WO2008047658A1

WO2008047658A1 - Additif pour aliments pour animaux et aliments pour animaux

Info

Publication number: WO2008047658A1
Application number: PCT/JP2007/069807
Authority: WO
Inventors: Shinji Ito; Yasuo Kobayashi; Motoshi Suzuki
Original assignee: Idemitsu Kosan Co., Ltd.; Suzuki, Kuniko
Priority date: 2006-10-17
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2008-04-24
Also published as: US20100249058A1; MX2009003416A; AR063475A1; BRPI0717628A2; KR20090079238A; TW200824577A; AU2007313580A1; AU2007313580B2; CA2666674A1; NZ575806A; CA2666674C; EP2074889A1; AU2007313580B8; EP2074889A4; MY142794A

Description

明細書

飼料添加剤及び飼料

技術分野

[0001] 本発明は、糖脂質を含有する飼料添加剤、飼料及びこれらを用いた鳥類及び哺乳類の飼育方法に関する。

背景技術

[0002] 家畜の感染症は、家畜の体重を減少させたり、様々な病状を引き起したりするなど、その商品価値を著しく低下させる。例えば、スタフイロコッカス 'ァウレウス（Staphyloc occus aureus)は、ゥシ、ヒッジ、ャギの乳房炎、皮下腫瘍、膿血症、馬の発疹、豚、鶏の関節炎、皮膚炎、敗血症の原因菌である。また、ストレプトコッカス'スイス（Strept ococcus suis)は、豚の髄膜炎、敗血症、心内膜炎、関節炎の原因菌であり、ストレブトコッカス.ボビス（Streptococcus bovis)はゥシの鼓張症の原因菌である。

[0003] 抗生物質を家畜飼料に少量添加することにより家畜の成長が促進されることが 194 0年代に発見され、それ以来、家畜の成長を促進したり、疾病を予防したりする手段として、家畜の飼料に抗生物質を添加することが広く行われてきた。抗生物質は、家畜の病原菌感染の予防、代謝の改善、腸内の有害菌の増殖抑制の作用を示し、結果として疾病を予防し、成長を促進すると考えられているが、詳細は依然不明である。その一方で、飼料に抗生物質を混ぜることは、結果的に抗生物質を外環境に広くばら撒くこととなり、畜産界においても抗生物質耐性菌の出現が問題となっている。例えば、代表的な抗生物質耐性菌である MRSA (メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（St aphylococcus aureus) )は、馬などの家畜でも発見されていることが報告されている。このような背景下、近年では、抗生物質の飼料への添加が厳しく規制されるようになつてきている。例えば、欧州では 2006年までに抗生物質の飼料が全面禁止され、日本でも使用できる抗生物質の数が段階的に減ってきている。また、このような動きと相まって、生産者からは抗生物質の代替物につ!/、ての要望が大きくなつて!/、る。

[0004] このような抗生物質の代替の流れを受け、一部では、乳酸菌が生産するナイシン、バチルス菌が生産するイツリンなどのポリペプチド類を抗生物質の代わりに使用する動きも出てきている。また、乳化剤として缶コーヒーなどに添加されている糖脂質であるショ糖エステル類がバチルス菌等に対する抗菌作用を期待されて添加されている。

[0005] また、牛や羊などの反芻家畜はルーメン内で微生物によって飼料を消化'発酵させ、その発酵生産物を利用して生きている。そのため、ルーメンからのメタン発生は、飼料のエネルギー効率の損失となる。更には、メタンは地球温暖化に影響を及ぼす温暖化ガスであることから、反芻動物のルーメンにおけるメタン生成を減らすことは重要である。

ルーメン内のメタン生成菌は水素を利用して二酸化炭素を還元してメタンを生成している。メタンの温暖化に対する寄与率は二酸化炭素に次いで高ぐ総メタン放出量のうち、反芻家畜から放出されるメタンは 15〜20%を占めるとされる。

[0006] 抗生物質であるモネンシン等のィオノフォア類は、反芻動物用の飼料に広く使用されている。モネンシンは、ルーメン微生物に対して選択的な抑制効果を示し、結果としてメタン生成を低減させ、プロピオン酸生成を促進する働きがある。プロピオン酸は他の揮発性脂肪酸に比べて ATP生成効率が高!/、ことから、プロピオン酸の生成促進により飼料効率が改善される。

[0007] このような背景から反芻動物用飼料に添加するモネンシン等の代替物の開発が望まれている。代替物としては、植物抽出油（非特許文献 1)、抗乳酸生成菌ワクチン（非特許文献 2)、抗乳酸生成菌鶏卵抗体 (非特許文献 3)などが研究されている。しかしながら、これらの技術は効果が一定しない、飼料としての登録が認められないなどの課題が残されており実用化には至ってレ、なレ、。

[0008] 一方、マンノシルエリスリトールリピッド（MEUやラムノリピッド（RUに代表される糖脂質には、界面活性作用をはじめとするさまざまな性質があり、以下に述べるような多様な用途への展開が図られている。例えば、 MELを含むリボソームを用いて、遺伝子の導入効率を向上させる技術 (特許文献 1)、 MELを用いて薬剤耐性等の遺伝子を含むリボソームの形成を阻害し、薬剤耐性菌等の発生を減少させる方法 (特許文献 2)、 MELを抗炎症剤及び抗アレルギー剤の有効成分として用いる技術 (特許文献 3)等が知られている。また、ラムノリピッドを用いて天然繊維の吸水性を向上させる技術 (特許文献 4)、ラムノリピッドを用いて有害使用性有機化合物を含む非処理物から前記有機化合物を分離する技術 (特許文献 5)、ラムノリピッドを用いて高密度冷熱蓄熱輸送用の氷スラリーを調製することにより、氷の凝集及び合一を防止する技術 (特許文献 6)等が知られている。なお、 MELやラムノリピッドの抗菌性は一部報告されているが（非特許文献 4、非特許文献 5)、家畜の感染症を引き起こす細菌に対する抗菌性については、未だ検討されておらず、 MELやラムノリピッドを畜産分野で適用した例はない。

[0009] 特許文献 1：特開 2006— 174727号公報

特許文献 2：特開 2006— 158387号公報

特許文献 3 :特開 2005— 68015号公報

特許文献 4 :特開 2002— 105854号公報

特許文献 5：特開 2001— 327803号公報

特許文献 6：特開 2001 _ 131538号公報

非特許文献 l : Benchaar et al.， Can.J.Anim.Sci. 86， 91-96 (2006)

非特許文献 2 : Shu et al.， FEMS Immunology & Medical Microbiology, 26(2)， 153-15

8 (1999)

非特許文献 3 : DiLorenzo et al.， J.Anim.Sci. , 84,2178-2185 (2006)

非特許文献 4 : Fat. Sci. Technol., 91， 363-366， 1989

非特許文献 5 : Biotechnol.， 29， 91-96， 1993

発明の開示

[0010] 本発明は、鳥類及び哺乳類、特に家畜の疾病を予防又は治療するための安全かつ簡便な手段を提供することを課題とする。本発明は、特に、グラム陽性細菌によつて引き起こされる家畜の感染症を予防又は治療するための手段を提供することを課題とする。

また、本発明は、反芻動物のルーメン発酵を改善し、温暖化ガスの発生抑制に貢献し、更には飼料効率を向上させることを課題とする。

[0011] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、マンノシルエリスリト一ルリピッド (MEL)及びラムノリピッド (RL)等の糖脂質が、家畜の感染症を引き起こすグラム陽性細菌に対して、抗菌活性を有することを見出し、発明を完成するに至つ (RU等の糖脂質力ルーメンにおいてメタン生成を抑制し、かつ、プロピオン酸生成を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。

[0012] すなわち、本発明は以下のとおりである。

(1)マンノシルエリスリトールリピッド及び/又はラムノリピッドを含有する鳥類又は哺乳類用の飼料添加剤。

(2)家畜用であることを特徴とする、 (1)に記載の飼料添加剤。

(3)家畜が、鶏、豚又は牛であることを特徴とする、 (2)に記載の飼料添加剤。

(4)反芻動物用であることを特徴とする、（1)に記載の飼料添加剤。

(5)マンノシルエリスリトールリピッド力シユードザイマ（Pseudozyma)属に属する酵母力、ら得られることを特徴とする、（1 )〜（4)の何れかに記載の飼料添加剤。

(6)ラムノリピッド力シユードモナス（Pseudomonas)属に属する細菌力、ら得られることを特徴とする、（1)〜（5)の何れかに記載の飼料添加剤。

(7)疾病の予防又は治療用であることを特徴とする、（1)〜（6)の何れかに記載の飼料添加剤。

(8)前記疾病がグラム陽性細菌により引き起こされる感染症であることを特徴とする、 (7)に記載の飼料添加剤。

(9)グラム陽 1·生細菌が、スタフイロコッカス（Staphylococcus)属又はストレプトコッカス（ Streptococcus)属に属する細菌である（8)に記載の飼料添加剤。

(10)グラム陽性細菌が、スタフイロコッカス 'ァウレウス（Staphylococcus aureus)、スタフイノコッカス.ェピデルミディス（Staphylococcus epidermidis)、ストレプトコッカス'スィス (Streptococcus suis)又（まストレフ。トコッカス ' ビス (Streptococcus bovis)である (9 )に記載の飼料添加剤。

(11 ) (1)〜（； 10)の何れかに記載の飼料添加剤を含む、飼料。

(12) (11)に記載の飼料を、鳥類又は哺乳類に摂取させることを特徴とする、鳥類又は哺乳類の飼育方法。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1]図 1は、 RL及び MELのルーメンにおけるガスの生成量及び組成に対する影響を示す。

[図 2]図 2は、 RL及び MELのルーメンにおける揮発性脂肪酸の濃度および比率に対する影響を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本発明の飼料添加剤は、マンノシルエリスリトールリピッド（MEU及び/又はラムノリピッド (RL)を含有することを特徴とする。

[0015] MELは、糖脂質型のバイオサーファタタントの一種で、マンノース、エリスリトール及び脂肪酸が結合した構造を有しており、下記一般式（1)で表される。

[0016] [化 1]

[0017] 一般式（1)において、 R¹及び R²は、それぞれ独立して、炭素数 3〜25の脂肪族ァシル基である。特に、 R¹及び R²は、それぞれ独立して、炭素数 5〜； 14の脂肪族ァシル基であることが好ましい。また、 R¹及び R²は、それぞれ独立して、炭素数 5〜； 13の脂肪族ァシル基であってもよい。これらの脂肪族ァシル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよぐ飽和であっても不飽和であってもよい。また、 R³及び R⁴は、一方がァセチル基であり、他方が水素であるか、両方がァセチル基である。

なお、 R³及び R⁴が共にァセチル基であるものは MEL— A、 R³が水素であり、 R⁴がァセチル基であるものは MEL— B、 R³がァセチル基であり、 R⁴が水素であるものは M EL— Cと呼ば'れる。

また、本発明の飼料添加剤における MELは、一種のみであっても、複数種の混合物であってもよい。

[0018] 本発明において用いる MELは、菌類、特に酵母類などの微生物を培養して得ることができる。例えば、シユードザイマ（Pseudozyma)属、カンジダ（Candida)属、クルツマノミセス (Kurtzmanomyces)属に属する酵母等を用いることができる。また、 Shizonell a melanogrammaを用いることもできる。この中でも、シユードザイマ属に属する酵母を用いることが好ましい。シユードザイマ属に属する酵母としては、 Pseudozyma aphidis 、 Pseudozyma antarctica等が挙げられる。具体的には、例えは、 Pseudozyma aphidis NBRC皿 82菌株、 Peudozyma Antarctica NBRC 10260菌株、 Peudozyma Anta rctica NBRC 10736菌株を用いることができる。

NBRC皿 82菌株、 NBRC 10260菌株、 NBRC 10736菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（NBRC)に登録されている株である。また、 MELは、合成したものや市販品を用いることもできる。

[0019] ラムノリピッドは、糖脂質型のバイオサーファタタントの一種で、ラムノースと脂肪酸が結合した構造を有してレ、る。本発明にお!/、て用いるラムノリピッドは特に制限されないが、例えば下記一般式（2)又は一般式（3)で表される構造を有するものを用いること力 Sできる。

[0020] [化 2]

[0021] 一般式（2)において、 Rは、水素原子、—CH—〔CH (OH)〕 —CH (OH)、一（

2 m 2

XO) H、若しくは炭素数 1〜36のアルキル基、アルケニル基又は脂肪族ァシル基を n

示す。ここで、アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐状であってもよぐ脂肪族ァシル基は直鎖状であっても分岐状であってもよぐ飽和であっても不飽和であってもよい。また、 mは 0〜8の整数であり、 Xはエチレン、プロピレン及びブチレンの少なくとも一種を示し、 nは 1〜1000の整数である。 R⁶は、水素原子又は 2—デセ基である。 R⁵と R⁶は独立している。

[0022] [化 3]

一般式（3)において、 R⁷は、水素原子、 CH—〔CH (OH)〕 -CH (OH)、一（

2 m 2

XO) H、若しくは炭素数 1〜36のアルキル基、アルケニル基又は脂肪族ァシル基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐状であってもよぐ脂肪族ァシル基は直鎖状であっても分岐状であってもよぐ飽和であっても不飽和であってもよい。また、 mは 0〜8の整数であり、 Xはエチレン、プロピレン及びブチレンの少なくとも一種を示し、 nは 1〜1000の整数である。 R⁸は、水素原子又は 2—デセノィル基である。 R⁷と R⁸は独立している。

また、本発明の飼料添加剤におけるラムノリピッドは、一種のみであっても、複数種の混合物であってもよい。

[0024] 本発明において用いるラムノリピッドは、細菌を培養して得ること力 Sできる。例えば、シユードモナス（Pseudomonas)属、バークホルデリア（Burkholderia)属に属する細菌等を用いることができる。この中でも、シユードモナス属に属する細菌を用いることが奸ましい。シュートモフスに ϋ¾Τ 細菌としては、 Pseudomonas aeruginosa^ Pseudo monas chlororaphis等力、举け、りれる力、、 Pseudomonas sp.を用いることできる。ノークホルデリア属に属する細菌としては、 Burkholderia pseudomalle等が挙げられる。この中でも、特に Pseudomonas aeruginosaを用いることが好ましい。具体的には、例えば Pseudomonas aeruginosa NBRC 3924菌株、 Pseudomonas sp. DSM 2874菌株等を用いることができる。

NBRC 3924菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（NBRC)に登録されている菌株である。

DSM 2874菌株は、 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen una Zellkulturen GmbH (DSMZ)に登録されて!/、る菌株である。

また、ラムノリピッドは、合成したものや市販品を用いることもできる。

[0025] 上述した微生物を用いて MEL及びラムノリピッドを生産させるためには、以下のような方法を用いることができる。

MELを生産させるためには、天然油脂類、脂肪酸、アルコール、ケトン類、炭化水素類、 n—アルカン等の原料のうち、用いる微生物に適した原料を選択し、その微生物の培養に通常用いられる培養温度を用いて培養すればよ!/、。原料として好まし!/、のは、天然油脂類であり、例えば、大豆油、ひまわり油、ココナッツ油、綿実油、コーン油、パーム油等を用いることができ、この中でも特に大豆油が好ましく用いられる。また、ラムノリピッドを生産させるためには、天然油脂類、脂肪酸、アルコール、ケトン類、炭化水素類、 n—アルカン、糖類等の原料のうち、用いる微生物に適した原料を選択し、その微生物の培養に通常用いられる培養温度を用いて培養すればよい。このような方法として、例えば、特開平 10— 75796号公報に記載の方法を用いることができる。

何れの場合も、培養方法は特に制限されず、静置培養、往復動式振とう培養、回転動式振とう培養、ジャーフアーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いること力 Sでさる。

[0026] Pseudozyma属に属する酵母を用いて、 MELを生産する場合には、通常 Pseudozy 腿属に属する酵母の培養に用いられる培地に、大豆油等の天然油脂類を添加し、 2 0°C〜35°Cで培養すればよい。

また、 Pseudomonas属に属する細菌を用いて、ラムノリピッドを生産する場合には、通常 Pseudomonas属に属する細菌の培養に用いられる培地に、大豆油等の天然油脂類、グルコース等の糖類、エタノール等のアルコール類を添加し、 20〜40°Cで培養すればよい。

[0027] また、微生物を用いて MEL及び/又はラムノリピッドを生産する場合は、培養物を精製し、 MEL及び/又はラムノリピッドの精製品を用いてもよいし、培養物を遠心分離し、 MEL及び/又はラムノリピッドを含む画分を用いてもよい。また、培養物をそのまま用いてもよく、例えば、培養液や固体培養物を乾燥 4分砕したものなどを用いること力 Sできる。

[0028] 本発明の飼料添加剤は、 MEL及びラムノリピッドの何れかを含んでいてもよぐこれらの両方を含んでいてもよい。また、 MEL及び/又はラムノリピッドの含有量は、特に制限されないが、効果を十分に得る観点からは、好ましくは 10質量 ppm以上、さらに好ましくは 1質量％以上である。

[0029] また、本発明の飼料添加剤は、 MEL及び/又はラムノリピッドの他に、鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療に有効な成分、反芻動物の成長促進に有効な成分、栄養補助成分、保存安定性を高める成分等の任意成分をさらに含むものであってもよい。このような任意成分としては、例えば、ェンテロコッカス類、バチルス類、ビフィズス菌類等の生菌剤；アミラーゼ、リパーゼ等の酵素； Lーァスコルビン酸、塩化コリン、イノシトール、葉酸等のビタミン;塩化カリウム、クェン酸鉄、酸化マグネシウム、リン酸塩類等のミネラル、 DL—ァラニン、 DL—メチォニン、塩酸 L—リジン等のアミノ酸；フマル酸、酪酸、乳酸、酢酸及びそれらの塩類等の有機酸;エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；プロピオン酸カルシウム等の防カビ剤； CMC、カゼィンナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等の粘結剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の乳化剤；ァスタキサンチン、カンタキサンチン等の色素；各種エステル、エーテル、ケトン類等の着香料が挙げられる。

[0030] 本発明の飼料添加剤の剤形は特に制限されず、例えば粉末、液体、錠剤など任意の形態とすることができる。本発明の飼料添加剤は、 MEL及び/又はラムノリピッド、並びに必要に応じて任意成分を混合し、製剤化することにより製造することができる。

[0031] また、 MEL及びラムノリピッドは、鳥類又は哺乳類の疾病を引き起こす細菌に対して抗菌活性を示すことから、本発明の飼料添加剤は、これらの細菌によって引き起こされる鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療するために用いることができる。

本発明の飼料添加剤は、特にグラム陽性細菌により引き起こされる感染症の予防又は治療に好適に用いることができる。

このようなグラム陽性細菌としては、例えば、 Micrococcus, Staphylococcus、 Strepto coccus、 Planococcus、 ^tomatococcus^ terococcus、 Peptococcus、 Peptostreptococ cus、 Ruminococcus、 Leuconostoc^ Psdiococcus、 Asrococcus、 Gemella^ Coprococcu s、 Sarcina、 Bacillus Clostridium^ Lactobacillus Listeria^ Erysipelothrix、 Corynebac terium、 Rhodococcus、 Propionibacterium^ Eubacterium、 Actinomyces^ Bifidobacteriu m、 Mycobacterium, Nocardia, Dermatophilus等の属に属する細菌カ挙げられる。本発明の飼料添加剤は、特に、スタフイロコッカス属又はストレプトコッカス属に属する細菌、具体的に (ュ Staphylococcus aureus staphylococcus epidermidis、 ^treptococ cus suis、 Streptococcus bovis等により引き起こされる疾病の予防又は治療に好適に用いること力 Sでさる。

[0032] 本発明の飼料添加剤は、鳥類又は哺乳類の飼料、ペットフード、ペット用サブリメント（以下、飼料という。）に用いられる他の飼料成分と混合して、鳥類又は哺乳類用の飼料とすること力できる。飼料の種類や成分は、特に制限されない。また、本発明の飼料には、飼料添加剤に添加することができる、上記任意成分を加えて調製してもよい。また、本発明の飼料は、鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療するための飼料とすることあでさる。

[0033] 本発明の飼料における MEL及び/又はラムノリピッドの含有量は、与える動物の種類、健康状態、飼料の種類、飼料成分、年齢、性別、体重等により適宜調節され、特に制限されないが、乾物質量当たり、好ましくは 1〜； 10000質量 ppm、さらに好まし <は 10〜； 10000質量 ppm、さらに好まし <は 10〜； 1000質量 ppmである。

[0034] 本発明の飼料は、飼料添加剤をそのまま飼料成分に添加し、混合して製造することができる。この際、粉末状、固形状の飼料添加剤を用いる場合は、混合を容易にするために飼料添加剤を液状又はゲル状の形態にしてもよい。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビュルアルコールやポリビュルピ口リドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中における MEL及び/又はラムノリピッドの均一性を保っために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グァーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。

[0035] 本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、鳥類又は哺乳類である。例えば、家畜や犬、猫などのペットに用いることができる。本発明の飼料は、この中でも家畜、特に鶏、豚、牛の飼育に好適である。また、反芻動物の飼育にも好適である。例えば、本発明の飼料は、牛、ャギ、羊などの飼育に好適である。摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。

飼料を摂取させる方法及び飼育する方法は、動物の種類に応じて、通常用いられる方 '法をとることができる。

実施例

[0036] [I]抗菌性の評価

< 1〉MELの生産

(1)シユードザイマ属酵母の培養 (前培養）

ポテトデキストロース培地 10mlを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、 Pseudozyma aphidis NBRC 10182を植菌し、 30。Cにて 24時間振とう培養した。

(本培養）

イオン交換水、大豆油 8%、 NaNO 0. 2%、 KH PO 0. 02%、 MgSO · 7Η Ο

3 2 4 4 2

0. 02%、 yeast extract 0. 1 %からなる培地 50mlを 500mlErlenmeyerフラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。そこに、先述した NBRC 10182 の前培養液を加え、 30°C/220rpmにて 7日間振とう培養を行った。

(2) MELの抽出 ·精製

(抽出）

本培養で得た培養液 50mlを分液ロートにとり、等量の酢酸ェチルで二回抽出を行い、酢酸ェチル層を合わせて溶媒を留去した。その後、メタノール 25mlに溶解し、 5 0mlのへキサンで二回洗浄した後、メタノールを留去して、 MELの粗精製物を得た（後述のアンスロン反応より、純度 69%)。

(精製）

上記粗精製物 lgを少量のクロ口ホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて分画した。クロロホノレム 500ml、クロ口ホルム/酢酸ェチル = 4/1 500ml,アセトン 500ml、メタノール 500mlを順次流して分画した。

各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒 CHC1 /MeOH/水 = 65

3

/15/2)、下記文献 1)に記述された、各種 MELの Rf直（Rf = 0. 52、 0. 58、 0. 6 3、 0. 77)を示す画分を選別し、これらの画分をまとめて標準サンプルとした。

DAgric. Biol. Chem., 54 (1) 31-36， 1990

(純度測定:アンスロン反応）

酢酸ェチルにより適度な濃度に希釈した粗精製物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（0. 2%アンスロン 75%硫酸液） 5mlを加え、沸騰水中で 1

0分間反応させ、 620nmの吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。 [0038] < 2〉ラムノリピッドの生産

(1)シユードモナス属菌の培養

(前培養）

ペプトン培地 10mlを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、 Pseu domonas aeruginosa NBRC 3924を植菌し、 30°Cにて 24時間振とう培養した。

(本培養）

イオン交換水、 CaCO 0. 2%、 K HPO 0. 05%、 MgSO · 7Η Ο 0. 05%、 yea

3 2 4 4 2

st extract 0. 5%、 Soy flour 0. 5%からなる培地 50mlを 500mlErlenmeyerフラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレープにて滅菌した。そこに、フィルター滅菌したェタノール lml及び先述した NBRC 3924の前培養液を加え、二日ごとにフィルター滅菌したエタノール 0. 75mlを加え、 28°C/220rpmにて 8日間振とう培養を行った。

[0039] (2)ラムノリピッドの抽出-精製

(抽出）

本培養で得た培養液 50mlを分液ロートにとり、メタノール/クロ口ホルム = 1/1で二回抽出を行い、有機層を合わせて溶媒を留去し、ラムノリピッドの粗精製物を得た（後述のアンスロン反応より、純度 55%)。

(精製）

上記本培養で得た培養液 450mlを pH3に調製し、遠心分離により菌体を除去した。上清を、 0. 5M Tris— HClバッファー（ρΗ9· 0)で前処理した TSKgel DEAE— トヨパール 650Mを詰めたカラムに通し、その後 0· 5M Tris— HClバッファー（pH9 . 0)にてカラム洗浄した。 NaCl濃度 0〜0· 4Μ (0. 5Μ Tris— HClバッファー（ρΗ9 • 0) )の範囲でグラジェントをかけ、 2· 3ml/minでカラムに通し、ゲルに捕捉されて V、るラムノリピッドを溶出させて分画した。

3

/25/4)、下記文献 2)に記述された、各種ラムノリピッドの Rf値 (Rf = 0. 32、 0. 5 2)を示す画分を選別し、メタノール/クロ口ホルム = 1/1で抽出して、これらの画分をまとめて溶媒を留去して標準サンプルとした。

2) Biotechnology Letters, 54 (12) 1213-1215， 1997 (純度測定:アンスロン反応）

メタノールにより適度な濃度に希釈した粗精製物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（0. 2%アンスロン 75%硫酸液） 5mlを加え、沸騰水中で 10 分間反応させ、 620nmの吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。

[0040] < 3 >抗菌性の評価

下記の要領で、 MEL、ラムノリピッドについて、表 1に示す各種細菌の最小発育阻止濃度 (MIC)を測定した。

各種細菌の前培養は、感受性測定用ブイヨン培地（日水）を用いて行った。培養液の菌濃度を生理食塩水にて約 1. O X 10⁵〜； 10⁶CFU/mlとなるように調製したのち、測定培地に各種細菌を接種した。測定培地としては、 Staphylococcus aureus, Stap hylococcus epidermidis, Bacillus subtilisについては感受性測定用培地（日水）を用い、 Streptococcus suis、 Streptococcus bovisについては Jki夜寒天培地 (ノヽ一トインフ一ジョン培地：日水、綿羊無菌脱繊維血液：コージンバイオ)を用いた。培養は、 Stap nylococcus aureus及び Staphylococcus epidermidis、 Bacillus subtilis ίこつレヽ飞 tよ好¼ 培養、 Streptococcus suis、 Streptococcus bovisについては 5%炭酸ガス培養にて、いずれも 37°C、約 20時間行った。培養終了後、 MICを測定した。

MELは、 < 1〉で得た MELの粗精製物（純度 69%)を、ラムノリピッドは、 < 2〉で得たラムノリピッドの粗精製物（純度 55%)を使用した。また、比較のために、ショ糖ェスァノレ (Sucrose monodecanoate:シグマァノレドリッテシヤノヽン品ノ、マンノース (禾ロ光純薬工業品）、ラムノース（シグマアルドリッチジャパン品）についても MICを測定した。結果を表 1に示す。

[0041] [表 1] 表 1

[0042] MEL及びラムノリピッドは、同じ糖脂質の Sucrose monodecanoateと比較して、 Staph ylococcus、 Streptococcus, Bacillus属の細菌に対して数〜数十倍高い抗菌活性を示した。一方、糖脂質の構成体であるマンノース及びラムノースは抗菌活性を示さなかつた。

これより、 MEL及びラムノリピッドを鳥類や哺乳類に摂取させて飼育することにより、上記各種細菌により引き起こされる疾病を予防又は治療する効果が期待される。

[0043] [II]ガスおよび揮発性脂肪酸の生成量の評価

< 1 >マンノシルエリスリトールリピッド（MEL)の生産

( 1 )シユードザイマ属酵母の培養

(前培養）

ポテトデキストロース培地 10mlを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、 Psuedozyma aphidis NBRC 10182を植菌し、 30°Cにて 24時間振とう培養した。

(本培養）

イオン交換水、大豆油 8 %、關0 0· 2%、 ΚΗ ΡΟ 0.02%、 MgSO · 7Η 0 0.02%、

3 2 4 4 2

yeast extract 0.1%からなる培地 50mlを 500mlErlenmeyerフラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。其処に先述した Psuedozyma aphidis NBRC 10 182の前培養液を加え、 30°C/220rpmにて 10日間振とう培養を行った。

[0044] (2) MELの精製

(精製）

上記培養液 50mlに IN HC1を加え pH3に調整した後、遠心分離により上清を取り除いた。沈殿部に純水 50mlを加え撹拌した後、もう一度遠心分離操作を行い、沈殿部を回収した。沈殿部を 10mlの MeOHに溶解させた後、更に 10mlのへキサンを加え洗浄を行った（3回）。洗浄後の MeOH溶液に水 10mlを加え、そこからクロ口ホルム 10mlにて MELの抽出操作を行った（3回）。クロ口ホルム層を合せて溶媒を留去し、粗精製物を得た。アンスロン反応より純度 90%。

(標準サンプル）

上記粗精製物 lgを少量のクロ口ホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて分画した。クロロホルム 500ml、クロ口ホルム/酢酸ェチル = 4/1 500ml,アセトン 500ml、メタノール 500mlを順次流して分画した。

各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒 CHC1 /MeOH/水： 65/15/2

)、 Agri Biol. Chem., 54(1)，31_36， 1990に記述された Rf 直の分画（各種 MELが示す Rf値、 Rf = 0.52, 0.58, 0.63, 0.77)を選別し、それらをまとめて標準サンプルとした

〇

(純度測定:アンスロン反応）

酢酸ェチルにより適度な濃度に希釈した粗生成物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（0.2%アンスロン 75%硫酸液） 5mlを加え、沸騰水中で 10分間反応させ、 620匪の吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。

Bio Future Ltd.社製 BFL Biosurfactant (ラムノリピッド）を乾燥して使用した。

< 3〉ラムノリピッド（RUおよびマンノシルエリスリトールリピッド（MEL)のルーメンにおけるガス生成および揮発性脂肪酸生成に対する影響

(1)試料

前記したラムノリピッド（RUおよびマンノシルエリスリトールリピッド（MEUを供試した。培養イノキュラムには北海道大学北方生物圏フィールド科学センター生物生産研究農場所有のホルスタイン種雌牛 (ルーメンカニューレ装着）力採取したルーメン液（4重ガーゼろ液）を用いた。イノキュラムは McDougalの人工唾液（pH 6.8)で 2倍に希釈して使用した。 (2)培養

試験培養液濃度を RLで 500 μ g/ml、 MELで 500 μ g/mlとして実施した。 RL、 MEL 各 0.05gをそれぞれ lmlのエタノールに溶解し、各 100 1をハンゲートチューブに添加した。数時間放置することでエタノールを揮散させた。ここに培養基質としてコーンスターチ 0· 15g、配合飼料粉末 0.025gおよびオーチャードグラス乾草粉末 0.025gを加えた。上記の希釈ルーメン液を 10ml加え、ヘッドスペースに窒素ガスを吹き込みながらブチルゴムキャップとプラスチックスクリューキャップを施し、ウォーターバスにて嫌気培養した (37°C、 18時間)。

処理は無添加（エタノールのみ：対照区）、 RL添加 (RLE)および MEL添加 (ME L区）とし、それぞれ 5連の培養とした。

(3)分析

メタン、水素、二酸化炭素は TCDガスクロマトグラフィーにて分析した。総揮発性脂肪酸 (VFA)濃度と組成は FIDガスクロマトグラフィーで測定した。

(4)結果

(i)ガス生成

培養 18時間後の総ガス量は、 RL区および MEL区とも減少した（各々 51 %および 4 8%の減）。このうちメタンの減少はとくに顕著で、 RL区および MEL区で各々 96%および 99%の減少が認められ、メタン生成はほぼなくなった。二酸化炭素は RL区および MEL区で各々 37%および 35%減少した。総ガスにしめる比率でみると、メタンでは対照区の 23.7%にくらべ RL区で 2.1%へ、 MEL区で 0.3%に低下した。

結果を表 2および図 1に示す。

[表 2] 表 2

a , b , c ：異符号間に有意差あり

bと cの間は、 aと bの間と同様の有意差あり

斜体：対照に対して有意差あり

[0048] (ii)揮発性脂肪酸 (VFA)の生成

総 VFA濃度は処理による影響はなかった力各 VF A産生パターンは大きく変化した。すなわち、酢酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸およびイソ吉草酸濃度は RL添加および MEL添加により有意に低下した。一方、プロピオン酸濃度は顕著に増加した（RL 区で 85%、 MEL区で 53%増）。各酸のモル比率はプロピオン酸が増加（25.8%力 6. 7%および 41.1%へ）、酢酸と酪酸が低下（各々 60.9%が 49.7%および 53.4%へ、 10. 6%力 ¾·0%および 5.0%へ）したが、いずれも有意であった。とくにプロピオン酸比率は通常のルーメンでは見られないほどの上昇をみた。

結果を表 3および図 2に示す。

[0049] [表 3]

表 3

a , b , c ：異符号間に有意差あり

bと cの間は、 aと bの間と同様の有意差あり

斜体：対照に対して有意差あり産業上の利用の可能性

本発明の飼料添加剤を飼料に混合し、鳥類又は哺乳類に摂取させることにより、疾病を予防又は治療することができる。具体的には、グラム陽性細菌による感染症を予防又は治療することができる。本発明の飼料添加剤を含有する飼料は、鶏、豚、牛などの家畜の飼育に好適に用いることができる。また、本発明の飼料添加剤は、生分解性が高ぐ生体及び環境に対する安全性が高い。

また、本発明の飼料添加剤を飼料に混合し、反芻動物に摂取させることにより、メタン生成を抑制し、かつ、プロピオン酸生成を促進することができ、その結果、反芻動物の成長を促進させ、飼料効率を改善することができる。本発明の飼料添加剤を含有する飼料は、牛、ャギ、羊などの反芻動物の飼育に好適に用いることができる。また、本発明の飼料添加剤は、生分解性が高ぐ生体及び環境に対する安全性が高い。

Claims

請求の範囲

[I] マンノシルエリスリトールリピッド及び/又はラムノリピッドを含有する鳥類又は哺乳類用の飼料添加剤。

[2] 家畜用であることを特徴とする、請求項 1に記載の飼料添加剤。

[3] 家畜が、鶏、豚又は牛であることを特徴とする、請求項 2に記載の飼料添加剤。

[4] 反芻動物用であることを特徴とする、請求項 1に記載の飼料添加剤。

[5] マンノシルエリスリトールリピッド力 S、シユードザイマ（Pseudozyma)属に属する酵母から得られることを特徴とする、請求項 1〜4の何れか一項に記載の飼料添加剤。

[6] ラムノリピッド力シユードモナス（Pseudomonas)属に属する細菌力も得られることを特徴とする、請求項 1〜5の何れか一項に記載の飼料添加剤。

[7] 疾病の予防又は治療用であることを特徴とする、請求項;!〜 6の何れか一項に記載の飼料添加剤。

[8] 前記疾病がグラム陽性細菌により引き起こされる感染症であることを特徴とする、請求項 7に記載の飼料添加剤。

[9] グラム陽 1·生細菌が、スタフイロコッカス（Staphylococcus)属又はストレプトコッカス（Str 印 tococcus)属に属する細菌である請求項 8に記載の飼料添加剤。

[10] グラム陽性細菌が、スタフイロコッカス 'ァウレウス（Staphylococcus aureus)、スタフィノコッカス.ェピデルミディス（Staphylococcus epidermidis)、ストレプトコッカス'スイス（

Streptococcus suis 又（まストレフ。トコッカス 'ボビス (Streptococcus bovis)である青求項 9に記載の飼料添加剤。

[I I] 請求項;!〜 10の何れか一項に記載の飼料添加剤を含む、飼料。

[12] 請求項 11に記載の飼料を、鳥類又は哺乳類に摂取させることを特徴とする、鳥類又は哺乳類の飼育方法。