JPWO2008044628A1 - ペプチドチオエステルの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(ii)工程(i)で得たFmoc-(アミノ酸残基)n-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)NH-樹脂(nは0または1)のFmoc基を脱保護してから、必要に応じて、Fmoc-アミノ酸を反応させることによって、Fmoc-(アミノ酸残基)n-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)NH-樹脂(nは1または2)を製造し、以下、Fmoc基の脱保護とFmoc-アミノ酸との反応を繰り返すことによって、X-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)-NH-樹脂を製造する工程;
(iii)工程(ii)で得たX-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)-NH-樹脂に脱保護試薬を作用させて樹脂からの脱離とチオール基の脱保護を行う工程、
(iv)工程(iii)で得た化合物に酸性チオールを作用させて、チオエステル化合物を製造する工程:
(式中、Fmocは9-フルオレニルメトキシカルボニル基を示し、Rは炭素数1から12のアルキル基又は炭素数7から12のアラルキル基を示し、Yはチオール基の保護基を示し、Xはペプチド残基を示す。)
を含む、ペプチドチオエステルの製造方法が提供される。
好ましくは、工程(iv)における酸性チオールは、メルカプトカルボン酸、又はメルカプタンとカルボン酸の混合物である。
好ましくは、工程(iv)における酸性チオールは、HSCH2CH2COOH(MPA)、又はHSC6H4CH2COOH(MPAA)であるか、あるいはチオフェノールと酢酸の混合物である。
好ましくは、Yはトリチル基である。
(ii)工程(i)で得たYSCH2CH(N=CHR1)C(=O)OH(式中、Y及びR1は上記と同義である)で表される化合物に水素化剤を作用させて、YSCH2CH(NHCH2R1)C(=O)OH(式中、Y及びR1は上記と同義である)で表される化合物を製造し、所望により9-フルオレニルメトキシカルボニル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを作用させて、アミノ基を9-フルオレニルメトキシカルボニル基で保護する工程:
を含む、上記した本発明の化合物の製造方法が提供される。
好ましくは、工程(ii)における水素化剤は、NaBH4、又はNaBH3CN である。
(1):N-エチル-S-トリチル-L-システイン(1):NaBH4を水素化剤として用いる方法
S-トリチル-L-システイン(1.0 g, 2.8 mmol)をエタノール(7.0 ml) とKOH (150 mg, 2.8 mmol)を含む水(3.0 ml)に溶解し、アセトアルデヒド(0.20 ml, 3.6 mmol)を加えた。溶液を1時間室温で撹拌後、1M NaOH 2滴を含む水(2.0 ml)に溶解したNaBH4 (0.10 g, 2.8 mmol)を加え、室温で15分、60℃で10 分撹拌した。室温に戻した後、1M HClでpHを4に調整して目的物を沈殿させた。4℃で1時間放置後、沈殿を濾過し、少量の蒸留水で洗浄した後、50℃で減圧下一晩乾燥させた。得られた粉末をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=4:1、酢酸1%を含む)で精製し、目的物(0.34 g, 0.87 mmol, 31%)を得た。
S-トリチル-L-システイン(1.0 g, 2.8 mmol)とNaBH3CN(0.17 g, 2.8 mmol)をメタノール(28 ml)に懸濁し、アセトアルデヒド(0.19 ml, 3.3 mmol)を加えた。生じた溶液を室温で1時間撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を1-ブタノールに溶解して蒸留水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を留去後得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=4:1、酢酸1%を含む)で精製し、目的物(0.52 g, 1.3 mmol, 48%)を得た。
N-エチル-S-トリチル-L-システイン (220 mg, 0.56 mmol) を10%炭酸ナトリウム水溶液(3 ml) と1,2-ジメトキシエタン (1.5 ml)に溶解し、1,2-ジメトキシエタン (1.5 ml)に溶解したFmoc-OSu (300 mg, 0.89 mmol) を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過後、ろ液を1 M HClで中和し、目的物を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン:酢酸エチル=2:1、酢酸1%を含む)により精製し、目的物 (280 mg, 0.46 mmol, 82%)を得た。
S-トリチル-L-システイン(1.0 g, 2.8 mmol)をエタノール(7.0 ml) とKOH (150 mg, 2.8 mmol)を含む水(3.0 ml)に溶解し、イソブチルアルデヒド(0.30 ml, 3.3 mmol)を加えた。溶液を1時間室温で撹拌後、1M NaOH 2滴を含む水(2.0 ml)に溶解したNaBH4 (0.13 g, 3.4 mmol)を加え、室温で15分、60℃で10 分撹拌した。室温に戻した後、1M HClでpHを4に調整して目的物を沈殿させた。4℃で1時間放置後、沈殿を濾過し、少量の蒸留水で洗浄した後、50℃で減圧下一晩乾燥させた。得られた粉末をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=7:1、酢酸1%を含む)で精製し、目的物(0.79 g, 1.9 mmol, 67%)を得た。
N-イソブチル-S-トリチル-L-システイン(870 mg, 2.1 mmol)を10%炭酸ナトリウム水溶液(10 ml) と1,2-ジメトキシエタン (5 ml)に溶解し、1,2-ジメトキシエタン (10 ml)に溶解したFmoc-OSu (1.0 g, 3.0 mmol) を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過後、ろ液を1 M HClで中和し、目的物を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン:酢酸エチル=3:1、酢酸1%を含む)により精製し、目的物 (1.0 g, 1.6 mmol, 75%) を得た。
S-トリチル-L-システイン(1.0 g, 2.8 mmol)をエタノール(7.0 ml) とKOH (150 mg, 2.8 mmol)を含む水(3.0 ml)に溶解し、ベンズアルデヒド(0.30 ml, 3.0 mmol)を加えた。溶液を1時間室温で撹拌後、1M NaOH 2滴を含む水(1.0 ml)に溶解したNaBH4 (0.11 g, 2.9 mmol)を加え、室温で15分、60℃で10 分撹拌した。室温に戻した後、1M HClでpHを4に調整して目的物を沈殿させた。4℃で1時間放置後、沈殿を濾過し、少量の蒸留水で洗浄した後、50℃で減圧下一晩乾燥させた。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=13:1、酢酸1%を含む)で精製し、目的物(0.26 g, 0.60 mmol, 22%)を得た。
N-ベンジル-S-トリチル-L-システイン(220 mg, 0.49 mmol)を10%炭酸ナトリウム水溶液(3.5 ml)に溶解し、1,2-ジメトキシエタン (1.0 ml)に溶解したFmoc-OSu (0.25 g, 0.74 mmol) を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過後、ろ液を1 M HClで中和し、目的物を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン:酢酸エチル=5:1、酢酸1%を含む)により精製し、目的物 (180 mg, 0.27 mmol, 54%) を得た。
1H-NMR (CDCl3): δ4.63 (d, 0.3H, J=15.6Hz, -CH 2-Ph), 4.44 (d, 0.7H, J=16.1 Hz, -CH 2-Ph), 4.12 (m, 1H, Fmoc -CH-), 3.91 (d, 0.3H, J=15.1 Hz, -CH 2-Ph), 3.89 (d, 0.7H, J=16.1 Hz, -CH 2-Ph), 3.40 (m, 1H, αH), 2.95 (dd, 0.7H, J=5.8, 13.7 Hz, βH), 2.85 (d, 0.7H, J=8.3, 13.2 Hz, βH), 2.60 (m, 0.3H, βH), 2.45 (m, 0.3H, βH). HRFABMS: Calcd for C44H37NO4S・Na: 698.23410, found: m/z 698.23063.
S-トリチル-L-システイン(2.0 g, 5.5 mmol)をエタノール(14 ml) とKOH (300 mg, 5.4 mmol)を含む水(6.0 ml)に溶解し、ホルムアルデヒド(36-38%水溶液, 0.54 ml, 6.6 mmol)を加えた.溶液を1時間室温で撹拌後、1M NaOH 4滴を含む水(4.0 ml)に溶解したNaBH4 (0.25 g, 6.6 mmol)を加え、室温で15分、60oCで10 分撹拌した。室温に戻した後、1M HClでpHを4に調製して目的物を沈殿させた。4oCで1時間放置後、沈殿を濾過し、少量の蒸留水で洗浄した後、50oCで減圧下一晩乾燥させた。得られた粉末をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール、4:1、酢酸1%を含む)で精製し、さらにODSカラムを用いて0.1% TFAを含むアセトニトリル水溶液にて精製し、目的物(670 mg, 1.77 mmol, 32%)を得た。
1H-NMR (CDCl3): δ 2.96 (m, 1H, αH), 2.77 (m, 1H, βH), 2.59 (m, 1H, βH), 2.03 (bs, 3H, -CH3). HRFABMS: Calcd for C23H23NNaO2S: 400.1347, found: m/z 400.1781.
N-メチル-S-トリチル-L-システイン (46 mg, 0.12 mmol) を10% 炭酸ナトリウム水溶液(1.0 ml) と1,2-ジメトキシエタン (0.3 ml)に溶解し、1,2-ジメトキシエタン (0.6 ml)に溶解したFmoc-OSu (82 mg, 0.24 mmol) を加え、溶液を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過後、ろ液を1 M HClで中和し、目的物を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン:酢酸エチル、1:1、酢酸1%を含む)により精製し、目的物 (54 mg, 90 μmol, 74%)を得た。
Rf 0.22 (2:1 Toluene-ethyl acetate containing 1% AcOH).
1H-NMR (CDCl3): δ4.43-4.33 (m, 2H, Fmoc -CH2-), 4.24 (m, 0.6H, Fmoc ?CH-), 4.17 (m, 0.4H, Fmoc ?CH-), 3.97 (dd, 0.6 H, J=4.9, 10.2 Hz, αH), 3.83 (m, 0.4 H, αH), 2.85 (dd, 0.6 H, J=4.9, 13.1 Hz, βH), 2.71 (s, 1.8 H, -CH3), 2.68 (s, 1.2 H, -CH3), 2.60 (dd, 0.4 H, J= 4.9, 13.1 Hz, βH), 2.41 (dd, 0.4H, J=10.7, 13.1 Hz, βH). HRFABMS: Calcd for C38H33NNaO4S: 622.2028, found: m/z 622.2021.
Fmoc-アラニン1水和物(0.23 g, 0.7 mmol)、HATU(0.27 g, 0.7 mmol)をDMF(1 ml)に溶解し、DIEA (0.12 ml, 0.7 mmol)を加え、得られた溶液を室温で2分間撹拌した。この溶液を、 N-Et-Cys(Trt) (0.20 g, 0.53 mmol)、DIEA (0.092 ml, 0.53 mmol)をDMF(0.50 ml)に溶解した溶液に加え室温で1時間反応させた。DMFを減圧流去した後、残渣を酢酸エチルに溶解し、1 M 塩酸、飽和食塩水で洗浄の後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過した後、溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール、19:1 1% 酢酸を含む)で精製し、さらにバイオビーズSX-3 (トルエン:酢酸エチル、3:1)により精製し、目的物(0.24 g, 0.35 mmol, 67%)を得た。
Rf 0.29 (19:1 Chloroform-methanol containing 1% AcOH).
1H-NMR (CDCl3): δ4.56 (m, 1H, AlaαH), 4.45-4.14 (m, 3H, Fmoc -CH-, -CH2-), 1.33-1.29 (m, 3H, Ala -CH3), 1.02-0.96 (m, 3H, -CH2-CH 3).
HRFABMS: Calcd for C42H40N2NaO5S, 707.2556, found, m/z 707.2421.
(9-1)N-メチルシステインをC末端アミノ酸として用いたGlu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOHの合成
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(65 mg, 0.03 mmol) を20% ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-N-Me-Cys(Trt) (36 mg, 0.06 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.09 ml) 1 M DCC/NMP (0.09 ml)を30 分間反応させた溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPで洗浄後、樹脂を10% Ac2O-5% DIEA / NMP中で5分間震盪した。NMPによる洗浄、20% ピペリジン/NMPによるFmoc基の除去を行った後、Fmoc-Gly (89 mg, 0.3 mmol)、HATU (108 mg, 0.28 mmol)、DIEA (0.10 ml, 0.60 mmol)をNMPに溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂 (129 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間震盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1% TFAを含む15% アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% 3-メルカプトプロピオン酸 (MPA) 水溶液(2.0 ml)で希釈し、1夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOH (0.98 mg, 0.77 μmol, 33%)を得た。
Amino acid analysis: Thr0.84Glu0.93Gly2Val0.90Leu1.10 Lys1.00His0.93Arg0.87.
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(220 mg, 0.1 mmol) を20%ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-N-Et-Cys(Trt) (120 mg, 0.2 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.3 ml) 1 M DCC/NMP (0.3 ml)を30 分間反応させた溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPで洗浄後、樹脂を10%Ac2O-5%DIEA/NMP中で5分間振盪した。NMPによる洗浄、20%ピペリジン/NMPによるFmoc基の除去を行った後、Fmoc-Gly (300 mg, 1.0 mmol)、HATU (360 mg, 0.95 mmol)、DIEA (0.35 ml, 2.0mmol)をNMP(1.5 ml)に溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂 (430 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5%メルカプトプロビオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、1夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOH (1.0 mg, 0.81 μmol, 34%)を得た。なお、このときのHPLCによる反応経過を図4に示す。
アミノ酸分析: Thr0.95Glu0.87Gly2Val0.94Leu1.03 Lys1.02His0.98Arg0.92.
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(220 mg, 0.1 mmol) を20%ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-N-iBu-Cys(Trt) (130 mg, 0.2 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.3 ml) 1 M DCC/NMP (0.3 ml)を30 分間反応させた溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPで洗浄後、樹脂を10%Ac2O-5%DIEA/NMP中で5分間振盪した。NMPによる洗浄、20%ピペリジン/NMPによるFmoc基の除去を行った後、Fmoc-Gly (300 mg, 1.0 mmol)、HATU (360 mg, 0.95 mmol)、DIEA (0.35 ml、2.0mmol)をNMP(1.5 ml)に溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-iBu-Cys(Trt)-NH-樹脂 (390 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% メルカプトプロビオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、1夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOH (0.85 mg、0.67μmol、28%)を得た。
アミノ酸分析: Thr0.96Glu0.94Gly2Val0.93Leu1.02 Lys1.02His0.95 Arg0.94.
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(110 mg, 0.05 mmol) を20%ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-N-Bn-Cys(Trt) (68 mg, 0.1 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.15 ml) 1 M DCC/NMP (0.15 ml)を30 分間反応させた溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPで洗浄後、樹脂を10%Ac2O-5%DIEA/NMP中で5分間振盪した。NMPによる洗浄、20%ピペリジン/NMPによるFmoc基の除去を行った後、Fmoc-Gly (150 mg, 0.5 mmol)、HATU (180 mg, 0.47 mmol)、DIEA (0.18 ml, 1.0mmol)をNMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Bn-Cys(Trt)-NH-樹脂 (180 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% メルカプトプロビオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、1夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOH (0.60 mg, 0.47 μmol, 17%)を得た。
アミノ酸分析: Thr0.78Glu0.97Gly2Val0.79Leu1.01Lys0.91His0.87Arg0.82.
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(110 mg, 0.05 mmol) を出発物質としてABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-NH-樹脂 (209 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% メルカプトプロビオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、1夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOH (24 μg, 0.045 μmol, 1.9%)を得た。
アミノ酸分析: Thr0.84Glu0.89Gly2Val0.85Leu0.98Lys0.78His0.77Arg0.93.
(9-2)で合成したGlu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂 (430 mg)のうち10 mgをとり、Reagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、30% アセトニトリル水1.7 mlで希釈した。酢酸(100 μl)とチオフェノール(40 μl)を加え、反応液を室温で24時間震盪した。反応液をHPLCにより精製し、Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SC6H5 (1.0 mg, 0.80 μmol,35%)を得た。
アミノ酸分析: Thr0.98Glu0.92Gly2Val0.90Leu0.99Lys0.98His0.93Arg1.02.
(11-1) Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-SCH2CH2COOHの合成
Fmoc-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (0.03 mmol) 20%をピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-Leu (180 mg, 0.5 mmol)、HATU (180 mg, 0.47 mmol)、DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol)、NMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。樹脂をNMPにより洗浄後、上記のFmoc-Leuとの反応を2回繰り返した。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Ala-Thr(But)-Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (184 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% 3-メルカプトプロピオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、2夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-SCH2CH2COOH (0.15 mg, 0.12μmol, 7.0%)を得た。また、ラセミ化の度合いは6.8%程度であった。
MALDI-TOF MS: found, m/z (M+H)+: 1258.1, calcd. for (M+H)+ 1257.6.
Fmoc-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (0.03 mmol) を20%ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-Glu(OBut) (210 mg, 0.5 mmol)、HATU (180 mg, 0.47 mmol)、DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol)、NMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、50℃で1時間反応させた。樹脂をNMPにより洗浄後、上記のFmoc- Glu(OBut)との反応を2回繰り返した。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Val-Val-Leu-Lys(Boc)-Glu(OBut)-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (90 mg) を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% 3-メルカプトプロピオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、2夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Trp-Leu-Lys-Gly-Gly-Val-Val-Leu-Lys-Glu-SCH2CH2COOH (0.21mg, 0.18 mmol,5.3%)を得た。
MALDI-TOF MS: found, m/z (M+H)+: 1216.7, calcd. for (M+H)+ 1216.7.
Fmoc-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (0.03 mmol) を20%ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-Lys(Boc) (0.23 g, 0.5 mmol)、HATU (180 mg, 0.47 mmol)、DIEA (0.23 ml, 1.3 mmol)、NMP(0.8 ml)に溶解した溶液を加え、50oCで1時間反応させた。樹脂をNMPにより洗浄後、上記のFmoc-Lys(Boc)との反応を2回繰り返した。NMPによる洗浄後、ABI 433A ペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Thr(But)-Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-N-Et-Cys(Trt)-NH-resin (101 mg)を得た。樹脂の一部(10 mg)にReagent K (0.4 ml)を加えて室温で2 時間振盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを0.1%TFAを含む15%アセトニトリル水溶液(0.2 ml)で抽出し、5% 3-メルカプトプロピオン酸(MPA)水溶液(2.0 ml)で希釈し、3夜放置した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、Thr-Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-SCH2CH2COOH (0.17 mg, 0.13 μmol, 4.4%)を得た。また、ラセミ化の度合いは2.5%程度であった。
MALDI-TOF MS: found, m/z (M+H)+: 1315.0, calcd. for (M+H)+ 1314.7.
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(220 mg, 0.1 mmol) を20% ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-N-Et-Cys(Trt) (123 mg, 0.2 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.25 ml) 1 M DCC/NMP (0.25 ml)を30 分間反応させた溶液を加え、1時間反応させた。NMPで洗浄後、樹脂を10% Ac2O-5% DIEA / NMP中で5分間震盪した。NMPによる洗浄後、20% ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。Fmoc-Gly (150 mg, 0.5 mmol)、HATU (180 mg, 0.48 mmol), DIEA (0.17 ml, 1 mmol)を加えて50 ℃で1時間反応させた。もう一度同量のFmoc-Gly, HATU, DIEAを加えて50℃で1時間反応させた。得られた樹脂上でペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Thr(But)-Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂を得た。得られた樹脂の半分量(0.05 mmol)に対して Fmoc-Asn (GlcNAc2Bn5) (120 mg, 0.1 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.12 ml) 、1 M DCC/NMP (0.12 ml)を室温で30分撹拌した溶液を加え、50 ℃で1時間撹拌した。残りのアミノ酸配列も自動合成機により導入し、Gly-Ser(But)-Lys(Boc)-Ile-Leu-Leu-Thr(But)-Cys(Acm)-Ser(But)-Leu-Asn(GlcNAc2Bn5)-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Thr(But)-Glu(OBut)-Val-Thr(But)-Gly-His(Trt)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂 (356 mg)を得た。ペプチド鎖の脱保護を図るために、このうち200 mgに Reagent K (3.5 ml)を加えて室温で2 時間震盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた.沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。糖鎖部分の脱保護を図るため、粗ペプチドをさらにLow-TfOH [TfOH/TFA/DMS/m-cresol (1:5:3:1, 4.0 ml)]により-15 ℃で2時間処理した。エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを5% メルカプトプロビオン酸(MPA)を含む10%アセトニトリル水溶液 (30 ml)に溶解し、室温で2日間放置した後HPLCにより精製し、エムプリン(34-58)チオエステルGly-Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Thr-Cys(Acm)-Ser-Leu-Asn(GlcNAc2)-Asp-Ser-Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Gly-His-Arg-Trp-Leu-Lys-Gly-SCH2CH2COOH 1 (2.3 μmol, 8.2%)を得た。
Amino acid analysis: Asp1.94Thr2.42Ser2.47Glu0.94Gly3 Ala1.11Val1.49Ile0.86Leu3.78Lys1.95His0.98Arg1.03.
Amino acid analysis: Asp1.00Thr2.73Ser1.93Pro5.05Gly2.00 Ala3.88Val0.96His1.00Arg0.96.
Fmoc-CLEAR アミド樹脂(430 mg, 0.2 mmol) を20% ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。この樹脂にFmoc-N-Et-Cys(Trt) (245 mg, 0.4 mmol)、1 M HOBt/NMP (0.5 ml) 1 M DCC/NMP (0.5 ml)を30 分間反応させた溶液を加え、1時間反応させた。NMPで洗浄後、樹脂を10% Ac2O-5% DIEA / NMP中で5分間震盪した。NMPによる洗浄後、20% ピペリジン/NMP で5 分、15 分処理した。Fmoc-Gly (300 mg, 1.0 mmol)、HATU (360 mg, 0.95 mmol)、DIEA (0.35 ml, 2.0 mmol)を加えて50 ℃で1時間反応させた。もう一度同量のFmoc-Gly、HATU、DIEAを加えて50 ℃で1時間反応させた。得られた樹脂上でペプチド合成機を用いてFastMoc法によりペプチド鎖を伸長し、Arg(Pbf)-Ser(Bt)-Leu-Ala-Arg(Pbf) -Trp(Boc)-Leu- Glu(OBut)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂を得た。得られた樹脂 19 μmol分を取り、Fmoc-Asn[(Gal-GlcNAc-Man)2Man-GlcNAc2] (57 mg, 29μmol)、DEPBT(17 mg、57 μmol)、DIEA (20 μl, 104 μmol)をDMSO(0.4 ml)に溶解した溶液を加えた。50 oCで3時間震盪した後、NMPで洗い、Z(Cl)-OSu(57 mg, 0.2 mmol), DIEA (0.07 ml, 0.4 mmol)をNMP(0.4 ml)に溶解した溶液を加えて室温で20分間震盪した。残りのアミノ酸配列は、Fmoc-アミノ酸 (0.1 mmol)、DCC (0.15 mmol)、HOBt (0.15 mmol)のNMP溶液(2.5 ml)を用いて手動により伸長した。このようにして得られたFmoc-Asp(OBut)-Cys(Acm)-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Val-Val-Leu-His(Trt)-Leu-Ala-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser-Val-Cys(Acm)-Val-His(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Asn[(Gal-GlcNAc-Man)2Man-GlcNAc2]-Arg(Pbf)-Ser(But)-Leu-Ala-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Glu(OBut)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Gly-N-Et-Cys(Trt)-NH-樹脂(0.17 g)に Reagent K (3.5 ml)を加えて室温で2 時間震盪した後、窒素気流によりTFAを除去し、エーテルを加えて沈殿を生じさせた。沈殿物をエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥させた。粗ペプチドを2% メルカプトフェニル酢酸 (MPAA)を含む10%アセトニトリル水溶液 (30 ml)に溶解し、室温で2日間放置した後HPLCにより精製し、CCL27(37-69)チオエステルFmoc-Asp-Cys(Acm)-His-Leu-Gln-Ala-Val-Val-Leu-His-Leu-Ala-Arg-Arg-Ser-Val-Cys(Acm)-Val-His-Pro-Gln-Asn[(Gal-GlcNAc-Man)2Man-GlcNAc2]-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Trp-Leu-Glu-Arg-Gln-Gly-SC6H4CH2COOH (3.4 mg, 0.57 μmol, 3.0%)を得た。
Amino acid analysis: Asp0.95Thr1.68Ser2.81Glu4.43Pro3.99Gly1.00 Ala1.07Val0.62Met0.97Ile0.52Leu6.84Tyr0.75His0.90Arg3.66.
Claims (9)
- (i)Fmoc-NH-樹脂を脱保護して、Fmoc-(アミノ酸残基)n-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)OH(nは0または1)を反応させることによってFmoc-(アミノ酸残基)n-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)NH-樹脂を製造する工程;
(ii)工程(i)で得たFmoc-(アミノ酸残基)n-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)NH-樹脂(nは0または1)のFmoc基を脱保護してから、必要に応じて、Fmoc-アミノ酸を反応させることによって、Fmoc-(アミノ酸残基)n-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)NH-樹脂(nは1または2)を製造し、以下、Fmoc基の脱保護とFmoc-アミノ酸との反応を繰り返すことによって、X-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)-NH-樹脂を製造する工程;
(iii)工程(ii)で得たX-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)-NH-樹脂に脱保護試薬を作用させて樹脂からの脱離とチオール基の脱保護を行う工程、
(iv)工程(iii)で得た化合物に酸性チオールを作用させて、チオエステル化合物を製造する工程:
(式中、Fmocは9-フルオレニルメトキシカルボニル基を示し、Rは炭素数1から12のアルキル基又は炭素数7から12のアラルキル基を示し、Yはチオール基の保護基を示し、Xはペプチド残基を示す。)を含む、ペプチドチオエステルの製造方法。 - 工程(iii)における脱保護試薬が、トリフルオロ酢酸である、請求項1に記載の方法。
- 工程(iv)における酸性チオールが、メルカプトカルボン酸、又はメルカプタンとカルボン酸の混合物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(iv)における酸性チオールが、HSCH2CH2COOH(MPA)、又はHSC6H4CH2COOH(MPAA)であるか、あるいはチオフェノールと酢酸の混合物である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- Rがメチル基、エチル基、イソブチル基又はベンジル基である、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- Yがトリチル基である、請求項1から5の何れかに記載の方法。
- Z-N(R)-CH(CH2SY)-C(=O)OH(式中、Zは水素原子又は9-フルオレニルメトキシカルボニル基を示し、Rは炭素数1から12のアルキル基又は炭素数7から12のアラルキル基を示し、Yはチオールの保護基を示す)で表される化合物。
- (i)YSCH2CH(NH2)C(=O)OH(式中、Yはチオール基の保護基である)で表される化合物と、R1CHO(式中、R1は水素原子又は炭素数1から11のアルキル基又は炭素数6から11のアリール基を示す)で表される化合物とを反応させて、YSCH2CH(N=CHR1)C(=O)OH(式中、Y及びR1は上記と同義である)で表される化合物を製造する工程;
(ii)工程(i)で得たYSCH2CH(N=CHR1)C(=O)OH(式中、Y及びR1は上記と同義である)で表される化合物に水素化剤を作用させて、YSCH2CH(NHCH2R1)C(=O)OH(式中、Y及びR1は上記と同義である)で表される化合物を製造し、所望により9-フルオレニルメトキシカルボニル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを作用させて、アミノ基を9-フルオレニルメトキシカルボニル基で保護する工程:
を含む、請求項7に記載の化合物の製造方法。 - 工程(ii)における水素化剤が、NaBH4、又はNaBH3CN である、請求項8に記載の方法。
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