WO2008044628A1 - Procédé de production de peptide thioester - Google Patents

Procédé de production de peptide thioester Download PDF

Info

Publication number
WO2008044628A1
WO2008044628A1 PCT/JP2007/069555 JP2007069555W WO2008044628A1 WO 2008044628 A1 WO2008044628 A1 WO 2008044628A1 JP 2007069555 W JP2007069555 W JP 2007069555W WO 2008044628 A1 WO2008044628 A1 WO 2008044628A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
fmoc
resin
mmol
gly
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/069555
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hironobu Hojo
Yoshiaki Nakahara
Original Assignee
Tokai University Educational System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokai University Educational System filed Critical Tokai University Educational System
Priority to JP2008538697A priority Critical patent/JP5119159B2/ja
Priority to EP07829293A priority patent/EP2085403A4/en
Priority to US12/444,270 priority patent/US20110184148A1/en
Publication of WO2008044628A1 publication Critical patent/WO2008044628A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/14—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides
    • C07C319/20—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides by reactions not involving the formation of sulfide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/067—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for sulfur-containing functions

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for synthesizing peptide thioesters. More specifically, the present invention relates to a novel method for synthesizing peptide thioesters using N-alkylcysteine derivatives.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 peptide bonds are destabilized by N-alkylation after extending a peptide chain by a Fmoc method on a sulfonamide linker, and peptide thiols are obtained by thiolysis.
  • Methods for obtaining esters have been reported.
  • This method utilizes the fact that an amide bond with an imino group is more susceptible to thiolysis than an amide bond with an amino group.
  • this method has a problem in that the esterification performed after peptide chain elongation may not proceed (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Documents 5 to 8 report a method for preparing a thioester by N-S rearrangement.
  • the method of Non-Patent Document 5 has a problem that the N—S rearrangement at the final stage is not quantitative.
  • the peptide chain is slightly dropped during the elongation of the peptide chain, and the synthesis of the compound for performing the NS rearrangement is complicated. There is a problem such as.
  • a proline derivative is used as a compound for performing the N—S rearrangement.
  • This method is to convert the amide bond with secondary amine to thioester, but the synthesis of proline derivatives is complicated, and the rearrangement is very slow (about 1 week). Since it is necessary to destabilize the amide bond and increase the reaction rate, it is not practical.
  • JP-A No. 1-217397 and Non-Patent Document 9 a basic reagent containing 1-methylpyrrolidine or hexamethyleneimine is used alone as an Fmoc group removal reagent instead of piperidine.
  • a peptide chain can be extended without breaking a thioester bond. According to this method, the results of the study by the present inventors showed that the peptide chain was elongated after forming a thioester bond at the C-terminus, and the Fmoc group removal reagent was changed.
  • Non-Patent Document 1 Shin, ⁇ ; Winans,. A .; Backes, B. J .; Kent, S. B. H .; Ellman, J. A .;
  • Non-Patent Document 2 Ingenito, R .; Bianchi, E .; Fattori, D .; Pessi, A. J. Am. Chem. Soc, 122, 11369-11374 (1999).
  • Non-Patent Document 3 Marcaurelle, Shi A., Mizoue, Shi S, Wilken, J., Oldham, Shi ent, SB ⁇ , Handel, TM and Bertozzi, CR Chem. Eur. J., 7, 1129-1132 (2001).
  • Non-Patent Document 4 Kajihara, S .; Yoshihara, A .; Hirano,.; Yamamato, N. carbohydrate Res., 341, 1333-1340 (2006).
  • Non-Patent Document 5 Kawakami, ⁇ ; Sumida, M .; Nakamura,.; Vorherr, T .; Aimoto, S., T etrahedron Lett., 46, 8805-8807 (2005).
  • Non-Patent Document 6 Ohta, ⁇ ⁇ ; Itoh, S; Shigenaga, A ,; Shintaku, S .; Fuji N .; Otaka, A. Org. Lett., 8, 467 (2006).
  • Non-Patent Document 7 Nagaike et al., Abstracts of Annual Meeting of the Japanese Society for Agricultural Chemistry p324 (2005).
  • Patent Document 8 Nagaike, F., Onuma, ⁇ , anazawa, C, Ho, H, Ueki, A., Nakahara, ⁇ ., Nakahara, ⁇ ., Org. Lett., 8, 4465-4468 (2006 ).
  • Non-Patent Document 9 Li, X .; Kawakami, ⁇ ; Aimoto, S. Tetrahedron Lett .. 39, 8669-8672 (1998).
  • Patent Document 1 JP-A-H-217397
  • the present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, the present invention can synthesize the desired peptide thioester in a relatively short time under conditions where side reactions are unlikely to occur using a readily available compound as a reaction reagent! It was an object to be solved to provide a novel method for producing a peptide thioester, and an N-alkylcysteine derivative for use in the above production method.
  • the present inventors have extended the peptide chain using N-alkylcystine as the C-terminal amino acid by the Fmoc method, and after deprotection, the N-alkyl is subjected to mildly acidic conditions.
  • the present inventors have found that a thioester bond can be formed by NS transfer of a peptide bond to a cysteine thiol group, and the present invention has been completed.
  • step (iv) A step of producing a thioester compound by reacting an acidic thiol with the compound obtained in step (iii):
  • Fmoc represents a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group
  • R represents an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms or an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms
  • Y represents a protecting group for a thiol group.
  • X represents a peptide residue.
  • a method for producing a peptide thioester is provided.
  • the deprotection reagent in step (iii) is trifluoroacetic acid.
  • the acidic thiol in step (iv) is mercaptocarboxylic acid or a mixture of mercaptan and carboxylic acid.
  • the acidic thiol in step (iv) is a force that is HSCH CH COOH (MPA), or HSC H CH COOH (MPAA), or a mixture of thiophenol and acetic acid.
  • MPA HSCH CH COOH
  • MPAA HSC H CH COOH
  • R is a methyl group, an ethyl group, an isobutyl group or a benzyl group.
  • Y is a trityl group.
  • the hydrogenating agent in step) is NaBH or NaBHCN.
  • the method for producing a peptide thioester according to the present invention there is no degradation of the ester bond with piperidine! /, And there is no problem! /. Therefore, as a method for producing a peptide thioester by the Fmoc method, Highly useful.
  • the method for producing a peptide thioester of the present invention uses a cysteine derivative that can be synthesized from a commercially available product, has high stability of the peptide in the course of peptide chain elongation, and further proceeds quantitatively and rapidly in the final stage of thioesterification.
  • the method for producing a peptide thioester having high practicality.
  • the method for producing a peptide thioester according to the present invention is a highly practical method because the degree of racemization is low compared with the conventional thioester synthesis method.
  • the present invention will be described more specifically.
  • the peptide chain is elongated using N-alkylcysteine as the C-terminal amino acid by the Fmoc method, and after deprotection, the peptide bond is NS-transferred to the thiol group of N-alkylcysteine under weakly acidic conditions.
  • a thioester bond Figure 1
  • Glu-Va ⁇ Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly (SEQ ID NO: 1) was used as a model peptide, and peptide synthesis and thioesterification were attempted as shown in Fig. 3. .
  • Fmoc-CLEAR AMIDE resin N-alkyl cysteine derivatives were converted to DCC-HOBt
  • Fmoc-Gly was introduced using HATU-DIEA by the method, and then the peptide chain was elongated by FastMoc method using Fmoc amino acid using ABI 433A peptide synthesizer.
  • the peptide chain from the resin was removed and deprotected by Reag ent (TFA), and at the same time, the thiol group of the terminal N-alkylcysteine was deprotected.
  • the obtained crude peptide was allowed to stand in 5% 3_mercaptopropionic acid aqueous solution and then monitored by HPLC. The reaction was completed in about 20 hours.
  • the method for producing a peptide thioester according to the present invention includes the steps (i) to (iv) described below. Hereinafter, steps ⁇ to (iv) will be described.
  • Fmoc- (amino acid residue) nN (R) -CH (CH SY) _C ( O) NH -resin.
  • NH (R) _CH (CH SY) -C ( O)
  • the introduction rate of Fmoc-amino acid into the NH-resin is poor! To increase the introduction rate.
  • R represents an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms or an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms.
  • the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, and the like, and these may be any linear, branched, or cyclic hydrocarbon group. Good.
  • a benzyl group can be cited.
  • R is preferably a methyl group, an ethyl group, an isobutyl group or a benzyl group.
  • Y represents a protecting group for a thiol group.
  • protecting groups for thiol groups include trityl, acetamide, benzyl, methylbenzyl, 4-methoxybenzyl, 3-nitro-2-pyridinesulfenyl, ethylmercapto, tert-butyl. Examples include mercapto groups and tert-butyl groups.
  • Y is preferably a trityl group.
  • the reaction can be carried out at a suitable temperature (for example, 40 to 60 ° C.) for a predetermined time.
  • Fmoc-amino acid may or may not be reacted in step (ii).
  • step (1) specifically, the reaction product in step (i) is washed with NMP, and then the resin is shaken in Ac 2 0-D IEA I NMP for 5 minutes.
  • Fmoc_Gly hexafluorophosphoric acid o- (7_azabenzotriazolose-;!-Yl) -N, N, ⁇ ' , ⁇ '-Tetramethyluronium (HATU), ⁇ , N-diisopropylethylamine (DIEA) dissolved in NMP is added to react.
  • the reaction can be performed at an appropriate temperature (for example, 40 to 60 ° C.) for a predetermined time.
  • the peptide chain can be extended by repeating the deprotection of the Fmoc group and the reaction with Fmoc-amino acid using, for example, the FastMoc method using an ordinary peptide synthesizer. it can.
  • a deprotection reagent eg, trifluoroacetic acid
  • Reagent K can be added to the product (resin) in step (ii) and allowed to react at room temperature.
  • Step (iv) is a step of producing a thioester compound by reacting the compound obtained in step (iii) with an acidic thiol.
  • an acidic thiol may include mercaptocarboxylic acid, or a mixture of mercaptan and carboxylic acid, more preferably HSCH CH COOH (MPA), or HSC H CH COOH (MPAA), or
  • a mixture of thiophenol and acetic acid can be used.
  • step (iv) TFA is removed from the product of step (iii) by a nitrogen stream, and ether is added to cause precipitation. The precipitate is washed with ether and then dried.
  • acidic thiol such as 3-mercaptopropionic acid or 4-mercaptophenylacetic acid
  • a peptide thioester compound represented by CH 3 COOH can be obtained.
  • R represents an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms or an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms
  • Y represents a protecting group for thiol).
  • Y is a protecting group for a thiol group
  • I I ⁇
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 11 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 11 carbon atoms
  • the alkyl group represented by R 1 is preferably an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, Examples thereof include a butyl group, a pentyl group, and a hexyl group, and these may be linear, branched, or cyclic hydrocarbons.
  • R 1 is particularly preferably a methyl group, an isopropyl group or a phenyl group.
  • a cysteine protected thiol group is dissolved in water containing ethanol and potassium hydroxide, and the compound represented by I ⁇ CHO is added to the solution at an appropriate temperature (for example, it is performed by stirring for a predetermined time at room temperature.
  • a compound represented by YSCH CH (NHCH R 1 ) C ( ⁇ O) OH (wherein Y and R 1 are as defined above) is prepared, and 9-fluorenylmethoxycarbonyl —N— is optionally produced.
  • Fmoc-OSu hydroxysuccinimide ester
  • the represented compounds can be produced.
  • the hydrogenating agent is allowed to act, the reaction may be performed in the presence of a base such as sodium hydroxide.
  • a hydrogenating agent for example, NaBH, or
  • the reaction can be carried out by stirring at an appropriate temperature.
  • NaBH CN which is preferably dissolved in aqueous sodium hydroxide.
  • Fmoc-OSu is allowed to act to convert the amino group to Fmoc
  • Fmoc-OSu is reacted with Fmoc-OSu in the presence of sodium carbonate in a suitable solvent (eg, 1,2-dimethoxyethane, etc.). Can be protected by a group.
  • N-ethyl-S-trityl-L-cysteine (l) a method using NaBH as a hydrogenating agent
  • N-ethyl-S-trityl-L-cysteine (2) a method using NaBH CN as a hydrogenating agent
  • Example 2 N- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) -N-ethyl-S-trityl-L-cysty N
  • N-Ethyl-S-trityl-L-cysteine (220 mg, 0.56 mmol) is dissolved in 10% aqueous sodium carbonate solution (3 ml) and 1,2-dimethoxyethane (1.5 ml).
  • Fmoc-OSu 300 mg, 0.89 mmol dissolved in ethane (1.5 ml) was added and the solution was stirred at room temperature overnight. After filtration of the precipitate, the filtrate was neutralized with 1 M HC1, and the target product was extracted with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • N-isobutyl-S-trityl-L-cysteine (870 mg, 2.1 mmol) is dissolved in 10% aqueous sodium carbonate solution (10 ml) and 1,2-dimethoxyethane (5 ml), and 1,2-dimethoxy is dissolved.
  • Fmoc-OSu (1.0 g, 3.0 mmol) dissolved in ethane (10 ml) was added and the solution was stirred at room temperature overnight. After filtering the precipitate, the filtrate was neutralized with 1 M HC1, and the target product was extracted with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • N-benzyl-S-trityl-L-cysteine (220 mg, 0.49 mmol) was dissolved in 10% aqueous sodium carbonate solution (3.5 ml) and Fmoc-OSu dissolved in 1,2-dimethoxyethane (1.0 ml). (0.25 g, 0.74 mmol) was added and the solution was stirred at room temperature overnight. After filtration of the precipitate, the filtrate was neutralized with 1 M HC1, and the target product was extracted with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Example 8 N- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) -N-methyl-S-trityl-L-cysteine
  • N-Methyl-S-trityl-L-cysteine (46 mg, 0.12 mmol) was dissolved in 10% aqueous sodium carbonate solution (1.0 ml) and 1,2-dimethoxyethane (0.3 ml).
  • Fmoc-OSu (82 mg, 0.24 mmol) dissolved in 2-dimethoxyethane (0.6 ml) was added and the solution was stirred at room temperature overnight. After filtration of the precipitate, the filtrate was neutralized with 1 M HC1, and the target product was extracted with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Fmoc-CLEAR amide resin (65 mg, 0.03 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • Fmoc- N_Me- Cys (Trt) (36 mg, 0.06 mmol), 1 M HOBt / NMP (0.09 ml) 1 M DCC / NMP (0.09 ml) was reacted for 30 minutes to this resin, and 50 ° C And reacted for 1 hour. After washing with NMP, the resin was shaken in 10% Ac 0-5% DIEA / NMP for 5 minutes.
  • Fmoc-Gly (89 mg, 0.3 mmol), HATU (108 mg, 0.28 mmol), DIEA (0.10 ml, 0.60 mmol) was added in NMP and reacted at 50 ° C for 1 hour.
  • the peptide chain was extended by FastMoc method using ABI 433A peptide synthesizer, and Glu (OBu) -VaVThr (Bu) _Gl y-His (Trt) -Arg (Pbf) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Gly-N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (129 mg) was obtained. Reagent (0.4 ml) was added to a part (10 mg) of the resin and shaken at room temperature for 2 hours. Then, TFA was removed by a nitrogen stream, and ether was added to cause precipitation.
  • the precipitate was washed with ether three times and then dried under reduced pressure.
  • the crude peptide was extracted with a 15% aqueous acetonitrile solution (0.2 ml) containing 0.1% TFA, diluted with a 5% aqueous 3-mercaptopropionic acid (MPA) solution (2.0 ml), and allowed to stand overnight.
  • the crude peptide was purified by HPLC to obtain Glu-Va-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH (0.98 mg, 0.77 mol, 33%).
  • Fmoc-CLEAR amide resin (220 mg, 0.1 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes. To this resin was added a solution obtained by reacting Fmoc-N_Et-Cys (Trt) (120 mg, 0.2 mmol), 1 M HOBt / NMP (0.3 ml) 1 M DCC / NMP (0.3 ml) for 30 minutes. The reaction was performed at ° C for 1 hour. After washing with NMP, the resin was shaken in 10% Ac 0-5% DIEA / NMP for 5 minutes.
  • Fmoc-Gly 300 mg, 1.0 mmol
  • HATU 360 mg, 0.95 mmol
  • DIEA 0.35 ml, 2.0 mmol
  • the crude peptide was extracted with 15% aqueous acetonitrile (0.2 ml) containing 0.1% TFA, diluted with 5% mercaptopropionic acid (MPA) aqueous solution (2.0 ml), and left overnight.
  • the crude peptide was purified by HPLC to obtain Glu-Va-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH (1.0 mg, 0.81 mol, 34%).
  • the reaction progress by HPLC at this time is shown in FIG.
  • the 4 min peak appears to be MPA
  • the 12 min peak appears to be an MPA dimer.
  • Fmoc-CLEAR amide resin (220 mg, 0.1 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • Fmoc- N_iBu- Cys (Trt) 130 mg, 0.2 mmol
  • 1 M HOBt / NMP 0.3 ml
  • 1 M DCC / NMP 0.3 ml
  • Fmoc-Gly (30 0 mg, 1.0 mmol), HATU (360 mg, 0.95 mmol), DIEA (0.35 ml, 2.0 mmol) ) was dissolved in ⁇ (1 ⁇ 5 ml) and reacted at 50 ° C for 1 hour.
  • the peptide chain was extended by FastMoc method using ABI 433A peptide synthesizer, and Glu (OBu) -Va ⁇ Thr (Bu Gly-His Tr -Arg PbO-Trp Bod-Leu-Lys Boc ⁇ -Gly -N-iBu-Cys Tr -NH-resin (390 mg) was added, Reagent (0.4 ml) was added to a part of the resin (10 mg), shaken at room temperature for 2 hours, and then TFA was removed with a nitrogen stream.
  • the precipitate was washed with ether three times and then dried under reduced pressure, and the crude peptide was extracted with 15% aqueous acetonitrile (0.2 ml) containing 0.1% TFA. Dilute with 5% mercaptopropionic acid (MPA) aqueous solution (2.0 ml) and leave overnight.
  • the crude peptide was purified by HPLC and Glu-Val-T hr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- Lys-Gly-SCH CH COOH (0.85 mg, 0.67 ⁇ mol, 28%) was obtained.
  • Fmoc-CLEAR amide resin 110 mg, 0.05 mmol
  • 20% piperidine / NMP for 5 min, 15 Minute processed.
  • Fmoc-Gly 150 mg, 0.5 mmol
  • HATU 180 mg, 0.47 mmol
  • DIEA 0.18 ml, l.Ommol
  • NMP 0.8 ml
  • the precipitate was washed 3 times with ether and then dried under reduced pressure.
  • the crude peptide was extracted with 15% aqueous acetonitrile (0.2 ml) containing 0.1% TFA, diluted with 5% aqueous mercaptopropionic acid (MPA) (2.0 ml), and allowed to stand overnight.
  • the crude peptide was purified by HPLC to obtain Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH (0.60 mg, 0.47 mol, 17%).
  • Comparative Example 1 Synthesis of Glu-Va Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH using cysteine as the C-terminal amino acid
  • Fmoc-CLEAR amide resin 110 mg, 0.05 mmol
  • the peptide chain was extended by FastMoc method using ABI 433A peptide synthesizer, and Glu (OBu) -Va ⁇ Thr (Bu) _Gly-His (Trt) -Arg (Pbf) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Gly-Cys (Trt) -NH-resin ( 9 mg) was obtained.
  • Reagent 0.4 ml was added to a part (10 mg) of the resin and shaken at room temperature for 2 hours.
  • Example 10 Synthesis of Glu-Va-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SC H using N-ethylcystein as the C-terminal amino acid
  • the crude peptide was extracted with 15% aqueous acetonitrile (0.2 ml) containing 0.1% TFA and diluted with 1.7 ml of 30% aqueous acetonitrile.
  • Acetic acid (100 1) and thiophenol (40 1) were added, and the reaction was shaken at room temperature for 24 hours.
  • the reaction solution was purified by HPLC to obtain Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SC H (1.0 mg, 0.80 mol, 35%).
  • Example 11 Synthesis example of c-terminal residue peptidothioester using N derivative: (11-1) Synthesis of Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-SCH CH COOH
  • Fmoc-N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (0.03 mmol) 20% was treated with piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • a solution dissolved in Fmoc_Leu (180 mg, 0.5 mmol), HATU (180 mg, 0.47 mmol), DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol), NMP (0.8 ml) was added to the effect of this tree, and the mixture was stirred at 50 ° C for 1 hour. Reacted. After washing the resin with NMP, the above reaction with Fmoc-Leu was repeated twice. After washing with NMP, the peptide chain is extended by FastMoc method using ABI 433A peptide synthesizer,
  • N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (184 mg) was obtained.
  • Reagent 0.4 ml was added to a part (10 mg) of the resin and shaken at room temperature for 2 hours. Then, TFA was removed with a nitrogen stream, and ether was added to cause precipitation. The precipitate was washed 3 times with ether and then dried under reduced pressure.
  • the crude peptide was extracted with 15% aqueous acetonitrile (0.2 ml) containing 0.1% TFA, diluted with 5% 3_mercaptopropionic acid (MPA) aqueous solution (2.0 ml), and allowed to stand overnight.
  • MPA 3_mercaptopropionic acid
  • the crude peptide was purified by HPLC to obtain Ala-Thr-Glu-Va Thr-Gly_His-Arg_Trp_Leu-SCH CH COOH (0.15 mg, 0.12 mol, 7.0%). The degree of racemization was about 6.8%.
  • Fmoc-N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (0.03 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • the peptide chain is extended by FastMoc method using ABI 433A peptide synthesizer, and Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Gly-Gly-Va and Vato Leu-Lys (Boc)- Glu (0 Bu) -N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (90 mg) was obtained.
  • Reagent 0.4 ml
  • TFA was removed with a nitrogen stream, and ether was added to cause precipitation.
  • the precipitate was washed 3 times with ether and then dried under reduced pressure.
  • Fmoc-N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (0.03 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • the peptide chain was extended by the FastMoc method using an ABI 433A peptide synthesizer, and ⁇ ( ⁇ ) -01 ⁇ ( ⁇ ) - ⁇ & t Thr (Bu) -Gly-His (Trt) -Arg ( Pbf) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -N-Et-Cys (Trt) -NH-resin (101 mg) was obtained. To a part of the resin (10 mg), Re agent (0.4 ml) was added and shaken at room temperature for 2 hours. Then, TFA was removed with a nitrogen stream, and ether was added to cause precipitation.
  • the precipitate was washed 3 times with ether and then dried under reduced pressure.
  • the crude peptide was extracted with 15% aqueous acetonitrile (0.2 ml) containing 0.1% TFA, diluted with 5% 3-mercaptopropionic acid (MPA) aqueous solution (2.0 ml), and allowed to stand for 3 nights.
  • the crude peptide was purified by HPLC to obtain Thr-Glu-Va-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-SCH C H COOH (0.17 mg, 0.13 mol, 4.4%). The degree of racemization was about 2.5%.
  • Example 12 Glycopeptide thioester having an N-linked disaccharide [Empurin (34-58): Gly_Ser_Lys_Ile_Leu_Leu_Thr_Cys (Acm) _Ser_Leu_Asn (GlcNAc) _Asp_Ser_Ala_T hr- Glu- Va-Hir -Arg- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOH] (Fig. 5)
  • Fmoc-CLEAR amide resin (220 mg, 0.1 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • Fmoc- N_Et- Cys (Trt) (123 mg, 0.2 mmol), 1 M HOBt / NMP (0.25 ml) 1 M DCC / NMP (0.25 ml) was added to this resin for 30 minutes. Reacted for hours. After washing with NMP, the resin was shaken in 10% Ac 0-5% DIEA / NMP for 5 minutes. By NMP After washing, the cells were treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • Fmoc-Gly 150 mg, 0.5 mmol
  • HATU 180 mg, 0.48 mmol
  • DIEA 0.17 ml, 1 mmol
  • an Fmoc group removal reagent (1-methylbiphenyl lysine 25 ml, hexamethyleneimine 2 ml, 1-hydroxybenzotriazole 2 g, 1-me Tyl-2-pyrrolidinone (1-methyl-2-pyrrolidone) / dimethyl sulfoxide mixed solvent (volume ratio 1/1 )
  • the yield was 1.8%.
  • Example 12 Glycopeptide thioester having 2: 0-linked pentasaccharide (Empurin (34-58):
  • TFA was removed by a stream of air, ether was added to form a precipitate, the precipitate was washed three times with ether and dried under reduced pressure, and the crude peptide was further reduced to Low-TfOH [TfO H / TFA / DMS / m-cresol (1: 5: 3: 1, 0.6 ml)] for 2 hours at ⁇ 15 ° C.
  • Ether was added to form a precipitate, which was washed three times with ether, Dried under reduced pressure .
  • the crude peptide was dissolved in water (10 ml) containing 5% MPA and left at room temperature for 3 days.
  • MALDI-TOF MS found, m / z 3765.8 (M + H) + : calcd.for (M + H) + , 3764.8.
  • Amino acid analysis Asp Thr Ser Glu Gly Ala Val lie Leu Lys His Arg.
  • Literature Ueki, A .; Nakahara, ⁇ ; Hop, ⁇ ; Nakahara, ⁇ . Tetrahedron 2007, 63, 2170— 2181.
  • Example 12 Mucin peptide having two sugar chains in the molecule Ac-Va Thr (GalGalNAc) -Ser_Ala_Pro_Asp_hr-Arg-Pro-Ala-Pro-ly-Ser-Tnr (al alNAc) -Ala -Pro-Pro-A la- His- Gly- SCH CH COOH 5 synthesis
  • Fmoc-Val (67.8 mg, 0.2 mmol) was condensed with 1 M DCC (300 ⁇ 1) and 1 M HOB t (300 ⁇ 1) to obtain a protected peptide having an N-terminal Fmoc group.
  • Half of the resin was de-Fmoc and Ac converted by Ac 2 O / DIEA / NMP.
  • the obtained resin was dried, and the whole amount (352 mg) was reacted with Reagent (5 ml) for 1 hour.
  • the reaction solution was removed with nitrogen gas, and jetyl ether was added thereto to precipitate the peptide. This operation was repeated three times, and the precipitate was vacuum-dried.
  • the obtained peptide was treated with Low-TfOH [TfOH / TFA / DMS / m-cresol (1: 5: 3: 1, 4.0 ml)] at ⁇ 15 ° C. for 2 hours. Chilled jetyl ether In addition, the peptide was precipitated. This operation was repeated three times, and the precipitate was vacuum-dried. After drying, it was dissolved in 2 ml of distilled water, 5% mercaptopropionic acid was added, and the mixture was reacted for 2 days. Purification by HPLC gave the desired glycopeptide thioester 5. The obtained peptide was 18.9 mg (6.9 mmol, 14%).
  • Fmoc-CLEAR amide resin (430 mg, 0.2 mmol) was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • Fmoc- N_Et- Cys (Trt) (245 mg, 0.4 mmol), 1 M HOBt / NMP (0.5 ml) and 1 M DCC / NMP (0.5 ml) were added to this resin for 30 minutes. Reacted for hours. After washing with NMP, the resin was shaken in 10% Ac 0-5% DIEA / NMP for 5 minutes. After washing with NMP, it was treated with 20% piperidine / NMP for 5 minutes and 15 minutes.
  • Fmoc-Gly 300 mg, 1.0 mmol
  • HATU 360 mg, 0.95 mmol
  • DIEA 0.35 ml, 2.0 mmol
  • the peptide chain was extended by FastMoc method using a peptide synthesizer, and Arg (Pbf) -Ser (Bt) -Leu-Ala-Arg (Pbf) -Trp (Boc) -Leu-Glu ( OBu) -Arg (Pbf) -Gln (Trt) -Gly-N-Et-Cys (Trt) -NH-resin was obtained.
  • the present invention it is possible to solid-phase synthesize peptide peptides, N-linked and 0-linked glycopeptide esters essential for chemical synthesis of proteins and glycoproteins in high yield.
  • Proteins and glycoproteins obtained by this method can be used for IJ production.
  • the glycoprotein produced by the present invention is expected to exhibit the same activity as that of naturally derived glycoprotein, for example, the effect of promoting production of matrix metabolite proteinase from fibroblasts.
  • FIG. 1 shows an outline of a method for producing a peptide thioester according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a method for producing an N-alkylcysteine derivative.
  • FIG. 3 shows an outline of peptide synthesis and thioesterification when Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly is used as a model peptide.
  • FIG. 4 shows the course of reaction when N-ethyl-cysteine was used. * Indicates a peak derived from MPA.
  • FIG. 5 shows a synthetic route for empurin (34-58) thioester with chitobiose (GlcNAc).
  • FIG. 6 shows a synthetic route for CCL27 (37_69) thioester having 9 sugars.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

明 細 書 技術分野
[0001] 本発明は、ペプチドチォエステルの新規な合成方法に関する。より詳細には、本発 明は、 N-アルキルシスティン誘導体を利用したペプチドチォエステルの新規な合成 方法に関する。
背景技術
[0002] タンパク質の化学合成は、固相法により調製されたペプチドチォエステルを繰り返 して縮合することによりなされる。この方法の鍵物質であるペプチドチォエステルは、 チォエステル結合の安定性を考慮して Boc法 (t-ブトキシカルボニル化アミノ酸を用レヽ る方法)により合成されるのが一般的である。近年、糖鎖など、タンパク質の翻訳後修 飾に対する関心が高まっており、これらの修飾の酸性条件下での不安定性を考慮し て、強酸性条件を用いな!/、Fmoc法によるペプチドチォエステルの調製が望まれて!/ヽ る。しかし、 Fmoc基の除去に用いるピぺリジンによってチォエステル結合が切断され てしまうため、従来の Fmoc法はそのままでは適用できない。そこで、これまでに Fmoc 法によりチォエステルを得る方法として、ピぺリジンの代わりにチォエステル基存在下 で Fmoc基を除去できる脱保護試薬を用いる方法、スルホンアミドリンカ一上で Fmoc 法によりペプチド鎖を伸長した後、リンカ一のアルキル化、チオリシスによりチォエス テルを得る方法等が開発されている。しかし、どの方法にも一長一短があり、 Fmoc法 による一般的なチォエステル合成法の確立には未だ至って!/、なレ、。
[0003] 例えば、非特許文献 1及び 2においては、スルホンアミドリンカ一上で Fmoc法により ペプチド鎖を伸長した後、 N-アルキル化を行うことにより、ペプチド結合を不安定化し 、チオリシスによりペプチドチォエステルを得る方法が報告されている。この方法は、 ィミノ基とのアミド結合がァミノ基とのアミド結合に比較してチオリシスを受けやすいと いうことを利用している。しかし、この方法では、ペプチド鎖伸長後に行うチォエステ ル化が進行しない場合があるという問題点があり（非特許文献 3)、また糖鎖水酸基を 遊離のまま糖ペプチド固相合成を行う場合には、 N-アルキル化により糖鎖水酸基の アルキル化が起こることも報告されて!/、る（非特許文献 4)。
[0004] 非特許文献 5から 8においては、 N-S転位によるチォエステル調製法が報告されて いる。非特許文献 5の方法では、最終段階の N-S転位が定量的ではないという問題 点がある。また、非特許文献 6の方法では、ピぺリジンを使用する従来の Fmoc法では 、ペプチド鎖伸長途上、若干ペプチド鎖の脱落がみられること、さらに N-S転位を行 うための化合物の合成が煩雑であるといった問題点がある。本発明者らによる非特許 文献 7及び 8に記載の方法では、プロリン誘導体を N-S転位を行うための化合物とし て用いている。この方法は、 2級ァミンとのアミド結合をチォエステルに変換する方法 であるが、プロリン誘導体の合成が煩雑であること、また転位が非常に遅い（約 1週間 )ためにマイクロ波を照射してアミド結合を不安定化させ、反応速度を高める工夫が 必要になることから、実用性に欠けるものである。
[0005] また特開平 1卜217397号公報、非特許文献 9には、ピぺリジンに代わる Fmoc基除 去試薬として、 1-メチルピロリジン、又はへキサメチレンイミンを含む塩基性試薬を単 独であるいは混合して使用すると、チォエステル結合を切断することなぐペプチド鎖 を伸長させることができると記載されている。し力、しな力 この方法によると、本発明者 等の研究結果では、 C末端にチォエステル結合を形成してからペプチド鎖を伸長さ せていること力、ら、 Fmoc基除去試薬を変更してもなお徐々にチォエステル結合が分 解するので目的物の収率が上がらず、その上最初のアミノ酸 3残基の導入に際して、 ペプチド鎖の脱離を抑制するための特殊な縮合条件が求められ、さらにペプチド自 動合成を行うときのプロトコルにプログラム変更が必要になってくる。
[0006] 非特許文献 1： Shin, Υ· ; Winans, . A.; Backes, B. J.; Kent, S. B. H. ; Ellman, J. A.;
Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc , 121， 11684-11689 (1999).
非特許文献 2 : Ingenito， R.; Bianchi, E.; Fattori, D.; Pessi, A. J. Am. Chem. Soc , 1 21， 11369-11374 (1999).
非特許文献 3 : Marcaurelle，し A., Mizoue,し S.， Wilken, J., Oldham,し ent, S. B. Η·， Handel, T. M. and Bertozzi, C. R. Chem. Eur. J., 7， 1129-1132 (2001).
非特許文献 4 : Kajihara, Υ·; Yoshihara, A.; Hirano, . ; Yamamato, N. carbohydrate Res., 341， 1333-1340 (2006). 非特許文献 5 : Kawakami, Τ·; Sumida, M. ; Nakamura, .; Vorherr, T.; Aimoto, S., T etrahedron Lett., 46, 8805-8807 (2005).
非特許文献 6 : Ohta， Υ·; Itoh, S; Shigenaga, A,; Shintaku,S.; Fuji N. ; Otaka, A. Or g. Lett. , 8， 467 (2006).
非特許文献 7 :長池ら， 日本農芸化学会大会講演要旨集 p324 (2005).
^特許文献 8： Nagaike, F., Onuma, Υ·， anazawa, C, Ho , H, Ueki, A., Nakahara, Υ·， Nakahara, Υ·， Org. Lett., 8， 4465-4468 (2006).
非特許文献 9 : Li， X.; Kawakami, Τ· ; Aimoto, S. Tetrahedron Lett.. 39， 8669-8672 ( 1998).
特許文献 1 :特開平; U-217397号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即 ち、本発明は、容易に入手できる化合物を反応試薬に用いて、比較的短時間に、副 反応が生じにくい条件下にお!/、て目的とするペプチドチォエステルを合成することが できる、ペプチドチォエステルの新規な製造方法、並びに上記製造方法に用いるた めの N-アルキルシスティン誘導体を提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 Fmoc法により N-アル キルシスティンを C末端アミノ酸としてペプチド鎖を伸長し、脱保護後に弱酸性条件 下で N-アルキルシスティンのチオール基へペプチド結合を N-S転移させることにより チォエステル結合を形成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0009] 即ち、本発明によれば、（i) Fmoc- NH -樹脂を脱保護して、 Fmoc- (アミノ酸残基) n -N (R) -CH (CH SY) -C ( = 0) OH(nは 0または 1)を反応させることによって Fmoc_( アミノ酸残基) n-N (R) -CH (CH SY) _C ( = O) NH-樹脂を製造する工程；
(ii)工程（i)で得た Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) -CH (CH SY) _C ( = O) NH-樹 脂 (nは 0または 1)の Fmoc基を脱保護してから、必要に応じて、 Fmoc-アミノ酸を反応 させることによって、 Fmoc- (アミノ酸残基) n_N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0) NH-樹 脂 (nはほたは 2)を製造し、以下、 Fmoc基の脱保護と Fmoc-アミノ酸との反応を繰り 返すことによって、 X_N (R) -CH (CH SY) -C ( = 0) -NH-樹脂を製造する工程；
(iii)工程 (ii)で得た X-N (R) -CH (CH S Y) -C ( = O) -NH-樹脂に脱保護試薬を 作用させて樹脂からの脱離とチオール基の脱保護を行う工程、
(iv)工程 (iii)で得た化合物に酸性チオールを作用させて、チォエステル化合物を 製造する工程：
(式中、 Fmocは 9-フルォレニルメトキシカルボ二ル基を示し、 Rは炭素数 1から 12の アルキル基又は炭素数 7から 12のァラルキル基を示し、 Yはチオール基の保護基を 示し、 Xはペプチド残基を示す。 )
を含む、ペプチドチォエステルの製造方法が提供される。
[0010] 好ましくは、工程 (iii)における脱保護試薬は、トリフルォロ酢酸である。
好ましくは、工程（iv)における酸性チオールは、メルカプトカルボン酸、又はメルカ プタンとカルボン酸の混合物である。
好ましくは、工程（iv)における酸性チオールは、 HSCH CH COOH(MPA)、又は HSC H CH COOH(MPAA)である力、、あるいはチォフエノールと酢酸の混合物である
6 4 2
[0011] 好ましくは、 Rはメチル基、ェチル基、イソブチル基又はべンジル基である。
好ましくは、 Yはトリチル基である。
[0012] 本発明の別の側面によれば、 Z-N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0) OH (式中、 Zは水 素原子又は 9-フルォレニルメトキシカルボ二ル基を示し、 Rは炭素数 1から 12のアル キル基又は炭素数 7から 12のァラルキル基を示し、 Yはチオールの保護基を示す） で表される化合物が提供される。
[0013] 本発明のさらに別の側面によれば、（i)YSCH CH (NH ) C ( = 0) OH (式中、 Yは チオール基の保護基である）で表される化合物と、 I^CHO (式中、 R1は水素原子又 は炭素数 1から 11のアルキル基又は炭素数 6から 11のァリール基を示す）で表され る化合物とを反応させて、 YSCH CH (N = CHR1) C ( = 0) OH (式中、 Y及び R1は 上記と同義である）で表される化合物を製造する工程；
(ii)工程（i)で得た YSCH CH (N = CHR1) C ( = 0) OH (式中、 Y及び R1は上記と 同義である）で表される化合物に水素化剤を作用させて、 YSCH H (NHCH 1) C ( = 0) OH (式中、 Y及び R1は上記と同義である）で表される化合物を製造し、所望 により 9-フルォレニルメトキシカルボニル -N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを作用 させて、アミノ基を 9-フルォレニルメトキシカルボニル基で保護する工程：
を含む、上記した本発明の化合物の製造方法が提供される。
好ましくは、工程 ）における水素化剤は、 NaBH、又は NaBH CNである。
4 3
発明の効果
[0014] 本発明によるペプチドチォエステルの製造方法によれば、ピぺリジンによるチォェ ステル結合の分解と!/、う問題がな!/、ため、 Fmoc法によるペプチドチォエステルの製 造方法としての有用性が高い。本発明のペプチドチォエステルの製造方法は、市販 品から合成できるシスティン誘導体を用いる点、ペプチド鎖伸長途上のペプチドの安 定性が高い点、さらに最終段階のチォエステル化が定量的かつ速やかに進行する 点において、実用性の高いペプチドチォエステルの製造方法である。また、従来の チォエステル合成法と比較して、ラセミ化の程度が低ぐこの点からも、本発明のぺプ チドチォエステルの製造方法は、実用性の高レ、方法である。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明についてさらに具体的に説明する。本発明の方法においては、 Fmoc 法により N-アルキルシスティンを C末端アミノ酸としてペプチド鎖を伸長し、脱保護後 に、弱酸性条件下で N-アルキルシスティンのチオール基へペプチド結合を N-S転移 させることによりチォエステル結合を形成させる（図 1)。
[0016] 以下、本明細書に記載の実施例に即して、本発明を説明する。まず、図 2に記載 の方法により、 3種類の N-アルキルシスティン誘導体を合成した。市販の Cys(Trt)を 出発物質として、ァセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド又はべンズアルデヒドを反応 させ、生成したシッフ塩基を水素化ホウ素ナトリウムで還元した後、 Fmoc化を行い、 ペプチド合成に用いた。
[0017] 次に、モデルペプチドとして Glu-Va卜 Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly (配列 番号 1)を用い、図 3の要領でペプチド合成、およびチォエステル化を試みた。 Fmoc- CLEAR AMIDE樹脂を出発物質として、 N-アルキルシスティン誘導体を DCC-HOBt 法にて、続いて Fmoc-Glyを HATU-DIEAを用いて導入した後、 ABI社製 433Aぺプチ ド合成機を用いて Fmocアミノ酸を用いた FastMoc法にてペプチド鎖を伸長した。 Reag ent (TFA)による樹脂からのペプチド鎖の脱離、脱保護と同時に、末端 N-アルキル システィンのチオール基の脱保護も行った。得られた粗ペプチドを 5%3_メルカプト プロピオン酸水溶液中に放置後、 HPLCにより反応をモニターしたところ約 20時間で 反応が完了した。
[0018] また、光学活性アミノ酸を C末端としたときのラセミ化の度合いを検討するため、 Fm oc-N-Et-Cys(Trt)を導入した後、 Leu、 Lys、 Gluを C末端アミノ酸としてペプチド鎖を 合成した。 5%3_メルカプトプロピオン酸を用いたチォエステル化を行い、別途調製し た C末端が Dアミノ酸となったものとの HPLCの溶出位置を比較し、ラセミ化の度合!/ヽ を検討した。その結果、 Lysを C末端とした場合のラセミ化の度合いは 2.5%程度であ り、 Leuを C末端とした場合のラセミ化の度合いは 7%程度であった。
[0019] 上記の通り、本発明の方法に基づいて、 C末端に Glyを持つ 10残基のモデルぺプ チドを合成し、そのチォエステル化を試みたところ、約 1日でほとんど副反応なく目的 とするペプチドチォエステルが得られることが明らかとなった。また、 C末端アミノ酸と して Leu、 Lys、 Gluを持つペプチドのチォエステル化を行ったところ、 C末端アミノ酸の ラセミ化の度合いは 7%以下であった。これまでのチォエステル合成法に比較して、 ラセミ化の程度が低力、つた。以上の結果から、本発明の方法は、実用的なペプチドチ ォエステル合成法であることが分かる。
[0020] 本発明によるペプチドチォエステルの製造方法は、以下に記載の工程 (i)から（iv) を含む方法である。以下、工程 ωから（iv)について説明する。
[0021] 工程 (i)は、 Fmoc-NH-樹脂を脱保護して、 Fmoc- (アミノ酸残基) n_N (R) -CH ( CH SY) _C ( = 0) OH(nは 0または 1)を反応させることによって Fmoc- (アミノ酸残基） n-N (R) -CH (CH SY) _C ( =〇） NH -樹脂を製造する工程である。工程 (i)におい て、 Fmoc_N(R)-CH(CH Y)_C(=0)OHの代わりに、 Fmoc-アミノ酸残基- N (R) -CH ( CH SY) -C ( = O) 0HをNH -樹脂と反応させることにより、 Fmoc-アミノ酸残基- N ( R) -CH (CH SY) -C ( = 0) NH-樹脂を製造することができる。 NH (R) _CH (CH S Y) -C ( = O) NH-樹脂への Fmoc-アミノ酸の導入率が悪!/、場合は、この方法によつ て導入率を上げることができる。
[0022] 本発明において、 Rは炭素数 1から 12のアルキル基又は炭素数 7から 12のァラル キル基を示す。アルキル基の例としては、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル 基、ペンチル基、へキシル基などを挙げることができ、これらは直鎖、分岐鎖、又は環 状のいずれの炭化水素基でもよい。ァラルキル基の例としては、ベンジル基などを挙 げること力 Sできる。 Rは好ましくは、メチル基、ェチル基、イソブチル基又はベンジル基 である。
[0023] ここで Rが水素の場合、すなわち Fmoc基にシスティンが結合して!/、る場合には、後 述する比較例 1に示したようにチォエステル交換反応はほとんど進行しないことから、 Rはアルキル基又はァラルキル基であることが重要である。
[0024] 本発明にお!/、て、 Yはチオール基の保護基を示す。チオール基の保護基の例とし ては、トリチル基、ァセタミド基、ベンジル基、メチルベンジル基、 4-メトキシベンジル 基、 3-ニトロ- 2-ピリジンスルフエニル基、ェチルメルカプト基、第三ブチルメルカプト 基、第三ブチル基などが挙げられる。 Yは好ましくは、トリチル基である。
[0025] 工程（i)は、例えば、 Fmoc-CLEARアミド樹脂をピぺリジン/ N-メチルピロリドン（N MP)で処理することによって Fmoc基を脱保護し、この樹脂に、 Fmoc-N (R) -CH (C H SY) -C ( = 0) OHを、 HOBt/NMP、 N-ジシクロへキシルカルポジイミド（DCC) / NMPを反応させることによって行うことができる。反応は適温 (例えば、 40〜60°C) で所定の時間だけ行うことができる。
[0026] 工程（ii)は、工程（i)で得た Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) -CH (CH SY) _C ( = O ) NH-樹脂 (nは 0または 1)の Fmoc基を脱保護してから、必要に応じて、 Fmoc-ァミノ 酸を反応させることによって、 Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0 ) NH -樹脂 (nはほたは 2)を製造し、以下、 Fmoc基の脱保護と Fmoc-アミノ酸との反 応を繰り返すことによって、 X_N (R) -CH (CH SY) -C ( = 0) -NH -樹脂を製造する 工程である。なお、工程（i)において、 Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) -CH (CH SY) -C ( = 0) OH(nは 1)を反応させることによって Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) -CH (C H SY) -C ( = 0) NH -樹脂を製造した場合は、工程 (ii)においては、 Fmoc-アミノ酸 を反応させてもよいし、反応させなくてもよい。 [0027] 工程 ）では具体的には、工程 (i)の反応生成物を NMPで洗浄後、樹脂を Ac20-D IEA I NMP中で 5分間振盪する。 NMPによる洗浄、及びピぺリジン/ NMPによる Fmoc 基の除去を行った後、 Fmoc_Gly、へキサフルォロリン酸〇- (7_ァザベンゾトリァゾー ノレ -；!-ィル） -N, N, Ν', Ν'-テトラメチルゥロニゥム（HATU)、 Ν, N-ジイソプロピルェ チルァミン（DIEA)を NMPに溶解した溶液を加えて反応を行う。反応は適温（例えば、 40〜60°C)で所定の時間だけ行うことができる。次いで、反応産物を NMPで洗浄後 、通常のペプチド合成機を用いて、例えば、 FastMoc法により、 Fmoc基の脱保護と F moc-アミノ酸との反応を繰り返すことによって、ペプチド鎖を伸長することができる。
[0028] 工程（iii)は、工程（ii)で得た X_N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0) _NH_樹脂に脱保 護試薬 (例えば、トリフルォロ酢酸など）を作用させて樹脂からの脱離とチオール基の 脱保護を行う工程である。具体的には、工程 (ii)の生成物（樹脂）に、 Reagent Kを加 えて室温で反応することができる。ここで、 Reagent とは、 TFA: H 0:チオアニソー ル：エタンジチオール：フエノール = 82.5:5:5:2.5:5の試薬である。
[0029] 工程 (iv)は、工程 (iii)で得た化合物に酸性チオールを作用させて、チォエステル 化合物を製造する工程である。ここで用いる酸性チオールの具体例としては、メルカ プトカルボン酸、又はメルカプタンとカルボン酸の混合物を挙げることができる、さらに 好ましくは、 HSCH CH COOH(MPA)、又は HSC H CH COOH(MPAA),あるいは
2 2 6 4 2
チォフエノールと酢酸の混合物を用いることができる。
[0030] 工程（iv)では、工程（iii)の産物から窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加え て沈殿を生じさる。沈殿物をエーテルで洗浄した後、乾燥させる。粗ペプチドを TFA を含むァセトニトリル水溶液で抽出し、 3-メルカプトプロピオン酸水溶液あるいは 4-メ ルカプトフエニル酢酸などの酸性チオールのァセトニトリル等の水溶液で希釈し、数 時間から数十時間放置することによって、 X-S-CH CH COOHあるいは X-S-C H
2 2 6 4
CH COOHで表されるペプチドチォエステル化合物を得ることができる。
[0031] 本発明はさらに、 Z-N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0) OH (式中、 Zは水素原子又は
9-フルォレニルメトキシカルボ二ル基を示し、 Rは炭素数 1から 12のアルキル基又は 炭素数 7から 12のァラルキル基を示し、 Yはチオールの保護基を示す）で表される化 合物に関する。 R及び Yで表される基の詳細は上記の通りである。以下、上記化合物 の製造方法について説明する。
[0032] 先ず、 YSCH CH (NH ) C ( =〇） OH (式中、 Yはチオール基の保護基である）（即 ち、チオール基を保護したシスティン)で表される化合物と、 I^CHO (式中、 R1は水 素原子又は炭素数 1から 11のアルキル基又は炭素数 6から 11のァリール基を示す） で表される化合物とを反応させて、 YSCH CH (N = CHR1) C ( = 0) OH (式中、 Y 及び R1は上記と同義である）で表される化合物を製造する。ここで、 R1が示すアルキ ル基は、好ましくは炭素数 1から 9のアルキル基であり、さらに好ましくは炭素数 1から 6のアルキル基であり、例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチ ル基、へキシル基などを挙げることができ、これらは直鎖、分岐鎖、又は環状のいず れの炭化水素でもよい。 R1は特に好ましくはメチル基、イソプロピル基又はフエニル 基である。 I^CHOで表される化合物との反応は、チオール基を保護したシスティン をエタノールと水酸化カリウムを含む水に溶解し、これに I^CHOで表される化合物を 添加し、適当な温度（例えば、室温など）で所定の時間だけ攪拌することによって行う こと力 Sでさる。
[0033] 続!/、て、 YSCH CH (N = CHR1) C ( = O) OH (式中、 Y及び R1は上記と同義であ る）で表される化合物に水素化剤（例えば、 NaBH、又は NaBH CN)を作用させて、
4 3
YSCH CH (NHCH R1) C ( = O) OH (式中、 Y及び R1は上記と同義である）で表さ れる化合物を製造し、所望により 9-フルォレニルメトキシカルボニル -N-ヒドロキシス クシンイミドエステル（以下、 Fmoc-OSu)を作用させて、アミノ基を Fmoc基で保護 することによって、 Z-N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0) OH (式中、 Zは水素原子又は 9 -フルォレニルメトキシカルボ二ル基を示し、 Rは炭素数 1から 12のアルキル基又は炭 素数 7から 12のァラルキル基を示し、 Yはチオール基の保護基を示す）で表される化 合物を製造することができる。水素化剤を作用させる際には、水酸化ナトリウムなどの 塩基の存在下で反応を行ってもよい。具体的には、水素化剤（例えば、 NaBH、又
4 は NaBH CN)を YSCH CH (N ( ΗΙ^) ( ( =〇）〇Ηで表される化合物に添加して、
3 2
適当な温度で攪拌することによって反応を行うことができる。 NaBHを使用するとき
4
には、水酸化ナトリウム水溶液に溶解して用いるのが好ましぐ NaBH CNを使用する
3
ときには塩基は特に必要としない。また、 Fmoc-OSuを作用させてアミノ基を Fmoc 基で保護する際には、適当な溶媒 (例えば、 1 , 2-ジメトキシェタンなど）中で、炭酸 ナトリウムの存在下にお!/、て、 Fmoc-OSuを作用させることによってアミノ基を Fmoc 基で保護すること力できる。
[0034] 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する力 本発明は実施例によって 限定されるものではない。
実施例
[0035] 実施例 1
( 1 )： N-ェチル -S-トリチル -L-システィン (l):NaBHを水素化剤として用いる方法
4
S-トリチル -L-システィン (1.0 g， 2.8 mmol)をエタノール (7.0 ml)と KOH (150 mg， 2.8 mmol)を含む水（3.0 ml)に溶解し、ァセトアルデヒド (0.20 ml, 3.6 mmol)を加えた。溶 液を 1時間室温で撹拌後、 1M NaOH 2滴を含む水 (2.0 ml)に溶解した NaBH (0.10 g
4
， 2.8 mmol)を加え、室温で 15分、 60°Cで 10分撹拌した。室温に戻した後、 1M HC1 で pHを 4に調整して目的物を沈殿させた。 4°Cで 1時間放置後、沈殿を濾過し、少量 の蒸留水で洗浄した後、 50°Cで減圧下一晩乾燥させた。得られた粉末をシリカゲル クロマトグラフィー (クロ口ホルム：メタノール = 4: 1、酢酸 1 %を含む)で精製し、 目的物（ 0.34 g， 0.87 mmol, 31 %)を得た。
[0036] (2) N-ェチル -S-トリチル -L-システィン (2)： NaBH CNを水素化剤として用いる方法
3
S-トリチル -L-システィン (1.0 g， 2.8 mmol)と NaBH CN(0.17 g， 2.8 mmol)をメタノー
3
ノレ (28 ml)に懸濁し、ァセトアルデヒド (0.19 ml, 3.3 mmol)を加えた。生じた溶液を室温 で 1時間撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を 1-ブタノールに溶解して蒸留 水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を留去後得られ た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (クロ口ホルム：メタノール = 4: 1、酢酸 1 %を含む )で精製し、 目白勺物 (0.52 g， 1.3 mmol, 48%)を得た。
[0037] [ α ] +30.8° (c 1.1 in CHC1 ). R 0.27 (9: 1 CHC1 _CH OH containing 1 %ACOH). 1
D 3 f 3 3
H-NMR (CDC1 ): δ 3.03 (brt, 1H， J=6.1 Hz, a H)， 2.81 (m， 1H， β H)， 2.71 (m， 1H，
3
β H)， 2.56 (m， 2H， - CH CH )， 1.04 (brt, 3H， J= 7.3 Hz, CH -) HRFABMS: Calcd f
2 3 3
or C H NO S - Na: 414.15037, found: m/z 414.14576.
24 25 2
[0038] 実施例 2： N-(9-フルォレニルメトキシカルボニル) -N-ェチル -S-トリチル -L-システィ ン
N-ェチル -S-トリチル -L-システィン （220 mg， 0.56 mmol)を 10%炭酸ナトリウム水 溶液 (3 ml)と 1,2-ジメトキシェタン（1.5 ml)に溶解し、 1,2-ジメトキシェタン（1.5 ml)に 溶解した Fmoc-OSu (300 mg， 0.89 mmol)を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿 を濾過後、ろ液を 1 M HC1で中和し、 目的物を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トルェ ン：酢酸ェチル = 2 : 1、酢酸 1 %を含む）により精製し、 目的物（280 mg， 0.46 mmol, 82%)を得た。
[0039] [ a ] -39.6° (c 1.1 in CHC1 ). R 0.31 (2: 1 Toluene-ethyl acetate containing 1 % Ac
D 3 f
OH). 'H-NMR (CDCl ): δ 4.51—4.33 (m， 2H， Fmoc— CH―)， 4.19 (brt, J=6.6Hz, 0.6
3 2
H， Fmoc -CH-), 4.09 (m， 0.4H, Fmoc - CH- )， 3.39 (m， 0.4H, -CH CH )， 3.28 (m， 0
2 3
• 6H， -CH CH )， 3.11 (m， dd， J=5.8, 8.8 Hz, 0.6H, α H), 2.98—2.85 (m， 0.4H; a H,
2 3
1.2H; β H x2), 2.74-2.59 (m， 1H; -CH CH， 0.4H; β H)， 2.39 (dd， J=9.3, 13.7 Hz,
一 2 3
0.4H, β H)， 0.91-0.85 (m， 3H，— CH ). HRFABMS: Calcd for C H NO SNa: 636.21
3 39 35 4
845， found: m/z 636.21236.
[0040] 実施例 3： N-イソブチル -S-トリチル -L-システィン
S-トリチル _L-システィン (1.0 g， 2.8 mmol)をエタノール (7.0 ml)と KOH (150 mg， 2.8 mmol)を含む水（3.0 ml)に溶解し、イソブチルアルデヒド (0.30 ml, 3.3 mmol)を加えた 。溶液を 1時間室温で撹拌後、 1M NaOH 2滴を含む水 (2.0 ml)に溶解した NaBH (0.
4
13 g， 3.4 mmol)を加え、室温で 15分、 60°Cで 10分撹拌した。室温に戻した後、 1M H CrCpHを 4に調整して目的物を沈殿させた。 4°Cで 1時間放置後、沈殿を濾過し、少 量の蒸留水で洗浄した後、 50°Cで減圧下一晩乾燥させた。得られた粉末をシリカゲ ルクロマトグラフィー (クロ口ホルム：メタノール = 7 : 1、酢酸 1 %を含む)で精製し、 目的 物 (0.79 g， 1.9 mmol, 67%)を得た。
[0041] [ a ] +26.1° (c 1.0 in CHC1— CH OH 1 : 1). R 0.34 (9: 1 CHC1— CH OH containing 1
D 3 3 f 3 3
% AcOH). :H-NMR (CDCl -CD OD): δ 2.96-2.88 (m， 2H， a H, β H)， 2.69 (dd， 1H
3 3
， J=7.8, 12.7 Hz, β H)， 2.40—2.32 (m， 2H， CH CH(CH ) )， 1.83 (m， 1H， _CH(CH ) )
2 3 2 一 3 2
， 0.90 (m，6H，— CH ). HRFABMS: Calcd for C H NO S - Na: 442.18167, found: m/z 442.18614.
[0042] 実施例 4： N-(9-フルォレニルメトキシカルボニル) -N-イソブチル -S-トリチル -L-シス ティン
N-イソブチル -S-トリチル -L-システィン (870 mg， 2.1 mmol)を 10%炭酸ナトリウム水 溶液 (10 ml)と 1,2-ジメトキシェタン（5 ml)に溶解し、 1,2-ジメトキシェタン（10 ml)に溶 解した Fmoc-OSu (1.0 g， 3.0 mmol)を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾 過後、ろ液を 1 M HC1で中和し、 目的物を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリウム で乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン： 酢酸ェチル = 3 : 1、酢酸 1 %を含む）により精製し、 目的物（1.0 g， 1.6 mmol, 75%)を 得た。
[0043] [ a ] -56. Γ (c 1.0 in CHC1 ). R 0.22 (4: 1 toluene-ethyl acetate containing 1% Ac
D 3 f
OH). 'H-NMR (CDCO: δ 4.47 (m， 1.3H, Fmoc - CH -), 4.36 (m， 0.7H, Fmoc - CH ―)， 4.14 (m， 0.7H, Fmoc— CH— )， 4.08 (m， 0.3H, Fmoc— CH— )， 3.17 (dd， 0.3H, 8.8, 13.7 Hz, -CH2CH(CH ) )， 3.05 (dd， 0.7H, 4.9, 12.2 Hz, β H)， 2.91-2.75 (m， a H， 0.7H, β H， 0.7H, -CH2CH(CH ) )， 2.70 (m， 0.3H, β H)， 2.37-2.32 (m， 0.3H, β H， 0. 3H， -CH2CH(CH ) )， 2.22 (dd， 0.7H, 6.8, 14.1 Hz,— CH2CH(CH ) )' 1.45 (m， 0.3H, -CH(CH ) )， 1.35 (m， 0.7H, -CH(CH ) )， 0.77 (m， 1.8H,— CH )， 0.65 (d， 2.1H, 6.8 一 3 2 3 2 3
Hz, -CH )， 0.58 (d， 2.1H, 6.3 Hz, -CH ). HRFABMS: Calcd for C H NO S-Na: 66
3 3 41 39 4
4.24975, found: m/z 664.24466.
[0044] 実施例 5： N-ベンジル -S-トリチル -L-システィン
S-トリチル _L-システィン (1.0 g， 2.8 mmol)をエタノール (7.0 ml)と KOH (150 mg， 2.8 mmol)を含む水（3.0 ml)に溶解し、ベンズアルデヒド (0.30 ml, 3.0 mmol)を加えた。溶 液を 1時間室温で撹拌後、 1M NaOH 2滴を含む水 (1.0 ml)に溶解した NaBH (0.11 g
4
， 2.9 mmol)を加え、室温で 15分、 60°Cで 10分撹拌した。室温に戻した後、 1M HC1 で pHを 4に調整して目的物を沈殿させた。 4°Cで 1時間放置後、沈殿を濾過し、少量 の蒸留水で洗浄した後、 50°Cで減圧下一晩乾燥させた。得られた残渣をシリカゲル クロマトグラフィー (クロ口ホルム：メタノール = 13 : 1、酢酸 1 %を含む)で精製し、 目的 物 (0.26 g， 0.60 mmol, 22%)を得た。 [0045] [ a 29.8° (c 1.0 in CHC1 ). R 0.31 (13: 1 chloroform-methanol containing 1 %ACO
D 3 f
H H-NMR (CDCl ): δ 3.63 (brs, 2H， _CH _Ph)， 3.02 (brt, 1H， J=5.9 Hz, α H), 2.
3 一 2
73 (m， 2H， β H). HRFABMS: Calcd for C H NO S - Na: 476.16602, found: m/z 476
29 27 2
. 16271.
[0046] 実施例 6： N-(9-フルォレニルメトキシカルボニル) -N-ベンジル -S-トリチル -L-システ イン
N-ベンジル -S-トリチル -L-システィン (220 mg， 0.49 mmol)を 10%炭酸ナトリウム水 溶液 (3.5 ml)に溶解し、 1 ,2-ジメトキシェタン（1.0 ml)に溶解した Fmoc-OSu (0.25 g， 0 .74 mmol)を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過後、ろ液を 1 M HC1で中 和し、 目的物を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去後 、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：酢酸ェチル = 5 : 1、酢酸 1 %を含む）により精製し、 目的物（180 mg， 0.27 mmol, 54%)を得た。
[0047] [ ] —45.4° (c 1.0 in CHC1 ). R 0.25 (5: 1 toluene-ethyl acetate containing 1 % Ac
D 3 f
OH).
'H-NMR (CDCl ): δ 4.63 (d， 0.3H, J=15.6Hz, - CH - Ph)， 4.44 (d， 0.7H, J=16. 1 Hz
3 2
， -CH - Ph)， 4.12 (m， 1H， Fmoc - CH- )， 3.91 (d， 0.3H, J=15.1 Hz, -CH - Ph)， 3.89 ( d， 0.7H, J=16.1 Hz, -CH -Ph), 3.40 (m， 1H， a H), 2.95 (dd， 0.7H, J=5.8, 13.7 Hz, β H)， 2.85 (d， 0.7H, J=8.3, 13.2 Hz, β H)， 2.60 (m， 0.3H, β H)， 2.45 (m， 0.3H, β H). HRFABMS: Calcd for C H NO S - Na: 698.23410， found: m/z 698.23063.
44 37 4
[0048] 実施例 7： N-メチル -S-トリチル -L-システィン
S-トリチル _L -システィン (2.0 g， 5.5 mmol)をエタノール (14 ml)と KOH (300 mg， 5.4 mmol)を含む水（6.0 ml)に溶解し、ホルムアルデヒド (36-38%水溶液， 0.54 ml, 6.6 mm ol)を加えた.溶液を 1時間室温で撹拌後、 1M NaOH 4滴を含む水 (4.0 ml)に溶解し た NaBH (0.25 g， 6.6 mmol)を加え、室温で 15分、 60oCで 10分撹拌した。室温に戻
4
した後、 1M HCrCpHを 4に調製して目的物を沈殿させた。 4oCで 1時間放置後、沈 殿を濾過し、少量の蒸留水で洗浄した後、 50oCで減圧下一晩乾燥させた。得られた 粉末をシリカゲルクロマトグラフィー (クロ口ホルム：メタノール、 4: 1、酢酸 1 %を含む)で 精製し、さらに ODSカラムを用いて 0.1% TFAを含むァセトニトリル水溶液にて精製し、 目的物 (670 mg， 1.77 mmol, 32%)を得た。
[0049] [ a ]D -9.7o (c 0.5 in CHC1 ). R 0.27 (6: 1 CHC1— CH OH containing 1% AcOH).
3 f 3 3
:H-NMR (CDC1 ): δ 2.96 (m， 1H， a H)， 2.77 (m， 1H， β H)， 2.59 (m， 1H， β H)， 2.0
3
3 (bs， 3H，— CH ). HRFABMS: Calcd for C H NNaO S: 400.1347, found: m/z 400.1
3 23 23 2
781.
[0050] 実施例 8： N-(9-フルォレニルメトキシカルボニル) -N-メチル -S-トリチル -L-システィン
N-メチル -S-トリチル -L-システィン （46 mg， 0.12 mmol)を 10%炭酸ナトリウム水溶 ί夜 (1.0 ml)と 1 ,2-ジメトキシェタン（0.3 ml)に溶角早し、 1 ,2-ジメトキシェタン（0.6 ml)に 溶解した Fmoc-OSu (82 mg， 0.24 mmol)を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿 を濾過後、ろ液を 1 M HC1で中和し、 目的物を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トルェ ン：酢酸ェチル、 1 : 1、酢酸 1 %を含む）により精製し、 目的物（54 mg， 90 μ mol, 74%) を得た。
[0051] [ a ]D -25.9o (c 1. 1 in CHC1 ).
3
R 0.22 (2: 1 Toluene-ethyl acetate containing 1% AcOH).
f
'H-NMR (CDCl ): δ 4.43-4.33 (m， 2H， Fmoc -CH -)， 4.24 (m， 0.6H, Fmoc ？ CH- )
3 2
， 4.17 (m， 0.4H, Fmoc ？ CH— )， 3.97 (dd， 0.6 H， J=4.9, 10.2 Hz, α H), 3.83 (m， 0.4 H， a H)， 2.85 (dd， 0.6 H， J=4.9, 13.1 Hz, β H)， 2.71 (s， 1.8 H，— CH )， 2.68 (s， 1.2
3
H，— CH )， 2.60 (dd， 0.4 H， J= 4.9, 13. 1 Hz, β H)， 2.41 (dd， 0.4H, J=10.7, 13.1 Hz,
3
β H). HRFABMS: Calcd for C H NNaO S: 622.2028, found: m/z 622.2021.
38 33 4
[0052] [表 1] 合敵率 (%)
CH2R CH2R
p I I
Λ HN— CH— COOH Fmoc-N— CH— COOH
C- SY Y: トリチノレ c - SY
実施例 7' 8 H 32 74
実施例 1, 2 CH3 31 82
実施例 3, 4 ((¾)20¾ 67 75
実施例 5， 6 (¾ 22 54 [0053] 実施例 9： N-(9-フルォレニルメトキシカルボニル) -ァラニル -N-ェチル -S-トリチル -L- システィン
Fmoc-ァラニン 1水和物 (0.23 g， 0.7 mmol), HATU(0.27 g， 0.7 mmol)を DMF(1 ml) に溶解し、 DIEA (0.12 ml, 0.7 mmol)を加え、得られた溶液を室温で 2分間撹拌した。 この溶液を、 N-Et-Cys(Trt) (0.20 g， 0.53 mmol), DIEA (0.092 ml, 0.53 mmol)を DM F(0.50 ml)に溶解した溶液に加え室温で 1時間反応させた。 DMFを減圧流去した後、 残渣を酢酸ェチルに溶解し、 1 M塩酸、飽和食塩水で洗浄の後、無水硫酸ナトリウ ムにより乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過した後、溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロ マトグラフィー (クロ口ホルム：メタノール、 19 : 1 1%酢酸を含む)で精製し、さらにバイ ォビーズ SX-3 (トルエン：酢酸ェチル、 3 : 1)により精製し、 目的物 (0.24 g， 0.35 mmol, 67%)を得た。
[0054] [ a ]D -11.5ο (c 1.0 in CHC1 ).
R 0.29 (19: 1 Chloroform-methanol containing 1% AcOH).
f
'H-NMR (CDCl ): δ 4.56 (m， 1H， Ala a H), 4.45-4.14 (m， 3H， Fmoc _CH-， _CH -)
， 1.33-1.29 (m， 3H， Ala - CH )， 1.02-0.96 (m， 3H， - CH - CH ).
HRFABMS: Calcd for C H ON NaO S， 707.2556, found, m/z 707.2421.
[0055] 実施例 9： N-アルキルシスティン誘導体を用いる C末端残基がグリシンであるぺプチ ドチォエステルの合成例：
(9-1 ) N-メチルシスティンを C末端アミノ酸として用いた Glu-Va卜 Thr-Gly_His-Arg- Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOHの合成
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (65 mg， 0.03 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分 処理した。この樹脂に Fmoc- N_Me- Cys(Trt) (36 mg， 0.06 mmol), 1 M HOBt/NMP ( 0.09 ml) 1 M DCC/NMP (0.09 ml)を 30分間反応させた溶液を加え、 50°Cで 1時間反 応させた。 NMPで洗浄後、樹脂を 10% Ac 0-5% DIEA / NMP中で 5分間震盪した。 N MPによる洗浄、 20%ピぺリジン/ NMPによる Fmoc基の除去を行った後、 Fmoc-Gly (89 mg， 0.3 mmol), HATU (108 mg， 0.28 mmol), DIEA (0.10 ml, 0.60 mmol)を NMPに溶 解した溶液を加え、 50°Cで 1時間反応させた。 NMPによる洗浄後、 ABI 433Aぺプチ ド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、 Glu(OBu )-Va卜 Thr(Bu )_Gl y-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂（129 m g)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0.4 ml)を加えて室温で 2時間震盪した 後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をェ 一テルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを 0.1% TFAを含む 15% ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5% 3-メルカプトプロピオン酸（MPA)水溶液 (2 .0 ml)で希釈し、 1夜放置した。粗ペプチドを HPLCにより精製し、 Glu-Vaト Thr-Gly-H is-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH (0.98 mg, 0.77 mol， 33%)を得た。
[0056] MALDI-TOF MS: found, m/z 1270.3 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 1270.6.
Amino acid analysis: Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg .
0.84 0.93 2 0.90 1.10 1.00 0.93 0.87
[0057] (9-2) N-ェチルシスティンを C末端アミノ酸として用いた Glu-Va卜 Thr-Gly-His-Arg- Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOHの合成
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (220 mg, 0.1 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分 処理した。この樹脂に Fmoc- N_Et- Cys(Trt) (120 mg, 0.2 mmol), 1 M HOBt/NMP (0 .3 ml) 1 M DCC/NMP (0.3 ml)を 30分間反応させた溶液を加え、 50°Cで 1時間反応 させた。 NMPで洗浄後、樹脂を 10%Ac 0-5%DIEA/NMP中で 5分間振盪した。漏 Pによる洗浄、 20%ピぺリジン/ NMPによる Fmoc基の除去を行った後、 Fmoc-Gly (300 mg, 1.0 mmol), HATU (360 mg, 0.95 mmol), DIEA (0.35 ml, 2.0mmol)を ΝΜΡ(1 ·5 ml )に溶解した溶液を加え、 50°Cで 1時間反応させた。 NMPによる洗浄後、 ABI 433Aぺ プチド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、
Figure imgf000017_0001
)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂（4 30 mg)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0.4 ml)を加えて室温で 2時間振盪 した後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物 をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを 0.1 %TFAを含む 1 5%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5%メルカプトプロビオン酸 (MPA)水溶液 (2 .0 ml)で希釈し、 1夜放置した。粗ペプチドを HPLCにより精製し、 Glu-Vaト Thr-Gly-H is-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH (1.0 mg, 0.81 mol， 34%)を得た。なお 、このときの HPLCによる反応経過を図 4に示す。
[0058] MALDI-TOF MS: found, m/z 1270.8 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 1270.6. アミノ酸分析： Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg .
0.95 0.87 2 0.94 1.03 1.02 0.98 0.92
[0059] 図 4において、 0 hの RT=10 minのピークは、 Glu- Val- Thr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- L ys-Gly-N-ethyl-cysteine-NHを示し、 8 hおよび 24 hに現れた RT=10 minのピークは Glu- Vaト Thr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOHを示す。なお、 4 min のピークは MPA、 12 minのピークは MPA2量体と思われる。
[0060] (9-3) N-イソブチルシスティンを C末端アミノ酸として用いた Glu-Va卜 Thr-Gly-His-A rg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOHの合成
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (220 mg， 0.1 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分 処理した。この樹脂に Fmoc- N_iBu- Cys(Trt) (130 mg， 0.2 mmol), 1 M HOBt/NMP ( 0.3 ml) 1 M DCC/NMP (0.3 ml)を 30分間反応させた溶液を加え、 50°Cで 1時間反応 させた。 NMPで洗浄後、樹脂を 10%Ac 0-5%DIEA/NMP中で 5分間振盪した。漏 Pによる洗浄、 20%ピぺリジン/ NMPによる Fmoc基の除去を行った後、 Fmoc-Gly (30 0 mg， 1.0 mmol), HATU (360 mg， 0.95 mmol), DIEA (0.35 ml、 2.0mmol)を ΝΜΡ(1 · 5 ml)に溶解した溶液を加え、 50°Cで 1時間反応させた。 NMPによる洗浄後、 ABI 433A ペプチド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、 Glu(OBu )-Va卜 Thr( Bu Gly-His Tr -Arg PbO-Trp Bod-Leu-Lys Boc^-Gly-N-iBu-Cys Tr -NH-樹 脂（390 mg)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0.4 ml)を加えて室温で 2時間 振盪した後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈 殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを 0.1 %TFAを 含む 15%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5% メルカプトプロビオン酸 (MPA) 水溶液 (2.0 ml)で希釈し、 1夜放置した。粗ペプチドを HPLCにより精製し、 Glu-Val-T hr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOH (0.85 mg、 0.67 ^ mol, 28%)を 得た。
[0061] MALDI-TOF MS: found, m/z 1270.9 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 1270.6.
アミノ酸分析： Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg .
0.96 0.94 2 0.93 1.02 1.02 0.95 0.94
[0062] (9-4) N-ベンジルシスティンを C末端アミノ酸として用いた Glu-Va卜 Thr-Gly-His-Ar g- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOHの合成
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (110 mg, 0.05 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15 分処理した。この樹脂に Fmoc- N-Bn- Cys(Trt) (68 mg, 0.1 mmol)、 1 M HOBt/NMP (0.15 ml) 1 M DCC/NMP (0.15 ml)を 30分間反応させた溶液を加え、 50°Cで 1時間 反応させた。 NMPで洗浄後、樹脂を 10%Ac 0_5%DIEA/NMP中で 5分間振盪した 。 NMPによる洗浄、 20%ピぺリジン/ NMPによる Fmoc基の除去を行った後、 Fmoc-Gl y (150 mg, 0.5 mmol)、 HATU (180 mg, 0.47 mmol)、 DIEA (0.18 ml, l.Ommol)を NMP (0.8 ml)に溶解した溶液を加え、 50°Cで 1時間反応させた。 NMPによる洗浄後、 ABI 4 33Aペプチド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、 Glu(OBu )-Va卜 Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Bn-Cys(Trt)-NH- 樹脂（180 mg)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0.4 ml)を加えて室温で 2時 間振盪した後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。 沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを 0.1%TFA を含む 15%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5% メルカプトプロビオン酸 (MPA )水溶液 (2.0 ml)で希釈し、 1夜放置した。粗ペプチドを HPLCにより精製し、 Glu-Val- Thr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOH (0.60 mg, 0.47 mol， 17%) を得た。
[0063] MALDI-TOF MS: found, m/z 1270.6 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 1270.6.
アミノ酸分析： Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg .
0.78 0.97 2 0.79 1.01 0.91 0.87 0.82
[0064] 比較例 1：システィンを C末端アミノ酸として用いた Glu-Va卜 Thr-Gly-His-Arg-Trp-L eu- Lys- Gly- SCH CH COOHの合成
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (110 mg, 0.05 mmol)を出発物質として ABI 433Aぺプチ ド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、 Glu(OBu )-Va卜 Thr(Bu )_Gl y-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-NH-樹脂（ 9 mg)を得 た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0.4 ml)を加えて室温で 2時間振盪した後、窒 素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテル で 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを 0.1%TFAを含む 15%ァセト 二トリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5% メルカプトプロビオン酸 (MPA)水溶液 (2.0 ml) で希釈し、 1夜放置した。粗ペプチドを HPLCにより精製し、 Glu-Vaト Thr-Gly-His-Ar g-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH CH COOH (24 ^ g, 0.045 mol， 1.9%)を得た。 [0065] MALDI-TOF MS: found, m/z 1270.8 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 1270.6.
アミノ酸分析： Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg .
0.84 0.89 2 0.85 0.98 0.78 0.77 0.93
[0066] [化 1]
EVTGHRWLKG-SCH,CH2COOH
Figure imgf000020_0001
[0067] [表 2]
Rの種類 合舰率 (%)
比較例 1 H
実施例 CH, 3 3
実施例 C 2H5 3 4
実施例 し i Iソし 1 ί (し ノ 2 8
雄例 - CH 5 1 7
R：使用した N— Rシスティンの種類
[0068] 実施例 10： N-ェチルシスティンを C末端アミノ酸として用いた Glu-Va卜 Thr-Gly-His- Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SC Hの合成
6 5
(9-2)で合成した Gli OBt^-Val-Th Bi^-Gly-HisCTrO-Arg PbO-Trp Boc^-Leu-L ys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)_NH-樹脂（430 mg)のうち 10 mgをとり、 Reagent (0.4 m 1)を加えて室温で 2時間振盪した後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加え て沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗 ペプチドを 0.1%TFAを含む 15%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 30%ァセトニ トリル水 1.7 mlで希釈した。酢酸 (100 1)とチォフエノール (40 1)を加え、反応液を 室温で 24時間震盪した。反応液を HPLCにより精製し、 Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-T rp-Leu-Lys-Gly-SC H (1.0 mg, 0.80 〃 mol，35%)を得た。
6 5
[0069] MALDI-TOF MS: found, m/z 1274.9 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 1274.7.
アミノ酸分析： Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg
— " 0.90 0.99 0.98 0.93 1
[0070] 実施例 11 : N 誘導体を用いる c末端残基 ぺプチ ドチォエステル合成例: (11-1) Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-SCH CH COOHの合成
Fmoc-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (0.03 mmol) 20%をピペリジン/ NMPで 5分、 15 分処理した。この樹月旨に Fmoc_Leu (180 mg， 0.5 mmol), HATU (180 mg， 0.47 mmol) 、 DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol), NMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、 50°Cで 1時間反応 させた。樹脂を NMPにより洗浄後、上記の Fmoc-Leuとの反応を 2回繰り返した。 NMP による洗浄後、 ABI 433Aペプチド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸 長し、
Figure imgf000021_0001
N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (184 mg)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0.4 ml) を加えて室温で 2時間振盪した後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて 沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ぺ プチドを 0.1 %TFAを含む 15%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5% 3_メルカプ トプロピオン酸 (MPA)水溶液 (2.0 ml)で希釈し、 2夜放置した。粗ペプチドを HPLCによ り精製し、 Ala- Thr- Glu- Vaト Thr- Gly_His- Arg_Trp_Leu- SCH CH COOH (0.15 mg, 0.12〃 mol， 7.0%)を得た。また、ラセミ化の度合いは 6.8%程度であった。
[0071] アミノ酸分析： Thr Glu Gly Ala Val Leu His Arg .
1.81 0.93 1 0.96 0.94 0.93 0.95 0.91
MALDI-TOF MS: found, m/z (M+H)+: 1258.1, calcd. for (M+H)+ 1257.6.
[0072] (11-2) Trp-Leu-Lys-Gly-Gly-Val-Val-Leu-Lys-Glu-SCH CH COOHの合成
Fmoc-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (0.03 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15 分処理した。この樹脂に Fmoc-Glu(OBut) (210 mg, 0.5 mmol), HATU (180 mg, 0.47 mmol), DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol), NMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、 50°Cで 1時 間反応させた。樹脂を NMPにより洗浄後、上記の Fmoc- Glu(OBut)との反応を 2回繰 り返した。 NMPによる洗浄後、 ABI 433Aペプチド合成機を用いて FastMoc法によりぺ プチド鎖を伸長し、 Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Vaト Vaト Leu-Lys(Boc)-Glu(0 Bu )-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (90 mg)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Reagent (0. 4 ml)を加えて室温で 2時間振盪した後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを 加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた 。粗ペプチドを 0.1 %TFAを含む 15%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出し、 5% 3_メ ルカプトプロピオン酸 (MPA)水溶液 (2.0 ml)で希釈し、 2夜放置した。粗ペプチドを HP LCにより精製し、 Trp-Leu-Lys-Gly-Gly-Val-Val-Leu-Lys-Glu-SCH CH COOH (0 .21mg， 0.18 mmol，5.3%)を得た。
[0073] アミノ酸分析： Glu Gly Val Leu Lys
0.91 2 1.13 1.90 2.01
MALDI-TOF MS: found, m/z (M+H)+: 1216.7， calcd. for (M+H)+ 1216.7.
[0074] ( 1 1 -3) Thr— Glu— Vaト Thr— Gly— His— Arg— Trp— Leu— Lys— SCH CH COOH
Fmoc-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (0.03 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15 分処理した。この樹月旨に Fmoc_Lys(Boc) (0.23 g， 0.5 mmol), HATU (180 mg， 0.47 m mol)、 DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol), NMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、 50°Cで 1時間 反応させた。樹脂を NMPにより洗浄後、上記の Fmoc-Lys(Boc)との反応を 2回繰り返 した。 NMPによる洗浄後、 ABI 433Aペプチド合成機を用いて FastMoc法によりぺプ チド鎖を伸長し、 ΤΐΊΓ(Βυ )-01ιι(ΟΒυ )-ν&ト Thr(Bu )-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc) -Leu-Lys(Boc)-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (101 mg)を得た。樹脂の一部 (10 mg)に Re agent (0.4 ml)を加えて室温で 2時間振盪した後、窒素気流により TFAを除去し、ェ 一テルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で 乾燥させた。粗ペプチドを 0.1 %TFAを含む 15%ァセトニトリル水溶液 (0.2 ml)で抽出 し、 5% 3-メルカプトプロピオン酸 (MPA)水溶液 (2.0 ml)で希釈し、 3夜放置した。粗ぺ プチドを HPLCにより精製し、 Thr- Glu- Vaト Thr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- Lys- SCH C H COOH (0.17 mg, 0.13〃 mol， 4.4%)を得た。また、ラセミ化の度合いは 2.5%程度 であった。
[0075] アミノ酸分析： Thr Glu Gly Val Leu Lys His Arg .
1.81 0.82 1 0.93 0.93 1.02 0.99 0.92
MALDI-TOF MS: found, m/z (M+H)+: 1315.0, calcd. for (M+H)+ 1314.7.
[0076] 実施例 12— 1 : N-結合型の 2糖を有する糖ペプチドチォエステル [ェムプリン (34-58) ： Gly_Ser_Lys_Ile_Leu_Leu_Thr_Cys(Acm)_Ser_Leu_Asn(GlcNAc )_Asp_Ser_Ala_T hr- Glu- Vaト Thr- Gly- His- Arg- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOH]の合成（図 5)
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (220 mg, 0.1 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分 処理した。この樹脂に Fmoc- N_Et- Cys(Trt) (123 mg, 0.2 mmol), 1 M HOBt/NMP (0 .25 ml) 1 M DCC/NMP (0.25 ml)を 30分間反応させた溶液を加え、 1時間反応させ た。 NMPで洗浄後、樹脂を 10% Ac 0-5% DIEA / NMP中で 5分間震盪した。 NMPによ る洗浄後、 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分処理した。 Fmoc-Gly (150 mg， 0.5 mm ol)、 HATU (180 mg， 0.48 mmol), DIEA (0.17 ml, 1 mmol)を加えて 50 °Cで 1時間反 応させた。もう一度同量の Fmoc-Gly, HATU, DIEAを加えて 50°Cで 1時間反応させた 。得られた樹脂上でペプチド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、 Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Thr(But)-Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)- Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂を得た。得られた樹脂の半分 量 (0.05 mmol)に対して Fmoc— Asn (GlcNAc Bn ) (120 mg， 0.1 mmol), 1 M HOBt/N
2 5
MP (0.12 ml)、 1 M DCC/NMP (0.12 ml)を室温で 30分撹拌した溶液を加え、 50。C で 1時間撹拌した。残りのアミノ酸配列も自動合成機により導入し、 Gly-Se BuVLysC Boc)— lie— Leu— Leu— Thr(Bu )— Cys(Acm)— Ser(Bu )— Leu— Asn(GlcNAc Bn )— Asp(OBu )—
2 5
Ser(Bu )— Ala— Thr(Bu )— Glu(OBu )— Vaト Thr(Bu )— Gly-His(Trt)— Arg(Pbi)— Trp(Boc)— Le u-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂（356 mg)を得た。ペプチド鎖の脱保護を 図るために、このうち 200 mgに Reagent (3.5 ml)を加えて室温で 2時間震盪した後 、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた.沈殿物をエー テルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。糖鎖部分の脱保護を図るため、粗ぺ プチドをさらに Low_TfOH [TfOH/TFA/DMS/m-cresol (1:5:3: 1， 4.0 ml)]により- 15 °Cで 2時間処理した。エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回 洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを 5%メルカプトプロビオン酸 (MPA)を 含む 10%ァセトニトリル水溶液（30 ml)に溶解し、室温で 2日間放置した後 HPLCにより 精製し、ェムプリン (34-58)チォエステル Gly-Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Thr-Cys(Acm)-S er-Leu-Asn(GlcNAc )_Asp_Ser_Ala_Thr_Glu_Vaト Thr_Giy_His_Arg_Trp_Leu_Lys -Gly-SCH CH COOH 1 (2.3〃 mol， 8.2%)を得た。
[0077] MALDI-TOF MS: found, m/z 3251.8 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 3251.6.
Amino acid analysis: Asp Thr Ser Glu Gly Ala Val lie Leu Lys His
1.94 2.42 2.47 0.94 3 1.11 1.49 0.86 3.78 1.95 0.9
Arg .
8 1.03
[0078] なお、特開平 11-217397号公報記載の方法に準じ、 Fmoc基除去試薬（1-メチルビ 口リジン 25 ml、へキサメチレンィミン 2 ml、 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール 2 g、 1-メ チル -2-ピロリジノン (1-メチル -2-ピロリドン)/ジメチルスホキシド混合溶媒 (容量比 1/1 )全 100 ml)を用いて同様の反応を行ったところ、収率は 1.8%であった。
[0079] 文献 Fiojo, Η·; Haginoya, Ε·; Matsumoto, Υ·; Nakahara, Υ·; Nabeshima, Κ·; Toole,
Β. P.; Watanabe, Y. Tetrahedron Lett. 2003， 44， 2961—2964·
[0080] 実施例 12— 2 : 0-結合型の 5糖を有する糖ペプチドチォエステル (ェムプリン (34-58):
Gly- Ser- Lys- lie- Leu- Leu- Thr- Cys(Acm)- Ser- Leu- Thr[(Gaト GlcNAc) - GalNAc]-
Asp-Ser- Ala- Thr- Glu- Val-Thr- Gly-His- Arg-Trp-Leu- Lys- Gly- SCH CH COOH
3の合成
[0081] [化 2]
Figure imgf000024_0001
化合物 1を合成する際に得られた樹脂 AsptoBu Se Bu Ala-Th Bu Gh OBut) -Vaト Thr(Bu )- Gly-His(Trt)- Arg(Pbf)- Trp(Boc)- Leu- Lys(Boc)- Gly-N-Et- Cys(Trt)- NH-樹脂 25 a mol分を取り、化合物 2 (83 mg， 37 μ mol)、 1 Μ HOBt/NMP (0.1 ml) 、 1 M DCC/NMP (0.1 ml)を室温で 30分撹拌した溶液を加え、 50 oCで 8時間撹拌し た。残りのアミノ酸配列は、 Fmoc-アミノ酸 (0.1 mmol), DCC (0.15 mmol), HOBt (0.1 5 mmol)の NMP溶液を用いて手動により伸長した。以上のようにして得られた Fmoc-G ly— Ser(Bu )— Lys(Boc)— lie— Leu— Leu— Thr(Bu )— Cys(Acm)— Ser(Bu )— Leu— Thr*— Asp(OB u Ser(Bu )- Ala- Thr(Bu )- Glu(OBu )- Vaト Thr(Bu )- Gly-His(Trt)- Arg(Pbf)_Trp(Boc) - Leu-Lys(Boc)-Gly_N_Et-Cys(Trt)-NH -樹脂 (171 mg)のうち 85 mgを 20% piperidine/ NMPで処理した。得られた樹脂に Reagent (1.5 ml)を加えて室温で 2時間震盪した 後、窒素気流により TFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をェ 一テルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドをさらに Low-TfOH [TfO H/TFA/DMS/m-cresol (1 :5:3: 1， 0.6 ml)]により- 15 °Cで 2時間処理した。エーテルを 加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた 。粗ペプチドを 5% MPAを含む水 (10 ml)に溶解し、室温で 3日間放置した。その後 HP LCにより精製し、ェムプリン (34-58)チォエステル Gly_Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Thr-Cys (Acm)-Ser-Leu-Thr[(Gal-GlcNAc) _GalNAc]_Asp_Ser— Ala— Thr— Glu— Vaト Thr— Gly— His- Arg- Trp- Leu- Lys- Gly- SCH CH COOH 3 (0.7 mol， 5.5%)を得た。
[0083] MALDI-TOF MS: found, m/z 3765.8 (M+H)+: calcd. for (M+H)+, 3764.8. Amino acid analysis: Asp Thr Ser Glu Gly Ala Val lie Leu Lys His Arg .
0.97 3.33 2.43 0.94 3 1.15 1.39 0.89 3.80 2.04 1.00 1.00
[0084] [化 3]
-lvェ()9ν11の-SdJD」sl」」コ」ωί55AΛ」ι.ώΛ」-----.--,.Ι
Figure imgf000026_0001
[0085] なお特開平 11-217397号公報記載の方法に準じて同じペプチドチォエステル (ただ し C末端がチォエステルアミドとなっている）を合成したところ、収率は 2.2%であった。
[0086] 文献： Ueki, A.; Nakahara, Υ·; Hop, Η·; Nakahara, Υ. Tetrahedron 2007， 63， 2170— 2181.
[0087] 実施例 12— 3：分子内に 2つの糖鎖を持つムチンペプチド Ac-Va Thr(GalGalNAc)- Ser_Ala_Pro_Asp_ hr-Arg-Pro-Ala-Pro- ly-Ser-Tnr( al alNAc)-Ala-Pro-Pro-A la- His- Gly- SCH CH COOH 5の合成
[0088] [化 4]
Ph
Figure imgf000027_0001
4 Fmoc-T^r
[0089] CLEAR Amide resin (0.25 mmol, 544 mg)を出発物質とし、 Fmoc-N(Et)_Cys(Trt)- OH (307 mg, 0.5 mmol)を 1 M DCC (750〃 1)、 1 M HOBt (750 μ 1)を用いて 50oC で縮合した。ピぺリジンによる脱 Fmocの後、 Fmoc-Gly (372 mg, 1.25 mmol)を HATU
(475 mg, 1.25 mmol), DIEA (327 μ 1， 1.88 mmol)を用いて 50°Cで縮合反応し、 30分 後に DIEA (109 1， 0.63 mmol)を追加し、さらに 30分反応させた。 Fmoc-Glyは、ダブ ルカップリングさせた。 ABI 433Aペプチド合成機を用いて、得られた樹脂上で糖ュニ ット手前までペプチド鎖を伸長した。 0.1 mmol分の樹脂を取り出し、化合物 4 (231 mg,
0.2 mmol)を 0.45 M HBTU-HOBt/DMF (422 μ 1， 0.19 μ mol)と、 DIEA (69.7 ml, 0 .4 mmol)を用いて 50°Cで 1時間反応させた。さらに次の糖ユニットまでをペプチド合 成機により伸長させ、 Fmoc- Thr(GalGalNAc) (231 mg, 0.2 mmol)を 0·45 Μ HBTU-H OBt/DMF (422 μ 1， 0.19 μ mol)と、 DIEA (69.7 ml, 0.4 mmol)を用いて 50°Cで 1時間 反応させた。最後に Fmoc-Val (67.8 mg, 0.2 mmol)を 1 M DCC (300 〃 1)、 1 M HOB t (300 ^ 1)で縮合させ、 N末端が Fmoc基の保護ペプチドを得た。その樹脂の半分を、 脱 Fmoc、および Ac O/DIEA/NMPによる Ac化を行った。得られた樹脂を乾燥させ、 全量（352 mg)を Reagent (5 ml)で 1時間反応させた。反応液を窒素ガスにより除 去し、そこにジェチルエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。この操作を 3回繰り返 し、沈殿を真空乾燥させた。得られたペプチドを Low-TfOH [TfOH/TFA/DMS/m-cr esol (1 :5:3: 1， 4.0 ml)]により- 15 °Cで 2時間処理した。冷やしたジェチルエーテルを 加えて、ペプチドを沈殿させた。この操作を 3回繰り返し、沈殿を真空乾燥させた。乾 燥後、 2 mlの蒸留水に溶解し、 5%のメルカプトプロピオン酸を加え、 2日間反応させた 。 HPLCにより精製し、 目的とする糖ペプチドチォエステル 5を得た。得られたペプチド は、 18.9 mg (6.9 mmol, 14%)であった。
[0090] MALDI-TOF MS: found: m/z 2747.74 (M+H)+, calcd for: 2747.20 (M+H)+.
Amino acid analysis: Asp Thr Ser Pro Gly Ala Val His Arg .
1.00 2.73 1.93 5.05 2.00 3.88 0.96 1.00 0.96
[0091] [化 5]
r-
Figure imgf000028_0001
実施例 12— 4：無保護の 9糖を持つアミノ酸を利用した糖ペプチドチォエステル [CCL 27(37_69)]の合成例（図 6)
Fmoc-CLEARアミド樹脂 (430 mg, 0.2 mmol)を 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分 処理した。この樹脂に Fmoc- N_Et- Cys(Trt) (245 mg, 0.4 mmol), 1 M HOBt/NMP (0 .5 ml) 1 M DCC/NMP (0.5 ml)を 30分間反応させた溶液を加え、 1時間反応させた。 NMPで洗浄後、樹脂を 10% Ac 0-5% DIEA / NMP中で 5分間震盪した。 NMPによる 洗浄後、 20%ピぺリジン/ NMPで 5分、 15分処理した。 Fmoc-Gly (300 mg, 1.0 mmol )、 HATU (360 mg, 0.95 mmol), DIEA (0.35 ml, 2.0 mmol)を加えて 50 °Cで 1時間反 応させた。もう一度同量の Fmoc_Gly、 HATU, DIEAを加えて 50 °Cで 1時間反応させ た。得られた樹脂上でペプチド合成機を用いて FastMoc法によりペプチド鎖を伸長し 、 Arg(Pbf)-Ser(Bt)- Leu- Ala- Arg(Pbf) -Trp(B oc)-Leu- Glu(OBu )-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂を得た。得ら れた樹脂 19 mol分を取り、 Fmoc-Asn[(Gal-GlcNAc-Man) Man-GlcNAc ] (57 mg, 2 mol)、 DEPBT(17 mg、 57 μ mol), DIEA (20 μ 1， 104 μ mol)を DMSO(0.4 ml)に溶 解した溶液を加えた。 50 °Cで 3時間震盪した後、 NMPで洗い、 Z(Cl)-OSu(57 mg, 0.2 mmol), DIEA (0.07 ml, 0.4 mmol)を ΝΜΡ(0·4 ml)に溶解した溶液を加えて室温で 20 分間震盪した。残りのアミノ酸配列は、 Fmoc-アミノ酸（0.1 mmol), DCC (0.15 mmol) 、 HOBt (0.15 mmol)の NMP溶液 (2.5 ml)を用いて手動により伸長した。このようにして 得られた Fmoc-Asp OBt^-Cys Acn^-His Tr -Leu-GWTr -Ala-Vaト Vaト Leu_His( Trt)-Leu-Ala-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser-Val-Cys(Acm)-Val-His(Trt)-Pro-Gln(Trt)-As n[(Gal-GlcNAc-Man)2Man-GlcNAc2]-Arg(Pbi)-Ser(But)-Leu-Ala-Arg(Pbi)-Trp(Bo c Leu-Gli OBuVArg Pb -GlnCTrO-Gly-N-Et-CysCTrO-NH-樹脂 (0· 17 g)に Reag ent (3.5 ml)を加えて室温で 2時間震盪した後、窒素気流により TFAを除去し、ェ 一テルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで 3回洗浄した後、減圧下で 乾燥させた。粗ペプチドを 2%メルカプトフエニル酢酸（MPAA)を含む 10%ァセトニトリ ル水溶液（30 ml)に溶解し、室温で 2日間放置した後 HPLCにより精製し、 CCL27(37_ 69)チォエステル Fmoc- Asp- Cys(Acm)- His- Leu- Gin- Ala- Va卜 Va卜 Leu- His- Leu- Al a-Arg-Arg-Ser-Val-Cys(Acm)-Val-His-Pro-Gln-Asn[(Gal-GlcNAc-Man) Man-Glc NAc ]- Arg- Ser- Leu- Ala- Arg- Trp_Leu- Glu- Arg_Gln- Gly- SC H CH COOH (3.4 m
2 6 4 2 g， 0.57 ^ mol, 3.0%)を得た。
[0093] MALDI-TOF MS: found: m/z 5989.6 (M+H)+, calcd for: (M+H)+ 5988.6.
Amino acid analysis: Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Met lie Le
0.95 1.68 2.81 4.43 3.99 1.00 1.07 0.62 0.97 0.52 u Tyr His Arg .
6.84 0.75 0.90 3.66
産業上の利用可能性
[0094] 本発明によると、タンパク質や糖タンパク質の化学合成に必須のペプチドチォエス テルや N-結合型や 0-結合型の糖ペプチドチォエステルを高収率で固相合成するこ とができる。この方法によって得られたタンパク質や糖タンパク質は、医薬品の製造に 禾 IJ用すること力できる。また、本発明で製造した糖タンパク質は、天然由来の糖タン ノ ク質と同様の活性、例えば繊維芽細胞からのマトリックスメタ口プロティナ一ゼ産生 促進効果を示すことが予想される。
図面の簡単な説明
[0095] [図 1]図 1は、本発明によるペプチドチォエステルの製造方法の概要を示す。
[図 2]図 2は、 N-アルキルシスティン誘導体の製造方法を示す。
[図 3]図 3は、モデルペプチドとして Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Glyを 用いた場合のペプチド合成およびチォエステル化の概要を示す。 [図 4]図 4は、 N-ェチル-システィンを用いた場合の反応経過を示す。 *は MPA由 来のピークを示す。
[図 5]図 5は、キトビオース (GlcNAc )を持つェムプリン (34-58)チォエステルの合成ル ートを示す.
[図 6]図 6は、 9糖を持つ CCL27(37_69)チォエステルの合成ルートを示す。

Claims

請求の範囲
[1] (i) Fmoc- NH -樹脂を脱保護して、 Fmoc- (アミノ酸残基) n_N (R) _CH (CH SY) - C ( =〇）OH(nは 0または 1)を反応させることによって Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) - CH (CH SY) -C ( = 0) NH-樹脂を製造する工程；
(ii)工程（i)で得た Fmoc- (アミノ酸残基) n-N (R) -CH (CH SY) _C ( = O) NH-樹 脂 (nは 0または 1)の Fmoc基を脱保護してから、必要に応じて、 Fmoc-アミノ酸を反応 させることによって、 Fmoc- (アミノ酸残基) n_N (R) -CH (CH SY) - C ( = 0) NH-樹 脂 (nはほたは 2)を製造し、以下、 Fmoc基の脱保護と Fmoc-アミノ酸との反応を繰り 返すことによって、 X_N (R) -CH (CH SY) -C ( = 0) -NH-樹脂を製造する工程；
(iii)工程 (ii)で得た X-N (R) -CH (CH S Y) -C ( = O) -NH-樹脂に脱保護試薬を 作用させて樹脂からの脱離とチオール基の脱保護を行う工程、
(iv)工程 (iii)で得た化合物に酸性チオールを作用させて、チォエステル化合物を 製造する工程：
(式中、 Fmocは 9-フルォレニルメトキシカルボ二ル基を示し、 Rは炭素数 1から 12の アルキル基又は炭素数 7から 12のァラルキル基を示し、 Yはチオール基の保護基を 示し、 Xはペプチド残基を示す。）を含む、ペプチドチォエステルの製造方法。
[2] 工程 (iii)における脱保護試薬が、トリフルォロ酢酸である、請求項 1に記載の方法。
[3] 工程（iv)における酸性チオール力 S、メルカプトカルボン酸、又はメルカプタンとカルボ ン酸の混合物である、請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 工程（iv)における酸性チオールが、 HSCH CH COOH(MPA)、又は HSC H CH C
2 2 6 4 2
OOH(MPAA)である力、、あるいはチォフエノールと酢酸の混合物である、請求項 1から 3の何れかに記載の方法。
[5] Rがメチル基、ェチル基、イソブチル基又はべンジル基である、請求項 1から 4の何れ かに記載の方法。
[6] Yがトリチル基である、請求項 1から 5の何れかに記載の方法。
[7] Z-N (R) -CH (CH SY) _C ( = 0) OH (式中、 Zは水素原子又は 9_フルォレニルメト キシカルボ二ル基を示し、 Rは炭素数 1から 12のアルキル基又は炭素数 7から 12の ァラルキル基を示し、 Yはチオールの保護基を示す）で表される化合物。
[8] (i)YSCH CH (NH ) C ( = 0) OH (式中、 Yはチオール基の保護基である）で表さ れる化合物と、 I^CHO (式中、 R1は水素原子又は炭素数 1から 11のアルキル基又は 炭素数 6から 11のァリール基を示す）で表される化合物とを反応させて、 YSCH CH (N = CHR1) C ( = O) OH (式中、 Y及び R1は上記と同義である）で表される化合物を 製造する工程；
(ii)工程（i)で得た YSCH CH (N = CHR1) C ( = 0) OH (式中、 Y及び R1は上記と 同義である）で表される化合物に水素化剤を作用させて、 YSCH CH (NHCH R1) C ( = 0) OH (式中、 Y及び R1は上記と同義である）で表される化合物を製造し、所望 により 9-フルォレニルメトキシカルボニル -N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを作用 させて、アミノ基を 9-フルォレニルメトキシカルボニル基で保護する工程： を含む、請求項 7に記載の化合物の製造方法。
[9] 工程 ）における水素化剤が、 NaBH、又は NaBH CNである、請求項 8に記載の方
4 3
法。
PCT/JP2007/069555 2006-10-06 2007-10-05 Procédé de production de peptide thioester WO2008044628A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008538697A JP5119159B2 (ja) 2006-10-06 2007-10-05 ペプチドチオエステルの製造方法
EP07829293A EP2085403A4 (en) 2006-10-06 2007-10-05 PROCESS FOR PRODUCTION OF THIOESTER PEPTIDE
US12/444,270 US20110184148A1 (en) 2006-10-06 2007-10-05 Method for Producing Peptide Thioester

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-275022 2006-10-06
JP2006275022 2006-10-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008044628A1 true WO2008044628A1 (fr) 2008-04-17

Family

ID=39282824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/069555 WO2008044628A1 (fr) 2006-10-06 2007-10-05 Procédé de production de peptide thioester

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110184148A1 (ja)
EP (1) EP2085403A4 (ja)
JP (1) JP5119159B2 (ja)
WO (1) WO2008044628A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010041425A1 (ja) * 2008-10-07 2010-04-15 学校法人東海大学 ペプチドの製造方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2534168A4 (en) * 2010-02-09 2013-07-24 Univ Ben Gurion CHEMICAL PREPARATION OF UBIQUITIN THIOESTERS AND MODIFICATIONS THEREOF
FR2985259B1 (fr) * 2012-01-03 2016-12-09 Centre Nat De La Rech Scient - Cnrs - Peptides c-alpha-amides, leurs procedes de preparation et leurs utilisations comme precurseurs de peptides c-alpha-thioesters pour la synthese de proteines.
US10669306B2 (en) 2016-02-04 2020-06-02 University Of Washington Solid supports for use in solid-phase peptide synthesis, kits, and related methods

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5553248A (en) * 1978-10-11 1980-04-18 Hoffmann La Roche Cyclohexadiene derivative
JPH11217397A (ja) 1997-11-27 1999-08-10 Saburo Aimoto ペプチドチオールエステルの製造方法
JP2002030050A (ja) * 2000-07-19 2002-01-29 Sumitomo Chem Co Ltd アミン化合物、中間体、製造法および光学分割剤
JP2002526387A (ja) * 1998-09-30 2002-08-20 ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド インテイン媒介ペプチド連結

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7001745B1 (en) * 1998-09-30 2006-02-21 New England Biolabs, Inc. Intein mediated peptide ligation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5553248A (en) * 1978-10-11 1980-04-18 Hoffmann La Roche Cyclohexadiene derivative
JPH11217397A (ja) 1997-11-27 1999-08-10 Saburo Aimoto ペプチドチオールエステルの製造方法
JP2002526387A (ja) * 1998-09-30 2002-08-20 ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド インテイン媒介ペプチド連結
JP2002030050A (ja) * 2000-07-19 2002-01-29 Sumitomo Chem Co Ltd アミン化合物、中間体、製造法および光学分割剤

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAYO-PUXAN N. ET AL.: "Total Solid-Phase Synthesis of the Azathiocoraline Class of Symmetric Bicyclic Peptides", CHEM. EUR. J., vol. 12, 4 December 2006 (2006-12-04), pages 9001 - 9009, XP002513162, DOI: doi:10.1002/chem.200600815 *
HIRONOBU HOJO ET AL.: "N-Alkyl cysteine-assisted thioesterification of peptides", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 48, no. 1, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 25 - 28, XP005785943 *
LIU J.-F. ET AL.: "A Convenient Synthesis of N-Fluorenylmethoxycarbonyl-N-Methyl-L-Cysteine Derivatives [Fmoc,Me-Cys(R)-OH]", SYNTHESIS, no. 11, 2002, pages 1499 - 1501, XP003022163 *
OZAWA C. ET AL.: "Synthesis of Glycopeptide Dendrimer with Thioester Prepared by a new Method", THE JAPANESE SOCIETY OF CARBOHYDRATE RESEARCH NENKAI YOSHISHU, vol. 27, 10 July 2007 (2007-07-10), pages 135, XP003022164 *
See also references of EP2085403A4
TORU KAWAKAMI ET AL.: "Peptide Thioester preparation based on an N-S acyl shift reaction mediated by a thiol ligation auxiliary", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 46, 2005, pages 8805 - 8807, XP005161812 *
UEKI, A. ET AL., TETRAHEDRON, vol. 63, 2007, pages 2170 - 2181

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010041425A1 (ja) * 2008-10-07 2010-04-15 学校法人東海大学 ペプチドの製造方法
JPWO2010041425A1 (ja) * 2008-10-07 2012-03-01 学校法人東海大学 ペプチドの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2008044628A1 (ja) 2010-02-12
EP2085403A1 (en) 2009-08-05
EP2085403A4 (en) 2012-12-19
JP5119159B2 (ja) 2013-01-16
US20110184148A1 (en) 2011-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9175053B2 (en) Chemical preparation of ubiquitin thioesters and modifications thereof
JP5328345B2 (ja) ペプチドのチオエステル化合物の製造方法
KR20110056536A (ko) 프람린티드의 제조 방법
WO2009003666A1 (en) Process for the production of pramlintide
Haase et al. Extending the scope of native chemical peptide coupling
JP5119159B2 (ja) ペプチドチオエステルの製造方法
JP2004507557A (ja) 求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物、製造および使用の方法
WO2007100358A2 (en) Convergent synthesis of proteins by kinetically controlled ligation
US8076299B2 (en) Method for producing peptide thioester
KR20150114111A (ko) 데스모프레신의 제조방법
JP4793644B2 (ja) ケージドペプチドの合成法
JPH11217397A (ja) ペプチドチオールエステルの製造方法
WO2010041425A1 (ja) ペプチドの製造方法
US9683015B2 (en) Peptide C alpha-amides, methods for preparing same and uses thereof as precursors of peptide C alpha-thioesters for protein synthesis
JP2010538063A (ja) ポリペプチドおよび蛋白質の化学的合成のための方法および中間体
WO2003093301A2 (en) Process for the synthesis of peptides
WO2000005208A9 (en) Amino-aldehyde solid support, linker therefor and methods of preparation and use thereof
JPH0525196A (ja) 環状ペプチドの合成方法

Legal Events

Date Code Title Description
DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07829293

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008538697

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007829293

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12444270

Country of ref document: US