WO2008072584A1

WO2008072584A1 - アンミン白金錯体を高濃度で内包するリポソームおよびその製造方法

Info

Publication number: WO2008072584A1
Application number: PCT/JP2007/073727
Authority: WO
Inventors: Masahiko Hirai; Koichi Igarashi; Masahiko Chikuma; Kazunori Oie
Original assignee: Katayama Chemical Industries Co., Ltd.
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2008-06-19
Also published as: EP2090305A1; US20130011466A1; US20100034874A1; EP2090305A4; JP5364381B2; JPWO2008072584A1

Abstract

本発明は、アンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法を提供する。この方法は、Ａ）水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程；Ｂ）リポソーム、リポソーム原料またはその組合せを提供する工程：およびＣ）該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リポソーム、該リポソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リポソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リポソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である、工程を包含する。

Description

明細書

アンミン白金錯体を高濃度で内包するリボソームおよびその製造方法技術分野

[0001] 本発明は、アンミン白金錯体 (例えば、シスブラチン）を内包するリボソームおよびその製造方法に関する。詳細には、難水溶性のアンミン白金錯体を内包するリボソームおよびその製造方法に関する。

背景技術

[0002] リボソームは、中空球状の脂質二分子膜構造を有する。従って、その脂質二重膜の内側に水溶性薬物を封入することができる。この理由により、リボソームは、医薬品、農薬、化粧品等の分野で広く研究され、利用されてきた。特に、外膜表面にリガンドを結合したリボソームについては、がん'腫瘍などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するための DDS材料として多くの研究がなされてきた。

[0003] しかし、がん ·腫瘍の処置に用いる薬剤の多くは難水溶性であり、リボソームに封入できる薬物量は非常に少なかった。たとえば、シスブラチンの場合、水系以外には溶解せず、水系でも常温で約 2mg/mlの飽和濃度しかないため、がん ·腫瘍の処置に有効な量の薬剤を患者に投与するためには、投与されるリボソームの量は必然的に多くなるという不都合が存在する。

[0004] 特許文献 1は、シスプラチン、カルポプラチン等の制ガン剤、アスピリン、ァセトァミノフェン、インドメタシン等の解熱剤、酢酸コルチゾン等のホルモンなどを含有するリポソーム製剤を記載している。しかし、特許文献 1に記載されるリボソーム製剤は、その製造工程に加熱工程を要する。一般に、リボソームは加熱により不安定になることが知られている。従って、特許文献 1に記載される方法により製造されたリボソームは不安定である。特許文献 1では、リボソームに内包されたシスプラチンの量は、 8. 9 _§ /mg 脂質が限度である。従って、特許文献 1に記載される方法により製造されたリポソームはわずかな量しかシスプラチンを内包することができなかった。

[0005] 非特許文献 1には、シスブラチンを内包させたリボソームが記載されて!/、る。しかし、このリボソームは、 14. 0 g/mg脂質ほどし力、リボソームを内包することはできなかつた。

[0006] シスブラチンは、金属錯体の反応性を利用した制がん剤である。白金金属錯体であるシスプラチンは、無電荷の状態でがん細胞膜を透過して細胞内へ移行する。血中の塩化物イオン濃度は、 103mmol/lである力細胞内では 4mmol/lに低下することから、シスブラチンの塩化物イオンは水分子に置換され、細胞内では図 1Aに示すような平衡状態にある。

[0007] この状態のシスプラチンは細胞内の DNAと図 1Bに示すような様式で結合し、 DN Aの複製を阻害することにより抗がん作用を発揮する。しかし、シスブラチンは腎毒性や難聴などの強い副作用があるので、これらの副作用を軽減させながらも抗がん作用を維持するために種々のシスブラチン誘導体および剤型、ならびに投与方法の開発が試みられてきた。

[0008] しかし、水溶性が低いシスブラチンのような薬剤は高濃度でリボソームに内包することができな!/、ので、充分な量の薬剤を標的部位に送達させることは未だ成功して!/、ない。

[0009] 従って、難水溶性薬物を大量にリボソームに内包させる技術を開発し、提供することに対して需要がある。

特許文献 1 :特開平 5— 255070号公報

非特許文献 l : Mary ¾. Newman, Gail T. Colbern, Peter K. Workingら、「 comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic ef fectiveness of cisplatin encapsuklated in long― circulating, pegylate d liposome (SPI— 077) in tumor— bearing mice」、 Cancer Chemother Pharmacol (1999) 43 : 1— 7頁

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明は、難水溶性のアンミン白金錯体を大量にリボソームに内包させ、少量の投与で経口投与可能な難水溶性アンミン白金錯体内包リボソームを提供することを課題とする。

課題を解決するための手段 [0011] 上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、アンミン白金錯体の硝酸塩等の水溶性の塩と、リボソーム形成用の脂質懸濁液とを混合してリボソームを製造した後に、塩化物イオン等の難水溶性の錯体を形成させるイオンの存在下に配置することによって、予想外にも、その難水溶性の錯体が、リボソーム内において形成されたことを見出したことによって、本発明を完成させ、上記課題を解決するに至ったものである。

[0012] 上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。

(項目 1)

アンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：

A)水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程；

B)リボソーム、リボソーム原料またはその組合せを提供する工程：および

C)該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リボソーム、該リボソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リボソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リボソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である、工程

を包含する、方法。

(項目 2)

さらに、 D)前記 C)工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 3)

前記水溶性アンミン白金錯体力 2つのアンミン基を有する、上記項目に記載の方法

(項目 4)

前記水溶性アンミン白金錯体力 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)である、上記項目に記載の方法。

(項目 5) A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；

B)前記リボソーム原料を提供する工程であって、

B— i)リボソーム形成能を有する脂質を、メタノール 'クロ口ホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および

B— ii)該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程、を包含する、工程；ならびに

C)該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リボソーム形成維持条件に供する工程

を包含し、ここで、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目に記載の方法。

(項目 6)

前 B— ii)工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理することを含む、上記項目に記載の方法。

(項目 7)

前記 C)工程において、前記リボソーム形成維持条件が、前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供することおよび該混合物をー晚静置することからなる群より選択されることを含む、上記項目に記載の方法。

(項目 8)

A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；

B)前記リボソームを提供する工程；および

C)該白金錯体溶液と、該リボソームとを混合し、前記リボソーム形成維持条件に供する工程

を包含し、ここで、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるィオンを含まない、上記項目に記載の方法。

(項目 9) 前記 B)工程において、前記リボソームは、前記水溶性アンミン白金錯体力リポソ一ム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有する、上記項目に記載の方法。

(項目 10)

前記リボソーム形成維持条件が、前記リボソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体力 Sリボソーム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な条件である、上記項目に記載の方法。

(項目 11 )

前記リボソームを構成する脂質または前記リボソーム原料力 S、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルェタノールァミンポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。

(項目 12)

前記 C)工程において、前記混合物が、 pH6〜； 10の範囲内に調節される、上記項目に記載の方法。

(項目 13)

前記白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件が、塩化物イオン (C1—)、臭化物イオン（Br— )、ヨウ化物イオン（厂）、チォシアン酸イオン（SCN—)およびシアン化物イオン (CN—)からなる群より選択される該白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない溶液の存在下におくことである、上記項目に記載の方法。 (項目 14)

前記塩化物イオン（C1—)が、 0〜4mMの範囲で含まれる、上記項目にに記載の方法

〇

(項目 15)

前記工程 C)において、前記混合物が、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル ) - 1—ピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3- (N モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、 N トリス（ヒドロキシメチル） 1—2 —アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一2エタンスルホン酸緩衝剤、 N トリス（ヒドロキシメチル）メチル 2 ヒドロキシ一 3 -ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン N, N，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N， 2—ヒドロキシプロパン —3—プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルダリシン)緩衝剤、 N , N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルァミノ）ェタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤およびそれらの組合せからなる群より選択される緩衝剤を含む、上記項目に記載の方法。

(項目 16)

前記 C)工程において、前記水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、前記リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとカ、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合される、上記項目に記載の方法。

(項目 17)

前記 D)工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン力塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン（Br— )、ヨウ化物イオン（1—)、チォシアン酸イオン（S CN およびシアン化物イオン (CN からなる群より選択される、上記項目にに記載の方法。

(項目 18)

前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン力塩化物イオン (CDである、上記項目に記載の方法。

(項目 19)

前記塩化物イオン（C厂）が、 NaCl、 HCほたは CaClより提供される、上記項目に記

2

載の方法。

(項目 20)

前記 D)工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン力 N —トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、 2— [4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝液、 3— (N—モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝液、 N— 2— ヒドロキシェチルピペラジン一 N，一 2エタンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒドロキシメチル)メチル—2 ヒドロキシ— 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピぺラジン— N , N，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N， 2 ヒドロキシプロパンー3 プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒド口キシメチルメチルダリシン）緩衝液、 N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝液、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝液、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液および 3 シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝液からなる群より選択される緩衝液により提供される、上記項目に記載の方法。

(項目 21)

前記塩化物イオン（C厂）が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝液（ρΗ8· 0)および 2— [ 4一（2 ヒドロキシェチル）ー1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝液（ρΗ7· 2) からなる群より選択される緩衝液により提供される、上記項目に記載の方法。

(項目 22)

前記 D)工程が、

i)形成されたリボソームを親水性化処理する工程；

ii)該リボソームへ標的指向性物質を結合させる工程；

iii)該修飾標的指向性物質が結合したリボソームを親水性化する工程ならびに iv)該親水性化したリボソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程

を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 23)

前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。 (項目 24)

前記アンミン白金錯体が、難水溶性である、上記項目に記載の方法。

(項目 25)

cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：

(Al) cis ジアンミンジニトラト白金（II)を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液を調製する工程であって、該 N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4 mMの範囲で含む、工程；

(A2)該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH6〜 10に調節する工程；

(B1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを混合させて脂質を調製する工程；

(B2)該脂質を、メタノール 'クロ口ホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；

(B3)該脂質膜を、 N トリス (ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (pH6〜10)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該 N トリス（ヒド口キシメチル） 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；

(B4)該脂質懸濁液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および

(Cl) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 0 00で限外濾過に供する工程

を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 26) Cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：

(A2)該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH8 · 4に調節する工程；

(B1)リボソームを提供する工程；および

(Cl) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、該リボソームとを、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 000で限外濾過に供する工程

を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 27)

水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ること力 Sできる、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソーム。

(項目 28)

前記水溶性アンミン白金錯体と、前記リボソームとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 29)

前記水溶性アンミン白金錯体と、前記リボソーム原料とを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 30)

アンモニアを有するアンミン白金錯体が、 lmg脂質あたり 0. 3〃 g以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

(項目 31) 前記アンモニアを有するアンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 9 g以上で含まれる、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 32)

前記アンモニアを有するアンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 17 g以上で含まれる、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 33)

アンモニアを有するアンミン白金錯体が、 lmgリン脂質あたり 100 g以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

(項目 34)

アンモニアを有するアンミン白金錯体が、リボソーム lmlあたり 39〃 g/ml以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

(項目 35)

アンモニアを有するアンミン白金錯体が、リボソーム 1個あたり 3 X 10_¹⁽ g以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

(項目 36)

前記アンミン白金錯体が、 2つのアンモニアを有する、上記項目に記載のリボソーム。 (項目 37)

前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態である、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 38)

前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)である、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 39)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソーム力 S、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される脂質を含む、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 40)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載のリボソーム。

(項目 41 )

前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、上記項目に記載のリボソーム。 (項目 42)

がんまたは腫瘍を処置するための組成物であって、該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを含み、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、組成物

(項目 43)

がんまたは腫瘍を処置するための組成物であって、該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを含み、該リボソームは、該アンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 0. 3 ;^以上で含まれる、組成物。

(項目 44)

前記アンミン白金錯体が、 2つのアンモニアを有する、上記項目に記載の組成物。 (項目 45)

前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態である、上記項目に記載の組成物。

(項目 46)

前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)である、上記項目に記載の組成物。

(項目 47)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソーム力 S、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、パルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される脂質を含む、上記項目に記載の組成物。

(項目 48)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載の組成物。

(項目 49)

前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の組成物。

(項目 50)

がんまたは腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモユアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを投与する工程を包含し、ここで、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リポソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ること力 Sできる、方法。

(項目 51 )

がんまたは腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモユアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを投与する工程を包含し、ここで、該リボソームは、該アンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 0. 3 _§以上で含まれる、方法。

(項目 52)

前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームが、静脈内投与、皮下投与、経口投与，局所投与、または腹腔内投与により投与される、上記項目に記載の方法。

(項目 53) 前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームが、少なくとも白金錯体 1. S ^ g/g体重の用量で投与される、上記項目に記載の方法。

(項目 54)

前記がんまたは腫瘍が、睾丸腫瘍、膀胱癌、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、食道癌、子宮癌、神経芽細胞種および胃癌からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。

(項目 55)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載の方法。

(項目 56)

前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。

(項目 57)

医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソ一ムであって、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、リボソーム。

(項目 58)

医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソ一ムであって、該アンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 0. 3 ;^以上で含まれる、リポソーム。

また、本発明は、 1つの特定の実施形態では、以下のようにも記載することができる

〇

以下項目 Aとは、 Al〜Anの任意の項目であって、 nは、当該番号より 1つ少ない数をいう。

(項目 A1)

アンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程： A)アンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を提供する工程；

B)該水溶性の白金錯体を含む溶液とリボソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して混合溶液を作製する工程；

C)該混合溶液をリポソームが形成する条件に供する工程；および

D)該混合溶液を、形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程、

を包含する、方法。

(項目 A2)

前記水溶性のアンミン白金錯体が、 2つのアンミン基を有する、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A3)

前記水溶性の白金錯体が、 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)である、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A4)

前記 A)工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、 pH6〜； 10の範囲内に調節される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A5)

前記 A)工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A6)

前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン (C1—)、臭化物イオン (Br 一）、ヨウ化物イオン（厂）、チォシアン酸イオン（SCN—)およびシアン化物イオン（CN からなる群より選択される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A7)

前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン (C1—)である、上記項目 A に記載の方法。

(項目 A8)

前記塩化物イオン（C1—)が、 0〜4mMの範囲で含まれる、上記項目 Aに記載の方法 (項目 A9)

前記 A)工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、 N トリス（ヒドロキシメチル）一3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2— [4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]ェタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3—（ Ν モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1 2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν， 2エタンスノレホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル）メチル 2 ヒドロキシ一 3 -ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン一 Ν, Ν，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 Ν— 2 ヒドロキシェチルピペラジン N'—2 ヒドロキシプロパンー3 プ口パンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルダリシン)緩衝剤、 Ν, Ν ビス (2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—（シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— Ν シクロへキシルアミノー 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤および 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤からなる群より選択される緩衝剤を含む、上記項目 Αに記載の方法。

(項目 A10)

前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤を含む、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 Al l)

前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、 pH8. 4に調節されている、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A12)

前記 B)工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液と脂質懸濁液とが、 1 : 9 〜9 : 1の範囲内の比で混合される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A13)

前記 B)工程における前記脂質懸濁液が、

i)脂質を、メタノール 'クロ口ホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;および

ii)該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁させる工程

によって作製される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A14)

前記脂質懸濁液が、前記脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35 : 40 : 15 : 5 : 5 : 167のモル比で含む、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A15)

前記水溶性の白金錯体を含む溶液と前記脂質懸濁液とが、 7： 3の比で混合される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A16)

前記メタノール 'クロ口ホルム溶液が、メタノールとクロ口ホルムとを 1： 1の比で含む、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A17)

前記懸濁緩衝液が、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A18)

(項目 A19)

(項目 A20)

前記塩化物イオン（C1—)が、 0〜4mMの範囲で含まれる、上記項目 Aに記載の方法。（項目 A21)

前記懸濁緩衝液が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ)ァミノメタン緩衝剤、 3 - (Ν モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1 2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルビペラジン Ν，一 2エタンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル）メチル 2 ヒドロキシ一 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン一 Ν, Ν，ビス（ 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジンー Ν， 2 ヒドロキシプロパンー3 プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルダリシン)緩衝剤、 Ν, Ν—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— Ν シクロへキシルアミノー 2 ーヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤および 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤からなる群より選択される緩衝剤を含む、上記項目 Αに記載の方法。 (項目 A22)

前記懸濁緩衝液が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（pH8. 4)である、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A23)

前記工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理する工程をさらに包含する、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A24)

前記超音波処理する工程が、前記脂質容液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程である、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A25)

前記 C)工程において、前記混合溶液を、リボソームが形成するのに十分な時間、前記リボソームが形成する条件下に供する、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A26)

前記 C)工程において、前記混合溶液をリボソームが形成する条件が、該混合溶液を限外濾過に供することおよび該混合溶液をー晚静置することからなる群より選択される、上記項目 Aに記載の方法。 (項目 A27)

前記混合溶液をリボソームが形成する条件が、前記混合溶液を分画分子量 10, 00 0で限外濾過に供することである、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A28)

前記 D)工程が、前記 C)工程において、リボソームの形成を確認した後に行われる、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A29)

前記 D)工程において、前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（ C厂）、臭化物イオン (Br— )、ヨウ化物イオン (1—)、チォシアン酸イオン（SCN—)およびシアン化物イオン (CN からなる群より選択される、上記項目 Aに記載の方法。 (項目 A30)

(項目 A31)

前記 D)工程において、前記塩化物イオン（C1—)が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3 ーァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4)、炭酸緩衝液（pH8. 5)、リン酸緩衝液 (pH8. 0)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸（ HEPES)緩衝液（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝液、 3—(Ν—モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝液、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν， 2エタンスルホン酸緩衝酸緩衝液、ピぺラジン—Ν, N' ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝液、 Ν 2 ヒドロキシェチノレピペラジン Ν，一 2 ヒドロキシプロパン 3 プロパンスノレホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルダリシン)緩衝液、 Ν, Ν ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝液、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝液、 3 Ν シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液および 3 シク口へキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝液からなる群より選択される少なくとも 1つの緩衝液により提供される、上記項目 Αに記載の方法。 (項目 A32)

前記塩化物イオン（C厂）が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（PH8. 4)、炭酸緩衝液（pH8. 5)、PBS (pH8. 0)および HEPES緩衝液 (pH7. 2)からなる群より選択される少なくとも 1つの緩衝液により提供される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A33)

前記塩化物イオン（C厂）が、 NaCl、 HCほたは CaClより提供される、上記項目 Aに

2

記載の方法。

(項目 A34)

前記塩化物イオン (C1—)が、 NaClにより提供される、上記項目 Aに記載の方法。 (項目 A35)

前記 D)工程が、

i)形成されたリボソームを親水性化処理する工程；

ii)該リボソームへ標的指向性物質を結合させる工程；

を包含する、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A36)

前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A37)

前記アンミン白金錯体が、難水溶性である、上記項目 Aに記載の方法。

(項目 A38)

A— 1) 2つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を調製する工程； A— 2)該水溶性の白金錯体を含む溶液の pHを pH6〜； 10の範囲内に調節するェ程； B— 1) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 1： 9〜9： 1の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；および

C 1)該混合溶液を限外濾過に供する工程;および

D— 1 )限外濾過後に、該混合溶液を塩化物イオン (C1— )の存在下に供する工程、を包含し、

ここで、該アンミン白金錯体は難水溶性である、方法。

(項目 A39)

(B1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35： 40： 15： 5： 5： 167のモル比で混合させて脂質を調製する工程；

(B2)該脂質を、メタノール 'クロ口ホルム（1： 1)溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;および

(B3)該脂質膜を、 N トリス (ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (pH8. 4)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程、

(B4)該脂質懸濁液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程 (B5) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 7 : 3の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；

(C1 )該混合溶液を分画分子量 10, 000で限外濾過に供する工程；および

(D1)限外濾過後に、該混合溶液を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4)、炭酸緩衝液（pH8. 5)、PBS (pH8. 0)および H

EPES緩衝液 (pH7. 2)からなる群より選択される少なくとも 1つの緩衝液に曝すェ程、

を包含する、方法。

(項目 A40)

アンモニアを有するアンミン白金錯体が、 lmg脂質あたり 20〃 g以上で含まれる、ァンミン白金錯体を内包するリボソーム。

(項目 A41)

前記アンミン白金錯体が、 2つのアンモニアを有する、上記項目 Aに記載のリポソ一ム。

(項目 A42)

前記アンミン白金錯体が、 cis ジアミンジクロ口白金 (II)である、上記項目 Aに記載のリボソーム。

(項目 A43)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソーム力 S、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを含む、上記項目 Aに記載のリボソーム。 (項目 A44)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソーム力 S、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35： 40： 15： 5： 5： 167のモル比で含む、上記項目 Aに記載のリボソーム。

(項目 A45)

前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目 Aに記載のリボソーム。

(項目 A46)前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプタ一、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、上記項目 Aに記載のリボソーム。

[0014] なお、上記記載における、 A, B工程などの記載は、必ずしも同じ工程をさしているのではなぐ発明により適宜異なって理解されるべきことに留意すべきである。

[0015] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読めば、明白である。

発明の効果

[0016] これまで、リボソームに内包できないか、内包効率の低かった難水溶性アンミン白金錯体 (例えば、シスブラチン)をリボソームに効率よく内包することが可能とし、従来達成できなかった濃度 ·量の難水溶性アンミン白金錯体 (例えば、シスブラチン)をリポソーム中に内包させることができた。これにより、従来技術よりはるかに低用量の難水溶性アンミン白金錯体含有リボソーム製剤を投与して従来と同程度の薬効 (例えば、抗がん作用）を奏することが可能となった。

[0017] 以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術力もその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。

[0018] 以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むこと力 S理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。矛盾する場合、本明細書 (定義を含めて)が優先する。

[0020] (用語の定義）

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

[0021] 本明細書において「アンミン白金錯体」とは、アンモニアを有する白金錯体をいう。アンミン白金錯体としては、例えば、 cis ジアンミンジクロロ白金（II) <シスブラチンとして知られる。〉、 cis ジアンミンジニトラト白金（11)、 cis ジアンミン一 1 , 1—シクロブタンージカルボキシラト白金（II)くカルポプラチンとして知られる。〉、 cis ジァンミン（グリコラト）白金（Π) <ネダプラチンとして知られる。〉、（1R, 2R—ジアンミンシクロへキサン)ォキサラト白金（Π)くォキザリブラチンとして知られる。〉、 cis ジァンミンジブロモ白金（II) <抗がん活性を有する。〉、一ヒドロキソ白金（II) <抗がん活性を有する。〉などが挙げられるが、これらに限定されない。このうち、難水溶性のアンミン白金錯体としては、例えば、 cis ジアンミンジクロロ白金（11)、 cis ジアンミン 1 , 1ーシクロブタンージカルボキシラト白金（11)、 cis ジアンミンジブロモ白金（I I)等を挙げること力でさる。

[0022] 本明細書において「cis ジアンミンジクロロ白金（II) (CDDP)」とは、シスプラチンともいう。これは、以下の構造を有する：

[0023] [化 1]

NH₃、 ,Ci

Pt

NH₃, 、CI

[0024] シスブラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられる力これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。

[0025] 本明細書において「cis ジアミンジクロ口白金（II)の水溶性形態」とは、水溶性の状態にあるシスプラチンをいう。例えば、 cis ジアミンジクロ口白金（II)の水溶性形態としては、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II) (CDDP— 3)などが挙げあれる。

[0026] 本明細書において、「cis ジアンミンジニトラト白金（II) (CDDP— 3)」は、シスプラチン硝酸体ともいう。これは、以下の構造を有する：

[0027] [化 2]

[0028] 本明細書において、「cis ジアンミン 1 , 1ーシクロブタンージカルボキシラト白金

(11)」は、カルポプラチンともいう。これは、以下の構造を有する：

[0029] [化 3]

[0030] カルポプラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられる力これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。

[0031] 本明細書において、「cis ジアンミン（グリコラト）白金（11)」は、ネダプラチンともいう。これは、以下の構造を有する：

[0032] [化 4]

ネダプラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられる力これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。

[0034] 本明細書において、「1R, 2R—ジアンミンシクロへキサン）ォキサラト白金（II)」は、ォキザリブラチンともいう。これは、：

[0035] [化 5]

[0036] ォキザリブラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられる力これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。

[0037] 本明細書において、「cis—ジアンミンジブロモ白金（11)」は、以下の構造を有する：

[0038] [化 6]

[0039] cis—ジアンミンジブロモ白金（II)は、抗がん活性を有する。

[0040] 本明細書において、「ーヒドロキソ白金（II)二核錯体」は、例えば、以下の構造の化合物が挙げられる：

[0041] [化 7]

(N0₃)₂ [0042] [Iーヒドロキソ白金 (II)二核錯体は、抗がん活性を有する。

[0043] これらの白金錯体において、 Ptとアンミン配位子の結合は強い。従って、上記白金錯体は水溶液中では、 Ptと oの結合部分が解離した状態で存在する。

[0044] 本発明では、リボソーム力 Sリボソームとして存在する時点で水溶性の形態の白金錯体が接触して存在することが重要であると考えられる。したがって、シスブラチン以外の白金錯体であっても、いったん水溶性の形態にして、その後難水溶性の塩を形成することさえできれば本発明の効果が達成されることが理解される。当該分野において、上記白金錯体または他の白金錯体につ!/、てこのような水溶性および難水溶性の塩を形成するイオン種は知られている力、、または適宜選択することができることから、シスブラチン以外の白金錯体であっても本発明を実施することができることが理解される。そして、水溶性の選択の基準としては、 0. 5g/100g水〜 10g/100g水（例えば、 0. 5g/100g水、 1. 0g/100g水、 1. 5g/100g水、 2. 0g/100g水、 2. 5 g/100g水、 3. 0g/100g水、 3. 5g/100g水、 4. 0g/100g水、 4. 5g/100g 水、 5. 0g/100g水、 5. 5g/100g水、 6. 0g/100g水、 6. 5g/100g水、 7. Og /lOOg水、 7. 5g/100g水、 8. 0g/100g水、 8. 5g/100g水、 9. 0g/100g水、 9. 5g/100g水、 10g/100g水以上（以上、上限）であり、 10g/100g水、 9. 5g /lOOg水、 9. 0g/100g水、 8. 5g/100g水、 8. 0g/100g水、 7. 5g/100g水、 7. 0g/100g水、 6. 5g/100g水、 6. 0g/100g水、 5. 5g/100g水、 5. Og/1 00g水、 4. 5g/100g水、 4. Og/lOOg水、 3. 5g/100g水、 3. Og/lOOg水、 2. 5g/100g水、 2. Og/lOOg水、 1. 5g/100g水、 1. Og/lOOg水以下（以上、下限）の任意の範囲の可能な組合せ）（水溶性のものの溶解度）、および難水溶性の選択の基準としては、 0. 0g/100g水〜 0. 5g/100g水（例えば、 0· 0g/100g水、 0. 05g/100g水、 0. lg/100g水、 0. 15g/100g水、 0. 2g/100g水、 0. 25g /100g水、 0. 3g/100g水、 0. 35g/100g水、 0. 4g/100g水、 0. 45g/100g 水、 0. 5以上（以上、上限）であり、 0. 5g/100g水、 0. 45g/100g水、 0. 4g/10 0g水、 0. 35g/100g水、 0. 25g/100g水、 0. 2g/100g水、 0. 15g/100g水、 0. lg/100g水、 0. 05g/100g水以下（以上、下限）の任意の範囲の可能な組合せ）（難水溶性のものの溶解度）として溶解度で表すこと力できる。 [0045] 本明細書において「白金錯体原料」とは、緩衝液と混ぜると水溶性アンミン白金錯体を形成し得る原料をいう。したがって、混合することで、水溶性アンミン白金錯体を形成することができる限り、どのような材料を用いてもよぐ原料は、複数種類あってもよい。本明細書において使用され得る白金錯体原料としては、例えば、 cis -〔Pt (N H ) I〕、 cis—〔Pt (NH ) CI〕、 cis—〔Pt (NH ) Br〕、 K PtClが挙げられるが、

3 2 2 3 2 2 3 2 2 2 4

これらに限定されない。例えば、 cis—〔Pt (NH ) I〕、cis—〔Pt (NH ) CI〕、 cis—

3 2 2 3 2 2

〔Pt (NH ) Br〕、 K PtClは、硝酸銀 (AgNO )を 2等量（1. 98等量）添加するだ

3 2 2 2 4 3

けで硝酸体になる。

[0046] 例えば、シスプラチンの場合であれば、シスプラチンの水に対する溶き性は、 2mg /ml (室温）である。シスプラチン硝酸体は、 20mg/mlである。つまり、シスプラチンの溶解度（室温)以上の白金錯体で使用することできる。当該分野において、上記シスプラチンまたは他の白金錯体につ!/、てこのような水溶性および難水溶性の塩を形成するイオン種は知られている力、、または適宜選択することができることから、シスプラチン以外の白金錯体であっても、シスブラチンと同様に、その溶解性を考慮することによって適宜、選択すること力 Sできる。このときに、加える硝酸銀の当量数を適宜調節することによって同様に実施することができる。また、臭化物イオンの濃度、ヨウ化物イオンの濃度は、いずれも塩化物イオンと同等で問題なく実施することができる。臭化物イオン、ヨウ化物イオンのほうが塩化物イオンよりも結合性が強いため、同条件でおこなっても、同様に難水溶性物質が形成されると考えられるため。また、それぞれのイオンのリボソーム膜透過性に差異はな!/、と考えられることから、これらの要素を考慮して実施することができる。

[0047] 本明細書において「アンミン基」とは、アンモニア分子が別の基と結合したときに付される名称である。

[0048] 本明細書において「リボソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リボソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリボソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いので DDS用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。本発明において、リボソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位 (例えば、糖脂質、ガンダリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位 (例えば、ホスファチジルエタノールァミン)を有し得る。

[0049] 本発明において使用されるリボソームは、水溶性アンミン白金錯体を通過させることができさえすれば、どのような製法により作製されたものであってもよい。本発明において、リボソームは、複数の製造方法により調製されたリボソーム（例えば、改良コール酸塩法のもの、凍結乾燥法のもの）を混ぜ合わせて使用することもできる。なぜなら、水溶性アンミン白金錯体をリボソーム膜を介してリボソーム中に移行させ、維持できればよいからである。このようなリボソームは、その用途に応じて、構成脂質成分を組合せたリボソームへの水溶性白金錯体の内包量、内包効率、内包後の漏出およびリポソームの安定性などを検討することにより当業者が適宜、決定すること力 Sできる。そして、その判断基準は以下のとおりである。

[0050] 内包量は、リボソーム中の白金量を原子吸光高度法（FAAS)により測定し、その用途に応じた白金量であればょレ、。

[0051] 内包効率は、初期白金錯体量に対するリボソームに内包された白金量を割合として算出することができる。用途にもよる力たとえば、 0. 5%以上の白金錯体が内包されていればよい。

[0052] 内包後の漏出は、リボソーム中の白金量を原子吸光光度法 (FAAS)によって経時的に定量し、内包直後の白金量と比較することにより評価することできる。

[0053] リボソームの安定性は、粒子径分布を経時的に測定することによって、確認することができる。

[0054] リボソーム膜は固すぎると物質を透過させず、柔らかすぎるとリボソーム自体が不安定になる。リボソーム膜の堅さは、リボソーム構成成分の種類、混合比などにより決定される。リボソーム膜の堅さおよび流動性は、リボソームのバリアー能に影響する。

[0055] 水溶性物質力 Sリボソーム内水相に留まるのは、脂質 2重膜が水溶性物質に対する障壁として働!/、て!/、るためである。膜の流動性および透過性は、ゲル相と液晶相とで全く異なる。液晶相では一般に相転移温度の低い脂質が多く含まれるほど、また、温度が高いほど流動性は増加する。リボソームの内水相に封入した物質は、膜の相転移および流動性に依存して漏出性が変動する。

[0056] 飽和脂質で構成されるリボソームは、ゲル相では高!/、バリア能（透過しにくいが漏れにくい）を示す。飽和脂質で構成されるリボソームは、相転移温度以上にてバリア能を消失するが、液晶相の飽和脂質にコレステロールまたは少量の不飽和脂肪酸を添加するとバリア能が回復する。

[0057] 不飽和脂肪酸で構成されるリボソームは、液晶相でノリア能を有する力温度の上昇に従って、流動性および低分子の膜透過性が上昇する。不飽和脂肪酸膜においてもコレステロールの添加は、膜のバリア能を高める。つまり、コレステロール含量が多くなると透過性は下がる力内水相の物質は安定にとどめることができる。

[0058] コレステロールが膜成分に含まれている場合、相転移の状態および膜の流動性は大きく変化する。コレステロールは不飽和脂質膜では、脂質分子間の相互作用を高め、流動性および膜透過性の減少を引き起こす。一方、飽和脂質に加えると相転移が消失し、ゲル相の温度でも流動性を有する膜となる。

[0059] これらの効果は、コレステロールが脂質分子と複合体を形成するために生ずると考えられている。コレステロールが存在すると、相転移における劇的な流動性変化が消失するので、結果として、相転移温度以上では流動性の減少が生じ、一方、相転移温度以下では、流動性の増加が認められる。

[0060] 本発明において使用されるリボソームは、コレステロールが含まれる場合、封入させる物質が膜を通過し、リボソーム中に留まるリボソーム膜を硬さを達成するのに充分な比率（例えば、コレステロールがリン脂質に対して、例えば、約 30〜50モル％、約 30 モル％以上、約 35モル％以上、約 40モル％以上、約 45モル％以上であり、約 50モル％以下、約 45モル％以下、約 40モル％以下、約 35モル％以下であってもよぐ約 50モル％以上または約 30モル％であってもよぐそれらの任意の範囲の可能な組み合わせ)で含まれ得る。

[0061] リボソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製されたものであり得る（例えば、「リボソーム応用の新展開〜人工細胞の開発に向けて〜監修秋吉一成/辻井薫 NTS p33〜45 (2005)」、「リボソーム野島庄七 p21— 40 南江堂（1988)」を参照のこと。）が挙げられ得る。

[0062] 例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、 a)脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、および b)混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明の糖鎖リボソームにおいて好ましい実施形態では、リンカ一としてタンパク質を使用することが好ましぐタンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリボソームへのカップリングは、以下の 2段階反応によって行うことができる。 a)リポソーム膜上のガンダリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、および b)還元的ァミノ化反応による酸化リボソームへの糖タンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリボソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質'リボソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法 (GPC)および走査型電顕（SEM)や動的光散乱法 (DLS)などを使うことができる。一例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35： 40： 15： 5： 5： 167のタイプのリポソームを製造することができる。

[0063] リボソームは、凍結乾燥法によっても作製することができる。凍結乾燥法は、例えば、 H. Kikuchi, N. Suzuki et al, Biopharm. Drug Dispos. , 17, 589—り 05 (1999)等により報告されている。例えば、以下の方法により調製することができる。リポソーム溶液を— 40〜― 50°Cで凍結させ、凍結乾燥させる。凍結乾燥粉末に内包物質溶液を添加して再水和する。限外濾過法または透析法で、内包されなかった物質を除去する。必要に応じて、最初のリボソーム溶液に糖などを添加する。また、目的に応じて、フレンチプレス法、メンブランフィルタ一法により粒子サイズを調整する。

[0064] 本明細書において使用される場合、用語「リボソーム原料」とは、緩衝液に混ぜるとリボソームを形成することができる脂質をいう。これらとしては、たとえば、実施例において使用されているミセル懸濁液が挙げられる力水溶性アンミン白金錯体と接触するときにリボソームを形成することができ、水溶性アンミン白金錯体を通過させることができるような脂質であれば、これら以外のものであってもよい。本製造方法において使用されるリボソーム原料は、製造されるリボソームの用途に応じて、構成脂質成分を組合せたリボソームへの水溶性白金錯体の内包量、内包効率、内包後の漏れおよびリボソームの安定性を検討することにより当業者が適宜、決定することができる。

[0065] 本明細書において使用される場合、用語「脂質」とは、長鎖の脂肪族炭化水素またはその誘導体をいう。「脂質」は、例えば、脂肪酸、アルコール、ァミン、アミノアルコール、アルデヒドなどからなる化合物の総称である。本発明において使用されるリポソーム形成能を有する脂質またはリボソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類 (ガンダリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフインゴミエリン類、コレステロール類等。ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。

[0067] ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン等が挙げられる。

[0068] ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルホスフェート等が挙げられる。

[0069] 糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラタトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガンダリオシド類等が挙げられる。ガンダリオシド類としては、ガングリオシド GM1 (Gal β 1 , 3GalNAc β ΐ , 4 (NeuA α 2, 3) Gal /3 1 , 4Glc β ΐ , 1

' Cer)、ガンダリオシド GDla、ガンダリオシド GTlb等が挙げられる。

ル等が好ましい。 [0071] このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリボソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添カロするのが望ましい。例えば、本発明において使用されるリボソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類（モル比 0〜70%)、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比 0〜30%)、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される 1種以上の脂質 (モル比 0〜30%)、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフインゴミエリン類からなる群から選択される 1種以上の脂質 (モル比 0 〜40%)、ならびにコレステロール類（モル比 0〜70%)を含むものが挙げられる。ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含むことが好ましい。アルブミンのようなリンカ一の結合が容易になるからである。

[0072] 本発明において使用されるリボソームを構成する脂質またはリボソーム原料としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガンダリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、ジミリストイルホス

ファチジノレイノシトーノレ、ジノノレミトイノレホスファチジノレイノシトーノレ、ジステアロイノレホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイ

、ガラクトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラタトシルセラミド、ホスフナチド、グロポチド、 GM1 (Gal β 1 , 3GalNAc β ΐ , 4 (NeuA α 2, 3) Gal /3 1 , 4Glc β 1 , 1 ' Cer)、ガンダリオシド GDI a、ガンダリオシド GDlb、ジミリストイルホスファチジルグリセローール、ジォレオイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる力 S、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガンダリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。

[0073] 本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、 A)水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程; B)リボソーム、リボソーム原料またはその組合せを提供する工程：および C)該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リボソーム、該リボソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リポソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リボソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件に供する工程を包含する。本発明の製造方法は、 D)前記 C)工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程をさらに含み得る

[0074] 好ましくは、前記 D)工程は、 i)形成されたリボソームを親水性化処理する工程; ii) 該リボソームへ標的指向性物質を結合させる工程; iii)該修飾標的指向性物質が結合したリボソームを親水性化する工程ならびに iv)該親水性化したリボソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程を包含し得る。

[0075] 本発明において水溶性アンミン白金錯体は、好ましくは、 2つのアンミン基を有し、より好ましくは、 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)であり得る。

[0076] 好ましい製造方法としては、以下の工程: A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程； B)前記リボソーム原料を提供する工程; C)該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リボソーム形成維持条件に供する工程を包含し得る。この方法では、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないものが使用され得る。

[0077] 1つの実施形態において、本製造方法の前記 B)工程は、 B— i)リボソーム形成能を有する脂質を、メタノール 'クロ口ホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;および B— ii)該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程を包含し得る。 [0078] より好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、 A)工程として、 (Al) cis- ジアンミンジニトラト白金（II)を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を含む溶液を調製するェ程であって、該 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；（A2)該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH6〜； 10 (好ましくは、 pH8. 4)に調節する工程を包含し得る。

[0079] さらに、 B)工程として、（B1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを（好ましくは、例えば、 35 : 40 : 15 : 5 : 5 : 167のモル比）混合させて脂質を調製する工程；（B2)該脂質を、メタノール 'クロ口ホルム（好ましくは、 1： 1)溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および (B3)該脂質膜を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (ρΗ8· 4)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該 Ν トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；および (B4)該脂質懸濁液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程を包含し得る。

[0080] さらに、 C)工程として、（Cl) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II) 溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 1 : 9〜9： 1 (好ましくは、 7 : 3)の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 000 (好ましくは、 10, 000)で限外濾過に供する工程を包含し得る。

[0081] 別の好ましい製造方法としては、 A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程； B)前記リボソームを提供する工程；および C)該白金錯体溶液と、該リボソームとを混合し、前記リボソーム形成維持条件に供する工程を包含する方法が挙げられる。この方法では、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まな!/、ものが使用され得る。前記リポソ一ムは、例えば、水溶性アンミン白金錯体力リボソーム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有し得る。前記リボソーム形成維持条件は、例えば、リボソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体がリボソーム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な条件であり得る

〇

[0082] 別のより好ましい実施形態において、本発明の製造方法の A)工程は、（Al) cis— ジアンミンジニトラト白金（II)を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を含む溶液を調製するェ程であって、該 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；（A2)該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH6〜； 10 (好ましくは、 pH8. 4)に調節する工程を包含し得る。

[0083] 本発明の製造方法の B)工程は、（B1)リボソームを提供する工程；（Cl) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)溶液と、該リボソームとを、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 000 (好ましくは、 10, 000)で限外濾過に供する工程を包含し得る。

[0084] 1つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、 A) 2つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を提供する工程; B)該水溶性の白金錯体を含む溶液とリボソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して混合溶液を作製する工程; C)該混合溶液をリボソームが形成する条件に供する工程；および D)該混合溶液を、形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程、を包含する。好ましくは、本発明の水溶性の白金錯体は、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)であり得る。

[0085] より好ましい製造方法としては、以下の工程: A— 1) 2つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を調製する工程; A— 2)該水溶性の白金錯体を含む溶液の pHを pH6〜； 10の範囲内に調節する工程； B—l) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 1 : 9〜9： 1の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程;および C 1)該混合溶液を限外濾過に供する工程；および D— 1)限外濾過後に、該混合溶液を塩化物イオン (C1—)の存在下に供する工程、を包含する方法が挙げられる。

[0086] 本発明の cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包するリボソームは、以下の方法によつて製造され得る。具体的には、この方法は、（Al) cis ジアンミンジニトラト白金 (II )を、塩化物イオン (CDを実質的に含まな!/、N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液を調製する工程；（A2)該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を含む溶液の pHを pH8 • 4に調節する工程；（B1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35 : 40 : 15 : 5 : 5 : 167のモル比で混合させて脂質を調製する工程；（B2)該脂質を、メタノール 'クロ口ホルム（1： 1)溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;および (B3)該脂質膜を、塩化物イオン (C1—)を実質的に含まない N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程、（Β4)該脂質懸濁液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；（B5) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 7： 3の範囲内の比で混合して混合溶液を作製するェ程；（C1)該混合溶液を分画分子量 10, 000で限外濾過に供する工程；および (D1) 限外濾過後に、該混合溶液を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液（ρΗ8· 5)、PBS (pH8. 0)および HEPES緩衝液 (ρΗ7· 2)からなる群より選択される少なくとも 1つの緩衝液に曝す工程、包含す

[0087] 本明細書において使用される場合、用語「混合物」とは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せ (本明細書において、水溶性アンミン白金錯体等とも称される。）と、リボソーム、該リボソーム原料またはその組合せ（本明細書において、リボソーム等とも称される。）とを混合して含むものをいう。

[0088] 本明細書にぉレ、て使用される場合、用語「混合溶液」とは、水溶性の白金錯体を含む溶液とリボソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して作製した溶液をいう。 [0089] リボソーム、リボソーム原料またはその組合せ、白金錯体、白金錯体原料またはその組合せ、必要であれば緩衝液は、任意の順序で混合することができる。例えば、これらの順序は、 1)リボソーム原料と白金錯体とを混合して緩衝液を添加する順序、 2 )リボソーム原料と緩衝液とを混合した後に、白金錯体を添加する順序、 3)白金錯体を緩衝液に溶解した後にリボソーム原料を添加する順序であり得る力これらに限定されない。なぜなら、リボソームが形成 ·維持される条件を保持する限り、どのような順序で混合されても、リボソームが存在する時点で水溶性アンミン白金錯体がリポソ一ムに接触することができるかぎり、本発明は達成することができるからである。水溶液中で強酸性を示す白金錯体を用いる場合には、混合液は、 pH6〜； 10の範囲が好ましい。

[0090] すなわち、本発明では、リボソーム「形成 ·維持」条件を保持する限り問題がない、と理解される。

[0091] 理論に束縛されることを望まな!/、が、水溶液中で強酸性の白金錯体（シスプラチン硝酸体含む）は、脂質成分とシスブラチン硝酸体の混合物を水溶液で再溶解する場合、アルカリ性の緩衝液で再懸濁する必要があり、酸性化では、脂質が分解することから、これらの条件を考慮することができる。アルカリ性の必要なレベルとしては、たとえば、 80mgシスプラチン硝酸体を 4mlの TAPS(pH8.4)に溶解するとき、 INNaOHが約 3 50 1加える事を利用することができる。

[0092] 本発明の製造方法では、この混合物を、リボソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リボソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態に供することにより、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームが作製され得る。この混合物は、 pH6〜； 10の範囲内にありさえすればよい。なぜなら、中性付近の pHであれば、リボソームを形成することおよび/またはリボソームを維持することが可能であるからである。

[0093] 本明細書において使用される場合、用語「リボソーム形成維持条件」とは、リポソ一ムが形成するか、および/またはリボソームが維持されるための条件を!/、う。

[0094] 本明細書において使用される場合、用語「リボソームが形成する」条件とは、この混合物（例えば、混合溶液）中でリボソームが形成するための条件をいう。リボソームが形成する条件は、例えば、該混合物を限外濾過に供すること、該混合物を一晚静置すること等であり得る。さらに好ましくは、リボソームが形成する条件は、この混合物を分画分子量 500〜300, 000 (好ましくは、 10, 000)で限外濾過に供することであり得る。

[0095] 本明細書において使用される場合、用語「リボソームが維持される」条件とは、この混合物（例えば、混合溶液）中でリボソームが維持されるための条件をいう。リポソ一ムが維持される条件は、例えば、理論に束縛されることを望まないが、リボソームは、 pH6. 0以下になると壊れ維持されない。界面活性剤を添加すると壊れれる為、維持されない。超音波など物理化学的な力により壊れる為、維持されない。高温 60°C以上になると壊れるので維持されない。外液中に Cl—， Br- , I- , SCN—， CN—または核酸塩基（グァニン、シトシン）が含まれると、水溶性白金錯体の状態で存在しないか、または不活性化する。（グァニン塩基の N7位の窒素と結合すると不活化すること力ゝら、これらを考慮すること力 Sでさる。

[0096] 本明細書において使用される場合、用語「白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件」とは、その混合物中で白金錯体の形成する塩が水溶性の状態となる条件をいう。例えば、このような条件としては、混合液を、白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まな!/、溶液の条件下におくことを!/、う。

[0097] 本明細書において使用される場合、用語「形成する塩が難水溶性であるイオンを含まな!/、」とは、その溶液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを実質的に含まないことをいう。形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（ CD、臭化物イオン（Br— )、ヨウ化物イオン（厂）、チォシアン酸イオン（SCN—)、シァン化物イオン（CN—)等であり得る。この溶液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まなレ、か、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでレ、なければ'よい。

[0098] 本明細書において使用される場合、難水溶性塩を形成し得るイオンを「実質的に含まな!/、」とは、難水溶性塩を形成しなレ、程度の濃度で該イオンを含み得ることをレ、う。例えば、難水溶性塩を形成し得るイオンが塩化物イオン (CL—)であれば、その濃度は、体内で存在する濃度以下の濃度（約 0〜4mM程度)であるといえる。難水溶性塩を形成し得

る濃度は、以下のような工程を包含する方法により、実験的に決定され得る：

1)アンミン白金錯体を含む水溶液（6mM)を調製する工程；

2)種々の濃度で難水溶性塩を形成し得るイオンを含む溶液（終濃度 0〜200mM) を調製する工程；

3) 2)工程の難水溶性塩を形成し得るイオンを含む溶液を、 1)工程のアンミン白金錯体を含む水溶液に、該イオンが難水溶性塩を形成するまで添加する工程；および

4)該イオンを含む溶液を添加した量から、難水溶性塩を形成し得る濃度を算出する工程。

[0099] 難水溶性塩を形成しない濃度は、他の塩についても同様に定義される。

[0100] 本明細書において使用される場合、用語「水溶性」とは、水に溶ける性質をいう。本発明のアンミン白金錯体内包リボソームの製造方法によりリボソームに内包されるァンミン白金錯体は、好ましくは、難水溶性である。本明細書において使用される場合、用語「難水溶性」とは、水に溶けないか、ほとんど溶けない性質をいう。

[0101] 本明細書において「第一緩衝液」とは、水溶性アンミン白金錯体、その白金錯体の材料またはその組合せを溶解するための緩衝液をいう。

[0102] 本発明の製造方法にお!/、て、第一緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まないものが使用され得る。この第一緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。形成する塩が難水溶性であるイオンとは、例えば、塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン (Br— )、ヨウ化物イオン (厂）、チォシアン酸ィオン（SCN—)、シアン化物イオン (CN—)等であり得る。この第一緩衝液は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1— ピぺラジュル]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3- (Ν モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν，一 2エタンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチノレ）メチルー 2—ヒドロキシ一 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン一 N, N，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一 2—ヒドロキシプロパンー3—プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、 N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得る。好ましくは、第一緩衝液は、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、 _PH8. 4)を含む緩衝液であり得る。

[0103] 本明細書において「白金錯体溶液」とは、水溶性アンミン白金錯体を第一緩衝液に溶解して調製した、水溶性の白金錯体を含む溶液をいう。白金錯体溶液は、例えば、シスプラチン硝酸体であれば、 15mM〜300mM 溶解度の範囲を基にシスプラチン硝酸体（分子量 353)を基準として範囲を設定することができる。このような水溶性の白金錯体を含む溶液は、当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。従って、このような溶液の調製は、当業者の技術範囲内である。

[0104] 本明細書において使用される場合、用語「水溶性の白金錯体を含む溶液」とは、水溶性の状態で白金錯体を含む溶液であればょレ、。この水溶性の白金錯体を含む溶液は、 pH6〜10 (好ましくは、 8. 4)の範囲内に調節され得る。この水溶性の白金錯体を含む溶液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まな!/、溶液であり得る。

[0105] 本発明において使用される水溶性の白金錯体を含む溶液は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（pH8. 4)、炭酸緩衝剤（pH 8. 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1ーピペラジニル ]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3- (Ν モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1—2 —アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν，一2エタンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル）メチル 2 ヒドロキシ一 3 -ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン Ν, Ν，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν， 2—ヒドロキシプロパン —3—プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルダリシン)緩衝剤、 N , N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルァミノ）ェタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含み得る。好ましくは、水溶性の白金錯体を含む溶液は、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤 (pH8. 4)を含み得る。「白金錯体溶液」または「水溶性の白金錯体を含む溶液」は、上記以外の緩衝剤を含んでいてもよい。なぜなら、リポソ一ムが存在する時点で、アンミン白金錯体を水溶性の状態に保つことができればよい力もである。このような緩衝剤は、 pH6〜； 10に緩衝能を有し、白金錯体と結合性を有する陰イオンを含んでいなければ、リボソームを維持し、水溶性白金錯体を維持すること力 Sでさる。

[0106] 本明細書において使用される場合、用語「脂質懸濁液」とは、リボソーム形成能を有する脂質の懸濁液であり、リボソームを形成する条件に供したときにリボソームを形成する脂質が懸濁した任意の液をいう。膜状態で懸濁している場合は、「脂質膜懸濁液」ともいう。また、脂質が溶媒に溶解している場合には、「脂質溶液」ともいう。広義には、脂質溶液は、脂質懸濁状態のものも包含しうる。

[0107] そのような「リボソーム形成能を有する脂質の懸濁液」の組成は、以下の説明のように、当業者は、その組成を適宜決めることができ、その範囲が明確に決定することができる。その説明は以下のとおりである：本発明にお!/、て使用され得る脂質懸濁液は、リボソームの作製に一般的に用いられる脂質により作製され得る。リボソームの作製に一般的に用いられる脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール等が挙げられる。リボソームの作製において代替的に使用され得る脂質としては、ホスファチジルエタノールァミン、ガングリオシド、コール酸ナトリウム、ジセチルホスフエ

クトシルジグリセリド等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明において使用され得る脂質懸濁液は、以下の範囲の組成であり得る：

ホスファチジルコリン： 0〜50mM ホスファチジルエタノールァミン： 0〜3· 3mM

コレステロール： 0〜26· ImM

ガンダリオシド： 0〜9· 3mM

コーノレ酸ナ卜リウム： 0〜； 108. 9mM

ジセチノレホスフェート： 0〜3· 29mM。

[0108] このリボソーム形成能を有する脂質の懸濁液は、 B— i)ポソーム原料である脂質を、メタノール 'クロ口ホルム溶液 (好ましくは、 1： 1)に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程; B— ii)該脂質膜を、第二緩衝液 (懸濁緩衝液）に懸濁する工程によって作製され得る。この脂質懸濁液は超音波処理されていてもよい。この脂質懸濁液は、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを（好ましくは、 35 : 40 : 1 5 : 5 : 5 : 167のモル比）で含み得る。本方法において、水溶性アンミン白金錯体を含む溶液と脂質懸濁液とは、 1： 9〜9： 1の範囲内（好ましくは、 7： 3)の比で混合され得

[0109] 本明細書において「第二緩衝液」とは、脂質懸濁液を溶解するための緩衝液をいう

。この第二緩衝液は、本明細書において「懸濁緩衝液」ともいう。

[0110] 本発明の製造方法において、第二緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まないものが使用され得る。この懸濁緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。形成する塩が難水溶性であるイオンとは、例えば、塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン (Br— )、ヨウ化物イオン (厂）、チォシアン酸ィオン（SCN—)、シアン化物イオン (CN—)等であり得る。この第二緩衝液は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1— ピぺラジュル]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3- (Ν モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一 2エタンスルホン酸緩衝剤、 N トリス（ヒドロキシメチノレ）メチルー 2—ヒドロキシ一 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン一 N, N，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一 2—ヒドロキシプロパンー3—プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、 N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得る。好ましくは、第一緩衝液は、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、 _PH8. 4)を含む緩衝液であり得る。

[0111] 「第二緩衝液」または「懸濁緩衝液」は、上記以外の緩衝剤を含んで!/、てもよ!/、。なぜなら、リボソームが存在する時点で、アンミン白金錯体を水溶性の状態に保つことができればよいからである。このような緩衝剤は、 pH6〜； 10に緩衝能を有し、白金錯体と結合性を有する陰イオンを含んでいなければ、リボソームを維持し、水溶性白金錯体を維持することができる。

[0112] 本明細書において、第一緩衝液と第二緩衝液とは、同じ組成であってもよいし、別の組成であってもよい。なぜなら、これらの緩衝液は、リボソームが存在する時点で白金錯体を水溶性の状態に保つことができるような緩衝液でありさえすれば、どのようなものであってもよ!/、からである。

[0113] 本明細書において使用される場合、用語「白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下」とは、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンが提供され得る環境下におくことをいう。

[0114] 好ましい実施形態において、「白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下」は、塩化物イオン（C1—)の存在下であり得る。

[0115] 本製造方法において、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン (例えば、塩化物イオン（C厂））は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液（ρΗ8· 5)、 PBS (pH8. 0)または HEPES 緩衝液（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝液、 3— (Ν モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1 2—アミノエタンスルホン酸緩衝液、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン一 N，一 2エタンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒドロキシメチル)メチル—2 ヒドロキシ— 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピぺラジン一 N, N，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一2 ヒドロキシプロパン一 3 プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル )グリシン緩衝液、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝液、 3— N シク口へキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液、 3 シクロへキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝液等により提供され得るが、これらに限定されない。なぜなら、 pH6〜； 10に緩衝能を有し、白金錯体と結合性を有する陰イオンを含んでいなければ、リボソームを維持し、水溶性白金錯体を維持することができるからである。一般的な緩衝液の調製および特徴づけは、当該分野におレ、て公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。従って、目的とするアンミン白金錯体の難水溶性塩と、上記 pH、緩衝液が含み得るイオン等を考慮して、当業者は、白金錯体が難水溶性の塩を形成するイオンを含む緩衝液を適宜、選択することができる。

[0116] 本方法において、塩化物イオン（CDは、 NaCl、 HC1、 CaClにより提供され得る

2

1S これらに限定されない。好ましくは、塩化物イオン (CDは、 NaClにより提供され得る。

[0117] 好ましい実施形態において、本発明におけるリボソームは、ガンダリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含ませてそれにペプチドなどのリンカ一を結合させ、標的指向性物質 (例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一、抗体など）を結合させることが可能である。

[0118] 本明細書において使用される場合、用語「標的指向性物質」とは、病態（特に、腫瘍)を特異的に認識するものをいう。本発明において使用される「標的指向性物質」としては、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、ァプタマ一、抗体等が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。なぜなら、標的指向性物質は、リボソームを破壊することなぐリボソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リボソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定すること力 Sできる。適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリボソーム膜表面に修飾することができる。

[0119] 本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、免疫原である抗原によって惹起された特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、 B細胞により生産され、血液、体液中に存在する。抗体は、抗原と特異的に反応するという特徴を有する。抗体は、抗原の呈示による刺激の結果としてではなく自然に存在する場合もあり得る。基本的には、抗体の分子構造は各 2本の軽鎖と重鎖とから形成される力二量体、三量体、五量体としても存在し得る。これらとしては、例えば、 IgA、 Ig E、 IgM、 IgG等が挙げられる力これらに限定されない。

[0120] 本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および/またはその誘導体）が 1っ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラタトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテォグリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖 (ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約 20種類の単糖 (ダルコ一ス、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N— ァセチルガラタトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子 ·細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られている力そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第 3の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。

[0121] 本明細書において「糖」または「単糖」とは、少なくとも 1つの水酸基および少なくとも

1つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において使用される場合、糖はまた、炭水化物ともいい、両者は互換的に用いられる。本明細書において使用される場合、特に言及するときは、糖鎖は、 1つ以上糖が連なった鎖または配列をいい、糖または単糖というときは、糖鎖を構成する 1つの単位をいう。ここで、 n = 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 10であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ぺントース、へキソース、ヘプトース、オタトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。

[0122] 本発明において糖を記載するために使用する命名法および略称は、通常の命名法に従う。例えば、 /3— D—ガラクトース

[0123] [化 8]

p-D-Galactose

[0124] は、 Gal ;

N—ァセチノレー α — D—ガラクトサミン

[0125] [化 9]

N-Acety[- -D-galactosamine

[0126] は、 GalNAc ;

a—D—マンノース

[0127] [化 10] -D-Mannose

[0128] は、 Man ;

β D—グルコース

[0129] [化 11]

p-D-Glucose

[0130] は、 Glc ;

N ァセチノレー β—D グノレコサミン [0131] [化 12]

N-Acetvl-|J-D-glucosamine

[0132] は、 GlcNAc ;

a—Lーフコース

[0133] [化 13]

a-L-Fucose

[0134] は、 Fuc ;

a—N ァセチルノイラミン酸

[0135] [化 14] α-Ν-Acet l neuraminic acid

[0136] は、 Neu5Ac ;

セラミド

[0137] [化 15]

Ceramide

Ο

H -^/^(CH₂)₁₆CH₃ OH

[0138] は、 Cer ;

Lーセリン

CH (OH) CH (COOH) NH

2 2

は、 Serにより表す。なお、 Cerは通常脂質に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。また、 Serは通常アミノ酸に分類される力本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。環状の 2つのァノマーは、 αおよび /3により表す。表示上の理由により、 aまたは bと表すことがある。従って、本明細書において、 αと a、 /3と bは、ァノマー表記については交換可能に使用される。

[0139] 本明細書において、ガラクトースとは、任意の異性体を指す力代表的には β D ガラクトースであり、特に言及しないときには、 β D ガラクトースを指すものとして使用される。

[0140] 本明細書において、ァセチルガラタトサミンとは、任意の異性体を指す力代表的には Ν ァセチノレー a D ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、 N ァセチルー a—D ガラクトサミンを指すものとして使用される。

[0141] 本明細書において、マンノースとは、任意の異性体を指す力代表的には α— D— マンノースであり、特に言及しないときには、 a—D—マンノースを指すものとして使用される。

[0142] 本明細書において、グルコースとは、任意の異性体を指す力代表的には β D

グルコースであり、特に言及しないときには、 /3—D—グルコースを指すものとして使用される。

[0143] 本明細書において、ァセチルダルコサミンとは、任意の異性体を指す力代表的には N ァセチノレー β D グノレコサミンであり、特に言及しないときには、 Ν ァセチル一 /3—D—ダルコサミンを指すものとして使用される。

[0144] 本明細書において、フコースとは、任意の異性体を指す力代表的には α— Lーフコースであり、特に言及しないときには、 α Lーフコースを指すものとして使用され

[0145] 本明細書において、ァセチルノイラミン酸とは、任意の異性体を指す力代表的には α—Ν ァセチノレノイラミン酸であり、特に言及しないときには α—Ν ァセチノレノイラミン酸を指すものとして使用される。

[0146] 本明細書において、セリンとは、任意の異性体を指す力代表的には Lーセリンであり、特に言及しないときには Lーセリンを指すものとして使用される。

[0147] 本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称（Glcなど）などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基が結合先の糖の水酸基とが脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。

[0148] 糖力アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がァミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができる力 S、その場合は還元末端の水酸基がァミン基に置換されたものを指すことに留意する。

[0149] 単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、 αおよび /3により示す。 2つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。 [0150] 本明細書において糖鎖は、

[0151] [化 16] 単糖ァノマ一結口'様 A 単糖

[0152] により表される。従って、例えば、ガラクトースの C—1とグルコースの C— 4との間の /3 グリコシド結合は、 Gal/31, 4Glcにより表される。従って、例えば、シァリルルイス X( SLX)は、 Neu5Ac a 2, 3Gal /31, 4 (Fuc a 1, 3) GlcNAcと表される。 N_ァセチノレラタトサミン（G4GN)は、 Gal/31, 4GlcNAcと表される。 α 1-6マンノビオース（A6 )は、 Mana l, 6Manと表される。

[0153] 糖鎖の分岐は、括弧により表し、結合する単位糖のすぐ左に配置して表記する。例えば、

[0154] [化 17] 単糖ァノマー結単^ 6 と表され、括弧の中は、

[化 18] 単糖ァノマー結□■様 A

[0157] と表記される。従って、例えば、ガラクトースの C—1とグルコースの C— 4との間が /3 グリコシド結合し、さらにこのグルコースの C— 3がフコースの C—1と αグリコシド結合している場合、 Gal /31, 4(Fuca l, 3)Glcと表される。単糖は、（潜在）カルボニル原子団になるだけ小さい番号を付けることを基本にして表される。有機化学命名法の一般基準では (潜在)カルボニル原子団より優位な原子団が分子中に導入されたときでも、通常上記の番号付けで表される。

[0158] [化 19]

[0159] [化 20]

[0160] 本明細書において使用される糖鎖としては、例えば、シァリルルイス X、 N—ァセチルラクトサミン、 α 1—6マンノビオースならびにそれらの 2つ以上の組み合わせからなる群より選択される糖鎖が挙げられるが、これらに限定されない。 2つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖鎖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンに対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。

[0161] 本明細書において使用される場合、用語「レクチン」とは、細胞膜複合糖質 (糖タンノ^質および糖脂質)の糖鎖と結合能を有する物質をいい、細胞凝集，分裂誘発，機能活性化，細胞障害などの効果をおよぼす能力を有する。糖鎖を細胞が発信する情報分子とすれば、レクチンは受信分子であるといえる。一定の性質を有する細胞または組織は、それに相応したレクチンのパターンを有する。レクチンは、感染、生体防御、免疫、受精、標的細胞へのターグティング、細胞分化、細胞間接着、新生糖タンパク質の品質管理および細胞内選別輸送などを実現する。レクチンは、多用な糖鎖結合性を有し、速やかな結合および解離とレ、う固有の物理化学的性質を有することにより厳格に制御されている。糖鎖認識蛋白質とも呼ばれる。植物レクチンについての研究は古ぐ既に約 300種類が知られている。最近、動物レクチンについても活発に研究が行われており、新規レクチンの発見が続いている。動物細胞膜上に在る主要なレクチンファミリーのレクチン群 (約 100種類）に基づく多彩な糖鎖認識機能が研究されている。とりわけ、多様な構造をもつ糖鎖リガンドの構造情報を受け取るレセプター（情報受容蛋白質、または、標的分子）としての機能が注目されている。

[0162] 本明細書において使用される場合、用語「相補的核酸」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、核酸の塩基対合律により、互いに塩基対を形成し得る核酸をいう。これらとしては、例えば、 DNA、 RNA等が挙げられる力これらに限定されない。

[0163] 本明細書において使用される場合、用語「レセプター」とは、「受容体」とも称され、細胞に存在して外部からの刺激を認識し、伝達するための構造を有するものをいう。これらとしては、例えば、細胞表面受容体、細胞内受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。

[0164] 本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、物質にとって、それ自体が非常に強固に吸着される分子をいう。これらとしては、例えば、タンパク質、核酸、化学物質等が挙げられるが、これらに限定されない。

[0165] 本明細書において使用される場合、用語「アブタマ一」とは、種々の物質 (タンパク質、化学物質など）の構造を認識し、結合し得る比較的分子量の小さい核酸をいう。これらとしては、例えば、 RNAァプタマ一、 DNAァプタマ一等が挙げられる力これらに限定されない。

[0166] 本明細書において使用される場合、用語「抗原」とは、抗体の産生を促す働きを有する物質をいう。例えば、高分子の糖、タンパク質、それらの複合体、ウィルス、細胞などが挙げられる力 S、これらに限定されない。

[0167] 本明細書中で使用される場合、「親水性化」は、リボソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも 1つの OH基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも 2つの OH基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも 1つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも 1つの OH基と少なくとも 1つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のァミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチノレ）アミノエタン、トリス（ヒドロキシェチル）アミノエタンドロキシェチル）ァミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）ァミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノプロパン、トリス（ヒドロキシェチル）ァミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピノレ）ァミノプロパン等が挙げられる。本明細書において「アルキル」とは、メタン、ェタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（本明細書にお!/ヽて「アルカン」と!/、う）から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C H 一で表される（ここで、 nは正の整数である）。アルキルは、

n 2n+l

直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルの Hが置換されたアルキルを!/、う。これらの具体例は、 C1 C2アルキル、 C1 C3アルキル、 C1 C4アルキル、 C1 C5アルキル C1 C6アルキル、 C1 C7アルキル、 C1 C8アルキル、 C1 C9アルキル、 C1 C 10ァノレキノレ、じ1〜じ11ァルキルまたはじ1〜じ12ァルキル、 C1 C2置換されたアルキル、 C1 C3置換されたアルキル、 C1 C4置換されたアルキル、 C1 C5 置換されたアルキル、 C1 C6置換されたアルキル、 C1 C7置換されたアルキル、 C1 C8置換されたアルキル、 C1 C9置換されたアルキル、 C；! C 10置換されたアルキル、 C；! C 11置換されたアルキルまたは C；! C 12置換されたアルキルであり得る。アルカンについては、これらの具体例は、 C1 C2アルカン、 C1 C3アル力ン、 C1 C4アルカン、 C1 C5アルカン、 C1 C6アルカン、 C1 C7アルカン、 C ；! C8アルカン、 C1 C9アルカン、 C1 C10アルカン、 C1 C11アルカンまたは C1 C12アルカン、 C1 C2置換されたアルカン、 C1 C3置換されたアルカン、 C ；! C4置換されたアルカン、 C1 C5置換されたアルカン、 C1 C6置換されたアルカン、 C1 C7置換されたアルカン、 C1 C8置換されたアルカン、 C1 C9置換されたアルカン、 C；! C10置換されたアルカン、 C；! C11置換されたアルカンまたは C1 C12置換されたアルカンであり得る。ここで、例えば C1 C10アルキルとは、炭素原子を 1〜； 10個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル (CH—）

3

、ェチル（C H n—プロピル（CH CH CH―)、イソプロピル（（CH ) CH— )

2 5 3 2 2 3 2

n—ブチノレ（CH CH CH CH一）、 n—ペンチノレ（CH CH CH CH CH一）、 n

3 2 2 2 3 2 2 2 2 キシル（CH CH CH CH CH CH一）、 n—ヘプチル（CH CH CH CH CH

3 2 2 2 2 2 3 2 2 2

CH CH一）、 n—才クチノレ（CH CH CH CH CH CH CH CH一）、 n—ノニノレ（

2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2

CH CH CH CH CH CH CH CH CH一）、 n—デシノレ（CH CH CH CH CH

3 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2

CH CH CH CH CH一）、 C(CH ) CH CH CH(CH ) CH CH(CH )

2 2 2 2 2 3 2 2 2 3 2 2 3 2 などが例示される。また、例えば、 C；! C10置換されたアルキルとは、 C；! C10ァルキルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。 Rとしては、 C1〜C6アルキルが好ましぐ特に C1〜C6アルキルが好ましい。

[0169] 本発明の物質または上で定義した官能基が置換基 Rによって置換されている場合、そのような置換基 Rは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、カルボキシ、ァシル、チォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィエルからなる群より選択される。

[0170] (アンミン白金錯体内包リボソームを製造する技術の用途）

本発明のアンミン白金錯体内包リボソームを製造する技術は、病態（特に、腫瘍'がん）を処置するためのリボソーム製剤を製造するために利用され得る。

[0171] 本発明のアンミン白金錯体をリボソームに内包させる技術を用いてリボソームに内包される製剤としては、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍等を処置するための薬剤が挙げられる力これらに限定されない。この薬剤としては、例えば、 cis ジアンミンジクロロ白金（11)、 c is ジアンミン 1 , 1ーシクロブタンージカルボキシラト白金（11)、 cis ジアンミン（グリコラト）白金（11)、 (1R, 2R—ジアンミンシクロへキサン)ォキサラト白金（11)、 cis— ジアンミンジブロモ白金 (II)等が挙げられるが、これらに限定されな!/、。

[0172] (アンミン白金錯体内包リボソームの用途）

本発明のアンミン白金錯体内包リボソームは、病態（特に、腫瘍'がん）を処置するために利用され得る。

[0173] 本発明のアンミン白金錯体内包リボソームを用いて処置され得る病態としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍等を処置するための薬剤が挙げられる力これらに限定されない。

[0174] (好ましい実施形態の説明）

以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

[0175] (アンミン白金錯体内包リボソームの製造方法）

1つの局面において、本発明は、アンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法を提供する。該方法は、以下の工程: A)水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程; B)リボソーム、リボソーム原料またはその組合せを提供する工程:および C)該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リボソーム、該リボソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リボソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リボソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である工程を包含する。この方法は、さらに、 D)前記 C)工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程を包含し得る。

[0176] 1つの実施形態において、本発明において使用され得る水溶性アンミン白金錯体は、 2つのアンミン基を有し得る。好ましくは、 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)であり得る。

[0177] 他の実施形態において、本発明の製造方法は、 A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程; B)前記リボソーム原料を提供する工程; C)該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リボソーム形成維持条件に供する工程を包含し得る。この方法では、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないものが使用され得る。

[0178] 1つの実施形態において、本製造方法の前記 B)工程は、 B— i)リボソーム形成能を有する脂質を、メタノール 'クロ口ホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;および B— ii)該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程を包含し得る。

[0179] 別の実施形態にお!/、て、本製造方法では、第一緩衝液と第二緩衝液とは、同じ組成のものであっても、別の組成のものであってもよい。なぜなら、これらの緩衝液は、リポソームが存在する時点で白金錯体を水溶性の状態に保つことができるような緩衝液でありさえすれば、どのようなものであってもよ!/、からである。

[0180] 別の実施形態において、本発明の製造方法では、前 B— ii)工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理することを含み得る。

[0181] 別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記 C)工程において、前記リポソーム形成維持条件は、前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供すること、該溶液をー晚静置することを含み得る。前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供することおよび該混合物をー晚静置することは連続して実施されてもょレ、。

[0182] 別の実施形態において、本発明の製造方法において使用され得る第一緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まな!/、ものであり得る。この第一緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んで!/、なければょレ、。形成する塩が難水溶性であるイオンとは、例えば、塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン（Br— )、ョゥ化物イオン（1—)、チォシアン酸イオン（SCN—)、シアン化物イオン（CN—)等であり得る。この第一緩衝液は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2—

[4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤 (ρΗ7. 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3— (Ν モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν，一 2エタンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒド口キシメチル)メチル 2 ヒドロキシ一 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン一 Ν, Ν，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν， 2 ヒドロキシプロパンー3 プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、 Ν, Ν—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3 シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得る力 s、これらに限定されなレ、。好ましくは、第一緩衝液は、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、 pH8. 4)を含む緩衝液である。本発明において第一緩衝液は、上記以外の緩衝液も使用することができる。なぜなら、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでレ、な!/、緩衝液であれば、白金錯体が難水溶性の塩を形成することがな!/、からであ

[0183] 好ましい実施形態において、第一緩衝液は、 pH6〜10 (好ましくは、 8. 4)の範囲内に調節され得る。

[0184] 別の実施形態において、本発明の製造方法において使用され得る第二緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まな!/、ものであり得る。この第二緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んで!/、なければよ!/、。

[0185] 本明細書において、白金錯体の「形成する塩が難水溶性であるイオン」とは、例えば、塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン (Br— )、ヨウ化物イオン (1—)、チォシアン酸ィオン（SCN—)、シアン化物イオン (CN—)等であり得る。この第一緩衝液は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1— ピぺラジュル]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3- (Ν モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν，一 2エタンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチノレ）メチルー 2—ヒドロキシ一 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン一 Ν, Ν，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν，一 2—ヒドロキシプロパンー3—プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、 Ν, Ν—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得る力これらに限定されない。好ましくは、第二緩衝液は、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、 pH8. 4)を含む緩衝液である。本発明において第二緩衝液は、上記以外の緩衝液も使用すること力できる。なぜなら、緩衝液が、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければ、白金錯体が難水溶性の塩を形成することがないからである。

[0186] たとえば、以下を溶解度の例示としてあげることができる。

1.水溶性白金錯体（2分子の水分子が配位した状態）に対し 2等量の塩化物イオン（ C1 )および臭化物イオン (Br ）およびヨウ化物イオン (Γ)、チォシアン酸イオン（S CN ）が存在すると水溶性白金錯体の 2分子の配位水がこれらのイオンに置換して、難溶性の塩を形成する。 1等量のイオンを含む場合、 1分子の水分子がこれらのィオンによって置換される。イオンを含まない場合は、 2分子の水分子が配位した構造をとる。

2.塩化物イオン（C1一）の場合、細胞内の塩化物イオン濃度が 0〜4mMで水分子が置換した構造となり、 DNAと結合するといわれており、このこと力塩化物イオンの範囲については mM表記させて頂きました。臭化物イオン（Br ）およびヨウ化物ィオン（1—)、チォシアン酸イオン（SCN ）のうち、 Br—、 I一の配位した錯体には、活性の強さに差がある力活性があるといわれている。従って、細胞内の環境下では、水分子の配位した構造をとると考えられる。

[0187] 難水溶性物質は、 Cl_, Br_,厂で抗癌活性があることが知られている。白金原子への結合性は、 Cl_ < Br_ < fの順になるといわれている。 C厂よりも Br— ,厂は、白金と結合しやすぐ難溶性物質を形成しやすいと考えられる。従って、 C1—と同条件で難水溶性物質とすることができると考えられる。これらの条件を考慮して本発明を実施すること力 Sでさる。

[0188] また、本発明において、難水溶性であれば、いったん本発明のリボソームが形成されると形成後、白金錯体力 Sリボソームの外に出に《なり、送達効率が上がることが企図される。

[0189] 好ましい実施形態において、第二緩衝液は、 pH6〜10 (好ましくは、 8. 4)の範囲内に調節され得る。

[0190] 別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、以下の工程: A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程; B) 前記リボソームを提供する工程；および C)該白金錯体溶液と、該リボソームとを混合し、前記リボソーム形成維持条件に供する工程を包含し得る。この製造方法では、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含んでレ、なレ、。

[0191] 好ましい実施形態において、本発明の製造方法では、前記リボソームは、水溶性ァンミン白金錯体が、リボソーム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有し得る。

[0192] 別の好ましい実施形態において、前記リボソーム形成維持条件は、リボソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体力 Sリボソーム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な条件であり得る。

[0193] 1つの実施形態において、本発明の製造方法において使用されるリボソームを構成する脂質または前記リボソーム原料は、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート

ールァミン、コール酸ナトリウムエタノールァミン一ポリダリ

2, 3) Ga 1 /3 1 , 4Glc /3 1 , l ' Cer)、ガングリオシド GDla、ガングリオシド GDlb、ジミリストイノレ

れるカ S、これらに限定されない。好ましくは、ジパノレミトィルホスファチジノレコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノーノレアミン、コーノレ酸ナトリウム、ジセチノレフォスファチジノレエタノーノレアミンーポリグロールであり得る。

[0194] 本製造方法において使用されるリボソームは、好ましくは、前記脂質懸濁液は、前記脂質として、ジパルミトイノレホスファチジノレコリン、コレステロール、ガンダリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35： 40： 15： 5： 5： 167のモル比で含み得る。

[0195] 本製造方法において使用されるリボソームは、水溶性アンミン白金錯体がそのリポソーム膜を通過してリボソーム中に入ることができるようなものであれば、どのようなものであってもよい。リボソームは、市販されているものを使用してもよぐ例えば、日油などから市販されている。一般的なリボソームの調製および特徴付けは当該分野にお!/、て公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。例えば、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製されたものであり得る（例えば、「リポソーム応用の新展開〜人工細胞の開発に向けて〜監修秋吉一成/辻井薫 N TS p33〜45 (2005)」、「リボソーム野島庄七 p21— 40 南江堂（1988)」を参照のこと。）が挙げられ得る。

[0196] 1つの実施形態において、本製造方法において、リボソームは、複数の製造方法により調製されたリボソーム（例えば、改良コール酸塩法のもの、凍結乾燥法のもの）を混ぜ合わせて使用することもできる。

[0197] 本発明において使用される前記リボソームを構成する脂質または前記リボソーム原料は、上記以外のものであってもよい。なぜなら、水溶性アンミン白金錯体力その提供されたリボソームまたは形成されたリボソームの膜を通過してリボソーム内に移行し、その中に留まりさえすればよいからである。

[0198] 別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記 C)工程において、前記混合物は、 pH6〜； 10 (好ましくは、 pH8. 4)の範囲内に調節され得る。

[0199] 別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件は、該白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを実質的に含まなレ、溶液の存在下におくことである。形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン (Br— )、ヨウ化物イオン (Γ)、チオシアン酸イオン（SCN—)、シアン化物イオン（CN—)等（好ましくは、塩化物イオン（CD )であり得る。この溶液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んで!/、なければよ!/、。この白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン (C1—)であれば、 0〜4mMの範囲で含まれ得る。なぜなら、塩化物イオン（C1—)の場合、この 0〜4m Mという濃度は、体内で存在する濃度以下の濃度であるので、難水溶性の塩として析出することはな!/、と考えられるからである。

[0200] 1つの実施形態において、本発明の製造方法では、前記 C)工程において、前記水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、前記リボソーム、リポソ一ム原料またはその組合せとは、 1 : 9〜9： 1の範囲内の比で混合され得る。

[0201] リボソーム、リボソーム原料またはその組合せ、白金錯体、白金錯体原料またはその組合せ、必要であれば緩衝液は、任意の順序で混合することができる。例えば、これらの順序は、 1)リボソーム原料と白金錯体とを混合して緩衝液を添加する順序、 2 )リボソーム原料と緩衝液とを混合した後に、白金錯体を添加する順序、 3)白金錯体を緩衝液に溶解した後にリボソーム原料を添加する順序であり得る力これらに限定されない。なぜなら、リボソームが形成 ·維持される条件を保持する限り、どのような順序で混合されても、リボソームが存在する時点で水溶性アンミン白金錯体がリポソ一ムに接触することができるかぎり、本発明は達成することができるからである。水溶液中で強酸性を示す白金錯体を用いる場合には、混合液は、 pH6〜； 10の範囲が好ましい。

[0202] 1つの実施形態において、前記白金錯体懸濁液と脂質懸濁液とは、 1 : 9〜9： 1の範囲内の比で混合され得る。

[0203] 好まし!/、実施形態にお!/、て、前記白金錯体懸濁液と脂質懸濁液とは、 7： 3の比で混合され得る。

[0204] 別の実施形態において、前記白金錯体溶液とリボソームとは、 1 : 9〜9： 1の範囲内

(好ましくは、 7 : 3)の比で混合され得る。

[0205] 1つの実施形態において、本発明の製造方法では、前記 C)工程において、前記混合物は、形成する塩が難水溶性であるイオンを実質的に含まない。前記形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン (Br— )、ヨウ化物イオン（1—)、チォシアン酸イオン（SCN—)、シアン化物イオン（CN—)等であり得る。好ましくは、前記形成する塩が難水溶性であるイオンは、塩化物イオン（C1—)であり得る。 1つの実施形態において、前記混合物は、塩化物イオン（C1—)を、 0〜4mM の範囲で含み得る。前記混合物は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでレ、なければよ!/、。

[0206] 1つの実施形態において、前記混合物は、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝剤（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝剤（ρΗ8· 0)、 2—[4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュノレ]エタンスルホン酸（HEPES )緩衝剤（ρΗ7· 2)、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3— (Ν モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 1 2—アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン Ν，一 2エタンスルホン酸緩衝剤、 Ν トリス（ヒドロキシメチル)メチル—2 ヒドロキシ— 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン一 Ν, Ν，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 Ν— 2—ヒドロキシェチルピペラジン一Ν，一2 ヒドロキシプロパン一 3 プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、 Ν, Ν ビス（2—ヒドロキシェチル )グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、 3— Ν シク口へキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3 シクロへキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等（好ましくは、 Ν トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤 (ρΗ8. 4) )を含み得る。

[0207] 別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記 D)工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、塩化物イオン (CD、臭化物ィォン（Br— )、ヨウ化物イオン（厂）、チォシアン酸イオン（SCN—)、シアン化物イオン（CN

_)であり得る。好ましい実施形態において、この白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、塩化物イオン（cr)である。

[0208] 1つの実施形態において、前記塩化物イオン（CDは、 NaCl、 HC1、 CaClより提

2 供され得る。

[0209] 別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記 D)工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン (例えば、塩化物イオン (C1—) )は、例えば、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、 2— [4一（2 ヒドロキシェチル）一 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシ)ァミノメタン緩衝液、 3— (N モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝液、 N 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一 2エタンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒド口キシメチル)メチル—2 ヒドロキシ— 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピペラジン一 N, N，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N， 2 ヒドロキシプロパンー3 プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝液、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝液、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液、 3 シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝液などにより提供され得るが、これらに限定されない。好ましくは、この塩化物イオン（C厂）は、 N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝液（ρΗ8· 0)、 2— [4一（ 2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝液（ρΗ7· 2)などにより提供され得るが、これらに限定されない。本発明の製造方法の前記 D)工程において使用され得る、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、上記以外の緩衝液によっても提供され得る。なぜなら、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを提供するものであれば、白金錯体を難水溶性の塩にすることができるからである。 [0210] 別の実施形態において、本製造方法の前記 D)工程は、 i)形成されたリボソームを親水性化処理する工程； ii)該リボソームへ標的指向性物質を結合させる工程； iii)該修飾標的指向性物質が結合したリボソームを親水性化する工程ならびに iv)該親水性化したリボソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程を包含し得る。

[0211] 1つの実施形態において、本製造方法において使用され得る標的指向性物質は、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、ァプタマ一、抗原であり得る。好ましくは、標的指向性物質は、抗体、糖鎖であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、標的指向性物質は、リボソームを破壊することなぐリボソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リボソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。

[0212] 1つの実施形態において、本発明において使用され得る前記アンミン白金錯体は、難水溶性であり得る。

[0213] 好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、以下：（Al) cis—ジアンミンジニトラト白金（II)を、 N—トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)を含む溶液を調製する工程であって、該 N—トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物ィオン（C1—)を含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、ェ程；および (A2)該 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH6〜10 ( 好ましくは、 pH8. 4)に調節する工程；（B1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウム（好ましくは、 35 : 40 : 15 : 5 : 5 : 167のモル比）で混合させて脂質を調製する工程；（B2)該脂質を、メタノール 'クロ口ホルム（好ましくは、 1： 1)溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および (B3)該脂質膜を、 N—トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH6〜10、好ましくは、 pH8. 4)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該 N—トリス（ヒドロキシメチル）—3— ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン (CDを含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；（B4)該脂質懸濁液を 30°C〜40°C で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および (Cl) pHが調節された該 cis ージアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 1 : 9〜9： 1 ( 好ましくは、 7 : 3)の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 000 (好ましくは、 10, 000)で限外濾過に供する工程を包含し得る。

[0214] 別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、以下：（Al) cis ジアンミンジニトラト白金（Π)を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を含む溶液を調製する工程であつて、該 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（C1—)を含まな!/、か、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；および (A2)該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH6〜l 0 (好ましくは、 ρΗ8· 4)に調節する工程: Β)工程として、（B1)リボソームを提供する工程：および (CI) pHが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、該リポソームとを、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 000 ( 好ましくは、 10, 000)で限外濾過に供する工程を包含し得る。

[0215] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法は、以下の工程: A) 2つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を提供する工程; B)該水溶性の白金錯体を含む溶液とリボソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して混合溶液を作製する工程； C)該混合溶液をリボソームが形成する条件に供する工程;および D)該混合溶液を、形成する塩が難水溶性であるィォンを含む溶液の存在下に供する工程、を包含する。

[0216] 1つの実施形態では、 A)工程にお!/、て、前記水溶性の白金錯体を含む溶液は、 p H6〜； 10 (好ましくは、 8. 4)の範囲内に調節され得る。

[0217] 1つの実施形態では、前記 B)工程における前記脂質懸濁液は、 i)脂質を、メタノーノレ'クロ口ホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;および ii)該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁させる工程によって作製され得る。

[0218] 1つの実施形態において、前記メタノール 'クロ口ホルム溶液は、メタノールとクロ口ホルムとを 1： 1の比で含み得る。 [0219] 1つの実施形態において、本方法は、前記 B)工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理する工程をさらに包含し得る。好ましくは、前記超音波処理する工程は、前記脂質容液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程であり得る。

[0220] 1つの実施形態では、前記 C)工程において、前記混合溶液を、リボソームが形成するのに十分な時間、前記リボソームが形成する条件下に供し得る。好ましくは、前記混合溶液をリボソームが形成する条件は、例えば、該混合溶液を限外濾過に供すること、該混合溶液をー晚静置すること等であり得る。さらに好ましくは、前記混合溶液をリボソームが形成する条件は、前記混合溶液を分画分子量 10, 000で限外濾過に供することであり得る。

[0221] 1つの実施形態では、前記 D)工程は、前記 C)工程において、リボソームの形成を確認した後に行われ得る。

[0222] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法は、以下の工程: A— 1) 2つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を調製する工程; A— 2)該水溶性の白金錯体を含む溶液の pHを pH6〜； 10の範囲内に調節する工程; B— 1) ρΗが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II )溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 1： 9〜9： 1の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程;および C 1)該混合溶液を限外濾過に供する工程;および D 1)限外濾過後に、該混合溶液を塩化物イオン (C1—)の存在下に供する工程、を包含し、ここで、該アンミン白金錯体は難水溶性である。

[0223] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法は、以下の工程：（Al) cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を、塩化物イオン (C1 一）を実質的に含まない N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を含む溶液を調製する工程；（A2) 該 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを ρΗ8· 4に調節する工程； (Β 1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35 : 40 : 15 : 5 : 5 : 167のモル比で混合させて脂質を調製する工程；（Β2)該脂質を、メタノール.クロ口ホルム . 1)溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および (B3)該脂質膜を、塩化物イオン（CDを実質的に含まな!/、N トリス（ヒドロキシメチル） 3—アミノプロノンスルホン酸緩衝液 (ρΗ8· 4)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程、（Β4)該脂質懸濁液を 30°C〜40°Cで攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程； (B5) p Hが調節された該 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、 7 : 3の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；（C1)該混合溶液を分画分子量 10, 000で限外濾過に供する工程；および (D1)限外濾過後に、該混合溶液を、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (pH 8. 4)、炭酸緩衝液（pH8. 5)、PBS (pH8. 0)および HEPES緩衝液（ρΗ7· 2)からなる群より選択される少なくとも 1つの緩衝液に曝す工程、包含する。

[0224] (アンミン白金錯体を内包するリボソーム）

1つの局面において、本発明は、アンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。このアンミン白金錯体を内包するリボソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リボソーム原料とを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる。

[0225] 1つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、 2つのアンモニアを有し得る。

[0226] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、 cis ージアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態であり得る。

[0227] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、 cis ージアミンジクロ口白金 (II)であり得る。

[0228] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチノレホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジォレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホラタトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラタトシルセラミド、ホスフナチド、グロポチド、 GM1 (Gal β 1 , 3GalNAc β ΐ , 4 (NeuA a 2, 3) Gal /3 1 , 4Glc β 1 , 1 ' Cer)、ガングリオシド GDl a、ガンダリオシド GD lb、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ル、ジォレオイルホスファチジノレグリセロール等を含み得る力これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガンダリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールァミン一ポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジノレコリン、ジパノレミトイノレホスファチジノレグリセロールであり得る。なぜなら、上記以外の脂質から構成されたリボソームであっても、リボソーム中に cis—ジアンミンジクロ口白金（Π)および/またはその水溶性形態を含ませることができ、かつ、それらをリボソーム中に留めておくことができるような脂質により構成されていればよいからである。

[0229] 本発明にお!/、て、リボソームは、複数の製造方法により調製されたリボソーム（例えば、改良コール酸塩法のもの、凍結乾燥法のもの）を混ぜ合わせて使用することもできる。

[0230] 1つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、標的指向性物質をさらに含み得る。前記標的指向性物質としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原（好ましくは、抗体、糖鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリボソーム膜表面に修飾することができるからである [0231] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、 lmg脂質あたり 0. 3;^で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。例えば、アンモニアを有するアンミン白金錯体は、 0. 3〃gより多く、（例えば、 0. 3、 0. 4、 0. 5、 0. 6、 0. 7、 0. 8、 0. 9、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9. 0、 10.0、 11.0、 12.0、 13.0、 14.0、 15.0. 16.0、 17.0、 18. 0、 19.0、 20.0あるいは、好ましくは、 9〃g、 17〃g以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。

[0232] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、 1 mgUン脂質あたり lO^ g以上、 20;^以上、 30;^以上、 40;^以上、 50;^以上、 60;^以上、 70;^以上、 80;^以上、 90;^以上、 100〃 g以上、 150;^以上、 2 OO^ g以上、 300;^以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。

[0233] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム lmlあたり 39 μ g/ml、 40 μ g/ml、 50 μ g/ml、 60 μ g/ml、 70 μ g/

1、 80 g/ml以上、 90 μ g/ 100 g/mlで含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。

[0234] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム 1個あたり 1X10— " g以上、 2X10 " g以上、 3X10— " g以上、 4X

10 " g以上、 5X10— " g以上、 10 以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。

[0235] 1つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、 2つのアンモニアを有し得る。

[0236] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、 cis ージアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態であり得る。

[0237] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、 cis ージアミンジクロ口白金 (II)であり得る。

[0238] 別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチノレホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジ

ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジォレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラタトシルセラミド、ホスフナチド、グロポチド、 GMl (Gal /3 1 , 3GalNAc /3 1 , 4 (NeuA a 2, 3) Gal /3 1 , 4Glc [i 1 , l ' Cer)、ガングリオシド GDla、ガングリオシド GDlb、ジミリストイルホスファチジルルグリセロール、ジォレオイルホスファチジルグリセロール等を含み得る力 S、これらに限定されない。なぜなら、上記以外の脂質から構成されたリボソームであっても、リポソーム中に cis—ジアンミンジクロロ白金（II)および/またはその水溶性形態を含ませること力 Sでき、かつ、それらをリボソーム中に留めておくことができるような脂質により構成されていればよいからである。好ましくは、前記アンミン白金錯体を内包するリポソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリウムを、 35： 40： 15： 5： 5： 167のモル比で含み得る。

[0239] 1つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、標的指向性物質をさらに含み得る。前記標的指向性物質としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原（好ましくは、抗体、糖鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリボソーム膜表面に修飾することができるからである

[0240] ここで、本発明のアンミン白金錯体を内包するリボソームは、上述の（製造方法）に記載される任意の形態が使用され得る。

[0241] (組成物）

1つの局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための組成物を提供する。該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを含み、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リボソーム原料とを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる。

[0242] 別の局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための組成物を提供する。この組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを含み、該リボソームは、該アンミン白金錯体力例えば、 lmg脂質あたり 0. 3、 0.4、 0. 5 、 0. 6、 0. 7、 0. 8、 0. 9、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 1

0. 0、 11.0、 12.0、 13.0、 14.0、 15.0. 16.0、 17.0、 18.0、 19. 0、 20.0あるいは、好ましくは、 9ng 17 g以上で含まれ得る以上で含まれ得る。

[0243] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、 1 mgUン脂質あたり lO^ g以上、 20;^以上、 30;^以上、 40;^以上、 50;^以上、 60;^以上、 70;^以上、 80;^以上、 90;^以上、 100〃 g以上、 150;^以上、 2 OO^ g以上、 300;^以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームの組成物を提供する。

[0244] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム lmlあたり 39 μ g/ml、 40 μ g/ml、 50 μ g/ml、 60 μ g/ml、 70 μ g/

1、 80 g/ml以上、 90 μ g/ 100 g/mlで含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームの組成物を提供する。

[0245] 別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム 1個あたり 1X10— " g以上、 2X10 " g以上、 3X10— " g以上、 4X 10 " g以上、 5X10— " g以上、 10 以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリボソームの組成物を提供する。

[0246] 1つの実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリボソームでは、アンミン白金錯体は、 2つのアンモニアを有し得る。

[0247] 別の実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリボソームでは、前記アンミン白金錯体は、 cis ジアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態であり得る。

[0248] 別の実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリボソームでは、前記アンミン白金錯体は、 cis ジアミンジクロ口白金（II)であり得る。

[0249] 別の実施形態において、本発明の組成物において使用され得るアンミン白金錯体を内包するリボソームは、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウムコール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールァ

ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジォレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリジン酸、ジォレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラタトシルセラミド、ホスフナチド、グロポチド、 GM1 (Gal β 1 , 3GalNAc β 1 , 4 (NeuA a 2, 3) Gal /3 1 , 4Glc /3 1 , 1， Cer)、ガングリオシド GDla、ガングリオシド GDlb、

ル等を含み得るが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールァミンポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。なぜなら、上記以外の脂質から構成されたリボソームであっても、リボソーム中に cis ジアンミンジクロロ白金（II)および/またはその水溶性形態を含ませることができ、かつ、それらをリボソーム中に留めておくことができるような脂質により構成されて!/、ればよ!/、からである。 [0250] 1つの実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリボソームは、標的指向性物質をさらに含み得る。前記標的指向性物質としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原（好ましくは、抗体、糖鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、標的指向性物質は、リボソームを破壊することなぐリボソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリボソーム膜表面に修飾することカできる。当業者は、標的にあわせて、リボソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定すること力できる。

[0251] ここで、本発明の組成物において使用され得るアンミン白金錯体を内包するリポソームは、上述の（製造方法）および (アンミン白金錯体を内包するリボソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。

[0252] 本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フイラ一、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび/または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、アンミン白金錯体、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも 1つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクノレは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。

[0253] 本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、 α —トコフエロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グノレタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに/あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 Tween、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレングリコール (PEG) )などが挙げられる。

[0254] 例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH約 7. 0 - 8. 5の Tris緩衝剤または pH約 4. 0- 5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

[0255] 以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することカできることに注意されたい。

[0256] 本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、シァリルルイス X、脂質など以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、 pH、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内であ

[0257] 液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレンダリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。 [0258] 液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D マンニトール、安息香酸べンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウムおよびクェン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。

[0259] 液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ二ゥム、塩化べンゼトニゥム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリビニノレピロリドン、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる

〇

[0260] 液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、 D - マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。

[0261] 液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクェン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。

[0262] 液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニゥムおよび塩酸プロ力イン等が挙げられるがそれらに限定されない。

[0263] 液状製剤における防腐剤の好適な例としては、ノラオキシ安息香酸エステル類、ク口ロブタノ一ノレ、ペンジノレアノレコーノレ、 2—フエニノレエチノレアノレコーノレ、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。

[0264] 液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸、 a トコフエロールおよびシスティン等が挙げられるがそれらに限定されない。

[0265] 注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かっ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルタ一等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤 (塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよレ、。 [0266] さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでレ、てもよ!/、。

[0267] 本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定すること力 Sでさる。

[0268] (処置方法）

1つの局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための方法を提供する。この方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを投与する工程を包含し、ここで、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リボソーム原料とを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ること力 Sでさる。

[0269] 別の局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための方法を提供する。この方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを投与する工程を包含し、ここで、該リボソームは、該アンミン白金錯体力例えば、 lmg脂質あたり 0. 3、 0. 4、 0. 5、 0. 6、 0. 7、 0. 8、 0. 9、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0、 8. 0、 9. 0、 10. 0、 11. 0、 12. 0、 13. 0、 14. 0、 15. 0. 16. 0、 17. 0、 18. 0、 19. 0、 20. 0あるレヽ (ま、好ましく (ま、 9〃g、 17〃 g以上で含まれ得る。

[0270] 別の局面において、本発明の方法で用いられるものは、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、 lmgリン脂質あたり 10 g以上、 20 ;^以上、 30 ;^以上、 40 ;^以上、 50 ;^以上、 60 ;^以上、 70 ;^以上、 80 ;^以上、 90 ;^以上、 100 μ g以上、 150〃 g以上、 200 μ g以上、 300 μ g以上で含まれ得る。

[0271] 別の局面において、本発明の方法で用いられるものは、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リボソーム lmlあたり 39 ^ g/ml、 40 μ g/ml, 50 ^ g/ml 、 60 μ g/ml、 70 μ g/ml、 80 μ g/ml以上、 90 μ g/ml、 100 μ g/mlで含まれ得る。

[0272] 別の局面において、本発明の方法で用いられるものは、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リボソーム 1個あたり 1 X io_¹⁽V g以上、 2 X io_¹⁽V g以上、 3 X 10— " g以上、 4 X 10— " g以上、 5 X 10— " g以上、 10— ⁹〃g以上で含まれ得る。

[0273] 1つの実施形態において、本発明の処置方法では、前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームは、例えば、静脈内投与、皮下投与、経口投与，局所投与、腹腔内投与など (好ましくは、静脈内投与）により投与され得る。

[0274] 他の実施形態において、本発明の処置方法では、前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームは、アンミン白金錯体量として、 10〜90mg/m²の窜 11囲 (ί列えば、 10mg/m、 15mg/m、 20mg/m、 25mg/m、 30mg/m、 35mg/ m、 40mg/m、 45mg/m、 50mg/m、 55mg/m、 60mg/m、 65mg/m、 70m g/m、 75mg/m、 80mg/m、 85mg/m、 90mg/m以上であり、 90mg/m、 85m

2 2 2 ^ 2 ° g/m、 80mg/m、 75mg/m、 70mg/m、 65mg/m、 60mg/m、 55mg/m、 50 mg/m、 45mg/m、 40mg/m、 35mg/m、 30mg/m、 25mg/m、 20mg/m、 1 5mg/m²、 10mg/m²以下の任意の範囲の可能な組み合わせ）、好ましくは、 20〜5 Omg/m²の用！:で投与されネ辱る。 ί列免ば、 1曰 1回 15〜20mg/m²、 1曰 1回 50〜70 mg/m、 1曰 1回 25〜35mg/m、 1曰 1回 10〜20mg/m、 1曰 1回 70〜90mg/m 、 1日 1回 20mg/m²の用量で投与され得る力 S、これらに限定されない。

[0275] 別の実施形態において、本発明の処置方法により処置され得る前記がんまたは腫瘍は、例えば、睾丸腫瘍、膀胱癌、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、食道癌、子宮癌、神経芽細胞種、胃癌、好ましくは、前立腺癌、子宮癌であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、がん ·腫瘍の種類 '状態によりリボソームに内包させる白金錯体の種類、量、リボソームの投与量、投与形態などを調整することにより、本発明の処置方法をがん ·腫瘍に適用することができるからである。

[0276] ここで、本発明の処置方法において使用されるアンミン白金錯体を内包するリポソームは、上述の（製造方法）および (アンミン白金錯体を内包するリボソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。

[0277] 本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など)であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ヒト、ゥシ、ブタ、ゥマ、ニヮトリ、ネコ、ィヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、ヒトであり得る。

[0278] 本明細書において「処置するのに有効な量」とは、当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果 (例えば、予防、治療、再発防止など)を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、処置有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量 (例えば、処置有効量)を確認する 1つの有用なアツセィは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。

[0279] 治療有効量、予防有効量などおよび毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順 (例えば、 ED50、集団の 50%において治療的に有効な用量；および LD50、集団の 50%に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率 ED50/LD50として表され得る。大きな治療係数を呈する薬物送達媒体が好ましい。細胞培養アツセィおよび動物実験から得られたデータ力 S、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわない ED50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する細胞の種類等により適宜選択される。

[0280] (医薬用途）

1つの局面において、本発明は、医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。このリボソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リボソーム原料とを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ること力 Sできる。

[0281] 他の局面において、本発明は、医薬として使用するための、アンモニアを有するァンミン白金錯体を内包するリボソームを提供する。このリボソームは、アンミン白金錯体を、本明細書の他の場所において記載される任意の実施形態の濃度 ·レベルで含む。

[0282] ここで、本発明の医薬として使用するためのリボソームは、上述の (製造方法）および (アンミン白金錯体を内包するリボソーム）に記載される任意の形態が使用され得る

[0283] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本明細書の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

[0284] 以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。

実施例 [0285] (実施例 l : cis ジアンミンジクロロ白金（II)を内包したリボソームの調製）

(cis ジアミンジニトラト白金 (II) (シスブラチン硝酸体）の合成）

4塩ィ匕白金カリウム（K PtCl ) 4. 15g (10. Ommol)とョウイ匕カリウム 6. 64g (40m

2 4

mol)を、酸素を充分に除去した蒸留水 50mlに完全に溶解した後、窒素雰囲気下で 28%アンモニア水溶液 1 · 35ml (22mmol)を添加し、撹拌することにより沈澱を得た。この沈澱物を水とエタノールで各々 2回洗浄した後、常温で真空（〜20mmHg) 乾燥することにより、アンミン一白金中間体 cis—〔Pt (NH ) I ] 4. 49gを得た。この

3 2 2

アンミン一白金中間体 cis—〔Pt (NH ) I〕2· 41g (5. Ommol)を蒸留水 30mlに懸

3 2 2

濁させた後、硝酸銀 1. 68g (9. 9mmol)を添加して、遮光下、 24時間攪拌した。生成したヨウ化銀を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮し白色結晶を得た。この白色結晶を、冷蒸留水と冷エタノールで 2回洗浄し、乾燥させ、シスブラチン硝酸体として無色の cis—〔Pt (NH ) (NO ) 〕を 1 · Olg得た。

3 2 3 2

[0286] (cis ジアミンジニトラト白金（II)を内包したリボソームの調製）

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート（DCP)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE)をモル比で、 35 : 40 : 5 : 15 : 5の割合で合計脂質量 45. 6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添加し、メタノール 'クロ口ホルム溶液（1： 1)溶液 3mlに溶解させた。 37°C、 1時間撹拌し、メタノールクロ口ホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させて、真空乾燥させた。得られた脂質膜を NaCl未添加の N トリス（ヒドロキシメチル）—3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4) 3mlに懸濁させ、 37°C、 1 時間撹拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。次に、 cis ジァミンジニトラト白金（II)を 54. lmgを秤量して、 NaCl未添加の N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4) 7 mlに溶解させ、ミセル懸濁液と混合し、 PM10 (Amicon Co. , USA)と NaCl未添加の N トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)を用いた限外濾過（分画分子量： 10, 000)にかけ均一リボソーム 10ml (35. 5mg 脂質量)を調製した。

[0287] (リボソーム中に cis ジアミンジニトラト白金（II)が内包されたことの確認）本実施例で調製されたリボソームに、 cis ジアミンジニトラト白金 (II)が内包されて V、ることをフレームレス原子吸光光度法（FAAS)により確認した。

[0288] フレームレス原子吸光光度法（FAAS)には、 AA 6700 Atomic absorption

Flame emission spectrophotometer (島津)を用!/ヽ7こ。、/皮長 265. 9nm、スリツト幅 0· 5、ランプ電流 14mAの条件下にて、 120。Cで 30秒間、 250。Cで 10秒間、 70 0°Cで 20秒間、 700°Cで 5秒間、 2600°Cで 3秒間にわたって順次処理した。白金標準液（lmg Pt/ml、 lOOOppm)を精製水で希釈して、 12· 5ng/ml、 25ng/ml 、 50ng/ml、 lOOng/ml, 200ng/mlの溶液を調製し、検量線を作成した。リポソーム溶液を精製水で 10000倍して、被検試料とした。

[0289] (結果）

本実施例において調製されたリボソーム中には、 cis ジアミンジニトラト白金 (II)が 323. 33 ^ _§/ 11111 (91. 08 g/mg脂質）内包されていた。得られたリボソームの脂質量は 35. 5mgであった。この cis ジアミンジニトラト白金（II)のリボソームへの内包率は、 5. 9%であった。 cis ジアミンジニトラト白金（II)内包リボソームを含む溶液は、無色であった。

[0290] (cis ジァミンジニトラト白金（II)の cis ジアミンジクロロ白金（II)への転換）

cis ジアミンジニトラト白金（II)が内包されたことが確認されたリボソームを、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液 (ρΗ8. 5)、 PBS (pH8. 0)、または HEPES緩衝液（pH7. 2)に、 25°Cにて、 96時間にわたり供する。これらの緩衝液は、いずれも最終濃度 150mMの NaClが含まれている。

[0291] その結果、無色の溶液は淡黄色に変化することが確認される。これは、 cis ジアミンジニトラト白金 (Π)が、 cis ジアミンジクロ口白金 (II)に転換したことを示す。さらに、この変化は、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出することができる。

[0292] (吸光光度法）

(1)最終濃度 150mMの NaClが含まれるバッファーに 96時間供した cis ジァミンジニトラト白金 (Π)内包リボソームの NaClをバッファー交換により除き、 10倍濃縮する。（2) 100°Cで、 30分間の加熱後（リボソームの破壊）、クロ口ホルムにより溶媒抽出を行う。（3)水層を回収する。（4)回収した水層について波長 200〜400nmの吸収スペクトルを測定する。（5) cis—ジァミンジニトラト白金（II)を内包した直後（150mM

NaClに供する前）のリボソームにつ!/、ても（2)〜（4)の操作を行う。（6)バッファーに 96時間供した cis—ジアミンジニトラト白金（II)リボソームと、 cis—ジアミンジニトラト白金（II)の内包直後のリボソームについて、吸収スペクトルを比較することにより、 cis ージアミンジニトラト白金（II)から cis—ジアミンジクロ口白金（II)への転換を確認すること力 Sでさる。

[0293] (IR法）

吸光光度法と同様に溶媒抽出を行う。水層を回収後、ロータリーエバボレーターを用いて水を蒸発させる。 Nujol法により、 IRスペクトルを測定し、最終濃度 150mMの NaClが含まれるバッファーに 96時間供した cis—ジアミンジニトラト白金（II)内包リポソームと、 cis—ジアミンジニトラト白金（II)を内包した直後（150mMNaClに供する前 )のリボソームのスペクトルを比較する。

[0294] cis—ジアミンジニトラト白金（II)の状態である場合、 Pt— O— Hの変角振動のスぺクトルカ 950〜； 1100cm— ¹の領域に現れる。 cis—ジアミンジクロロ白金（II)の状態である場合、 Pt— Cl結合しかないので、 950〜； UOOcnT¹の領域にはバンドは認められない。従って、 cis—ジアミンジニトラト白金（II)から cis—ジアミンジクロ口白金（II) への転換を確認することができる。

[0295] 白金錯体に関する IR法の詳細については、例えば、 R. Fraggiani, B. Lippert, C. J. Lock and B. Rosenberg, J. Am. Chem. Soc. , 99, 777 (1977)、 F. D . Rochon, A. Morneau

and R. Melason, Inorg. Chem. , 27, 10 (1988) ίこ記載されてレヽる。

[0296] (リボソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換）

(¹⁹⁵PtNMRスペクトルによる解析）

リボソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換は、 ¹⁹⁵PtNMRスぺタトノレにより解析する。 ¹⁹⁵PtNMRスぺタトノレの感度は、天然の^{13 C}— NMRスぺタトノレの感度より 20倍大きい。また、 ¹⁹⁵Ptの天然存在比は、 33. 8%であり、天然に存在する白金の¹ Hに対する相対感度は、 3. 4 X 1CT³と比較的高い。さらにその化学シフトは 1500ppmという極めて広い周波数領域に観測されるので、構造や結合性を調べる上で、極めて有用である。

[0297] (サンプル調製）

以下のように、シスプラチン、硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（II) )および硝酸体 (cis ジアンミンジニトラト白金 (II) )内包リボソームのサンプルを調製する。

[0298] シスプラチン：シスプラチン（M. W: 300) 2mgを D Olmlに溶解させてサンプルと

2

する。（6· 6mM)

硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（II) )：硝酸体（Μ· W. 365) 5mgを D Olml

2 に溶解させてサンプルとする。 (13. 7mM)

硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（II) )内包リボソーム（NaCl⁺)： Pt濃度が 4. 75mMとなるように濃縮して使用する。

[0299] (測定方法）

Na PtCl (Sodium hexachloroplatinate (IV)を D Oに溶解させて外部標準液

2 6 2

を作成する。 NMR装置は、 INOVA— 600 (Varian社）を使用する。直径 5mmの測定管にサンプルをいれて、測定を行う。

[0300] この測定方法では、対照として測定したシスプラチンは、 2160ppm、硝酸体（cis —ジアンミンジニトラト白金（II) )は、 1620ppmに各々ケミカルシフトが観測されることになる。したがって、目的とするリボソームに内包された硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金 (II) )のケミカルシフトは、外液中に NaClが含まれる場合、シスブラチンと同じ一 2160ppmに観測される。これらのケミカルシフト等を測定することにより、内包された硝酸体 (cis ジアンミンジニトラト白金 (II) )は、緩衝液中の塩化ナトリウム由来の C厂ィオンにより置換され、シスプラチンに変換されて!/、るかどうかを確認することができる。

[0301] (比較例 1 ·塩化ナトリウムイオンの影響）

DPPC、コレステロール、ガングリオシド、 DCP、 DPPEをモル比で、 35 : 40 : 5 : 15 : 5の割合で合計脂質量 45. 6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添カロし、メタノール 'クロ口ホルム溶液（1 : 1)溶液 3mlに溶解させた。 37°C、 1時間撹拌し、メタノールクロ口ホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させて、真空乾燥させた。得られた脂質膜を NaClを添加した N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—アミノプ口パンスルホン酸緩衝液（pH8. 4) 3mlに懸濁させ、 37°C、 1時間撹拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。次に、 cis- ジァミンジニトラト白金（II)を 54· lmgを秤量して、 NaClを添加した N トリス（ヒド口キシメチル） 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4) 7mlに溶解させ、ミセル懸濁液と混合し、 PM10 (Amicon Co. , USA)と NaClを添加した Ν トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (ρΗ8· 4)を用いた限外濾過（分画分子量： 10, 000)にかけ均一リボソーム 10mlを調製した。

[0302] NaClを添加した N トリス（ヒドロキシメチル） 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (ρΗ8· 4)を用いた場合、 cis ジアミンジニトラト白金 (II)はリボソームに内包されなかった。 N トリス（ヒドロキシメチル）メチルー 3 -ァミノプロパンスルホン酸 (TAPS )緩衝液に溶解後、数十分で析出が生じた。これらは、吸光度法により確認した。測定には、 UV2500PC (島津）吸光光度計を使用した。

[0303] cis ジアミンジニトラト白金（II) 5mg/mlを 150mM 塩化ナトリウムを含む TAPS 緩衝液 (pH8. 4)に溶解し、 25°Cで静置し、経時的（0時間、 5分後、 10分後、 15分後、 30分後および 45分後）に UVスペクトルを測定した。コントロールとして、 cis ジアミンジクロ口白金（II) lmgを塩化ナトリウム含有 TAPS緩衝液 lmlに溶解し、その U Vスペクトルを測定した。図 4Aおよび図 4Bに示されるように、 45分後の UVスぺタトルの吸収特性は、シスプラチンと同一の特性であった。 45分後以上、放置しても、 U Vスペクトルに変化は認められなかった。従って、 cis ジアミンジニトラト白金（II)の水溶液を、 150mM NaClを含む TAPSに溶解し、 25°Cで 45分間静置すると、 cis ージアミンジニトラト白金 (II)が cis ジアミンジクロ口白金 (II)に変化することがわかつた。これは、 NaClの存在により、 cis ジアミンジニトラト白金（II)が水に難溶性の ci s ジアミンジクロ口白金 (II)となり析出してきてしまうことに原因があると考えられる。

[0304] (実施例 2·リボソームの定量分析）

(I.脂質定量）

リボソームの構成脂質量を、コレステロール量を定量することにより算出した。脂質の定量にはデタミナ一 TC555キット（カタログ番号 UCC/EAN128) (KYOWA C o. LTD)を用いた。標準物質として、キットに添付されている 50mg/ml

コレステロールを使用した。

[0305] スタンダード溶液として、標準物質（50mg/ml :コレステロール）を PBS緩衝液で希釈し、 0、 0. 1、 0. 25、 0. 5、 0. 75、 1、 5、 10 g/20 1溶 ί夜を調製した。 Cis— ジァミンジニトラト白金 (II)内包リボソームを PBS緩衝液で 5倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に 20 分注した。各試験管に、 TritonX— 100 (10%溶液）を17 1添加して撹拌し、その後、 37°C、 40分間、静置した。デタミナ一 TC555キットの酵素試薬を 300 1添加して撹拌し、その後、 3 7°C、 20分間、静置した。吸光度 540nmを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リボソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求めた。

コレステロール量力脂質量を求める換算式

脂質量 8/50 1) =コレステロール量 _§/50 1) X 4. 51 (換算係数）得られたリボソームの脂質量は 3. 55mg/mlであった。

[0306] (II.粒子径分布および粒子径）

リボソーム粒子を精製水で 50倍に希釈して、ゼータサイザ一ナノ（Nan— ZS : MA LVERN Co. LTD)を用いて測定した。

[0307] リボソーム粒子の平均粒子径は、 159nmであった（図 2A)。

[0308] (実施例 3.糖鎖を結合させた cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームの調製）

実施例 1の「cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームの調製」と同様の方法により、 cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームを調製した。本実施例において調製されたリボソーム中には、 cis—ジァミンジニトラト白金（II)が 323· SS ^ g/lml (91. 08 g/mg脂質）内包されていた。得られたリボソームの脂質量は 35· 5mgであった。この cis—ジアミンジニトラト白金（II)のリボソームへの内包率は、 5. 9%であつた。 cis—ジアミンジニトラト白金（II)内包リボソームを含む溶液は、無色であった。

[0309] (リボソーム脂質膜面上の親水性化処理）

cis—ジアミンジニトラト白金（II)内包リボソームの溶液 10mlを XM300膜（Amicon Co. , USA)と炭酸緩衝液（pH 8. 5)を用いた限外濾過（分画分子量： 300, 00 0)にかけ溶液の pHを 8· 5にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS³ ; Pierce Co. , USA) 10mgを加え、室温で 2時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリボソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミンと BS³との化学結合反応を完結した。そして、このリボソーム液を XM300 膜と炭酸緩衝液 (pH 8. 5)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)にかけた。次に、炭酸緩衝液（pH 8. 5) lmlに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 40mgをリポソーム液 10mlに加えた。次いで、この溶液を、室温で 2時間攪拌後、冷蔵下で一晚攪拌し、分画分子量 300, 000で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液を N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (ρΗ8· 4)に交換し、リボソーム膜上の脂質に結合した BS³とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リボソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。

(リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA)の結合）

リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA)の結合は、既報の手法（Yamaza ki, N. , Kodama, Μ. and Gabius, H. —J. (1994) MethodsEnzymol. 242, 56— 65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は 2段階化学反応で行い、はじめに、本実施例で得られた 10mlのリボソーム膜面上に存在するガンダリオシドを lmlの N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH 8. 4)に溶力もたメタ過ヨウ素酸ナトリウム 43mgを加え、冷蔵下でー晚攪拌して過ヨウ素酸酸化した。 XM300膜と PBS緩衝液 (pH 8. 0)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、 N—トリス（ヒドロキシメチル） 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液を PBS緩衝液（ρΗ8· 0)に交換して、酸化されたリボソーム 10mlを得た。このリボソーム液に、 20mgのヒト血清アルブミン（HSA) /PBS緩衝液（pH 8. 0)を加えて室温で 2時間反応させ、次に 2 M NaBH CN/PBS緩衝液（pH 8. 0) 100 1を加えて室温で 2時間、さらに冷

3

蔵下で一晩攪拌してリボソーム上のガンダリオシドと HSAとのカップリング反応で HS Aを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量： 300, 000)し、遊離のシァノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液 (pH 8. 5)に交換して、 HSA結合リボソーム液 10mlを得た。

[0311] (糖鎖の調製）

糖鎖として、シァリルルイス Xを使用した。

[0312] 各糖鎖の質量を計測し、以下において使用するための前処理をした。

[0313] (リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA)上への糖鎖の結合）

本実施例において調製した各糖鎖 2mgを精製水に溶解し、 0. 25gの NH HCO

4 3 を溶かした 0. 5ml水溶液に加え、 37°Cで 3日間攪拌した後、 0. 45 mのフイノレターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルァミン化合物 4mg/ml (アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリボソーム液の一部分 10mlに架橋試薬 3, 3'—ジチオビス (スルホスクシンィミジルプロピオネート） (D TSSP ; Pierce Co. , USA) 10mgを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下でー晚攪拌し、 XM300膜と炭酸緩衝液 (pH 8. 5)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)して、遊離の DTSSPを除去し、 DTSSPがリボソーム上の HSAに結合したリボソーム 1 Omlを得た。次に、このリボソーム液に上記のグリコシルァミン化合物（アミノ化糖鎖溶液） 12. 5、 37. 5、 125、 250、 500、 1250、 2500 1をカロえて、室温で 2時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタン/炭酸緩衝液 (pH 8. 5)を添加し、その後、冷蔵下でー晚攪拌し、リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DTSSPにグリコシル化ァミン化合物の結合を行った。 XM300膜と HEPES緩衝液（pH 7. 2)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリボソームとが結合したリポソーム各 10mlが得られた。

[0314] (リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA)上の親水性化処理）

本実施例で調製された糖鎖が結合したリボソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリボソーム上の HSAタンパク質表面の親水性化処理を行った。このリポソーム 10mlに、別々に、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 26· 4mgを加えて、室温で 2時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、 XM300膜と HEPES緩衝液 (pH 7. 2 )で限外濾過（分画分子量： 300, 000)し、未反応物を除去した。 0· 45 111のフィノレターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖が結合したリボソーム複合体各 10ml (総脂質量 15. 2mg、総蛋白量 1100 g、平均粒子径 171nm)を得た

[0315] (cis—ジアミンジクロ口白金（II)がリボソームに内包されていることの確認）

本実施例により調製された糖鎖の結合したリボソームを含む溶液は、無色から淡黄色に変化した。これは、リボソームに内包された cis—ジアミンジニトラト白金 (II)が、 ci s—ジアミンジクロ口白金 (II)に転換したことを示す。さらに、この変化は、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出することができる。

[0316] (リボソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換）

(¹⁹⁵PtNMRスペクトルによる解析）

リボソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換は、 ¹⁹⁵PtNMRスぺタトルにより解析した。

[0317] (サンプル調製）

以下のように、シスプラチン、硝酸体（cis—ジアンミンジニトラト白金（II) )および硝酸体 (cis—ジアンミンジニトラト白金 (II) )内包リボソームのサンプルを調製した。

[0318] シスプラチン：シスプラチン（M. W: 300) 2mgを D Olmlに溶解させてサンプルと

2

した。（6· 6mM)

硝酸体（cis—ジアンミンジニトラト白金（II) )：硝酸体（Μ· W. 365) 5mgを D Olml

2 に溶解させてサンプルとした。（13· 7mM)

硝酸体（cis—ジアンミンジニトラト白金（II) )内包リボソーム（NaCl⁺)： Pt濃度が 4. 75mMとなるように濃縮して使用した。

[0319] (測定方法）

2 6 2

を作成した。 NMR装置は、 INOVA—600 (Varian社）を使用した。直径 5mmの測定管にサンプノレ 600 H 1をいれて、測定を行った。

[0320] (結果）

対照として測定したシスプラチンは、— 2160ppm、硝酸体（cis—ジアンミンジニトラト白金（II) )は、—1620ppmに各々ケミカルシフトが観測された（図 5aおよび図 5b) 。目的とするリボソームに内包された硝酸体 (cis ジアンミンジニトラト白金 (II) )のケミカルシフトは、外液中に NaClが含まれる場合、シスプラチンと同じ一 2160ppmに観測された（図 5c)。このこと力、ら、内包された硝酸体 (cis ジアンミンジニトラト白金（ II) )は、緩衝液中の塩化ナトリウム由来の C厂イオンにより置換され、ほとんどが、シスプラチンに変換されていることが確認された。また、リボソームに内包させた cis ジァンミンジニトラト白金 (II)を cis ジアミンジクロ口白金 (II)に変化させない場合は、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)のケミカルシフ H直である 1620ppmのピークも、 cis ージアミンジクロ口白金（II)のケミカルシフト値である 2160ppmも認められなかつた（図 5d)。

[0321] 本実施例において調製されたリボソーム中には、 cis ジアミンジクロ口白金（II)が 2 53. 98 ^ _§/11111 (78. 38 g/mg脂質）内包されていた。得られたリボソームの脂質量は 32. 4mgであった。この cis ジアミンジクロ口白金（II)のリボソームへの内包率は、 4· 59%であった。

[0322] 特許文献 1の方法により製造されたリボソームに内包されるシスプラチンの量は、 8 . Q ^ g/mg 脂質であり、得られたリボソームの脂質量は 200mgである。従って、本方法により製造されたリボソーム 1個あたりが内包するシスブラチンの量は、特許文献 1のリボソームよりも約 9倍量も多い。また、本実施例の方法では、 54. lmgの cis ジアミンジニトラト白金 (II) (シスブラチンに換算すると 46· Omg)をリボソームに内包させているのに対し、特許文献 1では、約 2倍量の lOOmgのシスプラチンをリボソームに内包させている。従って、単位脂質量当たりの内包効率は、内包されたシスプラチン量と内包に使用したシスブラチン量から換算すると、本発明の方法により製造されたリボソームが約 18倍程度も優れているといえる。さらに、本発明の方法には加熱ェ程は含まれず、作製されたリボソームは安定であると!/、える。

[0323] また、非特許文献 1に記載されるリボソームには、 14. O ^ g/mg 脂質のシスプラチンが内包されている。従って、本方法により製造されたリボソーム 1個あたりが内包するシスブラチンの量は、非特許文献 1のリボソームよりも約 5. 6倍量も多い。

[0324] 従って、本方法により調製されるシスブラチン内包リボソームは、従来の方法により作製されたリボソームよりも非常に多くのシスブラチンを内包することができることが確認された。

[0325] (実施例 4·リボソームの定量分析）

本実施例では、実施例 3で調製した糖鎖の結合した Cis—ジアミンジニトラト白金 (II )内包リボソームの定量分析を行った。

[0326] (I.タンパク質定量）

リボソームに内包された HSA量とリボソーム表面にカップリングした HSAの総タンノク質量を BCA法により測定した。

[0327] タンパク質量の測定は、 Micro BCA™ Protein Assay Reagentキット（カタ口グ番号 23235BN) (PIERCE Co. LTD)を用いた。標準物質として、キットに添付された 2mg/mlアルブミン（BSA)を使用した。

[0328] スタンダード溶液として、標準物質（2mg/ml：アルブミン）を PBS緩衝液で希釈し、 0、 0. 25、 0. 5、 1、 2、 3、 4、 5〃 g/50〃 1溶液を調製した。 Cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームを PBS緩衝液で 20倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に 50 分注した。各試験管に 3%ラウリノレ硫酸ナトリウム溶液（SDS溶液）を 100 1添加した。キットに添付された試薬 A、 B、 C を、試薬 A：試薬 B：試薬 C = 48： 2： 50となるように混合し、各試験管に 150 μ 1添加した。この試験管を、 60°Cで 1時間、静置した。室温に戻ってから、吸光度 540nmを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リボソームのタンパク質量を測定した。リボソームのタンパク質量は、 l lO ^ g/mlであった。

[0329] (II.脂質定量）

コレステロールを使用した。

[0330] スタンダード溶液として、標準物質（50mg/ml :コレステロール）を PBS緩衝液で希釈し、 0、 0. 1、 0. 25、 0. 5、 0. 75、 1、 5、 10 g/20 1溶 ί夜を調製した。実施例 3で調製した糖鎖の結合した Cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームを ΡΒ S緩衝液で 5倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に 20 ,ι 1分注した。各試験管に、 TritonX— 100 (10%溶液）を 17 μ 1添加して撹拌し、その後、 37°C、 40分間、静置した。デタミナ一 TC555キットの酵素試薬を 300 ^ 1添加して撹拌し、その後、 37°C、 20分間、静置した。吸光度 540nmを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リボソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求めた。

コレステロール量力脂質量を求める換算式

脂質量 8/50 1) =コレステロール量 _§/50 1) X 4. 51 (換算係数）得られたリボソームの脂質量は 3. 24mg/mlであった。

[0331] (III.粒子径分布および粒子径）

[0332] リボソーム粒子の平均粒子径は、 171nmであった（図 2B)。

[0333] (実施例 5 :抗体を結合させた cis—ジアミンジクロ口白金 (II)内包リボソームの調製）実施例 1の「cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームの調製」と同様の方法により、 cis—ジアミンジニトラト白金（II)内包リボソームを調製した。この cis—ジアミンジニトラト白金 (II)内包リボソームを含む溶液は無色である。

[0334] (リボソーム脂質膜面上の親水性化処理）

実施例 1と同様の方法により、リボソーム脂質膜面を親水性化処理する。

[0335] (標的指向性物質の調製）

標的指向性物質として、腫瘍に特異的な抗体 (R&D systems (MN, USA)社製の E—セレクチン抗体 (AF575)を用いた。以下において使用するための前処理をした。 ATCCより抗ヒト E— selectinマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（Number : CRL— 2515 CL3)を購入して精製した。細胞を RPMI 1640 ( GIBCO code. 11875) /10%FBS/ペニシリン lOOunit/ml.ストレプトマイシン 100 ^ g/ ml (Antibiotic Antimycotic solution, stabiklized ¾IGMA A59 55) (ゥシ胎児血清 SIGMA F0926 中、 37°C、 5%C〇2環境下で培養した。マウス Balb/c (日本 SLC 雌性、 6週齢）にプリスタン（SOO ^ l/mouse)を 2回（5日間間隔）投与したのち、 5 X 10⁶のハイブリドーマ細胞を PBSに浮遊させ、 1mlずつ腹腔内に注射した。注射後、 14日目に開腹し、腹水を採取した。腹水に硫酸アンモニゥム（0. 4飽和）を添加して、 10, 000rpmX 30分（4°C)で遠心し、沈殿を生理食塩水で溶解し、透析（3日間、 4°C)を行った。 10, 000rpmX 30分（4°C)で遠心し、上清に 2容量の 0. 06M 酢酸緩衝液（ρΗ4· 8)を添加し、 n— Caprylic acidを終濃度で、 6. 8%となるように添カロし、室温で 30分間携持した。 10, 000rpmX 30分（0 〜4°C)で遠心し、透析（3日間、 4°C)を行った。 10, 000rpmX 30分（0〜4°C)で遠心し、上清を回収した。

[0336] (リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA)上への抗体の結合）

本実施例で得たリボソーム液の一部分 10mlに架橋試薬 3, 3'—ジチオビス (スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP ; Pierce Co. , USA) 10mgをカロえて室温で 2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、 XM300膜と炭酸緩衝液 (pH 8. 5)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)して、遊離の DTSSPを除去し、 DTSSPがリポソーム上の HSAに結合したリボソーム 10mlを得た。次に、このリボソーム液に本実施例で調製した 4· 6mg/mlの E—セレクチン抗体（AF575) 3. 26ml (15mg抗体）を 10mlのリボソーム液に添加して、 25°Cで 2時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン/炭酸緩衝液 (pH 8. 5)を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソ一ム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DTSSPに E—セレクチン抗体（AF575)の結合を行った。 XM300膜と HEPES緩衝液（pH 7. 2)で限外濾過（分画分子量： 30 0, 000)して、遊離の E—セレクチン抗体（AF575)およびトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去した。その結果、 E—セレクチン抗体 (AF575)とヒト血清アルブミンとリボソームとが結合したリボソーム各 10mlが得られた。

[0337] (リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA)上の親水性化処理）

本実施例で調製された E—セレクチン抗体 (AF575)が結合したリボソームについて、実施例 3と同様の方法により親水性化処理を行った。

[0338] (cis—ジアミンジクロ口白金（II)がリボソームに内包されていることの確認）

本実施例により調製された E—セレクチン抗体 (AF575)の結合したリボソームを含む溶液は、無色から淡黄色に変化した。これは、リボソームに内包された cis—ジアミンジニトラト白金 (Π)が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)に転換したことを示す。さらに、この変化は、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出することができる。

[0339] (リボソームの定量分析）

本実施例で調製した E—セレクチン抗体 (AF575)の結合した Cis—ジァミンジニトラト白金 (II)内包リボソームの定量分析 (タンパク質定量、脂質定量、粒子径分布および粒子径）を、実施例 1と同様の方法により行った（図 6)。

[0340] (実施例 6A :がん ·腫瘍の処置についての有効性の検討）

本実施例は、実施例 1 (糖鎖なしリボソーム）実施例 3 (糖鎖修飾リボソーム）および実施例 5 (抗体修飾リボソーム）により調製した cis—ジアミンジクロ口白金 (II)内包リポソームが、がん ·腫瘍の処置に有効であることを確認することを目的とする。

[0341] (cis—ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソームの抗癌活性評価）

( 1.担癌部位への集積性：癌部位の集積 cis—ジアミンジクロ口白金（II)量の評価）実施例 3 (シァリルルイス X修飾リボソーム）により調製した cis—ジアミンジクロ口白金 (II)内包リボソームをもちいた。

[0342] 6週齢のマウス（Balb/c、雌性）（各群 1匹）の右大腿部の皮下に、 1 X 10⁶細胞のエールリツヒ腹水癌細胞（EAT細胞）（ATCC Number CCL— 77TM E (E hrlich- Letter ascites) )を移植して 10日後に実験に用いた。 cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包させたシァリルルイス X修飾リボソーム、およびコントロールとして ci s—ジアミンジクロ口白金（II)のみを、それぞれ 1 · 7mg/kg#: (22& μ g/ml) ウスに 15(^ 1、尾静脈投与した。投与後 48 96時間後に腫瘍を摘出した。

[0343] 摘出した腫瘍組織（0. 2〜； 1. Og)のうち、 0. lgに対して濃硝酸 lmLを添加し、 5 分間撹拌した。 1時間静置したのち、 60°Cの水浴中で 1時間加熱し、室温に戻した。この硝酸で処理した溶液 100 1に蒸留水 300 1添加した。フレームレス原子吸光光度法 (FAA≥i AA— 00 Atomic absorption flame emission spectrop hotometer SIMAZU)で白金量を測定し、腫瘍 1グラムあたりの白金量を比較した。（波長 265. 9 、スリット幅 0. 5、ランプ電流 14mA 120 C 30秒、 250 C 10 秒、 700°C 5秒、 2600°C 3秒：検量線は、 lmg/ml 白金標準液（NAKARAI) を蒸留水で希釈して、 12. 5ng/ml 25ng/ml 50ng/ml 100ng/ml 200η g/mlの溶液を作製した。）。結果を以下の表に示す。

[0344] [表 1]

白金濃度：組織 lgあたりに存在した白金量 (ng)

投与後時間：各リボソームを投与し、組織に存在する白金濃度を測定した時間シスプラチン単独： cis—ジアミンジクロ口白金（II)のみ

SLX修飾： cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包した、シァリルルイス Xで修飾したリポソーム

(考察）

リボソーム投与の 48時間後において、シァリルルイス X修飾リボソームを投与したマウスでは、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)のみを投与したマウスに比べて、リボソームが癌部位に顕著に集積していることが観察された。また、投与 96時間後において、 ci s—ジアミンジクロ口白金 (II)のみを投与すると、癌部位への集積は顕著に減少した。シァリルルイス X修飾リボソームでは、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)のみを投与したときよりも 2· 5倍以上も cis—ジアミンジクロロ白金 (II)が) S瘍部位に残存していることが確認された (表 1)。

[0345] (2.細胞増殖を抑制する活性の確認）

本実施例は、実施例 1 (糖鎖なしリボソーム）、実施例 3 (糖鎖修飾リボソーム）および実施例 5 (抗体修飾リボソーム）により調製した cis—ジアミンジクロ口白金 (II)内包リポソームを用いた。

[0346] エールリツヒ腹水癌細胞（EAT細胞）（ATCC Number ： CCL— 77TM E ( Ehrlich- Letter ascites) )を 1 X 10³細胞/ 100 μ 1/ゥエル（Falcon3072)で播種し、 24時間培養後に試料を添加した。試料は、 cis—ジアミンジクロロ白金 (II)内包未修飾リボソーム、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)内包シァリルルイス Xリボソーム、 ci s ジアミンジクロロ白金（II)内包抗 E セレクチン抗体修飾リポソームを、 DMEM ( ダルベッコ改変イーグル液体培地低グルコース SIGMA D6046) /10%FBS (ゥシ胎児血清 SIGMA F0926) /ペニシリン lOOunit/ml.ストレプトマイシン 100 μ g/ mHAntioiotic Antimycotic solution, stabiklized SIGMA A5955 ) )で希釈して cis ジアミンジクロロ白金 (II)量として 10 g/mlに調製した。コント口ールとして、 cis ジアミンジクロロ白金（II)のみを DMEM/10%FBSで溶解し、 10 g/mlに調製したもの（シスブラチン単独）を用いた。次いで、この試料を、終濃度、 8· 3 M、 16. 6 となるように培養細胞へ添カロし、 37。C, 5% COインキュべ

2 一ター内で 48時間培養した。添加から 48時間後の細胞数を、ホルマザン量を指標と

[0347] さらに、試料を含まない対象として、 DMEM/10%FBSのみを添加したものついても、 MTTアツセィを行った。

[0348] 細胞数測定用 WST— 8 (キシダ化学）を各ゥエルに 20 μ 1添加して、 2時間後に吸光度 450nmを測定した。吸光度の測定には、 GEヘルスケア Ultrospec— 6300を用いた。 1試料あたり 4区; n = 3で実験を行った。結果を以下に示す。

[0349] (表 2·各試料による細胞増殖の抑制）

[表 2]

試料：添加した試料の終濃度（ 11 M)

試料なし:試料（cis ジアミンジクロ口白金（II) )を添加しなかった群の吸光度（450η m)の平均

シスプラチン単独： cis ジアミンジクロ口白金（II)のみ

未修飾： cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包した、未修飾のリボソーム

SLX修飾： cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包した、シァリルルイス Xで修飾したリポソーム抗体修飾： cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包した、抗 E—セレクチン抗体で修飾したリボソーム

平均：各試料を投与した後の吸光度（450nm)の平均

SD :標準偏差

(考察）

試料を添加しなかった群では、吸光度（450nm)は 0. 480であった（表 2、試料なし)。

[0350] 未修飾リボソーム、 SLX修飾リボソームおよび抗体修飾リボソームを投与した群は、試料終濃度が 8· 3 ^ Μのときも、 16· 6 Μのときも、 cis—ジアミンジクロロ白金（II) 単独のものとほぼ同様に効果があることが示された。この結果から、 cis—ジアミンジクロロ白金 (II)をリボソームに封入しても、抗がん作用は消失しないことが示された。シスプラチンが細胞内でリボソームから放出され、核酸と相互作用していることが確認できた。

[0351] 本実施例により、未修飾リボソーム、 SLX修飾リボソームおよび抗体修飾リボソームの全てにおいて、リボソームに内包された cis—ジアミンジクロ口白金（II)は、細胞に対して増殖抑制活性を示すことが確認された。

[0352] (3.腫瘍の増殖抑制効果の確認）

6週齢マウス（Balb/c 雌性）（各群 3匹）の右大腿部の皮下に、 1 X 10⁶細胞のェ一ルリッヒ腹水癌細胞（EAT細胞）（ATCC Number ： CCL— 77TM E (Ehrl ich— Letter ascites) )を移植した。移植の 5日後、 12日後、 19日後に、 cis—ジァミンジクロロ白金（Π)内包シァリルルイス X修飾リボソーム、および抗 E—セレクチン抗体修飾リボソームを、それぞれ、 1 · Smg/kg ^OO ^ g/ml)でマウスの尾静脈に投与した。コントロールとして、生理食塩水、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)を生理食塩水に 200 g/mlとなるように溶解させた。この溶解した溶液を、同様に投与した。

[0353] 腫瘍の大きさは、腫瘍を移植した 12日後、 19日後、 29日後に、デジタルノギス（Mi tutoyo CD— S15C)を用いて、長径（Amm)および担径（Bmm)を測定することで確認した。 (AX B²) X 0. 4の計算式により腫瘍体積 (mm³)を計算した。

[0354] この動物実験では、内包用のリボソームには、がんに指向させることが知られている糖鎖（SLX)および抗体を結合させたものを用いて、従来のシスブラチンに対する抗がん作用の改善を観察した。以下に結果を示す。

[表 3]

(表 3.各試料による腫瘍抑制効果）

腫瘍体積 (mm³)

日数:腫瘍移植後、腫瘍の大きさを測定した時期

生理食塩水：生理食塩水のみ

シスプラチン単独： cis—ジアミンジクロ口白金（II)のみ

抗体修飾： cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包した、抗 E—セレクチン抗体で修飾したリボソーム

平均：各試料を投与した後の腫瘍体積 (mm³)の平均

SD :標準偏差

(結果および考察）

この結果から、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包した、シァリルルイス X修飾リポソームまたは抗 E—セレクチン抗体修飾リボソームを投与した場合、腫瘍細胞の移植後 29日目において、腫瘍の大きさは、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)単独および未修飾のリボソームを投与したものよりも顕著に小さ力、つた。

[0356] これは、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包したリボソームは、シァリルルイス Xまたは抗 E—セレクチン抗体で修飾したことで、リボソームの腫瘍組織への集積性が高まったことにより、腫瘍に cis—ジアミンジクロ口白金 (II)の効果が集中した結果と考えられる。

[0357] 本実施例では、シァリルルイス Xおよび抗 E—セレクチン抗体の修飾による効果が確認された。この結果より、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包させ、シァリルルイス Xまたは抗 E—セレクチン抗体で修飾したリボソームは、 cis—ジアミンジクロ口白金（II )を単独で投与するよりも、顕著に少な!/、量で腫瘍の成長を抑制することが確認できた。このこと力ゝら、シァリルルイス Xまたは抗 E—セレクチン抗体で修飾したリボソームが腫瘍の治療に有効であることが示された。

[0358] また、従来の内包方法よりも脂質あたりまたはリン脂質あたりのシスブラチン内包量が顕著に増大させることができ、その結果、顕著な治療効果が奏されることも確認され。

[0359] これは、たとえば、従来の抗がん剤内包リボソーム（Cancer Chemotther Phar maco丄 (1999) 43 : 1— 7 Comparative pharmaco inetics, tissue distrib ution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in Ion g— circulating, pegylated liposome (SPI) in tumor— bear in mice) ίこおレヽて達成されたものよりも顕著であることが理解される。この文献に記載された SPI077 リボソームは、アメリカで臨床利用されているリボソームである。この文献の FiglAには、 SPI077リボソームのデータが記載されている力 S、その投与量は、本実施例のリポソームよりはるかに多い。したがって、本発明は、全体の投与量を減らしつつ、同程度以上の効果を達成するといえる。癌種によっては、プローブ標識していないリポソーム（SPI077)で、本論文程度の抗癌活性が認められるため、糖鎖および抗体を認識プローブとして用いたリボソームは、このシスブラチン投与量で、更に効果が見込めると考えられる。

[0360] (実施例 6B：他のがん ·腫瘍の処置につ!/、ての有効性の検討）

実施例 1 (未修飾リボソーム）、実施例 3 (糖鎖修飾リボソーム）および実施例 5 (抗体修飾リボソーム）により調製された cis ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソーム力精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍の処置に有効であることを確認する。

[0361] 雌性 Balb/cマウスの大腿部皮下に、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂 ·尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍の細胞（約 2 X 10⁷個）を移植し、がん組織が 0. 3〜0. 6gに発育したものを担がんマウスとして本実験に用いる。

[0362] 各々の担がんマウスに、各 cis ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソーム（200 μ 1) を、経口投与または尾静脈投与のいずれかで、それぞれ投与する。

[0363] cis ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソームを投与した全ての担がんマウスにおいて、がん ·腫瘍の体積は減少する力、、腫瘍 ·がんは消滅することが確認される。

[0364] したがって、本方法により作製された cis ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソームは、がん ·腫瘍の処置に有効であることがわかる。

[0365] (実施例 7：他の水溶性アンミン白金錯体での実験）

(シスブラチン硫酸体を内包したリボソームの調製）

(シスブラチン硫酸体の調製）

2 4

mol)を、酸素を充分に除去した蒸留水 50mlに完全に溶解した後、窒素雰囲気下で 28%アンモニア水溶液 1 · 35ml (22mmol)を添加し、撹拌することにより沈澱を得る。この沈澱物を水とエタノールで各々 2回洗浄した後、常温で真空（〜20mmHg)乾燥することによりアンミン一白金中間体 cis 〔Pt (NH ) I〕を得る。このアンミン一白

3 2 2

金中間体 cis—〔Pt (NH ) I〕1. 45g (3. Ommol)を蒸留水 300mlに懸濁させた後

3 2 2

、硫酸銀 0. 933g (3. Ommol)を添加して、攪拌しながら 4時間反応させ、生成したョゥ化銀を濾別し、シスブラチン—硫酸体として、無色の cis—〔Pt (NH ) SO〕を得る

3 2 4

〇

[0366] (シスプラチン硫酸体の内包されたリボソームの調製）

DPPC、コレステロール、ガングリオシド、 DCP、 DPPEをモル比で、 35 : 40 : 5 : 15 : 5の割合で合計脂質量 45. 6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添カロし、メタノール 'クロ口ホルム溶液（1 : 1)溶液 3mlに溶解させる。 37°C、 1時間撹拌し、メタノールクロ口ホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させて、真空乾燥させる。得られた脂質膜を NaCl未添加の N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノメタン (TAPS)緩衝液（pH8. 4) 3mlに懸濁させ、 37°C、 1時間撹拌する。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得る。次に、シスブラチン —硫酸体を 50mgを秤量して、 NaCl未添加の TAPS緩衝液（pH8. 4) 7mlに溶解させ、ミセル懸濁液と混合し、 PM10 (Amicon Co. , USA)と NaCl未添加の TAPS 緩衝液（pH8. 4)を用いた限外濾過（分画分子量： 10, 000)にかけ均一リボソーム 1 0mlを調製する。

[0367] (リボソーム中にシスプラチン硫酸体が内包されたことの確認）

本実施例で調製されたリボソームに、シスブラチン硫酸体が内包されていることを、実施例 1と同様の方法を用いて、フレームレス原子吸光光度法 (FAAS)により確認する。

[0368] その結果、リボソーム中に、シスプラチン硫酸体が内包されていることが確認され

[0369] (シスプラチン硫酸体の cis ジアミンジクロ口白金（II)への転換）

(1.緩衝液によるシスプラチン硫酸体の cis ジアミンジクロ口白金（II)への転換

)

シスプラチン硫酸体が内包されたことが確認されたリボソームを、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液（ρΗ8· 5 )、 PBS (pH8. 0)、または HEPES緩衝液（pH7. 2)に、 25°Cにて、 96時間供する。これらの緩衝液は、いずれも最終濃度 150mMの NaClが含まれている。

[0370] その結果、無色の溶液は淡黄色に変化することが確認される。これは、シスプラチンー硫酸体が、 cis ジアミンジクロ口白金 (II)に転換したことを示す。さらに、この変化は、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出すること力 Sでさる。

[0371] (2.糖鎖を結合させたシスブラチン硫酸体を内包したリボソームの調製）実施例 2と同様の方法を使用して、シスブラチン硫酸体が内包されたことが確認されたリボソームから、糖鎖を結合させた cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包したリポソームを調製する。得られたリボソームにおいて、シスプラチン硫酸体が cis ジアミンジクロ口白金 (II)へ転換したことは、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出することができる。

[0372] (3.抗体を結合させた cis ジアミンジクロ口白金 (II)を内包したリボソームの調製）実施例 6と同様の方法を使用して、シスブラチン硫酸体が内包されたことが確認されたリボソームの各溶液から、抗体を結合させた cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包したリボソームを調製する。得られたリボソームにおいて、シスブラチン硫酸体力 Scis ジアミンジクロロ白金 (II)へ転換したことは、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出することができる。

[0373] (リボソームの定量分析）

上記 (シスブラチン硫酸体の cis ジアミンジクロ口白金 (II)への転換)節で調製したリボソームの各々について、定量分析 (タンパク質定量、脂質定量、粒子径分布および粒子径）を、実施例 1と同様の方法により行う。

[0374] (がん.腫瘍の処置についての有効性の検討）

実施例 5と同様の方法により、上記（シスプラチン硫酸体の cis ジアミンジクロ口白金 (II)への転換)節で調製したリボソームの各々力 S、腫瘍 ·がんの処置に有効であるかどうかを確認する。

[0375] その結果、これらの難水溶性薬剤を内包したリボソームを投与した全ての担がんマウスにおいて、がん ·腫瘍の体積は減少する力、、腫瘍 ·がんは消滅することが確認される。

[0376] したがって、本方法により作製された cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包したリポソームは、がん '腫瘍の処置に有効であることがわかる。

(実施例 8：他の白金錯体での実験）

実施例 1と同様の方法を用いて、 cis ジアンミンジクロロ白金（II)の代わりに、 cis —ジアンミン一 1 , 1—シクロブタン一ジカルボキシラト白金（11)、 cis ジアンミン（ダリコラト）白金（11)、（IR, 2R—ジアンミンシクロへキサン)ォキサラト白金（11)、 cis ジアンミンジブロモ白金 (II)を内包させたリボソームを調製する。

[0377] (リボソーム中に薬剤が内包されたことの確認）

実施例 1と同様の方法を使用して、フレームレス原子吸光光度法 (FAAS)により、これら薬剤が水溶性形態としてリボソーム中に内包されたことを確認する。

[0378] (水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換）

(1.緩衝液による水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換）

実施例 1と同様の方法を使用して、水溶性薬物が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液を、各々が形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液に供する。その結果、水溶性薬剤が、難水溶性薬剤に転換したことを示す。さらに、この変化は、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出すること力 Sでさる。

[0379] (2.糖鎖を結合させた難水溶性薬剤を内包したリボソームの調製）

実施例 3と同様の方法を使用して、水溶性薬物が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液から、糖鎖を結合させた難水溶性薬剤を内包したリボソームを調製する。このリボソームについて、内包された水溶性薬剤が難水溶性薬剤へ転換したことは、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出すること力 Sでさる。

[0380] (3.抗体を結合させた難水溶性薬剤を内包したリボソームの調製）

実施例 6と同様の方法を使用して、水溶性薬物が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液から、抗体を結合させた難水溶性薬剤を内包したリボソームを調製する。このリボソームについて、内包された水溶性薬剤が難水溶性薬剤へ転換したことは、実施例 1と同様の方法を用いて、吸光光度法、 IR法、 ¹⁹⁵Pt— NMR法により検出すること力 Sでさる。

[0381] (リボソームの定量分析）

上記 (水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換)節で調製したリボソームの各々について、定量分析 (タンパク質定量、脂質定量、粒子径分布および粒子径）を、実施例 1と同様の方法により行う。

[0382] (がん.腫瘍の処置についての有効性の検討）実施例 5と同様の方法により、上記 (水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換)節で調製したリボソームの各々 1S 腫瘍 ·がんの処置に有効であるかどうかを確認する。

[0383] その結果、これらの難水溶性薬剤を内包したリボソームを投与した全ての担がんマウスにおいて、がん ·腫瘍の体積は減少する力、、腫瘍 ·がんは消滅することが確認される。

[0384] したがって、本方法により作製された難水溶性薬剤を内包したリボソームは、がん- 腫瘍の処置に有効であることがわかる。

[0385] (実施例 9·凍結乾燥空リボソームへの cis ジアンミンジニトラト白金（II)の内包）本実施例では、本発明の内包技術がどのようなリボソームにも応用できることを確認するために、改良コール酸塩法（N. Yamazaki, M. kodama, H— J. Gabius, Me thods Enzymol. , 242, 56— 65 (1994)； N. Yamazaki, J. Membr. Sci. , 41 , 249 - 267 (1989)；ぉよび M. Hirai, H. Minematsu, N Kondo, K Oie, K . Igarashi, N. Yamazaki, BBRC. , 353, 553— 558 (2007) )とは異なる凍結乾燥リポソーム法 (H. Kikuchi, N. Suzuki et al, Biopharm. Drug Dispos. , 17, 589— 605 (1999) )により作製されたリボソームを用いて、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を内包させた。

[0386] (cis ジアンミンジニトラト白金（II) (CDDP 3)の合成）

実施例 1と同様の方法を用いた。 cis ジアンミンジニトラト白金（II)は、 Daharaの方法（S . G. Dhara, Indian J. Chem. , 7, 335 (1970) )により合成した。

[0387] 塩化白金酸カリウム 4. 15g (10mmol)を蒸留水に溶解後、遮光、氷冷下で窒素を吹き込みながらヨウ化カリウム 6. 64g (40mmol)を加え 5分間撹拌した。この反応溶液に 28%アンモニア水溶液 1 · 35mL (22mmol)を滴下し、 3時間撹拌した。生成した黄色結晶を濾取し、蒸留水、エタノールで順次洗浄した後、 40°Cで 10時間減圧乾燥した。ここで、アンミン一白金中間体 cis—〔Pt (NH ) I〕 (cis - diamminediiod

3 2 2

e platinum (II) (CDDP— 2) )を 4· 49g得た。 cis—〔Pt (NH ) I ] 2. 41g (5mmol

3 2 2

)を蒸留水に懸濁させた後、硝酸銀 1. 68g (9. 9mmol)を加え、遮光下 24時間撹拌した。生成したヨウ化銀を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮して白色結晶を得た。この白色結晶を冷蒸留水、エタノールで順次洗浄した後、 40°Cで 10時間減圧乾燥し、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を 1 · Olg得た。

[0388] (2種類のリボソームの調製および cis ジアミンジクロ口白金（II)の内包）

(1.改良型コール酸塩法（リボソーム 1) )

リボソーム Iは、実施例 1の改良型コール酸塩法と同様の方法を用いて調製した。 D PPC、コレステロール、ガンダリオシド、 DCP、 DPPEをモル比で 35 : 40 : 5 : 15 : 5の割合で合計脂質量 45. 6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添カロして、メタノール 'クロ口ホルム（1 : 1)溶液 3mLに溶解させた。 37°C、 1時間撹拌後、メタノールとクロ口ホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させ、真空乾燥後に塩化ナトリウム不含の TAPS (N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸 )緩衝液 (pH8. 4) 3mLに懸濁した。 37°Cで 1時間撹拌した後、超音波処理をして透明なミセル懸濁液を得た。

[0389] 次に、 cis ジアンミンジニトラト白金（II) (108. 2mg)を塩化ナトリウム不含 TAPS 緩衝液（pH8. 4) 7mlに完全に溶解させ、 1Mの水酸化ナトリウムで pH8. 4に調製し、ミセル懸濁液と混合した。 PMIO (AMICON)と塩化ナトリウム不含 TAPS緩衝液（ pH8. 4)を用いた限外濾過（分画分子量： 10, 000)によりリボソーム 10mLを調製した。リボソーム外液を PMlO (Amicon)を用いた限外濾過により 150mMの塩化ナトリウム含有 TAPS緩衝液（pH8. 4)に置換し、リボソームに内包された cis ジアンミンジニトラト白金 (Π)を cis ジアミンジクロロ白金 (II)に変換させた。

(2.凍結乾燥法（リボソーム II)

凍結乾燥空リボソームは、 COASTOME ELシリーズ（EL— 01— PA、日油）を使用した。この COASTOME EL— 01— PA (負電荷リボソーム）の組成は、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G：ジパルミトイルホスファチジルコリン：コレステロ一ノレ：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール =4. 2 : 11. 4 : 15. 2 : 11. 4 Mol/バイアル）である。 cis ジアンミンジニトラト白金（II) (40mg)を塩化ナトリウム不含の TAPS緩衝液（pH8. 4) 2mLに溶解させ、 1M水酸化ナトリウムで pH8. 4に調製して凍結乾燥リボソームのバイャル内に 2mL滴下した。バイャルを 5 回転倒混和し、 PMIO (AMICON)と塩化ナトリウム不含の TAPS緩衝液（ρΗ8· 4) を用いた限外濾過（分画分子量： 10, 000)によりリボソーム 2mLを調製した。塩化ナトリウムを 150mMとなるようにリボソーム溶液に添加し 4°C、 96時間撹拌して内包された cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)を cis—ジアミンジクロロ白金 (II)に変換した。

[0390] (比較例 2· cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)を用いることなぐ cis—ジアミンジクロ口白金 (II)を直接内包させたリボソーム）

比較例として、 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)をリボソームに内包させ cis—ジァミンジクロロ白金 (Π)に変換するのではなぐ cis—ジアミンジクロ口白金 (II)を直接内包させたリボソームを調製した。

[0391] (1.改良型コール酸塩法）

cis—ジアミンジクロ口白金（II)を直接内包させたリボソームを、 cis—ジアミンジクロ口白金（II) (SIGMA) 28mgを 150mM塩化ナトリウム含有 TAPS緩衝液（ρΗ8· 4) 7mlに完全に溶解させ、 1M水酸化ナトリウムで pH8. 4に調製し、ミセル懸濁液と混合して作製した。 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)のかわりに cis—ジアミンジクロロ白金 (II)を用いることおよび緩衝液に塩化ナトリウムが含まれること以外、本実施例の cis—ジアンミンジニトラト白金（II)の内包と同様の方法を用いた。

[0392] (2.凍結乾燥法）

凍結乾燥空リボソームは、 COASTOME £しシリーズしー01—？八、日本油脂 )を使用した。 cis—ジアミンジクロロ白金 (II)を直接内包させたリボソームを、以下のようにして作製した。 COASTOME EL-01 -PA を室温に戻した。シスプラチン 4mgを 150mM塩化ナトリウム含有 TAPS緩衝液（pH8. 4) 2mlに完全に溶解させ、 COASTOME EL— 01—PAに添加し、 3回転倒混和した。遊離のシスプラチンを除くために、分画分子量 10, 000の膜を用いて限外濾過を行った。

[0393] (3.糖鎖で修飾した cis—ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソーム Iの製造）

本実施例の改良コール酸法において調製した cis—ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソーム Iのうちの一部分を用いて、実施例 3と同様の方法により、糖鎖で修飾したリポソーム Iを作製した。

[0394] (リボソーム脂質膜面上の親水性化処理）

cis—ジアミンジニトラト白金（II)内包したリボソーム Iの溶液 10mlを XM300膜（Am icon Co. , USA)と炭酸緩衝液（ρΗ 8. 5)を用いた限外濾過（分画分子量： 300 , 000)にかけ溶液の pHを 8· 5にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート（BS³ ; Pierce Co. , USA) 10mgを加え、室温で 2時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリボソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミンと BS³との化学結合反応を完結した。そして、このリボソーム液を X M300膜と炭酸緩衝液 (pH 8. 5)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)にかけた。次に、炭酸緩衝液（pH 8. 5) lmlに溶力もたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 40 mgをリボソーム液 10mlに加えた。次いで、この溶液を、室温で 2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量 300, 000で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液を N トリス（ヒドロキシメチル） 3—アミノプ口パンスルホン酸緩衝液 (pH8. 4)に交換し、リボソーム膜上の脂質に結合した BS³ とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミン上にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。

[0395] (リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA)の結合）

本実施例で得られた 10mlのリボソーム Iの膜面上に存在するガンダリオシドを lml の N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH 8. 4)に溶力、したメタ過ヨウ素酸ナトリウム 43mgを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。 XM300膜と PBS緩衝液（pH 8. 0)で限外濾過（分画分子量： 300, 000) することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3 ーァミノプロパンスルホン酸緩衝液を PBS緩衝液（ρΗ8· 0)に交換して、酸化されたリボソーム 10mlを得た。このリボソーム液に、 20mgのヒト血清アルブミン（HSA) /P BS緩衝液（pH 8. 0)を加えて室温で 2時間反応させ、次に 2M NaBH CN/PB

3

S緩衝液（pH 8. 0) 100 1を加えて室温で 2時間、さらに冷蔵下でー晚攪拌してリポソーム上のガンダリオシドと HSAとのカップリング反応で HSAを結合した。次!/、で、限外濾過（分画分子量： 300, 000)し、遊離のシァノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液 (pH8. 5)に交換して、 H SA結合リボソーム液 10mlを得た。

[0396] (糖鎖の調製）糖鎖として、シァリルルイス Xを使用した。

[0397] 各糖鎖の質量を計測し、以下において使用するための前処理をした。

[0398] (リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA)上への糖鎖の結合）

糖鎖 2mgを精製水に溶解し、 0. 25gの NH HCOを溶かした 0. 5ml水溶液に加

4 3

え、 37°Cで 3日間攪拌した後、 0. 45 mのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルァミン化合物 4mg/ml (アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリボソーム Iの溶液の一部分（10ml)に架橋試薬 3 , 3，一ジチォビス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP ; Pierce Co. , USA) lOmgを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下でー晚攪拌し、 XM300膜と炭酸緩衝液（pH 8. 5)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)して、遊離の DTSSPを除去し、 DTSSPがリボソーム上の HSAに結合したリボソーム 10mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシノレアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液） 37. 5 1を加えて、室温で 2時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタン/炭酸緩衝液 (pH 8. 5 )を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DTSSPにグリコシル化ァミン化合物の結合を行った。 XM300膜と HEPES緩衝液（pH 7. 2)で限外濾過（分画分子量： 300, 000)して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリボソーム各 10mlが得られた。

[0399] (リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA)上の親水性化処理）

本実施例で調製された糖鎖が結合したリボソーム Iにつレ、て、リボソーム上の HSA タンパク質表面の親水性化処理を行った。このリボソーム 10mlに、トリス（ヒドロキシメチノレ）ァミノメタン 26. 4mgを加えて、室温で 2時間、その後冷蔵下でー晚攪拌した後、 XM300膜と HEPES緩衝液（pH 7. 2)で限外濾過（分画分子量： 300, 000) し、未反応物を除去した。 0. 45 mのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖が結合したリボソーム複合体各 10mlを得た。

[0400] (粒子径およびゼータ電位の測定）

本実施例および比較例にぉレ、て調製した各リボソーム溶液 (糖鎖なし)を純水で 50 倍に希釈して、動的散乱法により、ゼータサイザ一ナノ Nan— ZS (Malvern)を用いて測定した。

[0401] cis—ジアンミンジニトラト白金（II)を内包させた後、 cis—ジアミンジクロ口白金（II) に変換した cis—ジアミンジクロ口白金（II)内包リボソーム Iの粒子径分布は、均一な粒度分布を示し、平均粒子径は 159nmであった（表 4)。 cis—ジアンミンジニトラト白金（Π)を内包させた後、 cis—ジアミンジクロロ白金（II)に変換した cis—ジアミンジクロロ白金 (II)内包リボソーム IIの粒子径分布は、均一な粒度分布を示し、平均粒子径は 147nmであった（表 4)。

[0402] [表 4]

(表 4 cis—ジァミンジクロロ白金（II)内包リボソームの物性）

リボソーム Iおよび IIの粒子径ゃ形状の確認を行った結果、表 4に示すように、 cis— ジアミンジクロロ白金（II)内包リボソームの粒子径は、レ、ずれのリボソームにお!/、ても約 150nmであった。腫瘍組織や炎症組織にリボソームを集積させるためには、リポソームの粒子径を調節することが重要となる。がん部位の新生血管や炎症部位の血管には、 100〜200nmの間隙が存在することが明らかにされていることから、リボソーム Iおよびリボソーム IIの粒子の大きさは、血管内から組織へ移行して集積することができる程度であると考えられる（A. A. Gabizon, Cancer Res. , 52, 891— 896 (19 92)； S. K. Huang, F. J. Martin, G. Jay et al, Am. J. Pathol. , 143, 10— 14 (1993) ; S. K. Huang, E. Mayhew, S . Gilani et al, Cancer Res. , 52, 6774 - 6781 (1992)；ぉよび N. Z. Wu, D. Da, T. L. RudoU et al, Cancer Res. , 53, 3765— 3770 (1993) )。 [0403] (電子顕微鏡による観察）

本実施例において調製した、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)を内包したリボソーム 1 ( 糖鎖なし）を 1 % 酢酸ウランによりネガティブ染色した (J. D. Almeida, C. M. Bra nd, D. C. Edwards and T. D. Heath, Lancet 2 (7941) . , 899— 901 (197

5)。具体的には、銅メッシュにリボソーム溶液を 1滴滴下し、 PBS緩衝液でよく洗浄し、 1 %酢酸ウランに数秒間浸した。余分な水分を吸い取り乾燥させた。その後、透過型電子顕微鏡 H— 71 OOS (HITACHI)により、粒子の形状と大きさを 80000倍で観察した。

[0404] その結果、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包したリボソーム Iは、均一な球状のリポソームであることがわかった（図 7)。また、電子顕微鏡で観察されたリボソーム Iの粒子径は、動的散乱法による平均粒子径と一致する結果を得た。

[0405] (脂質量の定量）

実施例 2と同様の方法を用いた。 0· 5%TitonX—100存在下でデタミナ一 TC55 5キット（KYOWA)を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した

その結果、リボソーム量の目安となる脂質量は、リボソーム Iで 3. 5mg/mL、リポソーム IIで 7· 6mg/mLであった（表 4)。

[0406] (cis—ジアンミンジニトラト白金（II)の定量）

リボソームに内包された cis—ジアンミンジニトラト白金（II)は、フレームレス原子吸光光度法 (FAA≥ ίこより AA—り 00 Atomic absorption flame emission s pectrophotometer (SHIMAZU) )を用いて定量した。波長 265. 9nm、スリット幅 0. 5、ランプ電流 14mAの条件下、 120。Cで 30秒間、 250。Cで 10秒間、 700。Cで 2 0秒間、 700°Cで 5秒間、 2600°Cで 3秒間、順次処理を行った。 lmg/mL白金標準液（NAKARAI)を精製水で希釈して 12· 5ng/ml、 25ng/ml、 50ng/ml、 10 0ng/ml、 200ng/mlの溶液を調製し、検量線を作成した。リボソーム溶液は精製水で 10, 000倍希釈して被検試料とした。

[0407] フレームレス原子吸光光度法（FAAS)で白金量を測定することによって、リポソ一ムに内包された cis—ジアミンジクロ口白金（II)の量を算出した結果、改良コ一ル酸塩法では、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を内包させ cis ジアミンジクロ口白金（II) に変換したリボソーム I溶液中の cis ジアミンジクロ口白金（II)濃度は、 91. 08 μ gZ 脂質 mg (323. S g/mUであった（表 4左欄）。一方、 cis ジアミンジクロ口白金（I I)をリボソームに直接内包した場合、 0· 306 _§/脂質11¾ ( 1. C^ g/mUであつた (表 4左欄)。

[0408] 凍結乾燥法においては、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を内包させ cis ジアミンジクロ口白金（Π)に変換したリボソーム II溶液中の cis ジアミンジクロ口白金（II)濃度は、 1 17· 5

でぁった（表4右欄）。一方、 cis ジァミンジクロロ白金（Π)をリボソームに直接内包した場合、 17. 7 _§/脂質11¾ ( 134. 6 μ g/mL)であった（表 4右欄）。

[0409] cis ジアンミンジニトラト白金（II)を内包させた後 cis ジアミンジクロロ白金（II)に変換したときの脂質 lmgあたりの内包量は、リボソーム Iでは、 cis ジアミンジクロ口白金（II)をリボソームに直接内包させたときの約 300倍量であり、リボソーム IIでは、 6 . 6倍量であった。この結果、特に、リボソーム形成と同時に物質を内包させる改良コ一ル酸塩法により作製したリボソーム Iの場合、より内包量の差が大きいことが確認され。

[0410] cis ジアンミンジニトラト白金（II)は、 cis ジアミンジクロ口白金（II)よりも水溶性が約 10倍高い。したがって、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)をリボソームに内包させた後 cis ジアミンジクロ口白金（II)に変換する方法により、脂質 lmgあたり約 300倍量の cis ジアミンジクロ口白金（II)がリボソームに内包されたことは、予測よりもはるかに高濃度で cis ジアミンジクロ口白金（II)が内包されたといえる。また、リボソーム I Iにおいては、その差が約 6〜7倍の内包量の差であったことから、この内包技術は、特に、改良コール酸塩法で作製したリボソーム Iでより効果的であるといえる。

[0411] —般的に、リボソーム形成と同時に物質を内包させる改良コール酸塩法を用いて作製したリボソーム Iの場合、 cis ジアミンジクロロ白金 (II)のような無電荷の低分子化合物の内包量は非常に低い。このため、 cis ジアミンジクロ口白金（II)をリボソームに直接内包させる方法では、リボソーム Iは 0. 306 g/脂質 mgの cis ジアミンジクロロ白金 (II)しか内包することができな力た。しかし、本発明の内包技術を用いた場合には、 91. 1 g/脂質 mgの cis—ジアミンジクロ口白金（II)を内包させることができた。改良コール酸塩法により作製したリボソーム Iのほうが、凍結乾燥空リボソーム法を用いて作製したリボソーム IIよりも cis—ジアミンジクロロ白金（II)内包量の差が大きく現れたことの原因は、改良コール酸塩法では無電荷の低分子化合物を内包させることがほとんどできないことにあると考えられる。

[0412] また、本実施例のリボソーム Iおよびリボソーム IIは、血中タンパク質との結合を防ぐために、リボソーム表面の電荷は負となるように負電荷を帯びた脂質成分により構成されているが正電荷のものでも適用可能であり、当業者は適宜設計変更することができる。 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)は、水溶液中でプラスの電荷を有することから、負電荷を有する脂質成分を用いたリボソームへの内包にとって有利な分子形態である可能性がある。 EPR効果（Υ· Matsumura and H. Maeda, Cancer Res . , 46, 6387— 6392 (1986) )により炎症や力ん咅 M立をターゲテイングするリポソ一ムのほとんどが、血中滞留性を向上させるために表面電荷が負となるように設計されているので、汎用されている多くのリボソームにおいても同じように、本発明の内包技術を用いることにより難水溶性の薬物のリボソームへの内包量を増加させることができると考えられる。

[0413] (cis—ジアンミンジニトラト白金（II)から cis—ジアミンジクロ口白金（II)への変換の確認）

cis—ジアンミンジニトラト白金（II)の硝酸イオン力 150mM塩化ナトリウムの塩化物イオンによって置換することを、吸収スペクトル法を用いて確認した（比較例 1および図 4Aおよび図 4B)。

[0414] 図 4Aおよび図 4Bに示す通り、 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)の吸収スペクトル（図 4A)は、塩化物イオンを添加した直後から経時的に変化し、図 4Bに示す cis—ジアミンジクロ口白金（II)の吸収スペクトルと一致した。このこと力、ら、 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)は、 150mM 塩化ナトリウム存在下で 99%以上力 Scis—ジアミンジクロロ白金 (II)に変換したことが確認できた。

[0415] 次に、リボソーム Iおよびリボソーム IIに内包された cis—ジアンミンジニトラト白金（II) 力 Sl 50mM塩化ナトリウム溶液中で cis—ジアミンジクロロ白金（II)に変換することを、 ^19bPt— NMR法により確認した。

[0416] (¹⁹⁵Pt— NMR法）

実施例 3と同様の方法を使用した。 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を内包させたリボソームとして、本実施例において調製したリボソーム IIを用いた。これらのリポソ一ムに内包させた cis ジアンミンジニトラト白金（II)力、ら cis ジアミンジクロロ白金（II) への変換を、 25°Cで直径 5mmの測定管にサンプルに入れ INOVA—600 (Varian 社)を用いた¹⁹⁵ Pt— NMR法により解析した。

[0417] (サンプル調製）

Sodium hexachloroplatinate (IV)を重水に 50mMとなるように溶解して外部標準液とした。 cis ジアミンジクロロ白金 (11)、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)をそれぞれ重水に終濃度 6. 6mM、 13. 7mMとなるように溶解させてサンプルとした。リポソーム IIに内包した cis ジアンミンジニトラト白金（II)を cis ジアミンジクロロ白金（II )に変換した場合および変換しな力た場合のリボソームサンプルを凍結乾燥し、次いで重水に懸濁させて、いずれも白金濃度が 4. 75mMとなるように調製した。

[0418] 図 8aおよび bに示すように、 cis ジアミンジクロ口白金（II)を重水に溶解させた時のケミカルシフ H直は、 2160ppmであり、また、 cis ジアンミンジニトラト白金（II) を重水に溶解させたときのケミカルシフト値は、 1620ppmであった。このケミカルシフト値は文献値と一致していた（Β· Rosenberg, Biochimie. , 60 859 (1978) )。図 8cに示すように、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を内包させたリボソーム IIの外液を 150mM塩化ナトリウム含有 TAPS (pH8. 4)緩衝液とし、 25°Cで 96時間放置後のケミカルシフト値は 2160ppmであり、図 8aに示される cis ジアミンジクロロ白金（II)のケミカルシフト値と一致した。このこと力、ら、リボソーム IIに内包された cis ジアンミンジニトラト白金（II)が cis ジアミンジクロロ白金（II)に変換して!/、ること力 S確認された。また、 cis ジアンミンジニトラト白金 (II)を cis ジアミンジクロ口白金 (II)に変化させなレ、場合は、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)のケミカルシフト値である 16 20ppmのピークも、 cis -ジアミンジクロロ白金（II)のケミカルシフ H直である 2160 ppmも認められなかった（図 8d)。

[0419] リボソーム Iについても、図 5a〜dおよび実施例 3に示す通り、同様の結果が得られ、リボソームに内包された cis ジアンミンジニトラト白金（II)が cis ジアミンジクロロ白金 (II)に変換していることが確認された。

[0420] リボソーム 1 (改良コール酸塩法）においてもリボソーム II (凍結乾燥法）においても、 ¹

9⁵Pt - NMR法による解析では、 cis -ジアンミンジニトラト白金（II)の一 1620ppmのケミカルシフトは認められず、 cis ジアミンジクロ口白金（II)のケミカルシフト位置である 2160ppmに確認、された（図 5cおよび図 8c)。このこと力、ら、いずれのリポソ一ムでも、リボソーム内の cis ジアンミンジニトラト白金（II)は、 cis ジアミンジクロ口白金 (Π)に構造が変化して!/、ることが確認された。

[0421] また、リボソームに内包させた cis ジアンミンジニトラト白金（II)を cis ジアミンジクロロ白金（II)に変換させな力、つた場合、図 5dおよび図 8dに示すように、 cis ジアンミンジニトラト白金（Π)の 1620ppmのケミカルシフトも cis ジアミンジクロロ白金（II) のケミカルシフトも認められなかった。これは、内包された cis ジアンミンジニトラト白金 (II)が、図 3に示すように水分子の配位により、リボソームの膜成分と緩やかな相互作用をすることによって非常に多数の分子種となったために、ケミカルシフトとしては検出されな力、つたものと考えられる。

[0422] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

産業上の利用可能性

[0423] 本発明は、リボソームに内包できないか、内包効率の低かった難水溶性アンミン白金錯体をリボソームに効率よく内包できるという有用性を有する。従って、経口投与できな力、つた難水溶性アンミン白金錯体をリボソーム製剤として利用するという有用性を提供する。

図面の簡単な説明

[0424] [図 1A]図 1Aは、シスプラチンの細胞内での挙動を示す模式図である。シスプラチンは血漿中では、 C厂イオン濃度が 103mmoleであるため、シスプラチンの状態で存在するが、細胞内においては、 C厂イオン濃度は、 4mmoleとなるため、シスプラチンの C厂イオンは解離して、水分子が配位した構造との平衡状態をとる。

[図 1B]図 1Bは、シスプラチンが DNAと結合する様式を示す模式図である。左上は、グァニン塩基と単結合した状態である。右上は、シスブラチンが DNAの二本鎖間で結合した状態である。左下は、シスブラチンが DNAと単結合し、タンパク質とも単結合した状態である。右下は、グァニン塩基と単結合し、一方でタンパク質と結合した状態である。

[図 1C]図 1Cは、 cis ジアミンジニトラト白金（II) (CDDP— 3)および cis ジアミンジクロ口白金（Π) (CDDP)の構造を示す図である。

[図 1D]図 1Dは、ガンダリオ系ガンダリオシドの生合成経路を示す図である。

園 2A]図 2Aは、実施例 1において調製された cis ジアミンジクロロ白金 (II)内包リポソームの粒子径の測定結果の図である。

園 2B]図 2Bは、実施例 3において調製された、糖鎖を結合させた cis ジアミンジクロロ白金（II)内包リボソームの粒子径の測定結果の図である。

園 3]図 3は、シスブラチン内包リボソームの作製を模式化した図である。

[図 4A]図 4Aは、シスジァミンジニトラト白金（II) 5mg/mlを 150mM 塩化ナトリウムを含む TAPS緩衝液 (pH8. 4)に溶解し、 25°Cで静置（0時間、 5分後、 10分後、 15 分後、 30分後および 45分後）したときの UVスペクトルを示す。 1 : 0時間、 2 : 5分後、

3 : 10分後、 4 : 15分後、 5 : 30分後、 6 : 45分後。

[図 4B]図 4Bは、コントロールとして、 cis ジアミンジクロロ白金（II) lmgを TAPS緩衝液 lmlに溶解したときの UVスペクトルを示す。

[図 5]図 5は、シスプラチンの¹⁹⁵ PtNMRスペクトルを示す。シスプラチンは、 2160 ppm、にケミカルシフトが観測された。図 5bは、硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（II) )の¹⁹⁵ PtNMRスペクトルを示す。この硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（I 1) )は、 1620ppmにケミカルシフトが観測された。図 5cは、硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（Π) )内包リボソーム（NaCl⁺)の¹⁹⁵ PtNMRスペクトルを示す。このリポソームに内包された硝酸体（cis ジアンミンジニトラト白金（II) )のケミカルシフトは、外液中に NaClが含まれる場合、シスプラチンと同じ一 2160ppmに観測された。図 5dは、リボソームに内包させた cis—ジアンミンジニトラト白金（II)を cis—ジアミンジクロロ白金（II)に変化させないかった場合（4· 75mM,重水）の¹⁹⁵ Pt— NMRスぺタトノレを示す。

[図 6]図 6は、実施例 5において調製された抗体を結合させた cis—ジアミンジクロ口白金（Π)内包リボソームの粒子径の測定結果の図である。

園 7]図 7は、 cis—ジアミンジクロロ白金 (II)内包リボソーム Iを透過型電子顕微鏡により観察した写真である。 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)をリボソーム Iに内包後、 1 50mM塩化ナトリウムを含有する TAPS緩衝液に交換した後のリボソーム Iを、 H— 7 100S (HITACHI)により観察した。バーは lOOnmを示す。

[図 8]図 8は、シスプラチンの¹⁹⁵ PtNMRスペクトルを示す。測定には INOVA— 600 ( Varian社）を使用した。図 8aは、 cis—ジアミンジクロ口白金（II) (6. 6mM,重水）の¹ ⁹⁵PtNMRスペクトルを示す。図 8bは、 cis—ジアンミンジニトラト白金（II) (13· 7mM ,重水）¹⁹⁵ PtNMRスペクトルを示す。図 8cは、 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)をリポソームに内包後、外液を 150mM塩化ナトリウムを含有する緩衝液に交換し、 cis— ジアンミンジニトラト白金 (II)を cis—ジアミンジクロロ白金 (II)に変換させた場合 (4. 7 5mM,重水）の¹⁹⁵ PtNMRスペクトルを示す。図 8dは、リボソームに内包させた cis— ジアンミンジニトラト白金 (II)を cis—ジアミンジクロロ白金 (II)に変化させな!/、かった場合（4· 75mM,重水）の¹⁹⁵ Pt— NMRスペクトルを示す。

Claims

請求の範囲

[1] アンミン白金錯体を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：

を包含する、方法。

[2] さらに、 D)前記 C)工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程を包含する、請求項 1に記載の方法。

[3] 前記水溶性アンミン白金錯体が、 2つのアンミン基を有する、請求項 1に記載の方法

[4] 前記水溶性アンミン白金錯体力 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)である、請求項 3 に記載の方法。

[5] A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；

B)前記リボソーム原料を提供する工程であって、

を包含し、ここで、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、請求項 1に記載の方法。

[6] 前 B— ii)工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理することを含む、請求項 5 に記載の方法。

[7] 前記 C)工程にお!/、て、前記リボソーム形成維持条件が、前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供することおよび該混合物をー晚静置することからなる群より選択されることを含む、請求項 1に記載の方法。

[8] A)前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；

B)前記リボソームを提供する工程；および

を包含し、ここで、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるィオンを含まない、請求項 1に記載の方法。

[9] 前記工程において、前記リボソームは、前記水溶性アンミン白金錯体力リポソ一ム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有する、請求項 1に記載の方法。

[10] 前記リボソーム形成維持条件が、前記リボソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体力 Sリボソーム膜を通過して該リボソーム内に移行し、留まるために充分な条件である、請求項 1に記載の方法。

[11] 前記リボソームを構成する脂質または前記リボソーム原料が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルェタノールァミンポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項 1 に記載の方法。

[12] 前記 C)工程において、前記混合物が、 pH6〜； 10の範囲内に調節される、請求項 1 に記載の方法。

[13] 前記白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件が、塩化物イオン (CD、臭化物イオン（Br— )、ヨウ化物イオン（I— )、チォシアン酸イオン（SCN—)およびシアン化物イオン (CN—)からなる群より選択される該白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない溶液の存在下におくことである、請求項 1に記載の方法。

[14] 前記塩化物イオン（C厂）が、 0〜4mMの範囲で含まれる、請求項 13に記載の方法。

[15] 前記工程 C)において、前記混合物が、 N トリス（ヒドロキシメチル）—3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル ) - 1—ピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝剤、 3- (N モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、 N トリス（ヒドロキシメチル） 1—2 —アミノエタンスルホン酸緩衝剤、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，一2エタンスルホン酸緩衝剤、 N トリス（ヒドロキシメチル）メチル 2 ヒドロキシ一 3 -ァミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピぺラジン N, N，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N， 2—ヒドロキシプロパン —3—プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルダリシン)緩衝剤、 N , N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝剤、 2—(シクロへキシルァミノ）ェタンスルホン酸緩衝剤、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、 3—シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝剤およびそれらの組合せからなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項 1に記載の方法。

[16] 前記 C)工程において、前記水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、前記リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとカ、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合される、請求項 1に記載の方法。

[17] 前記 D)工程にお!/、て、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン力塩化物イオン（C1—)、臭化物イオン（Br— )、ヨウ化物イオン（Γ)、チォシアン酸イオン（S CN_)およびシアン化物イオン（CN_)力、らなる群より選択される、請求項 2に記載の方法。

[18] 前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン力塩化物イオン (CDである

、請求項 17に記載の方法。

[19] 前記塩化物イオン（C厂）が、 NaCl、 HCほたは CaClより提供される、請求項 18に

2

記載の方法。

[20] 前記 D)工程にお!/、て、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン力 N —トリス（ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、 2— [4一（2—ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシ）ァミノメタン緩衝液、 3— (N モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒドロキシメチル） 1—2—アミノエタンスルホン酸緩衝液、 N— 2— ヒドロキシェチルピペラジン一 N，一 2エタンスルホン酸緩衝液、 N トリス（ヒドロキシメチル)メチル—2 ヒドロキシ— 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピぺラジン— N , N，一ビス（2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N， 2 ヒドロキシプロパンー3 プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒド口キシメチルメチルダリシン）緩衝液、 N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン緩衝液、 2 （シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸緩衝液、 3— N シクロへキシルアミノー 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液および 3 シクロへキシルァミノプロパンスルホン酸緩衝液からなる群より選択される緩衝液により提供される、請求項 2に記載の方法。

[21] 前記塩化物イオン（C厂）が、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3 ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4)、炭酸緩衝液（ρΗ8· 5)、リン酸緩衝液（ρΗ8· 0)および 2— [ 4一（2 ヒドロキシェチル）ー1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸緩衝液（ρΗ7· 2) からなる群より選択される緩衝液により提供される、請求項 18に記載の方法。

[22] 前記 D)工程が、

i)形成されたリボソームを親水性化処理する工程；

ii)該リボソームへ標的指向性物質を結合させる工程；

を包含する、請求項 2に記載の方法。

[23] 前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、請求項 22に記載の方法。

[24] 前記アンミン白金錯体が、難水溶性である、請求項 1に記載の方法。

[25] cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：

(B3)該脂質膜を、 N トリス (ヒドロキシメチル）—3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (pH6〜10)に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該 N トリス（ヒド口キシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（CDを含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4mMの範囲で含む、工程；

を包含する、請求項 1に記載の方法。

[26] cis ジアミンジクロ口白金（II)を内包するリボソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：

(Al) cis ジアンミンジニトラト白金（II)を、 N トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、 cis ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液を調製する工程であって、該 N トリス（ヒドロキシメチル）ー3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（CDを含まないか、または塩化物イオン（C1—)を 0〜4 mMの範囲で含む、工程；

(A2)該 cis—ジアンミンジニトラト白金（II)を含む溶液の pHを pH8 · 4に調節する工程；

(B1)リボソームを提供する工程；および

(Cl) pHが調節された該 cis—ジアンミンジニトラト白金 (II)溶液と、該リボソームとを、 1 : 9〜9 : 1の範囲内の比で混合して、分画分子量 500〜300, 000で限外濾過に供する工程

を包含する、請求項 1に記載の方法。

[27] 水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ること力 Sできる、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソーム。

[28] 前記水溶性アンミン白金錯体と、前記リボソームとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、請求項 27に記載のリボソーム。

[29] 前記水溶性アンミン白金錯体と、前記リボソーム原料とを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、請求項 27に記載のリボソーム。

[30] アンモニアを有するアンミン白金錯体が、 lmg脂質あたり 0. 3〃 g以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

[31] 前記アンモニアを有するアンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 9 g以上で含まれる、請求項 30に記載のリボソーム。

[32] 前記アンモニアを有するアンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 17 g以上で含まれる

、請求項 30に記載のリボソーム。

[33] アンモニアを有するアンミン白金錯体が、 lmgリン脂質あたり 100 g以上で含まれる

、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

[34] アンモニアを有するアンミン白金錯体が、リボソーム lmlあたり 39〃 g/ml以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

[35] アンモニアを有するアンミン白金錯体が、リボソーム 1個あたり 3 X 10_¹⁽ g以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリボソーム。

[36] 前記アンミン白金錯体が、 2つのアンモニアを有する、請求項 31に記載のリボソーム

[37] 前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態である、請求項 31に記載のリボソーム。

[38] 前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロロ白金（II)である、請求項 31に記載のリボソーム。

[39] 前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される脂質を含む、請求項 31 に記載のリボソーム。

[40] 前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、請求項 31に記載のリボソーム。

[41] 前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、請求項 40に記載のリボソーム。

[42] がんまたは腫瘍を処置するための組成物であって、該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを含み、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる

、組成物

[43] がんまたは腫瘍を処置するための組成物であって、該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを含み、該リボソームは、該アンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 0. 3 ;^以上で含まれる、組成物。

[44] 前記アンミン白金錯体が、 2つのアンモニアを有する、請求項 43に記載の組成物。

[45] 前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金 (II)の水溶性形態である、請求項 44に記載の組成物。

[46] 前記アンミン白金錯体が、 cis—ジアミンジクロ口白金（II)である、請求項 44に記載の組成物。

[47] 前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミンーポリグリセリン 8G、パルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される脂質を含む、請求項 43に記載の組成物。

[48] 前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、請求項 43に記載の組成物。

[49] 前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、ァプタマ一および抗原からなる群より選択される、請求項 48に記載の組成物。

[50] がんまたは腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモユアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを投与する工程を包含し、ここで、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リポソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ること力 Sできる、方法。

[51] がんまたは腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモユアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームを投与する工程を包含し、ここで、該リボソームは、該アンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 0. 3 _§以上で含まれる、方法。

[52] 前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームが、静脈内投与、皮下投与、経口投与，局所投与、または腹腔内投与により投与される、請求項 51に記載の方法。

[53] 前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリボソームが、白金錯体 1. 5 μ g/g体重の用量で投与される、請求項 51に記載の方法。

[54] 前記がんまたは腫瘍が、睾丸腫瘍、膀胱癌、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、食道癌、子宮癌、神経芽細胞種および胃癌からなる群より選択される、請求項 51に記載の方法。

[55] 前記アンミン白金錯体を内包するリボソームが、標的指向性物質をさらに含む、請求項 51に記載の方法。

[56] 前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アブタマ一および抗原からなる群より選択される、請求項 55に記載の方法。

[57] 医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソ一ムであって、該リボソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リボソーム、リボソーム原料またはその組合せとを混合して、リボソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、リボソーム。

[58] 医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソ一ムであって、該アンミン白金錯体力 lmg脂質あたり 0. 3 ;^以上で含まれる、リポソーム