CN116322356A - 新型青贮饲料添加剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于生产青贮饲料添加剂组合物的组合物和方法，该组合物用于生产青贮饲料和防治感染青贮饲料和储存谷物的害虫。青贮饲料添加剂组合物包含微生物接种剂和硅藻土，其中微生物接种剂包含一种或多种细菌菌株，其中一种或多种细菌菌株中的至少一种能够产生乳酸。

Description

新型青贮饲料添加剂组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月26日提交的美国临时专利申请第63/056,663号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
青贮饲料是一种由为全年喂养牛、羊和其他家畜动物而保存的绿色叶面作物制成的饲料。必须保护青贮饲料免受节肢类有害物(诸如例如蚜虫、玉米穗虫、根虫、切根虫、蝗虫、螨虫、蛞蝓和线虫)以及微生物类有害物的侵染。
“青贮”过程是一种潮湿饲料保存方法，并且在全世界都有采用。将切割好的植物置于青贮窖或坑洞中，压缩以尽可能去除氧气，并使用例如盖子、防水布或塑料薄片覆盖。备选地，可以将大捆的植物紧紧地包裹在塑料薄膜中，该塑料薄膜将植物向内压缩。
在压缩和密封植物后，青贮包括自然发酵，其中乳酸菌(LAB)在厌氧条件下将植物中的水溶性碳水化合物转化为有机酸。这导致了pH值的降低，从而抑制了微生物类有害物，使得湿饲料得以保存。
更具体，青贮过程的特点可以是四个不同的阶段。首先，在密封时，氧气仍然存在于植物物质颗粒之间，并且pH值仅为微酸性，例如约6.0至6.5。这些条件实现了植物持续呼吸、蛋白酶活性和好氧和兼性好氧微生物的活性。第二阶段包括发酵，其在青贮饲料变为厌氧之后开始并持续几天至几周。LAB生长并成为主要的微生物群体，从而产生乳酸和其他有机酸，将pH值降低至例如约3.8至5.0。
第三阶段是稳定的，只要防止空气进入青贮饲料环境，饲料的特性几乎不发生变化。最后阶段是输出饲料，此时青贮饲料最终卸载并暴露于空气。这导致了好氧微生物(主要是酵母、霉菌和某些细菌)的复活，这会引起腐坏。
好氧不稳定性是青贮饲料生产中的主要问题。即使是在打开储存单元以输出饲料之前，青贮饲料也会由于例如包装或密封不好而暴露于氧气。在这些类型的好氧条件下，酵母和霉菌的快速生长引起青贮饲料发热和腐坏，降低了其营养价值。即使在已经经历了传统上被认为是理想发酵阶段的接种青贮饲料中，好氧不稳定性也会是一个问题，这意味着pH值的快速下降和较低的最终pH值。在这些条件下，导致腐坏的酵母例如耐受酸性条件和/或能够代谢发酵期间LAB产生的乳酸。
尽管小心对青贮饲料进行有效包装以及小心取出青贮饲料用于动物饲料可以有助于将青贮饲料环境的通气降到最低，但是通常需要额外的方法来防止腐坏。一些方法利用了化学和/或生物添加剂。例如，这些化学和/或生物添加剂包括：发酵刺激剂，诸如糖蜜、蔗糖、葡萄糖、柑桔浆、菠萝浆和甜菜浆；酶，诸如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶；以及接种剂，诸如乳酸菌(LAB)。添加剂还包括：发酵抑制剂，例如酸和有机酸(诸如盐酸、甲酸、乙酸、乳酸、丙烯酸、甲酸钙、丙酸和丙酸盐)；以及化学品，诸如甲醛、亚硝酸钠和焦亚硫酸钠。
许多基于化学品的添加剂(诸如甲酸、甲醛、丙酸和氨)处理起来会不安全，并且会腐蚀设备。因此，许多种植者更喜欢使用生物添加剂。尤其是，细菌接种剂比化学添加剂更有优势，因为它们很安全、易于使用、对农业机械无腐蚀性、不污染环境并被视为天然产品。
含有“同型发酵”LAB的青贮饲料接种剂在世界许多地方通常用作生物添加剂。例如，同型发酵LAB包括乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、片球菌属和气球菌属的某些成员。它们的功能是通过作物水溶性碳水化合物的发酵产生乳酸和pH值的快速降低。接种剂也可以作为饲料的一部分来减少好氧腐坏和改善动物性能。
“异型发酵”LAB(例如包括某些明串珠菌属、丙酸杆菌属和乳杆菌属物种)的用途近来也得到了青睐。异型发酵菌具有将葡萄糖发酵成多种不同副产物的能力。这些副产物包括例如乳酸、乙醇和二氧化碳。异型发酵菌也可以在存在氧气的情况下将乳酸转化为乙酸和/或丙酸，并且产生的乙酸盐可以抑制其他有害生物体，诸如梭菌和真菌。然而，使用异型发酵LAB的一个不利方面是会损失大量的干物质，这些干物质被消耗并转化为二氧化碳气体。
尽管细菌青贮饲料接种剂是谷物和青贮饲料储存的一个重要方面，但是它们的使用会受到生产、运输、管理、定价和功效方面的困难的极大限制。例如，许多微生物难以生长并随后以足够有用的量运用到例如青贮饲料储存罐中。由于分配之前的加工、配制、储存和稳定化而导致的活力和/或活性损失加剧了该问题。此外，一旦应用，生物产品可能由于许多原因而不能茁壮成长，这些原因包括例如初始细胞密度不足、不能与特定位置处的现有微生物区系有效竞争以及被引入到青贮饲料和/或微生物无法繁荣生长或甚至存活的其他环境条件中。
青贮过程是一个复杂的过程，并且涉及许多不同的化学和微生物过程的相互作用。因此，需要用于维持好氧稳定性和防止青贮饲料腐坏的改进组合物和方法。
发明内容
本发明提供了用于青贮饲料生产和谷物保存的微生物基产品。具体地，本发明提供了用于生产青贮饲料和防治侵染青贮饲料和储存的谷物的有害物的青贮饲料添加剂。有利地是，本发明的微生物基产品和方法是环保、无毒和经济的。
在优选实施方案中，本发明提供了包括一种或多种微生物接种剂的青贮饲料添加剂组合物。有利地是，在某些实施方案中，使用本发明的微生物接种剂通过发酵生产和保存青贮饲料可以防止青贮饲料腐坏、防治有害物和/或提高青贮饲料作为家畜饲料产品的营养益处。
在一个实施方案中，如本文所述的微生物接种剂可以包括一种或多种细菌培养物，该细菌培养物包括菌株及其生长副产物(诸如例如有机酸、生物表面活性剂和/或酶)。优选地，微生物接种剂在将施加该组合物的每克饲料中提供了至少200亿、至少300亿或至少400亿CFU的微生物。
在一些实施方案中，微生物接种剂可以包括从该微生物接种剂的培养中剩余的营养物和/或基质。微生物可以是活的或无活性的，但是在优选实施方案中，它们是活的。接种剂可以是例如新鲜的活培养物、再水化的冻干细菌细胞或孢子或者解冻的冷冻细菌制剂的形式。
在优选实施方案中，至少一个细菌种类是一种乳酸细菌(LAB)，例如乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、片球菌属、气球菌属或其他LAB。
在某些具体实施方案中，LAB是传统上不归类为LAB、但产生乳酸作为初级或次级代谢物的细菌。例如，在某些实施方案中，LAB是芽孢杆菌属的菌株，诸如凝结芽孢杆菌。
在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌能够产生乳酸和其他有机酸。另外，在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌比其他种类的LAB更耐热(例如，能够在50℃至52℃下生长)，这可以增加青贮过程在较热气候中和/或在密封青贮饲料环境中漏气的情况下的有效性。
在一些实施方案中，细菌种类或菌株能够产生其他有益的生长副产物，诸如有助于青贮饲料保存和/或有害物防治的其他有机酸、生物表面活性剂和/或酶。在某些具体实施方案中，采用了解淀粉芽孢杆菌菌株，例如解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-67928(“B.amy”)。在某些具体实施方案中，采用了枯草芽孢杆菌菌株，例如枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-68031(“B4”)。在一些实施方案中，可以同时采用B.amy和B4。
在一些实施方案中，B.amy能够产生抗真菌、抗病毒和抗细菌的脂肽生物表面活性剂、有机酸(诸如丙酸和乙酸)以及酶(诸如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶)。
在一些实施方案中，B4能够比参照枯草芽孢杆菌菌株产生更多的抗菌脂肽表面活性素。因此，在一些实施方案中，B4是表面活性剂“超产菌种”。
在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌和B.amy和/或B4的组合实现了增强的青贮饲料发酵和青贮饲料或谷物储存环境中微生物类有害物的直接防治。
在一个实施方案中，该组合物包括凝结芽孢杆菌和B.amy，其中按重量计或体积计，凝结芽孢杆菌占该组合物的微生物接种剂部分的1％至99％，而B.amy占99％至1％。
在一个实施方案中，该组合物包括凝结芽孢杆菌和B4，其中按重量计或体积计，凝结芽孢杆菌占该组合物的微生物接种剂部分的1％至99％，而B4占99％至1％。
在一个实施方案中，所述组合物包括凝结芽孢杆菌与B4和B.amy，其中按重量计或体积计，凝结芽孢杆菌占该组合物的微生物接种剂部分的1％至99％，而B.amy与B4的组合占99％至1％。
该组合物中微生物和其他成分的种类和比例可根据例如待处理的饲料或谷物的类型、湿度/水分水平和其他环境因素来确定。因此，该组合物可以针对任何给定的饲料作物来定制。
在某些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括其他的组分，例如载体、干燥剂、盐、染料、香料、缓冲剂、营养物、淀粉、碳水化合物、水和/或其他微生物培养物和/或发酵副产物。
在某些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括硅藻土，该硅藻土可以用作例如具有外骨骼的青贮饲料和谷物有害物的有害物防治剂。有利地是，硅藻土也可以用作吸水物质或干燥剂，用于减少青贮饲料环境或谷物储存单元内的冷凝物形成，从而产生不利于霉菌和真菌生长的环境。
在一些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括一种或多种其他微生物(包括例如有益酵母、真菌和/或其他细菌)的发酵产物。例如，这些微生物可以包括异常威克汉姆酵母、球拟假丝酵母、绿针酵母、酿酒酵母、糙皮侧耳、汉斯德巴氏酵母和/或季也蒙毕赤酵母。例如，发酵产物可以包括有益微生物的纯化或天然形式的生长副产物、发酵培养基、细胞和/或发酵残留的营养物。在一个示例性实施方案中，该组合物包括由有益微生物产生的天然或纯化形式的生物表面活性剂，诸如槐糖脂。
在优选实施方案中，提供了用于青贮饲料的方法，其中该方法包括用根据本发明的青贮饲料添加剂组合物接种饲料，并且其中该组合物的微生物接种剂厌氧生长，从而发酵该饲料并制成青贮饲料。饲料可以包括例如草、玉米、高粱、谷类、燕麦和/或苜蓿的切碎料。
用本发明的组合物进行接种可以包括将组合物施用到饲料中以及任选地将该组合物与饲料进行混合。优选地，饲料装在合适的“青贮饲料环境”(指的是例如气密的青贮饲料袋、防水布、筒仓或储罐)中，该青贮饲料环境可以在接种后密封，同时任选地进行混合，使得可以进行厌氧发酵。
在某些实施方案中，将青贮饲料添加剂组合物以干燥形式直接施加到饲料中，之后将液体和/或营养培养基源施加到混合物中，以产生有利于发酵的环境。在某些其他实施方案中，当饲料具有足够的水分含量(例如，按重量计，45％至90％的水分含量)时，青贮饲料添加剂组合物可以以干燥形式施加，而不添加液体。在其他实施方案中，青贮饲料添加剂在施用到饲料中之前与水或营养培养基预混合。
在一些实施方案中，饲料发酵持续例如约24小时至12周或约10天至3周的时间。该方法可以包括对青贮饲料进行取样以例如在整个发酵期间监测pH值和/或检查青贮饲料的潜在污染。然而，取样时应当小心，以避免将空气引入青贮饲料环境中。
在一些实施方案中，本发明提供了防治储存的谷物有害物(诸如例如谷物螟虫、象鼻虫、蛾和甲虫)的方法，其中将本发明的青贮饲料添加剂组合物施用到储存的谷物中。例如，谷物可以包括面粉、精白面粉(maida)、苏吉(suji)、豆类、棉籽、玉米、稻米、大麦、苋菜、荞麦、碎小麦、法老小麦、亚麻、卡姆小麦、小米、藜麦、黑麦、斯佩耳特小麦、画眉草和黑小麦。
在某些实施方案中，青贮饲料添加剂组合物的施加提供一种或多种以下益处：提高青贮饲料发酵的速率；防治会引起青贮饲料和/或储存谷物腐坏的霉菌、真菌和细菌；防治以青贮饲料和/或储存谷物为食和/或感染青贮饲料和/或储存谷物的节肢类有害物；以及增强青贮饲料和/或储存谷物作为家畜饲料来源的营养益处。
在一些实施方案中，本发明提供了饲养家畜动物的方法，其中将根据本发明的实施方案制成的青贮饲料提供给家畜动物，使得动物可以摄取该青贮饲料。有利地是，饲料来源可以为家畜动物提供健康益处，包括例如提高生长速率(例如，平均日增重)、提高饲料-肌肉转化、提高乳汁的质量和产量、增加寿命、改善免疫健康、改善肠道菌群、减少消化病原体以及减少肠道甲烷的产生。
具体实施方式
本发明提供了用于青贮饲料生产和谷物保存的微生物基产品。具体地，本发明提供了用于生产青贮饲料和/或防治侵染青贮饲料和储存的谷物的有害物的青贮饲料添加剂。有利地是，本发明的微生物基产品和方法是环保、无毒和经济的。
选择的定义
如本文所用，“生物膜”是微生物的复杂聚集体，其中细胞彼此粘附和/或粘附到表面。在一些实施方案中，细胞分泌围绕整个聚集体的多糖屏障。生物膜中的细胞在生理学上不同于相同生物体的浮游细胞，这些浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或游动的单细胞。
如本文所用，术语“防治”在涉及有害物时是指杀死有害物、使有害物丧失能力、使有害物停止活动或减少有害物的种群数量或者以其他方式使有害物基本上不能繁殖和/或造成伤害。
如本文所用，“分离的”或“纯化的”化合物基本上不含与其天然相关的其他化合物(诸如细胞物质)。在微生物菌株的上下文中，“分离的”是指将菌株从其天然存在或其产生的环境中取出。分离的菌株可以作为例如生物学上纯净的培养物或者孢子或其他形式的繁殖体而存在。
如本文所用，“生物学上纯净的培养物”是从与其天然相关或在其中产生的材料中分离的培养物。在一个优选实施方案中，培养物已经从所有其他活细胞中分离出来。在进一步的优选实施方案中，与和其他材料结合存在的相同微生物的培养物相比，生物学上纯净的培养物具有有利的特征。例如，有利的特征可以是，提高了一种或多种生长副产物的产量。
在某些实施方案中，按重量计，纯化的化合物至少是60％的受关注化合物。优选地，按重量计，制剂至少是75％(更优选地至少90％，最优选地至少99％)的受关注化合物。例如，按重量计，纯化的化合物优选为所需化合物的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。通过任何合适的标准方法(例如，柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析)测量纯度。
如本文所用，“饲料”是指为农业目的(诸如饲喂家畜动物)切割的植物材料。例如，饲料植物包括草类(诸如剪股颖、须芒草、燕麦草、飓风草、苏里南草、湿生臂形草、雀麦草、纤毛狼尾草、无芒虎尾草、狗牙根、野茅、羚羊草、本格马草、羊茅、黑茅、沼泽草、红苞茅、李氏禾、黑麦草、几内亚草、糖蜜草、两耳草、毛花雀稗、虉草、早熟禾、狗尾草和偃麦草)；豆类(诸如平托花生、豌豆、百脉根、草木樨、爪哇大豆、三叶草、野豌豆、豇豆、无脉相思树、合欢树、白合欢、阔荚合欢、象耳豆和银合欢)；以及其他饲料植物(诸如苜蓿、玉米、高粱、燕麦和/或大豆秸秆)。
“代谢物”是指由代谢产生的任何物质(例如，生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物的实例包括但不限于生物表面活性剂、生物聚合物、酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和氨基酸。
如本文所用，“有害物”是除人以外的任何生物体，其对人或人所关注的事情(例如，青贮饲料生产和/或谷物储存)是破坏性的、有毒的和/或有害的。在一些但不是所有的情况下，有害物可以是致病生物体。有害物可以引起感染、侵染和/或疾病或者是感染、侵染和/或疾病的媒介，或者它们可以简单地以切碎的植物物质和/或活组织为食或者对切碎的植物物质和/或活组织造成其他物理伤害。有害物可以是单细胞或多细胞生物体，包括但不限于病毒、真菌、细菌、霉菌、原生动物、寄生虫、节肢动物和/或线虫。
如本文所用，“预防”状况或事件或状况或事件的“预防”是指延迟、抑制、压制、阻止和/或最大程度地降低状况或事件的发生、广泛性或发展。预防可以包括但不要求无限期、绝对或完全预防，这意味着状况或事件仍可能在以后发展。预防可以包括减少这种状况或事件发生的广泛性或严重性和/或抑制状况或事件发展到更广泛或更严重的程度。
本文提供的范围应理解为该范围内的所有值的简写。例如，1至20的范围应理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的任何数字、数字组合或子范围以及所有介于上述整数之间的小数值(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9)。至于子范围，特别考虑了从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至50的嵌套子范围可以在一个方向上包括1至10、1至20、1至30和1至40或者在另一方向上包括50至40、50至30、50至20和50至10。
如本文所用，“减少”是指负变化，而术语“增加”是指正变化，每种变化至少为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所用，“表面活性剂”是指降低相间表面张力(或界面张力)的表面活性化合物。表面活性剂用作例如洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。“生物表面活性剂”是一种由活细胞和/或采用天然来源的基质产生的表面活性和/或两亲性分子。
过渡术语“包括”与“包含”或“含有”同义，是包含性的或开放式的，并且不排除其他未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤以及“那些实质上不影响本要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”。术语“包括”的使用考虑了“由”或“基本上由”列举的组分组成的其他实施方案。
除非特别说明或从上下文显而易见，否则本文所用的术语“或者”应理解为包含性的。除非特别说明或从上下文显而易见，否则本文所用的术语“一个”和“该”应理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文显而易见，本文所用的术语“大约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。大约可理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
本文中变量的任何定义中的化学基团列表的描述包括作为任何单个基团或所列基团的组合的变量的定义。本文中变量或方面的实施方案的描述包括作为任何单个实施方案或与任何其他实施方案或其部分组合的实施方案。
本文引用的所有参考文献的全部内容都通过引用并入本文。
青贮饲料添加剂组合物
在优选实施方案中，本发明提供了包括一种或多种微生物接种剂的青贮饲料添加剂组合物。有利地是，在某些实施方案中，使用本发明的组合物发酵饲料可以防止青贮饲料的腐坏、防治有害物和/或增强青贮饲料作为家畜饲料产品的营养益处。
如本文所用，“微生物接种剂”是包括由于微生物或其他细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。因此，微生物接种剂可以包括微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可以是营养状态、孢子或分生孢子形式、菌丝形式、任何其他繁殖体形式或者这些形式的混合。微生物可以是浮游的或生物膜形式或者两者的混合。例如，生长副产物可以是代谢物、细胞膜成分、表达的蛋白质和/或其他细胞成分。微生物可以是完整的或裂解的。在优选实施方案中，微生物以例如每克或每毫升组合物至少1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012或1x1013或者更高CFU的浓度与它们在其中生长的生长培养基一起存在于微生物接种剂中。
在一个实施方案中，如本文所述的微生物接种剂可以包括一种或多种细菌培养物，该细菌培养物包括菌株及其生长副产物(诸如例如有机酸、生物表面活性剂和/或酶)。
在一些实施方案中，微生物接种剂可以包括发酵剩余的营养物和基质。微生物可以是活的或无活性的，但是在优选实施方案中，它们是活的。细菌培养物可以是例如新鲜的活培养物、再水化的冻干细菌细胞或孢子或者解冻的冷冻细菌制剂的形式。
例如，根据本发明有用的微生物可以是细菌、酵母和/或真菌的非植物致病菌株。这些微生物可以是天然的或转基因微生物。例如，可以用特定基因转化微生物以表现出特定的特征。微生物也可以是所需菌株的突变体。如本文所用，“突变体”是指参照微生物的菌株、遗传变体或亚型，其中与参照微生物相比，突变体具有一种或多种遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、复制、移码突变或重复扩增)。制备突变体的方法是微生物学领域公知的。例如，为此目的广泛采用了UV诱变和亚硝基胍。
在某些实施方案中，微生物是LAB。LAB是革兰氏阳性的且不形成孢子的球菌、球杆菌或杆菌。它们通常是非呼吸性的且缺乏过氧化氢酶。它们主要将葡萄糖发酵成乳酸和/或乳酸、CO2和乙醇。所有LAB都是厌氧生长的，但有些LAB可以在O2存在的情况下作为“耐氧厌氧菌”生长。
尽管许多菌属产生乳酸作为发酵的初级或次级终产物，但是术语乳酸菌通常保留给乳杆菌目的属，包括乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、乳球菌属、链球菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、丙酸杆菌属、气球菌属、酒球菌属、四联球菌属、游球菌属和魏斯氏菌属。
在某些具体实施方案中，本发明组合物的LAB是传统上不归类为LAB、但产生乳酸作为初级或次级代谢物的细菌。例如，在某些实施方案中，LAB是芽孢杆菌属的菌株，诸如凝结芽孢杆菌。
在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌能够产生乳酸和其他有机酸。另外，在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌比LAB的其他物种更耐热(例如，能够在50℃至52℃下生长)，这可以增加青贮过程在较热气候中和/或在密封青贮饲料环境中漏气的情况下的有效性。
在一些实施方案中，细菌种类或菌株能够产生其他有益的生长副产物，诸如有助于青贮饲料生产和/或有害物防治的其他有机酸、生物表面活性剂和/或酶。
在某些其他具体实施方案中，采用了解淀粉芽孢杆菌菌株，例如解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-67928(“B.amy”)。
在某些具体实施方案中，采用了枯草芽孢杆菌菌株，例如枯草芽孢杆菌菌株NRRLB-68031(“B4”)。
解淀粉芽孢杆菌“B.amy”微生物和枯草芽孢杆菌“B4”微生物的培养物已经保藏于美国农业部北方地区研究实验室(NRRL)(1400Independence Ave.,S.W.,Washington,DC,20250,USA)。B.amy保藏物已由保藏机构指定为登录号NRRL B-67928，保藏日期为2020年2月26日。B4保藏物已由保藏机构指定为登记号NRRL B-68031，保藏日期为2021年5月6日。
本发明的每种培养物都在一定条件下保藏，这些条件确保在本专利申请未决期间，待授权的专利和商标专员确定的人可以根据37CFR 1.14和35U.S.C122获得培养物。每种保藏物都可以根据外国专利法的要求在提交本申请的对应物或其后代的国家中获得。然而，应当理解的是，保藏物的可用性不构成在减损政府行为授予的专利权的情况下实践本发明的许可。
此外，将根据《布达佩斯微生物保藏条约》的规定，本发明的培养物保藏物将被储存并向公众开放。即，在最近一次要求提供保藏物样本之后的至少五年的时间内以及任何情况下在保藏日期之后至少30(三十)年的时间内或者在可能发布的公布培养物的任何专利的可实施期限内，应极其小心地储存这些培养物保藏物，以保持它们存活且未受污染。如果保藏机构因保藏物的状况而无法按要求提供样本，则保藏机构应承认有责任更换保藏物。一旦公开本发明的专利授权，对公众获得本发明的培养物保藏物的所有限制就将被不可撤回地解除。
在一些实施方案中，B.amy能够在高盐、高热和高压的条件(诸如通常用于制备压缩盐组合物的那些条件)下存活。例如，在一些实施方案中，B.amy孢子可表现出至少55℃至100℃或至少80℃至125℃的耐温性、至少200MPa至300MPa或至少250MPa至350MPa的耐压性以及例如1-15％或更高(例如,至少5％、10％、12％、15％或更高)浓度的耐盐性。在一些情况下，B.amy也是一种固氮微生物。
此外，B.amy产生独特的代谢物混合物，包括抗真菌、抗病毒和抗细菌的脂肽生物表面活性剂、有机酸(诸如丙酸和乙酸)以及酶(诸如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶)。例如，在一些实施方案中，B.amy可以产生表面活性素、丰原素、伊枯草菌素和地衣素生物表面活性剂的混合物。在一些实施方案中，B.amy可以比解淀粉芽孢杆菌的其他参照菌株产生更多的脂肽。
在某些实施方案中，该组合物可以包括枯草芽孢杆菌B4。菌株B4能够产生更多的脂肽生物表面活性剂，尤其是表面活性素。有利地是，在一些实施方案中，B4和/或其产生的更多的表面活性素可以尤其有助于增强对家畜消化道中的产甲烷生物膜的破坏。
在一些实施方案中，B4是“表面活性剂超产菌种”。例如，与其他枯草芽孢杆菌相比，该菌株可以产生至少0.1-10g/L(例如，0.5-1g/L)生物表面活性剂，或者例如至少10％、25％、50％、100％、2倍、5倍、7.5倍、10倍、12倍、15倍或更多。例如，在一些实施方案中，ATCC39307可以用作参照菌株。
因此，凝结芽孢杆菌与B.amy和/或B4的组合可促进青贮饲料或谷物储存环境中发酵速率的提高和对微生物类有害物的直接防治。
在一个实施方案中，该组合物包括约1x103至1x1012、1x104至1x1011、1x105至1x1010或者1x106至1x109CFU/ml的凝结芽孢杆菌。
在一个实施方案中，该组合物包括约1x103至1x1012、1x104至1x1011、1x105至1x1010或者1x106至1x109CFU/ml的B.amy。
在一个实施方案中，该组合物包括约1x103至1x1012、1x104至1x1011、1x105至1x1010或者1x106至1x109CFU/ml的B4。
在一个实施方案中，该组合物包括约1x103至1x1012、1x104至1x1011、1x105至1x1010或者1x106至1x109CFU/ml的另一种微生物，诸如LAB。
在一个实施方案中，该组合物可以包括一种微生物接种剂，按该接种剂的重量或体积计，该微生物接种剂包括1％至99％的凝结芽孢杆菌以及99％至1％的B.amy。在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌与B.amy的细胞计数比率为约1:9至约9:1、约1:8至约8:1、约1:7至约7:1、约1:6至约6:1、约1:5至约5:1或者约1:4至约4:1。
在一个实施方案中，该组合物可以包括一种微生物接种剂，按该接种剂的重量或体积计，该微生物接种剂包括1％至99％的凝结芽孢杆菌以及99％至1％的B4。在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌与B4的细胞计数比率为约1:9至约9:1、约1:8至约8:1、约1:7至约7:1、约1:6至约6:1、约1:5至约5:1或者约1:4至约4:1。
在一个实施方案中，该组合物可以包括一种微生物接种剂，按该接种剂的重量或体积计，该微生物接种剂包括1％至99％的凝结芽孢杆菌以及99％至1％的B4和B.amy。在一些实施方案中，凝结芽孢杆菌与B4和B.amy(组合总量)的细胞计数比率为约1:9至约9:1、约1:8至约8:1、约1:7至约7:1、约1:6至约6:1、约1:5至约5:1或约1:4至约4:1。
该组合物中微生物和其他成分的种类和比例可根据例如待处理的青贮饲料或谷物的类型、湿度/水分水平和其他环境因素来确定。因此，该组合物可以针对任何给定的饲料作物来定制。
在某些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括其他的组分，例如载体、干燥剂、盐、染料、香料、缓冲剂、营养物、淀粉、碳水化合物、水和/或其他微生物培养物和/或发酵副产物。
在某些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括硅藻土，该硅藻土可以用作例如青贮饲料有害物(包括软体幼虫以及具有外骨骼的有害物)的有害物防治剂。硅藻土包括一种被称为硅藻(例如，Melosira和Monolitica)的硬壳蛋白质的石化硅质残余物。在显微镜下，这些颗粒非常尖锐，并且会粘到昆虫身上，从而卡在昆虫的外骨骼关节之间。当昆虫移动时，其身体会被这些尖锐的颗粒割破。此外，这些磨蚀颗粒会刮除昆虫的蜡状外骨骼层，这会使内部水分从昆虫体内逸出。此外，除了被其磨蚀边缘切割之外，软体有害物还会因硅藻土脱水。
例如，有害物可以是蟑螂、螨虫、甲虫、螟虫、象鼻虫、白蚁、蚂蚁、蝗虫、蚜虫、蛞蝓、蜗牛、软体幼虫、线虫和/或可以以青贮饲料或储存谷物为食的其他蠕虫型或节肢类有害物。
有利地是，硅藻土也可以用作吸水物质或干燥剂，用于减少筒仓或谷物储存容器内的冷凝物形成，从而使得环境不利于霉菌和真菌的生长。
在优选实施方案中，硅藻土是粉末形式，其具有1微米至1毫米(优选为10微米至200微米)的粒度。在一些实施方案中，也可以采用浮石粉。
在某些实施方案中，按重量计，该组合物包括0.01％至75％、0.1％至50％、0.5％至25％或1.0％至15％的硅藻土。
在一些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括一种或多种其他微生物(包括例如有益酵母、真菌和/或其他细菌)的发酵产物。发酵产物可以含有活的和/或无活性的培养物、纯化的或天然形式的生长副产物(诸如生物表面活性剂、酶和/或其他代谢物)和/或任何残留的营养物。例如，按重量计，该组合物中生物质的量可以为约0.01％至100％、约1％至90％、约5％至约80％或者约10％至约75％中的任何值。
可以直接使用发酵产物，提取或纯化可选。如果需要，采用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术可以很容易地实现提取和纯化。
在某些实施方案中，发酵产物是一种或多种其他芽孢杆菌属(诸如例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粘液芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌)的产物。
在某些实施方案中，发酵产物是一种或多种酵母和/或真菌(例如，短梗霉属(例如，出芽短梗霉)、布拉霉属、假丝酵母菌属(例如，蜂生假丝酵母菌、熊蜂生假丝酵母菌和诺达假丝酵母菌)、隐球酵母属、德巴利氏酵母属(例如，汉逊德巴利氏酵母)、虫霉属、有孢汉逊酵母属(例如，葡萄有孢汉逊酵母)、汉逊酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属(例如，法弗克鲁维酵母)、须霉属、毕赤酵母属(例如，异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、西方毕赤酵母和库德里阿兹威氏毕赤酵母)、侧耳属(例如，糙皮侧耳)、拟酵母属(例如，蚜虫拟酵母)、酵母属(例如，布拉迪酵母、酿酒酵母和圆酵母)、斯塔莫酵母属(例如，熊蜂生斯塔莫酵母)、木霉属(例如，里氏木霉、哈茨木霉、钩状木霉和绿色木霉)、黑粉菌属(例如，玉米黑粉菌)、威克汉姆酵母属(例如，异常威克汉姆酵母和NRRL Y-68030菌株)、拟威尔酵母属(例如，姆拉克拟威尔酵母)、结合酵母属(例如，拜耳结合酵母)等)的产物。
在某些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物中采用的微生物具有许多可用于增强青贮过程的有益性质。
在一个实施方案中，这些微生物能够产生生物表面活性剂。作为两亲性分子，微生物表面活性剂降低了液体、固体和气体的分子之间的表面和界面张力。此外，生物表面活性剂是生物可降解的，具有低毒性，并且可以利用可再生资源以低成本制备。生物表面活性剂可以抑制不良的微生物粘附到多种表面上，防止生物膜的形成，并且可以具有强大的乳化和破乳性质。
例如，根据本发明方法的生物表面活性剂可以选自低分子量糖脂(例如，槐糖脂、纤维二糖脂质、鼠李糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如，表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、关节炎素和地衣素)、黄酮脂、磷脂(例如，心磷脂)和高分子量聚合物(诸如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。
该组合物可以包括按重量计0.001％至10％、0.01％至5％、0.05％至2％和/或0.1％至1％浓度的一种或多种生物表面活性剂。
在一个实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物还包括一种或多种酶。这些酶可以以纯净或天然的形式加入，和/或这些酶可以由存在于该青贮饲料添加剂组合物中的一种或多种微生物制备。酶可以增强饲料中糖和其他聚合物的分解，为LAB提供更容易发酵的化合物。酶也可以增强家畜动物对植物材料的消化能力。
示例性的酶包括但不限于植酸酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木质纤维素酶、蛋白酶K等。在具体实施方案中，该组合物包括纤维素酶、蛋白酶、木聚糖酶和/或淀粉酶。
在一些实施方案中，该青贮饲料添加剂组合物包括载体。载体可以包括液体或固体载体。例如，固体载体可以由碳酸钙、淀粉、面包糖、麦芽糖糊精、纤维素及其组合组成。液体载体包括但不限于水、来自微生物培养的发酵液和/或液体营养培养基。
本发明组合物的其他添加剂可以包括例如铝硅酸钠、碳酸氢钠、染料、葡萄糖、再水合缓冲剂、调味剂和/或二氧化硅。
在某些实施方案中，为了改善或稳定该组合物的效果，如果需要，可以将其与合适的佐剂混合，然后原样使用或稀释后使用。在优选实施方案中，该组合物被配制成液体、浓缩液体或者干粉或颗粒，该干粉或颗粒可以与水和其他组分混合以形成液体产品。在某些实施方案中，该组合物被配制为例如液体、粉末、颗粒、微颗粒、丸粒、可湿性粉末、可流动粉末、乳液、微胶囊、油或气溶胶。
有利地是，根据本发明的青贮饲料添加剂组合物是无毒的，并且可以以高浓度施用而不引起例如对人或其他非有害动物的皮肤或消化道的刺激。因此，当在活生物体(诸如种植者和牲畜)存在的情况下施用该组合物时，本发明尤其有用。
用于制备微生物接种剂的微生物的生长
本发明利用了用于培养微生物和制备微生物代谢物和/或其他微生物生长副产物的方法。本发明还利用了适于按所需规模培养微生物和制备微生物代谢产物的培养过程。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(SSF)及其变型、混合和/或组合。
如本文所用，“发酵”是指在受控条件下培养或生长细胞。生长可以是好氧的或厌氧的。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制备生物质(例如，活细胞材料)、细胞外代谢物(例如，小分子和分泌的蛋白质)、残余营养物和/或细胞内组分(例如，酶和其他蛋白质)的材料和方法。
根据本发明采用的微生物生长容器可以是任何工业用发酵罐或培养反应器。在一个实施方案中，容器可具有功能性调节装置/传感器或者可以与功能性调节装置/传感器连接以测量培养过程中的重要因素(诸如pH值、氧气、压力、温度、湿度、微生物密度和/或代谢物浓度)。
在另一个实施方案中，容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，测量细胞数量和生长期)。备选地，可以从容器中取出每日样本，并通过本领域已知的技术(诸如稀释平板涂布技术)进行计数。
在一个实施方案中，该方法包括在培养过程中补充氮源。例如，氮源可以是硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或两种或两种以上组合使用。
该方法可以对生长中的培养物进行充氧。一个实施方案利用空气的慢动作来去除包括含氧量低的空气并引入充氧空气。在深层发酵的情况下，充氧空气可以是通过机构每天补充的环境空气，该机构包括用于机械搅动液体的叶轮以及用于向液体供应气泡以将氧气溶解到液体中的曝气器。
该方法还可以包括在培养过程中补充碳源。碳源通常是碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露醇和/或麦芽糖)、有机酸(诸如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸)、醇(诸如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油)和脂肪和油(诸如大豆油、芥花油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻籽油)等等。这些碳源可以单独使用或两种或两种以上组合使用。
在一个实施方案中，培养基中含有微生物的生长因子和微量营养物。当培育不能产生它们需要的所有维生素的微生物时，这尤其是优选的。培养基中还可以含有无机营养物，包括微量元素(诸如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴)。此外，维生素、必需氨基酸和微量元素的来源可以例如以面粉或粗粉(诸如玉米粉)的形式或提取物(诸如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物和香蕉皮提取物)的形式等或者以纯化的形式包含在内。还可以含有氨基酸，例如那些用于蛋白质生物合成的氨基酸。
在一个实施方案中，还可以含有无机盐。可使用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或两种或两种以上组合使用。
在一些实施方案中，培养方法还可以包括在培养过程之前和/或期间在培养基中加入其他的酸和/或抗菌剂。抗菌剂或抗生素用于保护培养物免受污染。
另外，还可以加入消泡剂以防止在深层培养期间形成和/或积聚泡沫。
混合物的pH值应适合所需的微生物。缓冲剂和pH调节剂(诸如碳酸盐和磷酸盐)可以用于将pH值稳定在优选的值附近。当存在高浓度金属离子时，可能需要在培养基中使用螯合剂。
微生物可以浮游形式或作为生物膜生长。在生物膜的情况下，容器内可以有基质，微生物可以在该基质上以生物膜状态生长。该系统还可以具有例如施加刺激(例如剪切应力)的能力，该刺激可以促进和/或改善生物膜生长特性。
在一个实施方案中，在约5℃至约100℃(优选为15℃至60℃，更优选为25℃至50℃)下实施该用于培养微生物的方法。在另一个实施方案中，可以在恒温下连续进行培养。在另一个实施方案中，培养过程中可以改变温度。
在一个实施方案中，该方法和培养过程中使用的设备是无菌的。培养设备(诸如反应器/容器)可以与灭菌装置(诸如高压灭菌器)分开，但与之相连。培养设备还可以具有在开始接种之前进行原位灭菌的灭菌单元。可以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，环境空气在被引入容器之前可以穿过至少一个过滤器。在其他实施方案中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或者任选地根本不进行加热，其中可以利用低水活度和低pH值来控制不需要的细菌生长。
在一个实施方案中，本发明还提供了一种用于通过在适于生长和代谢物产生的条件下培养本发明的微生物菌株来制备微生物代谢物(诸如例如生物表面活性剂、酶、蛋白质、乙醇、乳酸、β-葡聚糖、肽、代谢中间物、多不饱和脂肪酸和脂质)和任选地纯化代谢物的方法。例如，通过该方法产生的代谢物含量可以至少是20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
由所需的微生物产生的微生物生长副产物可以保留在微生物中或分泌到生长培养基中。培养基可以含有稳定微生物生长副产物活性的化合物。
例如，发酵培养基的生物质含量可以是5g/l至180g/l或更高或者10g/l至150g/l。
例如，细胞浓度可以至少是1x106至1x1012、1x107至1x1011、1x108至1x1010或1x109CFU/ml。
用于培养微生物和制备微生物副产物的方法和设备可以分批、准连续或连续进行。
在一个实施方案中，在培养完成时(例如，在例如达到所需的细胞密度或特定代谢物的密度时)去除所有微生物培养组合物。在这个分批过程中，在收获第一批次时，开始一个全新的批次。
在另一个实施方案中，在任一时间仅去除一部分发酵产物。在该实施方案中，具有活细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或菌丝体的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。被取出的组合物可以是无细胞培养基或者含有细胞、孢子或其他生殖繁殖体和/或其组合。这样，产生了准连续系统。
有利地是，该方法不需要复杂的设备或很高的能量消耗。所需的微生物可以小规模或大规模地就地培养和利用，甚至仍与它们的培养基混合在一起。
然而，无需进一步稳定、保存和储存就可以使用所制备的微生物接种剂。有利地是，这些微生物接种剂的直接使用保持了微生物的高活力，降低了外来试剂和不良的微生物造成污染的可能性，并且保持了微生物生长副产物的活性。
在其他实施方案中，考虑到例如预期用途、预期的应用方法、发酵容器的尺寸和从微生物生长设施到使用位置的任何运输模式，可以将该组合物(微生物、生长培养基或微生物和培养基)置于适当尺寸的容器中。因此，其中放置了该微生物基组合物的容器可以是例如1品脱至1000加仑或更大。在某些实施方案中，容器是1加仑、2加仑、5加仑、25加仑或更大。
微生物基产品的生产
本发明提供了“微生物基产品”，该微生物基产品是将在实践中应用以实现期望结果的产品。该微生物基产品可以仅仅是从微生物培养过程中收获的微生物接种剂。备选地，该微生物基产品可以包括已添加的其他成分。例如，这些附加成分可以包括稳定剂、缓冲剂、合适的载体(诸如水、盐溶液或任何其他合适的载体)、为支持微生物进一步生长而添加的营养物、非营养生长促进剂和/或有助于在其所施用的环境中跟踪微生物和/或组合物的试剂。该微生物基产品还可以包括微生物接种剂的混合物。该微生物基产品还可以包括微生物接种剂的一种或多种组分，已经以某种方式(诸如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等)对该一种或多种组分进行了加工。
本发明的一种微生物基产品仅仅是含有微生物和/或由微生物产生的微生物代谢产物和/或任何残留营养物的发酵培养基。发酵产物可以在不进行提取或纯化的情况下直接使用。如果需要，采用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术可以很容易地实现提取和纯化。
该微生物基产品中的微生物可以是活性或非活性形式，或者是营养细胞、生殖孢子、分生孢子、菌丝体、菌丝或任何其他形式的微生物繁殖体的形式。该微生物基产品还可以含有任何这些形式的微生物的组合。
在一个实施方案中，使不同的微生物菌株单独生长，然后混合在一起以产生该微生物基产品。微生物可以任选地与它们在其中生长的培养基混合，并在混合前干燥。
在一个实施方案中，不同菌株未混合在一起，而是作为单独的微生物基产品施用于植物和/或其环境。
该微生物基产品可以在不进行进一步稳定、保存和储存的情况下使用。有利地是，这些微生物基产品的直接使用保持了微生物的高活力，降低了外来试剂和不良的微生物造成污染的可能性，并且保持了微生物生长副产物的活性。
在从生长容器收获该微生物基组合物时，可以在将收获的产物放置到容器中或以其他方式运输以供使用时添加另外的组分。例如，添加剂可以是缓冲剂、载体、在相同或不同设施中制备的其他微生物基组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、示踪剂、溶剂、抗微生物剂、抗生素、pH调节剂、螯合剂、稳定剂、抗紫外光剂、其他微生物以及常用于此类制剂的其他合适的添加剂。
在一个实施方案中，可以加入缓冲剂，包括有机酸和氨基酸或它们的盐。合适的缓冲剂包括柠檬酸盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳糖二酸盐、葡糖二酸盐、丙醇二酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其混合物。也可以采用磷酸和亚磷酸或它们的盐。合成缓冲剂适合使用，但优选使用天然缓冲剂(诸如上面列出的有机酸和氨基酸或它们的盐)。
在另一个实施方案中，pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸或混合物。
该微生物基组合物的pH值应适合所需的微生物。在一个优选实施方案中，该组合物的pH值为约3.5至7.0、约4.0至6.5或约5.0。
在一个实施方案中，可以将葡萄糖、甘油和/或甘油配制品加入到该微生物基产品中，以在储存和运输期间用作例如渗压剂。在一个实施方案中，可以含有糖蜜。
在一个实施方案中，益生元可以加入到该微生物基产品中和/或与该微生物基产品同时施加，以促进微生物生长。例如，合适的益生元包括海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和/或腐殖酸。
任选地，该产品可以在使用前储存。优选地，储存时间较短。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选实施方案中，如果该产品中存在活细胞，则将该产品储存在较冷的温度(诸如例如低于20℃、15℃、10℃或5℃)下。
微生物基产品的本地生产
在本发明的某些实施方案中，微生物生长设施按所需规模制备新鲜的高密度微生物和/或所需的微生物生长副产物。微生物生长设施可以位于施用地点或其附近。该设施以分批、准连续或连续培养的方式制备高密度的微生物基组合物。
本发明的微生物生长设施可以位于将使用微生物基产品的位置(例如，筒仓)。例如，微生物生长设施可以距离使用位置不到300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。
因为微生物基产品可以在不借助于传统微生物制备的微生物稳定、保存、储存和运输过程的情况下在本地产生，所以可以产生密度高得多的微生物，从而在现场应用中可以用到体积更小的微生物基产品，或者在必要时允许密度高得多的微生物应用，以实现期望的功效。这允许生物反应器按比例缩小(例如，较小的发酵容器和更少的的起始材料、营养物和pH控制剂的供应)，这使得该系统效率很高，并且可以不再需要对细胞进行稳定或将细胞从其培养基分离出来。微生物基产品的本地生产也有助于将生长培养基包含在产品中。培养基可以含有在发酵期间产生的尤其适合本地使用的试剂。
本地制备的高密度健壮微生物培养物在现场比那些在供应链中停留了一段时间的微生物培养物更有效。本发明的微生物基产品与传统产品相比尤其有利，在传统产品中，细胞已经与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离。运输时间的缩短实现了按照本地需求所要求的时间和体积生产和交付新鲜批次的微生物和/或其代谢物。
本发明的微生物生长设施制备新鲜的微生物基组合物，该微生物基组合物包括微生物本身、微生物代谢物和/或微生物在其中生长的培养基的其他组分。如果需要，该组合物可以具有高密度的营养细胞或繁殖体或者营养细胞和繁殖体的混合物。
有利地是，该组合物可以定制用于特定的场所。在一个实施方案中，微生物生长设施位于将使用该微生物基产品的地点(例如，柑橘园)或其附近。
有利地是，这些微生物生长设施提供了一种针对当前依赖于远距离的工业规模生产者的问题的解决方案。由于上游加工延迟、供应链瓶颈、不适当的储存和妨碍了例如活的高细胞计数产品和细胞最初生长于其中的相关培养基和代谢物的及时交付和施用的其他意外事件，这些生产者的产品质量受到影响。
微生物生长设施能够定制微生物基产品，以提高与目的地区的协同作用，从而提供了制造的灵活性。有利地是，在优选实施方案中，本发明的系统利用天然存在的本地微生物及其代谢副产物的力量来改善农业生产。
单个容器的培养时间可以是例如1至7天或更长。培养产物可以以许多不同方式中的任何一种收获。
在例如发酵24小时的时间内进行本地生产和交付可以得到纯净的高细胞密度组合物并显著降低运输成本。考虑到在开发更有效和更强大的微生物接种剂方面的快速发展前景，消费者将从这种快速交付微生物基产品的能力中受益匪浅。
生产青贮饲料的方法
在优选实施方案中，提供了用于青贮饲料的方法，其中该方法包括用根据本发明的青贮饲料添加剂组合物接种饲料，并且其中该组合物的微生物接种剂厌氧生长，从而发酵该饲料并制成青贮饲料。
接种可以包括将组合物施用到饲料中以及任选地将该组合物与饲料进行混合。优选地，饲料装在气密的青贮饲料袋、防水布、筒仓或储罐中，可以在接种后对其进行密封，同时任选地进行混合，使得可以进行厌氧发酵。
为了改善或稳定处理组合物的效果，如果需要，可以将该组合物与合适的佐剂混合，然后原样使用或在稀释后使用。在优选实施方案中，组合物被配制成干粉或颗粒，该干粉或颗粒可以与水和其他组分混合以形成液体产品。
在某些实施方案中，将青贮饲料添加剂组合物以干燥形式直接施加到饲料中，之后将液体和/或营养培养基源施加到混合物中，以产生有利于发酵的环境。在某些其他实施方案中，当饲料具有足够的水分含量(例如，按重量计，45％至90％的水分含量)时，青贮饲料添加剂组合物可以以干燥形式施加，而不添加液体。在其他实施方案中，青贮饲料添加剂在施用到饲料中之前与水或营养培养基预混合。
在某些实施方案中，该方法包括每吨饲料施用至少200亿、至少300亿、至少400亿CFU、至少500亿CFU、至少600亿CFU、至少700亿CFU、至少800亿CFU、至少900亿CFU或至少1000亿CFU的微生物接种剂。在某些具体实施方案中，该方法包括施用约100000CFU/克饲料。
在一些实施方案中，发酵进行的时间段范围为例如24小时至12周、36小时至10周、48小时至8周、56小时至6周或72小时至4周。在一个示例性实施方案中，发酵的时间段为约10天至3周。该方法可以包括对青贮饲料进行取样以例如在整个发酵期间监测pH值和/或检查青贮饲料的潜在污染。
在一些实施方案中，该方法还包括在施用期间施用具有该组合物的材料(例如，促进微生物萌发和/或生长的营养物、萌发促进剂和/或益生元)以促进微生物生长。在一个实施方案中，营养源可以包括例如氮、钾、磷、镁、蛋白质、维生素和/或碳的来源。在一个实施方案中，益生元可以包括例如海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和/或腐殖酸。在一个实施方案中，萌发促进剂包括L-丙氨酸和/或L-缬氨酸。
在一个实施方案中，根据该方法施用青贮饲料添加剂组合物提高了青贮饲料发酵的速率。
在一个实施方案中，根据该方法施用青贮饲料添加剂组合物实现了会引起青贮饲料和/或储存谷物腐坏的霉菌、真菌和细菌的直接防治。
在一个实施方案中，根据该方法施用青贮饲料添加剂组合物实现了节肢动物、蠕虫、蛞蝓、蜗牛、蛴螬以及以青贮饲料和/或储存谷物为食和/或感染青贮饲料和/或储存谷物的其他有害物的直接防治。
在一个实施方案中，根据该方法施用青贮饲料添加剂组合物提高了青贮饲料和/或储存谷物作为家畜饲料来源的营养益处。
在一些实施方案中，本发明提供了防治储存的谷物有害物(诸如例如谷物螟虫、象鼻虫、蛾和甲虫)的方法，其中将本发明的青贮饲料添加剂组合物施用到储存的谷物中。例如，谷物可以包括面粉、精白面粉(maida)、苏吉(suji)、豆类、棉籽、玉米、稻米、大麦、苋菜、荞麦、碎小麦、法老小麦、亚麻、卡姆小麦、小米、藜麦、黑麦、斯佩耳特小麦、画眉草和黑小麦。
在一些实施方案中，本发明提供了饲养家畜动物的方法，其中将根据本发明的实施方案制成的青贮饲料提供给家畜动物，使得动物可以摄取该青贮饲料。有利地是，饲料来源可以为家畜动物提供健康益处，包括例如提高生长速率(例如，平均日增重)、提高饲料-肌肉转化、提高乳汁的质量和产量、增加寿命、改善免疫健康、改善肠道菌群、减少消化病原体以及减少肠道甲烷的产生。
如本文所用，“家畜”动物是“驯养”动物，指的是已经被人影响、繁殖、驯养和/或控制持续数代使得在动物和人之间存在共生关系的物种。尤其是，家畜动物包括在农业或工业环境中饲养以产生商品(诸如食品、纤维和劳动力)的动物。术语家畜中所包括的动物类型可以包括但不限于羊驼、美洲驼、猪、马、骡、驴、骆驼、狗、反刍动物、鸡、火鸡、鸭、鹅、珍珠鸡和雏鸽。
在某些实施方案中，家畜动物是“反刍动物”或者利用适于在消化之前借助于专门的肠道微生物组发酵植物基食物的区室化胃的哺乳动物。例如，反刍动物包括牛、绵羊、山羊、野生山羊、长颈鹿、鹿、麋鹿、驼鹿、北美驯鹿、驯鹿、羚羊、瞪羚、黑斑羚、角马和一些袋鼠。
在具体的示例性实施方案中，家畜动物是牛类动物(牛科牛亚科的反刍动物)。牛类动物可以包括驯养和/或野生的品种。具体的实例包括但不限于水牛、小野牛、民都洛水牛、原牛、爪哇野牛、白肢野牛、大额牛、牦牛、柬埔寨野牛、家养肉和奶牛(例如，黄牛和瘤牛)、公牛、阉牛、瘤牛、武广牛、美洲野牛、北美野牛、欧洲野牛、紫羚、大捻角羚、西非薮羚、南非薮羚、小捻角羚、山薮羚、泽羚和巨羚羊。
实例
从以下通过举例说明的方式给出的实例中，可以更好地理解本发明及其许多优点。以下实例说明了本发明的一些方法、应用、实施方案和变型。它们不应被认为是对本发明的限制。可以对本发明进行许多改变和修改。
实例1——芽孢杆菌属微生物的固态发酵
对于芽孢杆菌属孢子生产，采用麦麸基培养基。将培养基以约1至2英寸的厚度铺在不锈钢盘上并灭菌。
灭菌后，将种子培养物接种在不锈钢盘中。任选地，可以包括添加的营养物以促进微生物生长，包括例如盐和/或碳源，如糖蜜、淀粉、葡萄糖和蔗糖。为了提高生长速度和提高细菌在整个培养基中的运动性和分布，可以向培养物中加入马铃薯提取物或香蕉皮提取物。
然后将所选芽孢杆菌菌株的孢子喷洒或移液管转移到基质表面上，并将盘子在32℃至40℃之间培育。将环境空气泵送通过烘箱以稳定温度。培养48至72小时可以产生1×1010个菌株孢子/克或更多。
实例2——B.AMY和黄色粘球菌共培养以提高脂肽产量
在一个实施方案中，采用B.amy和黄色粘球菌的共培养制备包括脂肽(例如，表面活性素、伊枯草菌素和/或丰原素)的组合物。当一起生长时，物种试图相互抑制，从而产生高浓度的脂肽。
B.amy接种剂在小规模反应器中生长24至48小时。黄色粘球菌接种剂在2L工作体积种子培养瓶中生长48至120小时。将两种接种剂接种于发酵反应器中。该营养培养基包括：
葡萄糖 1g/L至5g/L
酪蛋白胨 1g/L至10g/L
K2HPO4 0.01g/L至1.0g/L
KH2PO4 0.01g/L至1.0g/L
MgSO4.7H2O 0.01g/L至1.0g/L
NaCl 0.01g/L至1.0g/L
CaCO3 0.5g/L至5g/L
Ca(NO3)2 0.01g/L至1.0g/L
酵母提取物 0.01g/L至5g/L
MnCl2.4H2O 0.001g/L至0.5g/L
Teknova微量元素 0.5ml/L至5ml/L
细颗粒固定载体悬浮在营养培养基中。载体包括纤维素(1.0-5.0g/L)和/或玉米粉(1.0-8.0g/L)。
B.amy在液体发酵培养基中产生脂肽。可以照原样使用整个培养物，或者可以加工培养物，并且任选地纯化脂肽。
实例3——B.AMY作为家畜饲料强化剂
由于B.amy能够产生在消化道中保持存活且在一些实施方案中排泄到动物粪便中之后保持存活的孢子，因此其比传统的益生微生物尤其有优势。此外，B.amy产生独特的代谢物混合物，当施用于家畜动物时，该代谢物混合物提供广谱的消化和环境益处。
在某些实施方案中，如下表1所例示，生长副产物可以直接抑制产烷生物，破坏产烷生物的生物膜，和/或降低家畜动物的消化系统中的H2浓度。
表1.用于减少甲烷生成和H2的示例性B.Amy生长副产物
Figure BDA0004039691850000271
在一个实施方案中，如下表2所例示，该组合物包括B.amy和/或其生长副产物，其可以通过执行多种促进健康的功能来增强家畜动物的总体健康和生产力。因此，在一些实施方案中，当施用给动物时，B.amy可以充当益生菌。
表2.用于增强家畜健康的示例性B.amy生长副产物
Figure BDA0004039691850000272
Figure BDA0004039691850000281
Figure BDA0004039691850000291

Claims (25)

1.一种青贮饲料添加剂组合物，包括微生物接种剂、硅藻土和任选的载体，
其中，所述微生物接种剂包括一种或多种细菌菌株和/或其生长副产物，以及
其中所述一种或多种细菌菌株中的至少一种能够在饲料存在的情况下产生乳酸。
2.根据权利要求1所述的青贮饲料添加剂组合物，其中所述能够产生乳酸的细菌菌株是凝结芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的青贮饲料添加剂组合物，其中所述微生物接种剂包括解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-67928(“B.amy”)。
4.根据权利要求1所述的青贮饲料添加剂组合物，其中所述微生物接种剂包括枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-68031(“B4”)。
5.根据权利要求1所述的青贮饲料添加剂组合物，其中所述生长副产物是有机酸、生物表面活性剂和/或酶。
6.根据权利要求1所述的青贮饲料添加剂组合物，进一步包括选自干燥剂、盐、染料、香料、缓冲剂、营养物、淀粉、碳水化合物、水和其他微生物培养物和/或发酵副产物中的一种或多种的其他组分。
7.根据权利要求1所述的青贮饲料添加剂组合物，进一步包括选自异常威克汉姆酵母、球拟假丝酵母、绿针酵母、酿酒酵母、糙皮侧耳、汉斯德巴氏酵母和季也蒙毕赤酵母的一种或多种其他有益微生物的发酵产物。
8.根据权利要求7所述的青贮饲料添加剂组合物，其中所述发酵产物可以包括有益微生物的纯化或天然形式的生长副产物、发酵培养基、细胞和/或发酵残留的营养物。
9.一种用于饲料青贮的方法，其中所述方法包括用青贮饲料添加剂组合物接种容纳在青贮饲料环境中的饲料，所述青贮饲料添加剂组合物包括微生物接种剂和任选的载体，
其中所述微生物接种剂包括一种或多种细菌菌株和/或其生长副产物，
其中所述一种或多种细菌菌株中的至少一种能够产生乳酸，并且
其中所述微生物接种剂在所述青贮饲料环境中厌氧生长，并发酵所述饲料以产生青贮饲料。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述饲料包括草、玉米、高粱、谷类、燕麦和/或苜蓿植物的切碎料。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述青贮饲料环境是气密青贮饲料袋、防水布、筒仓或储罐。
12.根据权利要求9所述的方法，其中将所述组合物直接施用于所述饲料，并任选地与所述饲料混合，并且其中将所述青贮饲料环境密封以产生厌氧环境。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物接种剂使所述饲料发酵约24小时至12周的时间段。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述能够产生乳酸的细菌菌株是凝结芽孢杆菌。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物接种剂包括解淀粉芽孢杆菌“B.Amy”及其生长副产物。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物接种剂包括枯草芽孢杆菌“B4”及其生长副产物。
17.根据权利要求9所述的方法，其中所述生长副产物是有机酸、生物表面活性剂和/或酶。
18.根据权利要求9所述的方法，进一步包括选自干燥剂、盐、染料、香料、缓冲剂、营养物、淀粉、碳水化合物、水和其他微生物培养物和/或发酵副产物中的一种或多种的其他组分。
19.根据权利要求9所述的方法，进一步包括选自异常威克汉姆酵母、球拟假丝酵母、绿针酵母、酿酒酵母、糙皮侧耳、汉斯德巴氏酵母和季也蒙毕赤酵母的一种或多种其他有益微生物的发酵产物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述发酵产物包括有益微生物的纯化或天然形式的生长副产物、发酵培养基、细胞和/或发酵残留的营养物。
21.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物进一步包括硅藻土。
22.一种用于防治储存谷物有害物的方法，其中将根据权利要求1至8中任一项所述的青贮饲料添加剂组合物施用于储存谷物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述储存谷物是面粉、精白面粉迈达、粗面粉苏吉、豆类、棉籽、玉米、稻米、大麦、苋菜、荞麦、碎小麦、法老小麦、亚麻、卡姆小麦、小米、藜麦、黑麦、斯佩耳特小麦、画眉草和/或黑小麦。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述储存谷物的有害物是谷物螟虫、象鼻虫、蛾和/或甲虫。
25.一种饲喂家畜动物的方法，所述方法包括使用根据权利要求9至21任一项所述的方法生产青贮饲料，并将所述青贮饲料提供给所述家畜动物，以便所述动物可以摄取所述青贮饲料。
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