WO2007129466A1 - 補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法 - Google Patents

補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007129466A1
WO2007129466A1 PCT/JP2007/000471 JP2007000471W WO2007129466A1 WO 2007129466 A1 WO2007129466 A1 WO 2007129466A1 JP 2007000471 W JP2007000471 W JP 2007000471W WO 2007129466 A1 WO2007129466 A1 WO 2007129466A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganism
activity
acid
strain
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/000471
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Morishige
Mitsufumi Wada
Hitoshi Takahashi
Daisuke Mochizuki
Junko Tokuda
Original Assignee
Mitsui Chemicals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsui Chemicals, Inc. filed Critical Mitsui Chemicals, Inc.
Priority to KR1020087029542A priority Critical patent/KR101109402B1/ko
Priority to CN2007800162589A priority patent/CN101437949B/zh
Priority to JP2008514388A priority patent/JP4886775B2/ja
Priority to EP07737127.6A priority patent/EP2025760B1/en
Priority to ES07737127T priority patent/ES2424866T3/es
Priority to US12/299,679 priority patent/US8748157B2/en
Publication of WO2007129466A1 publication Critical patent/WO2007129466A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism that produces hydroxycarboxylic acid including glycolic acid, and a method for producing hydroxycarboxylic acid including glycolic acid using a microorganism.
  • Some hydroxycarboxylic acids are useful as polymer raw materials and pharmaceutical intermediates, and there is a demand for an efficient production method thereof.
  • One example is glycolic acid (hyhydroxyacetic acid).
  • Glycolic acid has been used as a raw material for detergents and cosmetics, but has recently attracted attention as a raw material for polyglycolic acid useful as a gas barrier polymer and a medical polymer.
  • the reason for attracting attention as a gas / clear material is that the polyglycolic acid layer has a high oxygen gas barrier property, and is used as a material for packaging altered soapy foods and carbonated drinks in the presence of oxygen. It is because it has the performance of.
  • glycolic acid of chemical synthesis products currently on the market contains a lot of impurities, and there is a problem in purity as a polymer raw material. This is because these contaminants not only inhibit the dehydration condensation reaction of glycolic acid, but methoxyacetic acid, one of the contaminants, is a suspected carcinogenic compound and is contained in food and beverage packaging materials. This is because it is not desirable. Although it is technically possible to remove impurities by refining, such a refined product is expensive and is not practical as an inexpensive packaging material.
  • a method for producing glycolic acid by a microorganism is disclosed.
  • the one having the highest glycolic acid accumulation concentration is a method using Pichianaganishii, The reaction yielded 35.3 gZL of glycolic acid.
  • Non-patent document 1 reports that for glycolic acid production using Pichia Naganishi, the reaction conditions were further improved, and 105 gZL of glycolic acid was obtained after 120 hours of reaction. .
  • Patent Document 3 by introducing a gene encoding lactaldehyde reductase and a gene encoding lactaldehyde dehydrogenase in the form of a plasmid, by using a microorganism to which the enzyme activity is imparted or enhanced, ethylene is used. It is possible to produce glycolic acid and other hydroxycarboxylic acids starting from aliphatic polyhydric alcohols having a hydroxyl group at the terminal, such as glycol, and glycolic acid oxidase possessed by microorganisms It has been disclosed that the productivity of glycolic acid is improved by disrupting the gene coding for and inactivating the enzyme activity.
  • a method for producing a ketone from alcohol using an oxidase reduced nicotinamide that produces oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter sometimes abbreviated as NAD) necessary for the reaction is produced.
  • NAD oxidized nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADH leotide
  • NAD regeneration methods that compensate for the above drawbacks include a method using NADH dehydrogenase that regenerates NAD by reducing molecular oxygen through the respiratory chain of microorganisms to produce water. (Patent Document 4), however, no examples of microorganisms with enhanced enzyme activity have been reported.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-174593
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-174594
  • Patent Document 3 International Publication No. 2005 1 06005 Pamphlet
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005_21 8349
  • Non-Terasho Literature 1 B Io s c I. B i o te c h n o l. B i o c h em., Vo l. 65 (1 0), p p. 2265-2270, (2001)
  • the chemical synthesis method is not sufficient in terms of the purity of the resulting hydroxycarboxylic acid, and the conventional biomethod has a problem that the amount of cells used for the production reaction is large and the cells are discarded.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing hydroxycarboxylic acids that can be efficiently produced with a small amount of bacterial cells, and a microorganism suitable for the production method. is there.
  • microorganism is a microorganism in which at least one enzyme activity of lactaldehyde reductase and lactaldehyde dehydrogenase is enhanced.
  • a microorganism that enhances at least one enzyme activity of lactaldehyde reductase and lactaldehyde dehydrogenase and enhances the activity of NADH dehydrogenase.
  • hydroxycarboxylic acids such as liglycolic acid can be efficiently produced with a small amount of cells.
  • FIG. 1 is a graph showing time-dependent changes in intracellular N A D HZN A D ratio (01 to 1 content, 80 content) in Reference Example 1.
  • the mouth in the figure indicates the N A D H N A D ratio of the I c D E FZ pGAP fuc O-a I d A-n d h strain.
  • the circles in the figure indicate the NAD HZ N AD ratio of I c DEF / pGA P fuc O-a I d A strain.
  • This embodiment is a method for producing a hydroxycarboxylic acid.
  • This method uses microorganisms with enhanced NADH dehydrogenase activity in a method for producing hydroxycarboxylic acid from an aliphatic polyhydric alcohol having a hydroxyl group at its terminal using microorganisms.
  • a microorganism is an aliphatic polyvalent having a hydroxyl group at its terminal by using any means, regardless of whether or not it originally has the ability to produce a hydroxycarboxylic acid from an aliphatic polyhydric alcohol having a hydroxyl group at its terminal. Any microorganism can be used as long as it is capable of producing hydroxycarboxylic acid from alcohol.
  • Escherichia genus Baci II us J ⁇ , Pseud omo nas J ⁇ , Serratia genus, Brevibacterium genus, Corynebacteria (C orynebacterium)), Srepeptococcus (S treptococcus)), Lactobaci II us, Rhodococcus, Streptomyces ces) Genus Sacchar omy ces, KI uyver omy ces J, Sch zosacchar omy ces exhibition, 1 ⁇ , yarrows ow ia), genus T richosporon, genus Rhodosporidium, Pichia, C andida, N eurospora, Aspergillus III us), cephalosporium (G epha Iosporium), Trichoderma (Trichoder ma) and other host vector systems such as bacteria, actinomycetes, yeast and mold Preferred ⁇ Escherichiacoli> is
  • the structure of the aliphatic polyhydric alcohol having a hydroxyl group at the end is not particularly limited as long as it is an aliphatic compound having a hydroxyl group at the end of the carbon chain and having two or more hydroxyl groups in the molecule.
  • Such compounds include ethylene glycol, diethylene glycol, glycerol, 1,3_propanediol, 1,2_butanediol, 1,3_butanediol, 1,4_butanediol, 1,2,4_butanetriol Etc. can be exemplified.
  • the hydroxycarboxylic acid is a compound obtained by oxidizing one of the terminal carbons having a hydroxyl group with respect to the aliphatic polyhydric alcohols having a hydroxyl group at the terminal as described above.
  • examples of such compounds include glycolic acid, hydroxyethoxyacetic acid, glyceric acid, 3-hydroxypropanoic acid, 2-hydroxybutanoic acid, 3-hydroxybutanoic acid, 4-hydroxybutanoic acid, and 2,4-dihydroxybutanoic acid. it can.
  • nicotinamide adenine dinucleotide refers to both oxidized and reduced forms unless otherwise specified.
  • ethylene glycol can be used as the aliphatic polyhydric alcohol having a hydroxyl group at the terminal.
  • hydroxycarboxylic acid For example, glycolic acid can be preferably used.
  • NADH dehydrogenase is the enzyme number 1.6.5.3 or 1.6.9.9 according to the report of the International Biochemical Union (UB) enzyme committee. It is a generic term for enzymes that are reversibly catalyzed to produce NAD from NADH using quinones such as ubiquinone, dimethylmenaquinone and menaquinone as electron acceptors. N A D H dehydrogenases classified into enzyme number 1.6.9.9.3 according to the report of I.U.B. Enzyme Committee are preferred.
  • NADH dehydrogenase encoded by the gene n d h reported by Gen B a n k a c c e s s i o n n um ber V 00306 is exemplified.
  • Microorganisms with improved enzyme activity are, for example, a method of introducing a gene encoding the enzyme into a wild-type microorganism (or a microorganism before recombination) using genetic recombination technology, or coding the enzyme in the genome. It can be created using a method such as introducing a mutation into the promoter of a gene.
  • An example of a method for introducing the gene into a wild-type microorganism (or a microorganism before recombination) is to introduce the gene into the microorganism in the form of a plasmid.
  • the microorganism according to this embodiment enhances at least one enzyme activity of lactaldehyde reductase and lactaldehyde dehydrogenase.
  • lactaldehyde reductase is classified into I. UB enzyme committee report according to the enzyme number 1. 1. 1. 77, 1.2 _ propanediol from the cofactor NAD NAD A generic term for enzymes that reversibly catalyze reactions that produce lactaldehyde in the presence.
  • lactaldehyde dehydrogenase is classified into enzyme number 1.2.22 according to the report of the I. UB Enzyme Committee. Lactic acid is used in the presence of NAD as a coenzyme. It refers to the generic name of enzymes that catalyze the reaction to be produced, and is classified as enzyme number 1.2.2.21 according to the report of the UB enzyme committee. From glycol aldehyde, in the presence of NAD which is a coenzyme It also refers to the generic name of the enzyme glycol aldehyde dehydrogenase that catalyzes the reaction to produce glycolic acid.
  • the fact that at least one enzyme activity of lactaldehyde reductase and lactaldehyde dehydrogenase has been enhanced means that, for example, in Escherichia coli, at least one enzyme activity of these enzymes is a wild strain (or group). It is preferably 20 times or more, more preferably 100 times or more that of the microorganism before replacement.
  • Microorganisms with improved enzyme activity include, for example, a method of introducing a gene encoding the enzyme into a wild-type microorganism (or a microorganism before recombination) using genetic recombination technology, or the enzyme in the genome. It can be created using a method such as introducing a mutation into the promoter of the gene to be encoded.
  • An example of a method for introducing the gene into a wild-type microorganism (or a microorganism before recombination) is to introduce the gene into the microorganism in the form of a plasmid.
  • Escherichia coli having improved enzyme activities of lactaldehyde reductase and lactaldehyde dehydrogenase can be prepared as follows.
  • Escherichia coli genomic DNA is used as a template, amplified by PCR using an oligonucleotide as a primer, and the resulting DNA fragment is digested with a restriction enzyme. Get the fuc O fragment.
  • Escherichia coli genomic DNA was used as a template, amplified by the PCR method using a primer oligonucleotide, and the resulting DNA fragment was restricted to a restriction enzyme. Digest with to get a I d A fragment.
  • GAP DH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the microorganism according to the present embodiment inactivates glycolic acid oxidase activity or reduces it compared to the original activity of the microorganism.
  • glycolate oxidase is classified into enzyme number 1.1.3.5 according to the I.U.B.Enzyme Committee report, and a reaction to produce glyoxylate from glycolic acid.
  • Inactivation of glycolate oxidase activity means that the enzyme activity is completely lost.
  • reduction of glycolate oxidase activity means that part of the enzyme activity disappears, and less than half of glycolate oxidase activity of wild strains (or microorganisms before recombination). More preferably, it is 10 or less.
  • mutations are introduced into the gene encoding the protein, it is deleted, replaced, or an agent that specifically inactivates the protein is added. There are methods such as irradiating. A method for deleting a target gene, a method for mutating it, and a method for replacing it can be carried out by ordinary methods well known to those skilled in the art.
  • Escherichia coli MT-1 1 0 2 3 strain is a microorganism in which the glycolic acid oxidase activity is inactivated by the destruction of g I c DEF, a gene that codes for glycomonophosphate oxidase It can be illustrated as
  • Escherichia coli 1 ⁇ 1 1 _ 1 1 0 2 3 strain glycolic acid oxidase is inactivated by gene disruption, and therefore, it is possible to carry out the present invention using this.
  • This strain has a deposit number of FERMBP- 1 0 2 9 3 and is located in 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture. It has been deposited since March 10, 1995, based on the Budapest Treaty concerning international recognition of deposits.
  • in the form of blastamide means that the gene is linked to a vector to produce a recombinant plasmid, which is transformed into It means introducing into the microorganism by a method.
  • a strong promoter that functions constantly in microorganisms and the target gene are operably linked, the number of copies per microbial cell is generally low due to the nature of the levicon contained in the plasmid.
  • the object of the present invention can also be achieved by using a plasmid. Examples of the plasmid having such a levicon include pACYC 84 (Genbank accession number X 06403).
  • microorganisms are cultured and grown using a medium to obtain a necessary amount of microbial cells.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.
  • a carbon source saccharides such as glucose, fructose and molasses, organic acids such as fumaric acid, succinic acid and succinic acid, alcohols such as methanol, ethanol and glycerol, and others are appropriately used.
  • organic and inorganic nitrogen sources such as organic ammonium salts, inorganic ammonium salts, ammonia gas, aqueous ammonia, and protein hydrolysates are used as appropriate.
  • magnesium ions magnesium ions, phosphate ions, potassium ions, iron ions, manganese ions, sulfate ions, and others are appropriately used as necessary.
  • organic trace components vitamins, amino acids and the like, yeast extracts containing these, peptone, corn steep liquor, casein degradation products, and others are used as appropriate.
  • the medium used for the culture is preferably a liquid medium in view of the point of being used for industrial production.
  • the culture medium composition is polypeptone 0.5 gZL or more and 10 gZL or less, Fe 2 SO 4 0.02 gZL or more and 0.3 gZL or less, K 2 H PO 4 0.5 gZL or more and 5 gZL or less, KH 2 PO 4 0.5 gZL or more, 5 gZL or less, Mg S0 4 ⁇ 7 H 2 OO. 5 gZL or more and 5 gZL or less, (NH 4 ) 2 SO 4 0.3 gZL or more 15 g ZL or less, Nicotinic acid 0.02 ⁇ 1_ or more and 1 gZL or less (solvent is water).
  • the culture conditions are not particularly limited,
  • the aeration rate is preferably 0.2 LZm in to 3 LZm in or less, and more preferably 0.5 LZm in to 2 LZm in per 1 L of the medium.
  • the stirring speed is preferably 20 0 rpm or more and 1 000 rpm or less, and more preferably 500 rpm or more and 80 0 rpm. By doing so, it is possible to obtain microbial cells having a large amount of hydroxycarboxylic acid production per microbial weight.
  • culture can be performed by using a bubble column or the like that can realize the above-described aeration and stirring conditions and supply of dissolved oxygen.
  • the pH is preferably 5 or more and 8 or less, more preferably pH 7.0 or more and 7.4 or less, and most preferably pH 7.2. By doing this, it is possible to obtain cells having a large amount of hydroxycarboxylic acid produced per cell weight.
  • the temperature is preferably 25 ° C or more and 40 ° C or less, more preferably 33 ° C or more and 37 ° C or less, and most preferably 35 ° C. By doing so, it is possible to obtain bacterial cells having a large production amount of hydroxycarboxylic acid per cell weight.
  • the time required for cultivation should be 12 to 50 hours. Thereby, a microbial cell with much production amount of hydroxycarboxylic acid per microbial cell weight can be obtained.
  • Examples of the solvent used for the production of hydroxycarboxylic acid include a buffer solution such as a potassium phosphate buffer, a medium used for culturing the aforementioned microorganism, and pure water.
  • the reaction can be carried out by bringing the microbial cells previously obtained by culturing into contact with a mixed liquid of a raw material aliphatic polyhydric alcohol and a solvent.
  • Microbial cells can be obtained by the method of using the culture solution itself after culturing or the culture solution. A method of recovering and using only bacterial cells from can be exemplified.
  • reaction conditions are not particularly limited,
  • pH is preferably 6 or more and 9 or less, more preferably pH 7.0 or more and 8.0 or less, and most preferably pH 7.2.
  • the temperature is preferably in the range of 20 ° C to 45 ° C, particularly preferably 30 ° C to 40 ° C, and most preferably 35 ° C.
  • the reaction is preferably aerobic.
  • the aeration rate is preferably 0.1 LZmin or more and 2.0 L / min or less per 1 liter of the reaction solution, and more preferably 0.2 Lmin or more and 1. OLzmin or less.
  • the stirring speed is preferably 200 rpm or more and 1 000 rpm or less, and more preferably 400 rpm or more and 800 rpm or less. By doing so, the effect of increasing the amount of hydroxycarboxylic acid produced per amount of cells added to the reaction solution can be obtained.
  • the reaction can also be achieved by using a bubble column or the like that can realize the above-described aeration and stirring conditions and supply of dissolved oxygen.
  • hydroxycarboxylic acid can be obtained with a yield of 80% or more.
  • the method for recovering hydroxycarboxylic acid, which is a product accumulated in the reaction solution obtained as described above, is not particularly limited.
  • cells are removed from the reaction solution by centrifugation or the like. After that, a method using a synthetic adsorption resin, a method using a precipitating agent, or a method of separating by a normal collection and separation method can be adopted.
  • SEQ ID NO: 1 (TTGGTAC CG TTCTGC CAG CAA CT GA CG) and SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2 (TTGGTAC CG TTCTGC CAG CAA CT GA CG) created based on the genetic information in the vicinity of g I c DEF of genomic DNA of Escherichia coli U MG 1 655 strain PCR was carried out using the oligonucleotides of TGTCT AGA GTACCTCTGTG CG T CA CTGG) and SEQ ID NO: 3 (GCTCT AGA CG CTTTGTTGTGTTGTGTGG) and SEQ ID NO: 4 (AACTG CAG GA TCG GT CAA T GA TTG CAG C).
  • the obtained DNA fragments were digested with restriction enzymes Kpn1 and Xbal, Xbal and Pstl, respectively, to obtain fragments of about 670 bp and 790 bp, respectively.
  • This DNA fragment was transformed into a temperature-sensitive cloning vector p TH 1 8 cs 1 (Gen B ankaccessionnumber ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 9 o 1 0) (Hashi mo to—Gotoh, T., Gene, 24 1, 1 8 5— 1 9 1 (2000)) was mixed with fragments obtained by digestion with K pnl and P st I, ligated with ligase, and then DH 5 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) at 30 ° C.
  • transformants were obtained that grew on LB agar plates containing 10 g / m I of chloramphenicol.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium containing 10 Ug / m I of chloramphenicol at 30 ° C., and the plasmid was recovered from the obtained cells.
  • This plasmid was transformed into Escherichia coli U MG 1655 strain at 30 ° C, and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mI of chloramphenicol at 30 ° C. A conversion was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / m I of chloramfic nicol and cultured at 30 ° C. for 1 hour. Next, it was applied to an LB agar plate containing 10 g / m I of chloramf ⁇ nicol so that these cultured cells were obtained, and colonies that grew at 42 ° C were obtained. Gain The obtained colonies were cultured in an LB liquid medium containing no drug at 30 ° C. and then applied to an LB agar plate containing no drug to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the genomic DNA of Escherichia coli MG 1 655 strain was used as a template, and SEQ ID NO: 5 (GCTCT AGA CG GAGAA AG TCTTAT GA TGGCT AA CAGAA T GA TTCTG) and SEQ ID NO: 6 ( GT GAAG CTTG CA TTTAC CAG G CG GTATGG) and amplified by PCR, and the resulting DNA fragment is digested with restriction enzymes XbaI and HindIII to give about 1.2 kbp. A fuc O fragment was obtained. Furthermore, to obtain a I d A, the genomic DNA of Escherichia U MG 1 655 strain was used as a template.
  • GAPDH glyceraldehyde 3_phosphate dehydrogenase
  • the genome DN A of Escherichia coli UMG 1 655 strain was used as a template, and SEQ ID NO: 9 (AACGAATTCTCGCAATGA TTGACACGATTC) and SEQ ID NO: 1
  • a DNA fragment encoding the GAPDH promoter of about 1 OO bp was obtained by amplifying by PCR using the oligonucleotide shown in 0 (ACAGAATTCGCT ATTTGTTAGTGAATAAAAGG) and digesting the obtained DNA fragment with the restriction enzyme Eco RI.
  • the plasmid p GAP fu cO_a I d A obtained in Production Example 2 was transformed into the I c DE F strain obtained in Production Example 1, and the LB agar plate containing 50 ⁇ g ampicillin at 37 ° C Ic DE FZ pGAP fu cO-a ld A strain was obtained by culturing for 1 hour.
  • Example 1 Construction of Lactaldehyde Reductase, Lactaldehyde Dehydrogenase, NADH Dehydrogenase Simultaneous Expression Vector and Construction of Ic DEF Strain Transformant Using the Vector
  • n d h The base sequence of the gene for NAD H dehydrogenase in Escherichia coli (hereinafter sometimes abbreviated as n d h) has already been reported (Gen B a n k a c c e s s i o n n umb e r V00306).
  • Escherichia coli UMG 1 655 genome DN A was used as template, SEQ ID NO: 1 1 (CGAAT T CCGGAGAAAG T CT TATGA CTACGGCAT TGAAAAAGAT TG TG) and SEQ ID NO: 1 2 (GGT CTAGACGAT TAATGCAACT T CAAACG
  • the ndh fragment of about 1.3 kbp was obtained by PCR amplification using the oligonucleotide shown in (1).
  • the obtained ndh fragment was treated with T4DNA polynucleotide kinase.
  • This DNA fragment and the p GAP fuc O_a I d A plasmid prepared in Production Example 2 were digested with Hind III, and then blunt-ended and dephosphorylated, and then mixed with ligase. And then transformed into Escherichia coli DH5 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 g mL of ampicillin. The obtained colony is cultivated in an LB liquid medium containing 50 g L of ampicillin at 37 ° C. The plasmid is recovered from the obtained bacterial cells, and this plasmid is recovered with pGA P fuc O-a.
  • I d A- ndh It was named I d A- ndh.
  • the resulting plasmid p GAP fuc Oa I d A_ ndh was transformed into the I c DEF strain obtained in Production Example 1 and cultured on an LB agar plate containing ampicillin 50 ⁇ gZm L at 37 ° C.
  • IcDEF / pGAPfucOaIdA_ndh strain was obtained.
  • Example 2 Glycolic acid production by Ag I c D E F / p GA P f u c O-a I d A-n d h strain
  • I c DEF / p GA P fuc Oa I d A_ nd obtained in Example 1 Inoculate 25 ml of LB Broth, Miller culture solution (D ifco 244620) in an Erlenmeyer flask as a pre-culture, and stir at a culture temperature of 35 ° C and 120 rpm. It was. The total amount of the preculture was transferred to a 1 L culture tank (AB LE culture device BM J — 01) containing 475 g of the medium having the composition shown below and cultured.
  • Cultivation was carried out at atmospheric pressure with an aeration rate of 0.5 LZmin, a stirring speed of 800 rpm, a culture temperature of 35 ° C, and a pH of 7.2 (adjusted with NH 3 aqueous solution). After the initial glucose completely depleted under the above conditions, 40 g of glucose was fed at a variable rate so that the glucose concentration in the medium was less than 0.1 g / 1 for the remaining time.
  • Nicotinic acid 0.1 gZL
  • the dry cell weight of the cells used in the reaction was determined from the dry weight after a part of the wet cells was dried at 50 ° C.
  • I c DE F / pGAP f u cO-a I d A-n d h produced 39.8 g of glycolic acid per g of dried cells.
  • the growth rate of the I c DE F / pGAP fu cO-a I d A-ndh strain is the same as that of the I c DE F / pGAP fu cO-a ld A strain in Comparative Example 1. It was confirmed that there was no growth delay due to the enhancement of ndh.
  • the I c DE F / pGAP fucO-al d A strain obtained in Production Example 3 was cultured and glycolic acid produced in the same manner as in Example 2. The amount of glycolic acid produced per 1 g of dried cells of the I c DE F / pGAP f u cO-al d strain was 20.2 g.
  • the ⁇ g Ic DE F / pGAP fucO—a I dA_n d h strain and the ⁇ Ic DE F / pGAP fucO-al d A strain were cultured and glycolic acid produced in the same manner as in Example 2.
  • the sample for NAD measurement contains 400 cells per 5 mg of collected wet cells.
  • Absorbance at 450 nm of the reaction solution was measured according to the protocol of Samurai Color One (Seikagaku Corporation).
  • a calibration curve was created by measuring a solution of NAD manufactured by SIGMA and subjected to the same treatment, and the NAD concentration of the sample was determined.
  • Samples for NADH measurement include 400 cells per 1.5 mg of wet cells collected
  • the method for producing hydroxycarboxylic acid and the microorganism of the present invention can be used for the production of hydroxycarboxylic acids such as glycolic acid, which are useful as polymer raw materials and pharmaceutical intermediates.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　微生物内にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入することによりＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの機能を強化して酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を向上させた微生物を用いてヒドロキシカルボン酸を生産する。

Description

明 細 書
補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法
技術分野
[0001 ] 本発明は、 グリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸を生産する微 生物と、 微生物を用いたグリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸生 産方法に関するものである。
背景技術
[0002] ヒドロキシカルボン酸類の中にはポリマー原料や医薬中間体として有用で 、 その効率的な生産方法が求められているものがある。 その一例としてグリ コール酸 （ひーヒドロキシ酢酸） が挙げられる。 グリコール酸は、 洗浄剤や 化粧品原料として利用されてきたが、 近年、 ガスバリア性ポリマーや医療用 ポリマーとして有用なポリグリコール酸の原料として注目されている。 ガス /くリァ性材料として注目されている理由はポリグリコ一ル酸層が高い酸素ガ スバリァ性を有しており、 酸素の存在下で変質しゃすい食品や炭酸飲料を包 装するための材料としての性能を備えているからである。
現行市販されている化学合成品のグリコール酸は少なからず夾雑物を含ん でおり、 ポリマー原料としては純度的に問題がある。 なぜならこれらの夾雑 物はグリコール酸の脱水縮合反応を阻害するのみならず、 夾雑物の一つであ るメ トキシ酢酸が発癌性の疑いのある化合物であり、 食品や飲料の包材中に 含まれることが望ましくないからである。 精製によって夾雑物を除くことは 技術的には可能であるが、 そのような精製品は価格が高くなり、 安価な包材 原料としては現実的でない。
[0003] 化学合成品のグリコール酸に見られる上記の問題点を回避するため、 ェチ レングリコールを原料としたバイォ法によるグリコール酸製造の試みが行わ れている。 特許文献 1及び特許文献 2において、 エチレングリコール含有培 地上で、 ピシァ （P i c h i a ) 属、 ロードトルラ （R h o d o t o r u I a ) 属、 スポロポロマイセス （S p o r o b o I o m y c e s ) 属、 クリベ ロマイセス ( K I u y v e r omy c e s) 属、 卜ノレロプシス (T o r u I o p s i s ) 属に属する酵母、 ノカルディァ （N o c a r d i a ) 属に属す る菌株、 口ドコッカス （R h o d o c o c c u s) 属に属する菌株、 または ェシェリヒア■ コリ B (E s c h e r i c h i a c o l i B) 株を培養 し、 培養液中からグリコール酸を分離■採取することを特徴とする微生物に よるグリコール酸の生産方法が開示されている。 特許文献 1及び特許文献 2 の実施例に記載されているグリコール酸生産方法の中でグリコール酸蓄積濃 度が最も高いものは、 ピシァ■ナガニシィ （P i c h i a n a g a n i s h i i ) を用いた方法であり、 30時間の反応で 35. 3 gZLのグリコー ル酸が得られている。 ピシァ■ナガ二シィを用いたグリコール酸生産につい ては更に、 反応条件の改善がなされ、 1 20時間の反応で 1 05 gZLのグ リコール酸が得られることが非特許文献 1で報告されている。
[0004] 特許文献 3においてはラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子 とラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をプラスミ ドの形 態で導入することで該酵素活性が付与又は強化された微生物を用いることに よりエチレングリコールをはじめとする末端に水酸基を有する脂肪族多価ァ ルコールを原料として、 グリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸 を生産することが可能であること、 さらには微生物が有しているグリコール 酸ォキシダーゼをコードする遺伝子を破壊し、 該酵素活性を不活性化するこ とによりグリコール酸の生産性が向上することが開示されている。
上記した従来の方法によるグリコ一ル酸をはじめとするヒドロキシカルボ ン酸の生産反応においては反応に供する菌体量が多いがために、 それに伴う 製造コストの上昇ゃ菌体に由来する不純物の夾雑、 さらにはヒドロキシカル ボン酸類の製造後に菌体を廃棄するのに多大な労力とコス卜がかかるという 問題点があげられる。
[0005] 酸化酵素を用いてアルコールからケトンを製造する方法においては反応に 必要な酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （以降 NADと略する ことがある） を反応に伴って生成する還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチド （以降 N ADHと略することがある） から再生させる以下のような 技術が利用されている。 つまり目的とするケトンを生産するための酸化反応 と N A D再生のためのケトンの還元反応の 2つの反応を組み合わせる方法や 、 グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるォキソグルタル酸の還元反応を組み 合わせる技術などである。
上記の NADを再生する技術においては NAD再生のための反応基質を反 応系に添加する必要があり、 さらには N A D再生反応により副生物が反応系 内に蓄積するという欠点があげられる。
アルコールからのケトン製造において、 上記の欠点を補う NAD再生方法 として微生物が有する呼吸鎖を介して分子状酸素を還元し水を生成すること で N A Dを再生する N A D Hデヒドロゲナーゼを利用する方法が例示される が （特許文献 4) 、 この酵素活性を強化した微生物による実例は報告されて いない。
特許文献 1 ：特開平 1 0— 1 74593号公報
特許文献 2：特開平 1 0— 1 74594号公報
特許文献 3：国際公開第 2005 1 06005号パンフレツ ト
特許文献 4：特開 2005 _ 21 8349号公報
非寺許文献 1 ： B I o s c I . B i o t e c h n o l . B i o c h em. ， Vo l . 65 (1 0) , p p. 2265-2270, (2001 )
発明の開示
[0006] 化学合成法では、 得られるヒドロキシカルボン酸の純度の点で十分ではな く、 また、 従来のバイオ法では、 生産反応に供する菌体量が多く菌体の廃棄 等の問題がある。 本発明が解決しょうとする課題は、 少ない菌体量で効率よ く生産することができる、 工業的に有利なヒドロキシカルボン酸類の生産方 法、 および該生産方法に適した微生物を提供することである。
[0007] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 微生物を 用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン 酸を生産する方法において、 酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド 再生能を強化した微生物を用いることにより、 ヒドロキシカルボン酸を少な ぃ菌体量で効率よく生産することができることを見出した。
即ち、 本発明は以下の 〔1〕 から 〔9〕 に記載のとおりである。
[0008] 〔 1〕 微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒド ロキシカルボン酸を生産する方法において、 N A D Hデヒドロゲナーゼの活 性を強化した微生物を用いることを特徴とするヒドロキシカルボン酸の生産 方法。
〔2〕 微生物が、 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデ ヒドロゲナーゼの少なくとも 1つの酵素活性を強化した微生物であることを 特徴とする 〔1〕 記載の生産方法。
〔3〕 微生物が、 グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化または微生物本 来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする 〔1〕 記載の生産方 法。
〔4〕 微生物が、 グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化または微生物本 来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする 〔2〕 記載の生産方 法。
〔5〕 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールがエチレングリコールで あり、 ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸であることを特徴とする 〔1〕 ~ 〔4〕 のいずれかに記載の生産方法。
[0009] 〔6〕 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナ ーゼの少なくとも 1つの酵素活性を強化し、 かつ、 N A D Hデヒドロゲナー ゼの活性を強化した微生物。
〔7〕 グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よ りも低減したことを特徴とする 〔6〕 記載の微生物。
〔8〕 微生物がェシエリヒア■ コリである 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載 の生産方法。
〔9〕 微生物がェシエリヒア■ コリである 〔6〕 または 〔7〕 に記載の微生 物。 [0010] 本発明によリグリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸類を少な ぃ菌体量で効率よく生産することが可能である。
図面の簡単な説明
[0011] 上述した目的、 およびその他の目的、 特徴および利点は、 以下に述べる 好適な実施の形態、 およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らか になる。
[0012] [図 1]参考例 1における細胞内の N A D HZN A D比 （ 01~1含量 八0 含量） の経時変化を示したグラフである。 図中の口は、 I c D E FZ p G A P f u c O- a I d A- n d h株の N A D H N A D比を示す。 図 中の〇は、 I c D E F/p GA P f u c O- a I d A株の NAD HZ N AD比を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下に本発明を詳しく説明する。
[0014] 本実施形態は、 ヒドロキシカルボン酸の生産方法である。 この方法は、 微 生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカ ルボン酸を生産する方法において、 NADHデヒドロゲナーゼの活性を強化 した微生物を用いるものである。
[0015] 微生物とは、 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシ カルボン酸を生産する能力を本来有するか否かに関わらず、 何らかの手段を 用いることにより末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキ シカルボン酸を生産する能力を有し得る微生物であればいずれの微生物であ つてよい。 好ましくはェシェリヒア （E s c h e r i c h i a) 属、 バチル ス ( B a c i I I u s) J禹、 シュ一ドモナス (P s e u d omo n a s) J禹 、 セラチア （S e r r a t i a ) 属、 ブレビバクテリゥ厶 （B r e v i b a c t e r i u m) 属、 コリネバクテリィゥ厶 (C o r y n e b a c t e r i u m) )禹、 ス卜レプ卜コッカス (S t r e p t o c o c c u s) )禹、 ラク卜 /くチノレス (L a c t o b a c i I I u s) 属、 ロドコッカス （R h o d o c o c c u s) 属、 ス卜レプ卜マイセス (S t r e p t omy c e s) 属、 サ ッカロマイセス (S a c c h a r omy c e s) 属、 クライべロマイセス ( K I u y v e r omy c e s) J 、 ンゾサッカロマイセス (S c h ι z o s a c c h a r omy c e s) 展、 チコサッカロマ セス (^. y g o s a c c h a r omy c e s) 1禹、 ャロウ 尸 ( Y a r r ow i a) 属、 卜リコスポ ロン (T r i c h o s p o r o n) 属、 口 ドス不リンゥム ( R h o d o s p o r i d i u m) 属、 ピキア （ P i c h i a ) 属、 キャンディダ （C a n d i d a) 属、 ノィロスポラ （N e u r o s p o r a) 属、 ァスペルギルス （ A s p e r g I I I u s) 属、 セファロスホリゥム (G e p h a I o s p o r i u m) 属、 トリコデルマ （T r i c h o d e r ma) 属などの宿主べク ター系の開発されている細菌、 放線菌、 酵母、 カビが例示され、 より好まし <はェシェリヒア ' コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) が例示され る。
また、 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとは、 炭素鎖の末端に 水酸基を有し、 かつ分子内に 2つ以上の水酸基を有する脂肪族化合物であれ ばその構造に特に制限はないが、 そのような化合物としてエチレングリコー ル、 ジエチレングリコール、 グリセロール、 1， 3 _プロパンジオール、 1 ， 2 _ブタンジオール、 1， 3 _ブタンジオール、 1， 4 _ブタンジオール 、 1， 2, 4 _ブタントリオールなどが例示できる。
また、 ヒドロキシカルボン酸とは、 上記した末端に水酸基を有する脂肪族 多価アルコール類について水酸基を有する末端炭素の一つが酸化されカルボ ン酸になっているものである。 そのような化合物としてグリコール酸、 ヒド ロキシエトキシ酢酸、 グリセリン酸、 3—ヒドロキシプロパン酸、 2—ヒド ロキシブタン酸、 3—ヒドロキシブタン酸、 4—ヒドロキシブタン酸、 2， 4—ジヒドロキシブタン酸などが例示できる。
本実施形態においてニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドとは、 酸化型 および還元型の明記がない限りそのどちらをも指す。
本実施形態では、 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとして、 ェ チレングリコールを用いることができる。 また、 ヒドロキシカルボン酸とし ては、 グリコール酸を好適に用いることができる。
[0017] また、 N A D Hデヒドロゲナーゼとは、 国際生化学連合 （に U. B. ) 酵素委員会報告に準拠した酵素番号 1 . 6. 5. 3または 1 . 6. 9 9. 3 または 1 . 6. 9 9. 5に分類され、 ュビキノン、 ジメチルメナキノン、 メ ナキノン等のキノン類を電子受容体として N A D Hから N A Dを生成する反 応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。 好ましくは I . U. B. 酵素委員 会報告に準拠した酵素番号 1 . 6. 9 9. 3に分類される N A D Hデヒドロ ゲナーゼである。 ェシェリヒア■ コリを例とすると G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r V 00306によって報告されている遺伝子 n d hにコードされている N A D Hデヒドロゲナーゼが例示される。
[0018] N A D Hデヒドロゲナーゼの活性を強化するとは、 その活性が強化前に比 ベ 2倍以上向上していることが好ましい。 酵素活性が向上した微生物は、 例 えば該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物 (又は組換え前の微生物） に導入する方法やゲノム内において該酵素をコー ドする遺伝子のプロモーターに変異を導入するなどの方法を用いて作出する ことができる。 野生型の微生物 （又は組換え前の微生物） に該遺伝子を導入 する方法としては、 該遺伝子をプラスミ ドの形態で微生物に導入することが 例示できる。 微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノム D N Aの調製、 プ ラスミ ドの調製、 D N Aの切断および連結、 形質転換、 P C R (P o I y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n) 、 ノフ マ一として用し、 ォ リゴヌクレオチドの設計、 合成等の方法は、 当業者によく知られている通常 の方法で行うことができる。 これらの方法は、 S a m b r o o k, J . ， e t . a I . , M o l e c u l a r c l o n i n g A L a b o r a t o r y M a n u a l , S e c o n d E d i t i o n , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , ( 1 9 8 9) 等 に記載されている。
[0019] 本実施形態に係る微生物は、 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクト アルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも 1つの酵素活性を強化する。 [0020] ここで、 ラクトアルデヒドレダクターゼとは、 I . U. B. 酵素委員会報 告に準拠した酵素番号 1. 1. 1. 77に分類され、 1. 2 _プロパンジォ ールから、 補酵素である NADの存在下でラクトアルデヒドを生成する反応 を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
[0021] また、 ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、 I . U. B. 酵素委員会 報告に準拠した酵素番号 1. 2. 1. 22に分類され、 ラクトアルデヒドか ら、 補酵素である N A Dの存在下で乳酸を生成する反応を触媒する酵素の総 称を指し、 且つに U. B. 酵素委員会報告に準拠した酵素番号 1. 2. 1 . 2 1に分類され、 グリコールアルデヒドから、 補酵素である NADの存在 下でグリコール酸を生成する反応を触媒する酵素グリコールアルデヒドデヒ ドロゲナーゼの総称も併せて指すものである。 なぜならばェシェリヒア■ コ リを用いた先行文献で、 ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとグリコールァ ルデヒドデヒドロゲナーゼは同一の酵素であることが報告されているからで める (C a b a l l e r o, E . ， e t . a I . ， J. B i o l . C h e m . ， V o l . 258， p p. 7788-7792, ( 1 983) ) 。
[0022] また、 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲ ナーゼの少なくとも 1つの酵素活性を強化したとは、 ェシエリヒア■ コリを 例にすると、 これらの酵素の少なくとも 1つの酵素活性が、 野生株 （又は組 換え前の微生物） の 20倍以上であることが好ましく、 より好ましくは 1 0 0倍以上である。
[0023] 酵素活性が向上した微生物は、 例えば該酵素をコードする遺伝子を遺伝子 組換え技術を用いて野生型の微生物 （又は組換え前の微生物） に導入する方 法やゲノム内において該酵素をコードする遺伝子のプロモーターに変異を導 入するなどの方法を用いて作出することができる。 野生型の微生物 （又は組 換え前の微生物） に該遺伝子を導入する方法としては、 該遺伝子をプラスミ ドの形態で微生物に導入することが例示できる。 微生物への遺伝子の導入に 用いられるゲノム DN Aの調製、 プラスミ ドの調製、 DNAの切断および連 結、 形質転換、 P CR、 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計 、 合成等の方法は、 当業者によく知られている通常の方法で行うことができ る。 これらの方法は、 前記 S a m b r o o J. らの文献等に記載されて いる。
[0024] たとえば、 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒド ロゲナーゼの酵素活性が向上したェシェリヒア■ コリは、 以下のように作製 することができる。
[0025] ェシェリヒア■ コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子 （以下、 f u c Oと略することがある） の塩基配列はすでに報告されている （G e n B a n k a c c e s s i o n n umb e r M3 1 059) 。 こェンェ リヒア■ コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子 （以下、 a I d Aと略することがある） の塩基配列もすでに報告されている （G e n B a n k a c c e s s i o n n umb e r M64 o 4 1 ) 。
[0026] f u c Oを取得するためにェシェリヒア■ コリのゲノム DN Aをテンプレ ートとし、 プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いて P C R法で増幅し 、 得られた D N Aフラグメントを制限酵素で消化することで f u c Oフラグ メントを得る。
[0027] また、 a I d Aを取得するためにェシエリヒア■ コリのゲノム DN Aをテ ンプレートとし、 プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いて P CR法で 増幅し、 得られた DNAフラグメントを制限酵素で消化することで a I d A フラグメントを得る。
[0028] さらに、 グリセルアルデヒド 3 _リン酸脱水素酵素 （GA P DH) プロモ 一ターを取得するためェシェリヒア■ コリのゲノム DN Aをテンプレートと し、 プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いて P C R法で増幅し、 得ら れた D N Aフラグメントを制限酵素で消化することで GA P DHプロモータ 一をコードする DN Aフラグメントを得る。
[0029] 上記の 3つの DN Aフラグメントと、 プラスミ ドを制限酵素で消化するこ とで得られるフラグメントを結合した後、 ェシェリヒア■ コリに形質転換し 、 L B寒天プレートに生育する形質転換体を得る。 得られたコロニーを L B 液体培地で培養し、 得られた菌体からプラスミ ドを回収する。 本プラスミ ド を任意の宿主ェシェリヒア■ コリに導入することでラクトアルデヒドレダク ターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が向上したェシ エリヒア■ コリを作製できる。
[0030] 本実施形態に係る微生物は、 グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化ま たは微生物本来の活性よりも低減される。
[0031 ] ここで、 グリコール酸ォキシダーゼとは、 I . U . B . 酵素委員会報告に 準拠した酵素番号 1 . 1 . 3 . 1 5に分類され、 グリコール酸からグリオキ シル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
[0032] また、 グリコール酸ォキシダーゼ活性の不活性化とは、 その酵素活性が完 全に消失することを意味する。 また、 グリコール酸ォキシダーゼ活性の低減 とは、 その酵素活性の一部が消失することを意味し、 野生株 （又は組換え前 の微生物） が有するグリコール酸ォキシダーゼ活性に対して、 2分の 1以下 であることが好ましく、 より好ましくは 1 0分の 1以下である。 酵素機能を 不活性化、 或いは低減するには、 そのタンパク質をコードする遺伝子に変異 を導入するか、 欠失させる、 置換させる、 あるいはそのタンパク質を特異的 に不活性化する薬剤を添加する、 紫外線を照射する、 などの方法がある。 標 的とする遺伝子についてそれを欠失させる方法や、 変異させる方法、 および 、 置換する方法については、 当業者によく知られている通常の方法で行うこ とができる。 具体的にはェシエリヒア■ コ M T— 1 1 0 2 3株が、 グリコ 一ル酸ォキシダ一ゼをコ一ドする遺伝子である g I c D E Fの破壊によりグ リコール酸ォキシダーゼ活性が不活性化した微生物として例示できる。
[0033] ェシヱリヒア ' コリ1\ 1丁_ 1 1 0 2 3株は遺伝子破壊によりグリコール酸 ォキシダーゼが不活性化しているため、 これを用いて本発明を実施すること が可能である。 本菌株は、 F E R M B P— 1 0 2 9 3の寄託番号で、 茨城 県つくば市東 1丁目 1番 1号中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 特許手続き上の微生物の寄託等の国際承認に関す るブタぺスト条約に基づいて、 平成 1 7年 3月 1 0日より寄託されている。 [0034] ある標的酵素をコードする遺伝子を微生物に導入するにあたっての 「ブラ スミ ドの形態で」 とは、 該遺伝子をベクターに連結し組換えプラスミ ドを作 成し、 これを形質転換等の方法で該微生物に導入する事を意味する。 また、 恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターと目的遺伝子を機能的に連 結した際には、 プラスミ ドが有するレブリコンの性質により、 微生物細胞当 たりのコピー数が一般的に少ないといわれるプラスミ ドを利用することでも 本発明の目的を達し得る。 そのようなレブリコンを有するプラスミ ドとして p ACYC l 84 (G e n B a n k a c c e s s i o n n umb e r X 06403) などが例示できる。
[0035] 本実施形態の生産方法を実施するに際しては、 通常、 培地を用いて微生物 を培養して増殖させて必要量の微生物菌体を得る。
本発明において、 培養に使用される培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン および必要に応じてその他の有機微量成分を含有する培地であれば特に制限 は無い。 炭素源としては、 グルコース、 フルクトース、 糖蜜などの糖類、 フ マル酸、 クェン酸、 コハク酸などの有機酸、 メタノール、 エタノール、 グリ セロールなどのアルコール類、 その他が適宜使用される。 窒素源としては、 有機アンモニゥ厶塩、 無機アンモニゥ厶塩、 アンモニアガス、 アンモニア水 、 蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、 その他が適宜使用される。 無機イオンとしては、 マグネシウムイオン、 リン酸イオン、 カリウムイオン 、 鉄イオン、 マンガンイオン、 硫酸イオン、 その他が必要に応じて適宜使用 される。 有機微量成分としては、 ビタミン、 アミノ酸等及びこれらを含有す る酵母エキス、 ペプトン、 コーンスティープリカ一、 カゼイン分解物、 その 他が適宜使用される。
[0036] 培養に使用される培地としては、 工業的生産に供する点を考慮すれば液体 培地が好ましい。
また、 培地組成は、 ポリペプトン 0. 5 gZL以上 1 0 gZL以下、 F e 2 SO40. 02 gZL以上 0. 3 gZL以下、 K2H PO40. 5 gZL以上 5 gZL以下、 KH2PO40. 5 gZL以上 5 gZL以下、 Mg S04 ■ 7 H2 OO. 5 gZL以上 5 gZL以下、 （NH4) 2SO40. 3 gZL以上 1 5 g ZL以下、 ニコチン酸 0. 02 § 1_以上1 gZL以下 （溶媒は水） とする と好ましい。
[0037] 本実施形態に係る微生物の培養に際して、 培養条件は特別の制限はなく、
P Hと温度を適切に制御しながら培養する。 好気条件であっても、 嫌気条件 であってもよいが、 好ましくは、 好気条件とする。 通気量は、 培地 1 Lあた り 0. 2 LZm i n以上 3 LZm i n以下とすると好ましく、 0. 5 LZm i n以上 2 LZm i n以下とするとより好ましい。 また、 攪拌速度は、 20 0 r p m以上 1 000 r p m以下とすると好ましく、 500 r p m以上 80 0 r pmとするとより好ましい。 こうすることにより、 菌体重量あたりのヒ ドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。 また、 上記の通気 、 攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることで も培養が可能である。
p Hは 5以上 8以下とすることが好ましく、 p H 7. 0以上 7. 4以下と するとより好ましく、 p H 7. 2とすると最も好ましい。 こうすることによ り、 菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることで さる。
また、 温度は、 25°C以上 40°C以下とすることが好ましく、 33°C以上 37°C以下とするとより好ましく、 35°Cとすると最も好ましい。 こうする ことにより、 菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得 ることできる。
培養に必要な時間は 1 2時間以上 50時間以下とする。 これにより、 菌体 重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
[0038] ヒドロキシカルボン酸の生産に使用される溶媒としては、 リン酸カリウム 緩衝液などの緩衝液や、 前述の微生物の培養に用いた培地、 及び純水を例示 することができる。 また、 原料の脂肪族多価アルコールと溶媒との混合液に 、 先に培養により得られた微生物菌体を接触させて反応を行うことができる 。 微生物菌体は、 培養が終わった培養液そのものを使用する方法や、 培養液 から菌体のみを回収して使用する方法が例示できる。
[0039] 本発明の生産方法における反応に際して、 反応条件は特別の制限はなく、
P Hと温度を適切に制御しながら反応する。
例えば、 p Hは 6以上 9以下とすると好ましく、 p H 7. 0以上 8. 0以 下とするとより好ましく、 p H 7. 2とすると最も好ましい。 こうすること により反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高め られるという効果が得られる。
また、 温度は、 20°C以上 45°C以下の範囲内が好ましく、 30°C以上 4 0°C以下とすると特に好ましく、 35°Cが最も好ましい。 こうすることによ り、 反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高めら れるという効果が得られる。
また、 反応は、 好ましくは、 好気条件とする。 通気量は、 反応液 1 Lあた り 0. 1 LZm i n以上 2. 0 L/m i n以下とすると好ましく、 0. 2 L m i n以上 1. O LZm i n以下とするとより好ましい。 また、 攪拌速度 は、 200 r p m以上 1 000 r p m以下とすると好ましく、 400 r pm 以上 800 r pm以下とするとより好ましい。 こうすることにより、 反応液 に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという 効果が得られる。 また、 上記の通気、 攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実 現できる気泡塔などを用いることでも反応が可能である。
また、 反応時間は 1 2時間以上 96時間以下とすることにより、 収率 80 %以上でヒドロキシカルボン酸を得ることができる。
[0040] 以上のようにして得られた反応液中に蓄積した生産物であるヒドロキシカ ルボン酸を回収する方法としては、 特に制限はないが、 例えば反応液から菌 体を遠心分離などで除去した後、 合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用い る方法、 その他通常の採取分離方法で分離する方法が採用できる。
[0041] (製造例 1 ) ェシェリヒア■ コ MG 1 655 g I c D E F欠失株の作製 ェシェリヒア■ コリのゲノム DN Aの全塩基配列は公知であり （G e n B a n a k a c c e s s i o n n u m b e r U 0009 6) 、 ェシエリ ヒア■ コリのグリコール酸ォキシダーゼの遺伝子 （以下、 g I c D E Fと略 することがある） の塩基配列もすでに報告されている （G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r l_ 43490) 。
[0042] ェシェリヒア■ コ U MG 1 655株のゲノム D N Aの g I c D E F近傍領 域の遺伝子情報に基づいて作成された、 配列番号 1 (T T G G T A C CG T T C T G C CAG CAA C T GA CG) 及び配列番号 2 (T G T C T AGA G T A C C T C T G T G CG T CA C T G G) 並びに配列番号 3 (G C T C T AGA CG C T T T G T T G T G T T G T G T G G) 及び配列番号 4 (A A C T G CAG GA T CG G T CAA T GA T T G CAG C) のォリゴヌク レオチドを用いて P C Rを行った。 得られた D N Aフラグメントをそれぞれ 、 制限酵素 K p n l と X b a l、 X b a l と P s t Iで消化することにより 、 それぞれ約 67 0 b p、 7 90 b pのフラグメントを得た。 この D N Aフ ラグメントを、 温度感受性クローニングベクター p T H 1 8 c s 1 (G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r Α Β Ο π 9 o 1 0) (H a s h i mo t o— G o t o h , T. ， G e n e , 24 1， 1 8 5— 1 9 1 ( 2000) ) を K p n l、 P s t Iで消化して得られるフラグメントと混合 し、 リガーゼを用いて結合した後、 D H 5ひ株 （東洋紡績社製） に 30°Cで 形質転換し、 クロラムフエ二コール 1 0 g/m I を含む L B寒天プレート に生育する形質転換体を得た。 得られたコロニーをクロラムフヱニコール 1 0 U g/m I を含む L B液体培地で、 30°Cで一晚培養し、 得られた菌体か らプラスミ ドを回収した。
[0043] このプラスミ ドをェシェリヒア■ コ U MG 1 655株に 30°Cで形質転換 し、 クロラムフエ二コール 1 0 μ g/m I を含む L B寒天プレートに 30°C で一晚培養し、 形質転換体を得た。 得られた形質転換体をクロラムフヱニコ ール 1 0 μ g/m I を含む L B液体培地に接種し、 30°Cで一晚培養した。 次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフヱ二コール 1 0 g/m I を含む L B寒天プレートに塗布し、 4 2°Cで生育するコロニーを得た。 得 られたコロニーを、 薬剤を含まない L B液体培地で、 30°Cで一晚培養し、 さらに薬剤を含まない L B寒天プレー卜に塗布して 4 2°Cで生育するコロニ 一を得た。
[0044] 出現したコロニーの中から無作為に 1 00コロニーをピックアップしてそ れぞれを、 薬剤を含まない L B寒天プレートとクロラムフヱ二コール 1 0 μ g/m I を含む L B寒天プレートに生育させ、 薬剤を含まない L B寒天プレ 一卜にのみ生育するクロラムフエ二コール感受性のクローンを選んだ。 さら にこれらの目的クローンの染色体 D N Aから P C Rにより g I c D E Fを含 む約 3. 8 k b p断片を増幅させ、 g I c D E F領域が欠失している株を選 抜し、 得られた株を MG 1 655 g I c D E F欠失株 （以下 I c D E F と略することがある） と命名した。 なおェシェリヒア■ コ U MG 1 655株 はァメリカンタイプカルチャーコレクシヨンより入手することができる。
[0045] (製造例 2) ラクトアルデヒドレダクターゼ、 ラクトアルデヒドデヒドロゲ ナーゼ同時発現ベクターの構築
ェシエリヒア■ コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子 （以下、 f u c Oと略することがある） の塩基配列はすでに報告されている （G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r M 3 1 059) 。 ま 7:ェンェ リヒア■ コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子 （以下、 a I d Aと略することがある） の塩基配列もすでに報告されている （G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r M o 4 o 4 1 ) 。
[0046] f u c Oを取得するためにェシェリヒア■ コ MG 1 655株のゲノム D N Aをテンプレー卜に用いて配列番号 5 (G C T C T AGA CG GAGAA AG T C T T A T GA T G G C T AA CAGAA T GA T T C T G) 及び配 列番号 6 (G T GAAG C T T G CA T T T A C CAG G CG G T A T G G ) に示すオリゴヌクレオチドを用いて P C R法で増幅し、 得られた D N Aフ ラグメントを制限酵素 X b a I及び H i n d I I Iで消化することで約 1 . 2 k b pの f u c Oフラグメントを得た。 さらに、 a I d Aを取得するため にェシェリヒア■ コ U MG 1 655株のゲノム D N Aをテンプレー卜に用い て配列番号 7 (CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAG TACCCGTTCAACATCC) 及び配列番号 8 (GCTCTAGAC TCTTTCACTCATTAAGACTG) に示すオリゴヌクレオチドを 用いて P C R法で増幅し、 得られた D N Aフラグメントを制限酵素 E c o R I及び X b a Iで消化することで約 1. 5 k b pの a l dAフラグメントを 得た。
さらに、 グリセルアルデヒド 3 _リン酸脱水素酵素 （GAPDH) プロモ 一ターを取得するためェシェリヒア■ コ UMG 1 655株のゲノム DN Aを テンプレー卜に用いて配列番号 9 (AACGAATTCTCGCAATGA TTGACACGATTC) 及び配列番号 1 0 (ACAGAATTCGCT ATTTGTTAGTGAATAAAAGG) に示すオリゴヌクレオチドを 用いて P C R法で増幅し、 得られた D N Aフラグメントを制限酵素 E c o R Iで消化することで約 1 OO b pの GAPDHプロモーターをコードする D N Aフラグメントを得た。
[0047] 上記の 3つの DNAフラグメントと、 プラスミ ド p UC 1 8 (東洋紡績社 製） を制限酵素 E c o R I及び H i n d I I Iで消化することで得られるフ ラグメントを、 リガーゼを用いて結合した後、 ェシエリヒア■ コリ DH 5ひ 株 （東洋紡績社製） に形質転換し、 アンピシリン 50 gZmLを含む LB 寒天プレー卜に生育する形質転換体を得た。 得られたコロニーをアンピシリ ン 5 O gZmLを含む LB液体培地で、 37°Cで一晚培養し、 得られた菌 体からプラスミ ドを回収し、 このプラスミ ドを p G A P f u c 0_ a I d A と命名した。
[0048] (製造例 3) ラクトアルデヒドレダクターゼ、 ラクトアルデヒドデヒドロゲ ナーゼ同時発現ベクターによる I c DE F株形質転換体の構築
製造例 2で得られたプラスミ ド p GAP f u cO_ a I d Aを製造例 1で 得られた I c DE F株に形質転換し、 アンピシリン 50〃 gZmLを含 む LB寒天プレートで、 37 °Cで一晚培養することにより I c DE FZ pGAP f u cO-a l d A株を得た。 [0049] (実施例 1 ) ラクトアルデヒドレダクターゼ、 ラクトアルデヒドデヒドロゲ ナーゼ、 NADHデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターの構築と該ベクターに よる I c D E F株形質転換体の構築
ェシエリヒア■ コリの NAD Hデヒドロゲナーゼの遺伝子 （以下、 n d h と略することがある） の塩基配列はすでに報告されている （G e n B a n k a c c e s s i o n n umb e r V00306) 。 n d hを取得する ためにェシェリヒア■ コ UMG 1 655株のゲノム DN Aをテンプレー卜に 用いて配列番号 1 1 (CGAAT T CCGGAGAAAG T CT TATGA CTACGGCAT TGAAAAAGAT TG TG) 及び配列番号 1 2 ( G G T CTAGACGAT TAATGCAACT T CAAACG) に示すォリ ゴヌクレオチドを用いて P C R法で增幅することで約 1. 3 k b pの n d h フラグメントを得た。 得られた n d hフラグメントを T 4 DN Aポリヌクレ ォチドキナーゼ処理した。
[0050] この DNAフラグメントと、 製造例 2で作成した p G A P f u c O_a I d Aプラスミ ドを H i n d I I Iで消化し、 平滑末端処理、 脱リン酸化処理 を行ったフラグメントを混合し、 リガーゼを用いて結合した後、 ェシエリヒ ァ■ コリ DH 5ひ株 （東洋紡績社製） に形質転換し、 アンピシリン 50 g mLを含む L B寒天プレー卜に生育する形質転換体を得た。 得られたコロ ニーをアンピシリン 50 g Lを含む L B液体培地で、 37 °Cで一晚培 養し、 得られた菌体からプラスミ ドを回収し、 このプラスミ ドを p GA P f u c O- a I d A- n d hと命名した。 得られたプラスミ ド p G A P f u c O-a I d A_ n d hを製造例 1で得られた I c D E F株に形質転換し 、 アンピシリン 50〃 gZm Lを含む L B寒天プレートで、 37°Cで一晚培 養することにより I c D E F/p GA P f u c O-a I d A_ n d h株 を得た。
[0051] (実施例 2) Ag I c D E F/p GA P f u c O-a I d A- n d h株によ るグリコール酸生産
実施例 1で得られた I c D E F/p GA P f u c O-a I d A_ n d h株を前培養として三角フラスコに入れた LB B r o t h, M i l l e r 培養液 （D i f c o 244620) 25 m Lに植菌し、 一晚、 培養温度 35 °C、 1 20 r pmで攪拌培養を行った。 前培養液全量を、 以下に示す組成の 培地 475 gの入った 1 L容の培養槽 （AB L E社製培養装置 BM J _01 ) に移し、 培養を行った。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5 LZm i n、 撹拌 速度 800 r p m、 培養温度 35°C、 p H 7. 2 (N H 3水溶液で調整） で行 つた。 前記の条件で最初のグルコースが完全に枯渴した後、 残りの時間を培 地中のグルコース濃度 0. 1 g/1未満となるような可変速度でグルコースを 全量で 40 g供給した。
[0052] <培地組成 >
ポリペプトン： 7 g/L
グルコース： 30 gZL
ニコチン酸： 0. 1 gZL
F e 2S04： 0. 09 gZL
K2H P04： 2 g/L
KH2P04： 2 g/L
M g S 04■ 7 H20 ： 2 /L
(N H4) 2S04 ： 5 g/L
溶媒：水
[0053] 培養開始後 24時間の菌体を遠心分離 （ 8000 r p m、 20分間） によ リ集菌した。 集菌後の湿菌体を 4. 5 g秤量し、 エチレングリコール 65 g と共に蒸留水に懸濁し最終液量を 50 Om I とした。 懸濁液を AB LE社製 培養装置 BM J_01の培養槽に移し 70時間反応を行った。 反応は大気圧 下、 通気量 0. 25 L/m i n、 撹拌速度 550 r p m、 反応温度 35°C、 p H 7. 2 (NH3水溶液で調整） で行った。 得られた反応液中のグリコール 酸蓄積量を、 日立製作所製高速液体クロマトグラフィーを用い、 以下の設定 にて定量した。
[0054] カラム： U LTRON PS— 80H (信和化工社製） 溶離液：過塩素酸水溶液 （ p H 2. 1 )
流 is： 1. 0 m LZm i n
検出器： U V検出器測定波長： 280 n m
[0055] また、 湿菌体の一部を 50°Cで乾燥させた後の乾燥重量から、 反応に使用 した菌体の乾燥菌体重量を求めた。 I c DE F/pGAP f u cO-a I d A- n d h株において乾燥菌体 1 gあたり 39. 8 gのグリコール酸を 生産していた。
[0056] また、 I c DE F/pGAP f u cO-a I d A- n d h株の生育速 度は、 比較例 1における I c DE F/pGAP f u cO-a l d A株と 同様のものであり、 n d hの強化による生育の遅延が起きていないことが確 認された。
[0057] (比較例 1 ) I c DE F/pGAP f u cO-a I d A株によるグリコ ール酸生産
製造例 3で得られた I c DE F/pGAP f u cO-a l d A株につ いて実施例 2と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。 I c DE F/pGAP f u cO-a l d株の乾燥菌体 1 gあたりのグリコール酸生産 量は 20. 2 gであった。
[0058] (参考例 1 ) I c DE F/pGAP f u cO-a I dA_n d h株、 △
I c DE F/pGAP f u cO-a I d A株における細胞内ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド含量の測定
Δ g I c DE F/pGAP f u cO— a I dA_n d h株、 および△ I c DE F/pGAP f u cO-a l d A株について実施例 2と同様に培養お よびグリコール酸生産を行った。
[0059] グリコール酸生産時の I c DE F/pGAP f u cO-a I d A- n d h株および I c DE F/pGAP f u cO-a I d A株について、 一 定時間においてサンプリングを行い、 それぞれの菌株について 2本の微量遠 沈管に 1 mLずつサンプリングし、 4°Cで遠心、 集菌した。 2本の遠沈管の うち 1本を NAD測定、 1本を NAD H測定に使用し、 それぞれ以下の処理 を行った。
[0060] NAD測定用のサンプルには、 集菌した湿菌体 1. 5mgあたり 400
Lの 0. 04 m o I Lの塩酸水溶液を加え懸濁した。 懸濁液を 90°Cで 3 分加熱の後、 氷上で急冷した。 この処理液の上清を用い、 以下に示す組成の 反応液を作成した。 なお、 1 mo I ZLT r i s_HC I として p H 9. 0 のものを用いた。 またアルコールデヒドロゲナーゼとして S I GMA社製ァ ルコールデヒドロゲナーゼ （A 3263) を 1 Ommo I Lの T r i s _ H C I (p H 8. 8) で溶解し、 400ユニット mL (ただし 1ユニット は p H 8. 8、 25°Cの条件下、 1分間に 1 〃 mo Iのエタノールをァセト アルデヒドに変換するのに必要な酵素量） としたものを使用した。 反応液の 450 nmにおける吸光度を亍トラカラーワン （生化学工業社製） のプロト コールに従って測定した。 なお S I GM A社製 NADの溶液について同様の 処理を施したものを測定することにより検量線を作成し、 サンプルの NAD 濃度を求めた。
[0061] N ADH測定用のサンプルには、 集菌した湿菌体 1. 5 m gあたり 400
Lの 0. 04mo l Lの水酸化力リゥ厶水溶液を加え懸濁した。 懸濁液 を 90°Cで 3分加熱の後、 氷上で急冷した。 この処理液の上清を用い、 以下 に示す組成の反応液を作成した。 なお 1 mo I ZL T r i s _H C I として p H 8. 8のものを用いた。 またアルコールデヒドロゲナーゼとして S I G MA社製アルコールデヒドロゲナーゼ （A 3263) を 1 Ommo I ZLの T r i s -H C I (p H 8. 8 ) で溶解し、 400ユニット m L (ただし 1ユニットは p H 8. 8、 25°Cの条件下、 1分間に 1 〃mo Iのエタノー ルをァセトアルデヒドに変換するのに必要な酵素量） としたものを使用した
[0062] 反応液の 450 nmにおける吸光度を亍トラカラーワン （生化学工業社製 ) のプロトコールに従って測定した。 なお、 S I GM A社製 NAD Hの溶液 について、 同様の処理を施したものを測定することにより検量線を作成し、 サンプルの N A D H濃度を求めた。 図 1は、 この時の N A D HZN A D比 （ N ADH含量 ZN AD含量） を示す。 横軸は反応時間 （h r ) 、 縦軸は NA DHZNAD比 （N A D H含量 ZN A D含量） を示している。
△ g I c D E FZp GA P f u c O— a I d A- n d h株において常に N ADH/N AD比の値が小さく、 NADHから NADを再生していることが 示された。
[0063] <反応液組成 >
サンプル上清： 25〃 L
I mo l ZL T r i s— H C I ： 25 β L
25%エタノール： 1 0 L
純水： 20 L亍トラカラーワン （生化学工業社製） ： 1 0〃 L
アルコールデヒドロゲナーゼ： 1 0〃 L
産業上の利用可能性
[0064] 本発明のヒドロキシカルボン酸の生産方法および微生物は、 ポリマー原料や 医薬中間体として有用なグリコール酸等のヒドロキシカルボン酸類の製造に 用いることができる。

Claims

請求の範囲
[1 ] 微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキ シカルボン酸を生産する方法において、 N A D Hデヒドロゲナーゼの活性を 強化した微生物を用いることを特徴とするヒドロキシカルボン酸の生産方法
[2] 微生物が、 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒド ロゲナーゼの少なくとも 1つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴 とする請求項 1記載の生産方法。
[3] 微生物が、 グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の 活性よりも低減した微生物であることを特徴とする請求項 1記載の生産方法
[4] 微生物が、 グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の 活性よりも低減した微生物であることを特徴とする請求項 2記載の生産方法
[5] 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールがエチレングリコールであり
、 ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸であることを特徴とする請求項 1〜
4のいずれか 1項に記載の生産方法。
[6] ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ の少なくとも 1つの酵素活性を強化し、 かつ、 N A D Hデヒドロゲナーゼの 活性を強化した微生物。
[7] グリコール酸ォキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも 低減したことを特徴とする請求項 6記載の微生物。
[8] 微生物がェシェリヒア■ コリである請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の 生産方法。
[9] 微生物がェシエリヒア■ コリである請求項 6または 7に記載の微生物。
PCT/JP2007/000471 2006-05-09 2007-04-27 補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法 WO2007129466A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020087029542A KR101109402B1 (ko) 2006-05-09 2007-04-27 보효소 재생에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법
CN2007800162589A CN101437949B (zh) 2006-05-09 2007-04-27 利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法
JP2008514388A JP4886775B2 (ja) 2006-05-09 2007-04-27 補酵素再生によるグリコール酸の生産方法
EP07737127.6A EP2025760B1 (en) 2006-05-09 2007-04-27 Method of producing glycolic acid by regenerating coenzyme
ES07737127T ES2424866T3 (es) 2006-05-09 2007-04-27 Procedimiento para producir ácido glicólico por regeneración de coenzima
US12/299,679 US8748157B2 (en) 2006-05-09 2007-04-27 Method for producing hydroxycarboxylic acid by regenerating coenzyme

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-129986 2006-05-09
JP2006129986 2006-05-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007129466A1 true WO2007129466A1 (ja) 2007-11-15

Family

ID=38667578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/000471 WO2007129466A1 (ja) 2006-05-09 2007-04-27 補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8748157B2 (ja)
EP (1) EP2025760B1 (ja)
JP (1) JP4886775B2 (ja)
KR (1) KR101109402B1 (ja)
CN (1) CN101437949B (ja)
ES (1) ES2424866T3 (ja)
WO (1) WO2007129466A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4954985B2 (ja) * 2006-05-09 2012-06-20 三井化学株式会社 補酵素合成強化によるグリコール酸の生産方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011036213A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Metabolic Explorer Fermentation process for producing glycolic acid
WO2011052819A1 (ko) * 2009-10-29 2011-05-05 한국생명공학연구원 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 새로운 방법
BR112012020132B1 (pt) 2010-02-11 2021-09-28 Cj Cheiljedang Corporation Método para produzir um acrilato de alquila inferior e 2-buteno a partir de poli-3- hidroxibutirato de biomassa geneticamente modificada
BR112012031965A8 (pt) 2010-06-15 2020-05-19 Metabolic Explorer Sa uso de promotores induzíveis na produção de ácido glicólico
US20130210097A1 (en) 2010-08-27 2013-08-15 Metabolic Explorer Glycolic acid fermentative production with a modified microorganism
EP2828383A1 (en) * 2012-03-20 2015-01-28 Metabolix, Inc. Genetically engineered microorganisms for the production of poly-4-hydroxybutyrate
US9850192B2 (en) 2012-06-08 2017-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Renewable acrylic acid production and products made therefrom
US20150299670A1 (en) * 2012-11-16 2015-10-22 University Of Florida Research Foundation Incorporated Combining genetic traits for furfural tolerance
US9556443B2 (en) 2013-07-19 2017-01-31 Samsung Electronics Co., Ltd. Yeast cell with inactivated NADH dehydrogenase and method of producing lactate using the yeast cell
FR3028529B1 (fr) 2014-11-19 2016-12-30 Inst Nat De La Rech Agronomique Inra Procede de production d'au moins un metabolite d'interet par transformation d'un pentose dans un microorganisme
EP3354742A1 (en) 2017-01-26 2018-08-01 Metabolic Explorer Methods and microorganisms for the production of glycolic acid and/or glyoxylic acid
US11535873B2 (en) 2017-09-07 2022-12-27 The Governing Council Of The University Of Toronto Production of glycolate from ethylene glycol and related microbial engineering
CN107603998B (zh) * 2017-10-11 2020-10-09 北京化工大学 利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN109706107B (zh) * 2019-01-29 2021-04-09 天津科技大学 一种高效发酵生产甾药前体的方法
CN109706108B (zh) * 2019-01-29 2021-04-09 天津科技大学 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法
DE102022119514A1 (de) 2022-08-03 2024-02-08 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein Genetisch veränderte Zellen von Methylorubrum zur fermentativen Produktion von Glycolsäure und Milchsäure aus Cx-Verbindungen

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10174594A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 微生物によるグリコール酸の生産方法
JPH10174593A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 酵母によるグリコール酸の生産方法
JP2002345479A (ja) * 2001-05-28 2002-12-03 Daicel Chem Ind Ltd 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP2004159587A (ja) * 2002-11-14 2004-06-10 Mitsubishi Rayon Co Ltd ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体、及びそれを用いた光学活性体の製造方法
JP2005218349A (ja) 2004-02-05 2005-08-18 Daicel Chem Ind Ltd 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法
WO2005106005A1 (ja) 2004-04-27 2005-11-10 Mitsui Chemicals, Inc. ヒドロキシカルボン酸類の生産方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4380029B2 (ja) * 2000-07-05 2009-12-09 味の素株式会社 微生物を利用した物質の製造法
DE10112401A1 (de) * 2001-03-13 2002-09-19 Degussa Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10174594A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 微生物によるグリコール酸の生産方法
JPH10174593A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 酵母によるグリコール酸の生産方法
JP2002345479A (ja) * 2001-05-28 2002-12-03 Daicel Chem Ind Ltd 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP2004159587A (ja) * 2002-11-14 2004-06-10 Mitsubishi Rayon Co Ltd ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体、及びそれを用いた光学活性体の製造方法
JP2005218349A (ja) 2004-02-05 2005-08-18 Daicel Chem Ind Ltd 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法
WO2005106005A1 (ja) 2004-04-27 2005-11-10 Mitsui Chemicals, Inc. ヒドロキシカルボン酸類の生産方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 65, no. 10, 2001, pages 2265 - 2270
CABALLERO, E. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 258, 1983, pages 7788 - 7792
HASHIMOTO-GOTOH, T., GENE, vol. 241, 2000, pages 185 - 191
SAMBROOK, J.: "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2025760A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4954985B2 (ja) * 2006-05-09 2012-06-20 三井化学株式会社 補酵素合成強化によるグリコール酸の生産方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007129466A1 (ja) 2009-09-17
CN101437949A (zh) 2009-05-20
ES2424866T3 (es) 2013-10-09
EP2025760B1 (en) 2013-06-05
KR101109402B1 (ko) 2012-01-30
US8748157B2 (en) 2014-06-10
CN101437949B (zh) 2012-08-22
US20090305368A1 (en) 2009-12-10
JP4886775B2 (ja) 2012-02-29
EP2025760A1 (en) 2009-02-18
KR20090008446A (ko) 2009-01-21
EP2025760A4 (en) 2011-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007129466A1 (ja) 補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法
JP4523939B2 (ja) ヒドロキシカルボン酸類の生産方法
JP4954985B2 (ja) 補酵素合成強化によるグリコール酸の生産方法
WO2006046455A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
US10294479B2 (en) Candida carbonyl reductase and method for preparing (R)-lipoic acid precursor
EP1669460B1 (en) Biocatalyst for producing d-lactic acid
JPWO2008018640A1 (ja) プラスミド、形質転換体、及び３−カルボキシムコノラクトンの製造方法
WO2007099764A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP2005102625A (ja) Ｄ−乳酸製造法
WO2006109632A1 (ja) 新規α－ケト酸還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
EP2119770B1 (en) Production of alpha-oxyfunctionalized carbonyl compounds
JP4729919B2 (ja) 微生物の培養方法及び光学活性カルボン酸の製造方法
WO2005123921A1 (ja) 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法
JP2005278414A (ja) １，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法
JP6844073B1 (ja) （１ｒ，３ｒ）−３−（トリフルオロメチル）シクロヘキサン−１−オール及びその中間体の製造法
US20160186217A1 (en) Method for biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and ketones having enzymes of microbial styrene degradation
EP2138579A1 (en) Reductase, gene thereof and method of using the same
CN116218802A (zh) 一种l-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、编码基因及应用
WO2015119280A1 (ja) 酵素を利用したフェニルプロパン系化合物の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07737127

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008514388

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780016258.9

Country of ref document: CN

Ref document number: 12299679

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007737127

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087029542

Country of ref document: KR

Ref document number: KR