JP2023536372A - 新規サイレージ添加剤組成物 - Google Patents

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Abstract

サイレージを生産し、新規な微生物の組み合わせをサイレージに適用することによってその腐敗を防止するための組成物および方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2020年7月26日に出願された米国仮特許出願第63/056,663号の優先権を主張する。
発明の背景
サイレージは、年間を通じてウシ、ヒツジ、およびその他の家畜動物に給餌するために保存されている緑色葉作物から作られた飼い葉の一種である。サイレージは、例えば、アブラムシ、アメリカタバコガの幼虫、根切り虫、ヨトウムシ、バッタ、ダニ、ナメクジ、およびハリガネムシなどの有害節足動物から、ならびに微生物有害生物からの腐敗から、保護されなければならない。
「サイロ貯蔵」過程は、湿った飼料を保存する方法であり、世界中で使用されている。切断された植物は、サイロまたはピット内に置かれ、できるだけ多くの酸素を除去するために圧縮され、例えば蓋、防水シート、またはプラスチックシートを使用して覆われる。あるいは、植物の大きな丸いベールは、植物を内側に圧縮するプラスチックフィルムでしっかり包むことができる。
植物の圧縮および密封後、サイロ貯蔵は自然発酵を伴い、乳酸菌（LAB）が嫌気性条件下で植物中の水溶性炭水化物を有機酸に変換する。これはpHの減少をもたらし、次いで、湿った飼料が保存されるように有害微生物を抑制する。
より具体的には、サイロ貯蔵過程は、4つの異なる段階によって特徴付けることができる。第1に、密封時に、植物粒子間に酸素がなお存在し、pHはごくわずかに酸性、例えば約6.0～6.5である。これらの条件は、継続的な植物呼吸、プロテアーゼ活性ならびに好気性および通性好気性微生物の活動を可能にする。第2段階は発酵を含み、発酵はサイレージが嫌気性になった後に始まり、数日から数週間続く。LABは増殖して主要な微生物集団になり、それによって乳酸および他の有機酸を産生し、pHを例えば約3.8～5.0に減少させる。
第3段階は安定しており、サイレージ環境への空気の流入が防がれている限り、飼料の特性にほとんど変化は生じない。最終段階は取り出しであり、サイレージは最終的に取り出されて空気に曝される。これは、好気性微生物、主に、腐敗を引き起こし得る酵母、カビ、およびある種の細菌などを再び活性化させる。
好気的不安定性はサイレージ生産における主要な問題である。貯蔵ユニットが供給のために開放される前でさえ、例えば包装または密封が不十分であるために、サイレージが酸素に曝露され得る。これらの種類の好気性条件下では、酵母およびカビの急速な増殖が、サイレージを加熱して腐敗させ、その栄養価を低下させる。好気的不安定性は、伝統的に理想的な発酵段階と考えられるもの、すなわちpHの急速な低下および低い終末pHを経験した、接種されたサイレージにおいても問題となり得る。このような条件では、腐敗に寄与する酵母は、例えば、酸性条件に耐性であり、かつ/または発酵中にLABによって生成された乳酸を代謝することができる。
サイレージを効果的に包装することおよび動物飼料用にサイレージを取り出すことに注意を払うことは、サイレージ環境の通気を最小限に抑えるのに役立ち得るが、腐敗を防ぐためには追加の方法がしばしば必要とされる。いくつかの方法は、化学的および/または生物学的添加剤を利用する。これらには、例えば、糖蜜、スクロース、グルコース、柑橘類パルプ、パイナップルパルプ、およびサトウダイコンパルプなどの、発酵刺激剤;セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、およびアミラーゼなどの、酵素;ならびに、乳酸菌（LAB）などの、接種材料、が挙げられる。添加剤には、発酵阻害剤、例えば、塩酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アクリル酸、ギ酸カルシウム、プロピオン酸、およびプロピオナートなどの、酸および有機酸;ならびに、ホルムアルデヒド、亜硝酸ナトリウム、およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの、化学物質、も含まれる。
ギ酸、ホルムアルデヒド、プロピオン酸、およびアンモニアなどの、化学系添加剤の多くは、取り扱いが安全ではない可能性があり、機器に対して腐食性である可能性がある。したがって、多くの生産者は、生物学的添加剤を利用することを好む。特に、細菌接種材料は、安全で、使用が容易であり、農業機械に対して非腐食性であり、環境を汚染せず、天然産物と見なされるので、化学的添加剤よりも利点を有する。
「ホモ発酵性」LABを含有するサイレージ接種材料は、世界の多くの地域で生物学的添加剤として一般的に使用されている。ホモ発酵性LABには、例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、プロピオノバクター（Propionobacter）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、およびアエロコッカス（Aerococcus）属の、ある種のメンバーが含まれる。それらの機能は、作物の水溶性炭水化物の発酵を通じて乳酸を産生し、pHを急速に減少させることである。接種材料は、好気性腐敗を低減させ、飼料の一部として動物の状態を向上させることもできる。
例えば、ある種のロイコノストック（Leuconostoc）属の種、プロピオニバクター（Propionibacter）属の種、およびラクトバチルス（Lactobacillus）属の種を含む「ヘテロ発酵性」LABの使用も、最近、好まれている。ヘテロ発酵生物は、グルコースを複数の異なる副生成物に発酵させる能力を有する。これらには、例えば、乳酸、エタノール、および二酸化炭素が含まれる。ヘテロ発酵生物は、酸素の存在下で乳酸を、酢酸および/またはプロピオン酸に変換することもでき、産生されたアセタートはクロストリジウムおよび真菌などの他の有害生物を阻害し得る。しかしながら、ヘテロ発酵性LABを使用することの1つの欠点は、乾燥物質のかなりの部分が失われることであり、乾燥物質は消費されて炭酸ガスに変換される。
細菌性サイレージ接種材料は穀物およびサイレージ貯蔵の重要な局面であるが、それらの使用は、生産、輸送、投与、価格、および有効性における困難さによって、大きく制限され得る。例えば、多くの微生物は、有用である十分な量で増殖させ、その後、例えばサイレージ貯蔵タンク内に配備することが困難である。この問題は、分配前の処理、配合、貯蔵、および安定化による、生存率および/または活性の低下によって、より深刻なものになる。さらに、例えば、初期細胞密度が不十分であること、特定の場所で既存の微生物叢と効果的に競合することができないこと、ならびにサイレージおよび/または微生物がその中で繁殖することができずもしくは生存することさえできないその他の環境条件に導入されること、を含む、いくつかの理由のために、一旦適用されても、生物学的産物は発育しないことがあり得る。
サイロ貯蔵過程は複雑な過程であり、多数の異なる化学的および微生物学的過程の相互作用を伴う。したがって、好気的安定性を維持し、サイレージの腐敗を防止するための改善された組成物および方法が必要とされている。
本発明は、サイレージ生産および穀物保存において使用するための、微生物ベースの製品を提供する。具体的には、本発明は、サイレージを生産するための、サイレージおよび貯蔵された穀物に群がる有害生物を防除するための、サイレージ添加剤を提供する。有利には、本発明の微生物ベースの製品および方法は、環境に優しく、非毒性であり、費用効果が高い。
好ましい態様において、本発明は、1つまたは複数の微生物接種材料を含む、サイレージ添加剤組成物を提供する。有利には、ある特定の態様において、本微生物接種材料を使用した発酵を通じたサイレージの生産および保存は、サイレージの腐敗を防止し、有害生物を防除し、かつ/または家畜飼料製品としてのサイレージの栄養上の利点を高めることができる。
一態様において、本明細書に記載されている微生物接種材料は、細菌株、ならびに、例えば有機酸、生物系界面活性剤および/または酵素などのその増殖副生成物を含む1つまたは複数の細菌培養物を含むことができる。好ましくは、微生物接種材料は、組成物が適用される飼料のグラム当たり少なくとも200億、少なくとも300億、または少なくとも400億CFUの微生物を供給する。
いくつかの態様において、微生物接種材料は、微生物接種材料の培養からの栄養素および/または残余基質を含むことができる。微生物は、生きていてもよく、または不活性であってもよいが、好ましい態様においては、微生物は生きている。接種材料は、例えば、新鮮な生きた培養物、再水和された凍結乾燥細菌細胞もしくは芽胞、または解凍された凍結細菌調製物の形態であり得る。
好ましい態様において、細菌種の少なくとも1つは、乳酸菌（LAB）の一種、例えば、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、プロピオノバクター、エンテロコッカス、ペディオコッカス、アエロコッカスまたはその他のLABである。
ある特定の態様において、LABは、伝統的にLABとして分類されていないが、主要または副次的代謝産物として乳酸を産生する細菌である。例えば、ある特定の態様において、LABは、B.コアグランス（B.coagulans）などのバチルス属の種の株である。
いくつかの態様において、B.コアグランスは、乳酸およびその他の有機酸を産生することができる。さらに、いくつかの態様において、B.コアグランスは、LABの他の種より耐熱性であり（例えば、50℃～52℃で増殖することができる）、より暑い気候において、および/または密閉されたサイレージ環境で空気漏れが発生した場合に、サイロ貯蔵過程の有効性を増大させることができる。
いくつかの態様において、サイレージの保存および/または有害生物防除に有用な、他の有機酸、生物系界面活性剤、および/または酵素などの他の有益な増殖副生成物を産生することができる細菌種または株。ある特定の態様において、B.アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）の株、例えば、B.アミロリケファシエンス株NRRL B-67928（「B.amy」）が使用される。ある特定の態様において、B.スブチリス（B.subtilis）の株、例えば、B.スブチリス株NRRL B-68031（「B4」）が使用される。いくつかの態様において、B.amyおよびB4は一緒に使用することができる。
いくつかの態様において、B.amyは、抗真菌性、抗ウイルス性、および抗菌性の、リポペプチド生物系界面活性剤、プロピオン酸および酢酸などの、有機酸、ならびに、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼなどの、酵素、を産生することができる。
いくつかの態様において、B4は、B.スブチリスの参照株よりも増強された量で抗菌性リポペプチドサーファクチンを産生することができる。したがって、いくつかの態様において、B4は界面活性剤「過剰産生体」である。
いくつかの態様において、B.コアグランスとB.amyおよび/またはB4との組み合わせは、増強されたサイレージ発酵、およびサイレージまたは穀物貯蔵環境における微生物有害生物の直接防除を可能にする。
一態様において、組成物は、B.コアグランスおよびB.amyを含み、B.コアグランスは、組成物の微生物接種材料部分の1～99重量または体積％を占め、B.amyは、99～1重量または体積％を占める。
一態様において、組成物は、B.コアグランスおよびB4を含み、B.コアグランスは、組成物の微生物接種材料部分の1～99重量または体積％を占め、B4は、99～1重量または体積％を占める。
一態様において、組成物は、B4およびB.amyとともにB.コアグランスを含み、B.コアグランスは、組成物の微生物接種材料部分の1～99重量または体積％を占め、B.amyとB4の組み合わせは、99～1重量または体積％を占める。
組成物中の、微生物および他の成分の、種および比は、例えば、処理されている飼料または穀物の種類、湿度/湿気レベル、およびその他の環境因子に従って決定することができる。したがって、組成物は、任意の与えられた飼料作物に対してカスタマイズ可能であり得る。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物は、追加の成分、例えば、担体、乾燥剤、塩、染料、香味料、緩衝剤、栄養素、デンプン、炭水化物、水、ならびに/または、追加の微生物培養物および/もしくは発酵副生成物を含む。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物は、例えば外骨格を有する、サイレージおよび穀物有害生物に対する有害生物防除剤として役立ち得る珪藻土を含む。有利には、珪藻土は、サイレージ環境または穀物貯蔵ユニットにおける凝縮物形成を低減させるための、吸湿性物質または乾燥剤としても機能することができ、それによってカビおよび真菌の増殖にとってより好ましくない環境を生成する。
いくつかの態様において、サイレージ添加剤組成物は、例えば、有益な酵母、真菌および/または他の細菌を含む、1つまたは複数の追加の微生物の発酵生成物を含む。これらの微生物としては、例えば、ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus）、スターメレラ・ボンビコーラ（Starmerella bombicola）、サッカロミセス・クロロラフィス（Saccharomyces chlororaphis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、プレウロタス・オストレアタス（Pleurotus ostreatus）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、および/またはメイエロザイマ・ギリエルモンディ（Meyerozyma guilliermondii）を挙げることができる。発酵生成物は、例えば、精製されたまたは未精製の形態の、有益な微生物の増殖副生成物、発酵培地、細胞、および/または発酵からの残留栄養素を含むことができる。例示的な態様において、組成物は、有益な微生物によって産生される、ソホロ脂質などの、未精製のまたは精製された形態の生物系界面活性剤を含む。
好ましい態様において、飼料をサイロ貯蔵するための方法であって、本発明によるサイレージ添加剤組成物を飼料に接種することを含み、前記組成物の（1つまたは複数の）微生物接種材料が嫌気的に増殖し、それによって飼料を発酵させ、サイレージを生産する、方法が提供される。飼料は、例えば、草、トウモロコシ、モロコシ、穀類、カラスムギ、および/またはアルファルファ植物の刈り取り物を含むことができる。
本組成物の接種は、組成物を飼料に適用すること、および任意で組成物を飼料と混合することを含むことができる。好ましくは、飼料は、適切な「サイレージ環境」、すなわち、例えば、嫌気性発酵が起こり得るように任意で混合しながら接種後に密閉することができる、気密サイレージ袋、防水シート、サイロ、またはタンク中に収容される。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物は、乾燥された形態で飼料に直接適用され、その後、発酵を助長する環境を作るために、液体および/または栄養素培地の源が混合物に適用される。ある特定の他の態様において、飼料が十分な含水量、例えば45重量％～90重量％の含水量を有する場合、サイレージ添加剤組成物は、液体を添加することなく乾燥された形態で適用することができる。さらに他の態様において、サイレージ添加剤は、飼料への適用前に水または栄養素培地と予め混合される。
いくつかの態様において、飼料の発酵は、例えば、約24時間～12週間、または約10日間～3週間の範囲の期間、進行する。前記方法は、例えば発酵期間全体を通じてpHを監視するために、および/またはサイレージの潜在的な汚染をチェックするために、サイレージから検体を採取することを含むことができる。しかしながら、サイレージ環境内に空気を導入しないように、検体採取の際に注意を払うべきである。
いくつかの態様において、本発明は、例えばシンクイムシ、ゾウムシ、蛾、および甲虫などの、貯蔵された穀物の有害生物を防除する方法であって、本発明のサイレージ添加剤組成物が、貯蔵された穀物に適用される、方法を提供する。穀物としては、例えば、小麦粉、マイダ、スジ、豆、綿実、トウモロコシ、米、大麦、アマランス、ソバ、ブルグア麦、ファッロ、亜麻、カムート、雑穀、キノア、ライ麦、スペルト小麦、テフ、およびライ小麦を挙げることができる。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物の適用は、以下の利点の1つまたは複数を提供する:サイレージ発酵の速度を高めること;サイレージおよび/または貯蔵された穀物の腐敗を引き起こし得る、カビ、真菌、および細菌を防除すること;サイレージおよび/または貯蔵された穀物を餌にする、および/またはこれらに群がる有害節足動物を、防除すること;ならびに、家畜用の飼料源としてのサイレージおよび/または貯蔵された穀物の、栄養上の利点を高めること。
いくつかの態様において、本発明は、家畜動物に給餌する方法であって、前記動物がサイレージを摂取し得るように、本発明の態様に従って生産されたサイレージを前記家畜動物に利用可能とする、方法を提供する。有利には、飼料源は、例えば、成長速度（例えば、平均1日増体量）の改善、飼料から筋肉への変換の改善、乳の質および量の改善、寿命の延長、免疫健康の改善、腸内細菌叢の改善、消化病原体の減少、および腸内メタン産生の減少を含む健康上の利益を家畜動物に提供することができる。
発明の詳細な説明
本発明は、サイレージ生産および穀物保存において使用するための、微生物ベースの製品を提供する。具体的には、本発明は、サイレージを生産するための、かつ/またはサイレージおよび貯蔵された穀物に群がる有害生物を防除するための、サイレージ添加剤を提供する。有利には、本発明の微生物ベースの製品および方法は、環境に優しく、非毒性であり、費用効果が高い。
選択された定義
本明細書で使用される場合、「バイオフィルム」は、細胞が互いにおよび/または表面に接着する、微生物の複雑な集合体である。いくつかの態様において、細胞は、集合体全体を取り囲む多糖バリアを分泌する。バイオフィルム中の細胞は、液体培地中で浮遊または遊泳することができる単一細胞である同じ生物のプランクトン細胞とは生理学的に異なる。
本明細書で使用される場合、有害生物に関して使用される「防除」という用語は、有害生物を死滅させること、無能力化すること、固定化すること、もしくは有害生物の集団数を減少させること、または有害生物を実質的に複製させることができないようにおよび/もしくは害を引き起こすことができないようにすることを意味する。
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」化合物は、その化合物に自然の状態で随伴している細胞物質などの他の化合物を実質的に含まない。微生物の株の文脈における「単離された」とは、その株が自然の状態で存在する環境またはその株が産生された環境から、当該株が取り出されることを意味する。単離された株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として、または芽胞もしくは他の形態の栄養繁殖体として存在し得る。
本明細書で使用される場合、「生物学的に純粋な培養物」は、その培養物に自然の状態で随伴する材料またはその培養物がその中で産生された材料から、単離された培養物である。好ましい態様において、培養物は、他のすべての生きた細胞から単離されている。さらに好ましい態様において、生物学的に純粋な培養物は、他の材料を随伴して存在する同一の微生物の培養物と比較して有利な特性を有する。有利な特性は、例えば、1つまたは複数の増殖副生成物の向上した生産であり得る。
ある特定の態様において、精製された化合物は、関心対象の化合物の少なくとも60重量％である。好ましくは、調製物は、関心対象の化合物の少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％である。例えば、精製された化合物は、好ましくは、所望の化合物の少なくとも90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％または100重量％（w/w）であるものである。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定される。
本明細書で使用される場合、「飼料」は、家畜動物に餌として与えるなどの農業目的のために切断された植物材料を指す。飼料植物としては、例えば、ベントグラス、ウシクサ、偽エンバク草、ハリケーングラス、スリナムグラス、コロニビアグラ（koronivia graa）、ブロムグラス、ブッフェルグラス、ローズグラス、バミューダグラス、オーチャードグラス、アンテロープグラス、ブンゴマグラス、ウシノケグサ、ブラックスピアグラス、マーシュグラス、ジャラグア（jaragua）、タイワンアシカキ、ライグラス、ギニアグラス、モラセスグラス、カラバオグラス、ダリスグラス、リードカナリーグラス、ナガハグサ、エノコログサ、カモジグサなどの草;ピントピーナッツ、エンドウ、シロツメクサ、スイートクローバー、多年生ダイズ、クローバー、ベッチ、ビグナ、アカシアアネウラ、ネムノキ、ベルモント・シリス（Belmont siris）、ビルマネム（lebbeck）、イヤーポッドツリー、鉛樹などのマメ科植物;ならびに、アルファルファ、トウモロコシ（maize）、ソルガム、カラスムギ、トウモロコシ（corn）、および/または大豆ストーバーなどのその他の植物が挙げられる。
「代謝産物」は、代謝によって産生される任意の物質（例えば、増殖副生成物）、または特定の代謝過程に関与するために必要な物質を指す。代謝産物の例としては、生物系界面活性剤、バイオポリマー、酵素、酸、溶媒、アルコール、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量元素およびアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「有害生物」は、ヒトまたはヒトの重要な物（例えば、サイレージ生産および/または穀物貯蔵）に対して、破壊的、有害、および/または害をもたらす、ヒト以外の任意の生物である。一部の、ただしすべてではない例において、有害生物は病原性生物であり得る。有害生物は、感染、寄生、および/もしくは疾患を引き起こし、もしくはこれらの媒介物であり得る。あるいは、単に餌にして、または他の物理的な害を引き起こして、植物および/または生体組織を切断し得る。有害生物は、ウイルス、真菌、細菌、カビ、原虫、寄生生物、節足動物、および/または線虫を含むがこれらに限定されない、単細胞または多細胞生物であり得る。
本明細書で使用される場合、状況または出来事を、「防止する」またはその「防止」は、状況または出来事の、開始、拡大性または進行の遅延、阻害、抑制、未然防止、および/または最小化を意味する。防止には、無期限の、絶対的な、または完全な防止が含まれ得るが、これらを必要とするものではない、すなわち、状況または出来事は、後になお発生し得る。防止は、そのような状況もしくは出来事の開始の、拡大性もしくは重度を低減すること、および/または、状況もしくは出来事が、より広範なもしくは重度のものへと進行するのを抑制することを含むことができる。
本明細書で提供される範囲は、その範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、1～20の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、ならびに例えば1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8および1.9などの前述の整数の間にあるすべての介在する小数値からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。部分範囲に関しては、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子状部分範囲」が特に企図される。例えば、1～50の例示的な範囲の入れ子状部分範囲は、一方向に1～10、1～20、1～30および1～40、または他の方向に50～40、50～30、50～20および50～10を含み得る。
本明細書で使用される場合、「減少する」は負の変化を指し、用語「増加する」は正の変化を指し、少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％の、各々の変化である。
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」は、相間の表面張力（または界面張力）を低下させる界面活性化合物を指す。界面活性剤は、例えば、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、および分散剤として作用する。「生物系界面活性剤」は、生細胞によっておよび/または天然由来の基質を使用して産生される、界面活性および/または両親媒性分子である。
「含む（including）」または「含有する（containing）」と同義である「含む（comprising）」という移行句は、包括的または非限定的であって、列挙されていない追加の要素または方法工程を排除しない。対照的に、「からなる（consisting of）」という移行句は、特許請求の範囲において指定されていない一切の要素、工程または成分を除外する。「から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句は、指定された材料または工程と、「特許請求の範囲に記載の発明の基本的かつ新規な（1つまたは複数の）特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」とに特許請求の範囲を限定する。「含む（comprising）」という用語の使用は、列挙された（1つまたは複数の）構成要素「からなる（consist）」または「から本質的になる（consist essentially of）」他の態様を意図する。
本明細書で使用される場合、特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、「または」という用語は包摂的であると理解される。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という用語は単数または複数であると理解される。
本明細書で使用される場合、特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の2標準偏差以内であると理解される。約は、記載された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％以内と理解することができる。
本明細書での変数のあらゆる定義における化学基のリストの記載は、任意の単一の基または列挙された基の組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書での変数または局面についての態様の記載は、その態様を任意の単一の態様として含み、または任意の他の態様もしくはその一部と組み合わせて含む。
本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
サイレージ添加剤組成物
好ましい態様において、本発明は、1つまたは複数の微生物接種材料を含むサイレージ添加剤組成物を提供する。有利には、ある特定の態様において、本組成物を使用した飼料の発酵は、サイレージの腐敗を防止し、有害生物を防除し、および/または家畜飼料製品としてのサイレージの栄養上の利点を高めることができる。
本明細書で使用される場合、「微生物接種材料」は、微生物または他の細胞培養物の増殖の結果として生成された成分を含む組成物である。したがって、微生物接種材料は、微生物自体および/または微生物増殖の副生成物を含み得る。微生物は、栄養状態（vegetative state）、芽胞または分生子形態、菌糸形態、任意の他の形態の栄養繁殖体、またはこれらの混合物であり得る。微生物は、プランクトン様もしくはバイオフィルムの形態、または両方の混合物であり得る。増殖の副生成物は、例えば、代謝産物、細胞膜成分、発現されたタンパク質、および/または他の細胞成分であり得る。微生物は、無傷であり得、または溶解され得る。好ましい態様において、微生物は、微生物接種材料中に、例えば、組成物1グラムまたは1ml当たり、少なくとも1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012または1×1013またはそれを超えるCFUの濃度で、微生物がその中において増殖した増殖培地とともに存在する。
一態様において、本明細書に記載されている微生物接種材料は、細菌株、ならびに、例えば有機酸、生物系界面活性剤、および/または酵素などの、その増殖副生成物を含む、1つまたは複数の細菌培養物を含むことができる。
いくつかの態様において、微生物接種材料は、発酵からの栄養素および残余基質を含むことができる。微生物は、生きていてもよく、または不活性であってもよいが、好ましい態様においては、微生物は生きている。細菌培養物は、例えば、新鮮な生きた培養物、再水和された凍結乾燥細菌細胞もしくは芽胞、または解凍された凍結細菌調製物の形態であり得る。
本発明に従って有用な微生物は、例えば、細菌、酵母、および/または真菌の、非植物病原性株であり得る。これらの微生物は、天然のまたは遺伝子改変された微生物であり得る。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために特定の遺伝子で形質転換され得る。微生物は、所望の株の変異体でもあり得る。本明細書で使用される場合、「変異体」は、参照微生物の株、遺伝的変異形、またはサブタイプを意味し、変異体は、参照微生物と比較して1つまたは複数の遺伝子の変動（例えば、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、重複、フレームシフト変異または反復伸長）を有する。変異体を作製するための手順は、微生物学の分野で周知である。例えば、UV突然変異誘発およびニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。
ある特定の態様において、微生物はLABである。LABは、グラム陽性、非芽胞形成性球菌、球桿菌または桿菌である。LABは一般に非呼吸性であり、カタラーゼを欠く。LABは、グルコースを、主に、乳酸に、ならびに/または乳酸、CO2、およびエタノールに、発酵させる。すべてのLABは嫌気的に増殖するが、一部は「耐気性嫌気性」としてO2の存在下で増殖することができる。
細菌の多くの属が、発酵の主要または副次的最終生成物として乳酸を産生するが、乳酸菌という用語は、従来、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、コルノバクテリウム属（Cornobacterium）、エンテロコッカス属、プロピオノバクター属、アエロコッカス属、オエノコッカス属（Oenococcus）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、バゴコッカス属（Vagococcus）およびワイセラ属（Weisella）を含むラクトバチルス目（Lactobacillales）中の属のために確保されている。
ある特定の態様において、本組成物のLABは、伝統的にLABとして分類されていないが、主要または副次的代謝産物として乳酸を産生する細菌である。例えば、ある特定の態様において、LABは、B.コアグランスなどのバチルス属の種の株である。
いくつかの態様において、B.コアグランスは、乳酸およびその他の有機酸を産生することができる。さらに、いくつかの態様において、B.コアグランスは、LABの他の種より耐熱性であり（例えば、50℃～52℃で増殖することができる）、より暑い気候において、および/または密閉されたサイレージ環境で空気漏れが発生した場合に、サイロ貯蔵過程の有効性を増大させることができる。
いくつかの態様において、サイレージの生産および/または有害生物防除に有用な、他の有機酸、生物系界面活性剤、および/または酵素などの他の有益な増殖副生成物が可能である、細菌種または株。
ある他の特定の態様において、B.アミロリケファシエンスの株、例えば、B.アミロリケファシエンス株NRRL B-67928（「B.amy」）が使用される。
ある特定の態様において、B.スブチリス（B.subtilis）の株、例えば、B.スブチリス株NRRL B-68031（「B4」）が使用される。
B.アミロリケファシエンス「B.amy」微生物およびB.スブチリス「B4」微生物の培養物が、Agricultural Research Service Northern Regional Research Laboratory（NRRL）,1400 Independence Ave.,S.W.,Washington,DC,20250,USAに寄託されている。B.amy寄託物は、寄託機関によって受託番号NRRL B-67928が割り当てられ、2020年2月26日に寄託された。B4寄託物は、寄託機関によって受託番号NRRL B-68031が割り当てられ、2021年5月6日に寄託された。
本培養物の各々は、米国特許法施行規則1.14および米国特許法第122条に基づいてその権利が与えられることが特許商標庁によって決定された者に対して、本特許出願の係属中に当該培養物の入手が可能であることを保証する条件の下で寄託されている。各寄託物は、本出願の対応物または本出願の後継出願（progeny）が出願されている国における外国特許法によって要求されるところにしたがって入手可能である。しかしながら、寄託物が利用可能であることは、政府の措置によって付与された特許権から逸脱して本発明を実施するための実施権を構成するものではないことを理解されたい。
さらに、本培養物の寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の定めに従って保存され、公衆に利用可能とされる、すなわち、本培養物の寄託物は、当該寄託物の試料の供与の直近の請求後少なくとも5年の期間、かつ、いかなる場合においても、寄託日の後少なくとも30年の期間または当該培養物を開示する発行され得る任意の特許の法的強制力を有する期間、当該寄託物を生存させ、汚染させないように保つために必要な、あらゆる注意を払って保存される。寄託者は、寄託物の状態を原因として、寄託機関が、要求されたときに試料を供与することができなければ、寄託物を交換する義務を負うことを認める。本培養物の寄託物の公衆による利用可能性に関するすべての制限は、本培養物を開示する特許が付与された時点で変更不能に取り除かれる。
いくつかの態様において、B.amyは、圧縮された塩組成物を製造する際にしばしば利用されるような、高塩、高熱、および高圧の条件下で生存することができる。例えば、B.amy芽胞は、いくつかの態様において、少なくとも55℃～100℃、または少なくとも80℃～125℃の温度;少なくとも200MPa～300MPa、または少なくとも250MPa～350MPaの圧力;および、例えば、1％～15％またはそれより高い、例えば、少なくとも5％、10％、12％、15％またはそれより高い塩濃度に対する耐性を示すことができる。いくつかの例では、B.amyは窒素固定細菌でもある。
さらに、B.amyは、抗真菌性、抗ウイルス性、および抗菌性の、リポペプチド生物系界面活性剤、プロピオン酸および酢酸などの、有機酸、ならびに、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼなどの、酵素、を含む代謝産物の、独特の混合物を産生する。例えば、いくつかの態様において、B.amyは、サーファクチン、フェンギシン、イチュリン、およびリケニシン生物系界面活性剤の混合物を産生することができる。いくつかの態様において、B.amyは、B.アミロリケファシエンスの他の参照株よりも多い量でリポペプチドを産生することができる。
ある特定の態様において、組成物はB.スブチリスB4を含むことができる。株B4は、増強された量で、リポペプチド生物系界面活性剤、特にサーファクチンを産生することができる。有利には、いくつかの態様において、B4、および/またはB4が産生する増強された量のサーファクチンは、家畜消化管におけるメタン生成バイオフィルムの増強された破壊に特に有用であり得る。
いくつかの態様において、B4は「界面活性剤過剰産生」である。例えば、この株は、少なくとも0.1～10g/L、例えば0.5～1g/Lの生物系界面活性剤、または、他のB.スブチリス細菌と比較して、例えば少なくとも10％、25％、50％、100％、2倍、5倍、7.5倍、10倍、12倍、15倍もしくはそれより多くを産生し得る。例えば、いくつかの態様において、ATCC 39307を参照株として使用することができる。
したがって、B.コアグランスとB.amyおよび/またはB4との組み合わせは、サイレージまたは穀物貯蔵環境における、発酵の増強された速度および微生物有害生物の直接的な防除を促進することができる。
一態様において、組成物は、約1×103～1×1012、1×104～1×1011、1×105～1×1010、または1×106～1×109CFU/mlのB.コアグランスを含む。
一態様において、組成物は、約1×103～1×1012、1×104～1×1011、1×105～1×1010、または1×106～1×109CFU/mlのB.amyを含む。
一態様において、組成物は、約1×103～1×1012、1×104～1×1011、1×105～1×1010、または1×106～1×109CFU/mlのB4を含む。
一態様において、組成物は、約1×103～1×1012、1×104～1×1011、1×105～1×1010、または1×106～1×109CFU/mlの別の微生物、例えばLABを含む。
一態様において、組成物は、接種材料の1～99重量または体積％のB.コアグランス、および99～1重量または体積％のB.amyを含む微生物接種材料を、含むことができる。いくつかの態様において、B.コアグランス対B.amyの細胞数比は、約1:9～約9:1、約1:8～約8:1、約1:7～約7:1、約1:6～約6:1、約1:5～約5:1、または約1:4～約4:1である。
一態様において、組成物は、接種材料の1～99重量または体積％のB.コアグランス、および99～1重量または体積％のB4を含む微生物接種材料を、含むことができる。いくつかの態様において、B.コアグランス対B4の細胞数比は、約1:9～約9:1、約1:8～約8:1、約1:7～約7:1、約1:6～約6:1、約1:5～約5:1または約1:4～約4:1である。
一態様において、組成物は、接種材料の1～99重量または体積％のB.コアグランス、および99～1重量または体積％のB4とB.amyの合計を含む微生物接種材料を、含むことができる。いくつかの態様において、B.コアグランス対B4とB.amy（合わせた合計）の細胞数比は、約1:9～約9:1、約1:8～約8:1、約1:7～約7:1、約1:6～約6:1、約1:5～約5:1、または約1:4～約4:1である。
組成物中の、微生物および他の成分の、種および比は、例えば、処理されているサイレージまたは穀物の種類、湿度/湿気レベル、およびその他の環境因子に従って決定することができる。したがって、組成物は、任意の与えられた飼料作物に対してカスタマイズ可能であり得る。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物は、追加の成分、例えば、担体、乾燥剤、塩、染料、香味料、緩衝剤、栄養素、デンプン、炭水化物、水、ならびに/または、追加の微生物培養物および/もしくは発酵副生成物を含む。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物は、例えば軟体の幼虫（grub）および外骨格を有する有害生物を含むサイレージ有害生物に対する有害生物防除剤として役立ち得る、珪藻土を含む。珪藻土は、珪藻（例えば、メロシラ（Melosira）およびモノリチカ（Monolithica））として知られている硬殻原生生物（protest）の一種の化石化した珪質性遺骸を含む。微視的には、粒子は極めて鋭利であり、昆虫にくっつくことができ、昆虫の外骨格関節の間に留まった状態になる。虫が動くと、その体は鋭い粒子から切り傷および裂傷を受ける。さらに、研磨性粒子は、昆虫のワックス状外骨格層を掻き取ることができ、これにより、その後、内部の水分を昆虫の体から逸出させることができる。さらに、軟体有害生物は、珪藻土の研磨性縁部によって切断されることに加えて、珪藻土によって脱水された状態となり得る。
有害生物は、例えば、ゴキブリ、ダニ、甲虫、穿孔虫、ゾウムシ、シロアリ、アリ、バッタ、アブラムシ、ナメクジ、カタツムリ、幼虫（grub）、線虫、および/または、サイレージもしくは貯蔵された穀物を餌にし得るその他の虫型（worm-type）もしくは節足動物有害生物であり得る。
有利には、珪藻土は、サイロまたは穀物貯蔵容器における凝縮物形成を低減させるための、吸湿性物質または乾燥剤としても機能することができ、それによって環境をカビおよび真菌の増殖にとって、より好ましくないものにする。
好ましい態様において、珪藻土は、1マイクロメートル～1ミリメートル、好ましくは10～200マイクロメートルの粒径を有する粉末の形態である。いくつかの態様では、軽石粉末も使用することができる。
ある特定の態様において、組成物は、0.01重量％～75重量％、0.1重量％～50重量％、0.5重量％～25重量％、または1.0重量％～15重量％の珪藻土を含む。
いくつかの態様において、サイレージ添加剤組成物は、例えば、有益な酵母、真菌、および/または他の細菌を含む、1つまたは複数の追加の微生物の発酵生成物を含む。発酵生成物は、生きたおよび/または不活性培養物、精製されたまたは未精製の形態の増殖副生成物、例えば生物系界面活性剤、酵素、および/または他の代謝産物、および/または任意の残留栄養素を含有することができる。組成物中のバイオマスの量は、例えば、約0.01重量％～100重量％、約1重量％～90重量％、約5重量％～約80重量％、または約10重量％～約75重量％のいずれでもあり得る。
発酵生成物は、抽出または精製ありまたはなしで、直接使用され得る。所望であれば、文献に記載されている標準的な抽出および/または精製方法または技術を使用して、抽出および精製を容易に達成することができる。
ある特定の態様において、発酵生成物は、例えば、B.スブチリス、B.リケニフォルミス（B.licheniformis）、B.ムチラギナス（B.mucilaginous）、B.モヤベンシス（B.mojavensis）、B.メガテリウム（B.megaterium）およびB.ムチラギノサス（B.mucilaginosus）などの1つまたは複数の他のバチルス属の種の生成物である。
ある特定の態様において、発酵生成物は、1つまたは複数の、酵母および/または真菌、例えば、オーレオバシディウム（Aureobasidium）（例えば、A.プルランス（A.pullulans））、ブラケスレア（Blakeslea）、カンジダ（Candida）（例えば、C.アピコラ（C.apicola）、C.ボンビコラ（C.bombicola）、C.ノダエンシス（C.nodaensis））、クリプトコッカス（Cryptococcus）、デバリオマイセス（例えば、D.ハンゼニイ）、エントモフトラ（Entomophthora）、ハンセニアスポラ（Hanseniaspora）（例えば、H.ウバルム（H.uvarum））、ハンゼヌラ（Hansenula）、イッサチェンキア（Issatchenkia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）（例えば、K.ファフィー（K.phaffii））、フィコミセス（Phycomyces）、ピキア（Pichia）（例えば、P.アノマラ（P.anomala）、P.ギリエルモンディ（P.guilliermondii）、P.オクシデンタリス（P.occidentalis）、P.クドリアブゼビイ（P.kudriavzevii））、プレウロタス（Pleurotus）属の種（例えば、P.オストレアタス（P.ostreatus））、シュードザイマ（Pseudozyma）（例えば、P.アフィディス（P.aphidis））、サッカロミセス（例えば、S.ボウラルディイ・シクィーラ（S.boulardii sequela）、S.セレビシエ、S.トルラ（S.torula））、スターメレラ（例えば、S.ボンビコラ）、トルロプシス（Torulopsis）、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、T.リーセイ（T.reesei）、T.ハルジアナム（T.harzianum）、T.ハマタム（T.hamatum）、T.ビリデ（T.viride））、ウスチラゴ（Ustilago）（例えば、U.メイディス（U.maydis））、ウィッカーハモマイセス（例えば、W.アノマルス、NRRL Y-68030株）、ウィリオプシス（Williopsis）（例えば、W.ムラキイ（W.mrakii））、ザイゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）（例えば、Z.バイリイ（Z.bailii））などの生成物である。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物中で利用される微生物は、サイロ貯蔵過程を強化するために有用な、いくつかの有益な特性を有する。
一態様において、微生物は生物系界面活性剤を産生することができる。両親媒性分子として、微生物生物系界面活性剤は、液体、固体、および気体の分子間の表面および界面張力を低下させる。さらに、生物系界面活性剤は生分解性であり、毒性が低く、低コストかつ再生可能な資源を使用して製造することができる。生物系界面活性剤は、様々な表面への望ましくない微生物の付着を阻害し、バイオフィルムの形成を防止し、強力な乳化および解乳化特性を有することができる。
本方法による生物系界面活性剤は、例えば、低分子量糖脂質（例えば、ソホロ脂質、セロビオース脂質、ラムノ脂質、マンノシルエリスリトール脂質、およびトレハロース脂質）、リポペプチド（例えば、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、アルスロファクチン、およびリケニシン）、フラボ脂質、リン脂質（例えば、カルジオリピン）、ならびにリポタンパク質、リポ多糖-タンパク質複合体、および多糖-タンパク質-脂肪酸複合体などの、高分子量ポリマー、から選択することができる。
組成物は、0.001重量％～10重量％、0.01重量％～5重量％、0.05重量％～2重量％、および/または0.1重量％～1重量％の濃度で、1つまたは複数の生物系界面活性剤を含むことができる。
一態様において、サイレージ添加剤組成物は、1つまたは複数の酵素をさらに含む。酵素は、純粋なまたは未精製の形態で添加することができ、かつ/または酵素は、サイレージ添加剤組成物中に存在する1つまたは複数の微生物によって産生されることができる。酵素は、飼料中の糖および他のポリマーの分解を強化し、より容易に発酵可能な化合物をLABに提供することができる。酵素は、家畜動物のための植物材料の消化性を高めることもできる。
例示的な酵素には、フィターゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、セルラーゼ、ヘミクエルラーゼ（hemicuellulase）、ペクチナーゼ、リグノセルロース溶解（lignocellulytic）酵素、プロテイナーゼKなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、組成物は、セルラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、および/またはアミラーゼを含む。
いくつかの態様において、サイレージ添加剤組成物は担体を含む。担体は、液体または固体担体を含むことができる。例えば、固体担体は、炭酸カルシウム、デンプン、ベーカーの糖（baker's sugar）、マルトデキストリン、セルロース、およびこれらの組み合わせで構成され得る。液体担体には、水、微生物の培養からの発酵ブロス、および/または液体栄養素培地が含まれるが、これらに限定されない。
本組成物に対する他の添加剤としては、例えば、アルミノケイ酸ナトリウム（sodium silcoaluminate）、重炭酸ナトリウム、染料、デキストロース、再水和緩衝剤、香味料、および/または二酸化ケイ素を挙げることができる。
ある特定の態様において、組成物の効果を改善または安定化するために、組成物を適切な補助剤と混合し、次いでそのまままたは必要に応じて希釈後に使用することができる。好ましい態様において、組成物は、液体、濃縮された液体として、または水および他の成分と混合して液体生成物を形成することができる乾燥粉末もしくは顆粒として調合される。ある特定の態様において、組成物は、例えば、液体、粉塵、顆粒、微粒剤、ペレット、水和剤、流動性粉末、エマルジョン、マイクロカプセル、油、またはエアロゾルとして調合される。
有利には、本発明によるサイレージ添加剤組成物は非毒性であり、例えばヒトまたは他の非有害動物の皮膚または消化管に刺激を引き起こすことなく、高濃度で適用することができる。したがって、本発明は、組成物の適用が、生産者および家畜などの生きた生物の存在下で行われる場合に特に有用である。
微生物接種材料を生産するための微生物の増殖
本発明は、微生物の培養ならびに微生物代謝産物および/または微生物増殖の他の副生成物の生産のための方法を利用する。本発明は、さらに、微生物の培養および所望の規模での微生物代謝産物の生産に適した培養過程を利用する。これらの培養過程には、深部培養/発酵、固相発酵（SSF）、ならびにこれらの改変、混合、および/または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「発酵」は、制御された条件下での、細胞の培養または増殖を指す。増殖は、好気性または嫌気性であり得る。
一態様において、本発明は、バイオマス（例えば、生きた細胞材料）、細胞外代謝産物（例えば、小分子および排泄されたタンパク質）、残留栄養素および/または細胞内成分（例えば、酵素および他のタンパク質）の生産のための、材料および方法を提供する。
本発明に従って使用される微生物増殖容器は、産業用の任意の発酵槽または培養反応器であり得る。一態様において、容器は、pH、酸素、圧力、温度、湿度、微生物密度、および/または代謝産物濃度などの、培養過程における重要な要因を測定するために、機能的制御/センサを有し得る、または機能的制御/センサに接続され得る。
さらなる態様において、容器は、容器内の微生物の増殖（例えば、細胞数および増殖相の測定）を監視することもできる。あるいは、毎日の試料を容器から採取し、希釈プレーティング技術などの当技術分野で公知の技術による計数に供し得る。
一態様において、本方法は、培養に窒素源を補充することを含む。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、および/または塩化アンモニウムであり得る。これらの窒素源は、独立して、または2つもしくはそれより多くを組み合わせて、使用され得る。
本方法は、増殖培養物に酸素添加を提供することができる。一態様は、低酸素含有空気を除去して酸素含有空気を導入するために、空気の遅い動きを利用する。深部発酵の場合、酸素含有空気は、液体の機械的撹拌のための羽根車、および液体中への酸素の溶解のために液体に気体の泡を供給するためのエアスパージャを含む機構によって毎日補充される周囲空気であり得る。
この方法は、培養に炭素源を補充することをさらに含むことができる。炭素源は、典型的には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、および/またはマルトースなどの、炭水化物;酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、および/またはピルビン酸などの、有機酸;エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、および/またはグリセロールなどの、アルコール;大豆油、キャノーラ油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、および/または亜麻仁油などの、油脂類である。これらの炭素源は、独立して、または2つもしくはそれより多くを組み合わせて使用され得る。
一態様において、微生物のための増殖因子および微量栄養素が培地中に含まれる。これは、必要なビタミンのすべてを産生することができない微生物を増殖させる場合に特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン、および/またはコバルトなどの微量元素を含む無機栄養素も培地中に含まれ得る。さらに、ビタミン、必須アミノ酸、および微量元素の供給源は、例えば、小麦粉もしくは穀粉、例えばトウモロコシ粉の形態で、または抽出物、例えば酵母抽出物、ジャガイモ抽出物、牛肉抽出物、大豆抽出物、バナナ皮抽出物などの形態で、または精製された形態で、含まれ得る。例えば、タンパク質の生合成に有用なアミノ酸などのアミノ酸も含めることができる。
一態様において、無機塩も含まれ得る。使用可能な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、および/または炭酸ナトリウムであり得る。これらの無機塩は、独立して、または2つもしくはそれより多くを組み合わせて使用され得る。
いくつかの態様において、培養のための方法は、培養過程の前および/または間に、培地に、追加の酸および/または抗菌剤を添加することをさらに含み得る。培養物を汚染から保護するために、抗菌剤または抗生物質が使用される。
さらに、深部培養中の泡の形成および/または蓄積を防止するために、消泡剤も添加され得る。
混合物のpHは、関心対象の微生物に適しているべきである。好ましい値付近でpHを安定化させるために、カーボナートおよびホスファートなどの、緩衝剤およびpH調整剤が使用され得る。金属イオンが高濃度で存在する場合、培地中にキレート剤の使用が必要であり得る。
微生物は、プランクトン形態でまたはバイオフィルムとして、増殖させることができる。バイオフィルムの場合、容器は、微生物をバイオフィルム状態で増殖させることができる基材をその中に有し得る。系は、例えば、バイオフィルム増殖特性を、促進および/または改善する刺激（せん断応力など）を加える能力も有し得る。
一態様において、微生物の培養のための方法は、約5℃～約100℃、好ましくは15℃～60℃、より好ましくは25℃～50℃で行われる。さらなる態様において、培養は、一定温度で連続的に行われ得る。別の態様において、培養は温度の変化を受け得る。
一態様において、本方法および培養過程において使用される機器は無菌である。反応器/容器などの培養機器は、滅菌ユニット、例えばオートクレーブから分離され得るが、滅菌ユニットに接続されていてもよい。培養機器は、接種を開始する前にインサイチューで滅菌する滅菌ユニットも有し得る。空気は、当技術分野で公知の方法によって滅菌することができる。例えば、周囲空気は、容器中に導入される前に少なくとも1つのフィルタを通過することができる。他の態様において、培地は低温殺菌してもよく、または任意で熱を全く加えなくてもよく、望ましくない細菌増殖を制御するために、低水分活性および低pHの使用を活用し得る。
一態様において、本発明は、増殖および代謝産物の産生に適した条件下で本発明の微生物株を培養すること、ならびに任意で前記代謝産物を精製することによって、例えば、生物系界面活性剤、酵素、タンパク質、エタノール、乳酸、β-グルカン、ペプチド、代謝中間体、多価不飽和脂肪酸、および脂質などの、微生物代謝産物を生産するための方法をさらに提供する。本方法によって生産される代謝産物含有量は、例えば、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％であり得る。
関心対象の微生物によって産生された微生物増殖副生成物は、微生物中に保持され得るか、または増殖培地中に分泌され得る。培地は、微生物増殖副生成物の活性を安定化する化合物を含有し得る。
発酵培地のバイオマス含有量は、例えば、5g/l～180g/lもしくはそれより多く、または10g/l～150g/lであり得る。
細胞濃度は、例えば、少なくとも1×106～1×1012、1×107～1×1011、1×108～1×1010、または1×109CFU/mlであり得る。
微生物の培養および微生物副生成物の生産のための方法および機器は、バッチ、準連続過程または連続過程で行うことができる。
一態様において、すべての微生物培養組成物は、培養の完了時に（例えば、例えば所望の細胞密度または指定の代謝産物の密度を達成したときに）取り出される。このバッチ手順では、第1のバッチの回収時に完全に新しいバッチが開始される。
別の態様では、発酵生成物の一部のみが任意の一時点で取り出される。この態様では、生細胞、芽胞、分生子、菌糸、および/または菌糸体を有するバイオマスは、新しい培養バッチのための接種材料として容器内に残る。取り出される組成物は、無細胞培地であり得る、または細胞、芽胞もしくはその他の生殖性栄養繁殖体および/もしくはこれらの組み合わせを含有し得る。このようにして準連続系が作製される。
有利には、本方法は、複雑な機器または高いエネルギー消費を必要としない。関心対象の微生物は、その培地と依然混合されていても、現場で小規模または大規模に培養し、利用することができる。
しかしながら、生産された微生物接種材料は、さらなる安定化、保存、および貯蔵なしに使用され得る。有利には、これらの微生物接種材料の直接使用は、微生物の高い生存率を維持し、異物および望ましくない微生物からの汚染の可能性を低減し、微生物増殖の副生成物の活性を維持する。
他の態様において、組成物（微生物、増殖培地、または微生物および培地）は、例えば、意図される用途、企図される適用方法、発酵容器のサイズ、および微生物増殖設備から使用場所までの任意の輸送様式を考慮して、適切なサイズの容器に入れることができる。したがって、微生物ベースの組成物がその中に入れられる容器は、例えば、1パイント～1,000ガロンまたはそれを超え得る。ある特定の態様において、容器は、1ガロン、2ガロン、5ガロン、25ガロンまたはそれより大きい。
微生物ベースの製品の調製
本発明は、所望の結果を達成するために実際に適用されるべき製品である「微生物ベースの製品」を提供する。微生物ベースの製品は、単に、微生物培養過程から採集された微生物接種材料であり得る。あるいは、微生物ベースの製品は、添加されたさらなる成分を含み得る。これらの追加の成分は、例えば、安定剤、緩衝剤、適切な担体、例えば水、塩溶液、または任意の他の適切な担体、さらなる微生物増殖を支援するための添加された栄養素、非栄養素増殖促進剤、ならびに/またはそれが適用される環境における微生物および/もしくは組成物の追跡を容易にする作用物質を含むことができる。微生物ベースの製品は、微生物接種材料の混合物も含み得る。微生物ベースの製品は、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製などの、ただしこれらに限定されない何らかの方法で処理された、微生物接種材料の1つまたは複数の成分も含み得る。
本発明の1つの微生物ベースの製品は、単に、微生物、および/または微生物によって産生される微生物代謝産物、および/または任意の残留栄養素を含有する、発酵培地である。発酵の生成物は、抽出または精製なしで、直接使用され得る。所望であれば、文献に記載されている標準的な抽出および/または精製方法または技術を使用して、抽出および精製を容易に達成することができる。
微生物ベースの製品中の微生物は、活性形態もしくは不活性形態、または栄養細胞、生殖性芽胞、分生子、菌糸体、菌糸、もしくは微生物の栄養繁殖体の任意の他の形態の形態であり得る。微生物ベースの製品は、微生物のこれらの形態のいずれもの組み合わせも含有し得る。
一態様において、微生物ベースの製品を生産するために、微生物の異なる株が別々に増殖され、次いで一緒に混合される。微生物を、任意で、その中で微生物が増殖される培地と混ぜ、混合前に乾燥させることができる。
一態様において、異なる株は一緒に混合されず、別個の微生物ベースの製品として植物および/またはその環境に適用される。
微生物ベースの製品は、さらなる安定化、保存、および貯蔵なしに使用され得る。有利には、これらの微生物ベースの製品の直接使用は、微生物の高い生存率を維持し、異物および望ましくない微生物からの汚染の可能性を低減し、微生物増殖の副生成物の活性を維持する。
増殖容器から微生物ベースの組成物を採集したら、採集された生成物を容器内に入れる際に、または使用のために輸送される際に、さらなる成分を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、同一のまたは異なる設備で生産された他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、保存剤、微生物増殖のための栄養素、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、溶解度制御剤、追跡剤、溶媒、殺生物剤、抗生物質、pH調整剤、キレート剤、安定剤、紫外光耐性剤、他の微生物、およびこのような調製物に対して慣用的に使用される他の適切な添加剤であり得る。
一態様において、有機酸およびアミノ酸またはそれらの塩を含む緩衝剤を添加することができる。適切な緩衝剤としては、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコヘプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタル酸塩、グルカル酸塩、タルトロン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン、およびこれらの混合物が挙げられる。リン酸および亜リン酸またはこれらの塩も使用され得る。合成緩衝剤は使用するのに適しているが、有機酸およびアミノ酸または上に列記されているそれらの塩などの天然緩衝剤を使用することが好ましい。
さらなる態様において、pH調整剤としては、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、または重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸、または混合物が挙げられる。
微生物ベースの組成物のpHは、関心対象の（1または複数の）微生物に適しているべきである。好ましい態様において、組成物のpHは、約3.5～7.0、約4.0～6.5、または約5.0である。
一態様において、例えば、貯蔵および輸送中に浸透圧調節物質として機能するために、グルコース、グリセロール、および/またはグリセリンを、微生物ベースの製品に添加することができる。一態様において、糖蜜を含めることができる。
一態様において、微生物の増殖を増強するために、微生物ベースの製品にプレバイオティクスを添加することができ、かつ/または微生物ベースの製品と同時にプレバイオティクスを適用することができる。適切なプレバイオティクスとしては、例えば、海藻（kelp）抽出物、フルボ酸、キチン、フマート（humate）、および/またはフミン酸が挙げられる。
任意で、製品は使用前に貯蔵することができる。貯蔵時間は、好ましくは短い。したがって、貯蔵時間は、60日未満、45日未満、30日未満、20日未満、15日未満、10日未満、7日未満、5日未満、3日未満、2日未満、1日未満、または12時間未満であり得る。好ましい態様において、生きた細胞が製品中に存在する場合、製品は、例えば20℃未満、15℃未満、10℃未満、または5℃未満などの低温で貯蔵される。
微生物ベースの製品の局所生産
本発明のある特定の態様において、微生物増殖設備は、所望の規模で関心対象の新鮮な高密度微生物および/または微生物増殖副生成物を生産する。微生物増殖設備は、適用の部位にまたはその近くに配置され得る。設備は、バッチ、準連続、または連続培養で、高密度の微生物ベースの組成物を生産する。
本発明の微生物増殖設備は、微生物ベースの製品が使用される場所（例えば、サイロ）に配置することができる。例えば、微生物増殖設備は、使用の場所から300マイル未満、250マイル未満、200マイル未満、150マイル未満、100マイル未満、75マイル未満、50マイル未満、25マイル未満、15マイル未満、10マイル未満、5マイル未満、3マイル未満、または1マイル未満であり得る。
微生物ベースの製品は、従来の微生物生産の微生物安定化、保存、貯蔵、および輸送過程に頼ることなく、局所的に生成することができるので、はるかに高密度の微生物を生成することができ、それによって現場での適用において使用するために必要な微生物ベースの製品の体積がより小さくなり、または所望の有効性を達成するために、必要であれば、はるかに高密度の微生物の適用が可能になる。これにより、より小規模のバイオリアクタ（例えば、より小さい発酵容器、より少ない開始材料、栄養素、およびpH制御剤の供給量）が可能になり、これにより、系が効率的になり、細胞を安定化させるまたは細胞をそれらの培養培地から分離する必要性をなくすことができる。微生物ベースの製品の局所的な生成は、製品中に増殖培地を含めることも容易にする。培地は、発酵中に生産され、局所使用に特によく適した作用物質を含有することができる。
局所的に生産された高密度で堅牢な微生物の培養物は、しばらくの間サプライチェーンに留まっていた培養物よりも、現場においてより効果的である。本発明の微生物ベースの製品は、細胞が発酵増殖培地中に存在する代謝産物および栄養素から分離されている従来の製品と比較して特に有利である。輸送時間の短縮は、現地の要望によって求められる時間および量で、微生物および/またはそれらの代謝産物の新鮮なバッチを生産および送達することを可能にする。
本発明の微生物増殖設備は、微生物自体、微生物の代謝産物、および/または微生物がその中で増殖する培地の他の成分を含む、新鮮な微生物ベースの組成物を生産する。所望であれば、組成物は、高密度の栄養細胞もしくは栄養繁殖体、または栄養細胞と栄養繁殖体の混合物を有することができる。
有利には、組成物は、指定された場所での使用に合わせて調整することができる。一態様において、微生物増殖設備は、微生物ベースの製品が使用される場所（例えば、かんきつ園）の上または近くに配置される。
有利には、これらの微生物増殖設備は、上流の処理遅延、サプライチェーンのボトルネック、不適切な貯蔵、ならびに例えば、生きた高細胞数製品および細胞が最初にその中で増殖される関連する培地および代謝産物の適時の送達および適用を阻害する他の偶発的事象に起因してその製品の品質が損なわれる遠方の工業的規模の生産者に依存するという現在の問題に対する解決策を提供する。
微生物増殖設備は、目的地の地理との相乗作用を向上させるために、微生物ベースの製品を適合させる能力によって製造上の汎用性を提供する。有利には、好ましい態様において、本発明の系は、農業生産を改善するために、天然に存在する局所微生物およびその代謝副生成物の力を利用する。
個々の容器の培養時間は、例えば、1～7日またはそれより長くてもよい。培養生成物は、多くの異なる方法のいずれでも採集することができる。
例えば発酵の24時間以内の局所生産および送達は、純粋で高い細胞密度の組成物および実質的により低い輸送コストをもたらす。より効果的で強力な微生物接種材料の開発において急速な進歩が予想されることに鑑みると、消費者は、微生物ベースの製品を迅速に送達するこの能力から多大な利益を得るであろう。
サイレージを生産する方法
好ましい態様において、飼料をサイロ貯蔵するための方法であって、本発明によるサイレージ添加剤組成物を飼料に接種することを含み、前記組成物の（1つまたは複数の）微生物接種材料が嫌気的に増殖し、それによって飼料を発酵させ、サイレージを生産する、方法が提供される。
接種は、組成物を飼料に適用すること、および任意で組成物を飼料と混合することを含むことができる。好ましくは、飼料は、嫌気性発酵が起こり得るように任意で混合しながら接種後に密閉することができる、気密サイレージ袋、防水シート、サイロ、またはタンク中に収容される。
処理組成物の効果を改善または安定化するために、組成物を適切な補助剤と混合し、次いでそのまま、または必要に応じて希釈後に、使用することができる。好ましい態様において、組成物は、水および他の成分と混合して液体生成物を形成することができる、乾燥粉末としてまたは顆粒として調合される。
ある特定の態様において、サイレージ添加剤組成物は、乾燥された形態で飼料に直接適用され、その後、発酵を助長する環境を作るために液体および/または栄養素培地の源が混合物に適用される。ある特定の他の態様において、飼料が十分な含水量（例えば、45重量％～90重量％の含水量）を有する場合、サイレージ添加剤組成物は、液体を添加することなく乾燥された形態で適用することができる。さらに他の態様において、サイレージ添加剤は、飼料への適用前に水または栄養素培地と予め混合される。
ある特定の態様において、本方法は、飼料1トン当たり少なくとも200億、少なくとも300億、少なくとも400億CFU、少なくとも500億CFU、少なくとも600億CFU、少なくとも700億CFU、少なくとも800億CFU、少なくとも900億CFU、または少なくとも1000億CFUの、（1つまたは複数の）微生物接種材料を適用することを含む。ある特定の態様において、本方法は、約10万CFU/gの飼料を適用することを含む。
いくつかの態様において、発酵は、例えば、24時間～12週間、36時間～10週間、48時間～8週間、56時間～6週間、または72時間～4週間の範囲の期間進行する。例示的な態様において、発酵期間は約10日間～3週間である。前記方法は、例えば発酵期間全体を通じてpHを監視するために、および/またはサイレージの潜在的な汚染をチェックするためにサイレージから検体を採取することを含むことができる。
いくつかの態様において、本方法は、適用中に微生物増殖を増強するために組成物とともに材料を適用すること（例えば、微生物の発芽および/または増殖を促進するための栄養素、発芽促進剤および/またはプレバイオティクス）をさらに含む。一態様において、栄養素源は、例えば、窒素、カリウム、リン、マグネシウム、タンパク質、ビタミン、および/または炭素の源を含むことができる。一態様において、プレバイオティクスとしては、例えば、海藻抽出物、フルボ酸、キチン、フマート、および/またはフミン酸を挙げることができる。一態様において、発芽促進剤としては、L-アラニン、および/またはL-バリンが挙げられる。
一態様において、本方法に従うサイレージ添加剤組成物の適用は、サイレージ発酵の速度を調節し、高める。
一態様において、本方法によるサイレージ添加剤組成物の適用は、サイレージおよび/または貯蔵された穀物の腐敗を引き起こし得る、カビ、真菌、および細菌の、直接的防除をもたらす。
一態様において、本方法によるサイレージ添加剤組成物の適用は、サイレージおよび/または貯蔵された穀物を餌にする、かつ/またはこれらに群がる、節足動物、虫（worm）、ナメクジ、カタツムリ、幼虫、およびその他の有害生物の直接的防除をもたらす。
一態様において、本方法によるサイレージ添加剤組成物の適用は、家畜用の飼料源としてのサイレージ、および/または貯蔵された穀物の栄養上の利点を高める。
いくつかの態様において、本発明は、例えばシンクイムシ、ゾウムシ、蛾、および甲虫などの、貯蔵された穀物の有害生物を防除する方法であって、本発明のサイレージ添加剤組成物が、貯蔵された穀物に適用される、方法を提供する。穀物としては、例えば、小麦粉、マイダ、スジ、豆、綿実、トウモロコシ、米、大麦、アマランス、ソバ、ブルグア麦、ファッロ、亜麻、カムート、雑穀、キノア、ライ麦、スペルト小麦、テフ、およびライ小麦を挙げることができる。
いくつかの態様において、本発明は、家畜動物に給餌する方法であって、前記動物がサイレージを摂取し得るように、本発明の態様に従って生産されたサイレージを前記家畜動物に利用可能とする、方法を提供する。有利には、飼料源は、例えば、成長速度（例えば、平均1日増体量）の改善、飼料から筋肉への変換の改善、乳の質および量の改善、寿命の延長、免疫健康の改善、腸内細菌叢の改善、消化病原体の減少、および腸内メタン産生の減少を含む健康上の利益を家畜動物に提供することができる。
本明細書で使用される「家畜」動物は、「家畜化された」動物である、すなわち、動物とヒトの間に相利的関係が存在するように、ヒトによって、長期的な世代数にわたって影響を及ぼされ、繁殖され、飼い慣らされ、かつ/または管理された種である。特に、家畜動物には、食料、繊維、および労働などの商品を生産するために、農業または工業環境で飼育される動物が含まれる。家畜という用語に含まれる動物の種類には、アルパカ、ラマ、ブタ（pig）（ブタ（swine））、ウマ、ラバ、ロバ、ラクダ、イヌ、反芻動物、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、およびひな鳥（squab）が含まれ得るが、これらに限定されない。
ある特定の態様において、家畜動物は、「反芻動物」、すなわち、特殊な腸内微生物叢の助けを借りて、消化前に植物ベースの食物を発酵させるのに適した区画に分かれた胃を利用する、哺乳動物である。反芻動物には、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、アイベックス、キリン、シカ、エルク、ムース、カリブー、トナカイ、アンテロープ、ガゼル、インパラ、ウィルドビーストおよびいくつかのカンガルーが含まれる。
特定の例示的な態様において、家畜動物はウシ動物であり、ウシ動物はウシ科のウシ亜科に属する反芻動物である。ウシ動物は、家畜化された種、および/または野生種を含むことができる。具体的な例としては、水牛、アノア、タマロオ、オーロックス、バンテン、ガウル、ガヤル、ヤク、クープレー、家畜肉牛、および乳牛（例えば、ボス・タウルス（Bos taurus）、ボス・インディカス（Bos indicus））、雄ウシ、去勢牛、ホウギュウ、サオラ、バイソン、バッファロ、ヨーロッパバッファロー、ボンゴ、クーズー、キューウェル（kewwel）、インババラ、クーズー、ニアラ、シタツンガ、およびエランドが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明およびその多くの利点のよりよい理解は、例示として与えられる以下の実施例から得ることができる。以下の実施例は、本発明の方法、応用、態様、および変形のいくつかの例示である。以下の実施例は、本発明を限定するものと見なされるべきではない。本発明に関して、多くの変更および修正を行うことができる。
実施例1-バチルス微生物の固相発酵
バチルス属の種の胞子の産生のために、小麦ふすまをベースとする培地が使用される。ステンレス鋼パン上に約1～2インチ厚の層で培地を広げ、滅菌する。
滅菌後、前記パンに種培養物を接種する。任意で、微生物の増殖を増強するために、例えば、塩、ならびに/または糖蜜、デンプン、グルコースおよびスクロースなどの炭素源を含む添加される栄養素を含めることができる。増殖速度を高め、培養培地全体にわたる細菌の運動性および分布を高めるために、ジャガイモ抽出物またはバナナ皮抽出物を培養物に添加することができる。
次いで、選択されたバチルス株の芽胞を、基材の表面上に噴霧またはピペット注入し、トレイを32～40℃でインキュベートする。温度を安定させるために、周囲空気をオーブンを通して送り込む。48～72時間のインキュベーションは、1×1010個またはそれより多くの芽胞/グラム株を生産することができる。
実施例2
増強されたリポペプチド産生のためのB.amyおよびM.ザンサス（M.xanthus）の共培養
一態様において、リポペプチド（例えば、サーファクチン、イチュリン、および/またはフェンギシン）を含む組成物を、B.amyとミキソコッカス・ザンサス（Myxococcus xanthus）の共培養を使用して生産する。一緒に増殖させると、これらの種は互いに阻害しようとし、それによって高濃度のリポペプチドを産生する。
B.amy接種材料を、小規模反応器中で24～48時間増殖させる。ミキソコッカス・ザンサス接種材料を、2Lの作業容量の種培養フラスコ中で48～120時間増殖させる。発酵反応器に2つの接種材料を接種する。栄養素培地は、以下を含む。
Figure 2023536372000001
微粒子状物質を固着する担体を栄養素培地中に懸濁させる。この担体は、セルロース（1.0g/L～5.0g/L）および/またはトウモロコシ粉（1.0g/L～8.0g/L）を含む。
B.amyは、液体発酵培地中でリポペプチドを産生する。培養物全体はそのまま使用することができ、または培養物を処理し、任意でリポペプチドを精製することができる。
実施例3-家畜飼料増強剤としてのB.amy
消化管内で生き続ける、いくつかの態様においては排泄後に動物の排泄物中で生き続ける、芽胞を産生することができるので、B.amyは、従来のプロバイオティクス微生物よりも特に有利である。さらに、B.amyは、家畜動物に投与された場合に広範囲の消化および環境上の利点を提供する代謝産物の独特の混合物を産生する。
ある特定の態様において、以下の表1に例示されているように、増殖副生成物は、メタン生成菌を直接阻害し、メタン生成菌バイオフィルムを破壊し、かつ/または家畜動物の消化器系のH2濃度を低下させることができる。
（表１）メタン生成およびH2を低下させるための例示的なB.amy増殖副生成物
Figure 2023536372000002
一態様において、以下の表2に例示されているように、組成物は、様々な健康促進機能を発揮することによって家畜動物の全体的な健康および生産性を高めることができるB.amyおよび/またはその増殖副生成物を含む。したがって、いくつかの態様において、B.amyは、動物に投与された場合、プロバイオティクスとして役立ち得る。
（表２）家畜の健康を高めるための例示的なB.amy増殖副生成物
Figure 2023536372000003
Figure 2023536372000004

Claims (25)

  1. 微生物接種材料と、珪藻土と、任意で担体とを含むサイレージ添加剤組成物であって、
    前記微生物接種材料が、細菌の1つもしくは複数の株および/またはその増殖副生成物を含み、
    前記細菌の1つまたは複数の株のうちの少なくとも1つが、飼料の存在下で乳酸を産生することができる、
    サイレージ添加剤組成物。
  2. 乳酸を産生することができる前記細菌の株が、バチルス・コアグランス（Baccilus coagulans）である、請求項1記載のサイレージ添加剤組成物。
  3. 前記微生物接種材料が、B.アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）株NRRL B-67928（「B.amy」）を含む、請求項1記載のサイレージ添加剤組成物。
  4. 前記微生物接種材料が、B.スブチリス（B.subtilis）株NRRL B-68031（「B4」）を含む、請求項1記載のサイレージ添加剤組成物。
  5. 前記増殖副生成物が、有機酸、生物系界面活性剤、および/または酵素である、請求項1記載のサイレージ添加剤組成物。
  6. 乾燥剤、塩、染料、香味料、緩衝剤、栄養素、デンプン、炭水化物、水、ならびに追加の微生物培養物および/または発酵副生成物
    のうちの1つまたは複数から選択される追加の成分をさらに含む、請求項1記載のサイレージ添加剤組成物。
  7. ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus）、スターメレラ・ボンビコーラ（Starmerella bombicola）、サッカロミセス・クロロラフィス（Saccharomyces chlororaphis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、プレウロタス・オストレアタス（Pleurotus ostreatus）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、およびメイエロザイマ・ギリエルモンディ（Meyerozyma guilliermondii）から選択される1つまたは複数の追加の有益な微生物の発酵生成物をさらに含む、請求項1記載のサイレージ添加剤組成物。
  8. 前記発酵生成物が、精製されたまたは未精製の形態の、前記有益な微生物の増殖副生成物、発酵培地、細胞、および/または発酵からの残留栄養素を含むことができる、請求項7記載のサイレージ添加剤組成物。
  9. 飼料をサイロ貯蔵するための方法であって、
    サイレージ環境中に含有される飼料に、微生物接種材料と任意で担体とを含むサイレージ添加剤組成物を接種する工程を含み、
    前記微生物接種材料が、細菌の1つもしくは複数の株および/またはその増殖副生成物を含み、
    前記細菌の1つまたは複数の株のうちの少なくとも1つが、乳酸を産生することができ、
    前記微生物接種材料が、前記サイレージ環境において嫌気的に増殖し、前記飼料を発酵させてサイレージを産生する、
    方法。
  10. 前記飼料が、草、トウモロコシ、モロコシ、穀類、カラスムギ、および/またはアルファルファ植物の刈り取り物を含む、請求項9記載の方法。
  11. 前記サイレージ環境が、気密サイレージ袋、防水シート、サイロ、またはタンクである、請求項9記載の方法。
  12. 前記組成物が、前記飼料に直接適用され、任意で前記飼料と混合され、嫌気性環境を生成するために前記サイレージ環境が密閉されている、請求項9記載の方法。
  13. 前記微生物接種材料が、約24時間～12週間の範囲の期間にわたって前記飼料を発酵させる、請求項9記載の方法。
  14. 乳酸を産生することができる前記細菌の株が、バチルス・コアグランスである、請求項9記載の方法。
  15. 前記微生物接種材料が、バチルス・アミロリケファシエンス「B.amy」およびその増殖副生成物を含む、請求項9記載の方法。
  16. 前記微生物接種材料が、バチルス・スブチリス「B4」およびその増殖副生成物を含む、請求項9記載の方法。
  17. 前記増殖副生成物が、有機酸、生物系界面活性剤、および/または酵素である、請求項9記載の方法。
  18. 乾燥剤、塩、染料、香味料、緩衝剤、栄養素、デンプン、炭水化物、水、ならびに追加の微生物培養物および/または発酵副生成物
    のうちの1つまたは複数から選択される追加の成分をさらに含む、請求項9記載の方法。
  19. ウィッカーハモマイセス・アノマルス、スターメレラ・ボンビコーラ、サッカロミセス・クロロラフィス、サッカロミセス・セレビシエ、プレウロタス・オストレアタス、デバリオミセス・ハンゼニイ、およびメイエロザイマ・ギリエルモンディから選択される1つまたは複数の追加の有益な微生物の発酵生成物をさらに含む、請求項9記載の方法。
  20. 前記発酵生成物が、精製されたまたは未精製の形態の、前記有益な微生物の増殖副生成物、発酵培地、細胞、および/または発酵からの残留栄養素を含む、請求項19記載の方法。
  21. 前記組成物が珪藻土をさらに含む、請求項9記載の方法。
  22. 請求項1～8のいずれか一項記載のサイレージ添加剤組成物が貯蔵された穀物に適用される、貯蔵された穀物の有害生物を防除するための方法。
  23. 前記貯蔵された穀物が、小麦粉、マイダ、スジ、豆、綿実、トウモロコシ、米、大麦、アマランス、ソバ、ブルグア麦、ファッロ、亜麻、カムート、雑穀、キノア、ライ麦、スペルト小麦、テフ、および/またはライ小麦である、請求項22記載の方法。
  24. 前記貯蔵された穀物の有害生物が、シンクイムシ、ゾウムシ、蛾、および/または甲虫である、請求項22記載の方法。
  25. 家畜動物に給餌する方法であって、
    請求項9～21のいずれか一項記載の方法を使用してサイレージを生産する工程と、
    前記動物が前記サイレージを摂取し得るように、前記サイレージを前記家畜動物に利用可能にする工程と
    を含む、方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2021255849A1 (en) * 2020-04-14 2022-11-17 Locus Ip Company, Llc Bacillus strain for applications in agriculture, livestock health and environmental protection
CN114601041A (zh) * 2022-03-22 2022-06-10 山东再生营养生物科技有限公司 一种改善牦牛肉质的青稞酒糟发酵饲料及其制备方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010017568A1 (de) * 2008-07-21 2010-02-18 Erber Aktiengesellschaft Verfahren zur behandlung von futtersilage für wiederkäuer sowie futtersilagezusatz
IN2014DN10639A (ja) * 2012-06-12 2015-09-11 Pioneer Hi Bred Int
WO2016022779A1 (en) * 2014-08-06 2016-02-11 Envera, Llc Bacterial spore compositions for industrial uses
LT3185696T (lt) * 2014-08-28 2020-01-27 Chr. Hansen A/S Patobulinta hetero ir homofermentacinės pieno rūgšties bakterinių rūšių kompozicija, dvejopos paskirties siloso konservavimui
CA3004522C (en) * 2015-11-09 2023-09-26 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive composition
JP6807160B2 (ja) * 2016-03-15 2021-01-06 雪印種苗株式会社 サイレージ調製用乳酸菌及びサイレージ調製用添加剤
KR101845710B1 (ko) * 2016-06-14 2018-04-06 대한민국 바실러스 코아굴란스 kcc-29 및 이를 포함하는 조성물
BR112020013227A2 (pt) * 2017-12-28 2020-12-01 Sustainable Community Development, Llc. composição de base microbiana e método de uso.
AU2019212338A1 (en) * 2018-01-24 2020-08-13 Omnigen Research, Llc Bacillus combination for administration to animals

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