WO2007145274A1 - チトクロムｃを測定することによる肺傷害検査方法および検査キット - Google Patents

チトクロムｃを測定することによる肺傷害検査方法および検査キット Download PDF

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Kazuyoshi Kuwano
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6884—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from lung

Definitions

  • the present invention relates to a test method and test kit for lung injury in lung diseases. More particularly, the present invention relates to a method for detecting lung injury and a test kit for lung diseases such as interstitial lung disease or acute respiratory distress syndrome. The present invention also relates to a test method and test kit for lung diseases accompanied by lung injury.
  • Lung diseases include lung cancer, mediastinal tumor, respiratory infection (pneumonia, pulmonary mycobacteriosis, pulmonary mycosis), chronic obstructive pulmonary disease, interstitial lung disease (interstitial pneumonia) , Acute respiratory distress syndrome (AR DS), bronchial asthma 'allergic lung disease, spontaneous pneumothorax, sarcoidosis, bronchiectasis, pulmonary thromboembolism, sleep apnea syndrome (outpatient simple examination), etc.
  • interstitial lung disease is a general term for diseases in which the wall of the alveoli (stroma) is inflamed.
  • interstitial pneumonia a disease that easily causes fibrosis.
  • the shape of the alveoli also becomes irregular and the whole lungs become a little hard.
  • the lungs swell and the vital capacity falls, and at the same time the absorption efficiency of oxygen deteriorates, breathlessness, coughing, and further progress, the lung becomes a mass of fibrous components, The function as a lung in the part is lost.
  • This interstitial pneumonia includes idiopathic pulmonary fibrosis, nonspecific interstitial pneumonia, acute interstitial pneumonia, idiopathic organized pneumonia, exfoliative interstitial pneumonia, respiratory bronchiolitis-related interstitial lung
  • diseases such as diseases and lymphocytic interstitial pneumonia
  • changing the treatment method depending on the degree of alveolar cell damage is important for early healing of the disease.
  • Acute respiratory distress syndrome also called shock lung
  • shock lung is a general term for acute dyspnea, severe hypoxemia, and lung injury caused by various causes. Water and cell infiltration are seen in the lung interstitium and alveolar space, and oxygenation (incorporation of oxygen into the blood) is impaired. Its body is considered to be acute pulmonary edema resulting from impaired vascular endothelial cells and increased vascular permeability.
  • lung injury alveolar cell injury
  • cytochrome c is known as an important protein of the electron transport system in mitochondria, but when cells are exposed to a stimulus that triggers apoptosis and becomes apoptotic, cytochrome c in the mitochondria is changed. It has been reported that it is rapidly released into the cytosol (Non-patent Document 1). Cytosolic cytochrome c is involved in the activation of caspase-3, a key factor in apoptosis, and it has been reported that increased calorie of cytochrome c is associated with the progression of apoptosis (non-patented). Reference 2).
  • Patent document 1 International publication 01Z35093 pamphlet
  • Patent Document 2 JP 2003-028860 A
  • Non-patent literature l Dinsdale D. et al., American J. Pathol. 155: 607-18, 1999
  • Non-Patent Document 2 Medina V. et al., Cancer Research 57: 3697-707, 1999
  • An object of the present invention is to provide a test method and test kit for lung injury (alveolar cell injury).
  • Another object is to provide a test method and test kit for lung diseases associated with lung injury, particularly interstitial lung disease and acute respiratory distress syndrome.
  • the present inventors have predicted that apoptosis is involved in alveolar cell injury and, as a result of research, determined that cytochrome c, an apoptosis-related protein, in bronchopulmonary lavage fluid was measured. The inventors found that it was possible to examine the damage of cyst cells, and completed the invention.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for examining lung injury in a lung disease characterized by examining lung injury by quantifying cytochrome c in a solution containing a collected body fluid.
  • a kit for lung injury testing comprising a reagent for quantifying cytochrome c in a solution containing a collected body fluid.
  • kit according to Item 14 comprising a buffer solution for performing the reaction between the anti-cytochrome c antibody and cytochrome c in a buffer in an acidic region.
  • a method for examining a pulmonary disease associated with lung injury comprises examining a pulmonary disease associated with lung injury by quantifying cytochrome c in a solution containing a collected body fluid.
  • a kit for testing a pulmonary disease associated with lung injury comprising a reagent for quantifying cytochrome c in a collected bronchoalveolar lavage fluid.
  • kits according to item 30, wherein the immunochemical method is a method based on a reaction between an anti-cytochrome c antibody and cytochrome c.
  • kit according to Item 31 comprising a buffer solution for performing the reaction between the anti-cytochrome c antibody and cytochrome c in an acidic buffer solution.
  • FIG. 1 Quantitative results of cytochrome c contained in bronchoalveolar lavage fluid of lung disease patients (Mann-Whitney U-test) and significant differences between disease groups Shown).
  • ARDS Acute respiratory distress syndrome
  • IPF Idiopathic pulmonary fibrosis
  • NSIP Nonspecific interstitial pneumonia
  • COP persistent organizing pneumonia
  • CVD-IP interstitial pneumonia derived from collagen disease
  • HP hypersensitivity pneumonia
  • SA sarcoidosis
  • Fig.2 Quantitative results of cytochrome c contained in bronchoalveolar lavage fluid from patients with lung disease (one wav AJNTOVAj and tanabe ⁇ b ⁇ fe, post hoc analysis) ⁇ day (significant difference is also shown).
  • ARDS Acute respiratory distress syndrome
  • IPF Idiopathic pneumonia
  • NSIP Nonspecific interstitial pneumonia
  • COP Persistent organizing pneumonia
  • CVD-IP Interstitial pneumonia derived from collagen disease
  • HP Hypersensitivity pneumonia
  • SA Sarcoidosis
  • FIG. 3 The results of FIG. 2 show the difference in each disease of interstitial pneumonia other than the ARDS group.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the amount of cytochrome c in bronchoalveolar lavage fluid in model animals.
  • FIG. 5 shows the results of measurement of serum cytochrome c levels in patients with idiopathic pulmonary fibrosis.
  • the test method of the present invention is a test method for lung injury, characterized by testing lung injury by quantifying cytochrome c in a solution containing a collected body fluid.
  • lung injury means injury of alveolar cells.
  • the stage at which lung injury appears differs, but is often accompanied by lung injury. Therefore, the present invention also provides a method for examining a disease associated with lung injury, that is, a lung disease in a stage where lung injury appears. If the lung disease has a different degree of lung injury depending on the progress stage, the stage in the lung disease can be examined by the present invention.
  • lung diseases include lung cancer, mediastinal tumor, respiratory infection (pneumonia, pulmonary mycobacterial disease, pulmonary mycosis), chronic obstructive pulmonary disease, interstitial lung disease (interstitial lung disease). Pneumonia), bronchial asthma, allergic lung disease, spontaneous pneumothorax, sarcoidosis, bronchiectasis, pulmonary thromboembolism, sleep apnea syndrome (outpatient simple examination), etc. Interstitial lung disease and acute respiratory distress syndrome (ARDS) are preferable, and acute respiratory distress syndrome (ARDS) is particularly preferable.
  • the test method of the present invention is preferably applied to lung diseases that appear from an early stage of lung injury or lung diseases in which determination of the stage based on the presence or absence of lung injury is important.
  • an immunochemical method As a method for measuring cytochrome c in a solution containing a collected body fluid, an immunochemical method, a method using electrophoresis, a method using chromatography, and the like can be considered.
  • electrophoresis Examples of such a method include a method of detecting cytochrome c as a band by performing polyacrylamide gel electrophoresis, and a method of detecting as a peak by capillary electrophoresis.
  • a method based on kumatography there is a method of detecting as a peak by high performance liquid chromatography. In some cases, fluorescent labeling is allowed to increase sensitivity.
  • the solution containing body fluid includes bronchoalveolar lavage fluid, but may also be a solution containing other body fluids (blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, etc.).
  • the solution containing the body fluid may be the body fluid itself.
  • the bronchoalveolar lavage fluid can be collected by a normal method.
  • an immunochemical method is preferred because of its sensitivity and simplicity.
  • the immunochemical method is a method for quantifying cytochrome c using an antibody against cytochrome c.
  • immunochemical methods such as a competitive method for labeling cytochrome c, a sandwich method for labeling antibody, and a latex bead method for observing the aggregation of antibody-coated beads, but an antibody against cytochrome c was used. If it is a method, it is contained in the preferable aspect of this invention.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • labeling methods such as labeling with a radioisotope, labeling with an electrochemiluminescent compound, fluorescent labeling, enzyme labeling, and piotin labeling, but the present invention is not limited to these examples. .
  • the anti-cytochrome c antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it can detect cytochrome c (including a fragment), and may be polyclonal (antiserum) or monoclonal antibody.
  • the polyclonal antibody (antiserum) or monoclonal antibody referred to in the present invention can be produced by an existing general production method, and the monoclonal antibody has no ability to produce an antibody-producing cell and an autoantibody and myeloma.
  • Hydrioma was prepared from cell lines (myeloma cells) (Nature ⁇ 256, 495-497, 1975), and the hybridoma was cloned and used for immunization of mammals.
  • IgG In the case of a monoclonal antibody, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, etc. Monoclonal antibodies having these isotypes are also included. IgG or IgM is preferable.
  • the antibody in the present invention includes an antibody fragment, and the term "antibody fragment” means a partial region of the monoclonal antibody as described above.
  • the anti-cytochrome c antibody and cytochrome c are preferably reacted in the acidic region.
  • the acidic region as used herein is a pH region in which the influence of interfering substances in body fluids that affect the binding between an antibody and cytochrome c is attenuated. Although the effect of interfering substances can be reduced by lowering the pH, at the same time, the binding between the antibody and cytochrome c is also weakened. Therefore, the pH in the immunochemical measurement of the present invention usually satisfies the following conditions. It is determined to satisfy pH.
  • a measurement sensitivity capable of quantifying lOngZmL, preferably IngZmL of cytochrome c in a buffer solution is obtained.
  • a recovery rate in the additive recovery test in the presence of body fluid is 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more.
  • the pH used for the immunochemical method can determine the optimum pH for each antibody.
  • the pH is 7 or less, more preferably pH 3.0 to pH 6.0, particularly preferably pH 3.5 to pH 5, and more preferably pH 3.5 to pH 4.5.
  • dilute cytochrome c to 1 to L000 ng / mL in a pH 3 to pH 7.5 buffer containing an appropriate protein such as BSA, an appropriate salt such as NaCl, and an appropriate surfactant as necessary. If the immunochemical assay is a two-step sandwich method, dilute cytochrome c is After reacting with the activated anti-cytochrome C antibody, washing and adding the labeled anti-cytochrome C antibody, activity corresponding to the labeling substance, if radioactive labeling, radioactive activity, if enzyme labeling, labeling substance by enzyme activity To detect.
  • the immunochemical measurement method is a one-step sandwich method
  • the diluted cytochrome c and the immobilized anti-cytochrome c antibody and the labeled anti-cytochrome c antibody are mixed and reacted, and a labeling substance is obtained.
  • the labeling substance is detected by radioactivity, if it is a radioactive label, or if it is an enzyme label, the enzyme activity.
  • the pH is not immune.
  • a known amount of cytochrome c is added to the specimen (eg bronchoalveolar lavage fluid) used for the immunochemical assay.
  • the amount of cytochrome c in the sample supplemented with cytochrome c and the sample with strong force is measured by the immunochemical method, and the ratio of the measured value to the theoretical value is defined as the recovery rate.
  • the recovery rate is expressed as follows: the amount of cytochrome c added is A, the measured value of cytochrome c in the sample not containing cytochrome c is B, and the measured value of cytochrome c in the sample added with cytochrome c is C.
  • the pH is listed as a candidate pH of a buffer used in an immunochemical measurement method.
  • the pH of the buffer used in the immunochemical method is determined in consideration of 1. the effect of pH on measurement sensitivity and 2. the effect of pH on additional recovery.
  • the type of the buffer is not particularly limited as long as it can be adjusted to acidic conditions, and examples thereof include citrate phosphate buffer.
  • a method using an acidic region buffer is not limited to the first reaction in which the immobilized antibody and cytochrome c in the sample are reacted, It is also effective to use it in the second reaction (a step of reacting cytochrome c with a labeled antibody) when the interfering substances cannot be removed by the reaction.
  • the method of this embodiment is not limited to the method using an acidic region buffer in the first reaction.
  • cytochrome c is detected after reacting the anti-cytochrome c antibody with cytochrome c under acidic conditions.
  • the detection include a method in which, after washing, for example, a labeled secondary antibody is reacted and detected by a detection method according to the label.
  • a detection method for example, when a secondary antibody labeled with piotin is used, an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase labeled with avidin may be further reacted, and then detected by luminescence or color development using the enzyme substrate. it can.
  • an enzyme-labeled secondary antibody, a fluorescently-labeled secondary antibody, a ruthenium-labeled secondary antibody, or the like may be used.
  • Examples of immunochemical methods for measuring cytochrome c include, for example, a method using a ruthenium complex-labeled anti-cytochrome c antibody prepared by the method described in the following Reference Example.
  • the present invention provides a kit for lung injury testing, comprising a reagent for quantifying cytochrome c in a solution containing a collected body fluid, and a lung with lung injury
  • the present invention relates to a disease testing kit comprising a reagent for quantifying cytochrome c in a solution containing a collected body fluid.
  • the kit of the present invention preferably contains a reagent for immunochemically measuring cytochrome c in a solution containing a body fluid, usually a cytochrome c antibody. More preferably, the kit of the present invention is characterized in that the reaction between the anti-cytochrome c antibody and cytochrome c is carried out in an acidic buffer solution.
  • kits in which the instruction manual attached to the kit describes that the reaction between cytochrome c and anti-cytochrome c antibody is performed under acidic conditions.
  • the kit may contain a reaction buffer adjusted to acidity.
  • the kit of the present invention may contain a secondary antibody, a cytochrome c standard solution, a diluent, a washing solution, a detection substrate, and the like.
  • the test kit of the present invention usually contains a reagent for quantifying cytochrome c in a solution containing body fluid using an antibody against the cytochrome.
  • the reagent of this embodiment is, for example, an antibody Other than using an anti-cytochrome c antibody as a reagent, the same configuration as that of a reagent used in a normal sandwich method may be used.
  • test reagents for measuring cytochrome c by the sandwich method include, for example, 1) anti-cytochrome c antibody-coated solid phase such as anti-cytochrome c antibody-coated cup and anti-cytochrome c antibody-coated beads, 2) labeled anti-cytochrome c antibody, 3 A reagent containing a known concentration of cytochrome c standard solution, 4) diluent, and 5) washing solution. Furthermore, if it is an enzyme label, it may contain 6) a chromogenic substrate and 7) a reaction stop solution.
  • the degree of lung injury is examined by using the quantitative result of cytochrome c as an index.
  • lung injury can be determined when the quantitative value of cytochrome c is higher than the normal value.
  • a normal value upper limit (cut-off value) may be set (for example, the average value of the concentration of the control group + twice the standard deviation), and the presence or absence of lung injury may be determined by comparison with it. Lung diseases associated with lung injury can be examined in the same manner as lung injury.
  • Human cytochrome c (R & D Systems) 110 ⁇ g / 100 ⁇ L and 2 mg / mL ovalbumin 55 ⁇ L dissolved in 65 mM phosphate buffer pH 7.5 were mixed, and then 65 mM phosphate buffer pH 42 L of 1 mM dartalaldehyde diluted with 7.5 was added and stirred at room temperature for 2 hours. Next, the mixture was dialyzed against 0.15 M NaCl at 4 ° C. for 48 hours to prepare a mixture with an equal amount of FCA, and 0.1 mL of BALB / C mouse abdominal cavity was immunized. Immunization was repeated three times every two weeks.
  • mice Two weeks after the third immunization, mice were intravenously injected with c50 g / 100 L of human cytochrome c dissolved in physiological saline via the tail vein. Three days later, the spleen of the mouse was removed and the spleen lymphocytes were fused with myeloma cells P3X63 Ag8U.l by the polyethylene glycol method according to a conventional method. Screening was performed using human cytochrome c as an antigen, and a monoclonal antibody-producing hyperidoma (clone: 27G9) against human cytochrome c was established.
  • Anti-cytochrome c monoclonal antibody (clone: 2B5F8 (R & D Systems)) is dialyzed against 0.1 M acetate buffer (pH 4.2) containing 0.15 M NaCl, and 0.15 M NaC 1 is added so that the OD 280 nm is 0.56. Dilute with M acetate buffer (pH 4.2). 1.36 mL of diluted antibody was washed three times with 3 mL of 0.1 M acetate buffer (pH 4.2) containing 0.15 M NaCl in advance using a magnet (Dynabeads (registered trademark) M-450 Epoxy, Dynal) 3.36 The mixture was mixed with mL and stirred at room temperature for 17 hours. Next, the beads are suspended in 3 mL of blocking buffer (50 mM Tris-HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN, pH 7.5) and stirred for 7 hours at room temperature to block the beads.
  • blocking buffer 50 m
  • the anti-cytochrome c monoclonal antibody (27G9 antibody) prepared in Reference Example 1 was dialyzed with PBS to adjust the antibody concentration to a range of 0.5 mg / mL to 2 mg / mL.
  • Ruthenium complex ruthenium (II) tris (bipyridyl) -N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA
  • dimethyl sulfoxide dissolved in dimethyl sulfoxide at a concentration of 10 mg / mL in 1 mL of antibody was stirred at 12.2 ⁇ L for 30 minutes at room temperature. .
  • 50 L of 2 M glycine was added and stirred at room temperature for 10 minutes. It was separated from PBS-3 (10 mM potassium phosphate, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN, pH 6), pre-equilibrated with Sephadex G-25 (GE Healthcare
  • Cytochrome c standard antigen is 3000 ng / mL, 1000 ng / mL, 0.15 M sodium phosphate buffer pH 7.4 containing human cytochrome c (R & D Systems) 5% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN
  • Example 1 Patients with acute respiratory distress (impression) syndrome, idiopathic pulmonary fibrosis, nonspecific interstitial pneumonia, persistent organizing pneumonia, interstitial pneumonia derived from collagen disease, hypersensitivity pneumonia, and sarcoidosis, and Bronchoalveolar lavage fluid was collected from healthy volunteers.
  • the method for collecting bronchoalveolar lavage fluid was in accordance with the guidelines prepared by the Ministry of Health and Welfare's Specified Disease Research Group in 1990. That is, the bronchoalveolar alveoli were washed with 150 mL of sterilized physiological saline, and the collected lavage fluid was rinsed with gauze to remove mucus, thereby obtaining a bronchoalveolar lavage fluid.
  • a standard curve is drawn by plotting the human cytochrome c standard antigen concentration on the horizontal axis and the count value of human cytochrome c standard antigen on the vertical axis. Based on the standard curve, the luminescence count value of the bronchopulmonary lavage fluid The amount of cytochrome c contained was calculated, and the significant difference between the disease groups was examined by Mann-Whitney U-test.
  • non-specific interstitial pneumonia (NSIP) and control (CONTROL) showed no increase in cytochrome c levels
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • COP persistent organizing pneumonia
  • CV D-IP interstitial pneumonia derived from collagen disease
  • HP hypersensitivity pneumonia
  • SA sarcoidosis
  • acute respiratory distress syndrome showed a marked increase in cytochrome c content.
  • Cytochrome c content It is considered that the disease in which no increase is observed is the force that is a disease that does not involve lung injury, or the stage in which lung injury occurs in the patient from whom bronchoalveolar lavage fluid was collected in this example.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • HP hypersensitivity pneumonia
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • Changed to (ARDS) was changed to analysis of variance (one way ANOVA) and multiple comparison (post hoc analysis).
  • Bleomycin (BLM) -induced lung injury animal models are widely used as models of human acute lung injury and idiopathic interstitial pneumonia (Adamson IY. Et al., American J. Pathol. 77: 185-197, 1974) o 7- to 8-week-old C57BL / 6 male mice were intraperitoneally administered sodium phenobarbital (Cieling Brau) The animal was anesthetized and 3.0 U bleomycin (Nippon Yakuyaku Co., Ltd.) dissolved in sterile physiological saline was administered intratracheally per lkg body weight to produce an animal model of lung injury.
  • the bronchoalveolar lavage fluid was collected by washing the bronchoalveolar alveoli twice with 1 mL of sterile physiological saline.
  • Figure 4 shows the results of measuring the amount of cytochrome c in the tracheoalveolar lavage fluid.
  • Serum cytochrome c levels were measured in patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • Sample dilution (0.15M sodium chloride, 15mM EDTA, 2% Lipidure (registered trademark)-BL802 (Nippon Yushi Co., Ltd.), 2% Lipidure (registered trademark)-BL405 (Nippon Yushi Co., Ltd.), 0.1M amber containing 0.1% NaN3 200 ⁇ L of acid buffer (PH4.0) was placed in a reaction tube for Picormi TM 8220 (Sanko Junyaku Co., Ltd.), and then 20 ⁇ L of serum was injected.
  • PH4.0 acid buffer
  • the human cytochrome c standard antigen concentration is plotted on the horizontal axis and the count value of human cytochrome c standard antigen is plotted on the vertical axis, and a standard curve is drawn. The amount of cytochrome c contained was calculated.
  • Table 1 shows the day of serum collection, the number of days from the first collection date, and the amount of cytochrome c for each. It was confirmed that the disease was progressing through clinical and laboratory findings, and cytochrome c levels also increased accordingly.It was found that the death level was particularly high in death cases with severe lung injury. It was.
  • the degree of lung injury (alveolar cell injury) can be easily examined.

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Abstract

間質性肺疾患などにおける肺傷害の検査方法、及び、肺傷害を伴う肺疾患の検査方法を提供する。気管支肺胞洗浄液中のチトクロムｃ濃度を測定することにより間質性肺疾患などにおける肺傷害の検査が可能となる。また、肺傷害を伴う肺疾患を検査できる。        

Description

明 細 書
チトクロム Cを測定することによる肺傷害検査方法および検査キット 技術分野
[0001] 本発明は、肺疾患における肺傷害の検査方法および検査キットに関する。さらに詳 しくは、間質性肺疾患または急性呼吸窮迫症候群等の肺疾患における肺傷害の検 查方法および検査キットに関する。また、肺傷害を伴う肺疾患の検査方法及び検査 キットに関する。
背景技術
[0002] 肺疾患には、肺癌、縦隔腫瘍、呼吸器感染症 (肺炎，肺抗酸菌症，肺真菌症)、慢 性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患 (間質性肺炎)、急性呼吸窮迫 (促迫)症候群 (AR DS)、気管支喘息 'アレルギー性肺疾患、自然気胸、サルコイドーシス、気管支拡張 症、肺血栓塞栓症、睡眠時無呼吸症候群 (外来簡易検査)等があり、さまざまな診断 方法がある。特に、間質性肺疾患は、肺胞の壁（間質）に炎症がおきる疾患を総称す るもので、その中でも繊維化を起こしやすい疾患を特に間質性肺炎と呼んでいる。間 質性肺炎は、肺胞の形も不規則になって、肺全体が少し固くなつていく。その結果、 肺のふくらみが悪くなり肺活量がおちると同時に、酸素の吸収効率も悪くなつてゆき、 息苦しくなつたり、咳が出たりして、さらに進行すると、 肺は線維性成分の固まりとなり 、この部分での肺としての機能が失われる。この間質性肺炎には、特発性肺線維症、 非特異性間質性肺炎、急性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、 呼吸細気管支炎関連性間質性肺疾患、リンパ球性間質性肺炎等の疾患があるが、 肺胞細胞の傷害の程度により、治療方法を変えることが疾患の早期治癒に重要であ る。
[0003] 急性呼吸窮迫症候群は、ショック肺とも呼ばれ、さまざまな原因によって引き起こさ れる急性の呼吸困難、重症の低酸素血症、肺損傷の総称をいう。肺の間質や肺胞 腔に水分と細胞浸潤がみられ、酸素化 (血液中に酸素を取り込むこと）が損なわれる 症状が見られる。その本体は、血管内皮細胞が損なわれて血管の透過性が進み、そ の結果もたらされる急性肺水腫と考えられて 、る。 [0004] ところが、現在、肺傷害 (肺胞細胞の傷害)の程度を容易に検査する方法がなぐ特 に間質性肺疾患や急性呼吸窮迫症候群にお!、て、肺傷害を表すマーカーが望まれ ている。
[0005] 一方、チトクロム cは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の重要な蛋白質として知ら れているが、細胞がアポトーシスの引き金となる刺激に曝され、アポトーシスの状態に なると、ミトコンドリアにあったチトクロム cが急速にサイトゾルへと放出されることが報告 されている（非特許文献 1)。そしてサイトゾルのチトクロム cは、アポトーシスのキーフ アクターであるカスパーゼ (caspase)-3の活性化に関与し、チトクロム cの増カロが、アポ トーシス進行と関係することが報告されて 、る (非特許文献 2)。
[0006] チトクロム cを測定することにより種々の診断を行うことが知られている（特許文献 1
2)。
特許文献 1：国際公開 01Z35093号パンフレット
特許文献 2 :特開 2003— 028860号
非特許文献 l : Dinsdale D. et al., American J. Pathol. 155:607-18, 1999
非特許文献 2 : Medina V. et al., Cancer Research 57:3697-707, 1999
発明の開示
[0007] 本発明の課題は、肺傷害 (肺胞細胞の傷害)の検査方法および検査キットを提供 することである。
[0008] また、他の課題は、肺傷害を伴う肺疾患、特に間質性肺疾患や急性呼吸窮迫症候 群の検査方法および検査キットを提供することである。
[0009] 本発明者らは、肺胞細胞の傷害にアポトーシスが関与していると予測し、研究を行 つた結果、気管支肺洗浄液中の、アポトーシス関連タンパクであるチトクロム cを測定 することにより肺胞細胞の傷害を検査できることを見出し、発明を完成するに至った。
[0010] すなわち本発明は、以下に関する。
[1] 肺疾患における肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中のチ トクロム cを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする方法。
[2] 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、項 1記載の方法。
[3] 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、項 1記載の方法。 [4] 定量が免疫化学的方法による項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
[5] 以下の工程を含む項 4記載の方法。
(1)採取した体液中のチトクロム cを免疫化学的方法により定量する工程
(2)定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害と判定する工程
[6] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、項 4又は 5に記載の方法。
[7] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、項 6記載 の方法。
[8] 酸性領域力 ¾H3. 0から pH6. 0である、項 7記載の方法。
[9] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項 1〜8の 、ずれか 1項に記載の 方法。
[0011] [10] 肺傷害検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチトクロム cを定 量するための試薬を含むことを特徴とするキット。
[11] 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、項 10記載のキット。
[12] 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、項 10記載のキット。
[13] 定量が免疫化学的方法による項 10〜 12のいずれか 1項に記載のキット。
[14] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、 項 13に記載のキット。
[15] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩 衝液を含む、項 14記載のキット。
[16] 酸性領域力 ¾H3. 0力ら pH6. 0である、項 15記載のキット。
[17] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項 10〜16のいずれか 1項に記 載のキット。
[0012] [18] 肺傷害を伴う肺疾患を検査する方法であって、採取した体液を含む溶液中の チトクロム cを定量することにより肺傷害を伴う肺疾患を検査することを特徴とする方法
[19] 肺疾患が間質性肺疾患である、項 18記載の方法。
[20] 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、項 18記載の方法。 [21] 定量が免疫化学的方法による項 18〜20のいずれか 1項に記載の方法。
[22] 以下の工程を含む項 21に記載の方法。
(1)採取した体液中のチトクロム cを免疫化学的方法により定量する工程
(2)定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害を伴う肺疾患と判定するェ 程
[23] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、 項 21又は 22記載の方法。
[24] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、項 23記 載の方法。
[25] 酸性領域力 ¾H3. 0から pH6. 0である、項 24記載の方法。
[26] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項 18〜25の ヽずれか 1項に記 載の方法。
[0013] [27] 肺傷害を伴う肺疾患の検査用キットであって、採取した気管支肺胞洗浄液中 のチトクロム cを定量するための試薬を含むことを特徴とするキット。
[28] 肺疾患が間質性肺疾患である、項 27記載のキット。
[29] 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、項 27記載のキット。
[30] 定量が免疫化学的方法による項 27〜29の 、ずれか 1項に記載のキット。
[31] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、 項 30記載のキット。
[32] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩 衝液を含む、項 31記載のキット。
[33] 酸性領域力 ¾H3. 0から pH6. 0である、項 32記載のキット。
[34] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項 27〜33の 、ずれか 1項に記 載のキット。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]肺疾患患者の気管支肺胞洗浄液に含まれるチトクロム cの定量結果を示す (マ ンホイット-一順位和検定 (Mann-Whitney U-test)による疾患群間における有意差も 合わせて示す)。 ARDS :急性呼吸窮迫 (促迫)症候群、 IPF:特発性肺線維症、 NSIP: 非特異的間質性肺炎、 COP:持続性器質化肺炎、 CVD-IP:膠原病由来の間質性肺 炎、 HP:過敏性肺炎、 SA:サルコイドーシス
[図 2]肺疾患患者の気管支肺胞洗浄液に含まれるチトクロム cの定量結果を示す (分 散分析（one wav AJNTOVAjおよび多直《b匕 fe、post hoc analysis)【こよる疾,舎、群 Γ日【こお ける有意差もあわせて示す)。 ARDS :急性呼吸窮迫 (促迫)症候群、 IPF:特発性肺線 維症、 NSIP:非特異的間質性肺炎、 COP:持続性器質化肺炎、 CVD-IP:膠原病由来 の間質性肺炎、 HP:過敏性肺炎、 SA:サルコイドーシス
[図 3]図 2の結果を、 ARDS群以外の間質性肺炎の各疾患の差を示したものである。
[図 4]モデル動物で気管支肺胞洗浄液中のチトクロム c量を測定した結果を示す。
[図 5]特発性肺線維症患者の血清中チトクロム c量を測定した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の検査方法は、肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中の チトクロム cを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする。
[0016] 本発明において、肺傷害とは、肺胞細胞の傷害を意味する。肺疾患は、その種類 により、肺傷害が現れる段階が異なるが、肺傷害を伴う場合が多い。従って、本発明 は、肺傷害を伴う疾患、すなわち、肺傷害が現れる段階にある肺疾患の検査方法も 提供する。進行段階により肺傷害の程度が異なる肺疾患であれば、本発明により肺 疾患における段階が検査できる。
[0017] ここで、肺疾患とは、肺癌，縦隔腫瘍，呼吸器感染症 (肺炎，肺抗酸菌症，肺真菌 症)，慢性閉塞性肺疾患，間質性肺疾患 (間質性肺炎)，気管支喘息，アレルギー性 肺疾患， 自然気胸，サルコイドーシス，気管支拡張症，肺血栓塞栓症，睡眠時無呼 吸症候群 (外来簡易検査)等をいう。好ましくは、間質性肺疾患および急性呼吸窮迫 症候群 (ARDS)であり、特に好ましくは、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)である。
[0018] 本発明の検査方法は、肺傷害が早い段階から現れる肺疾患や、肺傷害の有無に よる段階の判定が重要な肺疾患に適用することが好ましい。
[0019] 採取した体液を含む溶液中のチトクロム cを測定する方法としては、免疫化学的方 法、電気泳動による方法、クロマトグラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動に よる方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってチトクロム cをバンドとして 検出する方法、キヤピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、ク 口マトグラフィ一による方法としては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出 する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許され る。
[0020] 体液を含む溶液としては、気管支肺胞洗浄液が挙げられるが、その他の体液 (血液 、血清、血漿若しくは脳脊髄液等）を含む溶液であってもよい。ここで、体液を含む溶 液は、体液そのものであってもよい。
気管支肺胞洗浄液は、通常の方法により採取されたものを用いることができる。
[0021] チトクロム cを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ま しい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロム cに対する抗体を用いて、チトクロム cを 定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロム cを標識する競合法、抗体 を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ 法等、様々な方法があるが、チトクロム cに対する抗体を用いた方法であれば、本発 明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体 でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する 化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ピオチン標識等、様々な方法があるが、本 発明はこれらの例に限られるものではない。
[0022] 本発明に使用される抗チトクロム c抗体は、チトクロム c (断片を含む）を検出できる 抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル (抗血清)でもモノクローナル抗体でも よい。
[0023] 本発明で言うポリクローナル抗体 (抗血清)あるいはモノクローナル抗体は、既存の 一般的な製造方法によって製造することができ、モノクローナル抗体は、抗体産生細 胞と自己抗体産生能のな 、骨髄腫系細胞 (ミエローマ細胞)からハイプリドーマを調 製し（ネイチヤー (Nature)ゝ第 256卷、第 495〜第 497頁、 1975年）、該ハイブリドー マをクローンィ匕し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノ クローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。
[0024] またモノクローナル抗体の場合には、 IgG、 IgM、 IgA、 IgDあるいは IgE等の!/、ず れのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、 IgGまたは Ig Mである。
[0025] さらに、本発明における抗体には、抗体のフラグメントも含まれるものであり、この「 抗体のフラグメント」とは、前述のようなモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し 、具体的【こ i F(ab ) 、 Fab、 Fab、 Fv (variable fragment of antibody)、 sFv、 dsFv (d
2
isulphide stabilised Fv)める ヽ ίま dAb (single domain antibody)など , g、味する (ェキ スパート'オピニオン'オン'テラピューティック 'パテンッ (Exp. Opin. Ther. Patents), 第 6卷，第 5号，第 441〜456頁， 1996年)。
[0026] 本発明の方法では、好ましくは酸性領域で抗チトクロム c抗体とチトクロム cとを反応 させる。本願明細書でいう酸性領域とは、抗体とチトクロム cの結合に影響を与える体 液中の妨害物質の影響が減弱する pH領域である。 pHを低下させることにより妨害 物質の影響を減弱させることができるが、同時に抗体とチトクロム cの結合も弱くなる ため、本発明の免疫化学的な測定における pHは、通常には、以下の条件を満たす p Hに決められる。
[0027] 1.緩衝液中で lOngZmL、好ましくは IngZmLのチトクロム cが定量可能な測定感 度が得られる。
2.体液存在下での添カ卩回収試験における回収率が 70%以上、好ましくは 80%以 上、さらに好ましくは 90%以上得られる。
[0028] 妨害物質の影響および抗体とチトクロム cの結合に及ぼす pHの効果は用いる抗体 により異なるため、当該免疫化学的方法に用いる pHは、抗体毎に最適な pHを決め ることができる。好ましくは、 pH7以下、さらに好ましくは pH3. 0〜pH6. 0、特に好ま しくは pH3. 5〜pH5、その中でもさらに好ましくは pH3. 5〜pH4. 5である。
[0029] 以下に、免疫化学的な測定における pHを決める方法を具体的に示す力 pHを決 める方法は、これに限定されるものではない。
[0030] 1.測定感度への pHの影響
BSA等の適当な蛋白質、 NaCl等の適当な塩類、必要により適当な界面活性剤を 含む pH3〜pH7. 5の緩衝液に、チトクロム cを 1〜： L000ng/mLに希釈する。当該 免疫化学的な測定法が 2ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロム cを固相 化した抗チトクロム C抗体を反応させ、洗浄後、標識した抗チトクロム C抗体を加えて標 識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活 性により標識物質を検出する。
[0031] また、当該免疫化学的な測定法が 1ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトク ロム cと固相化した抗チトクロム c抗体、標識した抗チトクロム c抗体をカ卩えて反応させ、 標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素 活性により標識物質を検出する。
[0032] 10ng/mL、好ましくは Ing/mLのチトクロム cを含む検体から得られるシグナルが 、チトクロム cを含まな 、緩衝液のみの検体のシグナルと比較して充分に強ければ、 当該 pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液の pHの候補として挙げられる。
[0033] 2.添カ卩回収への pHの影響
免疫化学的測定法に用いる検体 (例えば、気管支肺胞洗浄液）に、既知量のチトク ロム cを添加する。チトクロム cを添カ卩した検体、及び添カ卩しな力つた検体中のチトクロ ム c量を、当該免疫化学的な方法により測定し、理論値に対する測定値の比率を回 収率とする。
[0034] 回収率は、添カ卩したチトクロム c量を A、チトクロム c未添加検体中のチトクロム c測定 値を B、チトクロム c添加検体中のチトクロム c測定値を Cとして、
(1)測定値 (C) Z理論値 (Aと Bの加重平均)、
(2)チトクロム c添カ卩による測定値の上昇値 (C - B) Z添加量 (A)、
の何れでも計算できる。
[0035] 回収率が 70%以上、好ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上の場合、当該 pHは 免疫化学的測定法に用いる緩衝液の pHの候補として挙げられる。
[0036] 当該免疫化学的な方法に用いる緩衝液の pHは 1.測定感度への pHの影響、 2.添 加回収への pHの影響を勘案して決定する。緩衝液の種類は、酸性条件に調整し得 る緩衝液であれば特に制限されないが、例えばクェン酸リン酸緩衝液などが挙げら れる。
[0037] また、免疫化学的なチトクロム cの測定に当たり、酸性領域の緩衝液を用いる方法 は、固相化した抗体と検体中のチトクロム cとを反応させる第 1反応のみならず、第 1 反応で妨害物質が除去しきれなかった時に、第 2反応 (チトクロム cと標識抗体を反応 させる工程）に用いても有効である。
本態様の方法は、第 1反応で酸性領域の緩衝液を用いる方法に限られるものでは ない。
[0038] 本態様の方法では、通常には、酸性条件で抗チトクロム c抗体とチトクロム cとを反応 させた後に、チトクロム cの検出を行う。検出は、好ましくは洗浄を行った後、例えば、 標識された 2次抗体を反応させ、標識に応じた検出法により、検出する方法が挙げら れる。例えば、ピオチン標識された 2次抗体を用いる場合は、さらに、アビジン標識さ れたペルォキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を反応させた後、該酵 素の基質を用いて発光又は発色により検出することができる。また、酵素標識された 2 次抗体、蛍光標識された 2次抗体、ルテニウム標識された 2次抗体などを用いてもよ い。
[0039] チトクロム cを測定する免疫化学的方法の例としては、例えば下記の参考例に記載 した方法で調製したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体を用いる方法が挙げられ る。
[0040] さらに本発明は、肺傷害検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチト クロム cを定量するための試薬を含むことを特徴とするキット、及び、肺傷害を伴う肺 疾患検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチトクロム cを定量するため の試薬を含むことを特徴とするキットに関する。本発明のキットは、好ましくは、体液を 含む溶液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するための試薬、通常には、チトクロ ム c抗体を含む。本発明のキットは、さらに好ましくは、抗チトクロム c抗体とチトクロム c の反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とするキットである。例えば、キット付 属の使用説明書に、酸性条件でチトクロム cと抗チトクロム c抗体の反応を行う旨が記 載されたキットが挙げられる。また、酸性に調整した反応用緩衝液を含むキットでもよ い。本発明のキットは抗チトクロム c抗体の他に、 2次抗体、チトクロム c標準液、希釈 液、洗浄液、検出用の基質などを含むものでもよい。
[0041] 本発明の検査キットは、通常には、体液を含む溶液中のチトクロム cをチトクロムじに 対する抗体を用いて定量するための試薬を含む。この態様の試薬は、例えば、抗体 として抗チトクロム c抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられる試薬と 同様の構成でよい。その一例としてサンドイッチ法によりチトクロム cを測定する検査 試薬は、例えば 1)抗チトクロム c抗体コートカップ、抗チトクロム c抗体コートビーズなど の抗チトクロム c抗体コート固相、 2)標識抗チトクロム c抗体、 3)既知濃度のチトクロム c 標準溶液、 4)希釈液、 5)洗浄液、を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、 6) 発色基質、 7)反応停止液が含まれてもよい。
[0042] チトクロム cの定量結果を指標として用いることにより、肺傷害の程度が検査される。
例えばチトクロム cの定量値が正常値と比較して高値であるときに、肺傷害と判定する ことができる。また、正常値上限 (カットオフ値)を設定し (例えば、コントロール群の濃 度の平均値 +標準偏差の 2倍)、それとの比較で肺傷害の有無を判定してもよい。肺 傷害を伴う肺疾患の検査も肺傷害の程度の検査と同様に行うことができる。
実施例
[0043] 以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではな い。％は、特記しない限り質量％である。
[0044] [参考例 1 ]抗チトクロム cモノクローナル抗体の作製
ヒトチトクロム c (R&D Systems社） 110 μ g/100 μ Lと 65 mMリン酸緩衝液 pH 7.5に溶 解した 2 mg/mLォブアルブミン 55 μ Lを混合して、そこへ 65 mMリン酸緩衝液 pH 7.5 で希釈した 1 mMダルタルアルデヒド 42 Lを加え、室温で 2時間撹拌した。次に、 0.1 5 M NaClで 4°Cにおいて 48時間透析し、等量の FCAとの混合物を作製し、 BALB/C マウス腹腔に 0.1 mL免疫した。 2週間おきに合計 3回同様に免疫した。 3回目の免疫 の 2週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロム c50 g/100 Lを尾静脈よ り静注した。 3日後マウス力も脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリェチ レングリコール法によりミエローマ細胞 P3X63 Ag8U.lと細胞融合した。ヒトチトクロム c を抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロム cに対するモノクローナル抗体産生 ハイプリドーマ（clone： 27G9)を榭立した。
[0045] 榭立したノヽイブリドーマをエスクロン SF-B培地（三光純薬社)で培養して増殖させ、 BALB/Cマウス腹腔に接種した。 1週間後、腹水を採取した。採取した腹水からプロ ティン Aを用いて IgGを精製し、抗チトクロム c抗体 (27G9抗体)を得た。 [0046] [参考例 2]抗チトクロム c抗体固相化ビーズの作製
抗チトクロム cモノクローナル抗体（clone : 2B5F8 (R&D Systems社））を、 0.15M NaCl を含む 0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2)で透析し、 OD 280 nmが 0.56になるよう 0.15M NaC 1を含む 0.1 M酢酸緩衝液 (pH 4.2)で希釈した。希釈した抗体 1.67 mLを、あらかじめ 磁石を用いて 0.15M NaClを含む 0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2) 3 mLで 3回洗浄したビー ズ（Dynabeads (登録商標） M-450 Epoxy, Dynal社） 3.36 mL分と混合し、室温で 17時 間撹拌した。次にビーズをブロッキングバッファー（50 mM Tris - HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN , pH7.5) 3 mLで懸濁し、室温で 7時間撹拌してビーズをブロッキン
3
グした。ブロッキングされたビーズを 150mM Tris - HCl, 1% BSA, 0.3%トレハロース， 0. 03容量％ Tween 20, 0.3% NaN , EDTA, pH7.5、 3 mLで 3回洗浄し、 150mM Tris - HCl
3
,3% BSA, 0.3%トレハロース， 0.03容量％ Tween 20, 75 μ g/mLマウス IgG, 0.3% NaN ,
3 pH7.5、 12.5mLに懸濁した。これを使用時に濃度を調整して測定に用いた。
[0047] [参考例 3]ルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体の作製
参考例 1で作製した抗チトクロム cモノクローナル抗体 (27G9抗体)を PBSで透析し、 抗体濃度を 0.5 mg/mLから 2 mg/mLの範囲に調製した。抗体 1 mLにジメチルスルホ キシドに 10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体（ruthenium(II) tris(bipyridyl)-N-hy droxysuccinimide, IGEN Corp. USA)を 12.2 μ Lカ卩ぇ室温で 30分撹拌した。次に 2 M グリシンを 50 L加え、室温で 10分撹拌した。それを、 PBS-3 (10 mMリン酸カリウム， 0 .15M NaCl, 0.05% NaN , pH 6)であらかじめ平衡化した Sephadex G- 25 (GEヘルスケ
3
ァバイオサイエンス社)カラム（1.5 αη φ X 30 cm)にアプライして PBS- 3で溶出し、 1 m Lでフラクション分取した。各フラクションの OD 280 nmを測定し、第 1ピークのフラクシ ヨンを集め、ルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体とした。抗体濃度を Micro BCA pr otein Assay kit (PIERCE社）を用いて測定した。
[0048] [参考例 4]ヒトチトクロム c標準抗原の調製
チトクロム c標準抗原は、ヒトチトクロム c (R&D Systems社）を 5% BSA、 0.15 M NaCl, 0.1% NaNを含む 0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.4で 3000 ng/mL, 1000 ng/mL, 1
3
00 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mLに希釈して作製した。
[0049] [実施例 1] 急性呼吸窮迫 (促迫)症候群、特発性肺線維症、非特異的間質性肺炎、持続性器 質化肺炎、膠原病由来の間質性肺炎、過敏性肺炎、および、サルコイドーシスの患 者、ならびに、健常者カゝら気管支肺胞洗浄液を採取した。気管支肺胞洗浄液の採取 方法は、 1990年に厚生省特定疾患研究班により作成されたガイドラインに沿った。す なわち、滅菌生理食塩水 150mLで気管支肺胞を洗浄し、回収した洗浄液をガーゼで 漉して粘液を除去し、気管支肺胞洗浄液とした。
[0050] 検体希釈液（0.15M NaCl, 15mM EDTA, 2% Lipidure (登録商標)- BL802 (日本油 脂社)， 2% Lipidure (登録商標)- BL405 (日本油脂社)， 0.1% NaNを含む 0.1Mこはく酸
3
緩衝液， PH4.0)をピコルミ™8220用反応管（三光純薬社）に 200 L入れ、次に検体 を 20 μ L注入した。
[0051] 以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ™8220 (三光純薬社)を用 いて行った。
[0052] 反応管に、 1% BSA, 0.3%スクロース， 0.01容量％ Tween 20, 0.1% NaNを含む 0.15
3
M PBS, pH 7.5でビーズ濃度 lmg/mLに調整した抗チトクロム c抗体固相化ビーズ 25 Lをカ卩えて 9分反応させ、ピコルミ BF洗浄液 (三光純薬社) 350 Lで 2回洗浄後、 1% BSA, 0.3%スクロース， 0.01容量％ Tween 20, 0.1% NaNを含む 0.15 M PBS, pH 7.5
3
で 0.5— 1 μ g/mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 200 μ Lを加えて 9分反応させた。ピコルミ BF洗浄液 350 Lで 2回洗浄後、ピコルミ発光電解液 (三光 純薬社)を 300 μ L加えて発光カウント値を計測した。
[0053] 横軸にヒトチトクロム c標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロム c標準抗原のカウント値を プロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、気管支肺洗浄液の発光カウント 値力 それぞれに含まれるチトクロム c量を算出し、マンホイット-一順位和検定 (Man n-Whitney U-test)により疾患群間における有意差を検討した。
[0054] その結果を図 1に示す。図 1によれば、非特異的間質性肺炎 (NSIP)やコントロール（ CONTROL)にはチトクロム c量の上昇が全く見られず、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) 、特発性肺線維症 (IPF)、持続性器質化肺炎 (COP)、膠原病由来の間質性肺炎 (CV D-IP)、過敏性肺炎 (HP)、サルコイドーシス (SA)ではチトクロム c量の上昇が見られた。 特に急性呼吸窮迫症候群はチトクロム c量の上昇が顕著に見られた。チトクロム c量 の上昇が見られない疾患は肺傷害を伴わない疾患である力、又は、本実施例におい て気管支肺胞洗浄液を採取した患者では肺傷害が生じる段階に達して 、な 、と考え られる。
[0055] 次に、症例の疾患分類を詳細に検討した結果、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)l例を 過敏性肺炎 (HP)に、特発性肺線維症 (IPF)l例を急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)に変更 した。更に、有意差検定の方法を分散分析 (one way ANOVA)および多重比較 (po st hoc analysis)に変更して検討した。
[0056] その結果を図 2および図 3に示す。図 2および図 3によれば、非特異的間質性肺炎（ NSIP)、持続性器質ィ匕肺炎 (COP)およびコントロール (CONTROL)にはチトクロム c量 の上昇が全く見られず、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、特発性肺線維症 (IPF)、膠原 病由来の間質性肺炎 (CVD-IP)、過敏性肺炎 (HP)、サルコイドーシス (SA)ではチトクロ ム c量の上昇が見られた (pく 0.05)。特に急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)はチトクロム c量 の上昇が顕著に見られた (pく 0.0001)。チトクロム c量の上昇が見られな 、疾患は肺傷 害を伴わない疾患であるカゝ、又は、本実施例において気管支肺胞洗浄液を採取した 患者では肺傷害が生じる段階に達して 、な 、と考えられる。
[0057] [実施例 2]
肺傷害の程度とチトクロム c量との関係をマウス実験動物モデルにおいて説明する ブレオマイシン (BLM)誘発肺傷害動物モデルは、ヒト急性肺傷害 ·特発性間質性肺 炎のモデルとして広く使われている（Adamson IY. et al.， American J. Pathol. 77:185- 197, 1974) o 7〜8週齢の C57BL/6雄性マウスにフエノバルビタールナトリウム（シエリ ング ·ブラウ社)を腹腔内に投与して麻酔し、体重 lkgあたり、滅菌生理食塩水に溶解 した 3.0Uのブレオマイシン（日本ィ匕薬社)を気管内投与して、肺傷害動物モデルを作 製した。ブレオマイシン非投与群、投与後 7日群、投与後 14日群について、滅菌生 理食塩水 lmLで 2回気管支肺胞内を洗浄して気管支肺胞洗浄液を採取した。気管 支肺胞洗浄液中のチトクロム c量を測定した結果を図 4に示す。
[0058] 以上のことより、チトクロム cを測定することにより、肺傷害の程度が評価でき、また、 肺傷害を伴う肺疾患、特に急性呼吸窮迫症候群を検査できることが示された。 [0059] [実施例 3]
特発性肺線維症 (IPF)患者の血清中チトクロム c量を測定した。
検体希釈液（0.15M塩化ナトリウム， 15mM EDTA, 2% Lipidure (登録商標)- BL802 ( 日本油脂社)， 2% Lipidure (登録商標)- BL405 (日本油脂社)， 0.1% NaN3を含む 0.1M こはく酸緩衝液， PH4.0)をピコルミ™8220用反応管（三光純薬社）に 200 μ L入れ、 次に血清を 20 μ L注入した。
[0060] 以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ™8220 (三光純薬社)を用 いて行った。
[0061] 反応管に、 1% BSA, 0.3%トレハロース， 10mM EDTA, 0.15M塩化ナトリウム， 0.01 容量％ Tween 20, 0.1% NaNを含む 50mM Tris-HCl, pH 7.5でビーズ濃度 lmg/mLに
3
調整した抗チトクロム c抗体固相化ビーズ 25 Lを加えて 9分反応させ、ピコルミ BF洗 浄液（三光純薬社） 350 Lで 2回洗浄後、 1% BSA, 0.3%トレハロース， 0.15M塩化ナト リウム， 0.01容量％ Tween 20, 0.1% NaNを含む 50 mM Tris -HCl, pH 7.5で 0.5— 1
3
g/mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 200 μ Lをカ卩えて 9分反応させ た。ピコルミ BF洗浄液 350 Lで 2回洗浄後、ピコルミ発光電解液 (三光純薬社)を 300 μ L加えて発光カウント値を計測した。
[0062] 横軸にヒトチトクロム c標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロム c標準抗原のカウント値を プロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、気管支肺洗浄液の発光カウント 値力もそれぞれに含まれるチトクロム c量を算出した。
[0063] その結果を表 1及び図 5に示した。表 1に血清を採取した日、最初の採取日からの 日数、及びそれぞれのチトクロム c量を示した。疾患は臨床所見、検査所見により進 行していることを確認し、チトクロム c量もそれに応じて上昇し、特に重篤な肺障害を 伴った死亡例では、著明な高値を呈することが解った。
[0064] [表 1] チトクロム c量 疾患 症例 経過時間 （日）
(ng/raL)
0 18.3
98 13.5
1
126 9.8
IPF
194 1112.9
0 16.0
8 12.2
2
19 472.3
26 2536.6
[0065] 以上のことより、チトクロム cを測定することにより、肺傷害の程度が評価でき、また、 肺傷害を伴う肺疾患を検査できることが示された。
産業上の利用可能性
[0066] 本発明によれば、肺傷害 (肺胞細胞の傷害)の程度を容易に検査することができる 。また、肺傷害を伴う肺疾患、特に間質性肺疾患や急性呼吸窮迫症候群の検査を行 うことができる。

Claims

請求の範囲
[I] 肺疾患における肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロ ム cを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする方法。
[2] 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、請求項 1記載の方法。
[3] 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、請求項 1記載の方法。
[4] 定量が免疫化学的方法による請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
[5] 以下の工程を含む請求項 4記載の方法。
(1)採取した体液中のチトクロム cを免疫化学的方法により定量する工程
(2)定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害と判定する工程
[6] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、請求項 4又は 5に記載の方法。
[7] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、請求項 6記載 の方法。
[8] 酸性領域が pH3. 0から pH6. 0である、請求項 7記載の方法。
[9] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である請求項 1〜8の 、ずれか 1項に記載の 方法。
[10] 肺傷害検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチトクロム cを定量するた めの試薬を含むことを特徴とするキット。
[I I] 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、請求項 10記載のキット。
[12] 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、請求項 10記載のキット。
[13] 定量が免疫化学的方法による請求項 10〜 12のいずれか 1項に記載のキット。
[14] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、請求項 13に記載のキット。
[15] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩衝液を 含む、請求項 14記載のキット。
[16] 酸性領域が pH3. 0から pH6. 0である、請求項 15記載のキット。
[17] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である請求項 10〜16の ヽずれか 1項に記載 のキット。
[18] 肺傷害を伴う肺疾患を検査する方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロ ム cを定量することにより肺傷害を伴う肺疾患を検査することを特徴とする方法。
[19] 肺疾患が間質性肺疾患である、請求項 18記載の方法。
[20] 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、請求項 18記載の方法。
[21] 定量が免疫化学的方法による請求項 18〜20のいずれか 1項に記載の方法。
[22] 以下の工程を含む請求項 21に記載の方法。
(1)採取した体液中のチトクロム cを免疫化学的方法により定量する工程
(2)定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害を伴う肺疾患と判定するェ 程
[23] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、請求項
21又は 22記載の方法。
[24] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、請求項 23記載 の方法。
[25] 酸性領域が pH3. 0から pH6. 0である、請求項 24記載の方法。
[26] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である請求項 18〜25の ヽずれか 1項に記載 の方法。
[27] 肺傷害を伴う肺疾患の検査用キットであって、採取した気管支肺胞洗浄液中のチトク ロム cを定量するための試薬を含むことを特徴とするキット。
[28] 肺疾患が間質性肺疾患である、請求項 27記載のキット。
[29] 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、請求項 27記載のキット。
[30] 定量が免疫化学的方法による請求項 27〜29の 、ずれか 1項に記載のキット。
[31] 免疫化学的方法が抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応による方法である、請求項
30記載のキット。
[32] 抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩衝液を 含む、請求項 31記載のキット。
[33] 酸性領域が PH3. 0から pH6. 0である、請求項 32記載のキット。
[34] 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である請求項 27〜33の ヽずれか 1項に記載 のキット。
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