WO2008055671A2 - Verfahren zur aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden zielsubstanz - Google Patents

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Jochen Peter
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a method for purifying at least one target substance to be detected which occurs or is formed during cell cultivation in a cell culture medium in which magnetic, surface-functionalized particles, so-called beads, are added to the cell culture medium on the surface thereof selectively attaches the target substance and selected by applying a magnetic field, the particles containing the target substance from the cell culture medium.
  • Generic processes are preferably used for the preparative isolation of substances which are released by cells into a cell culture medium in order to be able to study cell properties as well as their further growth behavior.
  • study of tumor cells whose uncontrolled cell growth is responsible for the most common cause of death in humans.
  • a responsible therapy to combat a tumor detected in humans it is incessantly first to determine the type of tumor, for example, it is a non-invasive, invasive tumor or ductal carcinoma in situ, etc ..
  • the type of tumor is crucial for the further course of therapy.
  • the background to this is that tumor cells change their properties in the course of progression.
  • the non-invasive cancer cell line MCF-7 has an estrogen receptor, so that these types of tumors can be treated with an inhibitor of the estrogen receptor, for example with tamixofen.
  • an inhibitor of the estrogen receptor for example with tamixofen.
  • the progression of a tumor is triggered by mutations, which in turn are caused by external factors such as e.g. Low oxygen (hypoxia) can be caused.
  • external factors such as e.g. Low oxygen (hypoxia) can be caused.
  • tumor cells In addition to the cell nature that tumor cells not only provide receptors on their surface that undergo major changes in their nature, effect and number due to the mutation, tumor cells also alter their behavior in the secretion of various regulatory peptides and proteins.
  • SELDI-TOF-MS technology Surface Enhanced Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • the samples to be examined are placed on a chip with a mostly hydrophobic surface of the size of 3 mm 2 .
  • the proteins bound on the chip are subsequently ionized by laser bombardment, detected by mass spectrometry and graphically displayed in a 2-dimensional plot.
  • various cancer cell lines could be compared.
  • a limiting factor is the insufficient sensitivity of this technology.
  • the sensitivity limit for this system is a maximum of 300 nM, which is why SELDI-TOF-MS technology is usually only used for profiling serum samples.
  • particles with hydrophobic surfaces For the binding of as many different peptides or proteins from a solution, such as plasma, serum, urine or cell culture medium, particles with hydrophobic surfaces have prevailed. These particles bind proteins via hydrophobic interaction and are therefore able to bind a broad spectrum of peptides or proteins.
  • RP-beads magnetic microparticles with hydrophobic surfaces
  • RP-beads are increasingly used for desalination and accumulation of peptides and proteins, for example from serum.
  • Serum consists of a variety of substances that occur in very different concentrations.
  • albumin is present in a concentration in the mg / ml range, while e.g. Interleukine occurs only in a concentration of ng / ml range.
  • these highly concentrated proteins interfere with the discovery of low-concentration proteins, such as those from cells growing in a cell culture, e.g. Tumor cells are released into the cell culture medium.
  • regulatory peptides and proteins are released only in very small quantities.
  • cells generally require fetal calf serum for their growth in a cell culture medium, in short FCS.
  • this addition provides the cells with the necessary growth factors, and on the other hand, additional proteins with very high concentrations are again added to the cell culture in this way.
  • these highly concentrated substances compete for the binding sites, so that low-concentration peptides and proteins can only be bound to a small fraction.
  • hydrophobic magnetic beads used with success in the examination of serum or plasma samples are therefore only of limited suitability for use in a cell culture medium for the selective separation of regulatory peptides and proteins which are released by tumor cells into the cell culture medium.
  • the invention is based on the object of a method for purifying at least one target substance to be detected, which are delivered by cells in a cell culture medium in which the cell culture medium magnetic, in their Surface functionalized particles, so-called beads, are added to the surface of which the target substance selectively accumulates and by application of a magnetic field containing the target substance particles selected from the cell culture medium to develop such that a selective separation of the target substance with an improved selectivity the cell culture medium should be possible, wherein the target substance is present with only a small amount or concentration in the cell culture medium.
  • the purification process should be used for targeted extraction of substances which are present during the incubation of cells, in particular tumor cells, inter alia by secretory processes in the cell culture medium and this in a low concentration of 10 "12 to 10 '7 M.
  • the method according to the invention for purifying at least one target substance to be detected, preferably of regulatory peptides and proteins which are delivered by cells, in particular tumor cells, in a cell culture medium consists in (a) carrying out the cell culture with the aid of a serum replacement and ( b) magnetic, surface-functionalized particles, so-called beads, are added to the cell culture medium, on the surface of which the target substance selectively accumulates and the application of a magnetic field selects the particles containing the target substance from the cell culture medium, characterized by the following method steps : (For better traceability of the individual main process steps, these keywords are edited in bold.)
  • the serum replacement to be provided is characterized in particular by the fact that it does not adversely affect cell growth, as with other products, but above all does not contain interfering substances with a size of less than 10 kDa.
  • fetal calf serum fetal calf serum
  • bovine or sheep serum just to name a few.
  • human serum can be used.
  • the natural serum is first centrifuged using ultrafiltration units, so that a supernatant, the so-called retentate, and a permeate are obtained.
  • the permeate depending on the filter size used, substances with particle sizes are smaller than the filter pore size used in each case.
  • membranes with suitably selected pore sizes or exclusion limits between 3 KDa and 100 kDa are used.
  • the supernatant obtained in the course of the first centrifugation run is mixed with a nutrient medium and subjected to renewed centrifugation.
  • This process which can also be referred to as a washing process, is advantageously repeated several times.
  • nutrient media such as Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, IMDM, IMEM, ERDF, RPM11640 or buffers such as PBS, MES, TRIS, etc., are suitable.
  • the recovered supernatant or retentate is subsequently centrifuged back, the vessel in which the supernatant is merely inverted and again subjected to centrifugation, the retentate now being conveyed out of the centrifugation unit into a collecting vessel for further processing and is added with the nutrient medium or buffer used in each case, preferably by adding sufficient nutrient medium that the originally used volume is achieved.
  • the so-called serum supernatant obtained in the above manner is subjected to sterile filtration for purposes of further purification and sterilization, preferably using a 0.2 ⁇ m filter, and then, as the serum substitute to be provided by the method according to the invention, into practicable amounts of, for example, 500 portioned aliquots and frozen for future use at - 2O 0 C to - 80 0 C.
  • the serum replacement is incorporated at a volume fraction of 1-10% in which the cells are kept for several days, i. 1 to 14 days, incubated.
  • a cell culture supernatant enriched with substances during the incubation of the mixture of cell culture medium, cells and serum replacement with substances is subsequently separated and, for purposes of transport or for storage purposes, filled into correspondingly prepared containers, so-called vials, and optionally frozen.
  • the cell culture supernatant is subjected to centrifugation by means of an ultrafiltration unit after appropriate thawing.
  • membranes with suitably selected pore sizes or exclusion limits between 3 kDa and 60 kDa are preferably used.
  • the filtrate obtained by the filtration is further purified by treatment with suitably functionalized magnetic beads.
  • the novel magnetic beads have on their functionalized surfaces a variety of dendrimers, each with up to 10 Branching on, ie ten generations, with the terminals of the last
  • Such new Magnetbeads can be produced or assembled, for example, in the following way:
  • the magnetic particles which are commercially available in different particle sizes in the nano or micro range, i. one or more nm or microns, there are, on the surfaces, for example, amino groups are applied.
  • the beads are placed in an organic solvent to which methyl acrylate has been added. After a contact time, which is preferably 2 to 48 hours of duration, the beads are separated from the reaction liquid and washed with fresh solvent. Subsequently, the thus prepared beads to form a first generation of dendrimer (G 1 -Beads) on their surface in an organic reaction liquid to which ethylenediamine has been added.
  • the beads react for another 2 to 48 hours, whereby the reaction process can be assisted by shaking the reaction bath. Subsequently, the beads are again separated from the reaction liquid, preferably using a magnet, and washed.
  • the process described above for the formation of the first generation of dendrimer G1 up to nine times.
  • dendrimer beads are suspended in a solvent with the addition of activated alkyl (C 1 -C 30) or aromatic derivatives, for example monoaromatics or polyaromatics, in order finally to achieve a modification with hydrophobic derivatives at the dendrimer chain end points, as a result of which Beads have hydrophobic properties. Therefore, these functionalized beads are also referred to as dendritic reversed-phase beads (G1-RP beads to G10-RP beads). For provision, the beads are separated from the reaction suspension, washed again and stored in distilled water or buffer such as PBS, MES, TRIS, etc.
  • activated alkyl C 1 -C 30
  • aromatic derivatives for example monoaromatics or polyaromatics
  • dendrimer RP beads obtained in the above manner are used for further purification and separation of the substances located within the sterile filtered cell culture supernatant, i.a. regulatory peptides and proteins secreted by the cells are added to the filtrate obtained after filtration with the addition of a buffer solution. This is followed by incubation with a residence time of 10 to 120 minutes at room temperature. In this case, the binding of the substances located in the cell culture supernatant to the modified terminal sites of the dendrimer structures takes place. Subsequently, the magnetic selection of the magnetic beads from the mixture and an elution of the bound to the dendritic structure to be detected substances, especially the secreted by the cells substances, especially the regulatory peptides and proteins.
  • other substances can be selectively selected, so for example. Metabolites, steroids, etc.
  • the core idea of the solution purification method according to the invention essentially comprises two fundamentally advantageous principles, namely the provision of a cell culture additive or serum substitute in which no disturbing small substances are present from the outset, which possibly compete with the target substances actually to be detected in the subsequent analysis, for other novel magnetic beads with a dendritic structure and a reversed phase (RP) phase, wherein the dendritic structure has up to ten branch points and thus optimizes the number of target substances to be detected for binding.
  • RP reversed phase
  • the resulting serum replacement (also called serum supernatant) is sterile filtered through an O.2 ⁇ m filter.
  • a dendritic structure is built up at each amino group via a branching reaction.
  • the principle for the synthesis of Starburstmolekülen is used until a tenfold branching in the dendritic structure to obtain so-called G1 to G10 beads is achieved.
  • the modification of the terminal NH 2 groups of the dendrimer beads is carried out, among other things, by means of microwave synthesis with alkyl chains of various lengths (CrC 30 ) via an activated group.
  • step (e) see step (c), i. Separate the beads from the reaction liquid with a magnet and wash beads 3x with 10 - 100 ml MeOH.
  • step (h) it is also possible to otherwise modify the dendrimer beads at the terminal sites of their dendrimer chains, for example by addition of antibodies.
  • the preprocessed dendritic aminobeads (G1-G10) are reacted in a buffer with a bifunctional linker for amino groups.
  • Glutardialdehyde, bis (sulfosuccinimidyl) suberate, succinimidyl suberate, dimethyl pimelidate or bifunctional PEG linker are preferably suitable as linkers.
  • the beads are preferably washed in a phosphate buffer.
  • antibodies are added to the buffer in a concentration of 1 mg / ml to 50 mg / ml buffer. After incubation for about 1-14 h at RT or + 4 ° C, the beads provided with antibodies are washed and stored in a buffer for further use at about + 4 ° C.
  • EXAMPLE 3 Carrying out a Purification of Secreted Substances of Tumor Cells Present in a Cell Culture Medium Using the Serum Replacement Obtained in Example 1 and the Magnetic Particles Modified in Example 2
  • the tumor cells are seeded in various containers in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) and 1-10% serum replacement obtained from fetal calf serum (FCS) and kept at 37 ° C. and 5% CO for several days 2 incubated -incurification.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FCS fetal calf serum
  • ZKÜ FCS serum replacement
  • the thawed ZKÜ is filtered through a membrane filtration unit.
  • the filtrate is further purified by means of the modified dendrimer beads (G1-G10) and concentrated. This is followed by elution and further work-up.
  • Target substances provided magnetic beads, as obtained by the solution according to the purification process.
  • the magnetic beads loaded with the target substances are added to a non-reducing or reducing gel electrophoresis sample buffer consisting of TRIS, urea, thiourea, LDS, SDS or CHAPS, etc.
  • the resulting mixture is preferably heated to 60 ° C. for 5 to 30 minutes, whereby the target substances are released from the beads.
  • the magnetic beads are separated from the mixture by means of a magnet and the remaining gel electrophoresis sample buffer is pipetted off with the target substances and placed in gel pockets of an electrophoresis gel (SDS-GeI, native gel, 2-D gel).
  • the target substances bound to the antibody particles are eluted by adding a carboxylic acid or a chaotropic high salt buffer.
  • the resulting by elution carboxylic acid eluate is evaporated (Speed-Vac) and taken up in a buffer solution.
  • the target substances contained in the buffer solution are subject to enzymatic digestion.
  • the digested target substances are then subjected to mass spectrometric identification via peptide mass fingerprint (PMF) or MS / MS spectra.
  • PMF peptide mass fingerprint
  • the magnetic beads charged with one or more target substances are washed and then fed to a buffer solution containing a protease for digestion of the target substances.
  • the digested target substances become subsequently subjected to mass spectrometric identification via peptides Mass Fingerprint (PMF) or MS / MS spectra.
  • PMF Mass Fingerprint
  • the magnetic beads are again washed and then added to a mixture of an organic solvent and / or carboxylic acids to obtain an eluate. Finally, the eluate is again subjected to a mass spectrometric measurement.
  • the target substances bound to the antibodies are eluted by adding a carboxylic acid or a high salt buffer. To the eluates, the dendritic reversed-phase beads are added. After incubation for 1-60 minutes, the beads are separated by means of a magnet and then washed several times with a buffer.
  • Cells such as tumor cells, are seeded into different containers depending on the experiment and incubated for several days at 37 ° C and 5% CO 2 content. Thereafter, the cells are washed with cell culture medium or buffer. Subsequently, the addition of cell culture medium without serum and a second incubation of 0 - 72 h. The respective cell culture supernatants are filled and optionally frozen at -20 0 C.
  • the binding of the substances to the modified dendrimer beads is carried out by adding them to the thawed cell culture supernatants. Subsequently, the beads are washed and these are revealed as in alternative 1, subjected to gel electrophoresis or, as shown in alternative 3, subjected to digestion with a protease and the digested substances subjected to MS or MS / MS analysis.
  • the functionalized magnetic beads described above represent a product which, as a substance having a sensory effect, can basically be used for a large number of different purposes.
  • One possible use is the above-described purification of target substances. For the production of such a product in general form the following measures have to be taken:
  • a branching reagent e.g. C
  • separating the beads from the organic solvent and washing the beads with an organic solvent d) reacting the beads with a connector such as e.g. E) separating the beads from the organic liquid and washing the
  • the reaction liquid is especially alcohol.
  • the beads are derivatized with a chemical or proteinogenic group, such as alkyl (CrC 3 o) or aromatic groups.
  • Suitable base bodies for the beads are stable magnetic particles which have a particle size of 10 nm-10 ⁇ m.
  • the group applied to the magnetic particles for purposes of their functionalization is preferably of at least one of the following Substance groups constructed: primary and secondary amino, prim., Sec. and unsym. Hydrazine, azide, phosphine, aldehyde, polyaldexyd, carboxylic, carboxylic, cyanate, isocyanate, thiocyanate, hydroxy, thiol, imino, hydrazide, piperidine, azomethine, semicarbazone , Hydrazone, cyanogen bromide, tosyl, epoxide-cyanuric acid chloride, cyanuric acid ester. Groups. Diamino, triamino, tetraamino heterocycles.
  • branching reagents provided in a solvent, wherein the branching reagents are selected from at least one of the following groups:
  • the charged with the branching agent magnetic particles are reacted with a bifunctional or trifunctional linker, wherein the linker is selected from one of the following composition: lysines, diaminoalkanes, diamino, triamino, tetraaminoheterocycles, diaminoethylene glycols, piperazine, allylamines , Triepoxides, tetraepoxides, tris (hydroxymethylamine).
  • the magnetic particles are derivatized with subsequent chemical groups as the end group or with peptides, proteins, glycans or glycoproteins of all types:
  • n-alkyl, sec-alkyl, tert-alkyl groups unsubstituted and substituted aryl, unsubstituted and substituted acyl, primary, secondary and tertiary amino, primary, sec. and unsym.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz, die während.einer Zellkultivierung in einem Zellkulturmedium auftritt oder gebildet wird, bei dem dem Zellkulturmedium magnetische, an ihrer Oberfläche funktionalisierte Partikel, so genannte Beads, zugegeben werden, an deren Oberfläche sich die Zielsubstanz selektiv anlagert und durch Applikation eines Magnetfeldes die mit der Zielsubstanz behafteten Partikel aus dem Zellkulturmedium selektiert werden. Das Verfahren zeichnet sich durch folgende Verfahrensschritte aus: Bereitstellen eines Serumersatzes, der aus einem natürlich vorkommenden Serum gewonnen wird und frei oder nahezu frei ist von niedermolekularen Substanzen, die eine Masse von kleiner gleich 60 kDa, insbesondere kleiner gleich 10 kDa, aufweisen, Beimischen des Serumersatzes zum Zellkulturmedium, in dem die Zellen bereits enthalten sind oder in das die Zellen beigegeben werden, Inkubation der Zellen in dem mit Serumersatz angereicherten Zellkulturmedium, Separation wenigstens eines Teils eines sich während der Inkubation einstellenden Zellkulturüberstandes, Filtration des Zellkulturüberstandes im Wege einer Ultrafiltration zum Erhalt eines Retentats, Bereitstellen der Beads derart, dass die funktionalisierte Oberfläche der Beads eine Vielzahl an Dendrimeren mit jeweils bis zu 10 Verzweigungen, d.h. zehn Generationen, aufweist, wobei die Endstellen der jeweils letzten Generation der Dendrimere modifiziert werden, Beimischen der Beads sowie das Retentat in eine Pufferlösung unter Ausbildung eines Gemisches, Inkubation und Bindung der im Retentat enthaltenen Zielsubstanzen an die Beads und magnetische Selektion der magnetischen Beads aus dem Gemisch.

Description

Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz
Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz, die während einer Zellkultivierung in einem Zellkulturmedium auftritt oder gebildet wird, bei dem zu dem Zellkulturmedium magnetische, an ihrer Oberfläche funktionalisierte Partikel, so genannte Beads, zugegeben werden, an deren Oberfläche sich die Zielsubstanz selektiv anlagert und durch Applikation eines Magnetfeldes die mit der Zielsubstanz behafteten Partikel aus dem Zellkulturmedium selektiert werden.
Stand der Technik
Gattungsgemäße Verfahren werden bevorzugt zur präparativen Isolierung von Substanzen, welche von Zellen in ein Zellkulturmedium abgegeben werden eingesetzt, um Zelleigenschaften sowie auch ihr weiteres Wachstumsverhalten studieren zu können. Von besonderem Interesse ist dabei die Erforschung von Tumorzellen, deren unkontrolliertes Zellwachstum verantwortlich für die häufigste Todesursache beim Menschen ist. Für eine verantwortungsvolle Therapie zur Bekämpfung eines beim Menschen festgestellten Tumors ist es unablässig zunächst die Tumorart zu bestimmen, bspw. handelt es sich um eine nicht invasive, invasive Tumorart oder um ductales Carcinoma in situ, etc.. Die Art des Tumors ist hierbei entscheidend für den weiteren Verlauf der Therapie. Hintergrund dabei ist, dass Tumorzellen im Laufe der Progression ihre Eigenschaften verändern. So besitzt bspw. die nicht invasive Krebszelllinie MCF-7 einen Östrogenrezeptor, so dass diese Art von Tumore mit einem Inhibitor des Östrogenrezeptors, z.B. mit Tamixofen, behandelt werden können. Im Wege der Progression kann eine Umwandlung einer gutartigen, d.h. nicht invasiven Tumorzelle in einen bösartigen, d.h. invasiven, Zelltyp erfolgen, bei dem der Östrogenrezeptor an der Zelloberfläche nicht mehr präsentiert wird und daher eine Hormonhandlung nicht mehr möglich ist.
Grundsätzlich wird die Progression eines Tumors durch Mutationen ausgelöst, die wiederum durch äußere Einflüsse wie z.B. Sauerstoffarmut (Hypoxie) hervorgerufen werden können. Neben der Zelleigenschaft, dass Tumorzellen nicht nur Rezeptoren an ihrer Oberfläche vorsehen, die in Art, Wirkung und Anzahl aufgrund der Mutation starken Veränderungen unterliegen, verändern Tumorzellen aber auch ihr Verhalten in der Sekretion von verschiedenen regulatorischen Peptiden und Proteinen.
Ein Ansatz zur Findung von Tumormarkern aus Serum/Plasma heraus wird in der modernen Proteomforschung unter der Verwendung verschiedener chromatographischer Schritte, der Verwendung von 2-D-Gelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Methoden durchgeführt. Gegenwärtig ist jedoch aufgrund von sehr hoch konzenrtierten Proteinen im Serum/Plasma die Suche nach potentiellen Markern durch Überlagerungseffekte ins Stocken geraten. Aus diesem Grunde werden Untersuchungen mit Tumorzelllinien durchgeführt. Derartige Untersuchungen an Tumorzellen haben aber gezeigt, dass Peptide und Proteine nur in äußerst geringen Konzentrationen, d.h. Stoffmengen von 10~12 bis 10"9 M, von Zellen abgegeben werden. Da das Detektionslimit der gängigen Massenspektrometern zur Zeit bei 10~9 M liegt und für die massenspektrometrische Detektion die Substanzen hochrein vorliegen müssen, sind für die Anreicherung von Analyten in Zellkulturüberständen, z.B. Sekretionsmolekülen, effiziente Aufreinigungsschritte unabdingbar.
Aus diesem Grund liegt der Hauptaugenmerk der Proteomforschung momentan in der Präanalytik von niedrigkonzentrierten Substanzen. Eine Serie von verschieden aufeinander folgenden Aufreinigungsschritten führt aber bei einer geringen Proteinmenge durch unspezifische Bindungen an den zu verwendeten Gefäßwänden zu einem totalen Verlust an Protein. Ein zusätzliches Problem bei vielen Aufreinigungsschritten ergibt sich durch eine zunehmende Kontamination der Proben, die eine massenspektrometrische Analyse durch Störsignale unmöglich machen kann.
Deshalb konnten sekretorische Untersuchungen mit Zellen bisher nur mit sehr hohen Zellzahlen durchgeführt werden.
Experimente haben gezeigt, dass bei einer anfänglichen Zellzahl in der Größenordnung von 107 Zellen und einer mehrtägigen Vermehrungsphase in einem serumhaltigen Medium und anschließender Inkubation in serumfreier Umgebung lediglich wenige mg Gesamtproteine erhalten werden. Bspw. wurde bei der Untersuchung von Hefezellen nach Abschluss der Zellkultur bei einer Zellzahl von 109 Zellen eine Konzentration von 30 nM AIP-Protein in den Überständen gemessen. Solch große Mengen an Zellen stehen aber in der Regel nicht zur Verfügung. Bei der Untersuchung von Krebszellen, die aus Tumorgewebe durch Biopsie entnommen werden, können pro Stechzylinder maximal einige 105 Zellen isoliert werden, wobei viele Zellen davon nicht Tumorzellen sind. Aufgrund der sehr geringen Konzentration der ausgeschütteten Substanzen ist es somit äußerst wichtig, die Sekretionsmoleküle in einem einzigen Aufreinigungsschritt effizient zu isolieren und der nachfolgenden Analytik ohne Umwege zuzuführen.
In den letzten 5 Jahren wurde versucht, als Screeningmethode für die von Zellen sekretierten Peptide und Proteine die SELDI-TOF-MS Technologie (Surface Enhanced Laser Desorption lonization Time of Flight Mass Spectrometry) einzusetzen. Hierzu werden auf einem Chip mit einer meist hydrophoben Oberfläche von der Größe von 3 mm2 die zu untersuchenden Proben aufgegeben. Die auf dem Chip gebundenen Proteine werden anschließend durch Laserbeschuss ionisiert, massenspektrometrisch detektiert und in einem 2-dimensionalen Plot graphisch dargestellt. Durch die Anwendung dieser Methode konnten z.B. verschiedene Krebszelllinien miteinander verglichen werden. Ein limitierender Faktor ist jedoch die ungenügende Empfindlichkeit dieser Technologie. In der Regel liegt die Empfindlichkeitsgrenze für dieses System bei maximal 300 nM und aus diesem Grund wird die SELDI-TOF-MS-Technologie meist nur noch für das Profiling von Serumproben eingesetzt.
Eine Steigerung der Empfindlichkeit kann nur durch den Einsatz von Partikeln mit geringer Größe erfolgen, da dadurch eine größere Gesamtoberfläche für die Bindung von Protein zur Verfügung steht. Durch die Verwendung von magnetischen Partikeln als Trägersubstanzen für die selektierenden Proteine und Peptide ist eine Automatisierung und somit ein höherer Durchsatz an Proben möglich. Der Einsatz von magnetischen Partikeln, so genannte Beads, zur Isolierung von Proteinen wurde mit biotinylierten Antikörpern, welche an magnetische Streptavidinbeads gekoppelt waren, gezeigt und erfolgreich für die massenspektrometrische Untersuchung von Prostata Spezifischen Antigen (PSA) aus Seren heraus verwendet. Leider kann aber durch den Einsatz von magnetischen „Antikörper-Partikeln" jeweils nur ein einzelnes Protein isoliert werden.
Für die Bindung von möglichst vielen unterschiedlichen Peptiden oder Proteinen aus einer Lösung, wie Plasma, Serum, Urin oder Zellkulturmedium, haben sich Partikel mit hydrophoben Oberflächen durchgesetzt. Diese Partikel binden Proteine über hydrophobe Wechselwirkung und sind somit in der Lage, ein breites Spektrum an Peptiden bzw. Proteinen zu binden. So werden derartige magnetische Mikropartikel mit hydrophoben Oberflächen (RP-Beads) immer häufiger für die Entsalzung und Anreicherung von Peptiden und Proteinen z.B. aus Serum heraus angewendet. Diese so aus z.B. verschiedenen Seren aufgereinigten Peptide und Proteine werden nun normalerweise direkt auf ein MALDI-TOF MS Target aufgebracht, um z.B. Peptid- und Proteinprofile zu erstellen.
Serum besteht aus einer Vielzahl von Stoffen die in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vorkommen. So kommt bspw. Albumin in einer Konzentration im mg/ml-Bereich vor, während z.B. Interleukine nur in einer Konzentration von ng/ml- Bereich vorkommt. Diese hochkonzentrierten Proteine wirken sich jedoch störend bei der Findung von niedrig konzentrierten Proteinen aus, wie sie von in einer Zellkultur wachsenden Zellen, z.B. Tumorzellen, in das Zellkulturmedium abgegeben werden. Derartige regulatorische Peptide und Proteine werden aber nur in sehr geringen Mengen abgegeben.
Hinzu kommt ferner, dass Zellen für ihr Wachstum in einem Zellkulturmedium als Zusatz im Allgemeinen noch fötales Kälberserum benötigen, kurz FKS. Dieser Zusatz liefert den Zellen zwar einerseits die notwendigen Wachstumsfaktoren, andererseits werden der Zellkultur auf diese Weise wieder zusätzliche Proteine mit sehr hohen Konzentrationen zugesetzt. Bei einer Bindung an hydrophobe Magnetbeads konkurrieren somit diese hochkonzentrierten Substanzen um die Bindungsstellen, wodurch niedrig konzentrierte Peptide und Proteine nur zu einem kleinen Bruchteil gebunden werden können.
Die mit Erfolg bei der Untersuchung von Serum bzw. Plasmaproben eingesetzten hydrophoben Magnetbeads sind somit für den Einsatz in einem Zellkulturmedium zur selektiven Separation von regulatorischen Peptiden und Proteinen, die von Tumorzellen in das Zellkulturmedium abgegeben werden, nur bedingt geeignet.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz, die von Zellen in einem Zellkulturmedium abgegeben werden, bei dem dem Zellkulturmedium magnetische, an ihrer Oberfläche funktionalisierte Partikel, so genannte Beads, zugegeben werden, an deren Oberfläche sich die Zielsubstanz selektiv anlagert und durch Applikation eines Magnetfeldes die mit der Zielsubstanz behafteten Partikel aus dem Zellkulturmedium selektiert werden, derart weiterzubilden, dass eine selektive Separation der Zielsubstanz mit einer verbesserten Selektivität aus dem Zellkulturmedium möglich sein soll, wobei die Zielsubstanz mit nur geringer Menge bzw. Konzentration im Zellkulturmedium vorhanden ist.
Insbesondere soll das Aufreinigungsverfahren zur gezielten Extraktion von Substanzen dienen, die während der Inkubation von Zellen, insbesondere Tumorzellen, u.a. durch sekretorische Prozesse in dem Zellkulturmedium vorliegen und dies in geringer Konzentration von 10"12 bis 10'7 M
Die Lösung der der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe ist im Anspruch 1 angegeben. Das lösungsgemäße Verfahren wird darüber hinaus durch die in den Unteransprüchen angegebenen Merkmalen sowie den in der Beschreibung insbesondere unter Bezugnahme auf die Ausführungsbeispiele entnehmbaren Merkmalen vorteilhaft weitergebildet.
Das lösungsgemäße Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz, vorzugsweise von regulatorischen Peptiden und Proteinen, die von Zellen, insbesondere von Tumorzellen, in einem Zellkulturmedium abgegeben werden, besteht darin, dass (a) die Zellkultur unter der Zuhilfenahme eines Serumersatzes durchgeführt wird und dass (b) dem Zellkulturmedium magnetische, an ihrer Oberfläche funktionalisierte Partikel, so genannte Beads, zugegeben werden, an deren Oberfläche sich die Zielsubstanz selektiv anlagert und durch Applikation eines Magnetfeldes die mit der Zielsubstanz behafteten Partikel aus dem Zellkulturmedium selektiert werden, zeichnet sich durch folgende Verfahrensschritte aus: (Zur besseren Verfolgbarkeit der einzelnen Hauptprozessschritte sind zu diese zugehörige Schlagworte fett editiert.)
Bereitstellen eines Serumersatzes, der aus einem natürlich vorkommenden Serum gewonnen wird und frei oder nahezu frei ist von niedermolekularen Substanzen, die eine Masse von kleiner gleich 60 kDa, 30 kDa, vorzugsweise kleiner gleich 10 kDa, aufweisen. So zeichnet sich der bereitzustellende Serumersatz insbesondere dadurch aus, dass er sich nicht, wie bei anderen Produkten, nachteilig auf das Zellwachstum auswirkt, aber vor allem keine störenden Substanzen mit einer Größe unterhalb 10 kDa enthält.
Als natürliches Serum bieten sich grundsätzliche tierische Seren an, vorzugsweise fötales Kälberserum, Rinder- oder Schafsserum, um nur einige zu nennen. Auch kann menschliches Serum verwendet werden.
Zur Aufbereitung und Bereitstellung des Serumersatzes wird in einer bevorzugten Ausführungsvariante das natürliche Serum zunächst unter Einsatz von Ultrafiltrationseinheiten zentrifugiert, so dass ein Überstand, das so genannte Retentat, und ein Permeat erhalten wird. Im Letzteren, dem Permeat, befinden sich je nach verwendeter Filtergröße Substanzen mit Partikelgrößen kleiner der jeweils verwendeten Filterporengröße. Hierbei kommen Membranen mit geeignet gewählten Porengrößen bzw. Ausschlussgrenzen zwischen 3 KDa und 100 kDa zum Einsatz. Um einen möglichst an Kleinstpartikeln befreiten Serumüberstand zu erhalten, wird der im Rahmen des ersten Zentrifugationsdurchgang erhaltene Überstand mit einem Nährmedium versetzt und einer erneuten Zentrifugation unterzogen. Dieser auch als Waschvorgang zu bezeichnende Vorgang wird in vorteilhafter Weise mehrmals wiederholt. Als Waschlösung, das dem jeweils erhaltenen Überstand beizumischen ist, bieten sich Nährmedien, wie Dulbecco's Modified Eagle Medium, kurz DMEM, IMDM, IMEM, ERDF, RPM11640 oder Puffer, wie PBS, MES, TRIS, etc. an.
Nach dem Waschvorgang erfolgt im Weiteren ein Rückzentrifugieren des erhaltenen Überstandes bzw. des Retentats, wobei das Gefäß in dem der Überstand enthalten ist lediglich umgedreht wird und abermals einer Zentrifugation unterzogen wird, wobei nun das Retentat aus der Zentrifugationseinheit zur weiteren Verarbeitung in ein Auffanggefäß herausbefördert und mit dem jeweils eingesetzten Nährmedium oder Puffer versetzt wird, vorzugsweise durch Zugabe von soviel an Nährmedium, dass das ursprünglich eingesetzte Volumen erreicht wird. Der auf die vorstehende Weise erhaltene, so bezeichnete Serumüberstand wird zu Zwecken einer weiteren Reinigung sowie Sterilisation einer sterilen Filtration unterzogen, vorzugsweise unter Einsatz eines 0,2 μm-Filters, und anschließend als der dem lösungsgemäßen Verfahren bereitzustellende Serumersatz in praktikable Mengen von bspw. 500 μl-Aliquots portioniert und für eine künftige Verwendung bei - 2O0C bis - 800C eingefroren.
Beimischen des vorstehend beschriebenen Serumersatzes zu dem mit den Zellen versetzen Zellkulturmedium, für das gleichsam dem vorstehend beschriebenen Nährmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium, kurz DMEM, IMDM, IMEM, ERDF oder RPM11640 geeignet ist. Das Beimischen des Serumersatzes erfolgt mit einem Volumenanteil von 1-10%, in dem die Zellen über mehrere Tage, d.h. 1 bis 14 Tage, inkubiert werden. Ein während der Inkubation des Gemisches aus Zellkuturmedium, Zellen und Serumersatz mit Substanzen angereicherter Zellkulturüberstand, wird im Weiteren separiert und zu Zwecken eines Transportes oder zu Zwecken der Aufbewahrung in entsprechend konfektionierte Behältnisse, so genannte Vials, abgefüllt und gegebenenfalls eingefroren.
Zur weiteren Verarbeitung bzw. Aufreinigung der sich innerhalb des Zellkulturüberstandes befindlichen Substanzen wird der Zellkulturüberstand nach entsprechendem Auftauen einer Zentrifugation mittels einer Ultrafiltrationseinheit unterzogen. Hierbei finden Membranen mit geeignet gewählten Porengrößen bzw. Ausschlußgrenzen zwischen 3 kDa bis 60 kDa bevorzugt Einsatz. Das durch die Filtration gewonnene Filtrat wird im Weiteren durch Behandlung mit geeignet funktionalisierten Magnetbeads aufgereinigt.
Zur erfolgreichen Anwendung des lösungsgemäßen Verfahrens sind besonders funktionalisierte, magnetische Partikel, kurz Beads oder Magnetbeads, bereitzustellen, die im Vergleich zu bislang kommerziell erhältlichen Beads über eine höhere Bindekapazität und eine neue Methode zur Bindung von Substanzen verfügen, die sich durch eine hohe Anreicherung der niedrig konzentrierten Substanzen auszeichnet. So weisen die neuartigen Magnetbeads an ihren funktionalisierten Oberflächen eine Vielzahl an Dendrimeren mit jeweils bis zu 10 Verzweigungen auf, d.h. zehn Generationen, wobei die Endstellen der jeweils letzten
Generation der Dendrimere modifiziert werden.
Derartig neue Magnetbeads sind beispielsweise in folgenderweise herstellbar bzw. konfektionierbar:
Zunächst gilt es die magnetischen Partikel bereitzustellen, die es kommerziell in unterschiedlichen Partikelgrößen im Nano- oder Mikro-Bereich, d.h. ein oder mehrere nm bzw. μm, zu erhalten gibt, an deren Oberflächen beispielsweise Aminogruppen appliziert sind. Zur weiteren Funktionalisierung der Aminobeadoberfläche werden die Beads in ein organisches Lösungsmittel gegeben, dem Methylacrylat zugegeben worden ist. Nach einer Einwirkzeit, die vorzugsweise 2 bis 48 Stunden von Dauer ist, werden die Beads aus der Reaktionsflüssigkeit abgetrennt und mit frischem Lösungsmittel gewaschen. Anschließend werden die so vorbereiteten Beads zur Ausbildung einer ersten Dendrimergeneration (G 1 -Beads) an ihrer Oberfläche in eine organische Reaktionsflüssigkeit, der Ethylendiamin zugegeben worden ist. In dieser Umgebung reagieren die Beads weitere 2 bis 48 Stunden, wobei der Reaktionsvorgang durch Schütteln des Reaktionsbades unterstützt werden kann. Anschließend werden die Beads aus der Reaktionsflüssigkeit erneut, vorzugsweise unter Verwendung eines Magneten separiert und gewaschen. Um nun eine mehrfache Dendrimerausbildung zu erlangen, auf die letztlich die überaus hohe Bindefähigkeit der neuartig funktionalisierten Beads zurückzuführen ist, gilt es den vorstehend beschriebene Vorgang zur Ausbildung der ersten Dendrimergeneration G1 bis zu neun mal zu wiederholen.
Liegen nach entsprechender Prozessierung Dendrimer-Beads vor so werden diese in einem Lösungsmittel unter Hinzufügen von aktivierten Alkyl- (Ci - C30) oder Aromatenderivaten, z.B. Monoaromaten oder Polyaromaten, suspendiert, um letztlich an den Dendrimerkettenendstellen eine Modifizierung mit hydrophoben Derivaten zu erreichen, wodurch die Beads über hydrophobe Eigenschaften verfügen. Man bezeichnet diese funktionalisierten Beads deshalb auch als dendritische Reversed Phase Beads (G1-RP-Beads bis G10-RP-Beads). Zur Bereitstellung werden die Beads aus der Reaktionssuspension separiert, abermals gewaschen und in destilliertem Wasser oder Puffer, wie PBS, MES, TRIS etc. bevorratet.
Die auf die vorstehende Weise erhaltenen, so genannten Dendrimer-RP-Beads werden zu Zwecken der weiteren Aufreinigung und Separierung der sich innerhalb des steril gefilterten Zellkulturüberstandes befindlichen Substanzen, u.a. von den Zellen sekretierte regulatorische Peptide und Proteine dem nach der Filtration erhaltenen Filtrats unter Zugabe einer Pufferlösung, beigemischt. Anschließend erfolgt eine Inkubation mit einer Verweilzeit von 10 bis 120 Minuten bei Raumtemperatur. Hierbei erfolgt die Bindung der in dem Zellkulturüberstand befindlichen Substanzen an die modifizierten Endstellen der Dendrimerstrukturen. Anschließend erfolgt die magnetische Selektion der magnetischen Beads aus dem Gemisch und eine Elution der an der dendritischen Struktur gebundenen nachzuweisenden Substanzen, vornehmlich die von den Zellen sekretierten Substanzen, allen voran die regulatorischen Peptide und Proteine. Selbstverständlich können je nach Funktionalisierung der Magnetbeads auch weitere Substanzen gezielt selektiert werden, so bspw. Metabolite, Steroide etc.
Der Kerngedanke des lösungsgemäßen Aufreinigungsverfahren umfasst im Wesentlichen zwei vorteilhaft zusammenwirkende Grundgedanken, nämlich zum einen die Bereitstellung eines Zellkulturzusatzes bzw. Serumersatzes, in dem von vornherein keine störende Kleinsubstanzen enthalten sind, die möglicherweise bei der nachfolgenden Analyse in Konkurrenz mit den eigentlich nachzuweisenden Zielsubstanzen treten, zum anderen neuartiger Magnetbeads mit einer dendritischen Struktur und einer RP-Phase (reversed phase), wobei die dendritische Struktur bis zu zehn Verzweigungsstellen aufweist und somit die Anzahl der für eine Bindung von nachzuweisenden Zielsubstanzen optimiert.
Durch das lösungsgemäße Verfahren können weit mehr Substanzen isoliert werden als bei der Verwendung von bisher im Einsatz befindlichem normalem Serum, wie bspw. fötales Kälberserum. Durch Verwendung der neuartigen Beads kann im Vergleich zu kommerziell erhältlichen eine 10 bis 100-fache Steigerung der Sensitivität aus bsp. Zellkulturübertständen erreicht werden. Zusammengefasst wird bei der Verwendung der Beads und des Serumersatzes eine bis zu 1000-fach höhere Empfindlichkeit erzielt, wie bei der Anwendung von normalem Serum und kommerziell erhältlichen Beads.
Im Weiteren werden einige konkrete Ausführungsbeispiele zur Verfahrensführung dargestellt:
Beispiel 1 : Herstellung eines Serumersatzes
(a) Niedermolekulare Substanzen aus fötalem Kälberserum oder aus humanem Serum werden durch Zentrifugation und Waschen mit Dulbeccos Eagle Modified Medium entfernt. Hierbei erfolgt die Zentrifugation über eine Filtrationsmembran, die je nach Bedarf eine Porengröße zwischen 3 kDa und 100 kDa haben kann. Der Zentrifugationsvorgang wird eine Stunde durchgeführt. Bei Bedarf kann das Serum mit Proteaseinhibitoren (PMSF1 EDTA, Proteaseinhibitoren in Form von einzelnen Inhibitoren oder eines Cocktails etc.) vor der Aufarbeitung versetzt werden.
(b) Der im Wege der Zentrifugation erhaltene Überstand wird mit Dulbeccos Medium Eagle Medium (DMEM) versetzt und wieder 1 Stunde zentrifugiert (Reinigung des Serums).
(c) Der Zentrifugations- und Waschschritt werden insgesamt 2-5x durchgeführt.
(d) Der erhaltene Überstand wird nun in ein Gefäß rückzentrifugiert und mit DMEM auf das ursprünglich eingesetzte Volumen eingestellt.
(e) Der erhaltene Serumersatz (auch Serumüberstand genannt) wird über einen O.2μm-Filter steril filtriert.
(f) Der Serumersatz wird zu 500 μl-Aliquots portioniert und bei -200C bis zur Verwendung eingefroren. Beispiel 2: Herstellung von modifizierten Magnetbeads
Ausgehend von der Aminoberfläche der Beads wird über eine Verzweigungsreaktion an jeder Aminogruppe eine dendritische Struktur aufgebaut. Hierbei wird das Prinzip zur Synthese von Starburstmolekülen zugrunde gelegt, bis eine bis zu zehnfache- Verzweigung in der dendritischen Struktur zum Erhalt so genannter G1- bis G10- Beads erreicht wird. Am Schluss erfolgt die Modifizierung der endständigen NH2- Gruppen der Dendrimer-Beads u. a. mittels Mikrowellensynthese mit unterschiedlich langen Alkylketten (CrC30) über eine aktivierte Gruppe.
(a) Bereitstellen von 10 -2000 mg Aminobeads und in einem Behältnis mehrmals mit 10 bis 100 ml MeOH waschen.
(b) Beads in 10 -100 ml MeOH aufnehmen und 10 - 100 ml kaltes Methylacrylat zugegeben. Auf einem Schüttler 2 - 48 Stunden bei Raumtemperatur (RT) reagieren lassen.
(c) Abtrennen der Beads von der Reaktionsflüssigkeit durch einen Magneten und Beads 3x mit jeweils 10 - 200 ml MeOH waschen.
(d) Zugabe von 10 - 100 ml MeOH und langsame Zugabe von 10 - 100 ml kaltem Ethylendiamin. Bei Raumtemperatur 2 - 48 h unter Schütteln regieren lassen; (G 1 -Beads).
(e) siehe Schritt (c), d.h. Abtrennen der Beads von der Reaktionsflüssigkeit durch einen Magneten und Beads 3x mit jeweils 10 - 100 ml MeOH waschen.
(f) N-malige Wiederholung der Schritte (b) - (e), wobei n= 0 bis 9 ist.
(g) Waschen der Dendrimer-Beads jeweils 3x mit 10 - 100 ml MeOH und 5x mit 10 - 100 ml halogeniertem Kohlenwasserstoff,
(h) Dendrimer-Beads in 50 - 100 ml halogeniertem Lösungsmittel suspendieren und langsames Zutropfen von 5 - 10 ml eines aktivierten Alkylderivates, z.B. C1-C30 oder Aromatenderivates. Reaktion für 10 bis 120 Minuten bei RT im Ultraschallbad und/oder unter Erhitzen bis maximal 38°C oder mittels Mikrowellensynthese.
(i) Modifizierte Dendrimer-Beads jeweils 5 x mit 10 - 100 ml MeOH und 5 x mit 10 - 100 ml ultrareinem Wasser waschen. G) Aufnahme der Dendrimer-Beads in ultrareinem Wasser und Lagerung bei +4°C.
Alternativ ist es anstelle des Verfahrensschrittes (h) ebenso möglich die Dendrimer- Beads anderweitig an den Endstellen ihrer Dendrimerketten zu modifizieren, bspw. durch Hinzufügung von Antikörpern. Hierzu werden die vorprozessierten dendritischen Aminobeads (G1-G10) in einem Puffer mit einem bifunktionalem Linker für Aminogruppen zur Reaktion gebracht. Als Linker eignet sich vorzugsweise Glutardialdehyd, Bis (Sulfosuccinimidyl) suberate, Succinimidylsuberate, Dimethyl Pimelidate oder bifunktionelle PEG-Linker. Anschließend erfolgt ein Waschen der Beads vorzugsweise in einem Phosphatpuffer. Schließlich werden dem Puffer Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml bis 50 mg/ml Puffer zugegeben. Nach einer Inkubation von ca. 1 - 14 h bei RT oder +4°C werden die mit Antikörpern versehenen Beads gewaschen und in einem Puffer zur weiteren Verwendung bei etwa +4°C bevorratet.
Beispiel 3: Durchführung einer Aufreinigung von sekretierten Substanzen von in einem Zellkulturmedium vorliegenden Tumorzellen unter Verwendung des in Beispiel 1 gewonnenen Serumersatzes sowie der in Beispiel 2 modifizierten magnetischen Partikel
Die Tumorzellen werden je nach Größe des Experiments in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) und 1-10% Serumersatz, der aus fötalem Kälberserum (FKS) erhalten worden ist, in verschiedenen Behältnissen eingesät und über mehrere Tage bei 37°C und 5% Cθ2-An reicherung inkubiert. Der Zellkulturüberstand, d.h. DMEM + 1-10% FKS-Serumersatz, kurz ZKÜ genannt, wird in vorher behandelte Vials abgefüllt und zum Transport bei -200C eingefroren.
Vor der Aufreinigung mit den modifizierten Dendrimer-Beads (G1-G10) wird der aufgetaute ZKÜ über eine Membranfiltrationseinheit filtriert. Das Filtrat wird im Weiteren mittels der modifizierten Dendrimer-Beads (G1-G10) aufgereinigt und konzentriert. Anschließend erfolgt die Elution und weitere Aufarbeitung. Im Einzelnen:
(a) Zellen in DMEM und FKS-Überstand aufnehmen und je nach Ansatz (Volumen) in geeignetem Zellkulturgefäß bei 37°C und 5% CO2 für 3 Tage inkubieren.
(b) Verwerfen des ZKL) und vorsichtiges Waschen der Zellen mit jeweils 10 ml PBS, bei pH 7.2 oder DMEM1 den Waschvorgang 2-5x wiederholen.
(c) Zugabe der erforderlichen Menge DMEM + 1-10% FKS-Serumüberstand und Inkubation der Zellen über die erforderliche Zeit (1- 14 Tage). Nach erfolgter Inkubation ZKÜ's in vorbehandelte Vials (1 ml) geben und bei -2O0C oder bei -8O0C einfrieren.
(d) Auftauen der eingefroren ZKÜ's und jeweils 500 μl in eine Filtrationseinheit überführen.
(e) Zentrifugation der ZKÜ für 1 h bei 12000 rpm und Filtrat auffangen.
(f) In der Zwischenzeit Vorbereitung der Beads für die Inkubation. 80 μl der modifizierten Dendrimer-Beads (G1- G10) in 450 μl Puffer bei pH 7.2 aufnehmen und kurz suspendieren. Danach Abtrennen der Beads über einen Magneten.
(g) Zugabe von 450 μl eines Puffers mit pH 7.2 und Beads suspendieren. Anschließend 450 μl des von der ZKÜ-Zentrifugation erhaltenen Filtrats mit einer Pipette zugeben und 10 x auf und ab pipettieren (Beads vollständig suspendieren).
(h) Inkubation für 10 - 120 min bei Raumtemperatur.
(i) Lösung nach magnetischer Separation verwerfen und magnetische
Dendrimer-Beads (G1-G10) 3 x mit jeweils 500 μl Puffer waschen. G) Zugabe von 20 μl Aceton itriliTFA 1 :1 , v:v und mischen der Beadlösung durch
10-maliges auf- und abpipettieren (Elution), (k) Inkubation für 1 - 120 min bei Raumtemperatur. (I) Abtrennung der magnetischen Partikel und Elutionslösung für weitere
Aufarbeitung separieren. Beispiel 4: Fünf alternative Beispiele zur weiteren Untersuchung der mit den
Zielsubstanzen versehenen magnetischen Beads, wie sie nach dem lösungsgemäßen Aufreinigungsverfahren gewonnen werden.
Erste Alternative:
Die mit den Zielsubstanzen beaufschlagten magnetischen Beads werden zu einem nicht reduzierenden oder reduzierenden Gelelektrophoreseprobenpuffer, bestehend aus TRIS, Harnstoff, Thiohamstoff, LDS, SDS oder CHAPS etc., zugegeben.
Das sich dabei bildende Gemisch wird vorzugsweise auf 600C für 5 - 30 min erhitzt, wodurch sich die Zielsubstanzen von den Beads lösen. Im Weiteren werden die magnetischen Beads mittels eines Magneten aus dem Gemisch abgetrennt und der verbleibende Gelelektrophoreseprobenpuffer wird mit den Zielsubstanzen abpipettiert und in Geltaschen eines Elektrophoresegels (SDS-GeI, Native-Gel, 2-D-
GeI) aufgegeben und nachfolgend einer elektrophoretischen Auftrennung unterzogen.
Zweite Alternative (gilt nur für mit Antikörper gekoppelten Dendrimer-Beads (G1- G10):
Die an den Antikörperpartikeln gebundenen Zielsubstanzen werden durch Zugabe einer Carbonsäure oder eines chaotropen Hochsalzpuffers eluiert. Das sich im Wege der Elution ergebende Carbonsäureeluat wird einrotiert (Speed-Vac) und in einer Pufferlösung aufgenommen. Schließlich unterliegen die in der Pufferlösung enthaltenen Zielsubstanzen einem enzymatischen Verdau. Die verdauten Zielsubstanzen werden anschließend einer massenspektrometrischen Identifizierung über Peptide Mass Fingerprint (PMF) oder MS/MS-Spektren unterzogen.
Dritte Alternative:
Die mit einer oder mehreren Zielsubstanzen beaufschlagten magnetischen Beads werden gewaschen und anschließend einer Pufferlösung mit einer Protease zum Verdau der Zielsubstanzen zugeführt. Die verdauten Zielsubstanzen werden anschließend einer massenspektrometrischen Identifizierung über Peptide Mass Fingerprint (PMF) oder MS/MS-Spektren unterzogen. Desweiteren werden die magnetischen Beads abermals gewaschen und anschließend einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und/oder Carbonsäuren zugegeben, zum Erhalt eines Eluats. Letztlich wird das Eluat wieder einer massenspektrometrischen Messung unterzogen.
Vierte Alternative:
Die an den Antikörpern gebundenen Zielsubstanzen werden durch Zugabe einer Carbonsäure oder eines Hochsalzpuffers eluiert. Zu den Eluaten werden die dendritischen reversed-phase Beads gegeben. Nach einer Inkubation von 1 - 60 Minuten, werden die Beads mit Hilfe eines Magneten separiert und anschließend mehrmals mit einem Puffer gewaschen.
Anschließend erfolgt entweder der in Alternative 1 aufgezeigte Weg für eine Gelelektrophoretische Auftrennung oder der in Alternative 3 aufgezeigte Weg für eine Erzeugung von proteolytischen Peptide, die anschließend über MS- oder MS/MS- Spektren detektiert und aufgeklärt werden.
Fünfte Alternative:
Zellen, wie z.B. Tumorzellen, werden je nach Experiment in verschiedene Behältnisse eingesät und für mehrere Tage bei 37°C und 5% Cθ2-Gehalt inkubiert. Danach erfolgt ein Waschen der Zellen mit Zellkulturmedium oder Puffer. Anschließend erfolgt die Zugabe von Zellkulturmedium ohne Serum und eine nochmalige Inkubation von 0 - 72 h. Die jeweiligen Zellkulturüberstände werden abgefüllt und gegebenenfalls bei -200C eingefroren.
Die Bindung der Substanzen an die modifizierten Dendrimerbeads erfolgt durch Zugabe derselben zu den aufgetauten Zellkulturüberständen . Anschließend erfolgt ein Waschen der Beads und diese werden wie in Alternative 1 aufgezeigt, einer Gelelektrophorese unterzogen oder wie in Alternative 3 aufgezeigt einem Verdau mit einer Protease unterzogen und die verdauten Substanzen einer MS bzw. MS/MS- Analyse unterzogen. Die vorstehend beschriebenen funktionalisieren Magnetbeads stellen als solche ein Produkt dar, das als sensorisch wirkende Substanz grundsätzlich für eine Vielzahl unterschiedlicher Einsatzwecke verwendbar ist. Ein möglicher Einsatz ist die vorstehend beschriebene Aufreinigung von Zielsubstanzen. Zur Herstellung eines solchen Produktes in allgemeinen Form sind folgende Maßnahmen zu treffen:
a) Bereitstellen von magnetischen Partikeln, kurz Beads, mit einer Partikelgröße im Nano- und/oder Mikro-Bereich, d.h. ein oder mehrere nm oder μm, und mit an deren Oberflächen applizierte funktionelle Gruppe, wie z.B. Aminogruppen, b) Reagieren der Beads in einem Verzweigungsreagenz, wie z.B. Methylacrylat enthaltenden organischen Lösungsmittel, c) Abtrennen der Beads aus dem organischen Lösungsmittel und Waschen der Beads mit einem organischen Lösungsmittel, d) Reagieren der Beads mit einem Verbinder, wie z.B. Ethylendiamin, enthaltenden organischen Flüssigkeit, e) Abtrennen der Beads aus der organischen Flüssigkeit und Waschen der Beads, f) n - maliges Wiederholen der Schritte b) bis e) g) Suspendieren der Beads in einer mit wenigstens einem Derivat enthaltenden Lösung, und h) Abtrennen und Waschen der Beads und Bereitstellen der derivatisierten Beads in Wasser oder pufferhaltiger Lösung.
Vorzugsweise wird n = 0 bis 9 gewählt. Als Reaktionsflüssigkeit eignet sich vor allem Alkohol. Damit die Beads reversed-phase Eigenschaften annehmen, werden die Beads mit einer chemischen oder proteinogenen Gruppe, wie Alkyl-(CrC3o) oder Aromatgruppen derivatisiert. Als Grundkörper für die Beads eignen sich stabile magnetische Partikel, die eine Partikelgröße von 10 nm - 10 μm aufweisen.
Die auf den magnetischen Partikeln zu Zwecken ihrer Funktionalisierung applizierte Gruppe ist vorzugsweise aus wenigstens einem Stoff der nachfolgenden Stoffgruppen aufgebaut: Primäre und sekundäre Amino-, prim., sek. und unsym. Hydrazin-, Azid-, Phosphin-, Aldehyd-, Polyaldeyhd-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Cyanat-, Isocyanat-, Thiocyanat-, Hydroxy-, Thiol-, Imino-, Hydrazid-, Piperidin-, Azomethin-, Semicarbazon-, Hydrazon-, Cyanbromid-, Tosyl-, Epoxid-.Cyanursäurechlorid-, Cyanursäureester.-gruppen. Diamino-, Triamino- .Tetraaminoheterocyclen.
Die vorstehend beschriebenen funktionalisierten Beads werden ferner mit Verzweigungsreagenzien, die in einem Lösungsmittel bereitgestellt werden, zur Reaktion gebracht, wobei die Verzweigungsreagenzien aus wenigstens eine der nachfolgenden Gruppe ausgewählt sind:
Melamin, Diamino-, Triamino-, Tetraaminoheterocyclen, Triepoxide, Tetraepoxide, Diallylamine, Methylacrylate, Triacrylate, Tetraacrylate, Tris(hydroxymethylamin), Oxazine, Oxetane, Diethanolamine.
Anschließend werden die mit dem Verzweigungsreagenz beaufschlagten magnetischen Partikel mit einem bi- oder trifunktionalen Linker zur Reaktion gebracht werden, wobei der der Linker aus einer der nachfolgenden Stoffzusammenstellung ausgewählt wird: Lysine, Diaminoalkane, Diamino-, Triamino-, Tetraaminoheterocyclen, Diaminoethylenglycole, Piperazin, Allylamine, Triepoxide, Tetraepoxide, Tris(hydroxymethylamin).
Schließlich werden nach n-maligem Wiederholen der vorstehend genannten Verfahrensschritte b) bis e) die magnetischen Partikel mit nachfolgenden chemischen Gruppen als Endgruppe oder mit Peptiden, Proteinen, Glycanen oder Glycoproteinen aller Art derivatisiert:
n-Alkyl-, sek-Alkyl-, tert-Alkylgruppen, unsubstituirte und substituirte Aryl-, unsubstituirte und substituirte Acyl-, primäre, sekundäre und tertiäre Amino-, prim., sek. und unsym. Hydrazin-, Azid-, Aldehyd-, Phosphin-, Polyaldeyhd-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäurehalogenid-, Carbonsäureanhydrid-, Cyanat-, Isocyanat-, Thiocyanat-, Hydroxy-, Thiol-, Sulfid-, Sulfit-, Sulfat-, Imino-, Hydrazid-, Piperidin-, Azomethin-, Semicarbazon-, Hydrazon-, Hydroxamsäure-, Amidrazon-, Amidin-, Cyanbromid-, Tosyl-, Epoxid-.Cyanursäurechlorid-Cyanursäureester- gruppen, unsubstituierte und substituierte Carbodiimide, N-Hydroxysuccinimidester, Ethylenglycole, unsubstituierte und substituierte Arylalkane, Arylalkene, Heterocyclische Verbindungen, Mono- und Polycyclische Verbindungen, Die Anzahl der Kohlenstoffe beträgt hierbei 2 bis 100.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz, die während einer Zellkultivierung in einem Zellkulturmedium auftritt oder gebildet wird, bei dem dem Zellkulturmedium magnetische, an ihrer Oberfläche funktionalisierte Partikel, so genannte Beads, zugegeben werden, an deren Oberfläche sich die Zielsubstanz selektiv anlagert und durch Applikation eines Magnetfeldes die mit der Zielsubstanz behafteten Partikel aus dem Zellkulturmedium selektiert werden, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
Bereitstellen eines Serumersatzes, der aus einem natürlich vorkommenden
Serum gewonnen wird und frei oder nahezu frei ist von niedermolekularen
Substanzen, die eine Masse von kleiner gleich 60 kDa, insbesondere kleiner gleich 10 kDa, aufweisen,
Beimischen des Serumersatzes zum Zellkulturmedium, in dem die Zellen bereits enthalten sind oder in das die Zellen beigegeben werden,
Inkubation der Zellen in dem mit Serumersatz angereicherten
Zellkulturmedium,
Separation wenigstens eines Teils eines sich während der Inkubation einstellenden Zellkulturüberstandes,
Filtration des Zellkulturüberstandes im Wege einer Ultrafiltration zum Erhalt eines Retentats,
Bereitstellen der Beads derart, dass die funktionalisierte Oberfläche der
Beads eine Vielzahl an Dendrimeren mit jeweils bis zu 10 Verzweigungen, d.h. zehn Generationen, aufweist, wobei die Endstellen der jeweils letzten
Generation der Dendrimere modifiziert werden,
Beimischen der Beads und einer Pufferlösung zu dem Retentat unter der
Ausbildung eines Gemisches, Inkubation und Bindung der im Retentat enthaltenen Zielsubstanzen an die Beads und magnetische Selektion der magnetischen Beads aus dem Gemisch.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Serumersatz als Retentat im Wege einer Ultrafiltration aus einem natürlichem Blutserum eines Tieres oder Menschen gewonnen wird, und dass das Retentat mittels eines Nährmediums oder Puffer gewaschen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Waschlösung Nährmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), IMDM1 IMEM, ERDF oder RPMM 640 verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Serumerssatz in folgender Weise gewonnen und bereitgestellt wird: a) Zentrifugieren von natürlichem Serum über eine Ultrafiltrationseinheit zum Erhalt eines Überstandes, dem so genanten Retentat, und einem
Permeat, b) Zusetzen des Retentats mit einem Nährmedium und anschließendem Zentrifugieren gemäß Schritt a) c) n-maliges Wiederholen des Schrittes b) d) Zugeben von Nährmedium an das erhaltene Retentat zum Erhalt eines so genannten Serumüberstandes und e) Filtration des Serumüberstandes zum Erhalt eines dem Serumersatz entsprechenden Permeats.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Filtration des Serumüberstandes eine Sterilfiltration durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das natürliche Serum vor dem Schritt a) mit wenigstens einem reversiblen oder irreversiblen Proteaseinhibitor versetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und/oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und/oder proteinogene Inhibitoren einzeln oder als Proteaseinhibitoren Cocktail dem Serum zugesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Zentrifugieren gemäß der Schritte a) und b) wenigstens eine Stunde bei Raumtemperatur bis hinab zu +4°C durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b) n gleich 2-5 mal wiederholt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtration gemäß Schritt e) mit einem 0,2 μm Sterilfilter durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Zellkulturüberstand zeitlich vor der Filtration bei
-200C bis -80° C eingefroren wird, dass der eingefrorene Zellkulturüberstand aufgetaut und, dass die Filtration im Wege einer Zentrifugation unter Verwendung einer
Ultrafiltrationseinheit durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Beimischen der Beads sowie des Retentats eine antichaotrope Pufferlösung verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass nach der Inkubation, der Bindung der im Retentat enthaltenden Zielsubstanz an die Beads und magnetischen Selektion der Beads die mit den Zielsubstanzen versehenen Beads mit einer Niedrigsalzpufferlösung gewaschen werden, und dass anschließend die wenigstens eine Zielsubstanz von den Beads in einem Gemisch aus wenigstens einer organischen Komponente und/oder einer Säure eluiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als organische Substanz Alkohol oder Acetonitril und als Säure Carbonsäure oder Mono-, Di-, Trihalogencarbonsäure verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellkulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), IMDM, IMEM, ERDF oder RPMI1640 verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass beim Beimischen des Serumersatzes zum Zellkulturmedium, 1 - 10 Vol.% Serumersatz in das Zellkulturmedium beigegeben wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen der Beads folgende Schritte durchgeführt werden: a) Bereitstellen von magnetischen Partikeln, kurz Beads, mit einer Partikelgröße im Nano- und/oder Mikro-Bereich, d.h. ein oder mehrere nm oder μm, und mit an deren Oberflächen applizierte Aminogruppen, b) Reagieren der Beads in einem Methylacrylat enthaltenden organischen Lösungsmittel, c) Abtrennen der Beads aus dem organischen Lösungsmittel und Waschen der Beads mit einem organischen Lösungsmittel, d) Reagieren der Beads in einer Ethylendiamin enthaltenden organischen Flüssigkeit, e) Abtrennen der Beads aus der organischen Flüssigkeit und Waschen der Beads, f) n - maliges Wiederholen der Schritte b) bis e) g) Suspendieren der Beads in einer mit wenigstens einer funktionalisierenden Substanz enthaltenden Lösung, und h) Abtrennen und Waschen der Beads und Bereitstellen der funktionalisierten Beads in Wasser.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als n = 0 bis 9 gewählt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Reaktionsflüssigkeit Alkohol, kurz R-OH1 verwendet wird, mit R = Ci bis C6.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Suspendieren im Rahmen eines Ultraschallbades und/oder unter Erhitzen auf maximal 36°C und/oder im Rahmen einer Mikrowellensynthese durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass als die wenigstens eine funktionalisierende Substanz enthaltende Lösung halogenhaltige Lösungsmittel unter Hinzufügen von aktivierten Alkylderivaten ( Ci - C3o) verwendet werden, wobei als aktivierte Gruppen Halogene, insbesondere Cl, Br, J, Cyanate, Iso-Cyanate oder Isothiocyanate eingesetzt werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Verfahrensschritt f) die Beads mit einem bifunktionalem Linker für Aminogruppen zur Reaktion gebracht werden, dass die Beads in einem Puffer gewaschen werden, und dass als die wenigstens eine funktionalisierende Substanz enthaltende Lösung
Antikörper in einer Konzentration von c = 1 mg/ml bis 50 mg/ml in einer Pufferlösung verwendet wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass als bifunktionaler Linker Glutardialdehyd, Bissulfosuccinimidylsuberate (BS3), Disuccinimidysuberate (DSS), Dimethyl Pimelidate (DMP) oder bifunktionale PEG-Linker verwendet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffer zum Waschen Phosphat- oder Carbonatpuffer verwendet wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass den mit der wenigstens einen Zielsubstanz beaufschlagten magnetischen Beads ein Gelelektrophoreseprobenpuffer zugegeben wird, dass das sich dabei bildende Gemisches auf 40 bis 95°C für 5 - 30 min erhitzt wird, dass die magnetischen Beads mittels eines Magneten aus dem Gemisch abgetrennt werden, und dass der verbleibende Gelelektrophoreseprobenpuffer abpipettiert und in Geltaschen eines Elektrophoresegels aufgegeben und einer elektrophoretischen Auftrennung unterzogen wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die an die Beads gebundenen Zielsubstanzen durch Zugabe einer Carbonsäure eluiert werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein sich im Wege der Eluierung ergebendes Carbonsäureeluat einrotiert und in einer Pufferlösung aufgenommen wird.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielsubstanz einem enzymatischen Verdau zugeführt werden, und dass die verdauten Zielsubstanzen einer massenspektrometrischen Identifizierung über Peptide Mass Fingerprint (PMF) oder MS/MS-Spektren unterzogen werden.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den Zielsubstanzen beaufschlagten magnetischen Beads gewaschen und anschließend einer Pufferlösung mit einer Protease zum Verdau der Zielsubstanzen zugeführt werden.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine massenspektrometrische Messung über Peptide Mass Fingerprint (PMF) oder MS/MS-Spektren der Pufferlösung nach dem enzymatischen Verdau durchgeführt wird.
31. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Beads gewaschen werden anschließend einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und/oder Carbonsäuren zugegeben werden zum Erhalt eines Eluats.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass eine massenspektrometrische Messung des Eluats durchgeführt wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine an den Beads gebundene Zielsubstanz durch Zugabe einer Carbonsäure oder eines chaotropen Puffers eluiert wird und die sich in dem gewonnenen Eluat befindlichen Substanzen mit Hilfe von magnetischen, dendritischen, reversed-phase Partikel gebunden werden.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den in dem Eluat befindlichen Substanzen beaufschlagten magnetischen, dendritischen, reversed-phase Partikel einem
Gelelektrophoreseprobenpuffer zugegeben werden, dass das sich dabei bildende Gemisches auf 40 bis 95°C für 5 - 30 min erhitzt wird, dass die magnetischen Beads mittels eines Magneten aus dem Gemisch abgetrennt werden, und dass der verbleibende Gelelektrophoreseprobenpuffer abpipettiert und in Geltaschen eines Elektrophoresegels aufgegeben und einer elektrophoretischen Auftrennung unterzogen wird.
35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den in dem Eluat befindlichen Substanzen beaufschlagten magnetischen, dendritischen, reversed-phase Partikel gewaschen und anschließend einer Pufferlösung mit einer Protease zum Verdau der an den Partikeln gebundenen Substanzen zugeführt werden.
36. Produkt aus einem Serum, das im Wege eines Reinigungsverfahrens von niedermolekularen Stoffbestandteilen befreit ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Reinigungsverfahren folgende
Verfahrensschritte vorsieht: a) Zentrifugieren von natürlichem Serum über eine Ultrafiltrationseinheit zum Erhalt eines Überstandes, dem so genanten Retentat, und einem
Permeat, b) Zusetzen des Retentats mit einem Nährmedium und anschließendem
Zentrifugieren gemäß Schritt a) c) n-maliges Wiederholen des Schrittes b) d) Zugeben von Nährmedium an das erhaltene Retentat zum Erhalt eines so genannten Serumüberstandes und e) Filtration des Serumüberstandes zum Erhalt eines dem Serumersatz entsprechenden Permeats.
37. Produkt, mit Magnetbeads, die eine funktionalisierte Oberfläche aufweisen und in folgender Weise herstellbar sind: a) Bereitstellen von magnetischen Partikeln, kurz Beads, mit einer Partikelgröße im Nano- und/oder Mikro-Bereich, d.h. ein oder mehrere nm oder μm, und mit an deren Oberflächen applizierte funktionelle Gruppe, wie z.B. Aminogruppen, b) Reagieren der Beads in einem Verzweigungsreagenz, wie z.B. Methylacrylat enthaltenden organischen Lösungsmittel, c) Abtrennen der Beads aus dem organischen Lösungsmittel und Waschen der Beads mit einem organischen Lösungsmittel, d) Reagieren der Beads mit einem Verbinder, wie z.B. Ethylendiamin, enthaltenden organischen Flüssigkeit, e) Abtrennen der Beads aus der organischen Flüssigkeit und Waschen der Beads, f) n - maliges Wiederholen der Schritte b) bis e) g) Suspendieren der Beads in einer mit wenigstens einem Derivat enthaltenden Lösung, und h) Abtrennen und Waschen der Beads und Bereitstellen der derivatisierten Beads in Wasser oder pufferhaltiger Lösung.
38. Produkt nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass als n = 0 bis 9 gewählt wird.
39. Produkt nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass als Reaktionsflüssigkeit Alkohol verwendet wird.
40. Produkt nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, das die Beads mit einer chemischen oder proteinogenen Gruppe, wie Alkyl-(d-C3o) oder Aromatgruppen derivatisiert werden und somit reversed-phase Eigenschaften annehmen.
41. Produkt nach einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass als Grundkörper der Beads stabile magnetische Partikel verwendet werden, die eine Partikelgröße von 10 nm - 10 μm aufweisen.
42. Produkt nach einem der Ansprüche 37 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass die auf den magnetischen Partikeln applizierte Gruppe aus wenigstens einem Stoff der nachfolgenden Stoffgruppen aufgebaut ist:
Primäre und sekundäre Amino-, prim., sek. und unsym. Hydrazin-, Azid-, Phosphin-, Aldehyd-, Polyaldeyhd-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Cyanat-, Isocyanat-, Thiocyanat-, Hydroxy-, Thiol-, Imino-, Hydrazid-, Piperidin-, Azomethin-, Semicarbazon-, Hydrazon-, Cyanbromid-, Tosyl-, Epoxid-.Cyanursäurechlorid-, Cyanursäureester.-gruppen. Diamino-, Triamino-.Tetraaminoheterocyclen.
43. Produkt nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierten Beads mit Verzweigungsreagenzien, die in einem Lösungsmittel bereitgestellt werden, zur Reaktion gebracht werden, und dass die Verzweigungsreagenzien aus wenigstens eine der nachfolgenden Gruppe ausgewählt sind:
Melamin, Diamino-, Triamino-, Tetraaminoheterocyclen, Triepoxide, Tetraepoxide, Diallylamine, Methylacrylate, Triacrylate, Tetraacrylate, Tris(hydroxymethylamin), Oxazine, Oxetane, Diethanolamine.
44. Produkt nach einem der Ansprüche 37 bis 43, dadurch gekennzeichnet, das die mit dem Verzweigungsreagenz beaufschlagten magnetischen Partikel mit einem bi- oder trifunktionalen Linker zur Reaktion gebracht werden, und dass der Linker aus der nachfolgenden Stoffzusammenstellung ausgewählt wird:
Lysine, Diaminoalkane, Diamino-, Triamino-, Tetraaminoheterocyclen, Diaminoethylenglycole, Piperazin, Allylamine, Triepoxide, Tetraepoxide, Tris(hydroxymethylamin).
45. Produkt nach einem der Ansprüche 37 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass nach n-maligem Wiederholen der Schritte b) bis e) die magnetischen Partikel mit nachfolgenden chemischen Gruppen als Endgruppe oder mit Peptiden, Proteinen, Glycanen oder Glycoproteinen aller Art derivatisiert werden:
n-Alkyl-, sek-Alkyl-, tert-Alkylgruppen, unsubstituirte und substituirte Aryl-, unsubstituirte und substituirte Acyl-, primäre, sekundäre und tertiäre Amino-, prim., sek. und unsym. Hydrazin-, Azid-, Aldehyd-, Phosphin-, Polyaldeyhd-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäurehalogenid-, Carbonsäureanhydrid-, Cyanat-, Isocyanat-, Thiocyanat-, Hydroxy-, Thiol-, Sulfid-, Sulfit-, Sulfat-, Imino-, Hydrazid-, Piperidin-, Azomethin-, Semicarbazon-, Hydrazon-, Hydroxamsäure-, Amidrazon-, Amidin-, Cyanbromid-, Tosyl-, Epoxid-.Cyanursäurechlorid-Cyanursäureester- gruppen, unsubstituierte und substituierte Carbodiimide, N-Hydroxysuccinimidester, Ethylenglycole, unsubstituierte und substituierte Arylalkane, Arylalkene, Heterocyclische Verbindungen, Mono- und Polycyclische Verbindungen.
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