JPWO2010041425A1 - ペプチドの製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明の課題は、従前のチオール補助基を利用したネイティブケミカルライゲーション法と比べて、良好なライゲーション効率であり、かつペプチドの他の官能基に対する副反応が生じにくいライゲーション反応を利用した、ペプチドの新規な製造方法を提供することである。本発明によれば、第一のペプチド及び第二のペプチドを還元剤の存在下で反応させて、第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物を得る工程を含むペプチドの製造方法であって、第一のペプチドは、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含み、及び第二のペプチドは、チオール補助基を有するセリン若しくはトレオニン誘導体をＮ末端に含む、前記方法が提供される。

Description

本発明は、ペプチドの新規な合成方法に関する。より詳細には、本発明は、チオール補助基を有するセリン又はトレオニン誘導体、及びチオエステル基を有するアミノ酸誘導体を利用したペプチドの新規な合成方法に関する。
ペプチドを化学的に合成する方法として、固相法により調製されたペプチドチオエステルセグメントを繰り返して縮合するチオエステル法（非特許文献１）及びネイティブケミカルライゲーション法（非特許文献２）が一般的に用いられている。
チオエステル法は、部分的に保護されたペプチドチオエステルの末端チオエステル基を銀イオンで活性化させることにより、セグメント同士の縮合を実現する。一方、ネイティブケミカルライゲーション法では、保護基を持たないペプチドチオエステルの末端チオエステル基と、他方のペプチドのＮ末端にあるシステイン残基との間で分子間のチオエステル結合を形成させた後、該システイン残基のアミノ基の分子内アミノリシス反応によりペプチド結合を形成させる方法である（図１）。
ネイティブケミカルライゲーション法は、チオエステル法に比べて、固相法により調製したペプチドをそのまま縮合に用いることができるという簡便性を有することから、現在のタンパク質化学合成法の主流となっている。
しかし、ネイティブケミカルライゲーション法は、保護基を持たない末端にチオエステル基を持つペプチドチオエステルとＮ末端にシステインを持つペプチドとの間でしか縮合ができないという問題点があった。
上記問題点を克服するために、これまで多くの研究者によって、ライゲーション後に除去することのできる種々の修飾されたチオール補助基が開発されてきた（図２）。チオール補助基を利用したネイティブケミカルライゲーション法としては、例えば、システインでライゲーションした後に脱硫反応により該システインをアラニンに変換する方法（非特許文献３−５）、β位にチオール補助基を持つフェニルアラニン残基でのライゲーションを行った後に脱硫反応を用いてフェニルアラニンに変換する方法（非特許文献６）、ホモシステインでライゲーションを行った後、メチル化を行い、メチオニン残基に変換する方法（非特許文献７）、図２の８、９に示す如き糖鎖のアセタミド基、水酸基にチオール補助基を結合してライゲーションを行う方法（非特許文献８−１２）、さらには、側鎖カルボキシル基にチオール補助基を結合させてライゲーションを行う方法（非特許文献１３）などがある。
しかし、上記した従前のチオール補助基を利用したネイティブケミカルライゲーション法には種々の問題点がある。
非特許文献３−５及び６に記載の方法は、脱硫反応の際に金属触媒を用いるために、ペプチドが金属に吸着されて回収率が低下し、さらにペプチド中のメチオニン残基における脱メチルチオール化反応などの副反応が生じ得る。
非特許文献７に記載の方法は、ホモシステイン残基のメチル化の際に、他の官能基もメチル化され得る。
非特許文献８−１２及び１３に記載の方法は、アセタミド基を使う場合には最終的に脱硫反応を行うので上記と同じ状況になり、また、糖鎖水酸基を使う場合には、最終的にアルカリ処理による除去を行うので、糖鎖のβ−脱離やα炭素のラセミ化などが生じる可能性がある。
したがって、従前のチオール補助基を利用したネイティブケミカルライゲーション法は、ライゲーションの効率が低く、かつペプチド中の種々のアミノ酸残基中の官能基に対して副反応が生じる可能性があった。
Hojo, H.; Aimoto, S. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1991, 64, 111-117 Dawson, P. E.; Muir, T. W.; Clark-Lewis, I.; Kent, S. B. Science 1994, 266, 776-779 Yan, L. Z.; Dawson, P. E. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533. Pentelute, B. L.; Kent, S. B. H. Org. Lett. 2007, 9, 687-690. Wan, Q.; Danishefsky, S. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 9248-9252. Crich, D.; Banerjee, A. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 10064-10065. (Phe)X-Met site Saporito, A.; Marasco, D.; Chambery, A.; Botti, P.; Monti, S. M.; Pedone, C.; Ruvo, M. Biopolymers 2006, 83, 508-518. Brik, A.; Ficht, S.; Yang, Y.-Y.; Bennett, C. S.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 15026-15033. Brik, A.; Yang, Y.-Y.; Ficht, S.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 5626-5627. Yang, Y.-Y.; Ficht, S.; Brik, A.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 7690-7701. Payne, R. J.; Ficht, S.; Tang, S.; Brik, A.; Yang, Y.-Y.; Case, D. A.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 13527-13536. Ficht, S.; Payne, R. J.; Brik, A.; Wong, C.-H. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5975-5979.Side-chain auxiliary Lutsky, M.-Y.; Nepomniaschiy, N.; Brik, A. Chem. Commun. 2008, 1229-1231.
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、従前のチオール補助基を利用したネイティブケミカルライゲーション法と比べて、良好なライゲーション効率であり、かつペプチドの他の官能基に対する副反応が生じにくいライゲーション反応を利用した、ペプチドの新規な製造方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、該製造方法に用いる、新規なチオール補助基を有する化合物を提供することを解決すべき第二の課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体を含む第一のペプチド及びチオール補助基を有するセリン若しくはトレオニン誘導体を含む第二のペプチドを、還元剤の存在下で反応させることにより、良好なライゲーション効率であり、かつペプチドの他の官能基に対する副反応を生じることなく、第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、第一のペプチド及び第二のペプチドを還元剤の存在下で反応させて、第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物を得る工程を含むペプチドの製造方法であって、第一のペプチドは、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含み、及び第二のペプチドは、チオール補助基を有するセリン若しくはトレオニン誘導体をＮ末端に含む、前記方法が提供される。
本発明の製造方法の好ましい態様は、チオール補助基が、ジスルフィド結合を含む基である。
本発明の製造方法の好ましい態様は、還元剤が、ホスフィン系化合物である。
本発明の製造方法の好ましい態様は、第一のペプチドは−ＣＯ−Ｓ−Ｒ基
（式中、Ｒはカルボキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜１２のアルキル基又はカルボキシル基で置換されていてもよい炭素数７〜１２のアリール基を示す）
を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含み、
第二のペプチドは−Ｒ2−Ｓ−Ｙ1基
（式中、Ｙ1はチオール補助基の保護基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいメチレン基を示す）
を有するセリン若しくはトレオニン誘導体をＮ末端に含む。
本発明の別の側面によれば、下記式１
Figure 2010041425
 （Ｙ1はチオール補助基の保護基を示し、Ｙ2はアミノ基の保護基を示し、Ｒ1は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいメチレン基を示し、ｎは１〜３の整数を示す）
で表される化合物が提供される。
本発明の化合物の好ましい態様は、Ｙ1はｔ−ブチル基であり、Ｙ2は９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、Ｒ1は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2はメチレン基であり、及びｎは２である。
本発明のペプチドの製造方法によれば、ライゲーションに関与するチオール補助基がライゲーション反応終了後に自発的に分解するために、該チオール補助基を除去する反応を特別に必要としない。したがって、本発明のペプチドの製造方法は、従前のチオール補助基を利用したネイティブケミカルライゲーション法と比較して、副反応の生じる可能性が低く、良好なライゲーション効率を示す。この有用性によって、本発明のペプチドの製造方法は、安定性の高いペプチドを簡便かつ大量に生産することを可能とする、工業的に実用性の高いペプチドの製造方法である。
図１は、ネイティブケミカルライゲーション法の概要を示す。 図２は、これまでにライゲーションに用いられたチオール補助基の例を示す。 図３は、本発明によるペプチドの製造方法の概要を示す。（Ａ）は、本発明のペプチドの製造方法について、想定される中間体Ａを介したライゲーション反応経路を示す。（Ｂ）は、本発明のペプチドの製造方法において、Ｎ末端側のペプチドのＣ末端のチオエステル基と、Ｃ末端側のペプチドのＮ末端のチオール補助基とが、ライゲーションすることを示した図である。 図４は、チオール補助基を有するセリン若しくはトレオニン誘導体の合成経路を示す。 図５は、チオール補助基を有するセリン又はトレオニン誘導体を末端に含む第二のペプチドの合成経路を示す。 図６は、実施例１（６）のペプチド１７の合成を確認したＨＰＬＣの結果を示す。図は、表１の条件４で２４時間ライゲーションを行った後のＨＰＬＣ結果を示す。計算値は以下の通り。C末端側鎖チオール補助基なし : 1427.78 ライゲーションしたもの : 1997.97 N末端がC末端に対し2カ所つながったもの : 2568.16 図７は、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含む第一のペプチドの合成経路を示す。
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。本発明の方法においては、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含む第一のペプチド及びチオール補助基を有するセリン若しくはトレオニン誘導体をＮ末端に含む第二のペプチドを、還元剤の存在下で反応させることにより、第一のペプチドのアミノ酸誘導体のチオエステル基と第二のペプチドのセリン若しくはトレオニン誘導体のチオール補助基との間で分子間チオエステルを形成し、次いで分子内転位を経てアミド結合を形成し、次いでチオール補助基の除去が起こり、最終的に第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物が得られる（図３）。
以下、本明細書に記載の実施例に示した糖ペプチドの合成を通して、本発明を説明する。まず、図４に記載の方法により、チオール補助基を持つ２種類のアミノ酸誘導体（セリン誘導体、及びトレオニン誘導体）の合成を行った。アミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）で保護し、かつカルボキシル基をｔ−ブチル基（Ｂｕt）で保護したセリン又はトレオニンを出発物質として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／Ａｃ2Ｏ／ＡｃＯＨにより側鎖水酸基をメチルチオメチル化し、次いでチオトシル酸カリウム（ＴｓＳＫ）及びｔ−ブチルメルカプタンと反応させてジスルフィド体へと変換した。得られたジスルフィド変換体をＴＦＡ処理してＢｕtエステルを除去し、下記式２
Figure 2010041425
 （式中、Ｒは水素原子又はメチル基を示す）
のセリン誘導体又はトレオニン誘導体を得た。
上記の通りに得られたセリン誘導体又はトレオニン誘導体を利用して糖ペプチドｃｏｎｔｕｌａｋｉｎ−Ｇ（ｐＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ＧａｌＮＡｃ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ）の合成を試みた。なお、天然のｃｏｎｔｕｌａｋｉｎ−Ｇは、１０位のＴｈｒ残基に結合している糖鎖はＧａｌ−ＧａｌＮＡｃであるが、ここでは本発明に係る反応の進行を確かめるために、１０位のＴｈｒ残基に単糖を持つものを合成することとした。
該糖ペプチドの合成に際して、まず、上記糖ペプチド鎖の６位のＧｌｙ残基と７位のＳｅｒ残基の間で２つに分割したものである、チオール補助基を有するセリン誘導体をＮ末端に含むＣ末端側ペプチド及びチオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含むＮ末端側ペプチドを合成することを試みた。
図５に記載の方法により、Ｃ末端側のペプチドは、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＬＥＡＲ Ａｃｉｄ ｒｅｓｉｎを出発物質として、自動合成機によりＦｍｏｃ法を用いてペプチド鎖を伸長した。伸長したペプチド鎖に、ＨＢＴＵ（2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate）−ＨＯＢｔ（Hydroxybenzotriazole）を利用して常法に従い合成した下記式１２
Figure 2010041425
 で示される化合物１２を導入し、さらにペプチド鎖を伸長した後に、上記のチオール補助基を有するセリン誘導体をＮ，Ｎ' −ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）−ＨＯＢｔ法を利用して導入した。得られたペプチド鎖をＴＦＡで処理し、ペプチドを樹脂から脱離し、次いで脱保護を行った。逆相ＨＰＬＣにより精製し、チオール補助基を有するセリン誘導体をＮ末端に含む下記式１３
Figure 2010041425
 のペプチド１３を得た。
チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含むペプチドであるペプチド１４（ｐＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＳＣ6Ｈ4ＣＨ2ＣＯＯＨ）は、国際公報ＷＯ２００８／０４４６２８号に記載の方法を参照して合成した（図７）。
上記により得られた２種のペプチド１３及び１４を表１に示す種々の条件でライゲーション法により縮合した。
Figure 2010041425
まず、ペプチド１３及び１４を１：１のモル比で０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）に溶解し、０．２Ｍ メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）を加えてライゲーションを試みた（表１の条件１）。この条件下では、メルカプトフェニル酢酸は、ペプチド１４のチオエステル結合の加水分解を抑制するとともに、ジスルフィド結合により保護されたペプチド１３のチオール補助基を還元してライゲーションを開始させる働きを持つことが予測された。しかし、ライゲーションは全く進行せず、チオール補助基が除去されたＣ末端ペプチドとＮ末端のチオエステル、その加水分解物が得られたのみであった。この結果から、チオール補助基は、還元されて遊離のチオール基の状態になると速やかに分解すること、２つのペプチド間でチオエステル結合が形成された後の分子内アミノリシスは、Ｃｙｓ残基を利用した場合よりかなり遅く、添加したメルカプトフェニル酢酸により速やかにチオエステル交換が起こることが予測された。そこで、添加したチオールとのチオエステル交換を抑制するため、以後の条件２〜４ではチオール非存在下でのライゲーションを試みた。また、チオール補助基を遊離のチオール基を持つ状態に還元するため、溶液中に還元剤であるトリスカルボキシエチルホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine；ＴＣＥＰ）を添加することとした。まず、条件２ではＴＣＥＰを含むリン酸緩衝液のみでライゲーションを行ったところ、得られた糖ペプチド１７（ｐＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ＧａｌＮＡｃＢｎ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ）の収率は２５％であった。そこでペプチド間でチオエステル結合を形成した後の加水分解を抑制するため、表１の条件３の如くアセトニトリルを５０％添加してライゲーションを行ったところ、収率は３９％に向上した。さらに、分子間のチオエステルは、１０分程度で速やかに形成されることから、条件４では反応１０分後にジメチルホルムアミドで反応溶液を１０倍に希釈し、分子内アミノリシスを優先させたところ、収率は４９％まで向上した（図６）。
以上の結果から、本発明のペプチドの製造方法は、ライゲーション後の除去反応を要しないために除去反応時の副反応の懸念がなく、効率的なライゲーションが可能な実用性の高い方法であることがわかった。さらに、本発明のペプチドの製造方法は、安定性の高いチオール補助基を用いることにより、ライゲーション収率の一層の向上が見込める方法である。
本発明のペプチドの製造方法は、第一のペプチド及び第二のペプチドを還元剤の存在下で反応させて、第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物を得る工程（以下、連結工程と呼ぶ場合もある）を含む方法である。以下、連結工程について説明する。
連結工程の出発物質である第一のペプチドは、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含む。連結工程の他方の出発物質である第二のペプチドは、チオール補助基を有するセリン誘導体若しくはチオール補助基を有するトレオニン誘導体をＮ末端に含む。
第二のペプチドのセリン若しくはトレオニン誘導体におけるチオール補助基は、還元剤の存在下で、第一のペプチドのアミノ酸誘導体におけるチオエステル基に作用して中間体であるチオエステル縮合体を形成する。形成されたチオエステル縮合体は、自発的に分子内でＳ→Ｎ転移が起こり、次いで該チオール補助基が除去される。したがって、第二のペプチドのＮ末端に存在するセリン若しくはトレオニン誘導体におけるチオール補助基は、第一のペプチドのＣ末端に存在するアミノ酸誘導体におけるチオエステル基に作用するものであれば特に制限されないが、例えば、Ｙ1−（Ｓ）n−Ｒ2−（Ｙ1はチオール補助基の保護基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいメチレン基を示し、ｎは１〜３の整数を示す）であることが好ましく、Ｙ1−（Ｓ）2−Ｒ2−（Ｙ1及びＲ2は上記と同義）がより好ましい。上記Ｒ2は、好ましくはメチレン基であり、より好ましくは水素原子が他の原子や基で置換されたメチレン基であり、さらに好ましくは水素原子が電子吸引性の原子又は基で置換されたメチレン基である。上記Ｒ2の具体例としては、−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＦ3）−、−ＣＨ（Ｆ）−などが挙げられる。第一のペプチドのＣ末端に存在するアミノ酸誘導体におけるチオエステル基は、第二のペプチドのＮ末端に存在するセリン若しくはトレオニン誘導体のチオール補助基による作用を受けるものであれば特に制限されないが、例えば、−ＣＯ−Ｓ−Ｒ基（式中、Ｒはカルボキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜１２のアルキル基又はカルボキシル基で置換されていてもよい炭素数７〜１２のアリール基を示す）が好ましい。上記Ｒにおける、炭素数１〜１２のアルキル基の例はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基などが挙げられ、炭素数７〜１２のアリール基としてはフェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基、メシチル基、クメニル基、フェネチル基、ナフチル基などが挙げられる。上記Ｒにおける、炭素数１〜１２のアルキル基及び炭素数７〜１２のアリール基はそれらの持つ水素原子がカルボキシル基で置換されていてもよい。上記Ｒの好ましい例は、−Ｃ6Ｈ4ＣＨ2ＣＯＯＨである。
セリン若しくはトレオニン誘導体は、例えば、下記式１
Figure 2010041425
 （Ｙ1はチオール補助基の保護基を示し、Ｙ2はアミノ基の保護基を示し、Ｒ1は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいメチレン基を示し、ｎは１〜３の整数を示す）
で示される化合物としてペプチド鎖に導入される。
セリン若しくはトレオニン誘導体において、Ｙ1のチオール補助基の保護基及びＹ2のアミノ基の保護基の例としては、それぞれ異なる、ｔ−ブチル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、トリチル基、アセタミドメチル基、ベンジル基、４−メチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルメルカプト基、第三ブチルメルカプト基などが挙げられる。Ｙ1は好ましくはｔ−ブチル基であり、Ｙ2は好ましくは９−フルオレニルメトキシカルボニル基である。
セリン若しくはトレオニン誘導体において、Ｒ2は、好ましくはメチレン基であり、より好ましくは水素原子が他の原子や基で置換されたメチレン基であり、さらに好ましくは水素原子が電子吸引性の原子又は基で置換されたメチレン基である。Ｒ2の具体例としては、−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＦ3）−、−ＣＨ（Ｆ）−などが挙げられる。チオール補助基の安定性を高めてライゲーション収率を挙げるためには、−ＣＨ（Ｆ）−、−ＣＨ（ＣＦ3）−などの置換されているメチレン基であることが好ましい。
セリン若しくはトレオニン誘導体において、硫黄原子の数を示すｎの整数の範囲は１〜３であることが好ましく、１〜２であることがより好ましく、２であることがさらに好ましい。
セリン若しくはトレオニン誘導体の合成は以下の通りである（図８）。
まず、アミノ基をＦｍｏｃで保護し、かつカルボキシル基をＢｕtで保護したセリン又はトレオニンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルエチルスルホキシド、ジエチルスルホキシドなどの硫黄含有化合物、並びにＡｃ2Ｏ及びＡｃＯＨと反応させて、側鎖水酸基をアルキルチオアルキル化する。反応は適温（例えば、１０〜６０℃）で所定の時間だけ行うことができる。アルキルチオアルキル化体は、例えば、沈殿物として回収することができる。さらに、生じた沈殿物を酢酸エチルなどの適当な溶媒で溶解した後に、飽和重曹水、飽和食塩水などで順次洗浄することもできる。得られたアルキルチオアルキル化体は、適宜、乾燥及び濃縮などの操作を経た後に、分離精製される。分離精製には、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーを用いることが好ましい。
次に、アルキルチオアルキル化体からジスルフィド変換体を得る場合は、以下の操作を行なう。
分離精製されたアルキルチオアルキル化体を中和剤、好ましくはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含む塩基性溶媒に適温（例えば、−１０〜１０℃）で所定の時間だけ溶解して中和し、次いでハロゲン化剤、好ましくは塩化スルフリルを含む溶媒と適温（例えば、１０〜６０℃）で所定の時間だけ混和してアルキルチオアルキル基をハロゲン化し、次いでチオール基へと変換する薬剤、好ましくはチオトシル酸カリウムを含む溶媒と適温（例えば、１０〜６０℃）で所定の時間だけ混和してハロゲンをチオールに置換する。さらにこれにＢｕt−ＳＨを加えて適温（例えば、１０〜６０℃）で所定の時間だけ撹拌し、適当な有機溶媒で希釈してジスルフィド変換体を得る。得られたジスルフィド変換体を含む有機層を適当な水性溶媒（例えば、飽和重曹水及び食塩水など）で洗浄することもできる。ジスルフィド変換体は、適宜、乾燥及び濃縮などの操作を経た後に、分離精製される。分離精製には、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーを用いることが好ましい。なお、同様にして、アルキルチオアルキル化体からトリスルフィド変換体を得ることもできる。
ジスルフィド変換体は、ＴＦＡ、好ましくはチオアニソールを含むＴＦＡにより適温（例えば、１０〜６０℃）で所定の時間だけ溶解される。ＴＦＡ中のチオアニソールはＢｕtエステルの分解によって発生する可能性のあるＢｕtカチオンをトラップし得る。得られたセリン若しくはトレオニン誘導体は、適宜、乾燥及び濃縮などの操作を経た後に、分離精製される。分離精製には、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーを用いることが好ましい。
セリン若しくはトレオニン誘導体の具体例として、上記式１の化合物において、Ｙ1はｔ−ブチル基であり、Ｙ2は９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、Ｒ1は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2はメチレン基であり、及びｎは２であるものが好ましい。
第二のペプチドは、例えば、ペプチド自動合成機により伸長させたペプチド鎖のＮ末端にセリン若しくはトレオニン誘導体を結合することにより合成することができる。例えば、樹脂に結合させたアミノ酸残基を出発物質とし、自動合成機を用いてＦｍｏｃ法により、ペプチド鎖を伸長させる。次いで樹脂結合ペプチドのＮ末端にセリン若しくはトレオニン誘導体（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−Ｂｕt）−ＯＨ）を加えて縮合させる。次いで得られた樹脂の末端Ｆｍｏｃを除去し、乾燥後、ＴＦＡ：フェノール：蒸留水：チオアニソールの混合液を加えて撹拌する。液を窒素ガスにより除去しジエチルエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させる。次いで沈殿を真空乾燥させた後に、アセトニトリル水溶液でペプチドを抽出し、樹脂をろ過する。逆相ＨＰＬＣにより精製することにより、第二のペプチドを得ることができる。第二のペプチドの合成における反応は、適温（例えば、１０〜６０℃）で所定の時間だけ行うことができる。なお、ペプチド鎖の伸長において、糖などで修飾されたアミノ酸残基を常法に従って導入することもできる。例えば、ペプチド鎖を延長させた樹脂にＦｍｏｃで保護された糖修飾アミノ酸を、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ／ＤＭＦ及びＤＩＥＡをＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した溶液に加え、適温（例えば、５０℃）で所定の時間だけ反応させることにより、ペプチド鎖上に糖修飾アミノ酸残基を加えることができる。このようにして得られる第二のペプチドの具体例としては、上記ペプチド１３を挙げることができる。
第一のペプチドの合成は、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含むペプチドを得ることができれば特に制限されないが、例えば、Ｂｏｃ法を用いた直接合成法（Hojo, H.; Aimoto, S. Bull. Chem. Soc. Jpn., 64, 111- 117, (1991)）、Ｆｍｏｃ法を用いた直接合成法（Li, X.; Kawakami, T.; Aimoto, S. Tetrahedron Lett., 39, 8669-8672, (1998)）、Ｆｍｏｃ法を用いたペプチド鎖を構築した後にＣ末端をチオエステル化する方法（Shin, Y.; Winans, K. A.; Backes, B. J.; Kent, S. B. H.; Ellman, J.A.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc., 121, 11684-11689, (1999)）などにより実施することができ、さらに、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６９５５５号に記載の方法によっても実施できる。以下、国際公報ＷＯ２００８／０４４６２８号に記載の方法について説明する。
国際公報ＷＯ２００８／０４４６２８号に記載の方法によれば、下記工程（ｉ）から（ｉｖ）を経ることにより、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端側に含むペプチドを合成することができる。
工程（ｉ）は、例えば、Ｆｍｏｃ−ＣＬＥＡＲ アミド樹脂をピペリジン／Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）で処理することによってＦｍｏｃ基を脱保護し、この樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨを、ＨＯＢｔ／ＮＭＰ、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／ＮＭＰを反応させることによって行うことができる。反応は適温（例えば、４０〜６０℃）で所定の時間だけ行うことができる。
Ｆｍｏｃ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨのＲは炭素数１から１２のアルキル基又は炭素数７から１２のアラルキル基を示す。アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを挙げることができ、これらは直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれの炭化水素基でもよい。アラルキル基の例としては、ベンジル基などを挙げることができる。Ｒは好ましくは、メチル基、エチル基、イソブチル基又はベンジル基である。
工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で得たＦｍｏｃ−（アミノ酸残基）ｎ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−樹脂（ｎは０または１）のＦｍｏｃ基を脱保護してから、必要に応じて、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を反応させることによって、Ｆｍｏｃ−（アミノ酸残基）ｎ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−樹脂（ｎは１または２）を製造し、以下、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃ−アミノ酸との反応を繰り返すことによって、Ｘ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−樹脂を製造する工程である。なお、工程（ｉ）において、Ｆｍｏｃ−（アミノ酸残基）ｎ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（ｎは１）を反応させることによってＦｍｏｃ−（アミノ酸残基）ｎ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−樹脂を製造した場合は、工程（ｉｉ）においては、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を反応させてもよいし、反応させなくてもよい。
工程（ｉｉ）では具体的には、工程（ｉ）の反応生成物をＮＭＰで洗浄後、樹脂をＡｃ2Ｏ−ＤＩＥＡ／ＮＭＰ中で５分間振盪する。ＮＭＰによる洗浄、及びピペリジン／ＮＭＰによるＦｍｏｃ基の除去を行った後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、ヘキサフルオロリン酸 Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）をＮＭＰに溶解した溶液を加えて反応を行う。反応は適温（例えば、４０〜６０℃）で所定の時間だけ行うことができる。次いで、反応産物をＮＭＰで洗浄後、通常のペプチド合成機を用いて、例えば、ＦａｓｔＭｏｃ法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃ−アミノ酸との反応を繰り返すことによって、ペプチド鎖を伸長することができる。
工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）で得たＸ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−樹脂に脱保護試薬（例えば、トリフルオロ酢酸など）を作用させて樹脂からの脱離とチオール基の脱保護を行う工程である。具体的には、工程（ｉｉ）の生成物（樹脂）に、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋを加えて室温で反応することができる。ここで、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋとは、ＴＦＡ：Ｈ2Ｏ：チオアニソール：エタンジチオール：フェノール＝８２．５：５：５：２．５：５の試薬である。
工程（ｉｖ）は、工程（ｉｉｉ）で得た化合物に酸性チオールを作用させて、チオエステル化合物を製造する工程である。ここで用いる酸性チオールの具体例としては、メルカプトカルボン酸、又はメルカプタンとカルボン酸の混合物を挙げることができる。さらに好ましくは、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ（ＭＰＡ）、又はＨＳＣ6Ｈ4ＣＨ2ＣＯＯＨ（ＭＰＡＡ）、あるいはチオフェノールと酢酸の混合物を用いることができる。
工程（ｉｖ）では、工程（ｉｉｉ）の産物から窒素気流によりＴＦＡを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせる。沈殿物をエーテルで洗浄した後、乾燥させる。粗ペプチドをＴＦＡを含むアセトニトリル水溶液で抽出し、３−メルカプトプロピオン酸水溶液あるいは４−メルカプトフェニル酢酸などの酸性チオールのアセトニトリル等の水溶液で希釈し、数時間から数十時間放置することによって、Ｘ−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨあるいはＸ−Ｓ−Ｃ6Ｈ4ＣＨ2ＣＯＯＨで表されるペプチドチオエステル化合物を得ることができる。
以上の工程（ｉ）〜（ｉｖ）により得られる第一のペプチドの具体例として、上記ペプチド１４を挙げることができる。
さらに、Ｚ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、Ｚは水素原子又は９−フルオレニルメトキシカルボニル基を示し、Ｒは炭素数１から１２のアルキル基又は炭素数７から１２のアラルキル基を示し、Ｙはチオールの保護基を示す）で表される化合物（Ｒ及びＹで表される基の詳細は上記の通り）の合成は以下の通りである。
まず、ＹＳＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、Ｙはチオール基の保護基である）（即ち、チオール基を保護したシステイン）で表される化合物と、Ｒ1ＣＨＯ（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１から１１のアルキル基又は炭素数６から１１のアリール基を示す）で表される化合物とを反応させて、ＹＳＣＨ2ＣＨ（Ｎ＝ＣＨＲ1）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、Ｙ及びＲ1は上記と同義である）で表される化合物を製造する。ここで、Ｒ1が示すアルキル基は、好ましくは炭素数１から９のアルキル基であり、さらに好ましくは炭素数１から６のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを挙げることができ、これらは直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれの炭化水素でもよい。Ｒ1は特に好ましくはメチル基、イソプロピル基又はフェニル基である。Ｒ1ＣＨＯで表される化合物との反応は、チオール基を保護したシステインをエタノールと水酸化カリウムを含む水に溶解し、これにＲ1ＣＨＯで表される化合物を添加し、適当な温度（例えば、室温など）で所定の時間だけ攪拌することによって行うことができる。
続いて、ＹＳＣＨ2ＣＨ（Ｎ＝ＣＨＲ1）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、Ｙ及びＲ1は上記と同義である）で表される化合物に水素化剤（例えば、ＮａＢＨ4、又はＮａＢＨ3ＣＮ）を作用させて、ＹＳＣＨ2ＣＨ（ＮＨＣＨ2Ｒ1）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、Ｙ及びＲ1は上記と同義である）で表される化合物を製造し、所望により９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（以下、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）を作用させて、アミノ基をＦｍｏｃ基で保護することによって、Ｚ−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＹ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、Ｚは水素原子又は９−フルオレニルメトキシカルボニル基を示し、Ｒは炭素数１から１２のアルキル基又は炭素数７から１２のアラルキル基を示し、Ｙはチオール基の保護基を示す）で表される化合物を製造することができる。水素化剤を作用させる際には、水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下で反応を行ってもよい。具体的には、水素化剤（例えば、ＮａＢＨ4、又はＮａＢＨ3ＣＮ）をＹＳＣＨ2ＣＨ（Ｎ＝ＣＨＲ1）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで表される化合物に添加して、適当な温度で攪拌することによって反応を行うことができる。ＮａＢＨ4を使用するときには、水酸化ナトリウム水溶液に溶解して用いるのが好ましく、ＮａＢＨ3ＣＮを使用するときには塩基を特に必要としない。また、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを作用させてアミノ基をＦｍｏｃ基で保護する際には、適当な溶媒（例えば、１，２−ジメトキシエタンなど）中で、炭酸ナトリウムの存在下において、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを作用させることによってアミノ基をＦｍｏｃ基で保護することができる。
第一のペプチド及び第二のペプチドのライゲーション反応は、還元剤の存在下で、緩衝液、又は緩衝液及び有機溶媒の混合液において実施することができる。
還元剤は、セリン若しくはトレオニン誘導体のチオール補助基を遊離のチオール基を持つ状態に還元することができれば特に制限されないが、例えば、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスヒドロキシメチルホスフィンなどの水溶性ホスフィン、トリメチルホスフィン、トリエチルホスフィン、トリイソプロピルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリフェニルホスフィンなどを用いることが好ましく、水溶性ホスフィンがより好ましく、ＴＣＥＰがさらに好ましい。チオフェノール、メルカプトフェニル酢酸、ｔ−ブチルメルカプタン、ジチオトレイトールなどのチオールを還元剤として用いるとチオエステル交換が生じるために、ライゲーション効率が低下する可能性が高い。還元剤の濃度は、セリン若しくはトレオニン誘導体のチオール補助基を遊離のチオール基を持つ状態に還元することができれば、還元剤の種類によって適宜調整できる。例えば、還元剤がＴＣＥＰである場合は、７．５〜５０ｍＭが好ましく、１５〜３０ｍＭがより好ましい。
第一のペプチド及び第二のペプチドのライゲーション反応に用いる緩衝液は、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを挙げることができ、この中でもリン酸緩衝液が好ましい。また、第一のペプチド及び第二のペプチドのライゲーション反応に用いる緩衝液及び有機溶媒の混合液としては、上記緩衝液とアセトニトリル、ＤＭＦ、ＮＭＰなどの有機溶媒を組み合わせた混合液を挙げることができ、リン酸緩衝液及びアセトニトリルの混合液が好ましい。緩衝液、並びに緩衝液及び有機溶媒の混合液の濃度や混合比は、第一のペプチド及び第二のペプチドの添加量、並びに緩衝液や有機溶媒の種類によって、適宜調整できる。例えば、第一のペプチド及び第二のペプチドの添加量がそれぞれ２０ｎｍｏｌである場合、ライゲーション反応に用いられるリン酸緩衝液の濃度は０．１〜１．０Ｍが好ましく、０．１〜０．５Ｍがより好ましく、０．１〜０．２Ｍがさらに好ましい。また、第一のペプチド及び第二のペプチドの添加量がそれぞれ２０ｎｍｏｌである場合、ライゲーション反応に用いられる０．１Ｍリン酸緩衝液及びアセトニトリルの混合液の混合比は、０．１Ｍリン酸緩衝液とアセトニトリルが１：１の割合で混合していることが好ましい。
ライゲーション反応時のｐＨは５〜９が好ましく、６〜８がより好ましく、７±０．２がさらに好ましい。ライゲーション反応時の温度及び時間は適宜調整でき、例えば、温度は室温（１０〜４０℃）で、時間は第一のペプチドと第二のペプチドの連結物が所定の量だけ得られる時間に設定することができる。
第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物は、通常のペプチドの確認に用いられる方法を制限なく用いることができ、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法が好ましい。
第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物の収率は、以下の方法で測定する。
Ｃ１８カラムを用いて、０．１％（ｖ／ｖ） ＴＦＡを含むアセトニトリル水溶液を溶離液として用いて、第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物をＨＰＬＣにより測定することにより、２８０ｎｍにおける目的物のピーク面積を目的物、未反応Ｃ末端セグメント、Ｃ末端由来の副生成物ピーク面積の合計で除して算出する。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１
（１）化合物１５（Fmoc-Ser(CH2SCH3)-OBut ）の合成
Fmoc-Ser-OBut (2.0 g, 5.2 mmol) にDMSO (10 ml, 140 mmol) とAc2O (6.6 ml, 70 mmol) とAcOH (10 ml, 180 mmol) を加えて室温で2日間反応させた。減圧濃縮した後、沈殿が出来るまで蒸留水を加え、上澄を除去した。沈殿を酢酸エチルに溶解後、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ過後、減圧濃縮して油状物を得、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 230 g, トルエン : 酢酸エチル = 9 : 1) により精製し、化合物１５ (1.8 g, 4.1 mmol 79%) を得た。
Rf 0.48 (トルエン : 酢酸エチル = 5 : 1). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS), δ 7.76 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.61 (m, 2H, Ar), 7.40 (t, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.33 (t, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 5.63 (d, 1H, J = 8.3 Hz, NH), 4.69 (d, 1H, J = 11.7 Hz, O-CH2-S), 4.60 (d, 1H, J = 11.2 Hz, O-CH2-S), 4.44 (m, 1H, αH), 4.39 (m, 2H, Fmoc CH2), 4.24 (brt, 1H, J = 6.8 Hz, Fmoc CH), 3.99 (dd, 1H, J = 3.4, 9.3 Hz, βH), 3.73 (dd, 1H, J = 2.9, 9.3 Hz, βH), 2.12 (s, 3H, S-CH3), 1.46 (s, 9H, But). HRFABMS: calcd for C24H29NO5SNa 466.1664. Found: m/z 466.1632. [α]D= +0.56o (c = 1.0, CHCl3)．
（２）化合物１６（Fmoc-Ser(CH2SSBut)-OBut）の合成
上記化合物１５ (0.67 g, 1.5 mmol) とDIEA (0.31 ml, 1.8 mmol) をジクロロメタン(5.0 ml)に溶解した後、この溶液を0 ℃に冷却した。SO2Cl2 (0.15 ml, 1.9 mmol) を溶解したジクロロメタン(0.5 ml)を加えて溶液を室温で１時間撹拌した後、チオトシル酸カリウム(0.51 g, 2.3 mmol)を溶解したDMF (0.5 ml) を加え、室温で３０分撹拌した。tBu-SH (0.34 ml, 4.7 mmol) を加えて室温で撹拌した。ジクロロメタンで希釈して有機層を飽和重曹水、食塩水で洗浄後、無水塩化カルシウムで乾燥した。塩化カルシウムをろ過した後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン-酢酸エチル、15:1）により精製し、化合物１６ (0.53 g, 1.0 mmol, 68%)を得た。
Rf 0.51(トルエン-酢酸エチル、9:1)．1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS), δ 7.75 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.63-7.60 (m, 2H, Ar), 7.39 (brt, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.30 (brt, 2H, J = 7.6 Hz, Ar), 5.65 (d, 1H, J = 8.3 Hz, NH), 4.85 (d, 1H, J = 11.2 Hz, O-CH2-S), 4.75 (d, 1H, J = 11.2 Hz, O-CH2-S), 4.44 (m, 1H, αH), 4.23 (brt, 1H, J = 7.3 Hz, Fmoc CH), 4.05 (dd, 1H, J = 2.9, 9.3 Hz, βH), 3.81 (dd, 1H, J = 2.7, 9.3 Hz, βH), 1.49 (s, 9H, But), 1.31 (s, 9H, But). HRFABMS: calcd for C27H35NO5S2Na 540.1854. Found: m/z 540.1744. [α]D= +13.77o (c = 1.3, CHCl3)
（３）化合物１０（Fmoc-Ser(CH2SSBut)-OH）の合成
上記化合物１６(110 mg, 0.21 mmol) を５％チオアニソールを含むTFA (1.0 ml)に溶解し、室温で３０分放置した。減圧下溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-メタノール、15：1)により精製し、化合物１０ (60 mg, 0.13 mmol, 61%)を得た。
Rf 0.46 (クロロホルム-メタノール、9:1 1%酢酸を含む)．1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3), δ 7.88 (d, 2H, J = 7.8 Hz, Ar), 7.72 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.41 (brt, 2H, J = 7.5 Hz, Ar), 7.34 (brt, 2H, J = 7.5 Hz, Ar), 4.86 (d, 1H, J = 11.2 Hz, O-CH2-S), 4.81 (d, 1H, J = 10.7 Hz, O-CH2-S), 3.83-3.74 (m, 2H, βH), 1.26 (s, 9H, But). HRFABMS: calcd for C23H27NO5S2Na 484.1228. Found: m/z 484.1244. [α]D= +26.9o (c = 0.75, CHCl3)．
（４）ペプチド１３（Ser(CH2S-S-But)-Asn-Ala-Thr(GalNAcBn)-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH）の合成
Fmoc-Leu-CLEAR Acid resin (0.49 meq / g, 200 mg, 0.1 mmol) を出発物質とし、自動合成機を用いてFastMoc法により、Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Tyr(But)-Ile-Leu-CLEAR Acid resin を得た。その樹脂3分の1量(0.033 mmol)に化合物１２であるFmoc-Thr(GalNAc)-OH (48 mg, 0.066 mmol)、0.45 M HBTU-HOBt/DMF (138 μl, 0.063 mmol)、DIEA (23.0μl, 0.132 mmol) をNMPに溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。さらにFmoc-Ala-OH (33 mg, 0.1 mmol) 、Fmoc-Asn(Trt)-OH (59.7 mg, 0.1 mmol) の縮合を1 M DCC (150μl)、1 M HOBt (150μl) を用いて、順次行なった。最後にFmoc-Ser(CH2-S-S-But)-OH (31 mg, 0.066 mmol) を1 M DCC (99μl)、1 M HOBt (99μl) で縮合した。得られた樹脂の半分量 (0.017 mmol) を末端のFmocを除去し、乾燥後、TFA : フェノール : 蒸留水 : チオアニソール = 85 : 5 : 5 : 5 の液 (1 ml) を加え、30分撹拌した。液を窒素ガスにより除去しジエチルエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。この操作を3回繰り返し、沈殿を真空乾燥させた。50%アセトニトリル水溶液でペプチドを抽出し、樹脂をろ過した。逆相HPLCにより精製し、目的とするペプチド１３ (5.5 mg, 3.6μmol, 収率21%)を得た。
MALDI-TOF MS : found : m/z 1562.01 (M+H)+, calcd for m/z 1561.80 (M+H)+. Amino acid analysis: Asp0.96Thr0.85Ser0.90Pro1.04Ala1.00Ile0.96Leu1.06Tyr0.98Lys1.55.
（５）ペプチド１４（pGlu-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-SC6H4CH2COOH）の合成
Fmoc-CLEAR-Amide resin (0.46 meq / g, 440 mg, 0.2 mmol) を20% ピペリジン/ NMPで処理し（５分x１回、１５分x１回）、NMPにより洗浄した後(1分x5)、Fmoc-(Et)Cys(Trt)-OH (250 mg, 0.4 mmol) 、1 M DCC/NMP (600 μl)、1 M HOBt / NMP(600 μl) を室温で３０分撹拌した溶液を加えて50℃で１時間震盪した。ピペリジンによる脱Fmocの後（５分x１回、１５分x１回）、Fmoc-Gly-OH (300 mg, 1.0 mmol) 、HATU (380 mg, 1.0 mmol)、DIEA (350 μl, 2.0 mmol) を溶解したNMP溶液をくわえ、50℃で１時間震盪した。この反応をもう一度繰り返した。半分量の樹脂 (0.1 mmol) を取り出し後、残りの樹脂をアプライドバイオシステムズ(ABI 433A)自動合成機にかけ、FastMoc法を用いてペプチド鎖を伸長し、Ser(But)-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Gly-CLEAR amide resinを得た。Boc-pGlu-OH (46 mg, 0.20 mmol) を0.45 M HBTU, HOBt / DMF (420μl, 0.19 mmol) とDIEA (70μl, 0.40 mmol) を用いて縮合させ、Boc-pGlu-Ser(But)-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Gly-CLEAR amide resin (330 mg) を得た。樹脂全量をReagent K (TFA : フェノール : 蒸留水 : チオアニソール : 3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol = 82.5 : 5 : 5 : 5 : 2.5) (4.0 ml) で2時間処理した。TFAを窒素ガスにより除去し、そこにジエチルエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。この操作を3回繰り返し、沈殿を減圧下で乾燥させた。沈殿物を6 M尿素を含む30%アセトニトリル水溶液(10 ml)に溶解し、メルカプトフェニル酢酸 (0.2 ml)を加えて1晩反応させた。樹脂をろ過した後、粗ペプチドを逆相HPLCにより精製し、ペプチド１４ (4.3 mg, 5.8μmol, 6%)を得た。
MALDI-TOF MS : found : m/z 739.137 (M+H)+, calcd for: m/z 739.225 (M+H)+. Amino acid analysis : Ser0.75Glu2.63Gly2.01.
（６）ペプチド１７（pGlu-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr(GalNAcBn)-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH）の合成（上記表１を参照）
表１の条件１は、ペプチド１３と１４ (20 nmolずつ)を6 Mグアニジン塩酸及び0.2 M MPAAを含む0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2、4 μl)に溶解し、室温で一夜放置した。表１の条件２は、ペプチド１３と１４ (20 nmolずつ)を7.5 mM トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP) を含む0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0、4 μl)に溶解し、室温で一夜放置した。表１の条件３は、ペプチド１３と１４ (20 nmolずつ)を7.5 mM トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP) を含む50% 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液-アセトニトリル (pH 7.0、4 μl)に溶解し、室温で一夜放置した。表１の条件４は、ペプチド１３と１４ (20 nmolずつ)を7.5 mM トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP) を含む50% 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液-アセトニトリル (pH 7.0、4 μl)に溶解した。１０分後、DMF (36 μl)を加え室温で一夜放置した。
（７）化合物１８(Fmoc-Thr(CH2SCH2)-OBut)の合成
Fmoc-Thr-OBut (1.3 g, 3.3 mmol) をDMSO (6.0 ml, 85 mmol) とAc2O (4.0 ml, 42 mmol) とAcOH (6.0 ml, 0.10 mol) に溶解し、室温で2日間反応させた。減圧濃縮後、沈殿が出来るまで蒸留水を加え、上澄みを除去した。沈殿物を酢酸エチルに溶解し、分液ロートに移して飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過し、減圧濃縮を行なって油状物を得た。それをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル130 g, トルエン:酢酸エチル = 9 : 1) により精製し、化合物１８ (1.4 g, 3.0 mmol, 91%) を得た。 Rf 0.49 (トルエン : 酢酸エチル = 7 : 1).1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS), d 7.75 (d, 2H, J=7.8 Hz, Ar), 7.62 (m, 2H, Ar), 7.39 (brt, H, J=7.5 Hz, Ar), 7.31 (t, 2H, J=7.3 Hz, Ar), 5.50 (d, 1H, J=9.8 Hz, NH), 4.65 (d, 1H, J=11.7 Hz, O-CH2-S), 4.58 (d, 1H, J=11.7 Hz, O-CH2-S), 4.35 (m, 1H, bH), 4.27 (dd, 1H, J= 2.0, 9.8 Hz, aH), 4.24 (brt, 1H, J=6.8 Hz, Fmoc CH), 2.13 (s, 3H,SCH3), 1.49 (s, 9H, But), 1.23 (d, 3H, J=6.3 Hz, Thr CH3). [a]D= -19.1o (c 1.0 in Chloroform). MALDI-TOF MS: calcd for C25H31NNaO5S 480.182. Found: m/z 480.054.
（８）化合物１９(Fmoc-Thr(CH2SSBut)-OBut) の合成
化合物2 (0.50 g, 1.1 mmol) をトルエン共沸により脱水し、DCM (4.5 ml) を加えた後、DIEA (0.20 ml, 1.1 mmol) を加え塩基性にした。氷冷後、Sulfuryl chloride (92 μl, 1.1 mmol) を加え、30分間反応させた後、常温に戻した。DMF (2.3 ml) に溶かしたPotassium thiotosylate (0.38 g, 1.7 mmol) を加えて30分間反応させ、t-Butyl mercaptan (0.27 ml, 2.4 mmol) 加え、30分間反応させた。酢酸エチルを加え、１M-HCl飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。これをろ過、減圧濃縮の後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (90 g, ヘキサン:酢酸エチル = 4 : 1) で精製して化合物１９ (0.48 g, 0.90 mmol 82%) を得た。Rf 0.38 (ヘキサン : 酢酸エチル = 4 : 1). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS), d 7.75 (d, 2H, J=7.3 Hz, Ar), 7.62 (m, 2H, Ar), 7.39 (brt, H, J=7.6 Hz, Ar), 7.31 (brt, 2H, J=7.6 Hz, Ar), 5.49 (d, 1H, J=9.8 Hz, NH), 4.88 (d, 1H, J=11.2 Hz, O-CH2-S), 4.75 (d, 1H, J=11.2 Hz, O-CH2-S), 4.44 (m, 1H, bH), 4.28 (dd, 1H, J= 2.4, 9.7 Hz, aH), 4.24 (brt, 1H, J=7.3 Hz, Fmoc CH), 1.51 (s, 9H, But), 1.33 (s, 9H, But), 1.27 (d, 3H, J=6.3 Hz, Thr CH3). [a]D= 19.1o (c 1.0 in Chloroform). MALDI-TOF MS: calcd for C28H37NNaO5S2 554.201. Found: m/z 554.386.
（９）化合物１１(Fmoc-Thr(CH2SSBut)-OH)の合成
化合物5 (0.48 g, 0.90 mmol) を5% チオアニソールを含む50％TFA-ジクロロメタン (5.0 ml)に溶解し、30分間反応させた。反応終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (60 g, クロロホルム : メタノール : 酢酸 = 15 : 1 : 0.1) で精製し、次に同じくシリカゲルカラムクロマトグラフィー (40 g, トルエン : 酢酸エチル : 酢酸 = 2 : 1 : 0.1) で精製した。この後、さらにゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、化合物１１(95 mg, 0.20 mmol 22%)を得た。Rf 0.39 (クロロホルム : メタノール : 酢酸 = 5 : 1 : 0.1). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS), d 8.50 (brs, 1H, OH), 7.74 (d, 2H, J=8.0 Hz, Ar), 7.60 (m, 2H, Ar), 5.59 (m, 1H, NH), 5.10-4.71 (m, 2H, O-CH2-S), 4.50-4.36 (m, 4H, aH,bH, Fmoc CH2), 4.23 (t, 1H, J=6.8 Hz, Fmoc CH), 1.41-1.14 (m, 12H, But , Thr CH3). [a]D= -41.5o (c 1.0 in Chloroform). MALDI-TOF MS: calcd for C24H29NNaO5S2 498.139. Found: m/z 498.084.
本発明のペプチドの製造方法によれば、副生成物の発生を抑えて、安定性の高いタンパク質や糖タンパク質を高収率で液相合成することができる。本発明のペプチドの製造方法によって得られたタンパク質や糖タンパク質は、医薬品の製造に利用することができる。また、本発明で製造した糖タンパク質は、天然由来の糖タンパク質と同様の活性、例えば神経伝達物質の一種として特定の細胞受容体に結合する活性を示すことが予想される。

Claims (6)

  1. 第一のペプチド及び第二のペプチドを還元剤の存在下で反応させて、第一のペプチド及び第二のペプチドの連結物を得る工程を含むペプチドの製造方法であって、第一のペプチドは、チオエステル基を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含み、及び第二のペプチドは、チオール補助基を有するセリン若しくはトレオニン誘導体をＮ末端に含む、前記方法。
  2. チオール補助基が、ジスルフィド結合を含む基である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 還元剤が、ホスフィン系化合物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 第一のペプチドは−ＣＯ−Ｓ−Ｒ基
    （式中、Ｒはカルボキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜１２のアルキル基又はカルボキシル基で置換されていてもよい炭素数７〜１２のアリール基を示す）
    を有するアミノ酸誘導体をＣ末端に含み、
    第二のペプチドは−Ｒ2−Ｓ−Ｙ1基
    （式中、Ｙ1はチオール補助基の保護基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいメチレン基を示す）
    を有するセリン若しくはトレオニン誘導体をＮ末端に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 下記式１
    Figure 2010041425
     （Ｙ1はチオール補助基の保護基を示し、Ｙ2はアミノ基の保護基を示し、Ｒ1は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ2は置換されていてもよいメチレン基を示し、ｎは１〜３の整数を示す）
    で表される化合物。
  6. Ｙ1はｔ−ブチル基であり、Ｙ2は９−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、Ｒ1は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2はメチレン基であり、及びｎは２である、請求項５に記載の化合物。
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