WO2008156214A1 - フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法 - Google Patents
フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2008156214A1 WO2008156214A1 PCT/JP2008/061603 JP2008061603W WO2008156214A1 WO 2008156214 A1 WO2008156214 A1 WO 2008156214A1 JP 2008061603 W JP2008061603 W JP 2008061603W WO 2008156214 A1 WO2008156214 A1 WO 2008156214A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- gene
- flavone synthase
- amino acid
- acid sequence
- seq
- Prior art date
Links
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 title claims abstract description 95
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 title claims abstract description 92
- 241000220317 Rosa Species 0.000 title claims abstract description 82
- GCPYCNBGGPHOBD-UHFFFAOYSA-N Delphinidin Natural products OC1=Cc2c(O)cc(O)cc2OC1=C3C=C(O)C(=O)C(=C3)O GCPYCNBGGPHOBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 235000007242 delphinidin Nutrition 0.000 title claims abstract description 29
- JKHRCGUTYDNCLE-UHFFFAOYSA-O delphinidin Chemical compound [O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=C(O)C=1C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 JKHRCGUTYDNCLE-UHFFFAOYSA-O 0.000 title claims abstract description 29
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 title claims abstract description 27
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 244000047670 Viola x wittrockiana Species 0.000 claims abstract description 32
- 235000004031 Viola x wittrockiana Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108010062650 Flavonoid 3',5'-hydroxylase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000013557 Plantaginaceae Species 0.000 claims abstract description 6
- 241001293162 Torenia hybrid cultivar Species 0.000 claims abstract description 6
- 101710130467 Flavone synthase Proteins 0.000 claims description 101
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 67
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 claims description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 claims description 31
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 15
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 15
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 15
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 claims description 3
- 241000195620 Euglena Species 0.000 claims description 2
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 15
- 108091074665 OCTOPUS family Proteins 0.000 claims 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 claims 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 claims 1
- 241000736285 Sphagnum Species 0.000 claims 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 abstract description 4
- 241000960400 Torenia Species 0.000 abstract description 4
- KZMACGJDUUWFCH-UHFFFAOYSA-O malvidin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O)=C1 KZMACGJDUUWFCH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 64
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 44
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 44
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 44
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 42
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 235000009584 malvidin Nutrition 0.000 description 32
- 101150017816 40 gene Proteins 0.000 description 27
- IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N luteolin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N luteolin Natural products OC1=CC(O)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000009498 luteolin Nutrition 0.000 description 26
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 25
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 25
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 22
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 229930014669 anthocyanidin Natural products 0.000 description 21
- 235000008758 anthocyanidins Nutrition 0.000 description 21
- NWKFECICNXDNOQ-UHFFFAOYSA-N flavylium Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=C(C=CC=C2)C2=[O+]1 NWKFECICNXDNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- ARSRJFRKVXALTF-UHFFFAOYSA-N tricetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ARSRJFRKVXALTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 13
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 13
- VEVZSMAEJFVWIL-UHFFFAOYSA-O cyanidin cation Chemical compound [O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=C(O)C=1C1=CC=C(O)C(O)=C1 VEVZSMAEJFVWIL-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- XVFMGWDSJLBXDZ-UHFFFAOYSA-O pelargonidin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C(C(=C1)O)=[O+]C2=C1C(O)=CC(O)=C2 XVFMGWDSJLBXDZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 12
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 description 11
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000011957 flavonols Nutrition 0.000 description 11
- HKUHOPQRJKPJCJ-UHFFFAOYSA-N pelargonidin Natural products OC1=Cc2c(O)cc(O)cc2OC1c1ccc(O)cc1 HKUHOPQRJKPJCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000006251 pelargonidin Nutrition 0.000 description 11
- 229930015717 petunidin Natural products 0.000 description 11
- 235000006384 petunidin Nutrition 0.000 description 11
- AFOLOMGWVXKIQL-UHFFFAOYSA-O petunidin Chemical compound OC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O)=C1 AFOLOMGWVXKIQL-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 11
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 11
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 11
- HBQJTBXZMPSVBP-UHFFFAOYSA-N Cyanidine Natural products OC1=CC(=C2/Oc3cc(O)cc(O)c3C=C2O)C=CC1=O HBQJTBXZMPSVBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CMPNIWQMRYYTMK-UHFFFAOYSA-O tricetinidin Natural products [O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=CC=1C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 CMPNIWQMRYYTMK-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 9
- RRYLZZSYDRTJEL-UHFFFAOYSA-N Delphidin Natural products CCN1CC2(COC)CCC(O)C34C5CC6C(O)C5C(CC6OC)(OC(=O)C)C(C(O)C23)C14 RRYLZZSYDRTJEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 241000252229 Carassius auratus Species 0.000 description 7
- 108010076511 Flavonol synthase Proteins 0.000 description 7
- IKMDFBPHZNJCSN-UHFFFAOYSA-N Myricetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 IKMDFBPHZNJCSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 7
- 150000002216 flavonol derivatives Chemical class 0.000 description 7
- PCOBUQBNVYZTBU-UHFFFAOYSA-N myricetin Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C=2OC3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C(=O)C=2)=C1 PCOBUQBNVYZTBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000007743 myricetin Nutrition 0.000 description 7
- 229940116852 myricetin Drugs 0.000 description 7
- 241000723353 Chrysanthemum Species 0.000 description 6
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 6
- 101001018064 Homo sapiens Lysosomal-trafficking regulator Proteins 0.000 description 6
- 102100033472 Lysosomal-trafficking regulator Human genes 0.000 description 6
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 6
- 244000038561 Modiola caroliniana Species 0.000 description 6
- 235000010703 Modiola caroliniana Nutrition 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 108010091111 cytochrome P-450 CYP93B1 (Glycyrrhiza echinata) Proteins 0.000 description 6
- XCTGXGVGJYACEI-BYNFETKLSA-O Delphin Natural products O([C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(-c2cc(O)c(O)c(O)c2)[o+]c2c(c(O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)cc(O)c2)c1 XCTGXGVGJYACEI-BYNFETKLSA-O 0.000 description 5
- YYVIFBVXJYYHCW-UHFFFAOYSA-N Malvin Natural products COc1cc(cc(OC)c1O)C2=C(Cc3c(OC4OC(CO)C(O)C(O)C4O)cc(O)cc3O2)OC5OC(CO)C(O)C(O)C5O YYVIFBVXJYYHCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CILLXFBAACIQNS-BTXJZROQSA-O malvin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)=C1 CILLXFBAACIQNS-BTXJZROQSA-O 0.000 description 5
- 229940117886 malvin Drugs 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 229930015721 peonidin Natural products 0.000 description 5
- 235000006404 peonidin Nutrition 0.000 description 5
- XFDQJKDGGOEYPI-UHFFFAOYSA-O peonidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O)=C1 XFDQJKDGGOEYPI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 5
- 241001071795 Gentiana Species 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 4
- XCTGXGVGJYACEI-LCENJUANSA-O delphinidin 3-O-beta-D-glucoside-5-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=[O+]C1=CC(O)=C2)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)=CC1=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XCTGXGVGJYACEI-LCENJUANSA-O 0.000 description 4
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 description 4
- 150000002208 flavanones Chemical class 0.000 description 4
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- RDFLLVCQYHQOBU-GPGGJFNDSA-O Cyanin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(-c2cc(O)c(O)cc2)[o+]c2c(c(O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)cc(O)c2)c1 RDFLLVCQYHQOBU-GPGGJFNDSA-O 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- RDFLLVCQYHQOBU-ZOTFFYTFSA-O cyanin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=[O+]C1=CC(O)=C2)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)=CC1=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RDFLLVCQYHQOBU-ZOTFFYTFSA-O 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 3
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241000207875 Antirrhinum Species 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 2
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 2
- ZQMDJECDLYTUCE-LCENJUANSA-N Delphinidin-3,5-diglucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)OC2=CC(=O)C=C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C2=C1 ZQMDJECDLYTUCE-LCENJUANSA-N 0.000 description 2
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 2
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 2
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001479611 Iris ensata Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 241000222350 Pleurotus Species 0.000 description 2
- JMFSHKGXVSAJFY-UHFFFAOYSA-N Saponaretin Natural products OCC(O)C1OC(Oc2c(O)cc(O)c3C(=O)C=C(Oc23)c4ccc(O)cc4)C(O)C1O JMFSHKGXVSAJFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MOZJVOCOKZLBQB-UHFFFAOYSA-N Vitexin Natural products OCC1OC(Oc2c(O)c(O)cc3C(=O)C=C(Oc23)c4ccc(O)cc4)C(O)C(O)C1O MOZJVOCOKZLBQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001453 anthocyanidins Chemical class 0.000 description 2
- -1 anthocyanins Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000007336 cyanidin Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 108090001036 flavone synthase I Proteins 0.000 description 2
- 150000007946 flavonol Chemical class 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- MYXNWGACZJSMBT-VJXVFPJBSA-N isovitexin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=C(O)C=C(OC(=CC2=O)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1O MYXNWGACZJSMBT-VJXVFPJBSA-N 0.000 description 2
- OYJCWTROZCNWAA-UHFFFAOYSA-N isovitexin Natural products OCC1OC(C(O)C(O)C1O)c2c(O)cc3CC(=CC(=O)c3c2O)c4ccc(O)cc4 OYJCWTROZCNWAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 description 2
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOHGMAFQELVQRG-UHFFFAOYSA-N 1,3,8-trihydroxy-9-methoxy-7-(3-methylbut-2-enyl)-[1]benzofuro[2,3-b]chromen-11-one Chemical compound O1C2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C2=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1CC=C(C)C KOHGMAFQELVQRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YEDFEBOUHSBQBT-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroflavon-3-ol Chemical compound O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)C1C1=CC=CC=C1 YEDFEBOUHSBQBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCZVLDHREVKTSH-UHFFFAOYSA-N 4',5,7-trihydroxy-3'-methoxyflavone Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 SCZVLDHREVKTSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272878 Apodiformes Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 240000004385 Centaurea cyanus Species 0.000 description 1
- 235000005940 Centaurea cyanus Nutrition 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 101150002919 DFR gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003421 Dianthus chinensis Species 0.000 description 1
- 108010018087 Flavanone 3-dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 241000735332 Gerbera Species 0.000 description 1
- 241000791020 Gerbera hybrid cultivar Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- QYUIEHPERLKOCH-UHFFFAOYSA-N Lisetin Natural products CC(=CCc1cccc2c3C(=O)c4cc(O)c(O)cc4Oc3oc12)C QYUIEHPERLKOCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 1
- MZSGWZGPESCJAN-MOBFUUNNSA-N Melitric acid A Natural products O([C@@H](C(=O)O)Cc1cc(O)c(O)cc1)C(=O)/C=C/c1cc(O)c(O/C(/C(=O)O)=C/c2cc(O)c(O)cc2)cc1 MZSGWZGPESCJAN-MOBFUUNNSA-N 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000229722 Perilla <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 235000004348 Perilla frutescens Nutrition 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 244000154511 Rosa hybrid cultivar Species 0.000 description 1
- 235000002315 Rosa hybrid cultivar Nutrition 0.000 description 1
- 235000010295 Rosa x kordesii Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 241000220221 Rosales Species 0.000 description 1
- 240000007313 Tilia cordata Species 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 235000007212 Verbena X moechina Moldenke Nutrition 0.000 description 1
- 240000001519 Verbena officinalis Species 0.000 description 1
- 235000001594 Verbena polystachya Kunth Nutrition 0.000 description 1
- 235000007200 Verbena x perriana Moldenke Nutrition 0.000 description 1
- 235000002270 Verbena x stuprosa Moldenke Nutrition 0.000 description 1
- 241000405217 Viola <butterfly> Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- UOSZQIQUCYTISS-UHFFFAOYSA-N chrysoeriol Natural products C1=C(O)C(C)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 UOSZQIQUCYTISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150027734 cript gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- AYVZVUMKUBCNQZ-UHFFFAOYSA-N delphinidin 3,5-diglucoside Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)COC1=C(Oc2cc(O)cc(OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO)c2C1)c3cc(O)c(O)c(O)c3 AYVZVUMKUBCNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFNDMZIBVDSQFI-UHFFFAOYSA-N delphinidin chloride Chemical compound [Cl-].[O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=C(O)C=1C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 FFNDMZIBVDSQFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- SBHXYTNGIZCORC-ZDUSSCGKSA-N eriodictyol Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)O)=CC=C(O)C(O)=C1 SBHXYTNGIZCORC-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- TUJPOVKMHCLXEL-UHFFFAOYSA-N eriodictyol Natural products C1C(=O)C2=CC(O)=CC(O)=C2OC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 TUJPOVKMHCLXEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011797 eriodictyol Nutrition 0.000 description 1
- SBHXYTNGIZCORC-UHFFFAOYSA-N eriodyctiol Natural products O1C2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 SBHXYTNGIZCORC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 101150096282 fls gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013531 gin Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002659 luteolin Chemical class 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- PXDJXZJSCPSGGI-UHFFFAOYSA-N palmityl palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PXDJXZJSCPSGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
Definitions
- the present invention relates to a rose artificially containing flavones and delphinidin.
- the present invention relates to gene manipulation.
- It also relates to a method for modifying the rose flower color by co-pigmentation effect caused by the inclusion of flavones and delphinidin, especially for changing the flower color to blue direction. .
- Flaponoids are typical secondary metabolites of plants and have the basic skeleton of C6C3C6, as shown below, and are synthesized from phenylalanine and malonyl CoA. Depending on the oxidation state of the C ring, it is classified into flavones and flavonols.
- Lisetin Frapo / I Frapon Flaponoid absorbs ultraviolet rays and removes radicals, so it was thought that it originally had a function to protect plants from various stresses. In recent years, it has also attracted attention as a healthy ingredient (see Harborne and Williams 2000 Phytochemistry 55, 481-504).
- anthocyanidin has (1) Pelargoni, which is often found in orange to red flowers. Gin (pela rgonidin), (2) Cyanidin (cyan id in) and Peonidin ( P eonidin), which are common in red to red flowers, and (3) Delphinidine (del ph in id, which is common in purple to blue flowers) in), petunidin (pe tun id in) and malvidin are common.
- anthocyanin has a great influence on its color. Blueness increases as the number of hydroxyl groups on the B ring of anthocyanin increases. Therefore, Delphi dicin-type anthocyanins are blue compared to pelargonidin-type anthocyanins and cyanidin-type anthocyanins.
- the biosynthesis of flavonoids, including anthocyanins, is well preserved across plant species. Flaponoids are biosynthesized in the cytoplasm, added to the sugar and acyl groups, then transported to the vacuole and accumulated (Tanaka et al. 005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, Tan 24, and Tanaka and Brugl iera 2006 A inswor th, Flowering and its manipul at ion, pp. 201-239, Blackwel 1 Publishing Ltd.).
- the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase (hereinafter abbreviated as "F3'5'H") gene required to synthesize delphinidin.
- F3'5'H flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase
- delphindine is produced by expressing, and a blue flower that does not occur naturally is produced (see Tanak a 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283-291).
- This method of artificially modifying plant metabolism is sometimes called metabolic engineering.
- the enzyme gene that produces the target substance may be expressed in a recombinant plant.
- the target gene often competes with the endogenous enzyme of the plant itself. In many cases, the accumulation of substances does not occur at all or hardly, and it does not result in industrially useful traits.
- Petunia hybrida cannot accumulate peralgondin due to its specificity for dihydroflavonol reductase (DFR), so orange flower varieties naturally exist. do not do.
- DFR dihydroflavonol reductase
- Anthocyanins turn blue due to intramolecular pigment action as the number of aromatic acyl groups attached increases.
- Anthocyans with two or more aromatic acyl groups are called polyacylated anthocyanins and have a stable blue color (see Harborne and Williams 2000 phytochemistry 55, 481-504).
- anthocyanin pigment which is an essential pigment
- the color of the flower changes depending on the coexisting flavonoids (also called pigments), metal ions, and the pH of the vacuole.
- flavonol flavonol is a typical copy pigment, and has the effect of making anthocyanins blue and dark by stacking them in an anthocyanin and sandwich shape (Goto (1987) Prog Chem. Org. Natl.
- flavone is a colorless auxiliary pigment component.
- isovitexin isov i texin
- isovitexin exerts a copimentation effect on anthocyanins in Japanese gardeniris (Iris ensata Thunb.) And makes the color blue.
- Isovitexin has also been shown to stabilize the color of flowers of cornflower by stabilizing anthocyanins.
- flavones often show a stronger pigmentation effect than flavonols.
- the analysis of gene recombination indicates that flapones have a stronger copigment effect than flavonols (see Fukui et al. Phytochemistry, 63, 15-23, 2003). Therefore, the accumulation of flavones is important to make the flower color blue. However, not all plants can produce flavones.
- Flavon is synthesized from flavanone by a reaction catalyzed by flavone synthase.
- Flavone synthase I is a 2-oxoglycolate-dependent dioxygenase (Britsch et al. (1981) Z. Na turforsch 36c PP. 742-750, and Britsch (1990) Arch. Biochem. Biophys.
- flavone synthase II is a cytochrome P450 type monooxygenase.
- the structural genes of flavone synthase II are trenia, goldfish, perilla (Perilla frutescens), gerbera (gerbera hybr ida), and gentian. (See Tanaka and Brugl iera 2006 Ainsworth, F lowering and its mani ul at ion pp.201-239, Blackwel 1 Publishing Ltd.).
- flavone synthase gene When the flavone synthase gene is expressed in a transgenic plant that does not produce flavones, flavones are expected to be synthesized. However, there was a report that when the flavone synthase gene of Trenia was expressed in petunia, the color of the dark blue-purple flower faded (Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004). In addition, when a flavone synthase gene derived from linden was expressed in tobacco, flavones were synthesized, but there was also a report that the color of the flower was still light (Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breeding 17: 91-99).
- the flower color does not necessarily turn blue.
- factors that do not show the pigment effect include an inappropriate amount and ratio of anthocyanins and flavones, and an inappropriate modification of anthocyanins and flavones with sugar or acyl groups.
- Roses are the most popular flowering plant and have been cultivated since BC.
- artificial breeding has been done for hundreds of years.
- roses containing pelargonidin, cyanidin, flavonol and some flavonoids were obtained.
- roses that produce delphinidin which is not found in natural roses, have also been made using genetic engineering techniques.
- any gene of another species can be introduced into an arbitrary plant, such as a rose, and given a new ability to that plant.
- a plant such as a rose
- X-rays can be used to determine whether the introduced gene functions or not. It is known that it depends greatly on the promoters to be used.
- flavone synthase gene In order to synthesize flavones in roses, it can be easily analogized that the flavone synthase gene should be expressed, but dioxygenase Since it is not easy to infer which type of flavone synthase of type C or cytochrome P450 should be expressed, and what flavone synthase gene of plant origin should be expressed, trial and error Required.
- the copigment effect is a phenomenon that occurs when anthocyanins and flavones and flavonols coexist in the vacuole at a certain concentration. It has also been clarified that pigment flavones and flavonols need to be modified with more suitable glycosylation (Nature. 2005 Aug 11; 436 (7052): 791, and Nature, 358 , 515-518 (1992)).
- anthocyanins and flavones • flavonols must have an optimal structural combination for the desired color development, and how modified anthocyanins and flavones' flavonols can coexist. Trial and error will also be required in terms of what should be done. Furthermore, even if the flavone synthase functions in roses, flavanones such as naringenin are hydroxylated quickly by flavanone 3-hydroxylase (hereinafter abbreviated as “F3H”) in natural roses. Flavones are not always synthesized from roses.
- the present invention seeks to provide a rose containing a pigment suitable for the desired color development in the rose.
- the present inventor has found that the target color tone expression can be achieved by artificially containing flavone and delphidinidine as a result of various studies, and the present invention has been completed. Specifically, the present invention is as follows:
- a rose characterized by containing flavones and delphidinidine by genetic recombination techniques. 2. The rose according to 1 above, wherein the flavone is produced by expressing an introduced flavone synthase gene.
- a flavone synthase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (2) a flavone synthase having an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and substitution with Z or other amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
- Flavonoids 3 ′, 5′-hydroxylase encoded by a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a nucleic acid that is hyper-hybridized under high stringency conditions
- Flavone synthase genes and flavonoids 3 ', 5'-hydroxylation The rose according to any one of 2 to 9, wherein the flower color is changed as compared with the host before the introduction of the enzyme gene.
- the change in flower color is the hue angle in the L * a * b color system chromaticity diagram.
- a rose J refers to the generic name of an ornamental plant that is a deciduous shrub of the order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa. It is not intended to be limited to specific varieties, and means the whole plant or the part that usually contains flowers.
- high stringency conditions includes, for example, 6 XSSC (composition of 1 XSSC: 0.15 MN a C 1, 0.015 sodium kennate, pH 7.0) and 0.5% SDS, 5X Denhardt, lOO xg Zml l Denatured fragmented salmon sperm DNA and 50% formamide in solution containing antisense strand and nucleic acid of interest 5 5 Incubate overnight at ° C and refer to conditions such as 0.1 XSSC and washing under conditions such as no or 60 ° C and above. A condition that no longer exists.
- hue angle ( ⁇ ) in the L * a * b color system chromaticity diagram, as used in this document, was standardized by the International Certification Commission (CIE) in 1966.
- CIE International Certification Commission
- the color of the flower can be expressed by using this hue angle and the data of the color chart of RH S (Royal Horticultural Society).
- perilla-derived flavone synthase II gene was introduced together with pansy-derived F3 ′ 5′H gene and the like.
- flavones were not detected in roses introduced with perilla-derived flavone synthase II gene, indicating that this gene does not function in roses.
- flavones were detected in roses introduced with the gene for flavone synthase II derived from trenia or goldfish, and it was found that the flavone synthesis gene functions in roses.
- the enzymes related to the present invention are typically enzymes having a specific amino acid sequence described in the sequence listing. However, in an enzyme, the desired enzyme activity is maintained even if the amino acid sequence is modified not only in a specific, for example, native amino acid sequence, but also in a region other than the region involved in the enzyme activity. Is well known.
- the enzymes of the present invention have an amino acid sequence modified by addition, deletion and substitution with one or several amino acids and substitution with Z or other amino acids to the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO: And has a protein that maintains the original enzyme activity and an amino acid sequence that has 90% or more sequence identity to the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO., And maintains the original enzyme activity.
- proteins are also included in the enzyme of the present invention.
- a nucleic acid that hybridizes to the gene under highly stringent conditions is likely to encode an enzyme having the same activity as the enzyme.
- a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions and having the desired enzyme activity is also included in the enzyme of the present invention. Accordingly, examples of the enzyme gene involved in the present invention include the following.
- a flavone synthase having an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and substitution with Z or other amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A flavone synthase having an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and substitution with Z or other amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
- Anthocyanins were first prepared in order to simulate the pigment effect of flavones on anthocyanins. Cyan in was extracted from the petals of the rose variety “Rote Rose” (rose cv. "Rote Rose”) and purified. Delphin is a pigment extracted from the petals of the Verbena variety “Tapien Violet” (Tapien Violet or vberbena variety Sunmaref T PV ⁇ Tapien Violet ”) ⁇ Tapien” is a Trade Mark registered in Japan)). Alkaline hydrolysis followed by purification Malvin and Luteolin 7-0-glucos ide are Funakoshi shares Purchased from the company.
- Example 2 (Reference example): Introduction of pansy F3 '5' H # 40 gene and perilla flavone synthase gene into rose variety "Lavande"
- PYFS3 a plasmid containing the perilla-derived flavone synthase gene described in JP-A-2000-279182, digested with Xbal, blunt-ended, and further digested with BamHI to obtain an approximately 1.8 kb perilla flavone synthase gene fragment Got.
- PSPB906 described in W02005 / 017147 was digested with Xhol, blunt-ended, and further digested with BamHI. Between this blunt end and the BamHI cleavage site, the above-mentioned perilla flavone synthase gene fragment was inserted to obtain 906-pY FS3.
- 906- pYES3 are those having a flavone synthase gene derived from perilla between E1 2 35S promoter and D8 evening monomodal Isseki one (both described in W02005 / 017147).
- -P3B5 was the plasmid inserted with the F3 '5'# 40 gene fragment.
- PSPB1310 was defined as a vector in which the expression cassette of F3 '5' H # 40 gene and the expression cassette of perilla flavone synthase were linked in the same direction. This plasmid is constitutively expressed in plants in the pansy F3'5 ⁇ # 40 gene and perilla flavone synthase gene.
- the PSPB1310 produced in this way was introduced into a mauve rose variety “Lavande”, and 55 open polymorphism transformants were obtained. Of the 50 individuals subjected to the dye analysis, 49 were able to confirm the accumulation of delphinidin, with a delphidinidine content of up to 70% (26% on average). However, no flavones were detected, suggesting that perilla-derived flavone synthase genes do not function in rose cells.
- De 1 Delphidinidine, Cya: Cyanidine, Pe 1: Pelargonid, M: Myricetin, Q: Quercetin, K: Kenferrol, Tri: I cetin, Lut: Luteolin, Ap i: Apigenin
- -PSPB575 was a plasmid in which a fragment of the F3 '5' H # 40 gene was inserted.
- Ascl site an approximately 3.3 kb Trevan flavone synthase gene expression cassette obtained by digesting the above-mentioned 906-426 with Ascl was inserted.
- PSPB 1309 a vector in which the F3 ′ 5 ′ M40 gene expression cassette and the flavone synthase expression cassette were linked in the same direction was designated as PSPB 1309.
- This plasmid is constitutively expressed in plants in terms of pansy F3 '5'H # 40 gene and trenia flavone synthase gene.
- PSPB1309 produced in this way was introduced into a mauve rose variety “Lavande” to obtain 50 transformants.
- 36 were able to confirm the accumulation of delphinidin, with a delphidinidine content of up to 45% (average 12%).
- accumulation of flavones was confirmed in 35 individuals by the action of the trenia-derived flavone synthase gene. The total amount of flavones was the highest, with a high content of 1.68 mg per lg fresh petal weight.
- M Milysetin
- Q Quercetin
- K Kenferrol
- Tri Tricetin
- Lut Luteolin
- Api Apigenin
- the pSPB 1309 described in Example 3 was introduced into salmon-pink rose variety “WKS124” (salmon-pink rose variety “WKS124”) to obtain 40 transformants. Delphinidin accumulation was confirmed in 26 of the 27 individuals subjected to dye analysis, with a delphidinidine content of up to 96% (average 81%). On the other hand, accumulation of flavones (tricetin, luteolin, and apigenin) was confirmed in 26 individuals by the action of the trenia-derived flavone synthase gene. The total amount of flavones was the highest, with a high content of 4.41 mg per lg fresh petal weight.
- the cMA encoding the rose flavonol synthase described in Tanaka et al. is a plasmid vector pBluescript II SK.
- the resulting fragment is partially digested with Hindi II and then digested with Sacl.
- a fragment derived from about 0.85 kb upstream of the roseflavonol synthase cDNA was obtained.
- pRFLS was cleaved with BamHI at the multicloning site of the vector and Hind II I present in the flavonol synthase cDNA to obtain a fragment derived from about 0.6 kb upstream of the roseflavonol synthase cMA.
- the Qualcomm-derived flavone synthase gene ANFNS2 described in JP-A-2000-279182 is excised from BamHI and Xhol from the vector pBluescript II, and the PSPB906 described in W02005 / 017147 is digested with BamHI and Xhol. It was linked to the evening miner.
- This is called p SPB577.
- p SPB908 is obtained by inserting the Qualcomm flavone synthase expression cassette fragment obtained by cleaving p SPB577 with Ascl into the Ascl site of P SPB575 as described in Example 2.
- the PSPB908 obtained in this way was partially digested with Ascl, and a double-stranded RNA expression cassette derived from the approximately 3.5 kb roseflavonol synthase cDNA obtained by digesting pSPB1402 with Ascl was added here. I entered.
- the obtained plasmid P SPB 1403 is a binary-vector in which double-stranded RNA expression cassettes of pansy F3 ′ 5′H # 40, goldfish FNS gene, and rose FLS gene are linked in the same direction.
- This plasmid constitutively expresses F3 '5' H # 40 gene gene and goldfish flavone synthase gene in plants, and further suppresses the expression of endogenous flavonol synthase gene by RNAi method. Designed.
- PSPB 1403 was introduced into the mauve rose cultivar "Lavande" and 82 transformants were obtained. Of the 82 individuals subjected to the dye analysis, 64 individuals were able to confirm the accumulation of delphidin, and the delphidinidine content was 72% at maximum (average 19 %) Met. On the other hand, the accumulation of flavones (tricetin, luteolin, and apigenin) was confirmed in 70 individuals by the action of the flavone synthase gene derived from goldfish. The total amount of flavones was the highest, with a high content of 2.50 mg per lg fresh petal weight.
- PSPB1403 described in Example 5 was introduced into a salmon pink rose variety “WKS124” to obtain 20 transformants.
- Delphidinidine accumulation was confirmed in all 20 individuals subjected to dye analysis, with a maximum delphidinidine content of 89% (average 55%).
- flavone flavone (luteolin, apigenin) was confirmed in all 20 individuals by the action of the flavone synthase gene derived from goldfish. The total amount of flavones is the highest
- the fresh petal weight was as high as 1.26 mg per lg.
- PSPB 1309 described in Example 3 was treated with Pacl, and present in the vicinity of the ligation site between the Torenia-derived flavone synthase expression cassette and the pansy-derived F3 '5'H # 40 gene expression cassette (more precisely, Pancreatic F3 '5'H # 40 gene by cleaving the Pacl site and the Pacl site in the multicloning site of the vector.
- the expression cassette was cut out.
- the binary vector pSPB 1530 having the methyltransferase gene expression cassette described in W02003-062428 was cleaved with Pacl, and the above pansy F3'5'H # 40 expression cassette was methylated. Group transfer It was inserted in the same direction as the enzyme gene expression cassette. This plasmid is called TM T-BP40.
- PSPB 1309 was cleaved with Ascl to cut out the flavone synthase-expressing cassette of Trelia. This was inserted into the Ascl site of TMT-BP40 in the same direction as these expression cassettes, and the resulting plasmid was designated as pSFL535. This plasmid constitutively expresses pansy F3 '5'H # 40 gene, trenia methyltransferase gene and trenia flavone synthase gene in plants.
- the PSFL535 thus obtained was introduced into a salmon pink rose variety “W KS124” to obtain 173 transformants.
- 98 transformants that were analyzed for anthocyanidins 88 were able to confirm the accumulation of malvidin (anthocyanidins methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin), and rose petal-derived F3 '
- the product showed that the 5 'H # 40 gene and the anthocyanin methyltransferase gene from Trenia are functioning.
- the maximum malvidin content was 84% (average 50%).
- flavones ⁇ lysine, luteolin, and apigenin
- the total amount of flavones was highest, with a high content of 4.58 mg per lg fresh petal weight.
- methylated tricetin was detected in 51 individuals.
- Example 8 Introduction of Pansy-derived F3 '5' H _ # 40 gene, ⁇ Lennia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived An ⁇ cyanine methyltransferase gene into rose variety "Lavande"
- PSFL535 described in Example 7 was introduced into a mauve rose variety “Lavande” to obtain 130 transformants.
- 37 were able to confirm the accumulation of malvidin (anthocyanidins methylated at the 3 'and 5' positions of delphidin), and rose petal derived F3 '
- the product showed that the 5 'H # 40 gene and the trenia derived anthocyanin methyltransferase gene were functional.
- the maximum malvidin content was 55.6% (average 20.5%).
- flavones ⁇ -lysetin, luteolin, and apigenin
- the total amount of flavones was highest, with a high content of 5.11 mg per lg fresh petal weight.
- methylated tricetin or luteolin was detected in 20 of the transformants producing flavones.
- Example 9 Introduction of Pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, Trenia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene into rose variety "WKS82"
- the pSFL535 described in Example 7 was introduced into a mauve rose variety “WKS82” to obtain 250 transformants. 7 110 of the 232 transformants that were analyzed for tocyanidine were able to confirm the accumulation of malvidin (3 'and 5' methylated anthocyanidins) in the rose petals. The product showed that the derived F3 '5' H # 40 gene and the Torenia-derived anthocyanin methyltransferase gene are functioning. The maximum content of malvidin was 65.2% (average 19.7%).
- flavones ⁇ lysine, luteolin, and apigenin
- the total amount of flavones was the highest, with a high content of 4.71 mg per lg fresh petal weight.
- tricetin or luteolin methylated in 80 individuals was detected.
- Example 10 Introduction of Pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, Trenia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene into rose variety "WKS140"
- PSFL535 described in Example 7 was introduced into a mauve rose variety “WKS140” to obtain 74 transformants.
- 74 transformants that were analyzed for anthocyanidins, 20 were able to confirm the accumulation of malvidin (anthocyanidins methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin), and pansy in rose petals.
- the product showed that the F3 '5 ⁇ # 40 gene from origin and the anthocyanin methyltransferase gene from Trenia are functioning.
- the maximum malvidin content was 51.3% (average 33.5%).
- flavones ⁇ -lysine, luteolin, and apigenin
- the total amount of flavones was the highest, with a high content of 3.04 mg per lg fresh petal weight.
- methylated tricetin or luteolin was detected in 20 of the transformants producing flavones.
- Example 1 Propagation of flavone and malvidin to progeny
- One pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, Trenia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were introduced Cross between genetically modified roses and cultivated roses
- Example 1 2 Propagation of flavone synthesis ability to progeny
- Rose variety "WKS124” introduced with pansy-derived F3 '5' H # 40 gene and trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene, and pansy-derived F3 '5'H # 40 gene and trenia-derived flavone synthase gene Crossing the rose variety "Lavande"
- Hue angle (hue): In the L * a * b * color system, the axis of a * (red direction) is assumed to be 0 °, and the position of the color can be found from the angle moved relative to the counterclockwise hue. What I did. If it is 90 °, it means yellow, 180 ° means green, 270 ° means blue, and 0 ° ( 360 °) means red. That is, the closer the value is to 270 °, the bluer the hue. Industrial applicability
- roses which are popular flowering plants as ornamental plants, are changed in a blue direction by the pigmentation effect by adding flavones and delphinidin by genetic recombination techniques. Can be made. Roses with blue flowers are expected to be in demand as ornamental plants.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含むことを特徴とするバラを提供する。当該フラボン及びデルフィニジンは、典型的には、それぞれ、導入されたフラボン合成酵素遺伝子及びフラボノイド3', 5'−水酸化酵素遺伝子の発現によって生成される。前記フラボン合成酵素遺伝子は、例えば、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子であり、具体例として、ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子、及びゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子である。また、フラボノイド3', 5'−水酸化酵素遺伝子は、例えば、パンジー(Viola xwittrockiana)由来のフラボノイド3', 5'−水酸化酵素遺伝子である。
Description
フラボン及びデルフィ二ジンを含むバラ及びその生産方法
技術分野
本発明は、 フラボン（flavone)及びデルフィ二ジン（delphinidin) を人為的に含有させたバラ （a rose)に関する。 本発明は、 遺伝子操 明
作によりフラボン及びデルフィ二ジンを含めることにより生ずるコ ピグメンテ一ション効果（co- pigm田entation effect)によりバラの花 色を改変する方法、 特に花色を青色方書向に変化させる方法にも関す る。
背景技術
花は植物の生殖器官であり次の世代となる種子を生産するために 必要である。 種子を形成するためには花粉がめしべに付着し、 受精 することが必要である。 通常花粉の運搬は、 蜂や蝶などの昆虫や、 ハチドリ、 まれにはコゥモリにより行われる。 花弁の役割は花粉を 運ぶこれらの生物を魅了することにあり、 植物はそのために、 花の 色や形、 模様に工夫を凝らしている。
花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、 古 くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。 しかしながら 、 ひとつの植物種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、 たとえば 、 交配により作製されたバラ （rose (Rosa hybrida))、 力一ネーショ (carnat ion (Dianthus caryop yl lus) ) キク (chrysanthemum (Chr ysanthemum moriiolium))、 ユリ （1 i ly (Li 1 ium SPP. ) )などには紫力 ら青の品種がなく、 ハナショウプ（Japanese garden iris (Iris ens ata thumb. ))やリンドウ（gent ian (Gent iana tr i flora) )には鮮やか
な赤い品種はない。
花色のうち、 淡い黄色から赤色、 青色はフラポノイ ド （ilavonoid )及びアントシァニン（anthocyanin) (フラポノィ ドに属する有色配 糖体） に由来することが多い。 フラポノイ ドは植物の代表的な二次 代謝物で、 以下に示すように、 C6C3C6の基本骨格をもち、 フエニル ァラニンとマロ二ル CoAから合成される。 C環の酸化状態により、 フラボン、 フラポノール（flavonol)などに分類される。
卜リセチン フラポ /一 フラポン フラポノイ ドは、 紫外線を吸収したり、 ラジカルを除去したりす るので、 もともとは植物体を様々なストレスから保護する機能を担 つていたと考えられる。 また健康によい成分としても近年注目され ている （Harborne and Williams 2000 Phy tochemi s t ry 55, 481-504 参照）。
有色のアン卜シァニンには、 数百分子種が知られているが、 以下 に示すように、 その発色団であるアントシァニジン（anthocyanidin )には、 （ 1 ) オレンジ色から赤色の花に多いペラルゴ二ジン（pela rgonidin)、 （ 2) 赤色から紅色の花に多いシァニジン（cyan id in) 及びぺォニジン（Peonidin)、 並びに （ 3) 紫から青色の花に多いデ ルフィ二ジン（del ph in id in)、 ペチュニジン（pe tun id in)及びマルビ ジン（malvidin)の 6種が一般的である。
ペラ Jレゴニジン
アントシァニンの構造はその色に大きな影響を与える。 アントシ ァニンの B環の水酸基数が増えると青みが増す。 従って、 デルフィ 二ジン型アン トシァニンは、 ペラルゴ二ジン型アントシァニン、 シ ァニジン型アントシァニンに比べ青い。 アントシァニンを含むフラ ポノイ ドの生合成は、 植物種を超えてよく保存されている。 フラポ ノイ ドは細胞質で生合成され、 糖やァシル基が付加した後に、 液胞 へと輸送され蓄積される （Tanaka et al. 005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 卜 24、 及び Tanaka and Brugl iera 2006 A inswor th 編、 Flowering and its manipul at ion、 pp.201-239, Bla ckwel 1 Publ ishing Ltd.参照）。
生合成に関わる酵素の構造遺伝子はすべてクローニングされてい る。 組換え植物を作製できれば、 これらの遺伝子の発現を人為的に 調整することにより花で蓄積するフラポノィ ドの構造と量を改変し 、 花色を変えることができる （Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Ti ssue and Organ Culture 80, ト 24、 及び Tanaka and Brugl iera 20
06 Ainswor th 編、 Flowering and its manipulat ion pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。 たとえば、 花弁でデルフィ二 ジンを生産できないカーネーションゃバラにおいて、 デルフィニジ ンを合成するために必要なフラポノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素 （以下 、 「F3' 5'H」 と略す。 ） 遺伝子を発現させることにより、 デルフィ 二ジンを生産させ、 自然にはない青い花を作製した例がある （Tanak a 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283 - 291参照）。
このように植物の代謝を人為的に改変する方法は代謝工学と呼ば れることがある。 代謝を改変し、 目的の物質を蓄積させるためには 、 目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させ ればよいが、 しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、 目的の物質の蓄積がまったく、 あるいはほとんど起こらず、 産業上 有用な形質を持つに至らないことも多い。
たとえば、 ペチュニア（Petunia hybrida)はそのジヒ ドロフラポ ノール還元酵素 （以下、 「DFR」 と略す。 ） の特異性のためにペラ ルゴンジンを蓄積できず、 したがってオレンジ色の花色の品種は天 然には存在しない。
バラなどの DFR遺伝子を導入することによりペラルゴ二ジンを蓄 積させたオレンジ色のペチュニアが報告されているが、 ペラルゴ二 ジンを蓄積させるためには、 DFRと競合するフラボノィ ド 3'-水酸化 酵素 （以下、 「Π'1ϋ と略す。 ） 、 F3' 5'H、 フラポノール合成酵素
(以下、 「FLS」 と略す。 ） の遺伝子が欠損しているペチュニア品 種を用いる必要があり、 これらが欠損していないペチュニアにバラ の DFR遺伝子を導入しても表現型の変化は認められない （Tanaka an d Brugl iera 2006 Ains orth 編、 Flowering and its manipul at io n、 pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。 したがって目 的の遺伝子を単に導入するだけで目的の化合物が蓄積し表現型があ
らわれるかどうかは予想できない。
さらに、 代謝工学においては予想外の結果が出ることも多い。 た とえば、 トレニァ（Torenia hybrida)においてフラボン合成酵素遺 伝子の発現を抑制したところ、 フラボン量が減少し、 フラバノン（f lavanone)の蓄積が見られた。 フラパノンが蓄積すればァントシァ ニン量は増加するはずであるが、 実際にはアントシァニン量も減少 した （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002) 。 こ のように代謝物の増減を予想することは困難で目的の表現型を得る ためには鋭意工夫が必要である。
また、 アントシァニンは結合する芳香族ァシル基の数が増えると 分子内コピグメント作用により青くなる。 2つ以上の芳香族ァシル 基をもつアントシアンはポリアシル化アントシァニンと呼ばれ、 安 定な青い色を呈する （Harborne and Williams 2000 phytochemistr y 55, 481 - 504参照） 。
必須色素であるアントシァニン色素自体の構造によるほか、 共存 するフラポノイ ド （コピグメントともいう） や金属イオン、 液胞の p Hなどによっても花の色は変化する。 たとえば、 フラボンゃフラ ポノ一ルは、 代表的なコピグメン卜で、 アントシァニンとサンドィ ツチ状に積み重なることにより、 アン卜シァニンを青く し、 濃く見 えるようにする効果がある （Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl.
Prod. 52参照） 。 この点で、 フラボンは無色の補助色素成分であ るといえる。 たとえばフラボンの一種であるイソビテキシン （isov i texin) はノ、ナショゥフ (Japanese gardeniris (Iris ensata Thunb . ))においてアントシァニンに対しコピグメント効果を発揮し、 色 を青くする。 また、 イソビテキシンはアントシァニンを安定化する ことによりハナショウブの花の色を安定化することも示されている
(Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 卜 5参照） 。
また、 フラポンはフラポノールよりも強いコピグメント効果を示 す とが多い。 たとえば遺伝子組換え力一ネーションの解析ではフ ラポンがフラボノールよりもコピグメン卜効果が強いことが示され て る (Fukui et al. Phytochemi s t ry, 63, 15-23, 2003参照） 。 したがって、 フラボンの蓄積は花の色を青くするために重要である しかしな力 sら 、 すべての植物がフラボンを生産できるわけではな
< 、 バラやペチュニァなどはフラボンを蓄積しないことが知られて いる 。 また、 フラボンは、 花色以外に、 紫外線の吸収、 さまざまな ス 卜レス、 他の微生物との相互作用などにも関与しており、 フラポ ンを合成させるしとにより新しい形質を持った植物を得ることがで きることも知られている （フラボン合成酵素をコードする遺伝子に 関する特許文献として、 特開 2000-279182を参照のこと）。 しかしな がら、 バラにおいてフラボンを発現させた例は未だ知られていない フラボンはフラボン合成酵素が触媒する反応によりフラバノンか ら合成される。 すなわち、 ァピゲニン（apigenin)はナリ ンゲニン（n aringenin)から、 ルテオリ ン Uuteol in)はエリオジクチオール（er i odictyol)から、 卜リセチン（trice t in)はペン夕ヒ ドロキシフラバ ノンから合成される。 フラボン合成酵素には、 フラボン合成酵素 I とフラボン合成酵素 IIの 2種類がある。 両者は同じ反応を触媒する が、 異なるタイプの酵素である。 フラボン合成酵素 Iは 2-ォキソグ ル夕ル酸依存的なジォキシゲナ一ゼ （Britsch et al. (1981) Z. Na turforsch 36c PP. 742-750, 及び Britsch (1990) Arch. Biochem . Biophys.282 pp. 152- 160参照） の 1種であり、 フラボン合成酵素 IIはチトクローム P450型のモノォキシゲナーゼである。 フラボン合 成酵素 IIの構造遺伝子は、 トレニァ、 キンギヨソゥ、 シソ （Perilla frutescens)、 ガ一ベラ （gerbera (Gerbera hybr ida) )、 リンドウな
どから得られている （Tanaka and Brugl iera 2006 Ainsworth 編、 F lowering and its mani ul at ion pp.201-239, Blackwel 1 Publish ing Ltd.参照）。
フラボン合成酵素遺伝子を、 フラボンを生産しない遺伝子組換え 植物において発現させると、 フラボンが合成されることが予想され る。 しかしながら、 ペチュニアにおいてトレ二ァのフラボン合成酵 素遺伝子を発現させたところ、 濃い青紫色の花の色が薄くなつたと の報告もある （Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004) 0 また、 リ ンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで 発現させたところ、 フラボンが合成されたが、 やはり花の色は薄く なったとの報告もある （Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breed ing 17:91-99) 。 このように、 フラボンが合成されても必ずしも花 色は青くならない。 言い換えれば、 コピグメント効果を示さない原 因として、 アントシァニンとフラボンの量や比が適切でないことや 、 アントシァニンとフラボンの糖やァシル基による修飾が適切では ないことなどが挙げられる。 これらの結果から、 単にフラボン合成 酵素遺伝子を発現させフラボンを蓄積させるだけでは花の色をより 青くすることはできないという ことが示唆される。
バラは最も人気のある花卉植物であり、 紀元前から栽培されてい た記録がある。 また、 数百年にわたり人為的な品種改良がされてき た。 その結果、 ペラルゴ二ジン、 シァニジン、 フラポノールといつ たフラボノイ ドを含むバラが得られている。 また、 近年では遺伝子 組換えの手法を用いて、 自然のバラにはないデルフィ二ジンを生産 するバラも作られている。 しかしながら、 フラボンを蓄積するバラ は、 交配によっても遺伝子組換えによっても未だ得られていない。 発明の開示
植物の品種改良に遺伝子組換えの手法を用いることの最大の利点 は、 交配による品種改良と異なり、 交配することができない植物や 他の生物の遺伝子を利用して植物を改良できることである。 すなわ ち、 遺伝子組換えの手法を用いると他種の生物の任意の遺伝子を任 意の植物、 たとえばバラに導入し、 その植物に新しい能力を付与す ることができるとされている。 しかしながら、 ノ Xラはァラビドプシ ス （Arabidops is ihal iana)やタノ コ （tobacco (Nicot iana tabacum L - ))などのモデル植物とは異なり、 導入した遺伝子が機能するかど うかはその遺伝子の起源や使用するプロモーターなどに大きく依存 することが知られている。
W02005/017147によれば、 フラボノィ ド 3', 5'一水酸化酵素遺伝子 (F3' 5'H)をバラに導入した場合、 遺伝子組換えバラにおいて、 ペチ ュニァやリ ンドウに由来する同遺伝子は発現せず、 デルフィ二ジン も検出されなかったが、 興味深いことにパンジー由来の同遺伝子は 発現し、 デルフィ二ジンを生産するという新しい能力をバラに付与 することができた。 この結果はバラにおいては、 どの植物種由来の 遺伝子を導入すれば機能するかは容易に類推できないことを示して いる。
また、 キクにおいてはある遺伝子を導入することができてもその 遺伝子がキクで機能するかどうかは予想することは困難であり、 ま た組換えキクの加齢にしたがって導入した遺伝子が機能しなくなる ことが知られている。 組換え植物において異種の遺伝子の転写によ く使用されるカリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモータ一 は、 リンドウにおいては機能しないことも報告されている （Mi shiba et al. Plant Journal 2005, 44: 54卜 556参照）。
フラボンをバラで合成させるためには、 フラボン合成酵素遺伝子 を発現させればよいことは容易に類推できるが、 ジォキシゲナ一ゼ
型又はチトクローム P450型のいずれのフラボン合成酵素を発現させ ればよいのか、 どの植物起源のフラボン合成酵素遺伝子を発現させ ればよいのかなどについては、 容易に類推することはできないので 、 試行錯誤が要求される。 また、 コピグメント効果は液胞中にアン トシァニンとフラボンゃフラボノールが一定の濃度で共存すれば生 じる現象であるが、 発色源であるアン卜シァニンの配糖化等の修飾 状態に対し、 コピグメントとなるフラボンやフラポノールがより適 合した配糖化等の修飾を受けていることが必要であることも明らか にされている （Nature. 2005 Aug 11； 436 (7052)： 791、 及び Nature, 358, 515-518 (1992)参照） 。
つまり、 必要な色調発現のためには、 アントシァニンとフラボン • フラポノールが、 最適な構造上の組み合わせをとることが必要で あり、 また、 どのように修飾されたアントシァニンとフラボン ' フ ラボノールを共存させればよいのかという点についても試行錯誤を 要するであろう。 さらに、 フラボン合成酵素がバラで機能したとし ても、 天然のバラではナリ ンゲニンなどのフラバノンはフラバノン 3 -水酸化酵素（以下、 「F3H」 と略す。 ）により速やかに水酸化され るため、 フラバノンからフラボンが合成されるとは限らない。
従って、 本発明は、 バラにおける目的とする色調発現のために適 切な色素を含むバラを提供しょうとするものである。
上記の課題を解決するため、 本発明者は、 種々検討の結果、 パラ に人為的にフラボン及びデルフィ二ジンを含有せしめることにより 目的とする色調発現が達成されることを見出し、 本発明を完成した 具体的には、 本発明は以下の通りのものである ：
1. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含む ことを特徴とするバラ （a rose)。
2. 前記フラボンが、 導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現 によって生成したものである、 前記 1に記載のバラ。
3. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマノハグサ科由来のフラ ボン合成酵素遺伝子である、 前記 2に記載のバラ。
4. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノハクサ利-キンギヨソゥ (Scrophulariaceae, Antirrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、 前記 3に記載のバラ。
5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノハグサ科トレニァ（Scrophulariaceae, Torenia hybrida)由来の フラボン合成酵素遺伝子である、 前記 3に記載のバラ。
6. 前記ゴマノハグサ科キンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素遺 伝子が、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の ァミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下で八イブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコ一ドする遺伝子である、 前記 4に記載のバラ。
7. 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイプリダイズする核酸によりコ一ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 前記 4に記載のパラ。
8. 前記デルフィ二ジンが、 導入されたパンジー（Viola X wittr ockiana)由来のフラボノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の発現によ つて生成したものである、 前記 1〜 7のいずれかに記載のバラ。
9. 前記パンジー由来のフラポノイ ド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列を有するフラポノィ ド 3' ， 5'一水酸化酵素、
( 2 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラポノィ ド 3' , 5'—水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するァミノ酸配列を有するフラボノィ ド 3'， 5'—水酸化 酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 7に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたフラボノ ィ ド 3'， 5'—水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 前記 8に記載のパラ。
1 0. フラボン合成酵素遺伝子及びフラポノイ ド 3', 5'—水酸化
酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、 前記 2〜 9のいずれかに記載のバラ。
1 1 . 前記花色の変化が、 青に向けての変化である、 前記 1 0に 記載のバラ。
1 2. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度
( Θ ) が胄方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、 前記 1 0又 は 1 1 に記載のバラ。
1 3. 前記花色の変化が、 花弁の反射スペク トルの極小値が長波 長側にシフ トする変化である、 前記 1 0に記載のパラ。
1 4. 前記 1 〜 1 3のいずれかに記載のバラと同じ性質を有する 、 その部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞。
1 5. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含 めることにより生ずるコピグメンテーシヨ ン効果によりバラの花色 を改変する方法。
1 6. 前記コピグメンテーシヨン効果が、 花色を青色方向に変化 させる効果である、 前記 1 5に記載の方法。 発明を実施するための最良の形態
用語の定義
用語 「バラ （a rose) J とは、 本明細書中で使用するとき、 バラ目 パラ科バラ属 (Order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa)の 落葉低木である鑑賞用植物の総称をいい、 特定の品種に限定される ことを意図されず、 また、 植物の全体又は通常花を含む部分を意味 する。
用語 「バラ」 の 「部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞」 とは 、 本明細書中に使用するとき、 本願発明に係る 「バラ」 の所望の遺 伝的形質が保持されている限り、 当該 「バラ」 に由来するすべての
物を意味し、 特定のものに限定されることを意図されない。
用語 「高ス トリンジェン 卜条件」 とは、 本明細書中で使用すると き、 例えば、 6 X S S C ( 1 X S S Cの組成 ： 0. 1 5 M N a C 1 、 0. 0 1 5 クェン酸ナトリウム、 p H 7. 0 ) と 0. 5 % S D Sと 5 Xデンハルトと l O O x g Zm l 変性断片化サケ精子 DNAと 5 0 % ホルムアミ ドを含む^液中、 アンチセンス鎖と、 対象の核酸とを 5 5 °Cで一晩保温し、 0. 1 X S S C等の条件及び ノ又は 6 0 °C以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、 特に、 バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる 条件をいう。
用語 「L*a*b表色系色度図における色相角度 （ Θ ) 」 とは、 本明 細書中で使用するとき、 1 9 7 6年国際証明委員会 （C I E) で規 格化され、 日本国においても J I S 8 7 2 9 として採用された色相 角度 （ Θ ) をいい、 0 ° は赤方向、 9 0 ° は黄方向、 1 8 0 ° は緑 方向、 そして 2 7 0 ° は青方向である。 尚、 花の色は、 かかる色相 角度と、 RH S (英国王立園芸協会） のカラ一チャートのデータを 併用して、 表すことができる。
フラボン合成遗伝子及びフラボノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の 導入
バラに公知の方法で、 シソ由来のフラボン合成酵素 IIの遺伝子を 、 パンジー由来の F3' 5'H遺伝子などとともに導入した。 その結果、 シソ由来のフラボン合成酵素 IIの遺伝子を導入したバラではフラボ ンは検出されず、 この遺伝子はバラの中では機能しないことが示さ れた。 一方、 トレニァ又はキンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素 II の遺伝子を導入したバラではフラボンが検出され、 フラボン合成遺 伝子はバラの中で機能することがわかった。
このようにして、 従来は存在しなかったフラボンを蓄積するバラ
を作出することができた。 フラボンの総フラポノイ ド中の含量 （％
) は、 1 %以上、 好ましくは 5 %以上、 より好ましくは 10 %以上、 そ して最も好ましくは 30 %以上であればよい。 アントシァニンとフラ ボンの両方を蓄積するバラは、 同じアントシァニンのみを含むパラ よりも、 相対的に青い色をしており、 フラボンの蓄積が青色化とい う新しい形質の付与に貢献していることがわかった。
また、 交雑試験により、 デルフィ二ジン型アントシァニンとフラ ボンの両者を蓄積する形質は子孫にも伝達されることがわかった。 本発明に関連する酵素類は、 典型的には、 配列表に記載されてい る特定のアミノ酸配列を有する酵素である。 しかしながら、 酵素に おいては、 特定の、 例えば生来の、 アミノ酸配列のみならず、 酵素 活性に関与する領域以外の領域においてァミノ酸配列が修飾されて いても、 所望の酵素活性が維持されることはよく知られている。 従 つて、 本発明の酵素類は、 配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対 して、 1個〜数個のアミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸 による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、 本来の酵素活性 を維持しているタンパク質、 及び配列番号に示す特定のアミノ酸配 列に対して 90 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、 本 来の酵素活性を維持しているタンパク質も、 本発明の酵素に含まれ る。
また、 ある酵素をコードする遺伝子を手にすれば、 当該遺伝子に 対して高ス トリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸は、 当 該酵素と同様の活性を有する酵素をコードしている蓋然性が高いこ とが知られている。 従って、 特定の配列番号で示す塩基配列を有す る核酸と高ス トリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によ りコードされ、 且つ目的の酵素活性を有する酵素も、 本発明の酵素 に含まれる。
従って、 本発明に関与する酵素遺伝子として下記のものが挙げら れる。
( A) キンギヨソゥ （Antirrhinum ma.j us)由来のフラボン合成酵 素遺伝子
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
(4) 配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
(B) トレニァ（Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝
±_
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
(2) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリ ンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
( C ) シソ （Peri 11a frutescens)由来のフラボン合成酵素遺伝子
( 1 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 6 に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4) 配列番号 5に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコ一ドする遺伝子。
(D ) パンジ一（pansy (Viola x wi Urockiana) )由来の 3' , 5'—水 酸化酵素遺伝子
( 1 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列を有する 3'， 5'一水酸化 酵素、
( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化酵素、 又は
( ) 配列番号 7に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされた 3', 5'— 水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
(Ε) ト_レニァ (Torenia hybrida)由来のメチル基転移酵素遺伝
( 1 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移 酵素、
( 2 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個 のアミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により 修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
( 3 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、 又は
'( 4 ) 配列番号 9示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェン ト条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたメチル基転 移酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。 実施例
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。 本実施例は 、 本発明を例示することのみを目的とし、 本発明の範囲を限定する ものと解されることを意図されない。
実施例 1 ： アントシァニンに対するフラボンのコピグメント効果の シミュレーション
アントシァニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレ ーシヨ ンを行うため、 まずアントシァニン類を調製した。 Cyan inは バラ品種 "Rote Rose" (rose cv. "Rote Rose" )の花弁より抽出 、 精製した。 Delphinはバーべナ品種 "タピアンバイオレッ ト" （vb erbena cv. "Tapien Violet or vberbena variety Sunmaref T P-V { Tapien Violet" ) \ Tapien" is a Trade Mark registered in Japan))の花弁より抽出した色素を、 アルカリ加水分解した後 精製した。 Malvin、 及び Luteolin 7- 0- glucos ideはフナコシ株式
会社より購入した。
このようにして調製した種々のアントシァニンに対してフラボン
(Luteol in 7- O-glucoside) を、 pH5.0の緩衝液中、 0、 1、 2、 4当 量のモル濃度比で添加し、 吸収スペク トルを測定した。 アントシァ ニンとしては、 Cyanin (Cyanidin 3, 5-diglucos ide) 、 Delphin (D elphinidin 3, 5- diglucos ide) 、 Mai vin (Mai vid in 3, 5-diglucos ide) を用いた。 アントシァニンの濃度は Cyanin、 Delphinおよび Ma lvinは lmMとした。
以下の表 1 と 2に示すように、 フラボンの添加により、 アントシ ァニン水溶液の吸光度は増大し、 その変化の割合 （吸光度比） は、 Malvinで最大であった。 また、 吸収極大 （ λ max) もフラボンの添 加とともに長波長側へシフ トした。 その変化の割合は Mai vinで最大 、 次いで Delphinであつだ。 さらに、 L*a*b*表色系により色彩値の 評価を行ったところ、 フラボンの添加により、 色彩の青色化が観察 され、 彩度も上昇した。 その効果は、 Malvinで最も顕著であった。 すなわち、 Luteolin 7- 0- glucos ideのコピグメント効果を最も受 けるのは Malvinであることが判明した。
表 1 フラボン添加時のアントシァニン水溶液の吸収極大 ( λ max； 単 i nm)
おけるフラボン無添加に対する吸光度比
特開 2000-279182に記載のシソ由来フラボン合成酵素遺伝子を含 むプラスミ ド、 PYFS3を Xbalで消化した後、 平滑末端化し、 さらに B amHIで消化して、 約 1.8kbのシソ フラボン合成酵素遺伝子断片を 得た。 一方、 W02005/017147に記載の PSPB906を Xholで消化後、 平滑 末端化し、 さらに BamHIで消化した。 この平滑末端と BamHI切断部位 の間に、 前述のシソのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 906 - pY FS3を得た。 906- pYES3は E1235Sプロモーターと D8夕一ミネ一夕一 （ いずれも W02005/017147に記載） の間にシソ由来のフラボン合成酵 素遺伝子を有するものである。
Ueyama らの報告 （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された PSPB176の BamHIと Sail部位に、 WO2005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ -F3' 5Ή #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミ ドを PSPB575とした 。 この Ascl部位に、 上述の 906-PYFS3を Asclで消化して得られる約 3 • 4kbのシソのフラボン合成酵素遺伝子発現カセッ トを挿入した。 得 られたプラスミ ドのうち、 F3' 5' H #40遺伝子の発現カセッ トとシ ソのフラボン合成酵素の発現カセッ トが同じ方向に連結されたべク 夕一を PSPB1310 とした。 本プラスミ ドは植物においてはパンジー の F3' 5Ή #40遺伝子とシソのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現 する。
このようにして作製した PSPB1310を藤色系バラ品種 "Lavande" ( mauve rose variety "Lavande" )へ導入し、 55個体の开多質転換体 を得た。 色素分析を行った 50個体のうち 49個体でデルフィ二ジンの 蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 70% (平均 26%) で あった。 しかしながら、 フラボンは全く検出されず、 シソ由来のフ ラボン合成酵素遺伝子がバラの細胞では機能していないことが推察 された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 3 に示す。
表 3
対照 ： Lavande対照
De 1 ： デルフィジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴニジ 、 M： ミリセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri ： I セチン、 Lut ： ルテオリ ン、 Ap i ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 3 ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40 遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
Akashiらの報告 （Plant Cell Physiol 40， 1182- 1186, 1999) に 記載のトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子が、 プラスミ ド pBlues cript II SK (-) の EcoRIと Xhol部位に挿入されたプラスミ ドを pSP B426とした。 これを Kpnlで消化した後、 平滑末端化し、 さらに BamH Iで消化し、 約 1.7kbの 卜レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子断片を 得た。 一方、 W02005/0ni47に記載の PSPB906を Xholで消化後、 平滑 末端化し、 さらに BamHIで消化した。 この平滑末端と BamHI切断部位 の間に、 前述のトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 90 6 - 426を得た。
Ueyama らの報告 （IJeyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された pSPB176の BamHIと Sail部位に、 W02005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ
-F3' 5' H #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミ ドを PSPB575とし た。 この Ascl部位に、 上述の 906 - 426を Asclで消化して得られる約 3 .3 kbのトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子発現カセッ トを挿入し た。 得られたプラスミ ドのうち、 F3' 5' M40遺伝子の発現カセッ ト と トレ二ァのフラボン合成酵素の発現カセッ トが同じ方向に連結さ れたベクターを PSPB 1309 とした。 本プラスミ ドは植物においては パンジー F3' 5'H #40遺伝子と トレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子構 成的に発現する。
このようにして作製した PSPB1309を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し、 50個体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 38個体の うち 36個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含 有率は最高 45% (平均 12%) であった。 一方、 トレニァ由来フラポ ン合成酵素遺伝子の働きにより、 35個体で新たにフラボン （ルテオ リン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新 鮮花弁重量 lgあたり 1.68mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 4に示す。
、 M : ミ リセチン、 Q : ケルセチン、 K : ケンフエロール、 Tri : トリ セチン、 Lut ： ルテオリン、 Api ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 4 ： バラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
サ一モンピンク系のバラ品種 "WKS124" (salmon-pink rose vari ety "WKS124" )へ実施例 3に記載の pSPB 1309を導入し、 40個体の 形質転換体を得た。 色素分析を行った 27個体のうち 26個体でデルフ ィニジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 96% (平 均 81%) であった。 一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の 働きにより、 26個体で新たにフラボン （トリセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁 重量 lgあたり 4.41mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 5に示す。
表 5
対照 ： WKS124対照
Del ： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン 、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri ： トリ セチン、 Lut ： ルテォリン、 Ap i ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 5 ： バラ品種 "Lavande" でのパンジー由来 F3' 5' H # 40遺 伝子とキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在 性フラポノール合成酵素遺伝子の抑制
Tanakaらの報告 (Encyclopedia of rose science vol. 1, pp.34 1-350, ISBN 0- 12-227621-3) に記載のバラのフラポノール合成酵 素をコードする cMAが、 プラスミ ドベクタ一 pBluescript II SK-に クローニングされたものを pRFLSとする。 ベクターのマルチクロ一 ニングサイ ト上流の配列に由来する Reverseプライマー （AACAGCTiVT GACCATG) (配列番号 1 1 ) と、 バラのフラポノール合成酵素 cMA の配列の 5'末端から約 0.8kb下流の配列に加えて Hindi II認識配列を 付加した RFLS- Hindlllプライマ一 ( GATCTTGTTAAGCTTGTTGTAGACATAC ) (配列番号 1 2 ) を用い、 pRFLSを鎵型として常法に従い PCRを行 つた。
得られた断片を Hindi IIで部分消化し、 続いて Saclで消化するこ
とにより、 バラフラポノール合成酵素 cDNAの上流約 0.85kbに由来す る断片を得た。 一方、 pRFLS をベクターのマルチクローニングサイ トの BamHIとフラボノール合成酵素 cDNA内に存在する Hind II Iで切断 し、 バラフラボノール合成酵素 cMAの上流約 0.6kbに由来する断片 を得た。 フラポノ一ル合成酵素 cMAに由来するこれら約 0.6kbの断 片並びに約 0.85kbの断片を、 W02005/059141に記載の PSPB184 を、 B amHIおよび Saclにて消化し得られる BamHI/SacI部位に挿入し、 pSPB 1402を得た。
次に、 特開 2000- 279182に記載のキンギヨソゥ由来フラボン合成 酵素遺伝子 ANFNS2をベクター pBluescript II から BamHIと Xholから 切り出し、 これを W02005/017147に記載の PSPB906を BamHIと Xholで 消化して得られるプロモーターと夕一ミネ一ターに連結した。 これ を p SPB577とする。 p SPB577を Asclで切断して得られるキンギヨソ ゥのフラボン合成酵素発現カセッ ト断片を実施例 2に記載の P SPB5 75の Ascl部位に挿入したものを p SPB908とする。
このようにじて得られた PSPB908を Asclで部分消化し、 ここに、 p SPB1402を Asclで消化して得られる約 3.5kbのバラフラボノール合成 酵素 cDNAに由来する二本鎖 RNA発現カセッ トを揷入した。 得られた プラスミ ド P SPB 1403は、 パンジー F3' 5'H #40、 キンギヨソゥ FNS遺 伝子、 バラ FLS遺伝子の二本鎖 RNA発現カセッ 卜が同方向に連結され たバイナリ -ベクターである。 本プラスミ ドは植物においては F3' 5' H #40遺伝子遺伝子とキンギヨソゥフラボン合成酵素遺伝子を構成 的に発現し、 さらに RNAi法により内在性のフラボノール合成酵素遺 伝子の発現を抑制するようデザインされている。
藤色系バラ品種 "Lavande" へ pSPB 1403を導入し、 82個体の形質 転換体を得た。 色素分析を行った 82個体のうち 64個体でデルフィ二 ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 72% (平均 19
%) であった。 一方、 キンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の 働きにより、 70個体で新たにフラボン （トリセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁 重量 lgあたり 2.50mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 6に示す。
表 6
対照 ： Lavande対照
Del ： デルフィジニジン、 Cya： シァニジン、 Pel ： ペラルゴ二ジン 、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri : トリ セチン、 Lut ： ルテオリ ン、 Api ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 6 ： バラ品種 "WKS124" でのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子とキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在性 フラボノール合成酵素遺伝子の抑制
実施例 5に記載の PSPB1403をサーモンピンク系バラ品種 "WKS124 " へ導入し、 20個体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 20個体 全てでデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は 最高 89% (平均 55%) であった。 一方、 キンギヨソゥ由来フラボン 合成酵素遺伝子の働きにより、 20個体全てで新たにフラボン （ルテ ォリ ン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で
新鮮花弁重量 lgあたり 1.26mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 7に示す。
表 7
対照 ： S 124対照
Del ： デルフイジ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン 、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri ： トリ セチン、 Lut ： ルテォリン、 Ap i ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 7 ： バラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アント シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 3 に記載の PSPB 1309を Pacl処理し、 トレニァ由来のフラポ ン合成酵素発現カセッ トとパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子発現カセ ッ トの連結部位付近に存在する （より厳密には、 フラボン合成酵素 発現カセッ 卜の D8ターミネ一夕一 3'末端付近に存在する） Pacl部位 とベクターのマルチクローニングサイ ト内の Pacl部位を切断するこ とにより、 パンジー F3' 5'H #40遺伝子発現カセッ トを切り出した。 一方、 W02003-062428に記載トレニァのメチル基転移酵素遺伝子 発現カセッ トを有するバイナリ一べクタ一 pSPB 1530を Paclで切断し 、 そこに上記のパンジー F3' 5'H #40発現カセッ トを、 メチル基転移
酵素遺伝子発現カセッ 卜と同じ方向に挿入した。 本プラスミ ドを TM T-BP40とする。
一方、 PSPB 1309を Asclで切断し、 トレ二ァのフラボン合成酵素発 現カセッ トを切り出した。 これを TMT- BP40の Ascl部位に、 これらの 発現カセッ トと同じ方向に挿入し、 得られたプラスミ ドを pSFL535 とした。 本プラスミ ドは植物において、 パンジー F3' 5'H #40遺伝子 と トレニァのメチル基転移酵素遺伝子、 及びトレ二ァのフラボン合 成酵素遺伝子を構成的に発現する。
このようにして得られた PSFL535をサーモンピンク系バラ品種 "W KS124" へ導入し、 173個体の形質転換体を得た。 アントシァニジン 分析を行った 98個体の形質転換体のうち 88個体でマルビジン （デル フィニジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアントシァニジン） の蓄 積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能し ていることが生成物により示された。 なお、 マルビジン含有率は最 高 84% (平均 50%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 77個 体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン) の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4.58 mgという高い含有量であった。 また、 51個体でメチル化されたトリ セチンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 8に示す。
表 8
対照： WKS124対照
Del：デルフィジニジン、 Cya：シァニジン、 Pe t：ペチュニジン、 Pe l：ペラルゴ二ジン、 Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q ケルセチン、 K :ケンフエロール、 Tri： トリセチン 、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン
Del (%) 二ジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ：: ：:ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合、
Mai (%) 二ジン中のマルビジンの割合
実施例 8 ： バラ品種 "Lavande へのパンジー由来 F3' 5' H _# 40遺伝 子と 卜レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン卜 シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 7 に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し 、 130個体の形質転換体を得た。 アントシァニジン分析を行った 118 個体の形質転換体のうち 37個体でマルビジン （デルフィ二ジンの 3' 位と 5'位がメチル化されたアントシァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由 来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生 成物により示された。 なお、 マルビジン含有率は最高 55.6% (平均 20.5%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 78個 体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 5. 11 mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形質 転換体のうち 20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリ ンが 検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 9 に示す。
表 9
対照 ·ラノヾンデ対照
Del：デルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン： K：ケンフエロール、 Tri： トリセチン、 Lut：ルテオリ ン、 Api：ァピゲニン
Del {%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合
Mai {%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 9 ： バラ品種 "WKS82" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子 と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アントシ ァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 7に記載の pSFL535を藤色系バラ品種 "WKS82" (mauve ros e variety "WKS82" )へ導入し、 250個体の形質転換体を得た。 7 ントシァニジン分析を行った 232個体の形質転換体のうち 110個体で マルビジン （デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアン卜 シァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵 素遺伝子が機能していることが生成物により示された。 なお、 マル ビジン含有率は最高 65.2% (平均 19.7%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 125 個体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン) の 蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 71mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形 質転換体のうち 80個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリ ン が検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 1 0に示す。
表 1 o
対照： WKS82対照
De l：デルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pe t：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン： K：ケンフエロール、 Tri： トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン
De l (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合
Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 0 ： バラ品種 "WKS140" へのパンジー由来 F3' 5' H # 40遺 伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン トシァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 7に記載の pSFL535を藤色系バラ品種 "WKS140" (mauve ro se variety "WKS140" )へ導入し、 74個体の形質転換体を得た。 ァ ントシァニジン分析を行った 74個体の形質転換体のうち 20個体でマ ルビジン (デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアントシ ァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3 ' 5Ή #40遺伝子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素 遺伝子が機能していることが生成物により示された。 なお、 マルビ ジン含有率は最高 51.3% (平均 33.5%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 29個 体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 3.04 mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形質 転換体のうち 20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリ ンが 検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 1 1 に示す。
表 1 1
対照： WKS140対照
Del：デルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q :ケルセチン： K :ゲンフエロール、 Tri： トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン
Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合
Mai {%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 1 ： フラボン及びマルビジン合成能の後代への伝播一パン ジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺 伝子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子を導入 した遺伝子組換えバラと栽培バラとの交雑
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するた め、 実施例 7で作出したマルビジン及びフラボンを生産するバラ ( 表 8中、 植物 No.6) を花粉親として用いた交配を行った。 種子親に は、 中輪系栽培バラ "Medeo (メデォ） " （floribunda rose variet y "Medeo" )を用いた。
取得した形質転換体 Fl雑種後代のうち 10個体の色素分析を行った ところ、 7個体でマルビジンの蓄積が確認され、 バラの花弁におい てパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子と トレニァ由来アントシァニン メチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示され た。 なお、 マルビジン含有率は最高 68, 2% (平均 46.6%) であった 一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 8個 体の形質転換体後代でフラボン （トリセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲ ニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lg あたり 7.35mgという極めて高い含有量であった。 また、 フラボンを 生産していた形質転換体後代のうち 6個体でメチル化されたトリセ チンが検出された。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 2に示す。
表 1 2
Del： ルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pet：ペチ eo a M：ミリセチン、 Q：ケルセチン： K：ケンフエロール 、 Tri： トリセチン、 Lut :ルテオリン、 Api：ァピゲニン Del (%) 二ジン中のデ フィニジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合 Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 2 ： フラボン合成能の後代への伝播
パンジー由来 F3' 5' H # 40遺伝子及びトレニァ由来アントシァニン メチル基転移酵素遺伝子を導入したバラ品種 "WKS124" と、 パンジ —由来 F3' 5'H #40遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子 を導入したバラ品種 "Lavande" の交配
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するた め、 実施例 3で作出したフラボン生産株 （表 4中、 植物 No.4) を花 粉親として用いた交配を行った。 種子親には、 バラ品種 WKS124へ pS PB1532を導入し、 パンジー由来 F3' 5'H # 40遺伝子およびトレニァ 由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子の働きにより花弁でマ ルビジンを高蓄積した形質転換体 WKS 124/1532-12-1 (W02003/06242 8に記載） を用いた。
取得した形質転換体後代のうち 149個体の色素分析を行ったとこ ろ、 88個体でフラボン （トリセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン） の 蓄積が確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 09mgという高い含有量であった。 また、 42個体でメチル化されたト リセチンが検出され、 11個体でメチル化されたルテオリ ン （Chryso eriol (3'Met-Lut) ) が検出された。 なお、 色素分析を行った 149 個体のうち、 129個体でマルビジンの蓄積が確認できた。 マルビジ ン含有率は最高 79% (平均 36%) であった。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 3に示す。
表 1 3
M：ミリセチン、 Q：ケルセチン、 K：ケンフエロール、 Tr i： トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Ap i：ァピゲニン De l (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合、 Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 3 ： フラボンを含むバラの花色の評価
実施例 4及び 7 において作出された形質転換体 （バラ品種 "WKS1
24" を宿主とする） について、 ( 1 ) 主な色素としてデルフィニジ ンを蓄積し、 フラポンを含まないもの 、 （ 2 ) 主な色素としてデル フィニジンを蓄積し 、 フラボンを含むもの、 及び （ 3 ) 宿主 （主な 色素としてペラハゴ一ジンを蓄積） というグループに分類し、 それ ぞれの花弁の色彩について分光測色計を用いて評価を行った （ n =
10) 。
主色素がデルフィ 二ンンタイプのパラ、 マルビジンタイプのバラ いずれにおいても、 フラボンが共存する場合に花弁の色相角度は青 色方向へシフ トしていた。 また、 主色素がマルビジンタイプのバラ においては、 その傾向がより顕著であり、 反射スペク トルの極小 （ λ Min) も長波長側へ大きく シフ トしていた。 以上の結果から、 フ ラボンの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。 結果を以下の表 1 4 に示す。
表 1 4
色相角度 （hue) ： L*a*b*表色系において、 a* (赤方向） の軸を 0 ° として、 ここから反時計方向の色相に対して移動した角度で、 色 の位置がわかるようにしたもの。 90° であれば黄方向、 180° であ れぱ、 緑方向、 270° であれば青方向、 0° (= 360° )であれば赤方 向という ことになる。 すなわち、 数値が 270° に近いほど色相は青 い。
産業上の利用の可能性
本発明により、 鑑賞用植物として人気のある花卉植物であるバラ において、 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを 含ませることで、 コピグメンテーシヨ ン効果によりバラの花色を青 色方向に変化させることができる。 青色の花色をもつバラは観賞用 植物としての商品需要が見込まれる。
で、 本明細書中に引用した特許文献、 非特許技術文献の全て を、 個別に又はそれらを全体として、 本明細書中に援用する。
れまで、 本発明を説明してきたが、 本発明は、 その本質から ¾6 脱せずに、 修正又は変更されうると解されるべきであり、 本発明の 範囲は 、 実施例の記載に基づくのではな 添付の請求の範囲によ り画されるべきことはいうまでもない。
Claims
1. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含む ことを特徴とするバラ （a rose)。
2. 前記フラボンが、 導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現 によって生成したものである、 請求項 1 に記載のバラ。
3. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマノハグサ科由来のフラ ボン合成酵素遺伝子である、 請求項 2に記載のバラ。
4. 前記ゴマノ八ダサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノハクサ科キン千ョソゥ (Scrop ular iaceae, Ant i rrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、 請求項 3に記載のバラ。
5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノハグサ科トレニァ （Scrophular iaceae, Torenia hybrida)由来の フラボン合成酵素遺伝子である、 請求項 3 に記載のバラ。
6. 前記ゴマノハグサ科キンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素遺 伝子が、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2 に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ン卜条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 請求項 4に記載のバラ。
7. 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3 に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコ一ドする遺伝子である、 請求項 5に記載のバラ。
8. 前記デルフィ二ジンが、 導入されたパンジー（Viola X wittr ockiana)由来のフラポノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の発現によ つて生成したものである、 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載のバ
9. 前記パンジー由来のフラポノイ ド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列を有するフラポノィ ド 3' ， 5'—水酸化酵素、
( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及びノ又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラポノィ ド 3'， 5 '—水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8に記載のァミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノィ ド 3'， 5 '—水酸化 酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 7 に示す塩基配列を有する核酸と高ストリ ンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボノ ィ ド 3'， 5'一水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 請求項 8に記載のパラ。
1 0. フラボン合成酵素遺伝子及びフラポノィ ド 3' , 5'一水酸化 酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、 請求項 2 〜 9のいずれか 1項に記載のバラ。
1 1 . 前記花色の変化が、 青に向けての変化である、 請求項 1 0 に記載のバラ。
1 2. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度 ( Θ ) が青方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、 請求項 1 0 又は 1 1 に記載のバラ。
1 3. 前記花色の変化が、 花弁の反射スペク トルの極小値が長波 長側にシフ トする変化である、 請求項 1 0に記載のバラ。
1 4. 請求項 1〜 1 3のいずれか 1項に記載のバラと同じ性質を 有する、 その部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞。
1 5. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含 めることにより生ずるコピグメンテ一シヨン効果によりバラの花色 を改変する方法。
1 6. 前記コピグメンテーシヨン効果が、 花色を青色方向に変化 させる効果である、 請求項 1 5に記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0814715-9A2A BRPI0814715A2 (pt) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | Rosa contendo flavona e delfinidina, e método para produção da mesma |
| EP08765840A EP2159282A4 (en) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | ROSE CONTAINING FLAVONE AND DELPHINIDINE, AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME |
| CA2691156A CA2691156A1 (en) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | Rose containing flavone and delphinidin, and method for production thereof |
| AU2008264442A AU2008264442A1 (en) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | Rose containing flavone and delphinidin, and method for production thereof |
| CN200880020604A CN101688198A (zh) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | 含有黄酮及花翠素的月季及其生产方法 |
| US12/665,051 US20100287668A1 (en) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | Rose containing flavone and delphinidin, and method for production thereof |
| JP2009520627A JPWO2008156214A1 (ja) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法 |
| IL202820A IL202820A0 (en) | 2007-06-20 | 2009-12-17 | Rose containing flavone and delphinidin, and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007163029 | 2007-06-20 | ||
| JP2007-163029 | 2007-06-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2008156214A1 true WO2008156214A1 (ja) | 2008-12-24 |
Family
ID=40156362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2008/061603 WO2008156214A1 (ja) | 2007-06-20 | 2008-06-19 | フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100287668A1 (ja) |
| EP (1) | EP2159282A4 (ja) |
| JP (1) | JPWO2008156214A1 (ja) |
| KR (1) | KR20100029104A (ja) |
| CN (1) | CN101688198A (ja) |
| AU (1) | AU2008264442A1 (ja) |
| BR (1) | BRPI0814715A2 (ja) |
| CA (1) | CA2691156A1 (ja) |
| CO (1) | CO6170373A2 (ja) |
| EC (1) | ECSP099815A (ja) |
| IL (1) | IL202820A0 (ja) |
| RU (1) | RU2010101623A (ja) |
| TW (1) | TW200908873A (ja) |
| WO (1) | WO2008156214A1 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010110382A1 (ja) * | 2009-03-27 | 2010-09-30 | インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド | 青いバラに含まれる新規化合物 |
| WO2012036290A1 (ja) | 2010-09-17 | 2012-03-22 | サントリーホールディングス株式会社 | 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法 |
| WO2017169699A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 青系花色を有する植物及びその作出方法 |
| RU2636463C2 (ru) * | 2012-01-17 | 2017-11-23 | Сантори Холдингз Лимитед | Новый ген гликозилтрансферазы и его применение |
| US10102476B2 (en) | 2009-06-30 | 2018-10-16 | Agrigenetics, Inc. | Application of machine learning methods for mining association rules in plant and animal data sets containing molecular genetic markers, followed by classification or prediction utilizing features created from these association rules |
| WO2019069946A1 (ja) * | 2017-10-03 | 2019-04-11 | サントリーホールディングス株式会社 | 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法 |
| US10870861B2 (en) | 2015-07-01 | 2020-12-22 | Suntory Holdings Limited | Creation of chrysanthemum with blue flower color |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2163619B1 (en) * | 2007-06-20 | 2012-05-16 | Suntory Holdings Limited | Rose containing flavone and malvidin, and method for production thereof |
| RU2010101624A (ru) * | 2007-06-20 | 2011-07-27 | Интернэшнл Флауэр Девелопментс Проприэтери Лимитед (Au) | Роза, содержащая флавон, и способ ее получения |
| CN102577801B (zh) * | 2012-02-22 | 2013-07-31 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 预防月季杂交果实病变腐烂的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05184370A (ja) * | 1992-01-14 | 1993-07-27 | Kirin Brewery Co Ltd | フラボノイド水酸化酵素遺伝子 |
| JPH08511683A (ja) * | 1993-05-20 | 1996-12-10 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミティド | トランスジェニック顕花植物 |
| JP2000279182A (ja) * | 1999-01-29 | 2000-10-10 | Suntory Ltd | フラボン合成酵素をコードする遺伝子 |
| WO2005017147A1 (ja) * | 2003-08-13 | 2005-02-24 | International Flower Developments Proprietary Limited | 花色が変更されたバラの製造方法 |
| JP2006512057A (ja) * | 2002-08-30 | 2006-04-13 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド | フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ遺伝子配列およびその使用法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5480789A (en) * | 1991-04-01 | 1996-01-02 | Florigene Europe B.V. | Genetically transformed rose plants and methods for their production |
| US5948955A (en) * | 1991-07-13 | 1999-09-07 | International Flower Developments Pty Ltd | Transgenic plants having altered anthocyann levels |
| EP0632128A4 (en) * | 1992-03-02 | 1996-04-24 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | NEW PLANT GENE. |
| US20010007157A1 (en) * | 1993-11-18 | 2001-07-05 | Ebrahim Firoozabady | Genetically transformed rose plants and methods for their production |
| US5568832A (en) * | 1994-10-18 | 1996-10-29 | Eddy; Zonell | Skylight shade |
| JPH0970290A (ja) * | 1995-02-17 | 1997-03-18 | Suntory Ltd | アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 |
| AUPN298895A0 (en) * | 1995-05-16 | 1995-06-08 | International Flower Developments Pty Ltd | Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same |
| AUPS017402A0 (en) * | 2002-01-25 | 2002-02-14 | International Flower Developments Pty Ltd | Genetic sequences and uses therefor |
| KR100440332B1 (ko) * | 2002-06-28 | 2004-07-15 | 현대자동차주식회사 | 유압 회로용 투웨이 오리피스 첵밸브 장치 |
| JP4378676B2 (ja) * | 2003-06-03 | 2009-12-09 | 日本電気株式会社 | 電力制御方法および電力制御回路 |
| EP2163619B1 (en) * | 2007-06-20 | 2012-05-16 | Suntory Holdings Limited | Rose containing flavone and malvidin, and method for production thereof |
-
2008
- 2008-06-19 JP JP2009520627A patent/JPWO2008156214A1/ja not_active Withdrawn
- 2008-06-19 US US12/665,051 patent/US20100287668A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-19 CN CN200880020604A patent/CN101688198A/zh active Pending
- 2008-06-19 TW TW097122848A patent/TW200908873A/zh unknown
- 2008-06-19 CA CA2691156A patent/CA2691156A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-19 AU AU2008264442A patent/AU2008264442A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-19 BR BRPI0814715-9A2A patent/BRPI0814715A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-06-19 RU RU2010101623/10A patent/RU2010101623A/ru unknown
- 2008-06-19 WO PCT/JP2008/061603 patent/WO2008156214A1/ja active Application Filing
- 2008-06-19 EP EP08765840A patent/EP2159282A4/en not_active Withdrawn
- 2008-06-19 KR KR1020097027560A patent/KR20100029104A/ko not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-12-17 IL IL202820A patent/IL202820A0/en unknown
- 2009-12-18 EC EC2009009815A patent/ECSP099815A/es unknown
- 2009-12-18 CO CO09145326A patent/CO6170373A2/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05184370A (ja) * | 1992-01-14 | 1993-07-27 | Kirin Brewery Co Ltd | フラボノイド水酸化酵素遺伝子 |
| JPH08511683A (ja) * | 1993-05-20 | 1996-12-10 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミティド | トランスジェニック顕花植物 |
| JP2000279182A (ja) * | 1999-01-29 | 2000-10-10 | Suntory Ltd | フラボン合成酵素をコードする遺伝子 |
| JP2006512057A (ja) * | 2002-08-30 | 2006-04-13 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド | フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ遺伝子配列およびその使用法 |
| WO2005017147A1 (ja) * | 2003-08-13 | 2005-02-24 | International Flower Developments Proprietary Limited | 花色が変更されたバラの製造方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FUKUI Y. ET AL.: "A rationale for the shift in colour towards blue in transgenic carnation flowers expressing the flavonoid 3',5'-hydroxylase gene", PHYTOCHEMISTRY, vol. 63, no. 1, 2003, pages 15 - 23, XP004415736 * |
| See also references of EP2159282A4 * |
| TANAKA Y. ET AL.: "Shokubutsu Shikiso no Seikagaku to Idengaku Hana no Iro no Biotechnology", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 47, no. 3, 2002, pages 225 - 230, XP008124957 * |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2010228224B2 (en) * | 2009-03-27 | 2015-09-17 | Suntory Holdings Limited | Novel compound contained in blue rose |
| JP5099653B2 (ja) * | 2009-03-27 | 2012-12-19 | サントリーホールディングス株式会社 | 青いバラに含まれる新規化合物 |
| EP2947083A1 (en) * | 2009-03-27 | 2015-11-25 | Suntory Holdings Limited | Novel compound contained in blue rose |
| WO2010110382A1 (ja) * | 2009-03-27 | 2010-09-30 | インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド | 青いバラに含まれる新規化合物 |
| JP2013014589A (ja) * | 2009-03-27 | 2013-01-24 | Internatl Flower Dev Pty Ltd | 青いバラに含まれる新規化合物 |
| RU2507206C2 (ru) * | 2009-03-27 | 2014-02-20 | Сантори Холдингз Лимитед | Новое соединение, содержащееся в голубой розе |
| JP2014210786A (ja) * | 2009-03-27 | 2014-11-13 | サントリーホールディングス株式会社 | 青いバラに含まれる新規化合物 |
| US9057076B2 (en) | 2009-03-27 | 2015-06-16 | Suntory Holdings Limited | Compounds purified from blue roses |
| CN102365287A (zh) * | 2009-03-27 | 2012-02-29 | 三得利控股株式会社 | 蓝月季中含有的新型化合物 |
| US10102476B2 (en) | 2009-06-30 | 2018-10-16 | Agrigenetics, Inc. | Application of machine learning methods for mining association rules in plant and animal data sets containing molecular genetic markers, followed by classification or prediction utilizing features created from these association rules |
| WO2012036290A1 (ja) | 2010-09-17 | 2012-03-22 | サントリーホールディングス株式会社 | 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法 |
| RU2636463C2 (ru) * | 2012-01-17 | 2017-11-23 | Сантори Холдингз Лимитед | Новый ген гликозилтрансферазы и его применение |
| US10059956B2 (en) | 2012-01-17 | 2018-08-28 | Suntory Holdings Limited | Glycosyltransferase gene and use thereof |
| US10870861B2 (en) | 2015-07-01 | 2020-12-22 | Suntory Holdings Limited | Creation of chrysanthemum with blue flower color |
| US11299742B2 (en) | 2016-03-31 | 2022-04-12 | Suntory Holdings Limited | Plant having blue flower color and breeding method therefor |
| JPWO2017169699A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2018-10-25 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 青系花色を有する植物及びその作出方法 |
| WO2017169699A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 青系花色を有する植物及びその作出方法 |
| WO2019069946A1 (ja) * | 2017-10-03 | 2019-04-11 | サントリーホールディングス株式会社 | 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2691156A1 (en) | 2008-12-24 |
| BRPI0814715A2 (pt) | 2014-10-21 |
| AU2008264442A1 (en) | 2008-12-24 |
| CN101688198A (zh) | 2010-03-31 |
| KR20100029104A (ko) | 2010-03-15 |
| TW200908873A (en) | 2009-03-01 |
| JPWO2008156214A1 (ja) | 2010-08-26 |
| CO6170373A2 (es) | 2010-06-18 |
| EP2159282A4 (en) | 2010-07-28 |
| RU2010101623A (ru) | 2011-07-27 |
| IL202820A0 (en) | 2011-08-01 |
| ECSP099815A (es) | 2010-01-29 |
| EP2159282A1 (en) | 2010-03-03 |
| US20100287668A1 (en) | 2010-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5057349B2 (ja) | フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法 | |
| WO2008156214A1 (ja) | フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法 | |
| Griesbach | Biochemistry and genetics of flower color | |
| WO2008156211A1 (ja) | フラボンを含むバラ及びその生産方法 | |
| JPWO2019069946A1 (ja) | 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法 | |
| JP5765711B2 (ja) | 変更された花部を有する植物 | |
| ES2365261T3 (es) | Flavenoide metiltransferasa a partir de la torenia y sus usos. | |
| AU2008323629A1 (en) | Genetically modified plants with altered inflorescence | |
| JPWO2007094521A1 (ja) | フラボノイド糖転移酵素及びその利用 | |
| Tanaka et al. | Metabolic engineering of flower color pathways using cytochromes P450 | |
| WO2012036290A1 (ja) | 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法 | |
| ES2370175T3 (es) | Proceso para la producción de una rosa con color modificado. | |
| Nishihara et al. | Gentian: from gene isolating to molecular breeding | |
| Wang | Molecular analysis of anthocyanin biosynthetic pathway genes in Cymbidium orchids: a thesis presentation in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science in Plant Molecular Biology at Massey University, Palmerston North, New Zealand |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 200880020604.5 Country of ref document: CN |
|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 08765840 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2009520627 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 0901008 Country of ref document: KE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2691156 Country of ref document: CA |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2008264442 Country of ref document: AU |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 8242/DELNP/2009 Country of ref document: IN Ref document number: 2008765840 Country of ref document: EP |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 12665051 Country of ref document: US |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 09145326 Country of ref document: CO |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20097027560 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2008264442 Country of ref document: AU Date of ref document: 20080619 Kind code of ref document: A |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2010101623 Country of ref document: RU |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: PI0814715 Country of ref document: BR Kind code of ref document: A2 Effective date: 20091221 |