CN110769687A - 用于加强水产养殖和观赏鱼类饲养的成本有效的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于增强水产养殖的基于微生物的产品及其用途。特别地，本发明提供了通过将基于酵母和/或基于生物表面活性剂的组合物施用于养鱼场来生产健康和高质量养殖鱼的材料和方法。在一个实施方式中，本发明改善了养殖鱼的环境。在另一个实施方式中，本发明提供了一种营养丰富的鱼饲料，以及以低成本喂鱼的方法。

Description

用于加强水产养殖和观赏鱼类饲养的成本有效的组合物和 方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年4月20日提交的美国临时申请序列号62/487,676的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

背景技术

水产养殖(水产饲养或水产喂养)涉及在受控条件下养殖淡水或咸水生物种群。更具体地说，水产养殖是指食用或观赏鱼和其他水生生物(如虾和牡蛎)的养殖。水生生物的养殖通常涉及在饲养过程中通过某种形式的干预来提高产量，例如，定期饲养种群，喂养种群和/或保护种群免受掠食者的侵害。据报告，全球水产养殖业供应了人类消费的一半以上的鱼类和贝类。

鱼群的喂养，特别是在大规模养殖的情况下，占水产养殖经营支出的很大一部分。鱼类食品必须包含高度可消化的蛋白质来源以及适当营养所需的各种其他成分，包括氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质、胆固醇和必需脂肪酸。饲料来源可包括例如鱼粉、虾粉、鱿鱼粉、大豆粉、螺旋藻和全麦，或其组合。

一些水产养殖方法包括需要多方面系统的高度复杂的水培技术，在某些情况下，将鱼类养殖与植物养殖结合在一起。其他方法(例如大规模工厂化鱼类养殖)的目标是尽可能便宜地生产尽可能多的鱼。鱼和虾可能会养在过度拥挤的环境中，因此，在围栏本身和周围水域中的污染风险很高。鱼类工厂可能不卫生，通常需要大量的抗生素、激素和杀虫剂来控制疾病的传播。

水产养殖业面临的另一个问题是由于二氧化碳“窒息”而造成的鱼品大量损失。鱼塘中二氧化碳的主要来源来自鱼以及构成池塘生物区系的微小动植物的呼吸作用。有机物的分解也是二氧化碳的主要来源。鱼池中二氧化碳含量的增加，加上来分解自鱼尸体的水会导致鱼窒息和死亡。

当前的二氧化碳去除方法包括用浸灰剂，例如生石灰、熟石灰或碳酸钠对池塘水进行化学处理。这些试剂直接与二氧化碳反应，导致二氧化碳减少和碱度增加。但是，使用化学药品处理过量的二氧化碳只能提供一种临时解决方案，并且由于所用化学药品的毒性而受到限制。也可以使用机械方法(包括曝气和混合)来管理二氧化碳以及溶解氧，但是这些方法耗能很高。

水产养殖的另一个持续性问题是粘液形成或池塘浮渣。池塘中的粘液形成是多种藻类、真菌和鱼类的生命过程的结果。粘液积聚的区域通常会产生难闻的气味，这也会导致鱼类也获得恶臭。此外，一些产生粘液的生物还可能产生有害的副产品，这些副产品可能对鱼类甚至消费者产生毒性。

在水产养殖业中遇到的其他问题包括鱼类种群中的感染和侵染。所有鱼类均携带病原体和寄生虫，鱼类中的传染病通常与养殖鱼类和观赏鱼类有关。疾病尤其是幼鱼死亡率的一个因素，相互作用因素可能导致低度感染成为大规模流行病，从而大大降低了鱼的质量和商业用途的可能性。

尽管产品质量下降，大规模工厂化养鱼对环境的影响日益严重，但该行业仍在继续广泛发展。因此，需要一种无毒且对环境无害的产品，以降低鱼的饲养成本，并减少导致水产养殖中高运营成本以及鱼产品健康和质量下降的各种问题。

发明概述

本发明提供了用于增强水产养殖的基于微生物的产品及其用途。特别地，本发明提供了用于生产健康和高质量的养殖鱼的材料和方法。有利地，本发明在不使用例如有毒化合物或抗生素的情况下增强了水产养殖。因此，本发明的材料和方法是环境友好的，操作方便的和成本有效的。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法可用于改善水质和净度，增强鱼类的病原体防御能力并刺激鱼类的生长。

在一个实施方式中，本发明提供了基于微生物的组合物以及使用这些组合物改善水产养殖和水产饲养的方法。在一个具体的实施方式中，本发明利用包含产生生化物质的微生物及其生长副产物(例如生物表面活性剂、溶剂和/或酶)的组合物。在一个实施方式中，该组合物包含由微生物的培养产生的发酵液。

在优选的实施方式中，本发明组合物的微生物是培养的产生物表面活性剂、溶剂和/或酶的酵母。在一个实施方式中，微生物是例如培养的球拟假丝酵母(Starmerellabombicola)、蜜生假丝酵母(Candida apicola)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、西毕赤酵母(Pichiaoccidentalis)和/或蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)。在一个实施方式中，微生物是这些种类的酵母中的任意一者的培养的突变体。

在优选的实施方式中，本发明组合物的微生物生长副产物是生物表面活性剂、溶剂、酶或其他代谢物。在一个实施方式中，由微生物产生的生长副产物彼此协同作用以产生期望的效果。

在某些实施方式中，微生物生长副产物由于微生物生长而存在于组合物中。在一些实施方式中，可以将纯化的微生物生长副产物，例如一种或多种糖脂和/或脂肽生物表面活性剂添加到组合物中。

在一个实施方式中，根据本发明的基于微生物的组合物是通过从小规模到大规模的培养方法获得的。培养过程可以是例如深层培养、固态发酵(SSF)和/或其组合。

在某些实施方式中，本发明的组合物优于例如单独的生物表面活性剂、溶剂和/或酶，包括以下的一种或多种：作为酵母细胞壁外表面的一部分的高浓度的甘露糖蛋白；酵母细胞壁中存在的β-葡聚糖；培养物中存在的生物表面活性剂、代谢产物和/或溶剂(例如乳酸、乙醇、乙酸乙酯等)。

在一个实施方式中，本发明提供一种通过将包含一种或多种微生物的菌株和/或微生物生长副产物的基于微生物的组合物施用于养鱼场来增强水产养殖的方法。在一个实施方式中，该组合物是本发明的基于微生物的组合物。

根据本发明方法的“加强水产养殖”可能意味着，例如，通过减少水中的二氧化碳积累来提高养鱼场水的质量和净度；预防和/或治疗养鱼场中存在的病原体引起的感染或侵染；和/或通过补充饲料和改善营养吸收来刺激鱼的生长。

在优选的实施方式中，应用于养鱼场的微生物是培养的产生物表面活性剂、溶剂和/或酶的酵母，例如，球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)、蜜生假丝酵母(Candidaapicola)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、西毕赤酵母(Pichia occidentalis)和/或蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)。在一个实施方式中，微生物是这些种类的酵母中的任意一者的培养的突变体。

在某些实施方式中，本发明的微生物可以与其他化学和/或微生物处理结合使用。例如，不同种类的酵母可以一起使用，例如异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)。微生物的其他组合也是可以预期的。

施用时微生物可以是活的(或有生命的)或无活性的。本发明的方法可以进一步包括添加材料以在施用过程中增强微生物的生长(例如，添加营养以促进微生物的生长)。在一个实施方式中，营养源可包括例如氮和/或碳的有机源。

在优选的实施方式中，根据本发明方法的微生物生长副产物是生物表面活性剂、溶剂、酶或其他代谢物。在一个实施方案中，由微生物产生的生长副产物彼此协同作用以产生期望的效果。

在某些实施方式中，由于微生物生长而存在微生物生长副产物。在一些实施方式中，纯化的微生物生长副产物，例如一种或多种糖脂和/或脂肽生物表面活性剂，可以与基于微生物的组合物一起施用。

在一个实施方式中，提供了使用本发明的基于微生物的组合物喂养鱼的方法。该基于微生物的组合物可以用作鱼类的高营养补充食物来源，并且可以作为防止病原微生物污染鱼类食物的预防措施。在一个实施方式中，喂鱼的方法可包括将基于微生物的组合物引入养鱼场或水族馆，并允许其中的鱼摄取该组合物。有利地，本发明可以用于减少饲养养殖鱼的成本。

有利地，可以在不将大量无机化合物释放到环境中的情况下使用本发明。另外，该组合物和方法利用了可生物降解和毒理学上安全的组分。因此，本发明可以作为“绿色”处理用于增强鱼类养殖。

发明详述

本发明提供了用于增强水产养殖的基于微生物的产品及其用途。特别地，本发明提供了用于生产健康和高质量的养殖鱼的材料和方法。有利地，本发明在不使用例如有毒化合物或抗生素的情况下增强了水产养殖。因此，本发明的材料和方法是环境友好的，操作方便的和成本有效的。

在某些实施方式中，本发明通过用基于微生物的组合物处理养鱼场和水族馆来增强水产养殖，该基于微生物的组合物能够例如刺激鱼的生长，改善水质并增强病原防御。特别地，本发明的组合物可用于例如喂鱼和改善鱼的消化道中的营养吸收，清洁鱼池和鱼缸中的水，保护鱼免受感染和/或减少水中二氧化碳的积累。

术语定义

如本文所用，“水产养殖(aquaculture)”，“水产养殖(aquafarming)”，“水产养殖(aquatic farming)”，“水产饲养”或“养鱼”是指在养鱼场中繁殖、饲养和收获水生动物。水产养殖可以是集约化(在人工围栏内依靠人工饲养技术高密度养鱼的技术)，也可以是广泛的(在海洋或天然和人造湖，海湾河峡或其他水域中进行)。水产养殖包括从孵化场鱼类和贝类生产海鲜，并在围栏、池塘、水箱、水族馆、网箱或水道中使其生长到市场规模。另外，水产养殖包括海水养殖，这需要在开放海水或封闭海水中进行海洋生物的养殖。此外，水产养殖包括种群(stock)恢复或“增强”，其中孵化鱼类和贝类被释放到野外，以重建野生种群或沿海生境。更进一步，水产养殖业包括为水族贸易生产观赏鱼，以及饲养在水族馆内的观赏鱼。可以养殖的物种包括淡水或咸水鱼类和贝类，并且可以包括观赏鱼、食用鱼、娱乐用鱼、诱饵鱼、甲壳类动物、软体动物、藻类、海菜或鱼卵。

如本文所用，“养鱼场”是发生或可以发生水产养殖的任何水环境。根据本公开的养鱼场可以包括人造的或天然存在的所有类型的水环境或水环境的部分，包括池塘、灌溉沟渠、河流、湖泊、海洋、峡湾、水箱、水族馆、网箱或水道。

如本文所用，提及“基于微生物的组合物”是指包含由于微生物或其他细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。因此，基于微生物的组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可以是营养状态，孢子形式，菌丝体形式，任何其他形式的繁殖体或它们的混合物。微生物可以是浮游生物或生物膜形式，或两者的混合物。生长的副产物可以是例如代谢产物(例如生物表面活性剂)，细胞膜成分，表达的蛋白质和/或其他细胞成分。微生物可以是完整的或裂解的。细胞可能不存在，或者以例如每毫升组合物中1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶、1x 10⁷、1x 10⁸、1x 10⁹、1x 10¹⁰或1x 10¹¹或更高的细胞或繁殖体的浓度而存在。

如本文所用，繁殖体是可从新的和/或成熟的生物发展的微生物的任何部分，包括但不限于细胞、分生孢子、囊肿、孢子(例如生殖孢子，内生孢子和外孢子)、菌丝体、芽和种子。

本发明进一步提供“基于微生物的产品”，其是在实践中将被应用以实现期望结果的产品。基于微生物的产品可以简单地是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。或者，基于微生物的产品可以包含已经添加的其他成分。这些额外的成分可以包括，例如，稳定剂、缓冲液、适当的载体(例如水、盐溶液或任何其他适当的载体)、添加的营养物质以支持进一步的微生物生长，非营养物质的生长促进剂(例如植物激素)和/或有助于追踪微生物和/或所施用环境中的成分的物质。基于微生物的产品还可以包含基于微生物的组合物的混合物。所述基于微生物的产品还可以包含已经以某种方式，例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等处理的基于微生物的组合物的一种或多种组分。

如本文所用，“收获”是指从生长容器中移除一些或全部基于微生物的组合物。

如本文所用，“生物膜”是微生物例如细菌的复杂聚集体，其中细胞彼此粘附。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物的浮游细胞，后者是可以在液体培养基中漂浮或游泳的单个细胞。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分子，多核苷酸，多肽，蛋白质或有机化合物例如小分子(例如下文描述的那些)基本上不含它在自然界中与之相联系的其他化合物，如细胞物质。如本文所用，在微生物菌株的上下文中提及“分离的”是指将菌株从其自然存在的环境中移除。因此，分离的菌株可以作为例如生物学纯的培养物或作为与载体结合的孢子(或菌株的其他形式)存在。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含其处于自然状态下的侧翼的基因或序列。纯化或分离的多肽不含其处于自然状态下的侧翼的氨基酸或序列。。

在某些实施方式中，纯化的化合物为目标化合物的重量(干重)的至少60％。优选地，该制剂为目标化合物重量的至少75％，更优选至少90％，最优选至少99％。例如，纯化的化合物是目标化合物重量的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。通过任何适当的标准方法，例如通过柱色谱法，薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析来测量纯度。

“代谢物”是指由代谢产生的任何物质或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是有机化合物，它是代谢的原料(例如葡萄糖)，中间体(例如乙酰辅酶A)或终产物(例如正丁醇)。代谢物的实例可包括但不限于酶、毒素、酸、溶剂、醇、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、聚合物和表面活性剂。

如本文所使用的，“调节”可以与改变(例如，增加或减少)互换。通过标准技术已知的方法，例如本文所述的方法，可以检测到这种改变。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。例如，范围1到50应该理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50以及上述整数之间的所有中间十进制值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9构成的组的任何数字、数字的组合或子范围。关于子范围，特别地考虑了从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可以在一个方向上包括1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一个方向上包括50到40、50到30、50到20和50到10。

如本文所用，“减少”是指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的负变化。

如本文所用，“参考”是指标准或对照条件。

如本文所用，“表面活性剂”是指降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂充当洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活生物体产生的表面活性剂。

过渡术语“包含”或其之同义的“包括”或“含有”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。相反，过渡短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡性短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤上，“以及那些实质上不影响所要求保护的发明的本质和新颖性特征的材料或步骤”。

除非特别声明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“一个”，“和”和“该”应理解为单数或复数。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差之内。“约”可以理解为所述数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内的范围。

本文在变量的任何定义中列举化学基团的描述包括将该变量定义为所列基团的任何单个基团或组合。本文中对变量或方面的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合。

基于微生物的组合物

本发明提供微生物及其生长的副产物，例如生物表面活性剂、溶剂和/或酶。本发明还提供了在改良的水产养殖和水产饲养中使用这些微生物及其副产物的方法。此外，本发明提供了生产基于微生物的组合物，以及微生物生长的副产物的材料和方法。

有利地，根据本发明的基于微生物的组合物是无毒的(即，摄入毒性大于5g/kg)，并且可以以高浓度施用而不会引起例如对皮肤的刺激。因此，本发明在存在生物体例如为人类食用而生产的鱼和虾的情况下施用基于微生物的组合物时特别有用。

在一个实施方式中，本发明提供了基于微生物的组合物以及使用这些组合物改善水产养殖和水产饲养的方法。在特定的实施方式中，本发明利用了包含产生化物质的微生物及其生长副产物例如生物表面活性剂、溶剂和/或酶的组合物。在一个实施方式中，该组合物包含由微生物的培养产生的发酵液。

在优选的实施方式中，本发明组合物的微生物是培养的产生物表面活性剂、溶剂和/或酶的酵母。

这些微生物可以是天然的或遗传修饰的微生物。例如，可以用特定基因转化微生物以表现出特定特征。微生物也可以是所需菌株的突变体。如本文所用，“突变体”是指参考微生物的菌株，遗传变异体或亚型，其中，与参考微生物相比，突变体具有一个或多个遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、重复、移码突变或重复扩增)。制备突变体的方法是微生物学领域众所周知的。例如，为此目的广泛使用了紫外线诱变和亚硝基胍。

根据本发明适合使用的酵母和真菌包括，例如，假丝酵母(Candida)(例如C.apicola)，酿酒酵母(Saccharomyces)(例如S.cerevisiae,S.boulardiisequela,S.torula)，伊萨氏酵母(Issatchenkia)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)，毕赤酵母(Pichia)，异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)(例如W.anomalus)，球拟假丝酵母(Starmerella)(例如S.bombicola)，菌根(Mycorrhiza)，被孢霉(Mortierella)，须霉菌(Phycomyces)，布拉霉(Blakeslea)，破囊壶菌(Thraustochytrium)，腐霉(Phythium)，虫霉(Entomophthora)，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)，曲霉(Aspergillus)和/或根霉(Rhizopus spp)。

在一个实施方式中，微生物是嗜杀酵母(killer yeast)。如本文所用，“嗜杀酵母”意指特征在于其分泌毒性蛋白或糖蛋白的酵母菌株，该菌株本身对这些是免疫的。嗜杀酵母分泌的外毒素能够杀死酵母，真菌或细菌的其他菌株。例如，可以被嗜杀酵母控制的微生物包括镰刀菌(Fusarium)和其他丝状真菌。根据本发明的嗜杀酵母的实例包括但不限于异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)(例如W.anomalus)，毕赤酵母(Pichia)(例如P.anomala,P.guielliermondii,P.occidentalis,P.kudriavzevii)，汉逊酵母(Hansenula)，酿酒酵母(Saccharomyces)，有孢汉逊酵母(Hanseniaspora)(例如H.uvarum)，黑粉菌(Ustilago)(例如U.maydis)，汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyceshansenii)，假丝酵母(Candida)，隐球菌(Cryptococcus)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)，球拟酵母(Torulopsis)，拟威尔酵母(Williopsis)，接合酵母(Zygosaccharomyces)(例如Z.bailii)等。

在一个实施方式中，微生物是培养的嗜杀酵母菌株或其突变体，例如异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)(异常毕赤酵母(Pichia anomala))，季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)和/或西毕赤酵母(Pichia occidentalis)。

在一些实施方式中，微生物是培养的假单胞菌(Pseudozyma)酵母，例如蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)。在其他实施方式中，微生物是培养的球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)。另一个实施方式中，微生物是培养的假丝酵母(Candidaapicola)。

根据本发明，也可以使用其他微生物菌株，包括例如能够累积大量例如生物表面活性剂的其他微生物菌株。根据本发明有用的生物表面活性剂包括糖脂、甘露糖蛋白、β-葡聚糖和具有生物乳化和降低表面/界面张力的性质的其他代谢物。

在某些实施方式中，本发明的微生物可以与其他化学和/或微生物处理结合使用。例如，不同种类的酵母可以一起使用，例如异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)。微生物的其他组合也是可以预期的。

在优选的实施方式中，本发明组合物的微生物生长副产物是生物表面活性剂、溶剂、酶或其他代谢物。甚至更优选地，微生物生长副产物是生物表面活性剂。在一个实施方式中，微生物产生的代谢物彼此协同作用以产生所需的作用。

本发明的微生物和基于微生物的组合物具有许多有益的性质，可用于增强水产养殖。例如，根据本发明生产的生物表面活性剂可以抑制微生物对多种表面的粘附，防止生物膜的形成，并且可以具有强大的乳化和破乳性能。另外，生物表面活性剂能够减少例如养鱼场和水族馆中水的表面和界面张力。

在某些实施方式中，根据本发明有用的生物表面活性剂是糖脂生物表面活性剂，包括甘露糖赤藓糖醇脂和槐糖脂。甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)是例如由南极假丝酵母(Pseudozyma)大量产生的糖脂生物表面活性剂。槐糖脂(SLP)是糖脂生物表面活性剂，例如由球拟假丝酵母(Starmerella)，假丝酵母(Candida)和异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)生产。

MEL和SLP具有出色的水表面和界面张力降低性能，以及多种生化和生理影响。例如，本发明的生物表面活性剂可以具有抗真菌、抗菌、抗寄生虫和抗病毒的特性。此外，本发明的生物表面活性剂表现出高效的乳化和破乳性能。

可以将其他组分添加到基于微生物的组合物中，例如缓冲剂，载体，以相同或不同的设备生产的其他基于微生物的组合物，粘度调节剂，防腐剂，微生物生长养分，示踪剂，杀生物剂，其他微生物，表面活性剂，乳化剂，润滑剂，溶解度控制剂，pH调节剂，防腐剂，稳定剂和抗紫外线剂。

在某些实施方式中，本发明的基于微生物的组合物还包含载体。载体可以是本领域已知的任何合适的载体，其允许酵母或酵母副产物以使得产物保持存活的方式被递送到目标水，表面和/或鱼等，或者在非活性酵母的情况下，保留有效所需的成分。

在一个实施方式中，组合物可进一步包含缓冲剂，其包括有机酸和氨基酸或其盐，以将pH稳定在优选值附近。合适的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳糖酸盐、草酸盐、酒石酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其混合物。也可以使用磷酸和亚磷酸或其盐。合成缓冲剂是适合使用的，但是优选使用天然缓冲剂，例如有机酸和氨基酸，或其盐。

在另一个实施方式中，pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸及其混合物。

基于微生物的组合物的pH应适合于目标微生物。在一个优选的实施方式中，最终的基于微生物的组合物的pH为6.5-7.5。

在一个实施方式中，基于微生物的组合物中可以包括其他组分，例如盐的水溶液制剂，例如碳酸氢钠或碳酸钠、硫酸钠、磷酸钠或磷酸氢钠。

任选地，该组合物可以在使用前储存。储存时间优选是短的。因此，存储时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方式中，如果产品中存在活细胞，则将产品储存在凉爽的温度下，例如低于20℃、15℃、10℃或5℃。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以在环境温度下存储。

在一个实施方式中，根据本发明的基于微生物的组合物是通过已知的从小规模到大规模的培养方法获得的。培养过程可以是例如深层培养、固态发酵(SSF)和/或其组合。

发酵产物可以直接使用而无需提取或纯化。如果需要，可以使用本领域技术人员已知的标准提取方法或技术容易地实现提取和纯化。在某些实施方式中，本发明的基于微生物的组合物可包含发酵液，该发酵液包含活的和/或无活性的培养物和/或由微生物产生的微生物代谢产物和/或任何残留的营养物。

该组合物例如可以是按重量计至少是发酵液的1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％。组合物中生物质的量按重量计例如可以为0％至100％之间的任何值，包括其间所有百分比。

发酵液的生物质含量例如可以为5g/l至180g/l或更高。在一个实施方式中，发酵液的固体含量为10g/l至150g/l。

在某些实施方式中，本发明的组合物优于例如单独的生物表面活性剂，溶剂和/或酶，包括以下的一种或多种：作为酵母细胞壁外表面的一部分的高浓度的甘露糖蛋白；酵母细胞壁中存在的β-葡聚糖；培养物中存在的生物表面活性剂，代谢产物和/或溶剂(例如乳酸、乙醇、乙酸乙酯等)。

基于微生物的组合物中的微生物可以呈活性或非活性形式。基于微生物的产品组合物可以包含活性和非活性微生物的组合。

基于微生物的组合物可以在无需进一步稳定、保存和储存的情况下使用。有利地，直接使用这些基于微生物的组合物降低了被外来物质和不希望的微生物污染的可能性，并保持了微生物生长的副产物的活性。

根据本发明的微生物的生长

本发明利用用于培养微生物和产生微生物代谢产物和/或微生物生长的其他副产物的方法。本发明进一步利用适合于以所需规模培养微生物和产生微生物代谢产物的培养方法。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(SSF)及其组合。

如本文所用，“发酵”是指细胞在受控条件下的生长。生长可以是有氧的或厌氧的。

在一个实施方式中，本发明提供了用于生产生物质(例如，活细胞材料)，细胞外代谢物(例如，小分子和分泌的蛋白质)，残余营养物和/或细胞内组分(例如，酶和其他蛋白质)的材料和方法。

根据本发明使用的微生物生长容器可以是任何用于工业用途的发酵罐或培养反应器。在一个实施方式中，容器可具有功能控制/传感器或可连接至功能控制/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如pH、氧气、压力、温度、搅拌器轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。

在另一个实施方式中，容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，细胞数量和生长阶段的测量)。或者，可以从容器中取出每日样品，并通过本领域已知的技术进行计数，例如稀释平板技术。稀释板是一种用于估算样品中细菌数量的简单技术。该技术还可以提供一个指数，通过该指数可以比较不同的环境或处理。

在一个实施方式中，该方法包括用氮源补充培养物。氮源可以是例如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或两种以上组合使用。

培养方法可以为生长的培养物提供氧合作用。一个实施方式利用空气的慢速运动除去含低氧的空气并引入含氧空气。含氧空气可以是通过包括用于机械地搅动液体的叶轮和用于向液体供应气体气泡以将氧气溶解到液体中的叶轮的机构每天补充的环境空气。

该方法可以进一步包括用碳源补充培养物。碳源通常是碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和/或麦芽糖；有机酸，例如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，例如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇，异丁醇和/或甘油；油脂，例如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻子油。这些碳源可以单独使用或两种以上组合使用。

在一个实施方式中，培养基中包括微生物的生长因子和微量营养素。当生长无法产生它们所需的所有维生素的微生物时，这是特别优选的。培养基中还可以包括无机营养素，包括微量元素，例如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，维生素，必需氨基酸和微量元素的来源可以包括，例如以面粉或粗粉的形式，例如玉米粉，或以提取物的形式，例如酵母提取物，马铃薯提取物，牛肉提取物，大豆提取物，香蕉皮提取物等，或纯化形式。也可以包括诸如对蛋白质的生物合成有用的那些氨基酸，例如，L-丙氨酸。

在一个实施方式中，还可包括无机盐。可用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙，和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或两种以上组合使用。

在一些实施方式中，用于培养的方法可以进一步包括在培养过程之前和/或过程中在液体培养基中添加额外的酸和/或抗微生物剂。抗菌剂或抗生素可用于保护培养物免受污染。另外，还可以添加消泡剂，以防止在培养过程中产生气体时泡沫的形成和/或积累。

混合物的pH值应适合目标微生物。可以使用缓冲液和pH调节剂(例如碳酸盐和磷酸盐)将pH稳定在优选值附近。培养可以在恒定pH下连续进行，或者可以使pH变化。

当金属离子以高浓度存在时，可能需要在液体介质中使用螯合剂。

用于培养微生物和产生微生物副产物的方法和设备可以分批、准连续过程或连续过程进行。

微生物可以浮游形式或生物膜形式生长。在生物膜的情况下，容器中可以具有基质，微生物可以以生物膜的状态生长在基质上。该系统还可以具有例如施加鼓励和/或改善生物膜生长特性的刺激(例如剪切应力)的能力。

在一个实施方式中，用于培养微生物的方法在约5℃至约100℃，优选15至60℃，更优选25至50℃下进行。在另一个实施方式中，可以在恒定温度下连续进行培养。在另一个实施方式中，培养可以经历变化的温度。

在一个实施方式中，该方法和培养过程中使用的设备是无菌的。诸如反应器/容器的培养设备可以与灭菌单元例如高压灭菌器分开，但连接至灭菌单元。培养设备还可以具有在开始接种之前就地灭菌的灭菌单元。可以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，周围的空气在被引入容器之前可以经过至少一个过滤器。在其他实施方式中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或者可选地，完全不加热，其中可以利用低水分活度和低pH来控制细菌的生长。

在其他实施方式中，培养系统可以是自灭菌的，这意味着被培养的生物由于产生抗微生物生长副产物或代谢产物能够防止被其他生物污染。

发酵液的生物质含量可以为例如5g/l至180g/l或更高。在一个实施方式中，发酵液的固体含量为10g/l至150g/l。

由目标微生物产生的微生物生长副产物可以保留在微生物中或分泌到液体培养基中。在另一个实施方式中，用于产生微生物生长副产物的方法可以进一步包括浓缩和纯化目标微生物生长副产物的步骤。在另一个实施方式中，液体培养基可以包含稳定微生物生长副产物的活性的化合物。

在一个实施方式中，一种生产微生物的方法还包括使该微生物失活，以用于本发明的基于微生物的组合物中。优选地，使用不会导致微生物细胞壁的所需成分变性的方法进行灭活。

在一个实施方式中，通过在适于生长和生物表面活性剂生产的条件下培养本发明的微生物菌株来生产生物表面活性剂；以及最佳地纯化生物表面活性剂。酶或其他蛋白质也可以通过在适于生长和酶/蛋白质表达的条件下培养本发明的微生物菌株来产生；最佳地，纯化酶或其他蛋白质。

在一个实施方式中，在培养完成时(诸如，例如在达到期望的细胞密度或发酵液中特定代谢物的密度时)移除所有微生物培养组合物。在此批次过程中，在收获第一批次后会启动一个全新的批次。

在另一个实施方式中，在任何一次仅移除一部分发酵产物。在该实施方式中，具有活细胞的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。移除的组合物可以是无细胞发酵液或可以包含细胞。以这种方式，创建了准连续系统。

制备基于微生物的产品

本发明的一种基于微生物的产品仅仅是含有微生物和/或由微生物产生的微生物代谢产物和/或任何残留营养物的发酵液。发酵产物可以直接使用而无需提取或纯化。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。

基于微生物的产品中的微生物可以呈活性或非活性形式。基于微生物的产品可能包含活性和非活性微生物的组合。优选地，微生物被灭活。

基于微生物的产品可以在无需进一步稳定、保存和存储的情况下使用。有利地，直接使用这些基于微生物的产品减少了被外来物质和不合需要的微生物污染的可能性，并维持了微生物生长的副产物的活性。

可以将微生物和/或来自微生物生长的发酵液从生长容器中移除，并通过例如管道(piping)进行转移以立即使用。在另一个实施方式中，可以在使用前使微生物失活。

在其他实施方式中，可以将组合物(微生物、发酵液或微生物和发酵液)放置在适当大小的容器中，考虑到例如预期用途，预期的应用方法，发酵罐的大小和从微生物生长设施到使用地点的任何运输方式。因此，放置基于微生物的组合物的容器可以是例如1加仑至1,000加仑或更大。在其他实施方式中，容器是2加仑、5加仑、25加仑或更大。

有利地，根据本发明，基于微生物的产品可以包括其中生长有微生物的发酵液。产物可以是例如至少按重量计1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的发酵液。产品中生物质的量按重量计可以例如为0％至100％，包括其间所有百分比。

当从生长容器中收获基于微生物的组合物时，当将收获的产品放入容器和/或通过管道输送(或以其他方式运输使用)时，可以添加其他成分。添加剂例如可以是缓冲液，载体，在相同或不同设施下生产的其他基于微生物的组合物，粘度调节剂，防腐剂，微生物生长养分，跟踪剂，溶剂，杀菌剂，其他微生物和特别地用于目标用途的其他成分。

在某些实施方式中，可以将生物表面活性剂添加到基于微生物的组合物中。在优选的实施方式中，生物表面活性剂为纯化形式。

生物表面活性剂是由微生物产生的结构上不同的一组表面活性物质。生物表面活性剂是可生物降解的，并且可以使用可再生基质上的选定生物容易、廉价地生产。所有生物表面活性剂都是两亲性的。它们由两部分组成：极性(亲水)部分和非极性(疏水)部分。由于其两亲结构，生物表面活性剂增加了疏水性水不溶性物质的表面积，增加了此类物质的水生物利用度，并改变了细菌细胞表面的特性。

生物表面活性剂包括低分子量糖脂(例如鼠李糖脂、槐糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂)，脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、泛革素)，黄酮类脂(flavolipid)，磷脂和高分子量聚合物，例如脂蛋白，脂多糖-蛋白质复合物和多糖-脂肪酸复合物。生物表面活性剂分子的常见亲脂部分是脂肪酸的烃链，而亲水部分是由中性脂质的酯基或醇基，脂肪酸或氨基酸(或肽)的羧酸基，黄酮类脂的情况下有机酸，或者糖脂的情况下由碳水化合物形成。

生物表面活性剂在界面处积聚，从而降低了界面张力，并导致溶液中聚集的微胞(micellular)结构形成。安全、有效的微生物生物表面活性剂可减少液体、固体和气体的分子之间的表面张力和界面张力。生物表面活性剂形成孔并破坏生物膜稳定性的能力允许其用作抗菌剂、抗真菌剂和溶血剂。结合低毒性和可生物降解性的特点，生物表面活性剂在水产养殖业中具有广泛的应用优势。

在一个实施方式中，可根据本发明使用的生物表面活性剂包括一种或多种糖脂和/或脂肽。在一个实施方式中，糖脂选自鼠李糖脂(RLP)、槐糖脂(SLP)，海藻糖脂质和甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)。在一个实施方式中，脂肽选自表面活性素、伊枯草菌素A和泛革素。

在优选的实施方式中，可以将这些生物表面活性剂中的任何一种与基于微生物的组合物一起施用。优选地，组合物中生物表面活性剂的总浓度不超过5g/kg。在某些实施方式中，生物表面活性剂的浓度为总组合物重量的0.05％至90％，优选0.1％至50％，更优选0.5％至2％。

包含在根据本发明的制剂中的其他合适的添加剂包括通常用于这种制剂的物质。这样的添加剂的例子包括表面活性剂、乳化剂、润滑剂、缓冲剂、溶解度控制剂、pH调节剂、防腐剂、稳定剂和抗紫外线剂。

可选地，可以在使用之前将产品存储起来。储存时间优选是短的。因此，存储时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方式中，如果产品中存在活细胞，则将产品储存在凉爽的温度下，例如低于20℃、15℃、10℃或5℃。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以在环境温度下存储。

在一个实施方式中，为了产生基于非活性微生物的组合物，在不同的槽中培养不同的微生物菌株。通过在巴氏灭菌温度下(最高65至70℃，持续时间足以使100％的酵母细胞失活)使培养物失活并且将pH值增加至约10.0-12.0来制备组合物。这引起细胞的部分水解，并允许其中释放一些营养成分。然后，将组合物中和至pH值约为6.5–7.5，并混合各种水解成分。然后将所得的基于微生物的产品用于鱼饲料和水处理。

使用本发明的组合物增强水产养殖的方法

在某些实施方式中，本发明提供了环境友好，成本有效的材料和增强水产养殖的方法。在特定的实施方式中，本发明提供了用于改善养鱼场中养殖的鱼的健康和质量的方法。在另一个实施方式中，提供了用于饲养在养鱼场中养殖的鱼的方法。

如本文所用，“施加”组合物或产品，或“处理”养鱼场是指使组合物或产品与目标或地点接触，使得组合物或产品可对该目标或地点产生作用。该影响可以归因于例如微生物生长和/或生物表面活性剂或其他生长副产物的作用。根据本发明，可以通过例如将组合物用管道输送，泵送或倒入养鱼场内的水环境中，或例如通过将组合物涂覆或分散在渔场的各种表面、墙壁或围墙上来进行施用或处理。

在一个实施方式中，提供了通过将包含一种或多种微生物的菌株和/或微生物生长副产物的基于微生物的组合物施用于养鱼场或水族馆来增强水产养殖的方法。该方法任选地包括向该地点添加营养素的有机源，例如碳或氮，和/或其他试剂，以促进微生物生长(如果使用活性微生物的话)。

如本文所用，“改善”或“增强”水产养殖是指改善养鱼场养殖鱼的健康和质量。例如，可以通过改善鱼类生产环境的质量来间接实现水产养殖增强，或者例如通过为鱼类本身提供营养和健康益处而直接实现水产养殖增强。

本发明的方法和组合物能够例如改善水质和净度，增强病原体防御能力并刺激鱼的生长。特别地，本发明的组合物可用于清洁鱼池和鱼缸内的水和表面，保护鱼免受感染或侵染，减少水中的二氧化碳积累，或喂鱼并改善营养吸收。

在某些实施方式中，本发明提供了通过去除由于例如藻类生长而在养鱼场或水族馆中积累的粘液或池塘浮渣来增强水产养殖的方法。本发明的基于微生物的组合物可以应用于例如水、地板、墙壁或鱼池、水箱或水族馆的其他表面。在一个实施方式中，该组合物用作一种生物去乳剂，其能够分散粘液成分和/或杀死包含粘液的生物。

池塘粘液或浮渣通常是藻类在水体中生长的结果。藻类是天然存在的自然界中丰富的水生生物。这些复杂的生物体对于许多湖泊、池塘、泻湖和废水处理系统来说都是麻烦的，因为它们可以繁殖，并有可能以粘稠的，通常是难闻的垫子或涂层的形式在水中或者水的表面占据整个水源。通常，藻华会耗尽水源中的氧气，这可能导致鱼类死亡。一些花朵，例如蓝-绿藻水华(蓝藻细菌)，由于它们产生的有毒副产物，也可能对人类和水生生物有害。

可以使用本发明有效控制形成池塘浮渣的藻类的类型，包括但不限于浮游藻类(例如，鱼腥藻(Anabaena)、小球藻(Chlorella)、盘星藻(Pediastrum)、栅藻(Scenedesmus)和卵囊藻(Oocystis))，丝状藻类(例如，水绵(Spirogyra)，刚毛藻(Cladophora)、根枝藻(Rhizoclonium)、转板藻(Mougeotia)、双星藻(Zygnema)和水网藻(Hydrodictyon))以及其他，例如鞘丝藻(Lyngbya)、黑孢藻(Pithophora)，有毒水华藻类或殖民硅藻。

在一些实施方式中，本发明提供了通过改善养鱼场水的总体质量来增强水产养殖的方法。在一个实施方式中，改善水质意味着减少养鱼场水中的二氧化碳量。在另一个实施方式中，改善水质意味着减少养鱼场水中的硫化氢量。在又一个实施方式中，改善水质意味着增加和/或平衡养鱼场水中的氧气水平。

尤其是在养鱼场拥挤的高压大流量水产养殖操作中，水的气态含量可能变得不平衡，从而导致鱼的不健康生活条件。例如，由于庞大的种群规模，拥挤池塘中的鱼可能会使氧气耗尽。这可能导致二氧化碳含量增加，从而导致鱼类窒息和死亡。

此外，养鱼场底部的池塘污泥的形成会导致氧气水平降低，以及水中的硫化氢水平升高。由于各种有机物质沉降到底部而形成池塘污泥，例如，死去的藻类、细菌、鱼的排泄物和污垢。池塘污泥通常难以渗透氧气，从而促进产硫化氢的厌氧细菌的生长。硫化氢对其他生物有毒，还会产生强烈的烂蛋味。因此，去除硫化氢及其来源对于养殖鱼类的健康至关重要。

在某些实施方式中，使用本发明减少二氧化碳和/或硫化氢允许增加养鱼场水中的氧气含量，并因此提高水质和鱼品质。然而，在一些实施方式中，如果需要水的额外的氧合，则该方法可以进一步包括例如对水施加氧合的手段，例如使用过滤器、曝气器、泵和/或其他已知的给水充气的手段。

在一些实施方式中，本发明提供了通过降低养鱼场的水中二氧化碳和/或硫化氢浓度来增强水产养殖的方法。本发明的基于微生物的组合物可以施用于水中，在其中其作用是降低水的界面张力，从而有助于释放残留在水中的二氧化碳和/或硫化氢。

在特定的实施方式中，二氧化碳的减少通过防止由于二氧化碳窒息引起的鱼类死亡而增强了水产养殖。

在其他实施方式中，本发明提供了通过防止养鱼场的水中形成硫化氢来增强水产养殖的方法。本发明的基于微生物的组合物可以施用于鱼塘的水或底部，在该处其作用是使厌氧、产硫化氢的细菌繁衍的池塘污泥破乳。在进一步的实施方式中，由于组合物的抗微生物特性，该组合物可以起到控制产生硫化氢的厌氧细菌的作用。

在特定的实施方式中，通过防止由于硫化氢积累的毒性作用而导致的鱼类死亡，减少硫化氢和/或防止其形成可增强水产养殖。

在一些实施方式中，本发明提供了通过防止感染在鱼场种群内扩散来增强水产养殖的方法。另外，本发明可以用于预防病原体和寄生虫如蠕虫的侵染。本发明的基于微生物的组合物可以例如施用于养鱼场的水或表面，其中该组合物的抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫和抗粘着性能可防止鱼类被各种已知会导致鱼类疾病或死亡的疾病感染，以及防止在养鱼场环境中致病生物的侵染。

适用于本发明方法和组合物的病原体的实例包括但不限于病毒(例如水生双RNA病毒(Aquabirnavirus)、β野田村病毒(Betanodavirus)、正粘病毒(Orthomyxovirus)、甲病毒(Alphavirus)、弹状病毒(rhabdoviruses)和蛙病毒(Ranavirus))，细菌(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、气单胞菌(Aeromonas)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、黄杆菌(Flavobacterium)、弗朗西斯菌(Francisella)、发光细菌(Photobacterium)、鱼立克次氏体(Piscirickettsia)、假单胞菌(Pseudomonas)、黏着杆菌(Tenacibaculum)、弧菌(Vibrio)、耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia)、乳球菌(Lactococcus)、肾炎杆菌(Renibacterium)和链球菌(Streptococcus))，真菌(例如，水霉菌(Saprolegnia)、曲霉(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)，外瓶霉(Exophiala)、鱼孢霉(Ichthyophonus)、鳃霉菌(Branchiomyces)，肤胞虫(Dermocystidium)、原壁菌(Prototheca)、颤藻(Oscillatoria)、草茎点霉(Phoma herbarum)和拟青霉(Paecilomyces))，水霉菌(例如，水霉属(Saprolegnia sp.))和寄生虫(例如，线虫、绦虫、蛔虫、水蛭、虱子、后生动物寄生虫(例如桡足类)，单细胞寄生虫(例如多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis))和蠕虫(例如胃瘤线虫(Eustrongylides))。

使用本发明可以减轻或预防的病毒性疾病包括但不限于传染性胰腺坏死、病毒性神经坏死、鲑鱼性贫血病毒、胰腺疾病、传染性造血性坏死病毒、病毒性出血性败血病病毒和流行性造血性坏死病毒。

使用本发明可以减轻或预防的细菌疾病包括但不限于腐鳍病、鱼浮肿(fishdropsy)、运动性气单胞菌败血症、疖病、金黄杆菌病(chryseobacteriosis)、鲶鱼肠道败血病、爱德华菌病或腐烂性疾病、柱形病、假柱形病、黄杆菌病或虹鳟鱼苗综合征、细菌性烂鳃病、弗朗西斯科氏病、冬季溃疡病、巴斯德菌病、鱼立克次氏体病或立克次氏体败血病、假单胞菌败血症或赤斑病、黏着杆菌病(tenacibaculosis)、弧菌病、耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病或红嘴病、乳酸菌病、诺卡氏菌病、细菌性肾病、葡萄球菌病、链球菌病和出血性败血病。

使用本发明可以减轻或预防的其他疾病或感染包括烂鳃病、鱼孢霉菌病、水霉病、丝绒病(velvet disease)、头洞症和旋转病。有利地，该方法在不使用刺激性化学物质或抗生素的情况下改善了养殖鱼类的病原防御。

在一些实施方式中，本发明提供了通过改善养殖鱼类的消化道中的营养吸收来增强水产养殖的方法。具体地，当被鱼摄取时，本发明的基于微生物的组合物中的生物表面活性剂通过改善营养物质(包括脂溶性维生素)在鱼的消化道中的吸收(即生物利用度)而有助于提高养殖鱼类的整体健康和质量。

该组合物可以以例如液体溶液的形式或以干粉、粗粉、薄片、颗粒或小丸的形式施用于养鱼场。与饲喂常规鱼粉的鱼相比，摄入本发明组合物的鱼体重增加，其中大部分体重增加是身体蛋白质百分比增加，而身体脂肪百分比降低。

在另一个实施方式中，本发明提供补充喂鱼的方法以及降低喂鱼成本的方法。本发明的基于微生物的组合物可作为包含酵母细胞和任选地纯化的生物表面活性剂的单细胞蛋白质源施用于养鱼场。酵母细胞可以集中的数量提供大量的例如蛋白质、碳水化合物、脂质、脂肪酸、矿物质和维生素。

在某些实施方式中，将所述组合物配制成颗粒，其可以与传统鱼粉的颗粒一起喂鱼。在一些实施方式中，将组合物与传统鱼粉的成分组合，并且该组合用于制备颗粒。在其他实施方式中，代替传统的鱼粉，将组合物单独喂入鱼中。有利地，除了增加鱼的营养吸收外，由于该组合物的抗微生物特性，本发明的组合物还能够防止鱼饲料被病毒、真菌和细菌污染。

由于传统的鱼和鱼油来源的饲料成本上涨，许多水产养殖业已开始使用谷类饲料喂养鱼。玉米、大豆和高粱等成分现在被用于生产鱼饲料。目前以谷物为基础的饮食对鱼类自身健康的影响尚不明确，但随着时间的推移，仍有可能产生不良影响。

另外，海鲜产业的成功例如部分取决于人类食用海产品的有吸引力的健康益处，例如高水平的ω-3脂肪酸。通过将养殖鱼从肉食或杂食转变为严格的植物性饮食，最终鱼产品的营养含量可以改变，例如，鱼产品中的脂肪酸含量可以降低。这种变化对海鲜产业以及人类营养的影响可能是广泛的。

因此，通过充当现有鱼饲料的补充，本发明可以用于减轻使用传统的基于鱼的鱼饲料的增加的成本。本发明可以降低饲养鱼的成本，同时允许恢复到传统的基于鱼的饲料，而所有这些都不会损害养殖鱼的健康和质量。

基于微生物的产品的本地生产

在本发明的某些方式方案中，微生物生长设施以期望的规模产生所期望的新鲜的、高密度的微生物和/或微生物生长副产物。微生物生长设施可以位于施用地点或附近。该设施分批、准连续或连续培养生产高密度微生物基组合物。

本发明的微生物生长设施可以位于使用基于微生物的产品的位置(例如，养鱼场)。例如，微生物生长设施可距使用位置小于300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。

由于基于微生物的产品是在施用现场或附近产生的，不需要传统生产的中的稳定、保存、延长的存储和广泛的运输过程，因此可以产生更高密度的活微生物，从而需要用于现场施用的基于微生物的产品体积要小得多。这允许按比例缩小的生物反应器(例如，较小的发酵罐；起始原料、营养物、pH控制剂和消泡剂等的较少供应)，使系统高效。此外，本地生产有利于产品的便携性。

基于微生物的产物的本地产生也促进了将生长发酵液包含在产物中。发酵液可以包含发酵过程中产生的特别适合本地使用的试剂。

与已经进行营养性细胞稳定或在供应链中待了一段时间的微生物相比，本地生产的高密度、健壮的微生物培养在该领域更为有效。与其中细胞已与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离的传统产品相比，本发明的基于微生物的产品特别有利。运输时间的减少可以允许根据当地需求，在一定的时间和数量下生产和交付新鲜批次的微生物和/或其代谢产物。

本发明的微生物生长设施产生新鲜的基于微生物的组合物，包括微生物本身，微生物代谢产物和/或在其中生长微生物的发酵液的其他组分。如果需要，所述组合物可以具有高密度的营养细胞，灭活细胞或营养细胞、灭活细胞、生殖孢子、菌丝体和/或其他微生物繁殖体的混合物。有利地，可以定制组合物以用于指定位置。在一个实施方式中，微生物生长设施位于将使用基于微生物的产品的场所或其附近。

有利的是，这些微生物生长设施为当前的问题提供了解决方案，该问题依赖于遥远的工业规模生产商，这些生产商的产品质量由于上游加工延迟，供应链瓶颈，存储不当以及其他突发事件而受到影响，其妨碍例如存活的、高细胞数和/或繁殖数的产品以及微生物最初在其中生长的相关发酵液和代谢物的及时交付和施用。

有利地，在优选的实施方式中，本发明的系统利用天然存在的本地微生物及其代谢副产物的能力来处理植物病原细菌。可以基于例如耐盐性，在高温下生长的能力以及使用序列的遗传学鉴定来鉴定本地微生物。另外，微生物生长设施通过定制微生物产品来改善与目的地地理位置的协同作用，从而提供了制造通用性。

单个容器的培养时间可以是例如1天至2周或更长时间。可以以许多不同方式中的任何一种来收获培养产品。

在例如发酵的24小时之内的本地生产和递送导致纯的、高微生物密度的组合物并且大大降低了运输成本。鉴于在开发更有效、更强大的微生物接种剂方面有快速发展的前景，消费者将从这种快速交付基于微生物的产品的能力中受益匪浅。

本发明的基于微生物的产品可用于多种独特的环境，因为例如能够有效递送：1)具有活性代谢物的新鲜发酵液；2)微生物和发酵液的混合物；3)含有活细胞或孢子、菌丝体、分生孢子或其他微生物繁殖体的组合物；4)具有高密度微生物的组合物，包括活细胞和/或孢子、菌丝体，分生孢子或其他微生物繁殖体；5)基于微生物的短期产品；6)偏远地区的基于微生物的产品。

本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一个或多个组合。

从以下对本发明的优选实施方式的描述以及从权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。本文引用的所有参考文献通过引用并入本文。

实施例

实施例1–异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)和蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)的培养

异常威克汉姆酵母在工作容积为800L的反应器中生长，用于在非灭菌条件下生产生物质和槐糖脂。使用空容器消毒的方法，其中内表面用2-3％的过氧化氢处理，并用漂白剂和高压热水冲洗。将含有所有必需成分的培养基成分在85-90℃的温度下进行净化处理，或溶解在3％的过氧化氢中。发酵温度保持在25-30℃之间。pH值从5.0-5.5开始，然后下降到3.0-3.5，并在此保持稳定。发酵约48小时即可实现生物质的生产。

发酵7至9天后，槐糖脂会积累。发酵完成后，可将含有生物质和低浓度槐糖脂(如果适用)的培养物施用于例如含有鱼的鱼塘或鱼缸。

蚜虫拟酵母在相同的反应器中于相同的条件下生长，但有两个例外：最佳pH值保持在5.0-5.5之间，生物质和甘露糖赤藓糖醇脂(MELs)的生产在7至12天之内实现。

实施例2–用于喂鱼和鱼场处理的组合物

使用含有葡萄糖、菜子油、酵母提取物、NH₄Cl、KH₂PO₄.H₂O和MgSO₄.7H₂O的培养基均可获得处理产品和饲料产品。用KOH将初始pH调节至约5.5。培养物在约25℃下生长而没有稳定化。

异常威克汉姆酵母和蚜虫拟酵母在不同的罐中培养。发酵过程完成后，通过在巴氏灭菌温度下(最高65至70℃，持续时间足以使100％的酵母细胞失活)使培养物失活，并将pH值提高至约10.0-12.0，从而制备组合物。这引起细胞的部分水解，并允许其中释放一些营养成分。然后，将组合物中和至pH值约为6.5–7.5，并混合各种水解成分。

所得的基于微生物的产品可用于鱼饲料和水处理。

实施例3–鱼食

可以用本发明的组合物代替鱼粉的很大一部分或全部。在一个实施方式中，可以使用加热至100-150℃的空气干燥包含酵母生物质(例如，海洋嗜杀酵母(W.anomalus)、蚜虫拟酵母(P.aphidis)、球拟假丝酵母(S.bombicola)和/或假丝酵母(C.apicola))和任选地纯化的生物表面活性剂的组合物，以产生鱼饲料颗粒。可以将颗粒与传统鱼粉以例如1：1、2：1或1：2的比例混合。如果需要的话，这些颗粒也可以用于完全代替传统的鱼粉。本发明的基于酵母和生物表面活性剂的食物组合物可防止食物受到微生物病原体的污染，以及防止随后食用该食物的鱼类的潜在疾病。该组合物还可以提高营养成分对摄入它的鱼类的生物利用度，从而使鱼类整体更健康。

包含50％酵母单细胞蛋白代替鱼粉的饮食可根据增重百分比提供最佳的生长反应。对整个鱼体的胴体成分进行的近似检查表明，与传统饲料相比，饲喂50％酵母单细胞蛋白的鱼的身体蛋白含量更高，脂肪含量更低。

Claims (29)

1.一种用于增强水产养殖的组合物，其包含一种或多种的培养的产生化物质的酵母的菌株和/或一种或多种微生物生长副产物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述酵母是产生物表面活性剂的酵母。

3. 根据权利要求2所述的组合物，其中，所述酵母选自球拟假丝酵母（Starmerella bombicola）、蜜生假丝酵母（Candida apicola）、蚜虫拟酵母（Pseudozyma aphidis）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）、西毕赤酵母（Pichia occidentalis）和任何这些种类的突变体。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中酵母是无活性形式的。

5.根据权利要求1所述的组合物，包含一种以上的酵母菌株。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中分别培养一种以上酵母中的每一种，然后合并以形成组合物。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生长副产物是生物表面活性剂。

8.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含其中培养有酵母的发酵液。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述生长副产物存在于所述发酵液中。

10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述生物表面活性剂以纯化形式添加至所述组合物中。

11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述生物表面活性剂选自糖脂和脂肽。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中糖脂选自槐糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖脂和鼠李糖脂。

13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述脂肽选自表面活性素、伊枯草菌素。

14.一种增强水产养殖的方法，该方法包括将包含一种或多种产生化物质的酵母的菌株和/或微生物生长副产物的组合物施用于含水的养鱼场。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物是权利要求1-13中任一项的组合物。

16.根据权利要求14所述的方法，其中将所述组合物施用于所述养鱼场的水。

17.根据权利要求14所述的方法，其中，将所述组合物施用于养鱼场内的表面，包括墙壁和/或地板。

18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述养鱼场是池塘、湖泊、海洋、峡湾、水道、河流、水族馆、水箱或网箱。

19.根据权利要求14所述的方法，其中，所述方法用于改善养殖鱼类的环境的质量。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于从养鱼场移除粘液或池塘浮渣。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于降低所述养鱼场的水中的硫化氢和/或二氧化碳浓度。

22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于减少鱼池底部的池塘污泥。

23.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于防止病原体侵染鱼场。

24.根据权利要求14所述的方法，其中，所述方法用于改善养殖鱼类的健康和质量。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述方法用于防止鱼被细菌、病毒、真菌或寄生虫病感染。

26.根据权利要求16所述的方法，其中，所述方法用于改善鱼的消化道中的营养吸收。

27.一种喂养鱼的方法，其包括将包含非活性微生物和/或其生长副产物的组合物施用于养鱼场，并使鱼摄取该组合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组合物为干粉、粗粉、小丸、颗粒或薄片的形式。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述方法用于补充传统鱼饲料。