WO2009104718A1 - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents
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- G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
Definitions
- the present invention relates to a laser scanning microscope, and more particularly to a laser scanning microscope capable of acquiring an appropriate fluorescent image.
- a laser scanning microscope irradiates a sample such as a living cell with a laser beam, and scans the laser beam, thereby exciting a fluorescent substance of the sample and transmitting a fluorescence image by fluorescence emitted from the sample or the sample.
- a transmitted light image by transmitted light is acquired.
- Patent Document 1 in order to suppress damage (fading) of a sample due to laser light, when the amount of received fluorescence is greater than or equal to a predetermined upper threshold, and when the amount of received fluorescence is lower than a predetermined lower threshold A laser scanning microscope is disclosed that performs control so as to stop the irradiation of laser light in the following cases.
- the present invention has been made in view of such a situation, and makes it possible to acquire an appropriate fluorescent image.
- the laser scanning microscope of the present invention is a laser scanning microscope that scans a laser beam onto a sample to acquire an image, is excited by irradiation with the laser beam, and emits a plurality of fluorescent light amounts of different wavelengths emitted from the sample.
- Fluorescence measurement means for measuring, and when the light quantity of all the plurality of fluorescence is less than the lower limit threshold at the lower limit determination time shorter than the time for scanning the range corresponding to one pixel of the image, and one pixel of the image Control for stopping the irradiation of the laser light when at least one of the plurality of fluorescent light amounts exceeds an upper limit threshold during the time of scanning the range corresponding to 1 pixel of the image And an irradiation control means for each pixel scanning time which is a time for scanning the range corresponding to.
- the lower limit value shorter than the time for scanning the range corresponding to one pixel of the image is measured by measuring the light amounts of a plurality of fluorescent light having different wavelengths, which are excited by irradiation with laser light and emitted from the sample. At least when the light amounts of all of the plurality of fluorescent lights at the determination time are less than the lower limit threshold and when any one of the light amounts of the plurality of fluorescent lights exceeds the upper limit threshold during the time of scanning the range corresponding to one pixel of the image In the case of one of them, the control for stopping the irradiation of the laser light is performed every one pixel scanning time which is a time for scanning the range corresponding to one pixel of the image.
- an appropriate fluorescent image can be acquired.
- 11 laser scanning microscope system 12 samples, 13 laser scanning microscope, 14 personal computer, 15 display device, 16 input device, 17 application software, 21 laser light source unit, 22 laser scanning unit, 23 dichroic mirror, 24 objective lens, 25 stage , 26 Fluorescence detection unit, 27 Transmitted light detection unit, 28 Clem processing unit, 29 Image acquisition unit, 30 Fiber, 31a to 31c Laser light source, 32a to 32c shutter, 41 DM, 42 BA filter, 43 PMT, 51 Clem setting screen , 52 switch button, 53 dynamic range button, 54 file button, 55 setting sheet, 61 and 62 input buttons , 63 scroll bar, 64 and 65 input box, 66 scroll bar, 71 and 72 input box, 73 scroll bar, 74 and 75 input box, 76 scroll bar, 81 and 82 switching button, 83 input box, 91 and 92 OR Gate, 93 AND gate, 94 OR gate
- FIG. 1 is a block diagram showing a configuration example of an embodiment of a laser scanning microscope to which the present invention is applied.
- a laser scanning microscope system 11 is configured by connecting a laser scanning microscope 13 that acquires an image by laser light applied to a sample 12 and a personal computer 14 that controls the laser scanning microscope 13.
- a display device 15 such as a CRT (Cathode Ray Tube) or LCD (Liquid Crystal Display), and an input device 16 consisting of a mouse or a keyboard.
- the personal computer 14 includes a GUI for allowing a user to input an image acquired by the laser scanning microscope 13 or a setting value of the laser scanning microscope 13 when a built-in CPU (Central Processing Unit) executes the application software 17. Is displayed on the display device 15, or the laser scanning microscope 13 is controlled based on a setting value input by the user operating the input device 16.
- a built-in CPU Central Processing Unit
- the sample 12 is irradiated with the laser light from the laser light source unit 21, the fluorescent material of the sample 12 is excited by the laser light, and the fluorescence image by the fluorescence emitted from the sample 12 and the sample 12 are transmitted. A transmitted light image by the transmitted light is acquired.
- the laser light source unit 21 is provided with three laser light sources 31a to 31c that emit laser beams of different wavelengths, and three shutters 32a to 32c for turning on / off the irradiation of the laser beams.
- the shutters 32a to 32c are, for example, high-speed shutter elements such as AOM (Acousto-Optic Modulator) and AOTF (Acousto-Optic Tunable Filter), and are controlled by the laser light sources 31a to 31c according to the control of the Krem processing unit 28 as will be described later.
- the irradiation of the sample 12 with the laser beam is turned on / off.
- Laser light (excitation light) emitted from the laser light source unit 21 is introduced into the dichroic mirror 23 by an optical fiber (not shown) whose output end is connected to a fiber connector (not shown), and the reflected laser light is a laser. It is introduced into the scanning unit 22.
- the laser scanning unit 22 is, for example, a galvano scanner configured to include a mirror that reflects laser light and a drive mechanism that drives the mirror.
- the laser scanning unit 22 converts the laser light from the laser light source unit 21 into X ⁇ of the sample 12. Scanning is performed in the Y plane (a plane orthogonal to the optical axis of the laser beam irradiated onto the sample 12).
- the laser beam scanned by the laser scanning unit 22 is collected by the objective lens 24 and irradiated onto the sample 12 on the stage 25.
- Fluorescence emitted from the sample 12 excited by irradiating with laser light passes through the objective lens 24 and enters the laser scanning unit 22, and after being descanned, enters the dichroic mirror 23.
- the dichroic mirror 23 transmits fluorescence, and the fluorescence enters the fluorescence detection unit 26 through the fiber 30.
- the fluorescence from the sample 12 enters a DM (Dichroic Mirror) 41a, and the fluorescence in the first wavelength region is reflected by the DM 41a, and the BA filter (Barrier filter) 42a causes the sample 12 and the optical signal to be reflected. After the scattered light from the system is filtered, it enters a PMT (photomultiplier tube) 43a.
- DM Dynamic Mirror
- BA filter Barrier filter
- the fluorescence transmitted through the DM 41a enters the DM 41b, and the fluorescence in the second wavelength region is reflected by the DM 41b and filtered by the BA filter 42b, and then enters the PMT 43b.
- the fluorescence in the third wavelength region that has passed through the DM 41b is filtered by the BA filter 42c and then incident on the PMT 43c.
- each of the PMTs 43a to 43c detects the received fluorescence, and supplies an electrical signal (photoelectric conversion signal) having a voltage corresponding to the amount of light to the Krem processing unit 28.
- the PMTs 43a to 43c will be referred to as the PMT 43 when it is not necessary to distinguish them.
- the transmitted light transmitted through the sample 12 is incident on the transmitted light detection unit 27.
- the transmitted light detection unit 27 supplies an electrical signal having a voltage corresponding to the amount of transmitted light transmitted through the sample 12 to the Krem processing unit 28.
- the clem processing unit 28 controls the shutters 32a to 32c of the laser light source unit 21 based on the electrical signal from the PMT 43 for a predetermined time corresponding to one pixel for each pixel of the image of the sample 12 (corresponding to one pixel).
- a process for controlling the exposure time during which the sample 12 is exposed by laser light irradiation hereinafter referred to as a “CLEM: Controlled Light-Exposure Microscopy” process). Call).
- the Krem processing unit 28 performs the Krem processing, so that when the exposure time is shorter than the exposure time for one pixel set according to the scanning speed of the laser light, the PMT 43 or the transmitted light detection unit A process of extrapolating and outputting an electrical signal that will be obtained when exposure for one pixel of exposure time has been performed with respect to the electrical signal from 27 (hereinafter, referred to as Krem extrapolation process as appropriate) I do.
- the user can set whether or not the Krem processing unit 28 performs Krem processing by operating the personal computer 14, and when the Krem processing is set, The processing unit 28 performs Klem processing, performs Klem extrapolation processing on the electrical signal from the fluorescence detection unit 26, and supplies it to the image acquisition unit 29.
- the user determines whether or not the Krem extrapolation processing is performed on the electrical signal from the transmitted light detection unit 27 by using the personal computer 14. It can be set by operating. Then, when the Krem processing unit 28 is set to perform Klem extrapolation processing on the electrical signal from the transmitted light detection unit 27, the Krem processing unit 28 extrapolates the electrical signal from the transmitted light detection unit 27 to the image acquisition unit 29. In the case where it is set that the Krem extrapolation processing is not performed on the electrical signal from the transmitted light detection unit 27, the electrical signal from the transmitted light detection unit 27 is supplied to the image acquisition unit 29 as it is.
- the image acquisition unit 29 amplifies the electrical signal supplied from the Krem processing unit 28, performs A / D (Analog / Digital) conversion, performs image processing for assembling an image from the electrical signal, and obtains an image obtained by the image processing. Data is supplied to the personal computer 14. That is, the image acquisition unit 29 acquires fluorescence image data from the electrical signal from the fluorescence detection unit 26 and acquires transmitted light image data from the electrical signal from the transmitted light detection unit 27.
- a / D Analog / Digital
- the respective images are individually displayed on the display device 15 based on the fluorescence image data and the transmitted light image data, or the images designated by the user are overlaid or divided. Or can be displayed on the display device 15.
- the horizontal axis represents time, and an exposure time U (1 Pixel Dwell) per pixel that is set according to the scanning speed of the laser light elapses from the time T start at which exposure of a certain pixel is started. The time up to the time T end is shown.
- the vertical axis indicates the integrated value of the voltage of the electrical signal output from the PMT 43 in accordance with the amount of fluorescence received by the PMT 43 (that is, the value obtained by integrating the amount of fluorescence).
- V H ′ is calculated based on V thH preset by the user as a voltage value necessary and sufficient for acquiring an image in the laser scanning microscope 13. It shows the voltage value that will sometimes be measured. Further, V MIN indicates a lower limit voltage value that can be regarded as a background in the laser scanning microscope 13 or set as a signal that is not noticeable.
- the CLEM processing unit 28, PMT43 is receiving fluorescence from the sample 12, an electric signal having a voltage corresponding to the received light amount is supplied from PMT43, CLEM processing unit 28 starts integration of voltage from time T start Then, an integrated value integrated up to time T end is calculated by a method described later, and is output as a pixel value (fluorescence light amount) of one pixel.
- the Krem processing unit 28 determines that the voltage cannot reach the minimum voltage V MIN when the exposure time U of one pixel has elapsed, and the voltage is within the exposure time U of one pixel. If it is determined that the voltage V thH has been reached, the shutter 32 is closed and the sample 12 is controlled to stop irradiating the laser beam. That is, when the voltage does not reach the minimum voltage V MIN after the time U has elapsed, the pixel cannot sufficiently acquire the signal from the PMT 43, and it is not necessary to acquire any more electrical signal. is there. In addition, when the voltage exceeds the voltage V thH during the exposure time U of one pixel, the electric signal from the PMT 43 is sufficiently acquired, and it is not necessary to acquire any more electric signal. . Therefore, in this case, the deterioration (fading) of the sample 12 is suppressed by stopping the irradiation of the sample 12 with the laser beam.
- the Krem processing is a process in which the Krem processing unit 28 controls the opening and closing of the shutter 32 of the laser light source unit 21 based on the electrical signal corresponding to the amount of light received by the PMT 43 for each pixel.
- the Krem processing unit 28 determines that the voltage does not reach the minimum voltage V MIN, and when the shutter 32 is closed, the Krem processing unit 28 is obtained when the exposure is performed until the time T end without closing the shutter 32.
- the Krem extrapolation process is a process in which the Krem processing unit 28 extrapolates the measured voltage when the shutters 32a to 32c are closed by the Krem process.
- FIG. 3 is a diagram showing an example of a clem setting screen used for setting a clem process.
- the personal computer 14 displays the clem setting screen 51. It is displayed on the device 15.
- a switching button 52 for switching on / off of the clem processing On the clem setting screen 51, a switching button 52 for switching on / off of the clem processing, and a dynamic range button for selecting normal (Normal) or wide (Wide) of a dynamic range (Dynamic ⁇ Range) of an image obtained by the laser scanning microscope 13 53, a file button 54 for instructing reading (Load) or saving (Save) of a file (File) in which settings of Krem processing are described, and a setting sheet 55 for performing various settings are displayed.
- the display of the setting sheet 55 can be switched by selecting a tab.
- a sheet (Signal Level) for setting a signal level is displayed.
- the setting sheet 55 includes a sheet for setting the type and channel of the laser light source (Channel & Laser) and a sheet for designating a port for control communication (Port).
- the laser light source 31a of the laser light source unit 21 is the channel 1 (CH1), and the lower limit of the excitation light excited by the laser light (Ar 488/514) of the channel 1 is set on the setting sheet 55.
- An input box 61 for inputting a set value V L of “target lower limit fluorescence light amount” used for setting the threshold V thL an input box 62 for inputting a ratio of “target lower limit fluorescence light amount”, and ,
- a scroll bar 63 for designating a ratio of “target lower limit amount of fluorescent light” is displayed.
- the input box 61, the input box 62, and the scroll bar 63 are linked to each other.
- the setting value V L of “the target lower limit fluorescence light amount” is calculated from VL and displayed on the input box 62 and the scroll bar 63.
- the set value V L is calculated from the ratio and displayed in the input box 61.
- the amount of fluorescence (integrated value) can be set to a value between 0 and 4095.
- V L 205 is input as, according to the set value V L, the input box 62, 5% as a percentage of the "light quantity of fluorescence of the lower limit of the target" is set, depending on the 5%
- the slider of the scroll bar 63 is set at the position.
- the setting sheet 55 has a setting value V H of “target upper limit amount of fluorescence” used for setting the upper limit threshold V thH of excitation light excited by the laser light (Ar 488/514) of channel 1.
- the input box 64 is input to the input box 64 as the set value V H of “target upper limit amount of fluorescence”, and “target” is input to the input box 65 according to the set value V H.
- 40% is set as the ratio of “the upper limit fluorescence light amount”, and the slider of the scroll bar 66 is set at a position corresponding to 40%.
- the setting for the channel 2 (CH2) laser beam is the input box 71, the input box 72, the scroll bar 73, the input box 74, the input box 75, or This is done using the scroll bar 76.
- the CLEM processing except for using both lower threshold V thL and the upper limit threshold value V thH, processing using only the lower limit threshold value V thL (i.e., the shutter 32 exceeds the upper threshold V thH Or a process using only the upper limit threshold value V thH (that is, a process that does not control the shutter 32 even if it is less than the lower limit threshold value V thL ).
- the setting sheet 55 displays a switching button 81 for switching processing on / off using the lower limit threshold value V thL and a switching button 82 for switching processing on / off using the upper limit threshold value V thH .
- the user can set each switching by operating the switching buttons 81 and 82.
- the input box for inputting the set value factor for setting the lower limit determination time T thL that is the time for determining whether or not the voltage reaches the minimum voltage V MIN. 83 is displayed.
- the set value factor can be specified, for example, from the ratio of decreasing the lower limit determination time T thL with respect to the exposure time U of one pixel, and the ratio of setting the time T start to 100% and the time T end to 0%. Is entered. For example, in FIG. 3, 80% is input in the input box 83 as the set value factor.
- the exposure time U is set to, for example, 8.16 ⁇ sec.
- the horizontal axis represents time
- the vertical axis represents the integrated value of the voltage of the electric signal according to the amount of light received by the PMT 43, as in FIG.
- the circuit constant a (U) is obtained in consideration of various parameters such as the exposure time U of one pixel set in accordance with the scanning speed of the laser beam and the processing speed in the Krem processing unit 28. It is a constant.
- V Ln is a value (threshold voltage) obtained by converting the set value V L of “target lower limit fluorescence light amount” into a voltage when used in the Krem processing unit 28 as a threshold value.
- the linear voltage V n at the lower limit value determination time T thL is, when it is below the lower threshold V thL, laser light irradiation is stopped at the lower limit value determination time T thL, at the lower limit value determination time T thL the voltage V n A value Vout obtained by converting the output voltage Voutn obtained by extrapolation into light intensity (Intensity) is output.
- the user simply inputs the setting value V L and the setting value factor on the clem setting screen 51 (FIG. 3), and the lower limit threshold value V thL is calculated by the application software 17 and set in the clem processing unit 28.
- the application software 17 automatically calculates the lower limit threshold value V thL and changes the setting of the crem processing unit 28. Note that, for example, even when the scanning speed of the laser beam is changed and the exposure time U of one pixel is changed, the application software 17 is automatically based on the circuit constant a (U) corresponding to the change.
- the lower threshold V thL is calculated, and the clem processing unit 28 Change the setting.
- the personal computer 14 executes the application software 17 and uses the set value V H of “target upper limit amount of fluorescence” (Intensity) input in the input box 64 of FIG.
- V Hn is a value (threshold voltage) obtained by converting the set value V H of the “target upper limit fluorescence light amount” into a voltage when used in the Krem processor 28 as a threshold value.
- the voltage irradiation of the laser beam is stopped at time T n which is the upper limit threshold value V thH, at time T n, the output voltage V outn obtained by linearly extrapolating the upper threshold V thH, light intensity ( A value V out converted into (Intensity) is output.
- the user simply inputs the set value V H on the clem setting screen 51 (FIG. 3), and the upper limit threshold V thH is calculated by the application software 17 and set in the clem processing unit 28. Further, even when the set value V H is changed, the application software 17 automatically calculates the upper limit threshold V thH and changes the setting of the clem processing unit 28. Note that, for example, even when the scanning speed of the laser beam is changed and the exposure time U of one pixel is changed, the application software 17 is automatically based on the circuit constant a (U) corresponding to the change. The upper threshold value V thH is calculated, and the setting of the clem processing unit 28 is changed.
- the lower limit threshold V thL and the upper limit threshold V thH can be calculated based on the setting values input by the user using the clem setting screen 51.
- the lower limit threshold value V thL and the upper limit threshold value V thH can be automatically calculated according to the change and applied to the clem process.
- the user can confirm the effect of the clem processing by looking at the displayed fluorescence image, and can change the setting value by operating the clem setting screen 51 (for example, by moving the slider of the scroll bar 63). , An image in which the input is reflected in real time is displayed. Accordingly, the user can appropriately suppress the deterioration of the sample 12 and acquire an appropriate fluorescent image by changing the set value as appropriate so that the Krem process capable of acquiring an appropriate fluorescent image is performed. it can.
- the lower limit threshold value V thL and the upper limit threshold value V thH can be appropriately set by using the Krem setting screen 51, and the deterioration of the sample 12 is suppressed. An appropriate fluorescent image can be acquired.
- the value specified by the input boxes 61 and 64 is a luminance value (Intensity) that is easy for the user to understand.
- a luminance value Intensity
- laser scanning that is hardware is performed.
- Adjustment of the microscope 13 can be performed.
- the fluorescent image that can be acquired by specifying the luminance value in this way is a fluorescent image that the user wants to acquire, that is, an appropriate fluorescent image.
- the user operates the switching button 81 for switching on / off of the process using the lower limit threshold value V thL on the Krem setting screen 51 so that the lower limit threshold value V thL is not used in the clem process
- the switching button 82 for switching on / off of the process using the threshold value V thH By operating the switching button 82 for switching on / off of the process using the threshold value V thH , the upper threshold value V thH can be prevented from being used in the Krem process.
- the S / N ratio of the fluorescence image can be improved by not using the lower threshold value V thL in the Krem process.
- the input signal actually input from the PMT 43 to the Krem processing unit 28 uses the lower limit threshold V thL as the time T end (exposure time U).
- the Krem extrapolation process uses the input signal (actually depending on the amount of light received by the PMT 43).
- Linear extrapolation to amplify the signal a signal obtained by adding the noise signal and the noise component
- the noise component included in the input signal is five times larger. Basically, it is considered that the noise component is always included in the input signal at a constant rate.
- the noise component at the lower limit threshold V thL is 20 mV
- the noise component at time T end is also 20 mV. is there. Therefore, by not using the lower limit threshold value V thL in the Krem process, it is possible to avoid amplification of noise components, and thereby improve the S / N ratio of the fluorescence image.
- the rate of improving the S / N ratio is Although it is lower than when the lower threshold value V thL is not used in the Krem process, the S / N ratio of the fluorescent image can be improved similarly.
- a signal for instructing the closing of the shutter 32 is displayed. 32 to stop irradiation of the sample 12 with the laser beam.
- the sample 12 is irradiated with a plurality of laser beams having different wavelengths, and the fluorescence excited by the respective laser beams is detected by the fluorescence detection unit 26. It is necessary to control the irradiation of the sample 12.
- FIG. 6 shows a laser light source unit 21, a stage 25, and a fluorescence detection unit 26 that are necessary for explaining the irradiation control for each laser light among the blocks constituting the laser scanning microscope system 11.
- the laser light sources 31a and 31b are provided with shutters 32a and 32b, respectively, but the laser light source 31c is not provided with a shutter.
- the laser light (wavelength: 488/514 nm) emitted from the laser light source 31a is applied to the sample 12 on the stage 25 through the shutter 32a and excited by the laser light (excitation light).
- the reflected fluorescence is reflected by the DM 41a of the fluorescence detection unit 26, and the PMT 43a receives the fluorescence.
- the laser light (wavelength: 543 nm) irradiated from the laser light source 31b is irradiated onto the sample 12 on the stage 25 via the shutter 32b, and the fluorescence excited by the laser light (excitation light) is detected by fluorescence.
- the light passes through the DMs 41a and 41b of the unit 26, and the PMT 43b receives the fluorescence.
- the Krem processing unit 28 (FIG. 1) controls the shutter 32a according to the electrical signal corresponding to the amount of fluorescence received by the PMT 43a, and controls the shutter 32b according to the electrical signal corresponding to the amount of fluorescence received by the PMT 43b. To do.
- the Krem processing unit 28 controls the shutters 32a and 32b based on the logic circuit shown in FIG.
- the OR gate 91 shows the result of detecting whether or not the voltage V n indicating the amount of fluorescence received by the PMT 43a is less than the lower threshold V thL at the lower limit determination time T thL .
- the detection signal S 1L and the detection signal S 1H generated as a result of determining that the voltage V n indicating the amount of fluorescence received by the PMT 43a exceeds the upper limit threshold V thH are input, and the OR gate 91 receives the detection signal S Based on the logical sum of 1L and the detection signal S 1H , the control signal SC 1 for controlling the closing of the shutter 32a is output.
- the detection signal S 1L detects that the voltage V n indicating the amount of fluorescence received by the PMT 43a is less than the lower limit threshold V thL at the lower limit determination time T thL , the level transitions from 0 to 1. . Further, when the detection signal S 1H detects that the voltage indicating the amount of received fluorescence received by the PMT 43a exceeds the upper limit threshold V thH , the level transitions from 0 to 1.
- the level of the detection signal S 1L changes from 0 to 1 at the lower limit value determination time T thL earlier than the detection signal S 1H , and as a result, the control signal SC output from the OR gate 91. 1 level transitions from 0 to 1 at the lower limit value determination time T thL.
- the shutter 32a is closed at the lower limit determination time T thL and the irradiation of the laser light from the laser light source 31a is stopped.
- the OR gate 92 has a detection signal S indicating a result of detecting whether or not the voltage V n indicating the amount of fluorescence received by the PMT 43b is less than the lower limit threshold V thL at the lower limit determination time T thL . 2L and a detection signal S 2H generated as a result of determining that the voltage V n indicating the amount of fluorescence received by the PMT 43b exceeds the upper limit threshold V thH is input, and the OR gate 92 detects the detection signal S 2L and the detection signal S 2L Based on the logical sum with the signal S 2H , the control signal SC 2 for controlling the closing of the shutter 32b is output.
- the detection signal S 2L and the detection signal S 2H transition in the same manner as the detection signal S 1L and the detection signal S 1H .
- the level of the detection signal S 2H is a time after the lower limit determination time T thL.
- the level of the control signal SC 2 output from the OR gate 92 transitions from 0 to 1 at time T n .
- the shutter 32b is closed at time T n, the irradiation of laser beam from the laser light source 31b is stopped.
- some samples 12 emit fluorescence with a plurality of different wavelengths by excitation light having a certain wavelength.
- FIG. 8 shows the laser light source unit 21, the stage 25, and the fluorescence detection unit 26 of the laser scanning microscope system 11, as in FIG. As shown in FIG. 8, among the fluorescence from the sample 12 excited by the laser light emitted from the laser light source 31a, one having one wavelength is reflected by the DM 41a and received by the PMT 43a. Things are transmitted through DM 41a and 41b and received by PMT 43b.
- the clem processing unit 28 controls the shutter 32a based on the logic circuit shown in FIG.
- the AND gate 93 the result of detecting whether or not the voltage V n indicating the amount of received fluorescence of the light received by the PMT 43a is less than the lower threshold value V thL at the lower limit determination time T thL .
- a detection signal S 1L indicated, PMT43b voltage V n indicating the received light amount of the fluorescence received is, a detection signal S 2L showing results of detecting whether or not less than the lower limit threshold value V thL at the lower limit value determination time T thL
- the AND gate 93 outputs an output signal based on the logical product of the detection signal S 1L and the detection signal S 2L to the OR gate 94.
- the OR gate 94 receives the detection signal S 1H and the PMT 43b that are generated.
- the detection signal S 2H generated is input, and the OR gate 94 outputs the output signal from the AND gate 93, the detection signal S 1H , and the detection signal Based on the logical sum of the signal S 2H , the control signal SC 1 for controlling the closing of the shutter 32a is output.
- the shutter 32a when only the level of the detection signal S 1L becomes 1 at the lower limit determination time T thL , the shutter 32a is not controlled.
- 1 level changes from 0 to 1, by which, the shutter 32a is closed at time T n, the irradiation of the laser light from the laser light source 31a is stopped.
- the level of the detection signal S 1L changes from 0 to 1 at the lower limit value determination time T thL earlier than both the detection signal S 1H and the detection signal S 2H , and the detection signal S 2L the level of the transitions from 0 to 1 at the lower limit value determination time T thL, the level of the control signal SC 1 to OR gate 94 outputs transitions from 0 to 1 at the lower limit value determination time T thL.
- the shutter 32a is closed at the lower limit determination time T thL and the irradiation of the laser light from the laser light source 31a is stopped.
- the laser light irradiation is performed.
- an appropriate fluorescence image can be acquired even when fluorescence of a plurality of different wavelengths is emitted by excitation light of a certain wavelength.
- system represents the entire apparatus composed of a plurality of apparatuses.
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Abstract
本発明は、適切な蛍光画像を取得することができるレーザ走査顕微鏡に関する。
蛍光検出ユニット26は、レーザ光の照射により励起し、試料12から発せられる、異なる波長の複数の蛍光の光量を測定する。そして、クレム処理部28は、画像の1画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および画像の1画素に対応する範囲を走査する時間中に複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、レーザ光の照射を停止させる制御を、画像の1画素に対応する範囲を走査する時間である1画素走査時間ごとに行う。
Description
本発明は、レーザ走査顕微鏡に関し、特に、適切な蛍光画像を取得することができるようにしたレーザ走査顕微鏡に関する。
従来、レーザ走査顕微鏡は、生体細胞などの試料にレーザ光を照射し、そのレーザ光を走査させることで、試料の蛍光物質が励起されて試料から発せられる蛍光による蛍光画像や、試料を透過する透過光による透過光画像などを取得する。
また、特許文献1には、レーザ光による試料の損傷(退色)を抑制するために、蛍光の受光量が所定の上限の閾値以上となる場合、および、蛍光の受光量が所定の下限の閾値以下となる場合に、レーザ光の照射を停止するように制御を行うレーザ走査顕微鏡が開示されている。
しかしながら、上述のレーザ走査顕微鏡において、ある1波長のレーザ光から励起される複数の波長の蛍光による蛍光画像をそれぞれ取得するとき、レーザ光の照射が適切に制御されないと、適切な蛍光画像を取得することができないことがあった。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、適切な蛍光画像を取得することができるようにするものである。
本発明のレーザ走査顕微鏡は、レーザ光を試料に走査して画像を取得するレーザ走査顕微鏡であって、前記レーザ光の照射により励起し、前記試料から発せられる異なる波長の複数の蛍光の光量を測定する蛍光測定手段と、前記画像の1画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての前記複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および前記画像の1画素に対応する範囲を走査する時間中に前記複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、前記レーザ光の照射を停止させる制御を、前記画像の1画素に対応する範囲を走査する時間である1画素走査時間ごとに行う照射制御手段とを備えたことを特徴とする。
本発明のレーザ走査顕微鏡においては、レーザ光の照射により励起し、試料から発せられる、異なる波長の複数の蛍光の光量が測定され、画像の1画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および画像の1画素に対応する範囲を走査する時間中に複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、レーザ光の照射を停止させる制御が、画像の1画素に対応する範囲を走査する時間である1画素走査時間ごとに行われる。
本発明のレーザ走査顕微鏡によれば、適切な蛍光画像を取得することができる。
11 レーザ走査顕微鏡システム, 12 試料, 13 レーザ走査顕微鏡, 14 パーソナルコンピュータ, 15 表示装置, 16 入力装置, 17 アプリケーションソフトウェア, 21 レーザ光源ユニット, 22 レーザ走査部, 23 ダイクロイックミラー, 24 対物レンズ, 25 ステージ, 26 蛍光検出ユニット, 27 透過光検出部, 28 クレム処理部, 29 画像取得部, 30 ファイバー,31a乃至31c レーザ光源, 32a乃至32c シャッタ, 41 DM, 42 BAフィルタ, 43 PMT, 51 クレム設定画面, 52 切換ボタン, 53 ダイナミックレンジボタン, 54 ファイルボタン, 55 設定シート, 61および62 入力ボックス, 63 スクロールバー, 64および65 入力ボックス, 66 スクロールバー, 71および72 入力ボックス, 73 スクロールバー, 74および75 入力ボックス, 76 スクロールバー, 81および82 切換ボタン, 83 入力ボックス, 91および92 ORゲート, 93 ANDゲート, 94 ORゲート
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
図1は、本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
図1において、レーザ走査顕微鏡システム11は、試料12に照射されるレーザ光による画像を取得するレーザ走査顕微鏡13と、レーザ走査顕微鏡13を制御するパーソナルコンピュータ14とが接続されて構成される。
パーソナルコンピュータ14には、CRT(Cathode Ray Tube)やLCD(Liquid Crystal Display)などからなる表示装置15、および、マウスやキーボードからなる入力装置16が接続されている。パーソナルコンピュータ14は、内蔵するCPU(Central Processing Unit)がアプリケーションソフトウェア17を実行することで、レーザ走査顕微鏡13により取得された画像や、レーザ走査顕微鏡13の設定値をユーザに入力させるためのGUIなどを表示装置15に表示させたり、ユーザが入力装置16を操作することにより入力される設定値に基づいて、レーザ走査顕微鏡13を制御する。
レーザ走査顕微鏡13では、レーザ光源ユニット21からのレーザ光が試料12に照射され、そのレーザ光により試料12の蛍光物質が励起されて試料12から発せられる蛍光による蛍光画像、および、試料12を透過する透過光による透過光画像が取得される。
レーザ光源ユニット21には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発する3つのレーザ光源31a乃至31c、および、レーザ光の照射をオン/オフするための3つのシャッタ32a乃至32cが設けられている。シャッタ32a乃至32cは、例えば、AOM(Acousto-Optic Modulator)やAOTF(Acousto-Optic Tunable Filter)などの高速シャッタ素子であり、後述するようにクレム処理部28の制御に従って、レーザ光源31a乃至31cからのレーザ光による試料12の照射を、それぞれオン/オフする。
レーザ光源ユニット21から発せられるレーザ光(励起光)は、出力端がファイバコネクタ(図示せず)に接続された光ファイバ(図示せず)によりダイクロイックミラー23に導入され、反射したレーザ光はレーザ走査部22に導入される。
レーザ走査部22は、例えば、レーザ光を反射するミラーと、ミラーを駆動する駆動機構とを有して構成されるガルバノスキャナであり、レーザ光源ユニット21からのレーザ光を、試料12のX-Y平面(試料12に照射されるレーザ光の光軸に対し直交する平面)で走査する。レーザ走査部22により走査されるレーザ光は、対物レンズ24により集光されて、ステージ25上の試料12に照射される。
レーザ光を照射することにより励起され試料12から発せられた蛍光は、対物レンズ24を透過してレーザ走査部22に入射し、デスキャンされた後ダイクロイックミラー23に入射する。ダイクロイックミラー23は、蛍光を透過し、その蛍光は、ファイバー30を介して、蛍光検出ユニット26に入射される。
蛍光検出ユニット26において、試料12からの蛍光は、DM(Dichroic Mirror)41aに入射し、第1の波長領域の蛍光がDM41aにより反射されて、BAフィルタ(Barrier filter)42aにより、試料12や光学系からの散乱光がフィルタリングされた後、PMT(photo multiplier tube)43aに入射される。
また、DM41aを透過した蛍光は、DM41bに入射し、第2の波長領域の蛍光がDM41bにより反射されて、BAフィルタ42bによりフィルタリングされた後、PMT43bに入射される。また、DM41bを透過した第3の波長領域の蛍光は、BAフィルタ42cによりフィルタリングされた後、PMT43cに入射される。
そして、PMT43a乃至43cは、それぞれ受光した蛍光を検出し、その光量に応じた電圧の電気信号(光電変換信号)をクレム処理部28に供給する。なお、以下、適宜、PMT43a乃至43cを、それぞれ区別する必要がない場合、PMT43と称する。
また、試料12に照射されたレーザ光のうち、試料12を透過した透過光は、透過光検出部27に入射する。透過光検出部27は、試料12を透過した透過光の光量に応じた電圧の電気信号をクレム処理部28に供給する。
クレム処理部28は、PMT43からの電気信号に基づいて、レーザ光源ユニット21のシャッタ32a乃至32cの制御を、試料12の画像の1画素ごとに1画素に相当する所定時間(1画素に対応する範囲を走査する時間である1画素走査時間)内で行い、レーザ光の照射により試料12が露光される露光時間を制御する処理(以下、適宜、クレム(CLEM:Controlled Light-Exposure Microscopy)処理と称する)を行う。
また、クレム処理部28は、クレム処理を行うことにより、露光時間がレーザ光の走査速度に応じて設定される1画素分の露光時間より短い時間となったときに、PMT43または透過光検出部27からの電気信号に対し、1画素分の露光時間の露光がなされていたときに得られるであろう電気信号を演算により外挿して出力する処理(以下、適宜、クレム外挿処理と称する)を行う。
レーザ走査顕微鏡システム11では、クレム処理部28がクレム処理を行うか否かを、ユーザが、パーソナルコンピュータ14を操作することにより設定することができ、クレム処理を行うと設定されている場合、クレム処理部28は、クレム処理を行うとともに、蛍光検出ユニット26からの電気信号に対しクレム外挿処理を施して画像取得部29に供給する。
また、レーザ走査顕微鏡システム11では、クレム処理を行うと設定されているときに、透過光検出部27からの電気信号に対しクレム外挿処理を行うか否かを、ユーザが、パーソナルコンピュータ14を操作することにより設定することができる。そして、クレム処理部28は、透過光検出部27からの電気信号に対しクレム外挿処理を行うと設定されている場合、透過光検出部27からの電気信号を外挿して画像取得部29に供給し、透過光検出部27からの電気信号に対しクレム外挿処理を行わないと設定されている場合、透過光検出部27からの電気信号を、そのまま画像取得部29に供給する。
画像取得部29は、クレム処理部28から供給される電気信号を増幅してA/D(Analog/Digital)変換し、その電気信号から画像を組み立てる画像処理を行い、その画像処理により得られる画像データをパーソナルコンピュータ14に供給する。即ち、画像取得部29は、蛍光検出ユニット26からの電気信号から蛍光画像データを取得し、透過光検出部27からの電気信号から透過光画像データを取得する。
そして、レーザ走査顕微鏡システム11では、蛍光画像データおよび透過光画像データに基づいて、それぞれの画像を個別に表示装置15に表示したり、ユーザにより指定された画像を重ね合わせて、または分割して表示装置15に表示したりすることができる。
次に、図2を参照して、クレム処理およびクレム外挿処理について説明する。
図2において、横軸は時刻を表し、ある1画素の露光が開始される時刻Tstartから、レーザ光の走査速度に応じて設定される1画素あたりの露光時間U(1Pixel Dwell)が経過する時刻Tendまでの時刻が示されている。また、縦軸は、PMT43により計測される蛍光の受光量に応じてPMT43から出力される電気信号の電圧の積算値(即ち、蛍光光量を積算した値)が示されている。
また、図2において、VH'は、レーザ走査顕微鏡13において、画像を取得するために必要十分な電圧値として予めユーザにより設定されたVthHに基づいて算出される、画素の露光時間U経過時に計測されるであろう電圧値を示している。また、VMINは、レーザ走査顕微鏡13において、背景(バックグラウンド)と見なせるあるいは、注目に値しないほど低い信号として設定される下限の電圧値を示している。
クレム処理部28には、PMT43が試料12からの蛍光を受光し、その受光量に応じた電圧の電気信号がPMT43から供給され、クレム処理部28は、時刻Tstartから電圧の積算を開始し、後述する方法により時刻Tendまで積算した積算値を算出して、1画素の画素値(蛍光の光量)として出力する。
ここで、クレム処理部28は、1画素の露光時間Uの経過時に、電圧が最小電圧VMINまで到達することができないと判定した場合、および、電圧が1画素の露光時間Uの時間の中で電圧VthHに達したと判定した場合に、シャッタ32を閉鎖して試料12へのレーザ光の照射を停止させるように制御する。即ち、時間Uの経過時に、電圧が最小電圧VMINまで到達していなかった場合には、PMT43からの信号を十分に取得することができない画素であり、これ以上の電気信号の取得は不要である。また、電圧が1画素の露光時間Uの時間の中で、電圧VthHを超過する場合には、PMT43からの電気信号は十分に取得されており、これ以上の電気信号の取得は不要である。従って、この場合には、試料12へのレーザ光の照射を停止させることにより、試料12の劣化(退色)を抑制する。
例えば、クレム処理部28は、電圧が最小電圧VMINまで到達するか否かを判定する時刻である下限値判定時刻TthLにおける電圧Vnが、下限閾値VthL(VthL=VMIN×TthL/U)未満であるか否かを判定し、下限値判定時刻TthLにおける電圧Vnが、下限閾値VthL未満であると判定した場合、シャッタ32を閉鎖する。また、例えば、クレム処理部28は、電圧が、所定の上限閾値VthHを超えたときには、電圧が上限閾値VthHを超えた時刻Tnを記憶し、シャッタ32を閉鎖する。
このように、クレム処理部28が、1画素ごとに、PMT43の受光量に応じた電気信号に基づいて、レーザ光源ユニット21のシャッタ32の開閉を制御する処理がクレム処理である。
そして、クレム処理部28は、電圧が最小電圧VMINまで到達しないと判定し、シャッタ32を閉鎖した場合に、シャッタ32を閉鎖せずに時刻Tendまで露光を行ったとしたときに得られるであろう電圧を、下限値判定時刻TthLでの電圧Vnの直線外挿により求めることができる。即ち、電圧が最小電圧VMINまで到達しないときに外挿された電圧VL’は、VL’=Vn×(U/TthL)で求められる。
また、クレム処理部28は、電圧が1画素の露光時間Uの時間の中で上限閾値VthHに達したと判定し、シャッタ32を閉鎖した場合に、シャッタ32を閉鎖せずに時刻Tendまで露光を行ったとしたときに得られるであろう電圧を、上限閾値VthHでの時刻Tnの直線外挿により求めることができる。即ち、電圧が上限閾値VthHを越えたときに外挿された電圧VH'は、VH'=VthH×(U/Tn)で求められる。
このように、クレム処理部28が、クレム処理によりシャッタ32a乃至32cが閉鎖されたときに、測定された電圧を外挿する処理がクレム外挿処理である。
次に、図3は、クレム処理の設定に用いられるクレム設定画面の例を示す図である。
例えば、図1のレーザ走査顕微鏡システム11による試料12の観察を開始する際に、ユーザが、クレム処理の設定を行うように入力装置16を操作すると、パーソナルコンピュータ14は、クレム設定画面51を表示装置15に表示させる。
クレム設定画面51には、クレム処理のオン/オフを切り替える切換ボタン52、レーザ走査顕微鏡13により得られる画像のダイナミックレンジ(Dynamic Range)のノーマル(Normal)またはワイド(Wide)を選択するダイナミックレンジボタン53、クレム処理の設定を記載したファイル(File)の読み出し(Load)または保存(Save)を指示するファイルボタン54、および、各種の設定を行うための設定シート55が表示される。
設定シート55は、タブを選択することにより、その表示を切り替えることができ、図3においては、信号レベルを設定するシート(Signal Level)が表示されている。また、設定シート55には、レーザ光源の種類やチャンネルなどを設定するシート(Channel & Laser)、および、制御通信用のポートを指定するシート(Port)がある。
例えば、レーザ走査顕微鏡13では、レーザ光源ユニット21のレーザ光源31aがチャンネル1(CH1)とされ、設定シート55には、チャンネル1のレーザ光(Ar 488/514)により励起される励起光の下限閾値VthLの設定に用いられる「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値VLを入力する入力ボックス61、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合を入力する入力ボックス62、および、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合を指定するスクロールバー63が表示されている。
入力ボックス61、入力ボックス62、およびスクロールバー63は、それぞれ連動しており、例えば、ユーザが、入力ボックス61に「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値VLを入力すると、設定値VLから「目標とする下限の蛍光の光量」の割合が算出されて、入力ボックス62およびスクロールバー63に表示される。また、ユーザが、入力ボックス62またはスクロールバー63に、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合を設定すると、その割合から設定値VLが算出されて入力ボックス61に表示される。
レーザ走査顕微鏡13では、蛍光の光量(積算値)を、0から4095の間の値で設定することができ、図3においては、入力ボックス61には、「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値VLとして205が入力されており、設定値VLに応じて、入力ボックス62には、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合として5%が設定され、5%に応じた位置に、スクロールバー63のスライダが設定されている。
また、設定シート55には、チャンネル1のレーザ光(Ar 488/514)により励起される励起光の上限閾値VthHの設定に用いられる「目標とする上限の蛍光の光量」の設定値VHを入力する入力ボックス64、「目標とする上限の蛍光の光量」の割合を入力する入力ボックス65、および、「目標とする上限の蛍光の光量」の割合を指定するスクロールバー66が表示されている。
入力ボックス64、入力ボックス65、およびスクロールバー66は、入力ボックス61、入力ボックス62、およびスクロールバー63と同様に、それぞれ連動している。図3においては、入力ボックス64には、「目標とする上限の蛍光の光量」の設定値VHとして1600が入力されており、設定値VHに応じて、入力ボックス65には、「目標とする上限の蛍光の光量」の割合として40%が設定され、40%に応じた位置に、スクロールバー66のスライダが設定されている。
また、チャンネル1のレーザ光に対する設定と同様に、チャンネル2(CH2)のレーザ光(GRN 543)に対する設定が、入力ボックス71、入力ボックス72、スクロールバー73、入力ボックス74、入力ボックス75、またはスクロールバー76を用いて行われる。
また、レーザ走査顕微鏡13では、クレム処理において、下限閾値VthLおよび上限閾値VthHの両方を用いる他、下限閾値VthLだけを用いた処理(即ち、上限閾値VthHを超過してもシャッタ32の制御を行わない処理)、または、上限閾値VthHだけを用いた処理(即ち、下限閾値VthL未満であってもシャッタ32の制御を行わない処理)を行うことができる。設定シート55には、下限閾値VthLを用いた処理のオン/オフを切り替える切換ボタン81、および、上限閾値VthHを用いた処理のオン/オフを切り替える切換ボタン82が表示される。ユーザは、切換ボタン81および82を操作することにより、それぞれの切り替えを設定することができる。
また、図2を参照して説明したように、電圧が最小電圧VMINまで到達するか否かを判定する時刻である下限値判定時刻TthLを設定する設定値factorを入力するための入力ボックス83が表示されている。設定値factorは、例えば、1画素の露光時間Uに対して、下限値判定時刻TthLを減少させる割合より指定することができ、時刻Tstartを100%とし時刻Tendを0%とした割合が入力される。例えば、図3においては、設定値factorとして、入力ボックス83に80%と入力されている。なお、露光時間Uは、例えば、8.16μ秒に設定される。
そして、パーソナルコンピュータ14は、クレム設定画面51の入力ボックス61に入力された設定値VL(または、入力ボックス62またはスクロールバー63により設定された割合から求められる設定値VL)、および入力ボックス83に入力された設定値factorに基づいて、チャンネル1のレーザ光に対する下限閾値VthLを算出する。また、パーソナルコンピュータ14は、クレム設定画面51の入力ボックス64に入力された設定値VH(または、入力ボックス65またはスクロールバー66により設定された割合から求められる設定値VH)に基づいて、チャンネル1のレーザ光に対する上限閾値VthH(VthH=VH×a(U))を算出する。
次に、図4および図5を参照して、下限閾値VthLおよび上限閾値VthHを算出する方法について説明する。図4および図5では、図2と同様に、横軸は時刻を表し、縦軸はPMT43の受光量に応じた電気信号の電圧の積算値を表している。
例えば、パーソナルコンピュータ14は、アプリケーションソフトウェア17を実行し、図3の入力ボックス83に入力されている設定値factorと、入力ボックス61に入力されている「目標とする下限の蛍光の光量」(Intensity)の設定値VLとを用いて、下限閾値VthLを、図4に示すように、VthL=VL×a(U)×(100-factor)/100を演算することにより求める。
ここで、回路定数a(U)は、レーザ光の走査速度に応じて設定される1画素の露光時間Uや、クレム処理部28での処理の速度などの各種のパラメータを考慮して求められる定数である。また、図4において、VLnは、「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値VLを、クレム処理部28において閾値として用いる際の電圧に換算した値(閾値電圧)である。
なお、下限値判定時刻TthLにおける電圧Vnが、下限閾値VthL以下であるとき、下限値判定時刻TthLにおいてレーザ光の照射が停止され、下限値判定時刻TthLで電圧Vnを直線外挿することにより求められる出力電圧Voutnを、光の強度(Intensity)に換算した値Voutが出力される。
このように、ユーザは、クレム設定画面51(図3)に設定値VLおよび設定値factorを入力するだけで、アプリケーションソフトウェア17により下限閾値VthLが算出されて、クレム処理部28に設定される。また、設定値VLおよび設定値factorを変更した場合にも、アプリケーションソフトウェア17が自動的に下限閾値VthLを算出してクレム処理部28の設定を変更する。なお、例えば、レーザ光の走査速度が変更されて、1画素の露光時間Uが変更された場合にも、アプリケーションソフトウェア17は、その変更に応じた回路定数a(U)に基づいて自動的に下限閾値VthLを算出し、クレム処理部28
の設定を変更する。
の設定を変更する。
また、パーソナルコンピュータ14は、アプリケーションソフトウェア17を実行し、図3の入力ボックス64に入力されている「目標とする上限の蛍光の光量」(Intensity)の設定値VHを用いて、図5に示すように、上限閾値VthHを、VthH=VH×a(U)を演算することにより求める。また、図5において、VHnは、「目標とする上限の蛍光の光量」の設定値VHを、クレム処理部28において閾値として用いる際の電圧に換算した値(閾値電圧)である。
なお、電圧が上限閾値VthHとなる時刻Tnにおいてレーザ光の照射が停止され、時刻Tnで、上限閾値VthHを直線外挿することにより求められる出力電圧Voutnを、光の強度(Intensity)に換算した値Voutが出力される。
このように、ユーザは、クレム設定画面51(図3)に設定値VHを入力するだけで、アプリケーションソフトウェア17により上限閾値VthHが算出されて、クレム処理部28に設定される。また、設定値VHを変更した場合にも、アプリケーションソフトウェア17が自動的に上限閾値VthHを算出してクレム処理部28の設定を変更する。なお、例えば、レーザ光の走査速度が変更されて、1画素の露光時間Uが変更された場合にも、アプリケーションソフトウェア17は、その変更に応じた回路定数a(U)に基づいて自動的に上限閾値VthHを算出し、クレム処理部28の設定を変更する。
以上のように、レーザ走査顕微鏡システム11では、ユーザがクレム設定画面51を利用して入力した設定値に基づいて、下限閾値VthLおよび上限閾値VthHを算出することができる。
また、ユーザがクレム設定画面51を利用して設定値を変更すると、その変更に応じて下限閾値VthLおよび上限閾値VthHを自動的に算出し、クレム処理に適用することができる。例えば、ユーザは、表示される蛍光画像を見てクレム処理の効果を確認し、クレム設定画面51に対する操作を行って(例えば、スクロールバー63のスライダを動かして)設定値を変更することができ、その入力がリアルタイムに反映された画像が表示される。これにより、適切な蛍光画像を取得可能なクレム処理が行われるように、ユーザが、適宜、設定値を変更することで、試料12の劣化を抑制するとともに、適切な蛍光画像を取得することができる。
即ち、従来のレーザ走査顕微鏡では、上限および下限の閾値の設定が適切に行われないと、レーザ光による試料の損傷の抑制を効果的に行うことができなかったり、適切な蛍光画像を取得することができないことがあったが、レーザ走査顕微鏡システム11では、クレム設定画面51を利用することで、下限閾値VthLおよび上限閾値VthHを適切に設定することができ、試料12の劣化を抑制しながら適切な蛍光画像を取得することができる。
なお、例えば、クレム設定画面51では、入力ボックス61や64で指定される値は、ユーザにとってわかりやすい輝度値(Intensity)であり、このような輝度値を指定することにより、ハードウェアであるレーザ走査顕微鏡13の調整を行うことができる。また、このように輝度値の指定により取得することができる蛍光画像は、ユーザが取得したいと考えている蛍光画像、即ち、適切な蛍光画像である。
また、ユーザは、クレム設定画面51の下限閾値VthLを用いた処理のオン/オフを切り替える切換ボタン81を操作することにより、クレム処理において下限閾値VthLを用いないようにすることや、上限閾値VthHを用いた処理のオン/オフを切り替える切換ボタン82を操作することにより、クレム処理において上限閾値VthHを用いないようにすることができる。例えば、クレム処理において下限閾値VthLを用いないことで、蛍光画像のS/N比を向上させることができる。
即ち、下限閾値VthL以下の電気信号でクレム外挿処理を行う場合には、PMT43からクレム処理部28に実際に入力される入力信号は、下限閾値VthLを時刻Tend(露光時間U)で除算した値でしかなく、例えば、下限閾値VthLが最小電圧VMINの20%に設定されているとき、クレム外挿処理では、その入力信号(実際には、PMT43が受光した光量に応じた信号と、ノイズ成分とが加算された信号)を5倍に増幅する直線外挿が行われる。つまり、入力信号に含まれるノイズ成分は5倍になる。基本的に、ノイズ成分は、常に一定の割合で入力信号に含まれると考えられており、下限閾値VthLのときのノイズ成分が20mVであるとしたら、時刻Tendでのノイズ成分も20mVである。従って、クレム処理において下限閾値VthLを用いないことで、ノイズ成分が増幅されることを回避することができ、これにより、蛍光画像のS/N比を向上させることができる。
また、クレム処理において上限閾値VthHを用いない場合には、入力信号の信号レベル自体が大きく、時刻Tnでの電圧値に対して処理が行われるため、S/N比を向上させる割合は、クレム処理において下限閾値VthLを用いないときよりも低いが、同様に、蛍光画像のS/N比を向上させることができる。
このようにレーザ走査顕微鏡システム11では、電圧が最小電圧VMINまで到達しないと判定した場合、および、電圧が上限閾値VthHを超過すると判定した場合に、シャッタ32の閉鎖を指示する信号をシャッタ32に供給し、試料12へのレーザ光の照射を停止させる。ここで、レーザ走査顕微鏡システム11では、試料12に複数の異なる波長のレーザ光が照射され、それぞれのレーザ光により励起された蛍光が、蛍光検出ユニット26において検出されるため、レーザ光ごとに、試料12への照射を制御する必要がある。
次に、図6および図7を参照して、レーザ光ごとの照射の制御について説明する。
図6には、レーザ走査顕微鏡システム11を構成する各ブロックのうち、レーザ光ごとの照射の制御についての説明に必要なレーザ光源ユニット21、ステージ25、および蛍光検出ユニット26が示されている。なお、図6のレーザ光源ユニット21では、レーザ光源31aおよび31bには、シャッタ32aおよび32bがそれぞれ設けられているが、レーザ光源31cには、シャッタが設けられていない構成となっている。
図6に示すように、レーザ光源31aから照射されたレーザ光(波長:488/514nm)は、シャッタ32aを介して、ステージ25上の試料12に照射され、そのレーザ光(励起光)により励起された蛍光が、蛍光検出ユニット26のDM41aにより反射され、PMT43aが、その蛍光を受光する。また、レーザ光源31bから照射されたレーザ光(波長:543nm)は、シャッタ32bを介して、ステージ25上の試料12に照射され、そのレーザ光(励起光)により励起された蛍光が、蛍光検出ユニット26のDM41aおよび41bを透過し、PMT43bが、その蛍光を受光する。
クレム処理部28(図1)は、PMT43aが受光した蛍光の受光量に応じた電気信号に従って、シャッタ32aを制御し、PMT43bが受光した蛍光の受光量に応じた電気信号に従って、シャッタ32bを制御する。
即ち、クレム処理部28は、図7に示す論理回路に基づいて、シャッタ32aおよび32bを制御する。
図7Aに示すように、ORゲート91には、PMT43aが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが下限値判定時刻TthLにおいて下限閾値VthL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号S1Lと、PMT43aが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが上限閾値VthHを超えたと判定した結果、発生する検出信号S1Hとが入力され、ORゲート91は、検出信号S1Lと検出信号S1Hとの論理和に基づいて、シャッタ32aの閉鎖を制御する制御信号SC1を出力する。
例えば、検出信号S1Lは、PMT43aが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが、下限値判定時刻TthLにおいて下限閾値VthL未満であることを検出すると、レベルが0から1に遷移する。また、検出信号S1Hは、PMT43aが受光した蛍光の受光量を示す電圧が上限閾値VthHを超えたことを検出すると、レベルが0から1に遷移する。
従って、図7Bに示すように、検出信号S1Hより早く、検出信号S1Lのレベルが、下限値判定時刻TthLで0から1に遷移し、その結果、ORゲート91が出力する制御信号SC1のレベルは、下限値判定時刻TthLで0から1に遷移する。これにより、シャッタ32aが下限値判定時刻TthLで閉鎖され、レーザ光源31aからのレーザ光の照射が停止される。
同様に、ORゲート92には、PMT43bが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが、下限値判定時刻TthLにおいて下限閾値VthL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号S2Lと、PMT43bが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが上限閾値VthHを超えたと判定した結果、発生する検出信号S2Hとが入力され、ORゲート92は、検出信号S2Lと検出信号S2Hとの論理和に基づいて、シャッタ32bの閉鎖を制御する制御信号SC2を出力する。
検出信号S2Lおよび検出信号S2Hは、検出信号S1Lおよび検出信号S1Hと同様に遷移し、図7Bに示すように、検出信号S2Hのレベルが、下限値判定時刻TthL以降の時刻Tnで0から1に遷移すると、ORゲート92が出力する制御信号SC2のレベルは、時刻Tnで0から1に遷移する。これにより、シャッタ32bが時刻Tnで閉鎖され、レーザ光源31bからのレーザ光の照射が停止される。
ところで、試料12によっては、ある1つの波長の励起光により、異なる複数の波長の蛍光を発するものがある。
次に、図8および図9を参照して、1レーザ光により2つの波長の蛍光が発せられる場合における照射の制御について説明する。
図8には、図6と同様に、レーザ走査顕微鏡システム11のレーザ光源ユニット21、ステージ25、および蛍光検出ユニット26が示されている。図8に示すように、レーザ光源31aから照射されたレーザ光により励起された試料12からの蛍光のうち、1つの波長のものは、DM41aにより反射されてPMT43aが受光し、もう1つの波長のものは、DM41aおよび41bを透過し、PMT43bが受光する。
そして、クレム処理部28は、図9に示す論理回路に基づいて、シャッタ32aを制御する。
図9Aに示すように、ANDゲート93には、PMT43aが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが、下限値判定時刻TthLにおいて下限閾値VthL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号S1Lと、PMT43bが受光した蛍光の受光量を示す電圧Vnが、下限値判定時刻TthLにおいて下限閾値VthL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号S2Lとが入力され、ANDゲート93は、検出信号S1Lと検出信号S2Lとの論理積に基づいた出力信号をORゲート94に出力する。
ORゲート94には、ANDゲート93からの出力信号と、PMT43aが受光した蛍光の受光量を示す電圧が上限閾値VthHを超えたと判定した結果、発生する検出信号S1Hと、PMT43bが受光した蛍光の受光量を示す電圧が上限閾値VthHを超えたと判定した結果、発生する検出信号S2Hとが入力され、ORゲート94は、ANDゲート93からの出力信号、検出信号S1H、および検出信号S2Hの論理和に基づいて、シャッタ32aの閉鎖を制御する制御信号SC1を出力する。
従って、図9Bに示すように、下限値判定時刻TthLで検出信号S1Lのレベルのみが1となる場合には、シャッタ32aの制御は行われない。検出信号S1Hまたは検出信号S2Hのどちらか(図9Bの例では検出信号S1Hより早く検出信号S2H)のレベルが1に遷移する時刻Tnで、ORゲート94が出力する制御信号SC1のレベルが0から1に遷移し、これにより、シャッタ32aが時刻Tnで閉鎖され、レーザ光源31aからのレーザ光の照射が停止される。
また、図9Cに示すように、検出信号S1H及び検出信号S2Hのいずれよりも早く、検出信号S1Lのレベルが下限値判定時刻TthLで0から1に遷移し、且つ検出信号S2Lのレベルが下限値判定時刻TthLで0から1に遷移したので、ORゲート94が出力する制御信号SC1のレベルは、下限値判定時刻TthLで0から1に遷移する。これにより、シャッタ32aが下限値判定時刻TthLで閉鎖され、レーザ光源31aからのレーザ光の照射が停止される。
このように、複数の異なる波長の蛍光の光量のいずれか1つが上限閾値VthHを超過すると判定した場合、または、全てが最小電圧VMIN未満となると判定される場合に、レーザ光の照射を停止させるような制御を行うことで、ある1つの波長の励起光により、異なる複数の波長の蛍光が発せられる場合でも、適切な蛍光画像を取得することができる。
また、本明細書において、システムとは、複数の装置により構成される装置全体を表すものである。
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
Claims (9)
- レーザ光を試料に走査して画像を取得するレーザ走査顕微鏡において、
前記レーザ光の照射により励起し、前記試料から発せられる異なる波長の複数の蛍光の光量を測定する蛍光測定手段と、
前記画像の1画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての前記複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および前記画像の1画素に対応する範囲を走査する時間中に前記複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、前記レーザ光の照射を停止させる制御を、前記画像の1画素に対応する範囲を走査する時間である1画素走査時間ごとに行う照射制御手段と
を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。 - 前記蛍光測定手段は、前記異なる波長の複数の蛍光をそれぞれ受光し、光電変換する光電変換素子と、前記1画素に相当する1画素走査時間の間、時々刻々、蓄積される光電変換信号の積算値を、前記各蛍光の光量として測定する測定手段とから構成され、
前記照射制御手段は、前記積算値に基づき前記レーザ光の照射を停止させる制御を行う
ことを特徴とする請求項1に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記光電変換素子からの光電変換信号を1画素に相当する走査時間の間蓄積し、蓄積された光電変換信号に基づき、前記複数の蛍光に対応する前記試料の画像を生成する画像処理回路と、
前記積算値が前記下限値判定時刻において前記下限閾値未満である場合には、前記積算値に基づき、前記光電変換手段が前記1画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第一外挿値を外挿処理して算出し、また、同様に前記積算値が前記上限閾値を超えた場合には、前記積算値に基づき前記光電変換手段が前記1画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第二外挿値を外挿処理して算出する外挿処理手段と
をさらに備え、
前記画像処理回路は、前記第一外挿値あるいは前記第二外挿値に基づき、それぞれ前記蛍光に対応する前記画像を生成する
ことを特徴とする請求項2に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記照射制御手段は、前記下限閾値に基づく制御のオン/オフ、および、前記上限閾値に基づく制御のオン/オフをそれぞれ切り替えて制御を行う
ことを特徴とする請求項1に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記蛍光の光量が前記下限値判定時刻において前記下限閾値未満である場合には、前記蛍光の光量に基づき、前記蛍光測定手段が前記1画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第一外挿値を外挿処理して算出し、また、同様に前記蛍光の光量が前記上限閾値を超えた場合には、前記蛍光の光量に基づき前記蛍光測定手段が前記1画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第二外挿値を外挿処理して算出する外挿処理手段と、
目標とする上限の前記蛍光の光量あるいは目標とする下限の前記蛍光の光量の少なくとも一方を入力する入力手段と
を備え、
前記外挿処理手段は、前記入力手段により前記上限の蛍光の光量あるいは前記下限の蛍光の光量の少なくとも一方が入力されると、前記下限閾値あるいは前記上限閾値の少なくとも一方を逆算し、設定する
ことを特徴とする請求項1に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記蛍光測定手段は、前記蛍光を受光し、光電変換する光電変換素子と、前記1画素に相当する1画素走査時間の間、時々刻々、蓄積される光電変換信号の積算値を、前記蛍光の光量として測定する測定手段とから構成され、
前記照射制御手段は、前記積算値に基づき前記レーザ光の照射を停止させる制御を行う
ことを特徴とする請求項5に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記照射制御手段は、前記積算値が前記下限値判定時刻における前記下限閾値以上であって前記1画素走査時間の間に前記上限閾値を超えない場合には前記1画素走査時間の間、前記レーザ光の照射を停止しないよう制御する
ことを特徴とする請求項6に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記入力手段は、前記下限値判定時刻を設定すること
を特徴とする請求項5に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記入力手段は、前記下限の蛍光の光量及び前記上限の蛍光の光量をそれぞれ入力する2つの第一及び第二入力手段から構成され、
前記入力手段により入力された前記下限の蛍光の光量、前記上限の蛍光の光量をそれぞれ変更する第一及び第二変更手段を備え、
前記外挿処理手段は、前記第一及び第二変更手段により変更された前記下限の蛍光の光量及び前記上限の蛍光の光量に基づき、前記下限閾値及び前記上限閾値を逆算し、設定すること
を特徴とする請求項5に記載のレーザ走査顕微鏡。
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Cited By (3)
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---|---|---|---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000066107A (ja) * | 1998-08-18 | 2000-03-03 | Nikon Corp | 顕微鏡 |
WO2001027680A1 (fr) * | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Nikon Corporation | Microscope laser et instrument optique a balayage laser confocal |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000066107A (ja) * | 1998-08-18 | 2000-03-03 | Nikon Corp | 顕微鏡 |
WO2001027680A1 (fr) * | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Nikon Corporation | Microscope laser et instrument optique a balayage laser confocal |
JP2007500880A (ja) * | 2003-05-16 | 2007-01-18 | ユニヴェルシテイト ファン アムステルダム | 対象物の画像を形成する方法及び装置 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014206731A (ja) * | 2013-03-21 | 2014-10-30 | オリンパス株式会社 | 走査型レーザ顕微鏡 |
WO2018003069A1 (ja) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | オリンパス株式会社 | 観察支援装置および蛍光観察システム |
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WO2022230254A1 (ja) * | 2021-04-26 | 2022-11-03 | 浜松ホトニクス株式会社 | 共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法 |
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