WO2008055969A1 - Nouveaux derives de la triphenylamine utiles comme fluorophores en biologie, notamment pour la microscopie biphotonique - Google Patents

Nouveaux derives de la triphenylamine utiles comme fluorophores en biologie, notamment pour la microscopie biphotonique Download PDF

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WO2008055969A1
WO2008055969A1 PCT/EP2007/062106 EP2007062106W WO2008055969A1 WO 2008055969 A1 WO2008055969 A1 WO 2008055969A1 EP 2007062106 W EP2007062106 W EP 2007062106W WO 2008055969 A1 WO2008055969 A1 WO 2008055969A1
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WO
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group
formula
compound
iii
vinyl
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/062106
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English (en)
Inventor
Clémence ALLAIN
Fabrice Charra
Céline FIORINI-DEBUISSCHERT
Rémy LARTIA
Marie-Paule Teulade-Fichou
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
    • C07D213/38—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having only hydrogen or hydrocarbon radicals attached to the substituent nitrogen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes

Definitions

  • the present invention relates to novel triphenylamine derivatives useful as fluorophores in biology, especially for biphotonic microscopy.
  • compositions comprising these derivatives, to the use of these compositions as well as derivatives themselves for the labeling of biological molecules (or "biomolecules") of the nucleic acid, oligonucleotide, protein, polypeptide type, plasmids, etc., for their observation in particular by two-photon microscopy, and to biomolecules labeled with said derivatives.
  • biological molecules or "biomolecules”
  • biomolecules of the nucleic acid, oligonucleotide, protein, polypeptide type, plasmids, etc.
  • Fluorescence microscopy is a tool commonly used by biologists because of its ability to detect, quantify and provide images of both the natural components of biological systems and of elements unrelated to these systems.
  • fluorophores have the particularity to bind specifically to biomolecules: for example, 4, 6-diaminido-2-phenylindole (or DAPI), which fluoresces in blue when excited by a violet light, is fixed specifically on DNA.
  • Other fluorophores do not have this ability and need to be grafted on a molecule specific to that which one seeks to detect. This is the case, for example, with rhodamine and fluorescein that can be used either to detect an antigen, in which case they are grafted on an antibody specific for this antigen, or as tracers of cell lineage, in which case they are transplanted onto a molecule with good stability in biological media such as dextran.
  • fluorescence microscopy has grown considerably thanks to the arrival of new optical technologies including confocal laser scanning microscopy and, more recently, two-photon excitation fluorescence microscopy, also called biphotonic microscopy.
  • biphotonic microscopy is, of all fluorescence microscopy techniques, the one that develops most in the field of biology. Its principle is to simultaneously bring two photons of energy identical to a compound to produce an excitation equivalent to that which would have driven a single photon of high energy. For the process to be effective, it is necessary for the photons to reach the compound in a very short time interval, of about 10-15 seconds, which has been made possible by the use of laser light sources producing pulses. ultra-brief and very intense.
  • Two-photon microscopy has many advantages. Indeed, the processes of photobleaching and phototoxicity, often limiting in single-photon microscopy, are here limited to the maximum. In addition, excitation photons, which are typically located in the near infrared
  • excitation radiation is less destructive for biological samples and penetrates deeper into tissue up to about 0.5 mm.
  • two-photon microscopy has a spatial resolution as good as that of confocal laser scanning microscopy, that is to say of the order of a micrometer.
  • fluorophores used in two-photon microscopy are the same as those used in single-photon microscopy.
  • these fluorophores have poor two-photon fluorescence properties, especially in terms of absorption cross-section, which limits the scope of applications of bi-photon microscopy in biology.
  • the inventors have therefore set themselves the goal of developing fluorophores that are perfectly adapted to the use of two-photon fluorescence in the field of biology.
  • R 4 represents a hydrogen atom or a linker linker group, in which case:
  • R 4 represents a hydrogen atom
  • R 1 represents a linking group or a group of formula (II) below: in which: * Qi represents:
  • R 5 represents a hydrocarbon group
  • any one of R 6 to Rio represents a covalent bond connecting said heterocyclic group to B, while the others of R 6 to Rio represent, independently of one another, a hydrogen atom or a hydrocarbon group; or a heterocyclic group of formula (ii) or (iii) below:
  • R 5 represents a hydrocarbon group
  • any one of Rn to Ri 7 represents a covalent bond connecting said heterocyclic group to B, while the others of Rn to Ri 7 represent, independently of one another, a hydrogen atom or a hydrocarbon group
  • R12, R14 and R16 can also form, respectively with Rn and / or Ri 3 , R13 and / or Ri 5 , and with Ri 5 and / or Ri 7 , a
  • R 5 represents a hydrocarbon group
  • W represents an oxygen or sulfur atom or a group -N (R 3 i) - where R 31 is a hydrogen atom or a hydrocarbon group, or a group -C (R 3i) (R 32) - where R 31 and R 32 are, independently of one another, a hydrogen atom or a hydrocarbon group
  • R30 represents a covalent bond connecting said heterocyclic group to B, while
  • R 26 to R 29 represent, independently of each other, a hydrogen atom or a hydrocarbon group, R 27 may also form with R 2 6 and / or R 2 8 a bridging group, R 28 which can itself form with R 2 9 a bridging group;
  • R33 to R36 represent, independently of one another, a hydrogen atom or a hydrocarbon group
  • R33 and R36 can also form each with R34 and / or
  • R35 a bridging group; when R 1 represents a group of formula (II) above, then R 2 also represents a group of formula (II) above while, when R 1 represents a linker group, then R 2 represents a group of formula (III) above. after: in which: * Q2 represents:
  • R 6 at Rio have the same meaning as in formula (i) above; or a heterocyclic group of formula (vii) or (viii) below:
  • Rn to Ri 7 have the same meaning as in formulas (ii) and (iii) above; or a heterocyclic group of formula (ix) below:
  • R 3 represents a group of formula (III) above while, when R 1 represents a group of formula (II) above, then R 3 represents a hydrogen or halogen atom; a hydrocarbon group or a group of formula (II) above; 2) if R 4 represents a linking group, then R 1 and R 2 represent a group of formula (III) above while R 3 represents a hydrogen or halogen atom, a hydrocarbon group or a group of formula (III) above; wherein the linker group is a functional group capable of allowing the grafting by chemical reaction of the compound on a biomolecule, or a hydrocarbon group comprising such a functional group, and wherein each of the hydrocarbon groups mentioned above can be substituted with one or more substituents, identical or different, and include one or more heteroatoms.
  • the subject of the invention is also the isomers of these compounds as well as the addition salts of these compounds and their isomers.
  • any one of R 1 to R 10 represents a covalent link connecting said heterocyclic group to B" used herein means that the heterocyclic group in question is directly attached to B by a covalent bond involving any carbon atoms of the cycle that constitutes it.
  • any one of R 11 to R 17 represents a covalent bond connecting said heterocyclic group to B
  • the hydrocarbon groups which can be used for R 5 to R 36 in the groups of formulas (II) and (III) above as well as for R 3 can be saturated, mono- or polyunsaturated groups, aliphatic (that is, linear or branched), mono- or polycyclic.
  • these groups may, on the one hand, be substituted with one or more substituents, identical to each other or different from each other, and, on the other hand, include one or more heteroatoms, in which case this or these heteroatoms may as well bridge in said hydrocarbon groups as be carried by them in the form of substituents.
  • heteroatom any atom other than carbon or hydrogen such as, for example, an oxygen atom, nitrogen, sulfur, halogen, phosphorus, boron or silicon, the oxygen, nitrogen, sulfur and halogen atoms (fluorine, iodine, chlorine, bromine) being preferred.
  • hydrocarbon groups that may be used for R 5 to R 36 and for R 3 can in particular be:
  • Alkyl groups linear or branched, such as, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl or hexyl;
  • Linear or branched alkenyl or alkynyl groups such as, for example, ethenyl or ethynyl, propenyl or propynyl, isopropenyl or isopropynyl, butenyl or butynyl, isobutenyl or isobutynyl, sec-butenyl or sec-butynyl, tert-butenyl or tert-butynyl, pentenyl or pentynyl, isopentenyl or isopentynyl;
  • Cycloalkyl groups such as, for example, cyclopentyl or cyclohexyl groups
  • Cycloalkenyl or cycloalkynyl groups such as, for example, cyclopentenyl groups or cyclopentynyl, cyclohexenyl or cyclohexynyl;
  • fused ring aromatic groups such as, for example, cyclopentadienyl, phenyl, naphthyl, pyrenyl or anthracenyl groups;
  • fused ring heteroaromatic groups such as, for example, furanyl, pyrrolyl, thiophenyl, oxazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, imidazolyl, triazolyl, pyridinyl, pyranyl, quinolinyl, isoquinolinyl, pyrazinyl or pyrimidinyl groups; or
  • the hydrocarbon groups which can be used for R 5 to R 3 6 contain not more than 10 carbon atoms.
  • substituted (s) inclusive) are, if possible, C 1 to C 6 groups and, more preferably, C 1 to C 4 groups , in the case of aliphatic groups, or single cycle groups with 5 or 6 members in the case of cyclic groups.
  • the hydrocarbon groups which may be used for R 5 to R 36 are C 1 -C 4 alkyl groups, in particular methyl or ethyl.
  • the bridging groups that can be formed by:
  • Ri 9 , R 2 i, R 23 and R 25 can also form, respectively with Ris and / or R 20, R 20 and / or R 22, R 22 and / or R 24, and with R 24 and / or Ris, in the groups of formula ( iv);
  • R 33 and R 36 with R 34 and / or R 35 in groups A and B; are divalent groups formed by the sequence of n atoms chosen from carbon, nitrogen, oxygen and / or sulfur atoms and in which n is advantageously chosen so that the formation of these bridging groups results in the formation of 5- or 6-membered rings or heterocycles.
  • the bridging groups capable of being formed by R 1 with R 1 4 in the groups of formulas (ii) and (vii), by R 12 with R 1 and by R 6 with R 7 in the groups of formulas (iii) and (viii) by R 8 with R 2 and R 2 with R 22 in the group of formula (iv), by R 33 and R 36 with R 34 and / or R 35 in groups A and B are preferably groups formed by the sequence of 2 or 3 atoms; while
  • all other bridging groups which may be formed in the groups of formulas (ii) to (ix), are preferably groups formed by the chain of 3 or 4 atoms.
  • these bridging groups are preferably unsaturated groups, the unsaturations of which typically correspond to double bonds.
  • these double bonds form, between themselves and / or with the other double bonds present in the compounds, a system of conjugated double bonds.
  • the bridging groups may be substituted with one or more substituents, which may be identical or different, provided that the chain of atoms which forms them comprises one or more carbon and / or nitrogen atoms. This or these substituents correspond, preferably, to halogen atoms, to aliphatic groups comprising at least one heteroatom such as, for example, -COOR ", -CHO, -OR", -SR ", -SCOR” groups.
  • the compounds according to the invention typically correspond to the general formula (I) in which R 4 represents a hydrogen atom, Ri represents a group of formula (II) as defined above, R 2 represents a group of formula (II) identical to R 1, while R 3 represents a hydrogen or halogen atom, a hydrocarbon group as defined above or a group of formula (II) identical to R 1 and R 2 .
  • Such compounds have at least two positively charged nitrogen atoms whose charges are counterbalanced by anions.
  • These anions may especially be halide ions such as I ⁇ , Cl “ , Br “ , F “ , nitrate ions, phosphate ions such as PO 4 3" or PF 6 " , carbonate ions, carboxylate ions such as CH 3 COO " , sulphite ions such as SO 3 2 " or HSO 3 " , sulphate ions such as SO 4 2 “ or HSO 4" , sulphonate ions such as CF 3 SO 3 " or alkyl-SO 3 " , or even BF 4 " ions .
  • the group of formula (II) constituting R 1 and R 2 , and optionally R 3 is preferably a group in which a is 0, which means that A is absent, while R 35 and R 36 of B represent hydrogen atoms or C 1 -C 4 alkyl groups, advantageously methyl or ethyl.
  • Q 1 may represent any of the heterocyclic groups of formulas (i) to (v) above, it is preferred however that it represents either a group of formula (i) as defined above, a group of formula (v) as defined above.
  • Groups of formula (II) satisfying these criteria are typically: (a) groups of formula (II-1) below:
  • R 5 represents a C 1 -C 4 alkyl group, preferably methyl or ethyl
  • R 6 to R 6, R 35 and R 36 represent, independently of each other, a hydrogen atom or a C 1 -C 4 alkyl group; at C 4 , preferably methyl or ethyl
  • R 5 represents a C 1 -C 4 alkyl group, preferably methyl or ethyl
  • R 6 to R 8 , R 10 , R 35 and R 36 represent, independently of one another, a hydrogen atom or a alkyl group in Ci to C4, preferably methyl or ethyl
  • R 5 represents a C 1 -C 4 alkyl group, preferably methyl or ethyl
  • R 6 , R 7 , R 9 , R 10 , R 35 and R 36 represent, independently of each other, an atom hydrogen or alkyl to C 4, preferably methyl or ethyl
  • R 5 represents a C 1 -C 4 alkyl group, preferably methyl or ethyl
  • R 2 to R 29 , R 35 and R 36 represent, independently of one another, a hydrogen atom or an alkyl group
  • Ci to C 4 of preferably methyl or ethyl.
  • R 1 and R 2 are both a group of formula (II-5) wherein R 5 represents a methyl group, while R 3 represents a hydrogen atom or a group of formula (II-5) ) identical to Ri and R2.
  • halides and, in particular, bis- [4- (2-N-methyl-pyridinium-4-yl-vinyl) phenyl] phenylamine iodides and tris- [4- (2-N-methylpyridinium-4-yl-vinyl) phenyl] amine.
  • the compounds according to the invention typically correspond to the general formula (I) in which:
  • R 4 represents a hydrogen atom, in which case R 1 represents a linking group, R 2 represents a group of formula (III) as defined above and R 3 represents a group of formula (III) identical to R 2 ;
  • R 4 represents a linking group, in which case R 1 represents a group of formula (III) as defined above, R 2 represents a group of formula (III) identical to R 1, while R 3 represents a hydrogen or hydrogen atom; halogen, a hydrocarbon group as defined above or a group of formula (III) identical to R 1 and R 2 .
  • the linker group or the functional group which the linker group comprises when the latter is a hydrocarbon group can be selected from among many functional groups, as long as they are capable of chemically reacting with a functional group belonging to the biomolecule (s) it intends to label with these compounds.
  • An exhaustive list of linker groups likely to be used can not be given, but a person skilled in the art will know how to choose an appropriate linker group.
  • the linker group should preferably be a very hydrophilic group such as a polyhydric alcohol, a polyol, a polyethylene glycol or a polyamine.
  • a polyethylene glycol linker group will be particularly suitable as described by Mac Laughin et al. (J. Org Chem 1997, 62 (3), 523-529 [5]).
  • a linker group constituted by or comprising a group carboxylic acid, a group derived from a carboxylic acid (for example, an acid halide or a acid anhydride), an activated ester (for example, an N-hydroxysuccinimidyl, pentafluorophenyl or para-nitrophenyl ester), a primary amine group or a leaving group of the halide, tosylate, mesylate, maleimide, etc. type, can be used.
  • a linker group constituted by or comprising a group carboxylic acid, a group derived from a carboxylic acid (for example, an acid halide or a acid anhydride), an activated ester (for example, an N-hydroxysuccinimidyl, pentafluorophenyl or para-nitrophenyl ester), a primary amine group or a leaving group of the halide, tosylate, mesylate, maleimide, etc. type, can be
  • R4 represents the linker group
  • it is preferably ⁇ of the R1 group.
  • the compounds comprise at least two positively charged nitrogen atoms whose charges are, again, counterbalanced by anions such as those mentioned above .
  • the group of formula (III) constituting R 2 and R 3 when R 4 is a hydrogen atom, or R 1, R 2 , and optionally R 3 , when R 4 is a spacer group, is preferably a group in which wherein a is 0, while R 35 and R 3 B 6 represent hydrogen atoms or alkyl groups -C 4, preferably methyl or ethyl.
  • Q 2 preferably represents either a group of formula (vi) as defined above, or a group of formula (ix) as defined above.
  • Groups of formula (III) satisfying these criteria are typically: (a) groups of formula (III-1) below:
  • R 1 to R 6, R 35 and R 36 are, independently of one another, a hydrogen atom or a C 1 -C 4 alkyl group, preferably methyl or ethyl; (b) groups of formula (III-2) below:
  • R 1 to R 5 R 10, R 35 and R 36 independently of one another are hydrogen or C 1 -C 4 alkyl, preferably methyl or ethyl; (c) groups of formula (III-3) below:
  • R 6 , R 7 , R 6 , R 10 , R 35 and R 36 independently of one another are hydrogen or C 1-4 alkyl, preferably methyl or ethyl; and (d) groups of formula (III-4) below:
  • R26 to R29, R35 and R36 represent, independently of each other, a hydrogen atom or an alkyl group -C 4 methyl or ethyl radical.
  • R 4 is a linker group
  • R 1, R 2 and R 3 all represent:
  • the starting compound is generally a triphenylamine mono-, di- or trisubstituted with a halogen atom, for example bromine or iodine, or an aldehyde which is subjected to one or more successive coupling reactions to graft on the phenyl rings the groups respectively constituting R 1, R 2 , R 3 and / or R 4 in the compounds of general formula (I).
  • a halogen atom for example bromine or iodine
  • an aldehyde which is subjected to one or more successive coupling reactions to graft on the phenyl rings the groups respectively constituting R 1, R 2 , R 3 and / or R 4 in the compounds of general formula (I).
  • the coupling can sometimes lead to products having one to several substituents that can be separated by purification.
  • the use of silica gel chromatography is then recommended.
  • R 1 to R 3 are identical then, starting from a starting compound comprising, for example, -Br, -I or -CHO functions, it suffices to react a compound comprising an alkene, phosphonate or phosphonium type function in proportions at least stoichiometric.
  • R 3 is different from Ri and R 2 or in the case where R 1 is different from R2 and R3, it is possible to proceed in the same way provided that R3 in the first case or Ri in the second case does not react during coupling.
  • protecting groups to protect one or more functions that can react in order to guide the coupling reactions and to promote these reactions in a particular direction.
  • the subject of the invention is also a composition which comprises at least one compound corresponding to the general formula (I) as defined above, in solution in a solvent.
  • this labeling will preferably be carried out for the purpose of observing said biomolecules by two-photon microscopy.
  • the compounds according to the invention as markers of biomolecules as proteins in other applications such as, for example, in epifluorescence microscopy or in confocal microscopy.
  • the subject of the invention is also a biomolecule labeled with at least one compound corresponding to the general formula (I) as defined above, this biomolecule being, preferably, an acid nucleic acid or a fragment of a nucleic acid (oligonucleotide for example), a protein, a polypeptide or a fragment of a protein or polypeptide.
  • this biomolecule being, preferably, an acid nucleic acid or a fragment of a nucleic acid (oligonucleotide for example), a protein, a polypeptide or a fragment of a protein or polypeptide.
  • FIG. 1 illustrates the synthesis scheme of a first compound according to the invention (TP-2Py).
  • FIG. 2 illustrates the synthesis scheme of another compound according to the invention (TP-3Py).
  • FIG. 3 illustrates the influence of the presence of DNA on the absorption spectrum (optical density (OD) as a function of the wavelength ( ⁇ )) of a compound according to the invention (TP-2Py) in solution (5 ⁇ M) in sodium cacodylate buffer (10 mM, pH 7.0); are shown in this figure, the absorption spectrum of the compound as obtained in the absence of DNA (m) and its absorption spectra as obtained in the presence of 0.5 equivalent ( ⁇ ), 1 equivalent (0), 2 equivalents (X) and 5 equivalents (O) of DNA.
  • OD optical density
  • FIG. 4 which is a figure similar to FIG. 3, illustrates the influence of the presence of DNA on the absorption spectrum (optical density (OD) as a function of the wavelength ( ⁇ )), another compound according to the invention (TP-3Py), also in solution (5 ⁇ M) in sodium cacodylate buffer (10 mM, pH 7.0); here also, are represented in this figure, the absorption spectrum of the compound as obtained in the absence of DNA (m) and its absorption spectra as obtained in the presence of 0.5 equivalents ( ⁇ ) , 1 equivalent (0), 2 equivalents (X) and 5 equivalents (O) of DNA.
  • OD optical density
  • FIG. 5 illustrates the influence of the presence of DNA on the emission spectrum (fluorescence intensity (I f i uo ), expressed in counts per second (cps), as a function of the wavelength ⁇ ), a compound according to the invention (TP-3Py) in solution (3 ⁇ M) in sodium cacodylate buffer (10 mM, pH 7.0) and for excitation at 474 nm; are shown in this figure, the emission spectrum of the compound in the absence of DNA (curve A) and that obtained in the presence of 1 equivalent of DNA (curve B).
  • FIG. 6 illustrates the influence of the presence of DNA on the intensity of the fluorescence emitted by two compounds according to the invention (TP-2Py (m) and
  • FIG. 7 represents the variations of the fluorescence intensity (I f i uo ), expressed in arbitrary units, as a function of time, expressed in seconds, as measured for a compound according to the invention (TP-3Py (4)) and for TO-PRO-3 ( ⁇ ), during irradiation with a 150 W xenon-mercury lamp.
  • FIG. 8 represents the variations of the two-photon absorption cross-section ⁇ , expressed as Göppert- Mayer, as a function of the wavelength (nm) as measured for two compounds according to the invention (TP-2Py ( m) and TP-3Py (4)), for a compound which is structurally very close to them, tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phenyl] amine (•), and for fluorescein ( ⁇ ), the fluorescein being in solution in water (pH> 10), TP-2Py and TP-3Py being in solution in glycerol and tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phenyl) amine being in solution in dichloromethane.
  • FIG. 9 represents the results of a test similar to that whose results are presented in FIG. 8, but which was carried out using the two compounds according to the invention (TP-2Py (m) and TP-3Py (4) )) in solution in sodium cacodylate buffer (10 mM, pH 7.3) supplemented with 5 equivalents of herring testis DNA.
  • FIGS. 10A and 10B correspond to images, taken in epifluorescence microscopy, of CHO K1 cells treated with a mixture of a compound according to the invention (TP-3Py 2 ⁇ M) and DAPI (3 ⁇ M); these images were taken at the maximum fluorescence emission of the compound according to the invention in the case of FIG. 10A and the maximum fluorescence emission of the DAPI in the case of FIG. 1B.
  • FIG. 10C corresponds to overlapping, performed by computer processing, FIGS. 1OA and 10B which shows colocalization of markers in the nucleus.
  • Figures HA and HB correspond to images, taken in epifluorescence microscopy, of CHO K1 cells treated with a mixture of another compound according to the invention (TP-2Py 2 ⁇ M), and of DAPI
  • FIGS. 12A, 12B, 12C, 12D, 12E and 12F correspond to images taken in phase contrast microscopy (FIGS. 12A and 12D) and in confocal microscopy (FIGS. 12B and 12E) and by coupling these two methods (FIG.
  • Example 1 Compounds useful in direct fluorescence
  • TP-2Py and TP-3Py have a high solubility in water since aqueous solutions of these compounds 0.5 to 1 mM could be obtained without any precipitate being formed.
  • This aqueous solubility is a real advantage, especially for biological applications, since it makes it possible to work in an aqueous medium and not to use an organic solvent such as DMSO which, although conventionally used in this field, is deleterious for cell membranes. .
  • aqueous solutions of TP-2Py and TP-3Py follow the Beer-Lambert law, at least up to a concentration of 50 ⁇ M.
  • the orange thiazole is, under the conditions in which it is conventionally used, that is to say at a concentration of 36 ⁇ M and at a temperature of 20 ° C., in the form of dimers (Kubista et al. , Biopolymers 1998, 46, 39-51 [8]).
  • the maximum wavelengths of absorption of these two compounds are in the 450-500 nm range and are therefore perfectly compatible with the use of Titanium: Saphir lasers which are used in two-photon microscopy and which are generally tunable in the spectral range of 750-900 nm.
  • FIGS. 3 and 4 represent the absorption spectra of TP-2Py and TP-3Py, respectively, obtained from 5 ⁇ M solutions of these compounds, before and after they are not added a 26-base pair duplex DNA of autocomplementary sequence (hereinafter "ds26"), at levels ranging from 0.5 to 5 equivalents, indicate a high affinity of TP-2Py and TP-3Py for DNA in conditions analogous to physiological conditions.
  • ds26 26-base pair duplex DNA of autocomplementary sequence
  • FIG. 5 represents the emission spectra obtained from a 3 ⁇ M solution of TP-3Py, before and after the addition of 1 equivalent of ds26, for a 474 excitation. nm, as well as in FIG. 6 which represents the variations of the fluorescence intensity (I f i uo ) obtained from 3 ⁇ M solutions of TP-IPy (A), TP-2Py (U) and TP-3Py ( 4), also for excitation at 474 nm, depending on the number of equivalents of ds26 added.
  • I f i uo fluorescence intensity
  • TP-2Py and TP-3Py were determined by fluorometric titration under stringent conditions (10mM sodium cacodylate sodium cacodylate buffer, pH 7.0 supplemented with 100mM NaCl) and using ds26 as DNA.
  • stringent conditions 10mM sodium cacodylate sodium cacodylate buffer, pH 7.0 supplemented with 100mM NaCl
  • ds26 ds26 as DNA.
  • K d dissociation constant K d of the order of one micromolar was obtained, confirming their very high affinity for DNA.
  • TP-3Py The ability of TP-3Py to resist the effects of irradiation was tested and compared to that of a fluorophore conventionally used as a DNA marker in epifluorescence and confocal microscopies, namely TO-PRO-3 ( 1- (N, N, N-trimethylamino-propyl) -4- ⁇ 2- [3-methyl-2,3-dihydro- (benzo-1,3-thiazole) -2-ethylidene] -vinyl iodide; quinolinium).
  • FIG. 7 which represents the variations in fluorescence intensity (I f i uo ), expressed in arbitrary units, as a function of time, expressed in seconds, as measured for TP-3Py and TO- PRO-3 during a irradiation by a 150 W xenon-mercury lamp of about thirty minutes, the emission of fluorescence of TP-3Py is little modified by the irradiation, while that of the TO-PRO- 3 fall of more than 40%.
  • the two-photon absorption properties of the compounds according to the invention were assessed using the technique of fluorescence induced by two photons (TPIF for "Two-Photon-Induced Fluorescence") and by means of a femtosecond laser source Titanium: Sapphire pulsed from 90 fs to 76 MHz that can be tuned to 750-840 nm.
  • TPIF fluorescence induced by two photons
  • Titanium: Sapphire Titanium: Sapphire pulsed from 90 fs to 76 MHz that can be tuned to 750-840 nm.
  • the relative TPIF intensities of the compounds according to the invention were measured relative to a standard reference marker, fluorescein, as well as a compound structurally very close to TP-2Py and TP-3Py, tris- [4- (2 -pyridin-4-yl-vinyl) phenyl] amino.
  • the measurements were carried out using TP-2Py and TP-3Py in glycerol, fluorescein and tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phenyl] amine being, they respectively in water (pH> 10) and in dichloromethane.
  • FIG. 8 which represents the variations of the two-photon absorption cross section ⁇ , expressed in G ⁇ ppert- Mayer, as a function of the wavelength (nm) as obtained for TP-2Py (H). ), TP-3Py (4), tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phenyl] amine (•) and fluorescein ( ⁇ ), a relative maximum of around 820 nm is observed for TP-2Py and TP-3Py.
  • ⁇ corresponds to the molar extinction coefficient, expressed in L / mol.cm
  • ⁇ F corresponds to the fluorescence quantum yield
  • ⁇ corresponds to at the two-photon absorption cross section, expressed as G ⁇ ppert- Mayer (GM).
  • TP-3Py has a large absorption cross-section at two photons since it reaches a value of 700 GM in glycerol and 700 GM and in the presence of DNA. This significantly higher than those obtained for DAPI (0.16 GM), for fluorescein (38 GM) and for rhodamine 6G (100 GM), which is nevertheless considered to be one of the best fluorophores for microscopy. photonic.
  • tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phenyl] amine which is structurally very close to TP-3Py, exhibits as the latter a maximum of excitation towards 820 nm but the value of its two-photon absorption cross section is only 58 GM according to the literature and 90 GM according to measurements made by the inventors.
  • CHO-K1 cells previously cultured in wells, on polyornithine coated glass supports, containing a commercially available standard culture medium, were fixed using a solution of formaldehyde (4%) in PBS.
  • the cells were then incubated, at room temperature and for 20 minutes, in the presence of markers or mixtures of test markers (in aqueous solution), then washed with PBS buffer (NaCl 13mM, 0.27mM KCl, 0.15mM KH 2 PO 4 , 0.8mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4) to remove excess label.
  • PBS buffer NaCl 13mM, 0.27mM KCl, 0.15mM KH 2 PO 4 , 0.8mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4
  • the observations by epifluorescence microscopy were carried out with a Nikon microscope, Eclipse E 800, equipped with a 6Ox objective (1.4) and a Nikon digital camera, DXM 1200, whereas those by confocal microscopy were carried out with a microscope
  • the Leica DM6000 features an SP2 unit with a 63x (1.4) lens and a HeNe laser for marker excitation. As shown in Figures 10A, 10B and
  • FIGS. 12A to 12F which correspond to images of cells treated with TP-3Py, taken by phase contrast microscopy (FIGS. 12A and 12D), in confocal microscopy (FIGS. 12E) and by superimposing these two methods (FIGS. 12C and 12F), at the maximum fluorescence emission of TP-3Py, the latter made it possible to obtain, by coupling of phase contrast and confocal microscopies, chromosome images. in anaphase of a very sharpness and high resolution, with a very clear definition of the limits of the cell.
  • compound 12 60 mg
  • compound 13 (40 mg, 50 ⁇ mol), N-hydroxysuccinimide (9 mg, 78 ⁇ mol) and DCC (11 mg) are dissolved in dichloromethane (1 mL) and the mixture is stirred for 24 hours. . Then the medium is evaporated, taken up in a minimum of dichloromethane. The milky suspension is filtered, the operation is repeated several times. The mother liquors are evaporated to dryness to give compound 14 in the form of an orange-yellow powder.
  • compound 16 24 mg, 25.8 ⁇ mol
  • rac-7-oxabicyclo [2.2.1] heptene-2,3-dicarboxylic imide (5 mg, 28.4 ⁇ mol).
  • K2CO3 (18 mg, 129 ⁇ mol, 5 eq.).
  • the white suspension obtained is stirred at 55 ° C.
  • 1, 9-dibromononane (730 ⁇ l, 20 eq.) And potassium carbonate (125 mg, 5 eq.) are stirred for 3 hours at room temperature in DMF (1 mL). Then the reaction crude is poured into a large volume of ether
  • the compound 22 (30 mq) is dissolved in 5 ml of an irethanoi / iodomethane mixture
  • oligonucleotide having a terminal function, in the 3 'or 5' position, of the thiophosphate type and comprising ammonium counter-ions (NH 4 + ) is dissolved in a solution of 18-C-6 crown ether in methanol. (previously treated with a chelating resin) at approximately 20 OD per mL. Compound 16 (about 2 mg) is added, and the mixture is vortexed and stirred at 35 ° C for 6 hours.
  • the mixture is then subjected to a purification procedure by following the procedure below: the mixture is first evaporated, taken up in water (1 mL) and extracted several times with dichloromethane and then with dichloromethane. 'ethyl until that the organic phases remain colorless. The residual non-aqueous solvent is removed under vacuum, and the aqueous solution is diluted with 1M NaCl in a 5/1 (v / v) water / acetonitrile mixture. This solution is purified on a size exclusion column (exclusion ⁇ 1000 Da) and the first colored eluate fraction is recovered. If necessary, the fraction obtained is purified by HPLC according to the usual procedures.
  • the purification is carried out using a reverse phase column (RP-18) and a water / acetonitrile or water / methanol elution system, with a pH of about 7 and comprising a dissolved salt (about 0.1M) of type (trialkyl) ammonium acetate.
  • RP-18 reverse phase column
  • the isolated fractions are lyophilized at least three times.
  • oligonucleotide having a primary amine function is dissolved in 0.5% NaHCC buffer> 3 at pH 9.5 at a level of 10 OD per 500 ⁇ L.
  • Compound 14 (approximately 1 to 2 mg) dissolved in DMF (approximately 300 ⁇ L, previously purified amine impurities) is added. The mixture is stirred for 24 hours at 35 ° C.

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouveaux dérivés de la triphénylamine utiles comme fluorophores, notamment pour la microscopie biphotonique en biologie. Elle se rapporte également à des compositions contenant ces dérivés, à l'utilisation de ces compositions ainsi que des dérivés eux-mêmes pour le marquage de molécules biologiques (ou 'biomolécules') telles que les acides nucléiques, les oligonucléotides, les protéines, les polypeptides, les plasmides, etc, en vue de leur observation notamment par microscopie biphotonique, et à des biomolécules marquées par lesdits dérivés. Applications: imagerie biologique et médicale (recherche fondamentale pour l'étude structurelle ou fonctionnelle des systèmes biologiques, recherche appliquée à visée clinique ou thérapeutique, diagnostic et dépistage médical,...).

Description

NOUVEAUX DERIVES DE LA TRIPHENYLAMINE UTILES COMME FLUOROPHORES EN BIOLOGIE, NOTAMMENT POUR LA MICROSCOPIE
BIPHOTONIQUE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à de nouveaux dérivés de la triphénylamine utiles comme fluorophores en biologie, notamment pour la microscopie biphotonique.
Elle se rapporte également à des compositions comprenant ces dérivés, à l'utilisation de ces compositions ainsi que des dérivés eux-mêmes pour le marquage de molécules biologiques (ou "biomolécules") du type acides nucléiques, oligo- nucléotides, protéines, polypeptides, plasmides, etc, en vue de leur observation notamment par microscopie biphotonique, et à des biomolécules marquées par lesdits dérivés. La présente invention trouve application dans tous les domaines d'utilisation des techniques d'imagerie biologique et médicale comme, par exemple, la recherche fondamentale pour l'étude structurelle ou fonctionnelle des systèmes biologiques, la recherche appliquée à visée clinique ou thérapeutique, ou encore le diagnostic et le dépistage médical.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
La microscopie de fluorescence est un outil couramment utilisé par les biologistes en raison de ce qu'elle permet de détecter, de quantifier et de fournir des images aussi bien des composants naturels des systèmes biologiques que d'éléments étrangers à ces systèmes .
Elle repose sur l'aptitude que présentent certains composés d'émettre un rayonnement spécifique lorsqu'ils sont excités par un rayonnement électromagnétique incident d'une longueur d'onde particulière. Ainsi, l'absorption d'un photon incident par le composé lui permet de passer d'un état non excité à un état excité. Le composé retourne ensuite à l'état non excité soit par désexcitation non radiative, auquel cas il n'y a pas de fluorescence, soit par désexcitation radiative avec émission d'un photon fluorescent qui peut être détecté . Peu de composés naturellement présents chez les êtres vivants ont des propriétés intrinsèques de fluorescence susceptibles d'être exploitées à des fins analytiques car l'intensité du rayonnement émis est généralement trop faible et la coloration trop peu sélective. C'est la raison pour laquelle les biologistes utilisent des colorants particuliers, dotés de propriétés fluorescentes : les fluorophores ou fluorochromes . On parle alors de fluorescence secondaire . Certains fluorophores ont la particularité de se fixer spécifiquement sur des biomolécules : ainsi, par exemple, le 4, 6-diaminido-2-phénylindole (ou DAPI), qui fluoresce dans le bleu lorsqu'il est excité par une lumière violette, se fixe spécifiquement sur l'ADN. D'autres fluorophores n'ont pas cette aptitude et nécessitent d'être préalablement greffés sur une molécule spécifique de celle que l'on cherche à détecter. C'est le cas, par exemple, de la rhodamine et de la fluorescéine que l'on peut utiliser soit pour détecter un antigène, auquel cas on les greffe sur un anticorps spécifique de cet antigène, soit comme traceurs de lignage cellulaire, auquel cas on les greffe sur une molécule pourvue d'une bonne stabilité dans les milieux biologiques comme le dextran.
En l'espace de quelques décennies, la microscopie de fluorescence s'est considérablement développée grâce à l'arrivée de nouvelles technologies optiques dont la microscopie confocale à balayage laser et, plus récemment, la microscopie de fluorescence par excitation à deux photons, encore appelée microscopie biphotonique .
Actuellement, la microscopie biphotonique est, de toutes les techniques de microscopie de fluorescence, celle qui se développe le plus dans le domaine de la biologie. Son principe consiste à apporter simultanément deux photons d'énergie identique à un composé pour produire une excitation équivalente à celle qu'aurait entraînée un photon unique de haute énergie. Pour que le procédé soit efficace, il est nécessaire que les photons parviennent au composé dans un intervalle de temps très réduit, d'environ 10~15 secondes, ce qui a été rendu possible par l'utilisation de sources de lumière laser produisant des impulsions ultra-brèves et très intenses.
La microscopie biphotonique présente de nombreux avantages. En effet, les processus de photoblanchiment et de phototoxicité, souvent limitants en microscopie monophotonique, sont ici limités au maximum. De plus, les photons d'excitation, qui sont typiquement situés dans l'infrarouge proche
(750-900 nm) , sont moins énergétiques que les photons employés en microscopie monophotonique. Il en résulte que le rayonnement d'excitation est moins destructeur pour des échantillons biologiques et qu'il pénètre plus profondément dans les tissus jusqu'à 0,5 mm environ.
Enfin, la microscopie biphotonique a une résolution spatiale aussi bonne que celle de la microscopie confocale à balayage laser, c'est-à-dire de l'ordre du micromètre .
Il est à noter que le principe d'une excitation à plusieurs photons ne se limite pas à une excitation biphotonique et que des expériences de microscopie triphotonique ont déjà été réalisées avec succès .
Actuellement, les fluorophores utilisés en microscopie biphotonique sont les mêmes que ceux utilisés en microscopie monophotonique. Or, ces fluorophores ont de médiocres propriétés de fluorescence à deux photons, notamment en termes de section efficace d'absorption, ce qui limite l'étendue des applications de la microscopie biphotonique en biologie.
Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer de fluorophores mieux adaptés à la fluorescence biphotonique et, en particulier, à une utilisation de cette technique pour l'observation des systèmes biologiques. Au cours de ces dernières années, les propriétés d' absorption à deux photons des dérivés de la triphénylamine ont fait l'objet d'un certain nombre de travaux et des résultats notables ont été obtenus en milieux organiques pour des applications concernant le domaine des matériaux et l'optoélectronique. On peut ainsi citer :
" les travaux de Chung et al. (J. Phys . Chem. B 1999, 103, 10741-10745 [I]) portant sur trois dérivés obtenus en fonctionnalisant respectivement un, deux ou les trois groupes phényles de la triphénylamine par un enchaînement de trois cycles aromatiques dont un cycle oxadiazole, via un groupe vinylique ;
" ceux de Porrès et al. (Organic Letters 2004, 6(1), 47-50 [2]) portant sur une série de dérivés issus de la fonctionnalisation des trois groupes phényles de la triphénylamine par un groupe fortement électro-attracteur, via un groupe acétylénique ;
" ceux de Yang et al. (Organic Letters 2004, 6(9), 1389-1392 [3]) portant sur trois dérivés obtenus en fonctionnalisant les trois groupes phényles de la triphénylamine par un ou plusieurs noyaux aromatiques, via un groupe éthylénique ; et enfin
" ceux de Yan et al. (J. of Molecular Structure 2005, 733, 83-87 [4]) portant sur les propriétés spectrales d'un dérivé obtenu par fonctionnalisation des trois groupes phényles de la triphénylamine par des groupes pyridinyles, via un groupe vinylique. Toutefois, tous ces dérivés présentent un certain nombre de caractéristiques qui s'opposent à leur utilisation comme marqueurs de systèmes biologiques, en particulier une taille élevée de nature à perturber le comportement des biomolécules, une insolubilité dans l'eau et l'absence de fonctionnalités propres à permettre leur greffage sur des biomolécules pour un usage en fluorescence secondaire.
Les Inventeurs se sont donc fixé pour but de développer des fluorophores qui soient parfaitement adaptés à l'utilisation de la fluorescence biphotonique dans le domaine de la biologie.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
Ce but et d'autres sont atteints par la présente invention qui propose, en premier lieu, des composés dérivés de la triphénylamine, utiles comme marqueurs soit en fluorescence directe, soit en fluorescence secondaire et qui répondent à la formule générale (I) ci-après :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle :
R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe lieurgroupe lieur, auquel cas :
1) si R4 représente un atome d'hydrogène, alors Ri représente un groupe lieur ou un groupe de formule (II) ci-après :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle : * Qi représente :
- un groupe hétérocyclique de formule :D ci-après :
Figure imgf000009_0002
où R5 représente un groupe hydrocarboné ; l'un quelconque de R6 à Rio représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de R6 à Rio représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné ; ou un groupe hétérocyclique de formule (ii) ou (iii) ci-après :
Figure imgf000009_0003
( i j -i ) où R5 représente un groupe hydrocarboné ; l'un quelconque de Rn à Ri7 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de Rn à Ri7 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R12, R14 et R16 pouvant aussi former, respectivement avec Rn et/ou Ri3, R13 et/ou Ri5, et avec Ri5 et/ou Ri7, un
10 groupe pontant ; ou un groupe hétérocyclique de formule (iv) ci-après :
Figure imgf000010_0001
où l'un quelconque de Ris à R25 représente
15 une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de Ris à R25 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R19, R21, R23 et R25
20 pouvant aussi former, respectivement avec Ris et/ou R20, R20 et/ou R22, R22 et/ou R24, et avec R24 et/ou Ris, un groupe pontant ; ou un groupe hétérocyclique de formule (v) ci-après :
Figure imgf000011_0001
où R5 représente un groupe hydrocarboné ; W représente un atome d'oxygène ou de soufre ou un groupe -N(R3i)- où R31 est un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, ou un groupe -C(R3i) (R32)- où R31 et R32 sont, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné ; R30 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que
R26 à R29 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R27 pouvant aussi former avec R26 et/ou R28 un groupe pontant, R28 pouvant lui-même former avec R29 un groupe pontant ;
* a vaut 0 (auquel cas A est absent) ou 1 (auquel cas A est présent) ;
* A et B représentent les groupes ci-après :
Figure imgf000011_0002
dans lesquels R33 à R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R33 et R36 pouvant aussi former chacun avec R34 et/ou
R35 un groupe pontant ; lorsque Ri représente un groupe de formule (II) ci-avant, alors R2 représente également un groupe de formule (II) ci-avant tandis que, lorsque Ri représente un groupe lieur, alors R2 représente un groupe de formule (III) ci-après :
Figure imgf000012_0001
dans laquelle : * Q2 représente :
- un groupe hétérocyclique répondant à l'une quelconque des formules (i) à (v) ci-avant ; ou
- un groupe hétérocyclique de formule (vi) ci-après :
Figure imgf000012_0002
où R6 à Rio ont la même signification que dans la formule (i) ci-avant ; ou un groupe hétérocyclique de formule (vii) ou (viii) ci-après :
Figure imgf000012_0003
où Rn à Ri7 ont la même signification que dans les formules (ii) et (iii) ci-avant ; ou un groupe hétérocyclique de formule (ix) ci-après :
Figure imgf000013_0001
où W, R26 à R30 ont la même signification que dans la formule (v) ci-avant ;
* a, A et B ont la même signification que précédemment ;
• lorsque Ri représente un groupe lieur, alors R3 représente un groupe de formule (III) ci-avant tandis que, lorsque Ri représente un groupe de formule (II) ci-avant, alors R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (II) ci-avant ; 2) si R4 représente un groupe lieur, alors Ri et R2 représentent un groupe de formule (III) ci-avant tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (III) ci-avant ; dans laquelle le groupe lieur est un groupe fonctionnel apte à permettre le greffage par réaction chimique du composé sur une biomolécule, ou un groupe hydrocarboné comprenant un tel groupe fonctionnel, et dans laquelle chacun des groupes hydrocarbonés sus-mentionnés peut être substitué par un ou plusieurs substituants, identiques ou différents, et comprendre un ou plusieurs hétéroatomes .
L'invention a aussi pour objet les isomères de ces composés ainsi que les sels d'addition de ces composés et de leurs isomères.
L'expression "l'un quelconque de Re à R1O représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B" utilisée ci-avant signifie que le groupe hétérocyclique en question est relié directement à B par une liaison covalente impliquant l'un quelconque des atomes de carbone du cycle qui le constitue .
De manière similaire, les expressions "1 'un quelconque de R11 à R17 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B" et "1 'un quelconque de R1S à R25 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B" utilisées ci-avant signifient que les groupes hétérocycliques concernés sont reliés directement à B par une liaison covalente impliquant l'un quelconque des atomes de carbone des cycles qui les constituent.
Conformément à l'invention, les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 dans les groupes de formules (II) et (III) ci-avant ainsi que pour R3 peuvent être des groupes saturés, mono- ou polyinsaturés, aliphatiques (c'est-à-dire linéaires ou ramifiés), mono- ou polycycliques .
Comme précédemment mentionné, ces groupes peuvent, d'une part, être substitués par un ou plusieurs substituants, identiques entre eux ou différents les uns des autres, et, d'autre part, comprendre un ou plusieurs hétéroatomes, auquel cas ce ou ces hétéroatomes peuvent aussi bien former pont dans lesdits groupes hydrocarbonés qu'être portés par eux sous la forme de substituants.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "hétéroatome" , tout atome autre que de carbone ou d'hydrogène comme, par exemple, un atome d'oxygène, d'azote, de soufre, d'halogène, de phosphore, de bore ou encore de silicium, les atomes d'oxygène, d'azote, de soufre et d'halogène (fluor, iode, chlore, brome) étant les préférés.
Ainsi, les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 et pour R3 peuvent notamment être :
• des groupes alkyle, linéaires ou ramifiés, comme, par exemple, des groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec- butyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle ou hexyle ; • des groupes alcényle ou alcynyle, linéaires ou ramifiés, comme, par exemple, des groupes éthényle ou éthynyle, propényle ou propynyle, isopropényle ou isopropynyle, butényle ou butynyle, isobutényle ou isobutynyle, sec-butényle ou sec- butynyle, tert-butényle ou tert-butynyle, pentényle ou pentynyle, isopentényle ou isopentynyle ;
• des groupes cycloalkyle comme, par exemple, des groupes cyclopentyle ou cyclohexyle ;
• des groupes cycloalcényle ou cyclo- alcynyle comme, par exemple, des groupes cyclopentényle ou cyclopentynyle, un groupe cyclohexényle ou cyclo- hexynyle ;
• des groupes aromatiques à un ou plusieurs cycles fusionnés comme, par exemple, des groupes cyclopentadiényle, phényle, naphtyle, pyrényle ou anthracényle ;
• des groupes hétéroaromatiques à un ou plusieurs cycles fusionnés comme, par exemple, des groupes furanyle, pyrrolyle, thiophényle, oxazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, imidazolyle, triazolyle, pyridinyle, pyranyle, quinolinyle, isoquinolinyle, pyrazinyle ou pyrimidinyle ; ou encore
• des groupes dérivés des groupes susmentionnés par une ou plusieurs substitutions, cette ou ces substitutions correspondant, de préférence, à des atomes d'halogène ou à des groupes aliphatiques comprenant au moins un hétéroatome comme, par exemple, un groupe -COOR", -CHO, -OR", -SR", -SCOR", -SO2R", -NR"R"', -CONR"R"', -C(HaI)3, -OC(HaI)3, -C(O)HaI ou -CN dans lesquels R" et R"' représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, tandis que HaI représente un atome d'halogène, de préférence de fluor, de chlore ou de brome.
Pour éviter que les composés ne souffrent d'un encombrement stérique, on préfère que les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 ne comportent pas plus de 10 atomes de carbone
(substituant (s) inclus) et soient, si possible, des groupes en Ci à Ce et, mieux encore, des groupes en Ci à C4, dans le cas de groupes aliphatiques, ou bien des groupes à un seul cycle à 5 ou 6 membres dans le cas de groupes cycliques.
De manière particulièrement préférée, les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 sont des groupes alkyle en Ci à C4, en particulier méthyle ou éthyle.
Conformément à l'invention, les groupes pontants susceptibles d'être formés par :
• R12, R14 et R16, respectivement avec Rn et/ou R13, R13 et/ou Ri5, et avec Ri5 et/ou Ri7, dans les groupes de formules (ii) , (iii) , (vii) et (viii) ;
• Ri9, R2i, R23 et R25 pouvant aussi former, respectivement avec Ris et/ou R20, R20 et/ou R22, R22 et/ou R24, et avec R24 et/ou Ris, dans les groupes de formule (iv) ;
• R27 avec R26 et/ou R28 et par R2s avec R29 dans les groupes de formules (v) et (ix) ; et par
• R33 et R36 avec R34 et/ou R35 dans les groupes A et B ; sont des groupes divalents formés par l'enchaînement de n atomes choisis parmi les atomes de carbone, d'azote, d'oxygène et/ou de soufre et dans lesquels n est avantageusement choisi de sorte que la formation de ces groupes pontants se traduise par la formation de cycles ou d' hétérocycles à 5 ou 6 membres.
Ainsi :
• les groupes pontants susceptibles d'être formés par Ri3 avec Ri4 dans les groupes de formules (ii) et (vii) , par R12 avec Ri3 et par Ri6 avec Ri7 dans les groupes de formules (iii) et (viii) , par Ri8 avec R25 et par R2i avec R22 dans le groupe de formule (iv) , par R33 et R36 avec R34 et/ou R35 dans les groupes A et B sont, de préférence, des groupes formés par l'enchaînement de 2 ou 3 atomes ; tandis que
* tous les autres groupes pontants susceptibles d'être formés dans les groupes de formules (ii) à (ix) , sont, de préférence, des groupes formés par l'enchaînement de 3 ou 4 atomes.
Par ailleurs, ces groupes pontants sont, de préférence, des groupes insaturés dont les insatu- rations correspondent typiquement à des doubles liaisons. De préférence, ces doubles liaisons forment, entre elles et/ou avec les autres doubles liaisons présentes dans les composés, un système de doubles liaisons conjuguées. Au surplus, les groupes pontants peuvent être substitués par un ou plusieurs substituants, identiques ou différents, dès lors que l'enchaînement d'atomes qui les forme comprend un ou plusieurs atomes de carbone et/ou d'azote. Ce ou ces substituants correspondent, de préférence, à des atomes d'halogène, à des groupes aliphatiques comprenant au moins un hétéroatome comme, par exemple, des groupes -COOR", -CHO, -OR", -SR", -SCOR", -SO2R", -NR"R"', -CONR"R"', -C(HaI)3, -OC(HaI)3, -C(O)HaI ou -CN dans lesquels R", R"' et HaI ont la même signification que précédemment, ou encore à des groupes neutres comme des groupes alkyle, par exemple méthyle ou éthyle.
Pour une utilisation en fluorescence directe, les composés selon l'invention répondent typiquement à la formule générale (I) dans laquelle R4 représente un atome d'hydrogène, Ri représente un groupe de formule (II) telle que précédemment définie, R2 représente un groupe de formule (II) identique à Ri, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné tel que précédemment défini ou encore un groupe de formule (II) identique à Ri et R2.
De tels composés comportent au moins deux atomes d'azote chargés positivement dont les charges sont contrebalancées par des anions. Ces anions peuvent notamment être des ions halogénures comme I~, Cl", Br", F", des ions nitrates, des ions phosphates comme PO4 3" ou PF6 ", des ions carbonates, des ions carboxylates comme CH3COO", des ions sulfites comme SO3 2" ou HSO3 ", des ions sulfates comme SO4 2" ou HSO4", des ions sulfonates comme CF3SO3 " ou alkyle-SO3 ", ou encore des ions BF4 ".
Pour que ces composés aient une bonne solubilité dans l'eau, le groupe de formule (II) constituant Ri et R2, et éventuellement R3, est, de préférence, un groupe dans lequel a vaut 0, ce qui signifie que A est absent, tandis que R35 et R36 de B représentent des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en Ci à C4, avantageusement méthyle ou éthyle.
Bien que, dans ce groupe de formule (II), Qi puisse représenter l'un quelconque des groupes hétérocycliques de formules (i) à (v) ci-avant, on préfère toutefois qu'il représente soit un groupe de formule (i) telle que précédemment définie, soit un groupe de formule (v) telle que précédemment définie. Des groupes de formule ( I I ) répondant à ces critères sont typiquement : ( a ) des groupes de formule ( I I - l ) ci -après :
Figure imgf000020_0001
) dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R6 à Rg, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (b) des groupes de formule (II-2) ci-après :
Figure imgf000020_0002
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R6 à R8, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; ( c) des groupes de formule ( I I -3 ) ci-après
Figure imgf000021_0001
) dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R6, R7, R9, R10, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; et (d) des groupes de formule (II-4) ci-après :
Figure imgf000021_0002
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R26 à R29, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
Dans le cadre de leurs travaux, les Inventeurs ont constaté que les composés de formule générale (I) dans laquelle au moins Ri et R2 représentent un groupe de formule (II-5) ci-après :
Figure imgf000022_0001
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, et qui correspond à la formule (II-3) ci-avant où R6 = R7 = R9 = Rio = R35 = R36 = H, présentent un ensemble de propriétés rarement réunies par les fluorophores classiquement utilisés en biologie, à savoir :
" une bonne solubilité dans l'eau et, donc, dans les milieux biologiques ; " une excellente résistance aux effets des irradiations lumineuses (ni photoblanchiment, ni photodégradation) ;
" une fluorescence dans le rouge qui, d'une part, ne risque pas d'interférer avec les signaux émis dans le vert par les composants cellulaires qui fluorescent naturellement et, d'autre part, est moins nocive pour les cellules que des fluorescences dans le bleu et le vert ;
" une grande section efficace d'absorption à deux photons ; et surtout,
" une affinité particulièrement élevée pour l'ADN dans des conditions analogues aux conditions physiologiques, se manifestant par une forte exaltation de leur fluorescence en présence de cette biomolécule et conférant à ces composés un intérêt tout particulier pour le marquage de l'ADN.
Aussi, ces composés sont-ils particulièrement préférés pour une utilisation en fluorescence directe . II s'agit notamment de ceux dans lesquels Ri et R2 sont tous deux un groupe de formule (II-5) où R5 représente un groupe méthyle, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (II-5) identique à Ri et R2.
A titre d'exemples de tels composés, on peut citer les halogénures et, en particulier, les iodures de bis- [4- (2-N-méthyl-pyridinium-4-yl-vinyl) - phényl] phénylamine et de tris- [4- (2-N-méthylpyridinium- 4-yl-vinyl) phényl ] aminé .
Pour une fluorescence secondaire, les composés selon 1 ' invention répondent typiquement à la formule générale (I) dans laquelle :
• soit R4 représente un atome d'hydrogène, auquel cas Ri représente un groupe lieur, R2 représente un groupe de formule (III) telle que précédemment définie et R3 représente un groupe de formule (III) identique à R2 ;
• soit R4 représente un groupe lieur, auquel cas Ri représente un groupe de formule (III) telle que précédemment définie, R2 représente un groupe de formule (III) identique à Ri, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné tel que précédemment défini ou encore un groupe de formule (III) identique à Ri et R2.
Les Inventeurs ayant constaté que la nature du groupe lieur n'a pas ou que très peu d'incidence sur les propriétés de fluorescence des composés selon l'invention, le groupe lieur ou le groupe fonctionnel que comporte le groupe lieur lorsque ce dernier est un groupe hydrocarboné peut être choisi parmi de très nombreux groupes fonctionnels, pour autant qu'ils soient capables de réagir chimiquement avec un groupe fonctionnel appartenant à la ou aux biomolécules qu'il entend marquer par ces composés. Une liste exhaustive des groupes lieurs susceptibles d'être utilisés ne peut donc être donnée, mais un homme du métier saura parfaitement choisir un groupe lieur approprié.
Ainsi, par exemple, il saura que, pour favoriser la solubilité dans l'eau des composés, le groupe lieur devra, de préférence, être un groupe très hydrophile comme un polyalcool, un polyol, un polyéthylène glycol ou une polyamine.
Il saura également que, pour greffer les composés sur un acide nucléique, un groupe lieur de type polyéthylène glycol conviendra particulièrement bien comme décrit par Mac Laughin et al. (J. Org. Chem. 1997 , 62 (3) , 523-529 [5] ) .
De la même manière il saura que l'utilisation d'un polyol comme un saccharide (galactose par exemple), outre d'augmenter la solubilité, minimise aussi l'agrégation en milieu aqueux (Zongren et al., Org. Lett. 2004, 6, 2067-2070 [6]) . II saura encore que, pour greffer les composés sur une protéine ou un polypeptide et, notamment, sur un anticorps ou un antigène, par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel d'un acide aminé, un groupe lieur constitué par ou comportant un groupe acide carboxylique, un groupe dérivé d'acide carboxylique (par exemple, un halogénure d'acide ou un anhydride d'acide), un ester activé (par exemple, un ester de N-hydroxysuccinimidyle, de pentafluorophényle ou de para-nitrophényle) , un groupe aminé primaire ou encore un groupe partant du type halogénure, tosylate, mésylate, maléimide, etc, pourra être utilisé.
Conformément à l'invention, lorsque R4 représente le groupe lieur, alors celui-ci se trouve, de préférence, en α du groupe Ri.
Par ailleurs, lorsque, dans le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 quand R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri, R2, et éventuellement R3, quand R4 est un groupe espaceur, Q2 est un groupe hétérocyclique répondant à l'une quelconque des formules (i) à (v) , alors les composés comportent au moins deux atomes d'azote chargés positivement dont les charges sont, là également, contrebalancées par des anions tels que ceux précédemment cités.
Le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 quand R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri, R2, et éventuellement R3, quand R4 est un groupe espaceur, est, de préférence, un groupe dans lequel a vaut 0, tandis que R35 et R36 de B représentent des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en Ci à C4, avantageusement méthyle ou éthyle. Par ailleurs, dans ce groupe de formule
(III), Q2 représente, de préférence, soit un groupe de formule (vi) telle que précédemment définie, soit un groupe de formule (ix) telle que précédemment définie. Des groupes de formule (III) répondant à ces critères sont typiquement : (a) des groupes de formule (III-l) ci-après :
Figure imgf000026_0001
dans laquelle Re à Rg, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (b) des groupes de formule (III-2) ci-après :
Figure imgf000026_0002
dans laquelle Re à Rs Rio , R35 et R36 repré sentent , indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (c) des groupes de formule (III-3) ci-après :
Figure imgf000026_0003
:in-3) dans laquelle R6, R7, Rg, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; et (d) des groupes de formule (III-4) ci-après :
Figure imgf000027_0001
dans laquelle R26 à R29, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
Pour une utilisation en fluorescence secondaire, on préfère plus particulièrement les composés de formule générale (I) dans laquelle R4 est un groupe lieur, tandis que Ri, R2 et R3 représentent tous :
* soit un groupe de formule (III-5) ci-après :
Figure imgf000027_0002
(qui correspond à un groupe de formule ( I I I -3 ) ci-avant où R6 = R7 = R9 = Rio = R35 = R36 = H) ;
* soit un groupe de formule ( I I I- 6 ) ci-après :
Figure imgf000027_0003
; i I I - 6 ) (qui correspond à un groupe de formule (III-4) ci-avant dans laquelle R26 = R27 = R28 = R29 = R35 = R36 = H) .
Des exemples de tels composés sont notamment : - le 4-{5- [bis (A- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol-
2-yl) -vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- ( 1 , 3-benzothiazol-2- yl) -vinyl] phénoxyjbutanoate d'éthyle ;
- l'acide 4- { 5- [Ms (4- [ (E) -2- (1, 3-benzo- thiazol-2-yl) vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- (1, 3-benzo- thiazol-2-yl) vinyl] phénoxyjbutanoïque ;
- le 4-{5- [Ms (4- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol- 2-yl) vinyl]phényl) amino] -2- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol-2- yl) vinyl] phénoxyjbutanoate de succinimidyle ;
- la (3- (8-bromooctyloxy) -{4- [ (E) -2- (benzo-thiazol-2-yl) vinyl] }-N,N-Ms-{4- [ (E) -2- (benzo- thiazol-2-yl) vinyl ] phényl } aniline ;
- la (3- (8- (2, 5-dioxo-l-aza) cyclopent-3- ényl)-octyloxy)-{4-[ (£')-2-(benzothiazol-2-yl)vinyl] } - N,N-Ms-{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] phényl }- aniline ;
- la (3- (9-bromononyloxy) -4-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) vinyl] phényl } -N,N-bis- {4- [ (E) -2- (pyridin- 4-yl) -vinyl ] phényl } aniline ;
- la tris-méthiodure de 3- (9-bromononyl- oxy) -4, 4% 4"- tris (2- ( (E) -pyridin-4-yl) vinyl) triphényl- amine ;
- le 4- (N,N-bis- (4- (2- (pyridin-4-yl) - vinyl) ) phényl) aminobenzoate de méthyle ; et
- le 4- (N,N-Ms- (4- (2- (benzothiazol-2-yl) - vinyl) ) phényl) aminobenzoate de méthyle. Les composés selon 1 ' invention peuvent être préparés par des voies de synthèse à la portée de l'homme du métier, de nombreux procédés permettant de dérivatiser la triphénylamine ayant, en effet, été décrits dans la littérature comme, par exemple, dans les références [1] à [4] précitées.
Le composé de départ est généralement une triphénylamine mono-, di- ou trisubstituée par un atome d'halogène, par exemple de brome ou d'iode, ou un aldéhyde que l'on soumet à une ou plusieurs réactions successives de couplage pour greffer sur les noyaux phényles les groupes constituant respectivement Ri, R2, R3 et/ou R4 dans les composés de formule générale (I) .
Ces réactions de couplage comme, par exemple, la réaction de Heck ou de Wittig-Hôrner qui permet de greffer des composés vinylés sur des noyaux phényle, sont des réactions couramment utilisées en synthèse organique.
Le couplage peut conduire parfois à des produits comportant un à plusieurs substituants qu'il est possible de séparer par purification. L'utilisation d'une chromatographie sur gel de silice est alors recommandée .
Selon l'objectif de l'utilisateur, il est possible de procéder en plusieurs étapes. Si Ri à R3 sont identiques alors, à partir d'un composé de départ comportant par exemple des fonctions -Br, -I ou -CHO, il suffit de faire réagir un composé comportant une fonction de type alcène, phosphonate ou phosphonium en proportions au moins stoechiométriques . Dans le cas où R3 est différent de Ri et R2 ou bien dans le cas où Ri est différent de R2 et R3, il est possible de procéder de la même manière à condition que R3 dans le premier cas ou Ri dans le second cas ne réagisse pas lors du couplage. Bien entendu, il est également possible de recourir à l'utilisation de groupes protecteurs pour protéger une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir afin d'orienter les réactions de couplage et de favoriser ces réactions dans un sens particulier.
L'invention a, aussi, pour objet une composition qui comprend au moins un composé répondant à la formule générale (I) telle que précédemment définie, en solution dans un solvant.
Elle a, également, pour objet l'utilisation d'au moins un composé répondant à la formule générale (I) telle que précédemment définie, ou d'une composition comprenant un tel composé pour le marquage de biomolécules.
Compte tenu des propriétés de fluorescence à deux photons présentées par les composés selon l'invention, ce marquage sera, de préférence, réalisé en vue de l'observation desdites biomolécules par microscopie biphotonique . Ceci étant, il est également possible d'utiliser les composés selon l'invention comme marqueurs de biomolécules comme des protéines dans d'autres applications comme, par exemple, en microscopie par épifluorescence ou en microscopie confocale .
L'invention a, encore, pour objet une biomolécule marquée par au moins un composé répondant à la formule générale (I) telle que précédemment définie, cette biomolécule étant, de préférence, un acide nucléique ou un fragment d'un acide nucléique (oligonucléotide par exemple) , une protéine, un polypeptide ou un fragment d'une protéine ou d'un polypeptide . L'invention sera mieux comprise à la lumière du complément de description, qui se réfère à des exemples de réalisation de composés selon l'invention et de démonstration de leurs propriétés.
Bien entendu, ces exemples ne sont donnés qu'à titre d'illustrations de l'invention et n'en constituent en aucun cas une limitation.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 illustre le schéma de synthèse d'un premier composé selon l'invention (TP-2Py) . La figure 2 illustre le schéma de synthèse d'un autre composé selon l'invention (TP-3Py) .
La figure 3 illustre l'influence de la présence d'ADN sur le spectre d'absorption (densité optique (DO) en fonction de la longueur d'onde (λ) ) d'un composé selon l'invention (TP-2Py) en solution (5 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) ; sont représentés sur cette figure, le spectre d'absorption du composé tel qu'obtenu en l'absence d'ADN (m) et ses spectres d'absorption tels qu'obtenus en présence de 0,5 équivalent (Δ) , 1 équivalent (0), 2 équivalents (X) et 5 équivalents (O) d'ADN.
La figure 4, qui est une figure analogue à la figure 3, illustre l'influence de la présence d'ADN sur le spectre d'absorption (densité optique (DO) en fonction de la longueur d'onde (λ) ) , d'un autre composé selon l'invention (TP-3Py) , également en solution (5 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) ; là également, sont représentés sur cette figure, le spectre d'absorption du composé tel qu'obtenu en l'absence d'ADN (m) et ses spectres d'absorption tels qu'obtenus en présence de 0,5 équivalent (Δ) , 1 équivalent (0), 2 équivalents (X) et 5 équivalents (O) d ' ADN .
La figure 5 illustre l'influence de la présence d'ADN sur le spectre d'émission (intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en coups par seconde (cps) , en fonction de la longueur d'onde λ) , d'un composé selon l'invention (TP-3Py) en solution (3 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) et pour une excitation à 474 nm ; sont représentés sur cette figure, le spectre d'émission du composé en l'absence d'ADN (courbe A) et celui obtenu en présence d'1 équivalent d'ADN (courbe B).
La figure 6 illustre l'influence de la présence d'ADN sur l'intensité de la fluorescence émise par deux composés selon l'invention (TP-2Py (m) et
TP-3Py (4) ) en solution (1 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) et respectivement pour une excitation à 474 nm et 478 nm ; sont représentées sur cette figure, les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en unités arbitraires, en fonction du nombre d'équivalents d'ADN.
La figure 7 représente les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en unités arbitraires, en fonction du temps, exprimé en secondes, telles que mesurées pour un composé selon l'invention (TP-3Py (4)) et pour le TO-PRO-3 (Δ) ) , au cours d'une irradiation par une lampe xénon-mercure de 150 W.
La figure 8 représente les variations de la section efficace d'absorption à deux photons δ, exprimée en Gôppert-Mayer, en fonction de la longueur d'onde (nm) telles que mesurées pour deux composés selon l'invention (TP-2Py (m) et TP-3Py (4)), pour un composé qui leur est structurellement très proche, la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] aminé (•) , et pour la fluorescéine (Δ) , la fluorescéine étant en solution dans l'eau (pH > 10), TP-2Py et TP-3Py étant en solution dans le glycérol et la tris- [4- (2-pyridin-4- yl-vinyl) phényl] aminé étant en solution dans le dichlorométhane . La figure 9 représente les résultats d'un test analogue à celui dont les résultats sont présentés sur la figure 8, mais qui a été réalisé en utilisant les deux composés selon l'invention (TP-2Py (m) et TP-3Py (4) ) en solution dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,3) additionné de 5 équivalents d'ADN de testicule de hareng.
Les figures 1OA et 1OB correspondent à des images, prises en microscopie d' épifluorescence, de cellules CHO Kl traitées avec un mélange d'un composé selon l'invention (TP-3Py 2 μM) et de DAPI (3 μM) ; ces images ont été prises au maximum d'émission de fluorescence du composé selon 1 ' invention dans le cas de la figure 1OA et au maximum d'émission de fluorescence du DAPI dans le cas de la figure 1OB. La figure 10C correspond à la superposition (overlapping) , effectuée par un traitement informatique, des figures 1OA et 10B qui montre la colocalisation des marqueurs dans le noyau.
Les figures HA et HB correspondent à des images, prises en microscopie d' épifluorescence, de cellules CHO Kl traitées avec un mélange d'un autre composé selon l'invention (TP-2Py 2 μM) , et de DAPI
(3 μM) ; ces images ont été prises au maximum d'émission de fluorescence du composé selon l'invention dans le cas de la figure HA et au maximum d'émission de fluorescence du DAPI dans le cas de la figure HB. La figure HC correspond à la superposition (over- lapping) , effectuée par un traitement informatique, des figures HA et HB qui montre la colocalisation des marqueurs dans le noyau. Les figures 12A, 12B, 12C, 12D, 12E et 12F correspondent à des images, prises en microscopie à contraste de phase (figures 12A et 12D) et en microscopie confocale (figures 12B et 12E) et en couplant ces deux méthodes (figures 12C et 12F) , de cellules CHO Kl se trouvant à deux stades de mitose différents, ces cellules ayant été préalablement traitées par un composé selon l'invention (TP-3Py 2 μM) ; ces images ont été prises au maximum d'émission de fluorescence du composé selon l'invention. Les figures 13 à 15 illustrent les schémas de synthèse d'autres composés selon l'invention. EXPOSE DETAILLE D'EXEMPLES DE REALISATION
Exemple 1 : Composés utiles en fluorescence directe
1.1. Iodure de bis- [4- (2-N-méthylpyridinium-4-yl- vinyl) phényl] phénylamine
Le composé titre ou composé TP-2Py, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = R3 = H, Ri = R2 = groupe de formule (II-5) où R5 = -CH3, est synthétisé en partant de la 4, 4 ' -diiododiphénylamine ou composé 1, selon le schéma montré sur la figure 1.
La 4 , 4 ' -diiodophénylamine a préalablement été obtenue comme décrit par Kajigaeshi dans Bull. Chem. Soc. Jpn . 1998, 61(2), 600-602 [7].
Synthèse de la 4, 4 ' -diiodotriphénylamine ou composé 2
Dans de 1 ' acétonitrile sec (6 mL) , on dissout de la 4, 4 ' -diiododiphénylamine (406 mg, 1 éq.) et du 2- (triméthylsilyl) benzène trifluorométhane- sulfonate (244 μL, 602 mg, 1,04 éq.). Après 1 minute d'agitation, du CsF finement broyé est ajouté (295 mg, 2,01 éq.) et la suspension résultante est agitée pendant 3 jours à l'abri de la lumière. Puis la solution est évaporée, reprise dans le n-hexane et filtrée sur silice. Après évaporation des eaux-mères, on isole le composé 2 sous la forme d'une fine poudre blanche (Rdt : 86%) . Synthèse de la 4, 4 ' -Ms (2- ( (E) -pyridin-4-yl) vinyl) - triphénylamine ou composé 3
Le composé 2 (108 mg, 220 μmol) , de l'acétate de palladium (6 mg, 12%) et de la tris- (o-tolyl) phosphine (15 mg, 22%) sont introduits dans un réacteur sec qui est ensuite purgé avec de l'azote. Puis 70 μl de 4-vinylpyridine (660 μmol) et 3 mL d'un mélange triéthylamine/diméthylformamide (TEA/DMF : 2/1, v/v) dégazé sont ajoutés successivement. Le mélange est agité à 85-900C, sous azote pendant 3 heures. Puis, sa température est ramenée à la température ambiante et les solvants sont évaporés sous vide poussé. Le résidu huileux est dilué avec du dichlorométhane et lavé avec de l'eau plusieurs fois. Puis la phase organique est séchée et concentrée. Le résidu huileux est purifié par chromatographie sur gel de silice (élution : dichlorométhane/méthanol 100/0 à 95/5, v/v) . On obtient ainsi 79 mg (200 mmol) du composé 3 sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 80%) .
Synthèse de TP-2Py
Le composé 3 (37 mg, 82 μmol) est dissous dans 3 mL d'un mélange d' iodométhane/méthanol (2/1, v/v) et la solution ainsi obtenue est chauffée à reflux pendant 24 heures. Puis le brut est concentré, repris à l'éther et filtré. Le solide rouge obtenu est lavé plusieurs fois à l'éther et au pentane pour donner 52 mg (71 μmol) de TP-2Py sous la forme d'une poudre rouge foncé (Rdt : 87%) . RMN 1H (DMSO-de, 300 MHz) δ : 8,80 (d, 6, 6 Hz, 4H) ;
8,17 (d, 6, 6 Hz, 4H) ; 7, 97 (d, 16,2 Hz, 2H) ; 7,70 (d,
8,7 Hz, 4H) ; 7,35-7,46 (m, 4H) ; 7,08-7,28 (m, 7H) ; 4,23 (s, 6H) . RMN 13C (DMSO-de, 75 MHz) δ : 153,1 ; 148,8 ; 146,2 ;
145.4 ; 140, 6 ; 130, 6 ; 130,2 ; 126, 6 ; 125,8 ; 123, 6 ;
123.5 ; 122,0 ; 47,2.
1.2. Iodure de tris- [4- (2-N-méthylpyridinium-4- yl-vinyl) phényl] aminé
Le composé titre ou composé TP-3Py, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = H, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (II-5) où R5 = -CH3, est synthétisé en partant de la tris- (4-bromophényl) aminé ou composé 4, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 2.
Synthèse de la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] - aminé ou composé 5
Le composé 4 (1 g, 2,07 mmol, 1 éq.), de l'acétate de palladium (23 mg, 0,104 mmol, 0,05 éq.) et de la tris-o-tolylphosphine (95 mg, 0,311 mmol, 0,15 éq.) sont introduits dans un réacteur sec qui est ensuite purgé avec de l'azote. Un mL de 4-vinylpyridine
(0,98 g, 9,32 mmol, 4,5 éq.) et 5,4 mL d'un mélange
TEA/DMF (2/1, v/v) sont ajoutés successivement. Le mélange est agité à 85-900C, sous azote pendant
25 heures. Puis, sa température est ramenée à la température ambiante et les solvants sont éliminés sous vide poussé. Le produit est dilué avec 120 mL de dichlorométhane, lavé avec 3 x 30 mL d'une solution de carbonate de sodium saturée puis séché. Le volume de dichlorométhane est réduit et le produit est précipité par addition d'hexane et refroidissement à 4°C. On obtient ainsi 0,943 g du composé 5 sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 85,5%) .
Synthèse de TP-3Py
De 1 ' iodométhane en large excès (1,5 mL) est ajouté à une suspension du composé 5 (64 mg, 0,115 mmol) dans 1,5 mL de méthanol. On laisse le mélange, qui prend immédiatement une couleur rouge profond, toute une nuit sous agitation. Le produit est ensuite précipité par addition d'éther diéthylique et filtré.
On obtient ainsi 0,103 g de TP-3Py sous la forme d'un solide rouge (Rdt : 91%) .
Formule brute : C42H39N4 3+, 31" M : 980,5 RMN 1H (DMF d7) δ (ppm) : 4,50 (s, 9H, Me) , 7,28 (d,
J = 8,4Hz, 6H) ; 7, 64 (d, J = 16,2Hz, 3H) ; 7, 90 (d, J = 8,7Hz, 6H) ; 8,20 (d, J = 16,2Hz, 3H) 8,40 (d, J = 6, 6Hz, 6H) ; 9,06 (d, J = 6, 6Hz, 6H) . RMN 13C (DMF d7) δ (ppm) : 47,0 ; 122,3 123,7 r 124, 6 ; 130,1 ; 131,3 ; 140,5 ; 145,3 ; 148,3 153,4 MS (ESI+) : 363,11 ( [C42H39N4I ] 2+/2, 10%) 199, ,75 ( [C42H39N4] 3+/3, 100%) . Exemple 2 : Propriétés de TP-2Py et de TP-3Py
2.1. Solubilité dans l'eau
TP-2Py et TP-3Py présentent une solubilité dans l'eau élevée puisque des solutions aqueuses de ces composés 0,5 à 1 mM ont pu être obtenues sans que ne se forme un quelconque précipité. Cette solubilité aqueuse est un réel avantage, notamment pour des applications biologiques, puisqu'elle permet de travailler en milieu aqueux et de ne pas utiliser de solvant organique comme le DMSO qui, bien que classiquement employé dans ce domaine, est délétère pour les membranes cellulaires.
De plus, contrairement aux marqueurs couramment utilisés en biologie comme les dérivés des cyanines (thiazole orange par exemple) qui forment des agrégats en milieu aqueux, les solutions aqueuses de TP-2Py et TP-3Py suivent la loi de Beer-Lambert, au moins jusqu'à une concentration de 50 μM. A titre comparatif, le thiazole orange se trouve, dans les conditions où il est classiquement employé, c'est-à-dire à une concentration de 36 μM et à une température de 200C, sous forme de dimères (Kubista et al., Biopolymers 1998, 46_, 39-51 [8]).
2.2. Propriétés d'absorption monophotonique et d' émission
L'étude des propriétés d'absorption monophotonique de TP-2Py et TP-3Py a mis en évidence que ces deux composés présentent une forte absorption dans le domaine visible et que leurs coefficients d'extinction molaire (ε) sont, dans le glycérol, de 37400 L/mol.cm (à 474 nm) pour la TP-2Py et de 66000 L/mol.cm (à 474 nm) pour la TP-3Py.
Les longueurs d'onde maximales d'absorption de ces deux composés se situent dans la gamme de 450-500 nm et sont donc parfaitement compatibles avec l'utilisation des lasers Titane : Saphir que l'on emploie en microscopie biphotonique et qui sont généralement accordables dans la gamme spectrale de 750-900 nm.
Par ailleurs, des mesures de fluorescence réalisées sur TP-2Py et TP-3Py en solution dans un milieu aqueux (cacodylate de sodium 10 mM, pH 7,0) ont montré que la présence d'ADN dans ce milieu se traduit par un fort hypochromisme, d'environ 20%, de TP-2Py et de TP-3Py et par un déplacement vers le rouge de leurs spectres d'absorption, ce déplacement étant d'autant plus prononcé que la concentration en ADN des milieux est plus élevée.
Ces résultats, qui sont illustrés sur les figures 3 et 4, lesquelles représentent les spectres d'absorption, respectivement de TP-2Py et de TP-3Py, obtenus à partir de solutions 5 μM de ces composés, avant et après que ne leur soit ajouté un ADN duplex de 26 paires de bases de séquence autocomplémentaire (ci-après "ds26"), à des teneurs allant de 0,5 à 5 équivalents, indiquent une forte affinité de TP-2Py et TP-3Py pour l'ADN dans des conditions analogues aux conditions physiologiques.
La présence d'ADN dans un milieu aqueux contenant TP-2Py et TP-3Py s'est révélée avoir aussi pour effet d'exalter fortement les propriétés de fluorescence de ces composés à leur maximum d'émission de fluorescence, c'est-à-dire vers 660-680 nm.
Cet effet d'exaltation est illustré sur la figure 5 qui représente les spectres d'émission obtenus à partir d'une solution 3 μM de TP-3Py, avant et après que ne lui soit ajouté 1 équivalent de ds26, pour une excitation à 474 nm, ainsi que sur la figure 6 qui représente les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo) obtenues à partir de solutions 3 μM de TP-IPy (A), TP-2Py (U) et TP-3Py (4), également pour une excitation à 474 nm, en fonction du nombre d'équivalents de ds26 ajouté.
Cette dernière figure montre que l'intensité de la fluorescence émise par ces composés peut augmenter jusqu'à 20 fois en fonction du nombre d'équivalents d'ADN.
Des études de fluorescence analogues mais réalisées dans du glycérol, ont montré une exaltation encore plus prononcée des propriétés de fluorescence de TP-2Py et de TP-3Py, de l'ordre de 100 fois.
Il est à noter qu'une telle affinité vis-à- vis de l'ADN est rare chez les marqueurs classiquement utilisés en biologie, ce qui confère un grand intérêt à des composés tels que TP-2Py et TP-3Py, cette affinité garantissant a priori un niveau élevé de luminescence moléculaire dans un contexte cellulaire.
L'affinité de TP-2Py et de TP-3Py pour l'ADN a été déterminée par titration fluorométrique dans des conditions stringentes (tampon cacodylate de sodium cacodylate de sodium 10 mM, pH 7,0 additionné de NaCl 100 mM) et en utilisant ds26 comme ADN. Pour les deux composés, une constante de dissociation Kd de l'ordre du micromolaire a été obtenue, confirmant leur très forte affinité pour l'ADN.
2.3. Photostabilité
L'aptitude de TP-3Py à résister aux effets d'une irradiation a été testée et comparée à celle d'un fluorophore classiquement utilisé comme marqueur de l'ADN en microscopies à épifluorescence et confocale, à savoir le TO-PRO-3 (iodure de 1- (N, N, N-triméthylamino- propyl) -4- { 2- [3-méthyl-2, 3-dihydro- (benzo-1, 3-thiazole) -2-éthylidène] -vinyl } -quinolinium) .
Comme illustré par la figure 7, qui représente les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en unités arbitraires, en fonction du temps, exprimé en secondes, telles que mesurées pour le TP-3Py et le TO-PRO-3 au cours d'une irradiation par une lampe xénon-mercure de 150 W d'une trentaine de minutes, l'émission de fluorescence de TP-3Py est peu modifiée par l'irradiation, alors que celle du TO-PRO-3 chute de plus de 40%.
2.4. Propriétés d'absorption biphotonique
Les propriétés d'absorption biphotonique des composés selon l'invention ont été appréciées en utilisant la technique de fluorescence induite par deux photons (TPIF pour "Two-Photon-Induced Fluorescence) et au moyen d'une source laser femtoseconde Titane : Saphir à impulsions de 90 fs à 76 MHz pouvant être accordée à 750-840 nm. Les intensités TPIF relatives des composés selon 1 ' invention ont été mesurées relativement à un marqueur classique de référence, la fluorescéine, ainsi qu'à un composé structurellement très proche de TP-2Py et TP-3Py, la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] - aminé .
Dans un premier temps, les mesures ont été effectuées en utilisant TP-2Py et TP-3Py dans du glycérol, la fluorescéine et la tris- [4- (2-pyridin-4- yl-vinyl) phényl ] aminé étant, elles, respectivement dans de l'eau (pH > 10) et dans du dichlorométhane .
Comme le montre la figure 8, qui représente les variations de la section efficace d'absorption à deux photons δ, exprimée en Gδppert-Mayer, en fonction de la longueur d'onde (nm) telles qu'obtenues pour TP-2Py (H), TP-3Py (4), la tris- [4- (2-pyridin-4-yl- vinyl) phényl ] aminé (•) et la fluorescéine (Δ) , on observe un maximum relatif aux alentours de 820 nm pour TP-2Py et TP-3Py. Le maximum d'absorption à 2 photons se situe donc à une longueur d'onde inférieure à deux fois la longueur d'onde d'absorption à 1 photon (2 x 474 nm = 950 nm) ce qui indique que d'autres états excités, plus hauts en énergie participent au processus d'absorption à deux photons. Puis, les mesures ont été effectuées en utilisant TP-2Py et TP-3Py dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,3) additionné de 5 équivalents d'ADN de testicule de hareng. Comme le montre la figure 9, les spectres obtenus pour TP-2Py et TP-3Py en présence d'ADN sont identiques à ceux précédemment observés dans le glycérol et ce, pour toutes les longueurs d'onde d'excitation.
Les propriétés optiques de TP-2Py et TP-3Py sont résumées dans le tableau I ci-après, dans lequel ε correspond au coefficient d'extinction molaire, exprimé en L/mol.cm, ΦF correspond au rendement quantique de fluorescence et δ correspond à la section efficace d'absorption à deux photons, exprimée en Gδppert-Mayer (GM) .
TABLEAU I
Figure imgf000045_0001
II apparaît que TP-3Py présente une importante section efficace d'absorption à deux photons puisque celle-ci atteint une valeur de 700 GM dans le glycérol et de 700 GM et en présence d'ADN. Cette valeur est très nettement supérieure à celles obtenues pour le DAPI (0,16 GM), pour la fluorescéine (38 GM) et pour la rhodamine 6G (100 GM) qui est pourtant considérée comme l'un des meilleurs fluorophores pour la microscopie bi-photonique .
Il y a lieu de noter que la tris- [4- (2- pyridin-4-yl-vinyl) phényl] aminé, qui est structurel- lement très proche de TP-3Py, présente comme cette dernière un maximum d'excitation vers 820 nm mais la valeur de sa section efficace d'absorption à deux photons n'est que de 58 GM selon la littérature et de 90 GM selon les mesures effectuées par les Inventeurs.
2.5. Etude en microscopie Afin de mettre en évidence les potentialités des composés selon l'invention pour l'imagerie de l'ADN, des cellules CHO Kl (Chinese Ovarian Hamster Kl) ont été traitées respectivement par TP-2Py, TP-3Py, du DAPI et des mélanges TP-2Py/DAPI et TP-3Py/DAPI, puis observées en microscopie par épi- fluorescence et en microscopie confocale laser.
Les cellules CHO-Kl, préalablement cultivées dans des puits, sur des supports de verre recouverts de polyornithine, renfermant un milieu de culture standard disponible commercialement, ont été fixées en utilisant une solution de formaldéhyde (4%) dans le PBS.
Les cellules ont ensuite été incubées, à température ambiante et pendant 20 minutes, en présence des marqueurs ou mélanges de marqueurs à tester (en solution aqueuse) , puis lavées au tampon PBS (NaCl 13mM, KCl 0,27 mM, KH2PO4 0,15 mM, Na2HPO4 0,8 mM, pH 7,4) pour éliminer l'excès de marqueur. Les concentrations de TP-2py et de TP-3Py ont été fixées à 2 μM, tandis que celle du DAPI a été fixée à 3 μM. Les cellules ont ensuite été préparées de façon conventionnelle pour les observations microscopiques.
Les observations par microscopie par épifluorescence ont été réalisées avec un microscope Nikon, Eclipse E 800, muni d'un objectif 6Ox (1.4) et d'un appareil numérique Nikon, DXM 1200, tandis que celles par microscopie confocale ont été réalisées avec un microscope Leica DM6000 comportant une unité SP2 équipée d'un objectif 63x (1.4) et d'un laser HeNe pour l'excitation des marqueurs. Comme le montrent les figures 1OA, 10B et
10C, qui correspondent à des images de cellules ayant été traitées par un mélange de TP-3Py et de DAPI, prises en microscopie d' épifluorescence au maximum d'émission de fluorescence du TP-3Py dans le cas de la figure 10A, au maximum d'émission de fluorescence du DAPI dans le cas de la figure 10B et en superposant ces images par un traitement informatique dans le cas de la figure 10C, on observe une intense fluorescence (dans le rouge) due au traitement au TP-3Py et cette fluorescence est localisée exclusivement au niveau du noyau, ce qui démontre encore une fois l'affinité remarquable que présente ce composé vis-à-vis de l'ADN. S 'agissant du cytoplasme, un très grand contraste est obtenu et aucun bruit de fond n'a été détecté. Par ailleurs, considérant l'intensité lumineuse au point focal de l'objectif du microscope, il ressort de l'observation que TP-3Py est très stable.
Des résultats analogues ont été obtenus pour les cellules traitées avec un mélange TP-2Py/DAPI comme en témoignent les figures HA, HB et HC.
D'autre part, comme le montrent les figures 12A à 12F, qui correspondent à des images de cellules ayant été traitées par TP-3Py, prises en microscopie à contraste de phase (figures 12A et 12D) , en microscopie confocale (figures 12B et 12E) et en superposant ces deux méthodes (figures 12C et 12F), au maximum d'émission de fluorescence de TP-3Py, ce dernier a permis d'obtenir, par couplage des microscopies à contraste de phase et confocale, des images de chromosomes en anaphase d'une très grande netteté et de haute résolution, avec une définition très claire des limites de la cellule.
Ainsi, en dépit du fait que les rendements quantiques obtenus in vitro pour TP-2Py et TP-3Py soient relativement moyens, il s'avère que, grâce à leur grande section efficace d'absorption à deux photons et leur faible rendement quantique à l'état libre, ces composés offrent un contraste important.
Ces composés émettent dans le rouge, ce qui est un net avantage sur les fluorophores émettant dans le bleu ou le vert car, non seulement l'utilisation de ces derniers s'accompagne d'interférences dues aux composants cellulaires qui fluorescent naturellement dans le vert, mais de surcroît la lumière bleu-vert est susceptible de causer des dommages aux cellules. Pour ces raisons, une meilleure détection peut être obtenue car la diffusion dans le milieu est plus limitée.
Exemple 3 : Composés utiles en fluorescence secondaire
3.1. 4- {5- [Jbis(4- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl) - vinyl]phényl)amino] -2- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl) - vinyl] phénoxy}butanoate d' éthyle
Le composé titre ou composé 12, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur -0(CH2)SC(O)OC2H5, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), est synthétisé à partir du 2-méthoxy-4-aminobenzoate de méthyle ou composé 6, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 13.
Synthèse du 2-méthoxy-4- (N,N-bis (4-méthoxycarbonyl- phényl) amino) benzoate de méthyle ou composé 7
Dans 30 mL de toluène sec et dégazé, on introduit de l'acétate de palladium (186 mg, 828 μmol, 5%) de la tris- tert-butylphosphine (7,7 mL, 2,48 mmol, 15% ; solution à 10% dans l'hexane (m/m)) . Après 15 minutes d'agitation, on ajoute du 4-bromobenzoate de méthyle (10,7 g, 49,7 mmol, 3 éq.), le composé 6 (3,0 g, 16,6 mmol, 1 éq.) et du carbonate de césium (13,5 g, 41,4 mmol, 2,5 éq.). La solution est chauffée à reflux pendant 17 heures, puis refroidie et diluée avec du dichlorométhane (100 mL) . La solution est filtrée sur Celite, évaporée et purifiée par chromatographie (élution avec un gradient de n-hexane/dichlorométhane 2/1, v/v, à dichlorométhane) pour donner 6,35 g du composé 7 sous la forme d'une poudre jaune clair (Rdt : 89%) .
Synthèse du (4- {bis [4- (hydroxyméthyl) phényl] amino } -2- méthoxyphényl) méthanol ou composé 8
A une suspension d'hydrure d'aluminium et de lithium (LiAlH4, 1,7 g, 45 mmol, 15 éq.) dans du tétrahydrofurane (THF) sec (30 mL) à -78°C, on ajoute au goutte-à-goutte une solution du composé 7 (1,35 g, 3 mmol) dans 20 mL de THF. On laisse la température du milieu revenir à température ambiante puis la réaction est chauffée au reflux sous agitation. Après 1 heure, la solution est refroidie à -78°C et diluée par du dichlorométhane, puis on verse lentement de l'eau (10 mL) . Le solide obtenu est filtré et lavé au dichlorométhane. Les eaux-mères sont lavées à l'eau et à la saumure puis séchées et concentrées pour donner 1,05 g (2,88 mmol) d'un composé pâteux (Rdt : 97%).
Synthèse du 4- [bis (4-formylphényl) amino] -2-méthoxybenz- aldéhyde ou composé 9
A une solution du composé 8 (27 mg, 74 μmol) dans du dichlorométhane (2 mL) , on ajoute du Mnθ2 (40 mg, 444 μmol) . La suspension obtenue est agitée pendant 48 heures à température ambiante puis elle est filtrée. Le solide obtenu est lavé au dichlorométhane. Les eaux-mères sont ensuite concentrées pour donner 25 mg du composé 9 sous la forme d'un solide jaune (Rdt : 91%) Synthèse du 4- [bis (4-formylphényl) amino] -2-hydroxybenz- aldéhyde ou composé 10
A une suspension de chlorure d'aluminium (AICI3, 575 mg, 4,31 mmol, 5 éq.) dans du dichlorométhane (10 mL) à -100C, on ajoute au goutte-à- goutte une solution du composé 9 (310 mg, 860 μmol) dans du dichlorométhane (5 mL) . Le mélange est agité à reflux pendant 24 heures. Il est ensuite versé dans un mélange d'eau et de glace, puis il est vigoureusement agité 10 minutes. Il est extrait au dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau et à la saumure, séchée et concentrée pour donner un solide que l'on triture dans de l'hexane pour donner 260 mg (754 μmol) du composé 10 sous la forme d'une poudre jaune (Rdt : 87%) .
Synthèse du 4- { 5- [bis (4-formylphényl) amino] -2-formyl- phénoxyjbutanoate d'éthyle ou composé 11
A une solution du composé 10 (280 mg, 810 μmol) dans du DMF sec (12 mL) , on ajoute du K2CO3
(1,1 g, 8,0 mmol, 10 éq.) . La réaction est agitée pendant 15 minutes et du bromobutanoate d'éthyle
(175 μL, 1,22 mmol, 1,5 éq.) est lentement ajouté. Le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante puis concentré. Le résidu est repris dans du dichlorométhane et de l'eau. Le mélange biphasique est décanté, et la phase organique est lavée plusieurs fois à l'eau. Après séchage et concentration, on obtient un solide qu'on purifie par chromatographie (élution avec un gradient de méthanol de 0 à 1% dans du dichlorométhane) pour donner 275 mg (530 μmol) du composé 11 sous la forme d'une poudre orange (Rdt
Synthèse du composé 12 A une suspension d'hydrure de sodium
(dispersion à 60%, 51 mg, 1,26 mmol, 3,60 éq.) et de (2-méthylbenzothiazole) phosphonate de diéthyle (328 mg, 1,15 mmol, 3,3 éq.) dans du THF sec (10 mL) , on ajoute au goutte-à-goutte le composé 11 (160 mg, 348 μmol) en solution dans du THF (12 mL) . Le mélange est agité à température ambiante pendant 3 jours, puis il est dilué par du dichlorométhane, lavé à l'eau et à la saumure. La phase organique est séchée et concentrée. Le résidu obtenu est trituré dans le pentane pour donner 220 mg (257 μmol) du composé 12 (Rdt : 74%) .
RMN IH (CDC13, 300 MHz) δ : 1,27 (t, 6,9, 3H) ; 2,24
(quint, 6,9 Hz, 2H) ; 2,60 (t, 6,9 Hz, 2H) ; 4,00 (t,
6,9 Hz, 2H) ; 4,19 (q, 6,9 Hz, 2H) ; 6,72 (d, 1,8 Hz, IH) ; 6,79 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz,
4H) ; 7,33-7,65 (mult, 16H) ; 7,83 (d, 16,2 Hz, IH) ;
7,89 (mult, 3H) ; 8,01 (d, 8,4 Hz, IH) ; 8,03 (d,
8, 4 Hz, 2H) .
RMN 13C (CDC13, 75 MHz) δ : 14,2 ; 24,5 ; 30,8 ; 60,6 ; 67,5 ; 108,0 ; 117,1 ; 120,3 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ;
122,5 ; 122,7 ; 122,8 ; 124,6 ; 125,1 ; 125,3 ; 126,2 ;
126,3 ; 128,7 ; 130,8 ; 132,4 ; 134,3 ; 136,8 ; 147,6 ;
148,8 ; 154,0 ; 154,1 ; 157,8 ; 167,1 ; 168,2 ; 173,0. 3.2. Acide 4- {5- [bis (4- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol- 2-yl)vinyl]phényl)amino] -2- [ (E) -2- (1 , 3-benzothiazol-2- yl) vinyl] phénoxy}butanoïque
Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 13, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe espaceur -0 (CH2) 3COOH, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 12 tel qu'obtenu au point 3.1. ci-dessus. Pour ce faire, le composé 12 (60 mg,
0,070 mmol) est dissous dans du THF (2 mL) . On y ajoute 2 mL d'une solution aqueuse saturée en LiOH, et le mélange biphasique obtenu est vigoureusement agité pendant 24 heures. Puis le mélange est acidifié jusqu'à pH 2 et dilué par du dichlorométhane . Après décantation, la phase organique est séparée, lavée à l'eau puis à la saumure, séchée et concentrée pour donner un résidu qu'on triture dans l'éther et le pentane. On obtient ainsi 53 mg (63 μmol) du composé 13 (Rdt : 90%) .
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ : 2,32 (br, 2H) ; 2,59 (br,
2H) ; 4,01 (t, 6.0 Hz, 2H) ; 6,67 (d, 1.8 Hz, IH) ;
6,75 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,21 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,30-7,65 (mult, 16H) ; 7,86-7,91 (mult, 3H)
8,01-8,04 (mult, 3H) ; 8,14 (d, 15.0 Hz, IH).
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 25,0 ; 32,0 ; 68,6 ; 107,5 ;
116,9 ; 119,4 ; 120,1 ; 121,0 ; 121,5 ; 122,2 ; 122,8 ;
124,6 ; 125,0 ; 125,2 ; 126,5 ; 128,5 ; 128,7 ; 130,9 ; 132,8 ; 134,1 ; 134,3 ; 137,0 ; 147,5 ; 149,0 ; 153,1 ;
153,9 ; 158,1 ; 167,2 ; 168,7. 3.3. 4-{5- [Jbis(4- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2- yl) vinyl]phényl)amino] -2- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2- yl) vinyl] phénoxy}butanoate de succinimidyle Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 14, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe espaceur -0 (CH2) 3C (0) O-succinimidyle, Ri = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 13 tel qu'obtenu au point 3.2. ci-dessus.
Pour ce faire, le composé 13 (40 mg, 50 μmol) , du N-hydroxysuccinimide (9 mg, 78 μmol) et du DCC (11 mg) sont dissous dans du dichlorométhane (1 mL) et le mélange est agité pendant 24 heures. Puis le milieu est évaporé, repris dans un minimum de dichlorométhane. La suspension laiteuse est filtrée, l'opération est répétée plusieurs fois. Les eaux-mères sont évaporées à sec pour donner le composé 14 sous la forme d'une poudre jaune orangée.
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ : 2,34 (quint, 6,3 Hz, 2H) ; 2,83 (s, 4H) ; 2,93 (t, 6,3Hz, 2H) ; 4,06 (t, 6,0 Hz, 2H) ; 6,73 (d, 1,8 Hz, IH) ; 6,80 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,35-7,65 (mult, 16H) ; 7,83 (d, 16,5 Hz, IH) ; 7,90 (mult, 3H) ; 8,00 (d, 8,4 Hz, 2H) ; 8, 02 (d, 8,4 Hz, IH) .
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 22,7 ; 25,6 (3C) ; 66,8 ; 108,0 ; 117,3 ; 120,2 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ; 122,7 ;
122.8 ; 124,6 ; 125,1 ; 125,3 ; 126,2 ; 126,4 ; 128,5 ; 128,7 ; 130,8 ; 132,3 ; 134,3 ; 138,9 ; 147,6 ; 148,8 ;
153.9 ; 154,0 ; 157,4 ; 167,2 ; 168,2 ; 168,3 ; 169,0. 3.4. (3- (8-bromooctyloxy) -{4- [ (E) -2- (benzo- thiazol-2-yl)vinyl] } -N,N-bis-{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2- yl) vinyl] phényl}aniline Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 16, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe espaceur -0 (CH2) 8Br, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 10 tel qu'obtenu au point 3.1. ci-dessus.
Synthèse du 2- (8-bromooctyloxy) , 4- [N,N-bis (4-formyl- phényl) ] aminobenzaldéhyde ou composé 15
Dans de l'acétone sèche (10 mL) , on dissout le composé 10 (100 mg, 290 μmol) , du 1, 8-dibromooctane
(800 μL, 1,18 g, 4,34 mmol, 15 éq.) et du carbonate de potassium (100 mg, 723 μmol, 2,5 éq.). La suspension blanche est agitée à 45°C pendant 24 heures. Puis, on ajoute de l'éther et le mélange est filtré et lavé à l'éther. Après réunion et concentration des eaux-mères, le résidu est purifié par chromatographie sur colonne
(élution : dichlorométhane/n-hexane 1/1 à 4/1, v/v, puis dichlorométhane et dichlorométhane/méthanol
99,5/0,5, v/v) . Le composé 15 est obtenu sous forme d'un solide jaune (Rdt : 84%) .
Synthèse du composé 16
Du diéthyl (2-méthylbenzothiazole) phospho- nate (186 mg, 652 μmol, 3,5 éq.) est dissous dans du THF sec (5 mL) . On ajoute de l'hydrure de sodium
(dispersion à 60%, 25 mg, 625 μmol, 3,3 éq.) . Après environ 15 minutes, le composé 15 (100 mg, 186 μmol) en solution dans du THF sec (5 mL) est ajouté au goutte-à- goutte. Après 24 heures d'agitation à température ambiante, le milieu est évaporé à sec et le résidu purifié par chromatographie (élution avec un gradient de méthanol de 0 à 0,5% dans le dichlorométhane) pour donner, après évaporation, 98 mg (106 μmol) du composé 16 sous la forme d'une poudre orangée (Rdt : 57%) .
RMN 1H (CDCl3, 300 HMz) δ : 1,30-1,60 (br, 8H) ; 1,88 (br, 4H) ; 3,41 (t, 6,9 Hz, 2H) ; 3,94 (t, 6,3 Hz, 2H) ; 6,72 (br, IH) ; 6,77 (d, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,35-7,58 (mult, 16 H) ; 7,84 (d, 16,5 Hz, IH) ; 7,90 (mult, 3H) ; 8,01 (d, 7,6 Hz, IH) ; 8,03 (d, 7, 6 Hz, 2H) .
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 26,1 ; 28,1 ; 28,7 ; 29,0 ; 29,2 ; 32,8 ; 33,9 ; 68,6 ; 108,1 ; 116,9 ; 120,3 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ; 122,8 ; 122,9 ; 124,6 ; 125,1 ; 125,3 ; 126,2 ; 126,4 ; 128,6 ; 129,0 ; 130,8 ; 132,8 ; 134,3 ; 134,4 ; 138,8 ; 147,7 ; 148,8 ; 154,0 ; 154,1 ; 158,2 ; 167,1 ; 168,3.
3.5. (3- (8- (2,5-dioxo-l-aza)cyclopent-3-ényl) - octyloxy) -{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] }-N,N-bis- {4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] phényl}aniline
Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 17, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur - (CH2) 8-succinimidyle, Ri = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 16 tel qu'obtenu au point 3.4. ci-dessus. Dans 50 μL de DMF sec, on dissout le composé 16 (24 mg, 25.8 μmol) , du rac-7-oxabicyclo- [2.2.1 ] - heptène-2, 3-dicarboxylic imide (5 mg, 28,4 μmol, 1,1 éq.) et du K2CO3 (18 mg, 129 μmol, 5 éq.) . La suspension blanche obtenue est agitée à 55°C pendant 24 heures. L'avancement de la réaction est suivie par CCM. Une fois la disparition du produit de départ constatée, le mélange est dilué par du dichlorométhane et lavé plusieurs fois à l'eau. La phase organique est séchée et concentrée. Le résidu est remis en solution par 5 mL d'anisole et chauffé à reflux pendant 2 heures. Puis l'anisole est chassé sous vide et le résidu est purifié par CCM préparative. On obtient ainsi 11 mg (12 μmol) du composé 17 sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 47%) .
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ : 1,30-1,60 (br, 10H) ; 1,85
(quint, 2H) ; 3,52 (t, 7,2 Hz, 2H) ; 3,93 (t, 6,3 Hz,
2H) ; 6,67 (s, 4H) ; 6,72 (d, 1,8 Hz, IH) ; 6,77 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,33-7,60
(mult, 16 H) ; 7,84 (d, 16,2 Hz, IH) ; 7,90 (mult,
3H) ; 8,01 (d, 7,6 Hz, IH) ; 8,03 (d, 7,6 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 26,1 ; 26,6 ; 28,5 ; 29,0 ;
29,1 ; 29,2 ; 37,9 ; 68,6 ; 108,0 ; 116,9 ; 120,4 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ; 122,7 ; 122,9 ; 124,4 ; 125,0 ;
125,2 ; 126,3 ; 126,4 ; 128,7 ; 128,9 ; 130,6 ; 132,7 ;
134,0 ; 134,4 (2C) ; 136,8 ; 147,6 ; 148,9 ; 153,9 ;
154,0 ; 158,1 ; 167,3 ; 168,6 ; 171,0. 3.6. (3- (9-bromononyloxy) -4-{4- [ (E) -2- (pyridin-4- yl)vinyl]phényl}-N,N-.bis-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) - vinyl] phényl}aniline
Le composé titre ou composé 22, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur -0(CH2) 9Br, Ri = R2 = R3 = groupe de formule
(III-5), est synthétisé à partir de la
3-méthoxytriphénylamine ou composé 18, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 14.
Synthèse de l'acétate de 3- (N, N-diphénylamino) phényle ou composé 19
A une solution de composé 18 (1,012 g, 3,67 mmol) dans du dichlorométhane sec (10 mL) refroidi à -78°C, on ajoute goutte-à-goutte une solution molaire de BBr3 (5,5 mL, 5,5 mmol, 1,5 éq.) sur 45 minutes. La suspension ambrée résultante est agitée pendant 1 heure à température ambiante. Le milieu réactionnel est évaporé, redissous dans un mélange pyridine/anhydride acétique (6/4,5, v/v) et chauffé à reflux pendant 1 heure. Après refroidissement à température ambiante, le mélange est dilué par du dichlorométhane et lavé par de l'acide chlorhydrique 10 mM jusqu'à acidification de la phase aqueuse, Na2CO3 2% (m/v) et de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4, réduite à 5 mL et filtrée sur un peu de silice. Après séchage, on obtient 1,046 g (3,45 mmol) du composé 19 sous la forme d'une huile incolore (Rdt : 94%) . Synthèse de l'acétate de 2-iodo-5- (N, N-bis- (4-iodo- phényl) amino) phényle ou composé 20
A une solution de composé 19 (77 mg,
254 μmol) dans du dichlorométhane, on ajoute de l'iode (449 mg, 1,77 mmol, 7 éq.) puis de l'oxyde de mercure rouge (384 mg, 1,77 mmol, 7 éq.), et la suspension obtenue est agitée à température ambiante pendant
3 jours. Puis la suspension est filtrée sur Celite et les eaux-mères lavées par une solution de Na2S2Û3 et de l'eau. Les eaux-mères sont filtrées une seconde fois sur silice puis évaporées à sec pour donner 153 mg du composé 20 sous la forme d'une poudre blanche (Rdt :
Synthèse de la 3-hydroxy-4- { 4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) - vinyl]phényl}-I\f,N-Ms-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) vinyl] - phényl } aniline ou composé 21
Dans 3 mL d'un mélange TEA/DMF sec (2/1, v/v) , on dissous de l'acétate de palladium (5 mg, 22 μmol) et de la tris o-tolylphosphine (20 mg, 66 μmol) . Après 10 minutes d'agitation, on ajoute de la 4-vinylpyridine (150 μl, 1,39 mmol, 5 éq.) et le composé 20 (278 μmol, 1 éq.) et le mélange est chauffé pendant 3 heures à 85°C sous atmosphère inerte. Puis le milieu est évaporé à sec, et l'huile rouge obtenue est lavée au pentane puis à l'éther. Le résidu pâteux rouge résiduel est purifié sur colonne de silice (élution avec un gradient dichlorométhane à dichlorométhane/ méthanol 97/3, v/v) pour donner une poudre ocre correspondant au composé 21 (Rdt : 61%) . Synthèse du composé 22
Le composé 21 (103 mg, 1 éq.), du
1, 9-dibromononane (730 μl, 20 éq.) et du carbonate de potassium (125 mg, 5 éq.) sont agités pendant 3 heures à température ambiante dans du DMF (1 mL) . Puis, le brut réactionnel est versé dans un grand volume d'éther
(100 mL) et filtré sur silice. La silice est abondamment lavée à l'éther. Puis elle est lavée par un mélange dichlorométhane/méthanol (95/5, v/v) et les eaux-mères sont concentrées et purifiées sur colonne de silice (élution avec un gradient dichlorométhane à dichlorométhane/méthanol 97/3, v/v) pour donner, après évaporation, environ 30 mg du composé 22 sous la forme d'une poudre rouge.
3.7. Tris-méthiodure de 3- (9
4 , 4' , 4"-tris (2- { (E) -pyridin-4-yl) vinyl) triphénylamine
Comme visible sur la figure 14, le composé titre ou composé 23, qui répond à la formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur -O(CH2)9Br, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (II-5) où R5 est -CH3, peut être synthétisé à partir du composé 22 tel qu'obtenu au point 3.6. ci-dessus.
Pour ce faire, le composé 22 (30 mq) est dissous dans 5 mL d'un mélange iréthanoi /iodomethane
(1/1, v/v) et le tout est chauffé à reflux pendant
18 heures. Le brut est ensuite évaporé et repris dans un minimum de méthane1. Une grande quantité d'éther est ajouté. Le précipité résultant est filtré et lavé à l'éther puis au pentane pour donner le composé 23 sous la forme d'une poudre rouge (Fdt: 82%). 3.8. 4- (N,N-b±s- (4- (2- (pyridin-4-yl) vinyl) ) - phényl) aminobenzoate de méthyle
Le composé titre ou composé 27, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = H, Ri = groupe espaceur -COOCH3, R2 = R3 = groupe de formule (III-5), est synthétisé à partir du 4-aminobenzoate de méthyle ou composé 24, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 15.
Synthèse du 4- (N^N-diphénylamino) benzoate de méthyle ou composé 25
A une solution de composé 24 (500 mg, 3,31 mmol) dans du toluène sec (20 mL) , du carbonate de césium (1,6 g, 4,91 mmol), de l'acétate de palladium
(50 mg, 0,22 mmol), de la tris- tert-butylphosphine
(300 μl, à 10% dans de l'hexane, 0,15 mmol) et du bromobenzène (440 μl, 657,4 mg, 4,91 mmol) sont ajoutés sous azote. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 18 heures, puis les mêmes quantités de réactifs
(carbonate de césium, palladium et phosphine) sont de nouveau ajoutées et le mélange est à nouveau chauffé pendant 18 heures. A la fin de la réaction, le brut est filtré sur Celite et dilué à l'acétate d'éthyle. Les eaux-mères sont lavées à la saumure puis à l'eau et enfin séchées sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange n-hexane/AcOEt 85/15, v/v) . On obtient ainsi le composé 25 sous la forme d'une huile jaune qui cristallise après refroidissement à -4°C (Rdt : 91%). Synthèse du 4- (N,N-bis- (4-bromophényl) amino) benzoate de méthyle ou composé 26
A une solution de composé 25 (550 mg, 1,81 mmol) dans le chloroforme, du W-bromosuccinimide est ajouté (708 mg, 3,98 mmol) . La réaction est chauffée pendant 2 heures puis refroidie à température ambiante. Le brut réactionnel est alors lavé à l'eau puis à la saumure et séché sur sulfate de magnésium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice
(élution avec un mélange n-hexane/AcOEt 85/15, v/v) . On isole le composé 26 sous la forme d'une poudre jaune
(Rdt : 98%) .
Synthèse du composé 27
A une solution de composé 26 (138 mg, 0,30 mmol) dans 15 mL d'un mélange TEA/DMF (2/1) sec et dégazé, on ajoute de la 4-vinylpyridine (94,6 mg, 0,90 mmol), de l'acétate de palladium (10 mg, 0,04 mmol) et de la tris o-tolylphosphine (40,7 mg, 0,13 mmol) sous azote. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 18 heures. A la fin de la réaction, le brut est filtré sur Celite et dilué à l'acétate d'éthyle. Les eaux-mères sont lavées à la saumure puis à l'eau et enfin séchées sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange dichlorométhane/ méthanol 95/5, v/v) . Le composé 27 est obtenu sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 59%) . 3.9. 4- (N,N-bis- (4- (2- (benzothiazol-2-yl) vinyl) ) - phényl) aminobenzoate de méthyle
Comme visible sur la figure 15, le composé titre ou composé 29, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = H, Ri = groupe espaceur -COOCH3, R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 25 tel qu'obtenu au point 3.7. ci-dessus.
Synthèse du 4- (N,N-bis- (4-formylphényl) amino) benzoate de méthyle ou composé 28
Du DMF (2,9 ml, 37,5 mmol) est refroidi à 00C et du trichlorure de phosphoryle (POCl3, 3,7 ml, 40 mmol) est ajouté goutte-à-goutte sous atmosphère d'azote. Le mélange est agité pendant 1 heure à 00C. A ce mélange, on ajoute le composé 25 (500 mg, 1,6 mmol) lentement et le mélange est agité vigoureusement à 95°C pendant 4 heures. Après refroidissement, le mélange réactionnel est versé dans de la glace et neutralisé par addition de soude concentrée. Le mélange obtenu est extrait plusieurs fois au dichlorométhane . La phase organique est lavée à la saumure puis à l'eau et enfin séchée sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange n-hexane/AcOEt 75/25) . Le composé 28 est obtenu sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 35%) .
Synthèse du composé 29
Dans du THF sec (10 ml), on dissout du (benzothiazol-2-yl) méthyl) ] phosphonate de diéthyle (comme décrit dans J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7192-7198 [9] ; 175 mg, 0,61 mmol) , du NaH (50 mg, 1,25 mmol, dispersion à 60%) et une goutte d'éther- couronne 18-C-6. La solution rouge résultante est refroidie à 00C et une solution de composé 28 (100 mg, 0,28 mmol) dans du THF sec (5 ml) est ajoutée au goutte-à-goutte. Le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. Puis, la réaction est arrêtée par ajout d'eau (2 mL) et diluée par du dichloro- méthane. Les phases organiques sont lavées à la saumure puis à l'eau et enfin séchées sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange AcOEt/AcOH, 99/1). Le composé 29 est obtenu sous la forme d'une poudre jaune (Rdt : 41%) .
Exemple 4 : Fonctionnalisation d'oligonucléotides
4.1. Fonctionnalisation par le composé 16 :
Un oligonucléotide présentant une fonction terminale, en position 3' ou 5 ' , de type thiophosphate et comportant des contre-ions de type ammonium (NH4 +) est dissous dans une solution d' éther-couronne 18-C-6 dans le méthanol (préalablement traité par une résine chélatante) à hauteur approximativement de 20 DO par mL . Le composé 16 (environ 2 mg) est ajouté, et le mélange est vortexé puis agité à 35°C pendant 6 heures.
Le mélange est ensuite soumis à une procédure de purification en suivant le mode opératoire ci-après : le mélange est tout d'abord évaporé, repris par de l'eau (1 mL) et extrait plusieurs fois au dichlorométhane puis à l'acétate d'éthyle jusqu'à ce que les phases organiques restent incolores. Le solvant non-aqueux résiduel est chassé sous vide, et la solution aqueuse est diluée par NaCl IM dans un mL mélange eau/acétonitrile 5/1 (v/v) . Cette solution est purifiée sur colonne d'exclusion stérique (exclusion < 1000 Da) et la première fraction éluante colorée est récupérée. Si nécessaire, la fraction obtenue est purifiée par HPLC selon les procédures habituelles. Classiquement, la purification se fait en employant une colonne de type phase inverse (RP-18) et un système d'élution eau/acétonitrile ou eau/méthanol, de pH proche de 7 et comprenant un sel dissous (environ 0,1M) de type acétate de (trialkyl) ammonium. Les fractions isolées sont lyophilisées trois fois au minimum.
4.2. Fonctionnalisation par le composé 14 :
Un oligonucléotide comportant une fonction aminé primaire est dissous dans un tampon NaHCC>3 à 0,5% à pH 9.5 à hauteur de 10 DO pour 500 μL . Le composé 14 (environ 1 à 2 mg) en solution dans du DMF (environ 300 μL, préalablement purifié des impuretés aminées) est ajouté. Le mélange est agité pendant 24 heures à 35°C.
Le mélange est ensuite soumis à une procédure de purification identique à celle décrite au point 4.1. ci-dessus. DOCUMENTS CITES
[1] Chung et al., J. Phys . Chem. B 1999, 103, 10741-10745
[2] Porrès et al., Organic Letters 2004, 6(1), 47-50 [3] Yang et al., Organic Letters 2004, 6(9), 1389-1392 [4] Yan et al., J. of Molecular Structure 2005, 733,
83-87 [5] Mac Laughin et al., J. Org. Chem. 1997, 62(3),
523-529
[6] Zongren et al., Org. Lett. 2004, 6, 2067-2070 [7] Kajigaeshi, Bull. Chem. Soc. Jpn . 1998, 61(2),
600-602 [8] Kubista et al., Biopolymers 1998, 46, 39-51 [9] J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7192-7198

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé répondant à la formule générale (I) ci-après :
Figure imgf000067_0001
dans laquelle :
R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe lieur, auquel cas :
1) si R4 représente un atome d'hydrogène, alors :
• R1 représente un groupe lieur ou un groupe de formule (II) ci-après :
Figure imgf000067_0002
dans laquelle : * Qi représente :
- un groupe hétérocyclique de formule (i: ci-après :
Figure imgf000067_0003
où R5 représente un groupe hydrocarboné ; l'un quelconque de Re à Rio représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de Re à Rio représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné ; ou un groupe hétérocyclique de formule (ii) ou (iii) ci-après :
Figure imgf000068_0001
( ϋ ) ( iϋ ) où R5 représente un groupe hydrocarboné ;
10 l'un quelconque de Rn à Ri7 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de Rn à Ri7 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un
15 groupe hydrocarboné, R12, R14 et R16 pouvant aussi former, respectivement avec Rn et/ou Ri3, R13 et/ou Ri5, et avec Ri5 et/ou Ri7, un groupe pontant ; ou un groupe hétérocyclique de formule (iv)
20 ci-après :
Figure imgf000068_0002
où l'un quelconque de Ris à R25 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de Ris à R25 représentent, indépendamment les
5 uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R19, R21, R23 et R25 pouvant aussi former, respectivement avec Ris et/ou R20, R20 et/ou R22, R22 et/ou R24, et avec R24 et/ou Ris, un groupe pontant ; ou
10 - un groupe hétérocyclique de formule (v) ci-après :
Figure imgf000069_0001
où R5 représente un groupe hydrocarboné ; W représente un atome d'oxygène ou de soufre
15 ou un groupe -N(R3i)- où R31 est un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, ou un groupe -C(R3i) (R32)- où R31 et R32 sont, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné ; R30
20 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que R26 à R29 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R27 pouvant aussi
25 former avec R26 et/ou R28 un groupe pontant, R28 pouvant lui-même former avec R29 un groupe pontant ;
* a vaut 0 (auquel cas A est absent) ou 1 (auquel cas A est présent) ;
* A et B représentent les groupes ci-après :
Figure imgf000070_0001
dans lesquels R33 à R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R33 et R36 pouvant aussi former chacun avec R34 et/ou R35 un groupe pontant ; lorsque Ri représente un groupe de formule (II) ci-avant, alors R2 représente également un groupe de formule (II) ci-avant tandis que, lorsque Ri représente un groupe lieur, alors R2 représente un groupe de formule (III) ci-après :
Figure imgf000070_0002
dans laquelle :
* Q2 représente :
- un groupe hétérocyclique répondant à l'une quelconque des formules (i) à (v) ci-avant ; ou - un groupe hétérocyclique de formule (vi) ci-après :
Figure imgf000071_0001
où Rβ à Rio ont la même signification que dans la formule (i) ci-avant ; ou - un groupe hétérocyclique de formule (vii) ou (viii) ci-après :
Figure imgf000071_0002
(vi i ) (vi i i ) où Rn à Ri7 ont la même signification que dans les formules (ii) et (iii) ci-avant ; ou un groupe hétérocyclique de formule (ix) ci-après :
Figure imgf000071_0003
où W, R26 à R30 ont la même signification que dans la formule (v) ci-avant ; * a, A et B ont la même signification que précédemment ; lorsque Ri représente un groupe lieur, alors R3 représente un groupe de formule (III) ci-avant tandis que, lorsque Ri représente un groupe de formule (II) ci-avant, alors R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (II) ci-avant ;
2) si R4 représente un groupe lieur, alors Ri et R2 représentent un groupe de formule (III) ci-avant tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (III) ci-avant ; dans laquelle le groupe lieur est un groupe fonctionnel apte à permettre le greffage par réaction chimique du composé sur une biomolécule, ou un groupe hydrocarboné comprenant un tel groupe fonctionnel, et dans laquelle chacun des groupes hydrocarbonés sus-mentionnés peut être substitué par un ou plusieurs substituants, identiques ou différents, et comprendre un ou plusieurs hétéroatomes .
2. Composé selon la revendication 1, qui répond à la formule générale (I) dans laquelle R4 représente un atome d'hydrogène, Ri et R2 sont identiques et représentent un groupe de formule (II), tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (II) identique à Ri et R2.
3. Composé selon la revendication 2, dans lequel le groupe de formule (II) constituant Ri et R2 est un groupe où a vaut 0, R35 et R36 de B représentent des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que Qi a la même signification que précédemment.
4. Composé selon la revendication 3, dans lequel le groupe de formule (II) constituant Ri et R2 est un groupe où Qi est un groupe de formule (i) dans laquelle R5 à Rio ont la même signification que précédemment, ou bien un groupe de formule (v) dans laquelle R5, W et R26 à R30 ont la même signification que précédemment.
5. Composé selon la revendication 4, dans lequel le groupe de formule (II) constituant Ri et R2 est choisi parmi : (a) les groupes de formule (II-l) ci-après :
Figure imgf000073_0001
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4 et, de préférence, méthyle ou éthyle, tandis que Re à Rg, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (b) les groupes de formule (II-2) ci-après :
Figure imgf000073_0002
: n-2 ) dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que Re à R8, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (c) les groupes de formule (II-3) ci-après :
Figure imgf000074_0001
( 11 - 3 ) dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que Re, R7, R9, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; et
(d) les groupes de formule (II-4) ci-après :
Figure imgf000074_0002
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R26 à R29, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
6. Composé selon la revendication 5, dans lequel le groupe de formule (II) constituant Ri et R2 est un groupe de formule (II-5) ci-après :
Figure imgf000075_0001
où R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
7. Composé selon la revendication 5 , qui répond à la formule générale (I) dans laquelle Ri et R2 représentent un groupe de formule (II-5) où R5 représente un groupe méthyle, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (II-5) identique à Ri et R2.
8. Composé selon la revendication 7, qui est choisi parmi les halogénures et, de préférence, les iodures de bis- [4- (2-N-méthyl-pyridinium-4-yl-vinyl) - phényl ] phénylamine et de tris- [4- (2-N-méthylpyridinium- 4-yl-vinyl) phényl] aminé .
9. Composé selon la revendication 1, dans lequel : • soit R4 représente un atome d'hydrogène, auquel cas Ri représente un groupe lieur, R2 et R3 sont identiques et représentent un groupe de formule (III) telle que précédemment définie ; • soit R4 représente un groupe lieur, auquel cas Ri et R2 représentent un groupe de formule (III) telle que précédemment définie, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou encore un groupe de formule (III) identique à Ri et R2.
10. Composé selon la revendication 9, dans lequel, lorsque R4 représente le groupe lieur, alors celui-ci se trouve en α du groupe Ri.
11. Composé selon la revendication 9 ou la revendication 10, dans lequel le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 lorsque R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri et R2 lorsque R4 est un groupe lieur, est un groupe où a vaut 0, R35 et R36 de B représentent des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en Ci à C4, avantageusement méthyle ou éthyle, tandis que Q2 a la même signification que précédemment.
12. Composé selon la revendication 11, dans lequel le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 lorsque R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri et R2 lorsque R4 est un groupe lieur, est un groupe où Q2 représente un groupe de formule (vi) dans laquelle R6 à Rio ont la même signification que précédemment, ou un groupe de formule (iv) dans laquelle W, R26 à R3o ont la même signification que précédemment.
13. Composé selon la revendication 12, dans lequel le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 lorsque R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri et R2 lorsque R4 est un groupe lieur, est choisi parmi : (a) les groupes de formule (III-l) ci-après :
Figure imgf000077_0001
dans laquelle Re à Rg, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (b) les groupes de formule (III-2) ci-après :
Figure imgf000077_0002
dans laquelle Re à Rs, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ;
(c: les groupes de formule (III-3) ci-après :
Figure imgf000077_0003
dans laquelle Re, R7, Rg, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; et (d) les groupes de formule (III-4) ci-après :
Figure imgf000078_0001
dans laquelle R26 à R29, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
14. Composé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel R4 est un groupe lieur, tandis que Ri, R2 et R3 représentent tous un groupe de formule (III-5) ou (III-6) ci-après :
Figure imgf000078_0002
(III-5) (III-6)
15. Composé selon la revendication 14, qui est choisi parmi les composés suivants :
- 4- {5- [Ms (4- [ (E) -2- (l,3-benzothiazol-2- yl) -vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol-2- yl) -vinyl] phénoxyjbutanoate d' éthyle ;
- acide 4- { 5- [Ms (4- [ (E) -2- (1, 3-benzo- thiazol-2-yl) vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- (1, 3-benzo- thiazol-2-yl) vinyl] phénoxyjbutanoïque ; - 4- {5- [Ms (4- [ (E) -2- (l,3-benzothiazol-2- yl) vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- ( 1 , 3-benzothiazol-2- yl) vinyl] phénoxyjbutanoate de succinimidyle ;
(3- (8-bromooctyloxy) -{4- [ (E) -2- (benzo- thiazol-2-yl) vinyl] } -N,N-bis- { 4- [ (E) -2- (benzothiazol-2- yl) vinyl] phényl } aniline ;
- (3- (8- (2, 5-dioxo-l-aza) cyclopent-3- ényl)-octyloxy)-{4-[ (£')-2-(benzothiazol-2-yl)vinyl] } - N,N-bis-{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] phényl }- aniline ;
- la (3- (9-bromononyloxy) -4-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) vinyl] phényl } -N,N-bis- { 4- [ (E) -2- (pyridin- 4-yl) -vinyl] phényl } aniline ;
- la tris-méthiodure de 3- (9-bromononyl- oxy) -4, A'f 4"- tris (2- ( (E) -pyr idin-4-yl ) vinyl) triphényl- amine ;
- le 4- (N,N-bis- (4- (2- (pyridin-4-yl) - vinyl) ) phényl) aminobenzoate de méthyle ; et
- le 4- (N,N-bis- (4- (2- (benzothiazol-2-yl) - vinyl) ) phényl) aminobenzoate de méthyle.
16. Composition comprenant au moins un composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, en solution dans un solvant.
17. Utilisation d'au moins un composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour le marquage d'une biomolécule .
18. Utilisation d'une composition selon la revendication 16 pour le marquage d'une biomolécule.
19. Biomolécule marquée par au moins un composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
20. Biomolécule selon la revendication 19, qui est un acide nucléique, une protéine, un polypeptide ou un fragment de ceux-ci.
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