すため、 この値の差異に基づき、 「疾患の度合い」 を判 定することができる。 ここでの 「疾患の度合い」 とは、 一般に該分野において使用さ れる意味と同様であって、 具体的には、 例えば、 生物由来検体が細胞である場合には 該細胞の悪性度を意味し、 また例えば、 生物由来検体が組織である場合には該組織に おける疾患細胞の存在量等を意味している。 さらに、 生物由来検体が血漿 ·血清であ る場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。 従って、 本発明又は本発明 メチル化割合測定方法は、 メチル化異常を調べることにより、 各種疾患を診断するこ とを可能にする。 このような本発明又は本発明メチルイ匕割合測定方法における、 目的領域のメチル化 された D N A量の測定、 メチル化割合の測定を行うための各種方法で使用し得る制限 酵素、 プライマー又はプローブは、 検出用キットの試薬として有用である。 本発明は 、 これら制限酵素、 プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや 、 これらプライマー又はプローブ等が担体上に固定ィヒされてなる検出用チップも提供 しており、 本発明又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、 該方法の実質的な 原理を利用してなる前記ような検出用キットゃ検出用チップのような形態での使用も 含むものである。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるもので はない。
実施例 1
配列番号 17で示される塩基配列からなり Hp a I Iの認識配列がメチル化されて いるメチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079-21 76/98 me r - M(7 )、 及び、 配列番号 2で示される塩基配列からなり Hp a I Iの認識配列がメチル化さ れていないアンメチル化オリゴヌクレオチ G PR 7- 2079- 21 76/98 m e r- UMを合成して、 夫々にっき 0. 001 p m o 1 / 10 μ L TEバッファー溶 液を調製した。
<Hp a I Iの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド> Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M (7) ：
5， - GT'
GGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 17) く Hp a I Iの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド> GPR7- 2079- 2176/98mer-環：
5， - GGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 (配列番号 18)
A群 （無処理群） ：上記で調製されたオリゴヌクレオチド溶液に、 Hp a I I及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 （330raM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 5 I Lと、 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 μ Lとを加えて、 さらに該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 μ L とした。 Β群 （H p a I Iによる消化処理群） ：上記で調製されたォリゴヌクレオチド溶液に 、 Hp a I Iを 12Uと、 Hp a l l及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM腿 c、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 5 μ L と、 10 X B S A (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 Lとを加えて、 さらに該 混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした。
C群 （マスキング用オリゴヌクレオチド添加 + Hp a I Iによる消化処理群） ：上記 で調製されたォリゴヌクレオチド溶液に、 Hp a l lを 12Uと、 Hp a l l及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 5 と、 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 μ Lと、 配列番号 1 9で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴ ヌクレオチド MAを 5 p m o 1加えて、 さらに該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 μ Lとした。 '
<マスキング用オリゴヌクレオチド>
ΜΑ： 5， 一 GCCACCCGGCGCGA -3， (配列番号 1 9) 各々の反応液を 37 °Cで 18. 5時間ィンキュベーションした。
また、 配列番号 20で示される塩基配列からなる 5' 末端ピオチン標識オリゴヌク レオチド B i o— GPR 7— 2 1 76 Rを合成し、 0. 1 μΜ ΤΕバッファ一溶液 を調製した。 く 5， 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチド〉
Bio_GPR7- 2176R： 5， - GCACGACGAGTGTGACGATC -3' (配列番号 20) 得られたメチル化ォリゴヌクレオチド、 又は、 アンメチル化ォリゴヌクレオチドの 夫々の消化処理溶液各 50 L 3本ずつに、 5， 末端ピオチン標識ォリゴヌクレオチ ド溶液 1 / Lを添加し、 95 °Cで 5分間加熱した。 その後、 50 °Cまで速やかに冷却 し、 その温度で 5分間保温した。 次いで、 これを 3 7 °Cで 5分間保温した後、 室温に 戻した。 次に、 ストレプトアビジンで.被覆した PCRチューブに、 上記のようにして調製さ れた混合物を添加し、 さらに、 これを 3 7 °Cで 5分間保温した。
次いで、 前記 PCRチューブから溶液を除去した後、 1 00 μ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 · 7 0、 154mM NaCl pH7.4) ：]を添加し、 該バッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさ らに 2回繰り返した。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 2 1で示される塩基配列からなるプライ マーの溶液及び配列番号 2 2で示される塩基配列からなるプライマーの溶液 （P F 1 及ぴ PR 1) を添カ卩し、 下記の反応条件を用いて PC Rを行うことにより、 目的とす る DNA領域 （GPR 7-20 79- 2 1 76、 配列番号 23、 メチル化シトシンも C で表す） におけるメチル化された D N Aを増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF1： 5' -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3 ' (配列番号 2 1)
PR1： 5' -GCACGACGAGTGTGACGATC- 3' (配列番号 22) 2009/056782
43
く目的とする DNA領域〉
GPR7- 2079- 2176： 5， - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCC GGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 (配列番号 23)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 配列番号 21で示される塩基配列 からなるプライマー及び配列番号 22で示される塩基配列からなるプライマーの 3 μ Μとなるよう調製された溶液各 5 しと、 each 2 mM dNTPを5 JuLと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 と、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511 しを0. 25 しと、 5Nベタイ ン水溶液を 10 Lとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 WLとしたも のを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 59°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 31サイ クル行う条件で PCRを行つた。
P C Rを行った後、 2 '%ァガロースゲル電気泳動により D N Aの增幅を確認した。 その結果を図 1に示す。 A処理群 （無処理群） と B処理群 (Hp a I I処理群） では 、 H p a I Iの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド G P R 7 -2079-21 76/98me r -M (7) (M) と、 Hp a l Iの認識配列がメ チル化されていないアンメチル化オリゴヌクレ才チ GPR 7-2079-21 76 /98me r— UM (U) ともに、 D N Aの増幅が確認されその増幅産物 （目的とす る DNA領域： GPR7— 2079— 21 76) が得られた。 C処理群 （マスキング 用オリゴヌクレオチド添加 + Hp a I Iによる消化処理群） の場合、 Hp a l Iの認 識配列がメチル化されてレ、るメチル化ォリゴヌクレオチド GPR 7— 2079- 21 76/98me r -M (7) (M) では、 DNAの増幅が確認されその増幅産物 （目 的とする DNA領域： GPR 7-2079-21 76) が得られたが、 Hp a I Iの 認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド G PR 7— 207 9-2176/98 me r -UM (U) では、 DNAの増幅が確認されずその増幅産 物は得られなかった。 以上より、 前記目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N Aを選択することが可能で あること、 且つ、 マスキング用オリゴヌクレオチドを添加しメチルイ匕感受性制限酵素 を用いることにより、 前記目的とする D NA領域におけるメチル化されていない D N Aを増幅することなく、 メチルイヒされた D N Aのみを検出可能な量になるまで増幅で きることが確認、された。 産業上の利用可能性
本発明により、 簡便にメチ/レイヒされた D NAを定量又は検出する方法等を提供する ことが可能となる。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1 7
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号 1 8
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号 1 9
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 2 0
固定のために設計されたピオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号 2 1
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 3
目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド （GPR7 - 2079- 2176、 メチル化シ トシンも Cで表す）

Claims

請求の範囲
1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけるメチル 化された D N Aの含量を測定する方法であって、
(1) 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料をメチル化感受性制限 酵素による消化処理を行う第一工程、
(2) 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料から目的とする DN A領域 を含む一本鎖 DN A (正鎖） を取得し、 該一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNA の 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DN A領域を含まない。 ） に対して相補 性のある塩基配列を有する一本鎖固定ィヒオリゴヌクレオチドとを塩基対合させること により、 前記一本鎖 DN Aを選択する第二工程、
(3) 第二工程で選択された一本鎖 DNAを铸型として、 前記一本鎖固定化オリゴヌ クレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の —本鎖 DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第三工程、 及び、
(4) 下記の各本工程の前工程として、 第三工程で得られた伸長形成された二本鎖 D NAを一本鎖状態に一旦分離する工程 （前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記一本鎖固定ィヒオリゴヌクレオ チド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である DN Aを選択す る第 A 1工程と、
第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記一本鎖固定化 オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより 、 前記の一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 A 2工程と 、 を有する第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記一本鎖状態であ る DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記目 的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配列 （負鎖） の 3 ， 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） に対して相補性のある塩 基配列 （正鎖） を有するプライマー （リバース用プライマー） を伸長プライマーとし て、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記一本鎖状態である DN Aを 二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
更に前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N Aを一本鎖状態に一旦分離 した後、 繰り返すことにより、 前記目的とする DN A領域におけるメチル化された D NAを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する第四工程、 を有することを特徴とする方法。
2. 第二工程において目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 該一本 鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DN A領域を含まない。 ） に対 して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合さ せる際に、 二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させる請求項 1に記載の方法
3. 二価陽ィオンがマグネシゥムィオンである請求項 2に記載の方法。 4. 第四工程の前工程の前に、
前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DN A領域を含まない。 ） に対して相補性のある塩基配列を有し且 つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追 加前工程） を追加的に有し、 且つ、
第四工程の各本工程として、 下記の 1つの工程を更に追加的に有する方法。
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記一本鎖状態である D N Aを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを鏡型として、 前記一本鎖 オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記一本鎖状態である D N Aを二本鎖 D N Aとして伸長形成させる第 C 2 工程とを有する第 C工程 （本工程）
5. 第四工程の前工程の後に、
前記目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部 （伹し、 前記の目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性のある塩基配列を有し且 つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追 加前工程） を追加的に有し、 且つ、
第三工程及び前記の追加前工程を経て得られた未消化物である伸長形成された二本 鎖 DNA (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を 含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前 工程） を有し、 且つ、
第四工程の各本工程として、 下記の 1つの工程を更に追加的に有する方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記追加前工程で反応系 内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記一本鎖状態である D N Aを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを錶型として、 前記一本鎖 オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる第 C 2 工程とを有する第 C工程 （本工程）
6. 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の方法の工程として、 下記の 2つの工程を更 に追加的に有するメチル化割合の測定方法。
( 5 ) 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の方法の第一工程を行うことなく、 請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより 、 前記目的とする DNA領域の DNA (メチル化された DNA及ぴメチルされていな い DNAの総量） を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量す る第五工程、 及ぴ、
(6) 請求項 1〜5のいずれか一項に記載の第四工程により定量された DN Aの量と 、 第五工程により定量された DNAの量とを比較することにより得られる差異に基づ き前記目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aの割合を算出する第六ェ 程
7. 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿である請求項 1〜6のいずれか一項に 記載の方法。
8. 生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液である請求項 1〜 6のいずれか一項に 記載の方法。
9. 生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液である請求項 1〜 6の 、ずれか一項 に記載の方法。
10. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 該ゲノム DNAが 有する目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されて なる DN A試料である請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の方法。
1 1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製されてな る DN A試料である請求項 1〜 10のいずれか一項に記載の方法。
12. メチル化感受性制限酵素による消化処理が、 目的とする DN A領域を含む一本 鎖 DNA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基 配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、 該メチル化 感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DNAを生成させる第一 （A) ェ 程と、
第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する 第一 （B) 工程とからなる消化処理である請求項 1〜1 1のいずれか一項に記載の方 法。
13. メチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目 的とする D N A領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である請求項 1〜 12のい ずれか一項に記載の方法。
14. メチル化感受性制限酵素が、 Hpall又は Hhalである請求項 1〜13のいずれか 一項に記載の方法。
1 5. 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目的とする DNA領域における メチル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
( 1 ) 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料をメチル化感受性制限 酵素による消化処理を行う第一工程、
(2) 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料から目的とする DN A領域 を含む一本鎖 DN A (正鎖） を取得し、 該一本鎖 DNA (正鎖） と、 該一本鎖 DNA の一部に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを 塩基対合させることにより、 前記の一本鎖 DN Aを選択する第二工程、
(3) 第二工程で選択された一本鎖 DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程を有し、 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） を錶型として、 前記目的とする DNA領域 の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配列 （負鎖） を有するフォーヮ一ド用プライマーを伸長プ ライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖 DNAを 二本鎖 DNAとして伸長形成させる第三工程、 及び、
(4) 下記各本工程の前工程として、 第三工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN Aを一本鎖状態に一旦分離する工程 （前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記フォーワード用プライマー （ 負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 A1工程と、 第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを錄型として、 前記フ ォーヮ一ド用プライマーを伸長プライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させるこ とにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 A 2工程とを有する第 A工程 （本工程） と、 (b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記一本鎖状態であ る DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記目 的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性のある塩基配列 （負鎖） の 3 ' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性のある 塩基配列 （正鎖） を有するリバース用プライマーを伸長プライマーとして、 該伸長プ ライマーを 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
更に第四工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N Aを 一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域に おけるメチル化された DNAを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの 量を定量する第四工程、
を有することを特徴とする方法。
1 6. 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが、 5' 或いは 3， 末端が固定化されてなる 一本鎖固定化ォリゴヌクレオチドである請求項 1 5に記載の方法。
17. 第二工程において目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 該ー 本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （伹し、 前記の目的とする DN A領域を含まない。 ） に 対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合 させる際に、 二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させる請求項 15又は 16 に記載の方法。
18. 請求項 15又は 16に記載の方法の工程として、 下記の 2つの工程を更に追加 的に有するメチル化割合の測定方法。
(5) 請求項 15又は 16に記載の方法の第一工程を行うことなく、 請求項 1〜 5の いずれか一項に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、 前記目 的とする DNA領域の DNA (メチル化された DN A及びメチルされていない DN A の総量） を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する第五ェ 程、 及ぴ、
(6) 請求項 15又は 16に記載の第四工程により定量された DNAの量と、 第五ェ 程により定量された D N Aの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目 的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aの割合を算出する第六工程
19. 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿である請求項 15又は 16に記載の 方法。
•20. 生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液である請求項 15又は 1 6に記載の 方法。
21. 生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液である請求項 15又は 16に記載 の方法。
22. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 該ゲノム DNAが 有する目的とする DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されて なる DN A試料である請求項 15又は 16に記載の方法。
23. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製されてな る DNA試料である請求項 15又は 16に記載の方法。
24. メチルイヒ感受性制限酵素による消化処理が、 目的とする DN A領域を含む一本 鎖 DNA (正鎖） と、 メチルイ匕感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基 配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、 該メチル化 感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DNAを生成させる第一 （A) ェ 程と、
第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する 第一 （B) 工程とからなる消化処理である請求項 15又は 16に記載の方法。
25. メチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目 的とする DNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である請求項 15又は 16 に記載の方法。
26. メチル化感受性制限酵素が、 Hpall又は Hhalである請求項 15又は 16に記載 の方法。
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