ポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤
技術分野
[0001] 本発明はポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤に関し、更に詳しくは肝細胞増 殖因子(以下、 HGFと略記する。)又はそれをコードする DNAを含む DNAを有効成 分とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤に関する。
背景技術
[0002] ポリグルタミン病は常染色体優性進行性神経変性疾患である。ポリグルタミン病は、 ポリグルタミン病の該当遺伝子に異常に伸長したポリグルタミンをコードするシトシン' アデニン.グァニン (CAG)の繰り返し配列を有し、その異常に伸長した CAGの繰り 返し配列を有する原因遺伝子が翻訳されポリグルタミン病原因遺伝子産物を発現す ること〖こより発症する。ポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病において、原因遺 伝子としてハンチンチン遺伝子が第 4染色体短腕上に同定されている(非特許文献 1 ) oハンチンチン遺伝子は 3145アミノ酸残基のハンチンチン蛋白質をコードする。こ の蛋白質自体は様々な組織で発現し全長蛋白質は主に細胞質に存在し非病原性 である。ハンチンチン遺伝子の第 1ェクソンには CAGの繰り返し配列が存在する。こ の CAGの繰り返し配列は非病原性の場合では約 30未満の反復である力 CAGの 繰り返しが約 30以上にもなるとハンチントン舞踏病を惹起する病原性遺伝子となる。 CAGの繰り返しが約 30以上に増加したノヽンチンチン遺伝子からはハンチンチン蛋 白質の N末端側グルタミンの連続 (ポリグルタミン)が長くなつた蛋白質 (変異ハンチン チン)が作られる。このようなポリグルタミンが長くなつた変異ハンチンチンは凝集を起 こしゃすくなつている。また長いポリグルタミンは他の蛋白質との相互作用に影響する こと、ハンチンチン蛋白質自身の切断 (プロセシング)を促進することなどが報告され ている。切断されたノヽンチンチン蛋白質は核に多く存在し、このことが細胞に対する 毒性を発揮し、ハンチントン舞踏病を惹起すると考えられている。ハンチントン舞踏病 は、一般に中年で発病し、発病から 15— 20年で死に至る。その症状は特徴的な筋 肉運動の変調、認識力の低下及び精神科の症状等によって特徴づけられる。筋肉
運動の変調は、舞踏病や筋失調症を含む自発的随意運動と異常不随意運動の調 整喪失によると考えられて 、る。
[0003] 一方、 HGFは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、 198 9年にその遺伝子クロー-ングがなされた (非特許文献 2、 3参照)。 HGFの投与は、 抗アポトーシス活性によって劇症肝炎を伴うマウスにおけるエンドトキシン誘発致死 的肝障害を予防し、 HGF遺伝子治療は致命的な肝硬変を持つラットの生存率を改 善し得ることが知られている(非特許文献 4、 5参照)。また、ノックアウト Zノックインマ ウスの手法を含む発現及び機能的解析における近年の多数の研究により、 HGFは 新規な神経栄養因子であることも明らかにされた (非特許文献 6、 7参照)。とりわけ H GFは、 in vitroでグリア細胞株由来神経栄養因子 (GDNF)に匹敵する運動-ユー ロンに対する最も強力な生存促進因子の一つとして知られている(非特許文献 8参照 )。前記 GDNFの産生促進剤は、神経変性疾患の一つである筋委縮性側索硬化症( ALS)の治療剤として知られ (特許文献 1参照)、 HGF (遺伝子も含む)も ALS形質 転換モデルマウス(ヒト ALSの原因遺伝子である SOD 1 G93 Aを発現させた形質転 換マウス)の病気の進行を遅らせ、生存率を延長することが知られている(特許文献 2 、非特許文献 9参照)。
一方、ハンチントン舞踏病遺伝子で形質転換した R6Z2マウスにレンチウィルスべ クタ一を用いて GDNF遺伝子が導入された力 GDNF遺伝子の導入は該マウスに 対して有用な効果を示さな力 たことが知られている (非特許文献 10参照)。
これらのことは、神経変性疾患であっても、 ALSを含めアルツハイマー病やパーキ ンソン病等とハンチントン舞踏病等のポリグルタミン病とは、その病因や、病態、発病 方法等が全く異なり、これら疾患を同列に扱うことは出来ないことを示している。
[0004] また、特許文献 3には、パーキンソン病で変性する中脳黒質ドーノミン-ユーロンを 薬剤投与により特異的に死滅させる中脳黒質ドーノミン-ユーロン細胞死誘導ラット を用いて、 HGF遺伝子の中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットへの作用 効果を行動学的に及び組織学的に検討した実施例が示されており、 HGF遺伝子の 前投与により中脳黒質ドーパミン-ユーロンを神経毒 6— OHDAから保護し、中脳黒 質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットの症状を抑えたとの実験結果が示されてい
る。そして、この特許文献 3では、このような実験結果に基づいて、 HGF遺伝子がパ 一キンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線 条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン舞踏病、シャイ'ドレーガー症候群 、シャルコー 'マリー'トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸 閉塞症、アミロイド一シス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎'多発性筋炎、クロイツフエ ルド ·ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、結節性 動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱狭窄症、混合性結合組織病、糖尿病性 末梢神経炎、虚血性脳血管障害 (脳梗塞、脳出血等)などの神経疾患の治療にも適 用できるとし、力かる神経疾患の 1つとしてハンチントン舞踏病も挙げられている。 し力しながら、パーキンソン病は中脳黒質部のドーパミン作動性-ユーロンという特 定種の-ユーロンが選択的に脱落する神経変性疾患であるのに対して、ポリダルタミ ン病は上記したように長鎖のグルタミン鎖 (ポリグルタミン)を含む原因遺伝子産物を 発現することにより発症する神経変性疾患である。 6— OHDAによる神経細胞変性 又は細胞死惹起メカニズムとポリグルタミン病原因遺伝子産物による神経細胞変性 又は細胞死メカニズムは全く異なるものであり、 6— OHDAに対して神経保護作用を 示したからといって HGFがポリグルタミン病における神経細胞変性又は細胞死を保 護するとは到底予測できない。臨床的には、共に神経変性疾患であってもパーキン ソン病とポリグルタミン病とは、全く異なる病態を示すだけでなぐ両疾患に因果関係 は認められない。また、障害神経細胞も完全に異なっている。このため、パーキンソン 病モデルラットの上記実験結果のみから、 HGF蛋白質又はそれをコードする DNA がポリグルタミン病の治療に有効であるとは到底 、えず、また有効であったとする報 告もない。
上記のように、ハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病に対する治療方法は確立 されておらず、困難を極めているのが現状である。
特許文献 1:特開 2002— 47206号公報
特許文献 2 :特開 2002— 87983号公報
特許文献 3:国際公開第 2003Z045439号パンフレット
非特許文献 1:ザ ·ハンチントンズ 'ディジーズ 'コラボレイティブ ·リサーチ ·グループ(
The Huntington's Disease Collaborative Research Group) ,セノレ (Cell) , 1993 年,第 72卷, p. 971 - 983
非特許文献 2:中村 (Nakamura)ら,バイオケミカル ·アンド ·バイオフィジカル 'アンド' リサーチ 'コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 1984年,第 12 2卷, p. 1450- 1459
非特許文献 3 :中村(Nakamura)ら,ネイチヤー(Nature) , 1989年,第 342卷, p. 44 0-443
非特許文献 4 :コウサイ(Kosai)ら,へノ トロジー(Hepatology) , 1999年,第 30卷, p. 151 - 159
非特許文献 5 :ウエキ(Ueki)ら,ネィチヤ一'メデイシン(Nat. Med. ) , 1999年,第 5 卷, p. 226 - 230.
非特許文献 6:松本(Matsumoto)ら,チバ ·フアウンディション ·シンポジウム(C¾a Fou nd. Symp. ) , 1997年,第 212卷, p. 198— 211;ディスカッション 211— 194 非特許文献 7 :船越(Funakoshi)ら,タリ-力 'チミ力'ァクタ (Clin. Chim. Acta. ), 200 3年,第 327卷, p. 1 - 23
非特許文献 8 :二ユーロン(Neuron) , 1996年,第 17巻, p. 1157— 1172 非特許文献 9:サン(Sun)ら,ブレイン ·リサーチ ·モレキユラ ·ブレインリサーチ(Brain.
Res. Mol. Brain. Res. ) , 2002年,第 103卷, p. 36—48
非特許文献 10 :ポポビック 'ェヌ(Popovic N)ら,ェクスペリメンタル'ニューロジー(Exp . Neurol. ) , 2005年,第 193卷, p. 65— 74
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、ポリグルタミン病を治療又は発病抑制するのに有効な薬剤を提 供するものである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、 HGF蛋白質もしく は HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有す るペプチド (以下において、 HGF蛋白質等ということもある。)、あるいはそれらをコー
ドする DNA又は前記 DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条 件下でノ、イブリダィズする DNAであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有 する蛋白質をコードする DNAを含む DNA (以下にお 、て、 HGF遺伝子と ヽうことも ある。)がポリグルタミン病に対して優れた治療効果を奏することを見出し、さらに検討 を重ねて本発明を完成するに至った。
[0008] 本発明者らは、まずハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病のモデルマウスであ る変異 (CAGリピートの長 、病因変異)ハンチンチンェキソン 1 (変異 HDェキソン 1) を導入した形質転換マウス (R6Z2マウス)を用いて、 HGF蛋白質等又は HGF遺伝 子のポリグルタミン病への関与を検討した。
本発明者らは、神経向性を有し複製能を欠如したベクター (I型単純へルぺスウイ ルス (HSV- 1)ベクター)を用いて上記形質転換マウス (R6Z2)の線条体にラット H GF遺伝子を導入し、線条体においてラット HGF蛋白質を発現する R6Z2形質転換 マウスを作製し、当該マウスを用いて、実際に HGF遺伝子がポリグルタミン病に対し て効果を示すか否かを検討した。その結果、ラット HGF遺伝子の導入されたマウスで は、驚くべきことにクラスビングという手足を広げられない現象の開始が遅延され、寿 命が延び、また運動機能障害が改善されることが明らかとなった。これらの知見により 、 HGF蛋白質の発現はハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病に対して治療効 果、発病抑制効果をもたらすことが、初めて明らかとされた。
[0009] 次に本発明者らは、 HGF蛋白質等又は HGF遺伝子によるポリグルタミン病の治療 効果又は発病抑制効果のメカニズムを検討した結果、少なくとも線条体におけるカス パーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性ィ匕抑制作用と共に、神経細胞の新生 作用という 2つの新たなメカニズムにより、 HGF蛋白質又は HGF遺伝子がポリグルタ ミン病に有用な効果をもたらすことを見出した。 HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、 カスパーゼー 3及び/又はカスパーゼー 1の活性ィヒを抑制することにより線条体にお ける神経細胞変性又は細胞死を抑制し、線条体の萎縮を抑制すると共に脳室拡大 を抑制することができる。すなわち HGF蛋白質又は HGF遺伝子は、神経細胞変性 又は細胞死を抑制すると共に神経細胞を新生するという 2つの作用を通して、ポリグ ルタミン病における運動機能の改善効果と寿命の延長効果を奏する。
[0010] また、本発明者らは、変異ハンチンチンが有する長いポリグルタミンが断片化 (プロ セシング)により神経毒性を獲得することに注目し、前記プロセシングに及ぼす HGF 蛋白質又は HGF遺伝子の効果を検討した。本発明者らは、変異 HDェキソン 1を導 入した形質転換マウス (R6Z2マウス)では、ハンチンチン蛋白質は断片化されるが、 これに HGF遺伝子を導入した R6Z2形質転換マウスでは、ハンチンチン蛋白質の 断片化が抑制されることを知見した。
このような、 HGF蛋白質又は HGF遺伝子の効果は本発明において初めて見出さ れたものであり、発明者らはこれら知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成す るに至った。
[0011] すなわち、本発明は、
[1] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病 の治療剤又は発病抑制剤、
[2] 有効成分が、(ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部 分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードす る DNA又は(ハ)それら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな 条件下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 もしくはペプチドをコードする DNAであることを特徴とする前記 [1]記載の治療剤又 は発病抑制剤、
[3] HGF蛋白質をコードする DNA力 (a)配列番号 1、 2又は 5で表される塩基配 列からなる DNA又は (b)前記 (a)の塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性 を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [2]記載
の治療剤又は発病抑制剤、
[4] DNAが、 I型単純へルぺスウィルス (HSV- 1)ベクター、アデノウイルスベクタ 一又はアデノ随伴ウィルスベクターに組み込まれていることを特徴とする前記 [2]又 は [3]記載の治療剤又は発病抑制剤、
[5] 有効成分が、(ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであつ て HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを 特徴とする前記 [1]記載の治療剤又は発病抑制剤、
[6] HGF蛋白質力 (a)配列番号 3、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一又は (b )前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴と する前記 [5]記載の治療剤又は発病抑制剤、
[7] ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1 型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失 調症 7型、脊髄小脳失調症 12型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等よりなる群 から選択される少なくとも 1の疾患であることを特徴とする前記 [ 1]〜 [6]の ヽずれか に記載の治療剤又は発病抑制剤、
[8] ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病であることを特徴とする前記 [ 1]〜 [6]の V、ずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
[9] 治療剤又は発病抑制剤が、ポリグルタミン病の病変部位への局所投与用であ ることを特徴とする前記 [ 1]〜 [8]の ヽずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、 [10] 局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする前記 [9]記載の治療剤又は 発病抑制剤、
[11] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とする脳室の拡大抑制剤、
[12] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝 子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤、
[13] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とする神経細胞におけるカスバ ーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性化抑制剤、
[14] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝 子産物のプロセシング抑制剤、
[15] 治療又は発病抑制が、脳室の拡大抑制によるものであることを特徴とする前 記 [ 1]〜 [ 10]の ヽずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
[16] 脳室の拡大が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物による線条体神経細胞変性 又は細胞死によるものであることを特徴とする前記 [15]記載の治療剤又は発病抑制
剤、
[17] 線条体神経細胞変性又は細胞死がカスパーゼ 3及び Z又はカスパーゼ 1の活性ィ匕によるものであることを特徴とする前記 [16]記載の治療剤又は発病抑制 剤、
[18] 治療又は発病抑制が、神経新生によるものであることを特徴とする前記 [1]〜
[10]のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
[19] 治療又は発病抑制が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制 によるものであることを特徴とする前記 [1]〜 [10]の 、ずれかに記載の治療剤又は 発病抑制剤、
[20] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤の製造の為の使 用、
[21] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを哺乳動物に投与するポリグルタミン病の治療又は発病抑制 方法、及び、
[22] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは(2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF
蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ)それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤としての使用、 に関する。
[0013] また、本発明は(1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドであ つて HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは (2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドで あって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は( ノ、)それら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノヽィ ブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはぺプ チドをコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投与することを特徴とする脳室の拡 大抑制方法、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑 制する方法、カスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性化を抑制する方法、 又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシングを抑制する方法に関する。
[0014] さらに、本発明は、脳室の拡大を抑制する医薬、ポリグルタミン病原因遺伝子産物 依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する医薬、カスパーゼー 3及び Z又はカスバ ーゼ 1の活性ィ匕を抑制する医薬、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシ ングを抑制する医薬を製造するための(1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質 の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又は これらの塩、あるいは(2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白 質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドを コードする DNA又は(ハ)それら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの使用に関する。
[0015] さらに、本発明は、脳室の拡大を抑制する医薬、ポリグルタミン病原因遺伝子産物 依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する医薬、カスパーゼー 3及び Z又はカスバ ーゼ 1の活性ィ匕を抑制する医薬、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシ
ングを抑制する医薬としての( 1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分べ プチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩 、あるいは(2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分べ プチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする D NA又は(ハ)それら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もし くはペプチドをコードする DNAを含む DNAの使用に関する。
発明の効果
[0016] 本発明の治療剤又は発病抑制剤は、ポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病 、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状 核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等に対して極めて優れた治療効果又は発病抑制効果を 発揮するものである。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、 HSV— HGF形質導入後の R6Z2マウス線条体における HGFの発現 を示す図である。図中 aは野生型同腹子マウス線条体を、 bは R6Z2マウス線条体を 、 cは R6Z2(HSV— LacZ)マウス線条体を、 dは R6Z2 (HSV— HGF)マウス線条 体の組織像を示す。 eは ELISAにより測定した各マウス線条体の HGF量を示す。
[図 2]図 2は、 R6Z2マウスの線条体に HSV— HGF又は HSV— LacZ形質導入後 の体重の経時変化を示す図である。
[図 3]図 3は、 R6Z2マウスの線条体に HS V— HGF又は HSV— LacZ形質導入後 の生存曲線を示す図である。
[図 4]図 4は、クラスビングテストにおけるマウスの姿勢を示す図である。
[図 5]図 5は、クラスビングテストにおけるスコアの経時変化を示す図である。
[図 6]図 6は、ロタロッドテストにおける運動機能の経時変化を示す図である。
[図 7]図 7は、フットプリントテストにおける歩幅の平均間隔の経時変化を示す図である
[図 8]図 8は、フットプリントテストにおける前肢 Z後肢の重なりの分離の経時変化を示
す図である。
[図 9]図 9は、マウス脳の冠状断面を示す図である。図中、 Ctxは大脳皮質を、 CCは 脳梁を、 Strは線条体を、 Lvは側脳室(Lateral ventricle)を示す。
[図 10]図 10は、 9週令マウスの脳重量を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV— LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HG F)マウスを示す。
[図 11]図 11は、線条体における NeuN陽性細胞を示す図である。
[図 12]図 12は、線条体における NeuN陽性細胞数を示す図である。図中、 Aは野生 型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 ( HSV-HGF)マウスを示す。
[図 13]図 13は、線条体におけるリン酸化 c - Metの発現を示す図である。
[図 14]図 14は、線条体における活性ィ匕カスパーゼー 3の免疫染色像を示す図である
[図 15]図 15は、カスパーゼ— 3のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。図 中、 1, 2は野生型同腹子を、 3, 4は R6Z2マウスを、 5, 6は R6Z2(HSV—LacZ) マウスを、 7, 8は R6Z2 (HSV—HGF)マウスを示す。
[図 16]図 16は、ウェスタンブロット分析における活性ィ匕カスパーゼ 3のバンド強度 を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HS
V— LacZ)マウスを、 Dは R6/2 (HSV— HGF)マウスを示す。
[図 17]図 17は、野生型同腹子マウスにおけるカスパーゼー 3の活性ィ匕に対する R6 Z2マウスにおけるカスパーゼー 3の活性化率を示す図である。
[図 18]図 18は、カスパーゼ— 1のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。図 中、 1, 2は野生型同腹子を、 3, 4は R6Z2マウスを、 5, 6は R6Z2(HSV—LacZ) マウスを、 7, 8は R6Z2 (HSV—HGF)マウスを示す。
[図 19]図 19は、ウェスタンブロット分析における活性ィ匕カスパーゼ 1のバンド強度 を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HS
V— LacZ)マウスを、 Dは R6/2 (HSV— HGF)マウスを示す。
[図 20]図 20は、野生型同腹子マウスにおけるカスパーゼー 1の活性ィ匕に対する R6
Z2マウスにおけるカスパーゼー 3の活性化率を示す図である。
[図 21]図 21は、 R6Z2 (HSV— HGF)マウス及び野生型同腹子の線条体における Ki— 67陽性細胞の免疫染色像を示す図である。図中、 Strは線条体を、 LVは脳室 を、 SVZは脳室下帯を示す。
[図 22]図 22は、マウス脳室下帯及び線条体における BrdU陽性細胞数を示す図で ある。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ) マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 *は野生型同腹子に対する有 意差(ρ< 0. 05)を、 * *は R6Z2 (HSV— LacZ)マウスに対する有意差(p< 0. 0 5)を示す。
[図 23]図 23は、マウス脳室下帯及び線条体におけるネスチンと BrdUの両者が陽性 である細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 * * は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに対する有意差(p< 0. 05)を示す。
[図 24]図 24は、マウス脳室下帯及び線条体における DCXと BrdUの両者が陽性で ある細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 C は R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 * *R 6/2 (HSV-LacZ)マウスに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 25]図 25は、マウス脳室下帯及び線条体における PSA— NCAMと BrdUの両者 が陽性である細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マ ウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示 す。 *は野生型同腹子に対する有意差 (Pく 0. 05)を、 * *は R6Z2 (HSV— Lac Z)マウスに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 26]図 26は、マウス脳室下帯及び線条体における β IIIチューブリンと BrdUの両 者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2 マウスを、 Cは R6Z2 (HSV— LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを 示す。 * *は R6Z2 (HSV— LacZ)マウスに対する有意差(pく 0. 05)を示す。
[図 27]図 27は、マウス脳室下帯及び線条体における NeuNと BrdUの両者が陽性で ある細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 C
は R6Z2(HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 * * は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに対する有意差(p< 0. 05)を示す。
[図 28]図 28は、マウス線条体におけるネスチンとリン酸化 c— Metの両者が陽性であ る細胞の免疫染色像を示す図である。
[図 29]図 29は、マウス線条体における DCXとリン酸化 c— Metの両者が陽性である 細胞の免疫染色像を示す図である。
[図 30]図 30は、 HGF蛋白質をコードする DNAを挿入した HSV— HGF、 AAV2-
HGF及び AAV4— HGFの 3種のベクターをラット腰髄の脊髄実質に注射し、 5日後 の脊髄における HGFの発現量を示す図である。図中、 Uは脊髄の吻側を、 Mは中央 部を、 Lは尾側を示す。 *はコントロールに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 31]図 31は、 HGF蛋白質をコードする DNAを挿入した HSV— HGF、 AAV2-
HGF及び AAV4— HGFの 3種のベクターをラット腰髄の脊髄腔に注射し、 5日後の 脊髄における HGFの発現量を示す図である。図中、 Uは脊髄の吻側を、 Mは中央 部を、 Lは尾側を示す。 *はコントロールに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 32]図 32は、ハンチンチン蛋白質のウェスタンブロット分析の結果を示す図である
[図 33]図 33は、ハンチンチン蛋白質のウェスタンブロット分析における C末端フラグメ ントを定量解析した結果を示す図である。図中 *は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに 対する有意差 (P< 0. 05)を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明において「HGF蛋白質をコードする DNA」とは、 HGF蛋白質を発現し得る DNAをいう。 HGF蛋白質をコードする DNAを含む DNAとしては、例えば、 Nature, 342, 440 (1989);特許第 2777678号公報; Biochem. Biophys, Res. Commun. , 198 9年,第 163卷, p. 967-973 ;Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 1991年,第 88卷(16号 ) , p. 7001- 7005等に記載され、例えば、 GeneBank/EMBL/DDBJに Accession No. M60718、 M73240、 AC004960、 AY246560, M29145又は M73240等とし て登録されているヒト由来の HGF蛋白質をコードする DNA等が好ましく挙げられる。 また、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAには、前記 DNAと相補的な塩基配列
力もなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 HGF 蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋 白質をコードする DNA等が包含される。
[0019] HGF蛋白質をコードする DNAの具体例としては、例えば、配列番号 1又は 2で表 わされる塩基配列を有する DNA、若しくは配列番号 1又は 2で表わされる塩基配列 を有する DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノ、イブ リダィズする DNAであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン 活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードする DNA等が好ましく挙げられる。 ここで、配列番号 1で表される塩基配列は、 Accession No. M60718の塩基配列第 7 3乃至 2259に相当し、該 DNAは配列番号 3で表されるアミノ酸配列力もなる HGF蛋 白質をコードする DNAに相当する。配列番号 2で表される塩基配列は、 Accession N 0. M73240の塩基配列第 66乃至 2237〖こ相当し、該 DNAは配列番号 4で表される アミノ酸配列からなる HGF蛋白質をコードする DNAに相当する。
[0020] 配列番号 1又は 2で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、例えば上記 DNAの部分配列を プローブとして、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイブリダィゼーシヨン法 あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNA を意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定ィ匕したフィル ターを用いて、約 0. 7〜1. 0Mの塩化ナトリウム存在下、約 65°Cでハイブリダィゼー シヨンを行った後、約 0. 1〜2倍の濃度の SSC溶液(1倍濃度の SSC溶液の組成は 、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムよりなる。)を用い、約 65°Cの 条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAを挙げることができる。ストリ ンジ ントな条件は、以下において同様である。
[0021] 上記の配列番号 1又は 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAとして具体的には、配列番号 1又 は 2で表わされる塩基配列と約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を有する DNA等が挙げられる。ハイブリダィ ゼーシヨンは、公知の方法、例えば、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング(Molecular Cloning
, A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor
Lab. Press, 2001 :以下、モレキュラー 'クローユング第 3版と略す。)に記載の方法 等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用 説明書に記載の方法に従って行うことができる。
[0022] さらに、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAは上記に限定されず、発現する蛋 白質が HGF蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードする DNAである限 り、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAとして使用できる。例えば HGF蛋白質の 部分ペプチドをコードする DNAであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有す るペプチドをコードする DNA等も好ましく使用できる。
[0023] HGF蛋白質の部分ペプチドをコードする DNAとしては、上記した部分ペプチドを コードする塩基配列を有しかつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するぺプチ ドをコードする DNAであれば!/、かなるものであってもよ!/、。具体的な本発明の部分 ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、(a)配列番号 1又は 2で表わされる塩基 配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAであって、かつ HGF蛋白質と実 質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA、 (b)配列番号 1又は 2で表 わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配 列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA等が挙げられ る。このような DNAとしては、より具体的には、例えば、配列番号 1で表されるヒト HG Fの塩基配列の第 94番目力 第 630番目までの塩基配列 (HGFの N末端ヘアピン ループから第 1クリングルドメインまでのペプチドをコードする DNA)を有する DNAや 、配列番号 1で表されるヒト HGFの塩基配列の第 94番目力も第 864番目までの塩基 配列(HGFの N末端ヘアピンループから第 2クリングルドメインまでのペプチドをコー ドする DNA)を有する DNA等が好ましく挙げられる。
[0024] HGF蛋白質をコードする DNA又は HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNAは、例えば通常のハ イブリダィゼーシヨン法や PCR法等により容易に得ることができ、該 DNAの取得は具 体的には例えば前記モレキュラー 'クローニング第 3版等の基本書等を参考にして行
うことができる。
[0025] なお、本発明で用いられる HGF蛋白質をコードする DNA又は HGF蛋白質の部分 ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNAを含む DNAとしては、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリー、細胞もしくは組 織由来の cDNA、細胞もしくは組織由来の cDNAライブラリ一又は合成 DNA等が好 ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノム DNA断片がクローユングされるベクター としては、ノ クテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。 また、本発明で用いられる HGF蛋白質をコードする RNA又は HGF蛋白質の部分 ペプチドをコードする RNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有 するペプチドをコードする RNAも、逆転写酵素により HGF蛋白質又は部分ペプチド を発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該 RNAとしては 、例えば細胞又は組織より mRNA画分を調製して、 RT— PCR法によって増幅した R NA等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該 RNAも公知の手段により得ること ができる。
[0026] 本発明で使用される HGF蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に 精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
HGF蛋白質は、例えば HGF蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養 し、培養上清等から分離、精製して該 HGF蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝 子工学的手法により HGF蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、 これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清液から目 的とする組換え HGF蛋白質を分離すること等により得ることもできる。(例えば、特開 平 5— 111382号公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989年、第 163卷, p. 96 7等を参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用 いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることが できる。このようにして得られた HGF蛋白質は、天然型 HGF蛋白質と実質的に同じ 作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数個(複数個とは例えば、 2〜2 0個、好ましくは 2〜: L0個、より好ましくは 2〜5個;以下同様である。)のアミノ酸が置 換、欠失若しくは付加されていてもよぐまた同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加さ
れていてもよい。そのような HGF蛋白質として、下記する 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白 質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法 等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数(1〜複数個)が、欠失、 置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加した HGF蛋白質とは、例えば天然の HGF蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し 糖鎖を欠損させた HGF蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸 配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が 付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。具体的には、例えば NCBI のデータベースに登録されている Accession No. NP— 001010932のヒト HGFに 対し、糖鎖付カ卩部位の 289位 Asnを Ginに、 397位 Asnを Ginに、 471位 Thrを Gly に、 561位 Asnを Ginに、 648位 Asnを Ginにそれぞれ置換することによって糖鎖が 付カ卩しないようにした HGF[Fukuta K et al. , Biochemical Journal, 388, 555-562 (2005) ]等を挙げることができる。
さらに、 HGF蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上の相同性を有する蛋白 質、好ましくは約 90%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 95%以上の 相同性を有する蛋白質であって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質も本発明に使用される HGF蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列につ 、て「 相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するァ ミノ酸残基の一致の程度の意味である。
上記 HGF蛋白質としては、例えば NCBIのデータベース等に登録されている例え ば Accession No. P14210 (配列番号 3)又は Accession No. NP— 001010932 ( 配列番号 4)で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来の蛋白質等が好ましく挙げら れる。配列番号 4で表される HGF蛋白質は、配列番号 3で表されるアミノ酸配列の第 161〜165番目の 5個のアミノ酸残基が欠失している 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白質で ある。配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来 の天然 HGF蛋白質であって、 HGFとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有 する。
配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む 蛋白質としては、配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上、 好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば 配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列から、 1〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は 欠失させたアミノ酸配列、 1〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させた アミノ酸配列又は 1〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白 質であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質であることが好まし い。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる 20種類 のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、ァミノ基とカルボ キシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えば γ—ァミノ酪酸等が挙げ られる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質とし ては、例えば NCBIのデータベースに登録されている Accession No. BAA14348 又は AAC71655等のヒト由来 HGFが挙げられる力 これらに限定されない。
なお、本発明で用いられる HGF蛋白質又はそれをコードする DNAは、ヒトに適用 する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物(例え ばサル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ノヽムスター、モル モット、チンパンジー等)に由来する HGF蛋白質又はそれをコードする DNAであつ てもよい。このような HGFとしては、例えば NCBIのデータベース等に登録されている 例えば、マウス由来 HGF (例えば Accession No. AAB31855, NP— 034557, B AA01065, BAAO 1064等)、ラット由来 HGF [例えば Accession No. NP— 5871 3 (配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質)等]、ゥシ由来 HGF (例えば A ccession No. NP— 001026921、 XP874086, BAD02475等;)、ネコ由来 HGF ( 例えば Accession No. NP— 001009830、 BAC10545, BAB21499等)、ィヌ由 来 HGF (例えば Accession No. NP— 001002964、 BAC57560等)又はチンパン ジー由来 HGF (例えば Accession No. XP519174等)などが挙げられるが、これら
に限定されない。
[0029] 本発明に用いられる HGF蛋白質は、 C末端がカルボキシル基(一 COOH)、カル ボキシラート [― COOM (Mは金属を示す)]、アミド(― CONH )又はエステル(― C
2
OOR)のいずれであってもよい。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、 ェチル、 n—プロピル、イソプロピルもしくは n—ブチル等の C1— 6アルキル基、例え ば、シクロペンチル、シクロへキシル等の C3— 8シクロアルキル基、例えば、フエ-ル 、 a ナフチル等の C6— 12ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチル等のフエ- ルー C 1 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチル等の at ナフチルー C1 2アル キル基等の C7— 14ァラルキル基のほ力 ァセチルォキシメチル、ビバロイルォキシ メチル等の C2— 6アルカノィルメチル基等が用いられる。本発明で用いられる HGF 蛋白質が、 C末端以外にカルボキシル基又はカルボキシラートを有している場合、力 ルボキシル基又はカルボキシラートがアミド化又はエステル化されているものも本発 明における HGF蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C 末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられる HGF蛋白質には、上 記した蛋白質において、 Ν末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、ホルミ ル基、ァセチル等の C2 - 6アルカノィル基等の C 1 - 6ァシル基等)で保護されて!ヽ るもの、 Ν末端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸ィ匕した もの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基 (例えば、― ΟΗ、― SH、アミノ基、イミ ダゾリル基、インドリル基、グァ-ジノ基等)が適当な保護基 (例えば、ホルミル基、ァ セチル等の C2— 6アルカノィル基等の C1 6ァシル基等)で保護されて!ヽるもの、あ ¾ ヽは糖鎖が結合した 、わゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
[0030] 本発明で用いる HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質 の活性を有するペプチド (以下、 HGF部分ペプチドと略記する場合がある。)として は、上記した HGF蛋白質の部分ペプチドであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の 活性を有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、 HGF部 分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した HGF蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なく とも約 20個以上、好ましくは約 50個以上、より好ましくは約 100個以上のアミノ酸配 列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号 3で表されるヒト
HGFアミノ酸配列の N末端側から 32番目のアミノ酸から 210番目のアミノ酸までのァ ミノ酸配列(HGFの N末端ヘアピンループ力も第 1クリングルドメインまでの配列)で 示されるペプチドや、配列番号 3で表されるヒト HGFアミノ酸配列の N末端側から 32 番目のアミノ酸から 288番目のアミノ酸までのアミノ酸配列(HGFの N末端ヘアピン ループ力 第 2クリングルドメインまでの配列)で示されるペプチド等が好ましく挙げら れる。
本発明の HGF部分ペプチドにおいては、 C末端がカルボキシル基(― COOH)、 カルボキシラート [― COOM (Mは上記と同意義)]、アミド(― CONH )又はエステ
2
ル(一COOR;Rは上記と同意義)のいずれであってもよい。さらに、 HGF部分ぺプ チドには、上記した HGF蛋白質と同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護 基で保護されて ヽるもの、 N末端側が生体内で切断され生成した Ginがピロダルタミ ン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されて V、るもの、あるいは糖鎖が結合した 、わゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれ る。
[0031] 本発明に用いられる HGF蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基 との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩 が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素 酸、硫酸等)との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、 マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン 酸、ベンゼンスルホン酸等)との塩等が挙げられる。
[0032] 本発明に用いられる HGF蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチド の合成法に従って、あるいは HGF蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによ つて製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合 成法のいずれでも良い。すなわち、 HGF蛋白質を構成し得る保護基を有していても ょ 、部分ペプチドもしくはアミノ酸と保護基を有して 、てもよ 、残余部分とを縮合させ 、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製 造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、 M. Bodansz ky及び M. A. Ondetti、ペプチド 'シンセシス(Peptide Synthesis) , Interscience Publ
ishers, New York (1966年)、 Schroeder及び Luebke、ザ ·ペプチド(The Peptide) , A cademic Press, New York (1965年)等に記載された方法等が挙げられる。反応後は 通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグ ラフィー、結晶化又は再結晶等を組み合わせて HGF蛋白質の部分ペプチドを精製 単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公 知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公 知の方法によって遊離体に変換することができる。
[0033] 本発明における、「ポリグルタミン病」としては、原因遺伝子の塩基配列に含まれる シトシン ·アデニン ·グァニン(CAG;グルタミンのコドン)配列の繰り返し配列を約 30 以上含む原因遺伝子が転写、翻訳されてできる異常に伸長したグルタミン鎖 (ポリグ ルタミン)を含む原因遺伝子産物が神経細胞に異常蓄積又は凝集して神経細胞変 性又は細胞死や機能異常、例えば筋肉運動の変調 (例えば舞踏病や筋失調症等) 、認識力の低下又は精神化症状等を引き起こす遺伝性神経変性疾患が典型例とし て挙げられる。
ポリグルタミン病としては、具体的には、例えばノヽンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎 縮症、脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳 失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状核赤核淡蒼球ル ィ体萎縮症等が挙げられる。
[0034] 本発明にお ヽて、「治療」とは、ポリグルタミン病の症状を緩解、又は完治させること をいい、より具体的には、例えば、ポリグルタミン病における神経細胞変性又は細胞 死を抑制又は遅延させることによって、前記機能異常を抑制又は防止し、正常化さ せることを含む。また、該治療には、神経細胞変性又は細胞死が誘発される部位に おいて、神経細胞を新生させること等も包含される。
[0035] 本発明にお 、て、「発病抑制」とは、ポリグルタミン病の CAGの繰り返しを約 30以上 有する原因遺伝子が発現し、該原因遺伝子産物が生成されて誘発される神経変性 又はその進行を抑えることを 、 、、ポリグルタミン病の CAGの繰り返しを約 30以上有 する原因遺伝子が発現し、該原因遺伝子産物が生成され蓄積されるのを抑制又は 防止することを包含する。
原因遺伝子としては、例えばノヽンチンチン遺伝子等が挙げられる。該ハンチンチン 遺伝子はその第 1ェクソンに CAGの繰り返し配列を有する。なお、ハンチンチン遺伝 子は非病原性の場合では前記第 1ェクソンに存在する CAGの繰り返し配列が約 30 未満である力 病原性遺伝子としては前記 CAGの繰り返し配列が約 30以上になるも のが挙げられる。
[0036] ポリグルタミン病の発病抑制の方法としては、例えば(l) CAGの繰り返しを 30以上 有する原因遺伝子の発現抑制又は防止、(2) CAGの繰り返しを 30以上有する原因 遺伝子産物の生成抑制又は防止、(3)生成された CAGの繰り返しを 30以上有する 原因遺伝子産物の蓄積抑制又は防止、(4)ポリグルタミン病原因遺伝子産物に起因 しておこる神経変性の進行抑制、あるいは(5) CAGの繰り返しを 30以上有する原因 遺伝子産物のプロセシングの抑制等が挙げられる。前記(1)乃至(5) V、ずれかある いは 2つ以上を抑制又は防止することが好ま 、。
[0037] 本発明のポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳 動物(例えば、サル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ハム スター、モルモット、チンパンジー等)にも適用できる。
[0038] 本発明の治療剤又は発病抑制剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方 法、投与量等は、有効成分が HGF蛋白質の場合と、 HGF蛋白質をコードする DNA の場合と若干異なってもよ!/、。
例えば、有効成分が HGF蛋白質である場合の本発明の製剤は、種々の製剤形態 、例えば液剤、固形剤等をとりうる力 一般的には HGF蛋白質のみを又はそれを慣 用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤 (例えば、デポ剤)等に製剤されるのが 好ましい。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射 剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒 (注射用水、精製水等)に、 医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤 (塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、グリセリン 、マン-トール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等)、緩 衝剤(リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリ ス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等)、保存剤 (パラ ォキシ安息香酸メチル、ノ ラオキシ安息香酸ェチル、ノ ラオキシ安息香酸プロピル、
パラォキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化べンザル コ-ゥム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等)、増粘剤(ヒド 口キシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリ エチレングリコール等)、安定化剤(亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト 酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等)又 は pH調整剤 (塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等)等を適宜添加した溶液に、 H GF蛋白質を溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充 填すること〖こより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール( エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)又 は非イオン界面活性剤(ポリソルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等)等 をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油 又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はべンジルアルコ 一ル等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル 等に充填される。注射剤中の HGF蛋白質含量は、通常約 0. 0002-0. 2wZv%、 好ましくは約 0. 001-0. lwZv%に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、 凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製 剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
[0039] 噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する 場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添 加剤であればいずれのものであってもよぐ例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保 存剤、安定化剤、等張化剤、 PH調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス 噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化 水素(HCFC22、 HCFC— 123、 HCFC— 134a、 HCFC142等の代替フロン類等 )、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性 ガス (炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等)又は不溶性ガス(窒素ガス等)等が挙げられる。
[0040] また、本発明で用いられる HGF蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤
(例えばデポ剤)とすることもできる。 HGF蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬 回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製
剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内 分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のな力から適宜選択できるが、例え ばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類;コラーゲン又はゼラチン等の蛋白 質;ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチォニン等のポ リアミノ酸;ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸ーグリコール酸共重合体;ポリ力プロラクト ン、ポリ j8—ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸'ポリエチレ ングリコール .ビュルピロリドン共重合体等のポリエステル;ポリオルソエステル又はポ リメチルー α シァノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸;ポリエチレンカー ボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ま しくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸ーグリコール酸共重合体である 。乳酸ーグリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比(乳酸 Ζグリコール酸)( モル%)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約 2週間ないし 3力月、好 ましくは約 2週間ないし 1力月の場合には、約 100ZO乃至 50Ζ50が好ましい。該ポ リ乳酸又は乳酸ーグリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約 5, 00 0乃至 20, 000が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸—グリコール酸共重合体は、公知の製 造法、例えば特開昭 61— 28521号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体 分解性高分子と HGF蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性 高分子に対して、 HGF蛋白質が約 0. 01〜30wZw%が好ましい。
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接ポリグルタミン病の病変部位に直 接注射 (髄腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等)も しくは噴霧するカゝ、あるいは徐放性製剤(デポ剤)をポリグルタミン病の病変部位のあ る組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又 は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、 1回当たり1 /^〜50011^、好ましくは 1 0/ζ 8〜50πι8、さらに好ましくは l〜25mgである。また、投与回数も剤形、疾患の程 度又は年齢等に応じて適宜選択され、 1回投与とする力 ある間隔をおいて持続投 与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は 1日 1回力も数ケ月に 1回でよく、 例えば、徐放性製剤 (デポ剤)による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の 場合は、数ケ月に 1回でもよい。
[0042] 一方、 HGF遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学,遺伝子 治療の基礎技術,羊土社, 1996、別冊実験医学,遺伝子導入 &発現解析実験法, 羊土社, 1997、 日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ 'テ ィー 'エス, 1999等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、 HGF遺伝子が組み込まれた組換え発現べク ター等をポリグルタミン病の病変部位の組織 (例えば脊髄神経、脳等)へ局所注射す る方法、又は、患者の病変部位の組織又は脊髄等力 細胞を体外に取り出して、該 細胞に HGF遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後 に、形質転換された前記細胞を、患者の病変部位又は脊髄に移植する方法等が挙 げられる。
[0043] 発現ベクターとしては、 nakedプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス 、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス(I型単純へルぺスウィルス等)、ワクシニアゥ イノレス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスゥイノレス、センダイウィルス、 SV40 又は免疫不全症ウィルス (HIV)等の DNAウィルス又は RNAウィルス等が挙げられ るが、これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞 に組換えウィルスを感染させることにより、細胞内に HGF蛋白質をコードする DNAを 導入することが可能である。中でも、 I型単純へルぺスウィルス(HSV— 1)ベクター、 アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクター等が好まし!/、。
前記 HSV— 1ベクターは神経向性を有するベクターである。 HSV- 1ベクターとし ては、多重遺伝子(30kbまで)が組み込まれている大きな(152kb)ゲノムを有し、か つ生涯にわたり潜在的に神経細胞に対して感染を榭立する能力を有するものが好ま しい。具体的な HSV— 1ベクターとしては、ウィルス複製のための ICR4, ICP34. 5 及び VP16 (vmw65)をエンコードする 3つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態 にある複製能力のない HSV—1 (HSV1764Z4— ZpR19)ベクター(Coffin RS, e t al, J. Gen. Virol. 1998年,第 79卷, p. 3019- 3026 ; Palmer JA, et al, J. Virol., 2000年,第 74卷, p. 5604- 5618 ; Lilley CE, et al., J. Virol, 2001年,第 75卷, p. 4 343-4356)等が挙げられる。また、 AAVベクターは、非病原性ウィルスに属し、安全 性が高ぐまた神経細胞等の非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるベクターであ
る。 AAVベクターとしては、 AAV— 2、 AAV— 4、 AAV— 5等が挙げられる。これら HSV- 1ベクターや AAVベクターは目的遺伝子を神経細胞等において長期間発 現させ得る。ポリグルタミン病は長期間を経て病態を完成するので、本発明に使用さ れるベクターとしては、長期発現を可能とする HSV— 1ベクターや AAVベクターがと りわけ好ましい。
HGFのポリグルタミン病に対する効果の評価のためには、例えば、 HSV—1ベクタ 一、 AAVベクターを使用して HGF遺伝子をポリグルタミン病の病変部位、例えば線 条体ゃ髄腔内等へ形質導入するのが好まし ヽ。
[0044] 製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態 [例えば、 注射剤、噴霧剤、徐放性製剤 (デポ剤)、マイクロカプセル剤等]をとり得ることができ る。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤 (デポ剤)は HGF蛋白質の場合と同様にして調製 できる。また、マイクロカプセル剤を製造する場合、例えば HGF遺伝子を含む発現プ ラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法 (例えばコアセルべ ーシヨン法、界面重合法又は二重ノズル法等)に従って被膜物質で覆うことにより直 径約 1〜500、好ましくは約 100〜400 μ mの微粒子として製造することができる。被 膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ェチ ルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン 'アラビアゴム、ニトロセル ロース、ポリビュルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコ ール酸、乳酸ーグリコール酸共重合体、キトサン アルギン酸塩、硫酸セルロース ポリ(ジメチルジァリル)アンモ-ゥムクロライド、ヒドロキシェチルメタクリレートーメチル メタタリレート、キトサン カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩—ポリリジン アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中の DNAの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により 適宜調節することができる。また投与量は、 HGF遺伝子導入ベクターの種類により異 なるが、 HGF遺伝子導入ベクターに換算して、通常 1 X 106pfu〜l X 1012pfu、好ま しくは1 107 〜2 1011 、さらに好ましくは 1. 5 X 107pfu〜l. 5 X 10upfuを 数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。
[0045] 本発明の剤は、ポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、
脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎 縮症等、好ましくはハンチントン舞踏病の治療又は発病の抑制に用いることができる ポリグルタミン病の治療又は発病の抑制効果は、公知の方法 [例えば、クラスビング テスト(Nat. Med,第 10卷, p. 148—154, Epub. 2004年, Jan. 2018);ロタロッドテスト(J . Neurosci, 2000年,第 20卷, p. 4389-4397);フットプリントテスト(J. Neurosci, 1999 年,第 19卷, p. 3248-3257)等]やそれに準じる方法、例えば、後述する試験例等に 記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0046] また、本発明によれば、 HGF蛋白質もしくは HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド (HGF蛋白質等)、ある 、は H GF蛋白質をコードする DNAもしくは HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は前記 DNAと相 補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAを 含む DNA(HGF遺伝子)を、脳室の拡大抑制、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依 存神経細胞変性又は細胞死抑制、神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又は力 スパーゼー 1の活性ィ匕抑制又は神経細胞新生に使用し得る。
[0047] 脳室拡大は、脳の萎縮、特に線条体萎縮 (例えば、線条体細胞死に基づく線条体 萎縮)によるものが含まれる。本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、脳 室拡大により生じる症状、例えば歩行困難等の四肢障害等の運動機能障害、言語 障害、記憶障害又は神経科症状等を抑制し得る。
[0048] ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死は、神経組織、例 えば線条体等においてポリグルタミン病原因遺伝子産物が発現して蓄積するために 生じるものが含まれる。本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、ポリグルタ ミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死、特に線条体におけるポリグ ルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑制し得る。なお、細胞 死は、アポトーシス及びネクローシスを包含する。このため細胞死抑制というときは、
細胞自体の死が抑制されればよぐアポトーシスを抑制してもよぐまたネクローシス を抑制してもよく、ある 、はその両方を抑制してもよ 、。
[0049] また、本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、前記細胞死の誘導に関 与する、プロテアーゼ、例えばカスパーゼ、とりわけカスパーゼー 1又はカスパーゼー 3の活性化を抑制し得る。ヒトには、カスパーゼは約 10〜20種類存在し、ある種の力 スパーゼが活性ィ匕されるとそのカスパーゼによって他のカスパーゼが活性ィ匕されると いうカスケード反応を生じ、細胞死を誘導する。これらカスパーゼ中でカスパーゼー 3 はカスパーゼ活性ィ匕の最後の段階で細胞死を実行する酵素として知られて 、る。ま た、カスパーゼ 3は、ハンチントン舞踏病で活性化されることが知られている (Zhang Yら, J, Neurochem, 2003年,第 87卷, p. 1184-1192)。カスパーゼ 3は種々の細 胞内蛋白質を分解することによって細胞死を実行するプロテアーゼであって、神経細 胞にお ヽて神経細胞変性又は細胞死が誘導される際に活性化され得る。カスパー ゼー 3又はカスパーゼー 1の活'性ィヒ抑制とは、前記カスパーゼー 3又はカスパーゼー 1の活性ィ匕を抑制することをいう。カスパーゼー 3又はカスパーゼー 1の活性ィ匕抑制 作用は、公知の方法あるいはそれに準じる方法(例えば、 Trends Biochem. Sci. , 19 97年,第 22卷, p. 388-393 ; Biochem. J. , 1997年,第 326卷, p. 1-16 ; Anal. Bioche m. , 1997年,第 251卷, p. 98-102等に記載の方法)や例えば、後述する試験例等に 記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0050] また、本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、神経細胞新生に関与する 。神経細胞新生は、神経細胞に分化する神経芽細胞や神経幹細胞等の増殖を含む 。新しい神経細胞が生まれるには、細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂 時には、遺伝情報をコピーするために DNAが合成さる。 DNAが合成されたかどうか を知る手がかりとなる物質としては、例えば BrdU (ブロモデォキシゥリジン)等が挙げ られる。例えば、 BrdUを体内に注入すると新しく生まれる細胞には、この BrdUが取 り込まれるのでこの BrdUを指標に神経細胞の新生を判定できる。従って、神経細胞 新生作用は、例えば脳神経細胞に取り込まれる BrdUを指標に測定する方法や後述 する試験例等に記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0051] また、本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、ポリグルタミン病原因遺伝
子産物のプロセシングに関与する。プロセシングは、ポリグルタミン病原因遺伝子発 現過程において、該遺伝子の転写産物が細胞内の蛋白分解酵素等により部分分解 等を受け固有の局在性や機能をもつ蛋白質に成熟していく過程をいうが、本発明に おいては該原因遺伝子産物が断片化されることをも含む。ポリグルタミン病では、い ずれの原因遺伝子も原因遺伝子中に存在するポリグルタミンの伸張(30以上)を認 めることを共通の特徴とする。ポリグルタミン病における神経毒性発現には、 CAGの 繰り返しを 30以上有する原因遺伝子産物が断片化されることが含まれる。例えばノヽ ンチントン舞踏病においては、原因遺伝子 (ノヽンチンチン遺伝子)に含まれる CAGの 繰り返しが 30以上に増加したハンチンチン遺伝子が発現される過程においてプロセ シングにより、該原因遺伝子産物 (変異ハンチンチン)が断片化される。断片化され た変異ハンチンチンは、病原性を有し、神経毒性を発現すると考えられている。これ らのことを背景にして、ハンチンチン蛋白質がプロセシングを受けて断片化されたノヽ ンチンチンになる効率が HGF遺伝子により抑制されるかどうかを評価することで、プ ロセシングを抑制する力否かを評価することができる。前記プロセシングの抑制作用 は例えば後述する試験例に記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0052] 本発明の使用は(1) (ィ) HGF蛋白質もしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチドで あって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるい は(2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは(口) HGF蛋白質の部分ペプチド であって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又 は (ハ)それら DNAと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジ ントな条件下で ノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくは ペプチドをコードする DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制 剤としての使用である。また、上記の(1)あるいは(2)の成分のポリグルタミン病の治 療剤又は発病抑制剤の製造の為の使用である。
[0053] 本発明のポリグルタミン病の治療又は発病抑制方法は哺乳動物に上記の(1)ある いは(2)の成分を投与する方法である。
[0054] さらに、本発明の使用は上記の(1)あるいは(2)の成分の脳室の拡大抑制剤として の使用である。また、上記の(1)あるいは(2)の成分の脳室の拡大抑制剤の製造の
為の使用である。
[0055] 本発明の脳室の拡大抑制方法は哺乳動物に上記の(1)あるいは(2)の成分を投 与する方法である。
[0056] さらに、本発明の使用は上記の(1)あるいは(2)の成分のポリグルタミン病原因遺 伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤としての使用である。また、上記の( 1)あるいは(2)の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細 胞死抑制剤の製造の為の使用である。
[0057] 本発明のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制方 法は哺乳動物に上記の(1)あるいは(2)の成分を投与する方法である。
[0058] さらに、本発明の使用は上記の(1)あるいは(2)の成分の神経細胞におけるカスバ ーゼ— 3及び Z又はカスパーゼ— 1の活性ィ匕抑制剤としての使用である。また、上記 の(1)あるいは(2)の成分の神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又はカスパー ゼ— 1の活性化抑制剤の製造の為の使用である。
[0059] 本発明の神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性ィ匕抑 制方法は哺乳動物に上記の(1)あるいは(2)の成分を投与する方法である。
[0060] さらに、本発明の使用は上記の(1)あるいは(2)の成分のポリグルタミン病原因遺 伝子産物のプロセシング抑制剤としての使用である。また、上記の(1)あるいは(2) の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤の製造の為の使用 である。
[0061] 本発明のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制方法は哺乳動物に 上記の(1)ある 、は(2)の成分を投与する方法である。
[0062] 本発明の医薬及び方法はポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病、球脊髄性 筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄 小脳失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状核赤核淡蒼 球ルイ体萎縮症等、好ましくはハンチントン舞踏病の患者への使用が好適である。 実施例
[0063] 以下に試験例を用いて本発明を説明する力 本発明はこれらに限定されるもので はない。
[0064] 〔試験例 1〕
ハンチントン舞踏病遺伝子導入形質転換マウスにおける HGFの作用
1.実験動物
B6CBA—TgN (変異 HDェキソン l) 62GpbZj雌性マウス(Mangiarini Lら, Cell , 1996年,第 87卷, p. 493-506)から摘出した卵巣が移植された B6CBAF1ZJ雌性 マウスは、 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から入手し、 B6CBAF1ZJ雄性 マウスと共に飼育し、交配した。
交配した子は、その尾組織力ゝら抽出したゲノム DNAの PCR解析により遺伝子系を 決定し、 TgN62Gpb遺伝子を有するマウスをノヽンチントン舞踏病モデルマウス R6/ 2マウス(以下、 R6Z2マウスと略記する。)とした。また、前記 R6Z2マウスと同腹で T gN (変異 HDェキソン 1) 62Gpb遺伝子を持たな 、マウスを野生型同腹子マウスとし て使用した。
全ての実験は大阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべて の取り組みはできるだけ動物の負担を少なくし、できるだけ少な 、数の動物を使用し た。
[0065] 2.ベクターの構築、製造及び精製
pRl 9GFPWPRE (Lilley CEら, J. Virol, 2001年,第 75卷, p. 4343- 4356)の GFP (green fluorescent protein;緑色: i:光タンノ ク)遺伝子を、ラット HGFをコードする D NAの全長(ratHGF ;配列番号 5)に KT3タグ(3'— CCGCCCGAGCCAGAGA CT 5, ;配列番号 7)を付加した cDNA (Sun Wら, J. Neurosci, 2002年,第 22卷, p. 6537- 6548)で置換し、 pR19ratHGFKT3WPREを構築した。このベクター(pRl 9ratHGFKT3WPRE)のシークェンスは、 ABI 310キヤピラリーシークェンサ一を 使用する分析により確認した。次いで、 M49細胞を用いて、プラスミド pR19ratHGF KT3WPREの DNAと、 HSV1764/ - 4/pRl 9LacZウィルス DNAとのコトランス フエクシヨンにより相同組換えを行なった。白色プラークを選択し、 3回精製し、 Palmer JAらの方法 (J. Virol, 2000年,第 74卷, p. 5604-5618)に従い、複製能力のないウイ ルスを増殖させた。ラット HGFの発現を、免疫染色によって確認した。該発現を更に ウェスタンプロット法及びラット HGFの酵素抗体免疫測定法 (ELISA)により確認した
。本試験に使用するために、タイター (titer)が l〜2 X 109 pfu (プラーク 'フォーミング •ユニット) ZmLである HSV1764Z—4ZpR19HGFウィルスベクター(HGF発現 ベクター;以下、 HSV—HGFと略記する)と、タイターが 1〜1. 5 X 109pfuZmLで ある HS VI 764Z - 4ZpRl 9LacZウィルスベクター(HGF非発現ベクター;以下、 HSV— LacZと略記する)を調製した。
[0066] 3.脳内への HSV挿入(In vivo)
4週令の R6/2マウスに、ペントバルビタールを 50mg/kg静脈注射して深く麻酔 した。線条体(一 0. 4mm前後, ± 1. 8mm内外側方向、及び 3. 5mm背腹方向) へ注射するために、該マウスを Kopf脳定位固定装置に入れ固定した。 5 /z L HSV — LacZ (5 X 106pfu)又は HSV— HGF (3 X 105pfu)を該マウスに注射した。注射 は、マウスの前記線条体に 10 μ Lのハミルトンシリンジを用いて速度 0. 3 μ L/min で実施された。以下、 HSV— LacZを注射したマウスを R6Z2 (HSV— LacZ)マウス 、 HSV— HGFを注射したマウスを R6Z2 (HSV— HGF)マウスと!/、う。
[0067] 4.組織学的及び免疫組織化学的分析
マウスに深く麻酔し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を心臓力 流入してマウス の全身を灌流し、次いで 4%パラホルムアルデヒド含有 PBSで灌流固定した。脳を段 階的に 10%及び 20%シユークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳 を、 20 mの連続切片とした。得られた凍結切片は、ニッスル物質を染色するためク レシル ·バイオレットで染色した。
免疫組織化学的染色は、凍結切片を、 PBSで洗浄し、 10%ャギ又はロバ血清を含 む PBSに 1時間浸漬し、次いで抗体と共に 4°Cでー晚インキュベートすることによって 行なわれた。
[0068] 抗体は、以下を使用した。
(1) NeuN抗体
マウスモノクロナール抗体(Chemicon International社製;カタログ番号 MAB377) を 500倍希釈して使用した。
( 2) c— Met抗体
SP260、ゥサギポリクロナール抗体(Santa Cruz Biotechnology社製;カタログ番
号 sc— 162)を 50倍希釈して使用した。
(3)リン酸化 c Met抗体
ゥサギポリクロナール抗体, (Biosource社製;カタログ番号 44— 888G)を 100倍希 釈して使用した。
(4)活性化カスパーゼ 3抗体
ゥサギポリクロナール抗体 (プロメガ社製;カタログ番号 G748)を 125倍希釈して使 用した。
[0069] 5.酵素抗体免疫測定 (ELISA)法
組織の HGFは、 Sun Wら、 Brain Res Mol Brain Res, 2002年,第 103卷, p. 36- 48に記載のように抗 HGFポリクロナール抗体(Tokushu Meneki製)を用いて測定し た.
[0070] 6.ウェスタンブロッテイング
マウスの脳線条体のホモゲナイズは、 50mMトリス— HCl (pH7. 4)、 150mM N aCl、 1% (WZV)トリトン X— 100、 ImM PMSF (フエ-ルメタンスルホ-ルフルォ ライド;和光純薬工業株式会社製)、 2 /z gZmLアンチノ イン (ペプチド研究所製)、 2 μ g/mLロイぺプチン(ペプチド研究所製)、 2 μ g/mLぺプスタチン(ペプチド研究 所製)を用いて調製された。同量の蛋白質(120 μ gZレーン)を 15%SDS ポリア クリルアミドゲル電気泳動(SDS— PAGE)に付した。分離後、蛋白質をポリビ-リデ ンジフルオリド(polyvinylidene difluoride; PVDF)膜(BIO—RAD社製)へ電気的に 転写した。転写した PVDF膜は、室温で 2時間、 10質量%スキムミルクでブロッキン グ後、抗カスパーゼ 3抗体 (ゥサギポリクロナール抗体;カタログ番号 C9598, Sigma 社製)又は抗カスパーゼ— 1 (ρ20)抗体 (ゥサギポリクロナール抗体;カタログ sc— 12 18— R, Santa Cruz Biotechnology社製)でブロットした。次いで、抗カスパーゼ— 3 抗体又は抗カスパーゼー 1抗体は、 2次抗体(DakoCytomation社製)をコンジユゲー トしたホースラディッシュ 'ペルォキシダーゼ(HRP)と共にインキュベーションし、製品 説明書に従って ECL reagents (製品番号 RPN2106,アマシャム'バイオサイエンス 社製)で発色させた。
バンドの強度は、 Wayre Rasband氏によって開発された NIH (National Institutes o
f Health)イメージソフトウェアを使用して解析された。
[0071] 7.統計的分析
データは平均値士標準偏差 (SD)で示し、統計学的有意差の検定は、フィッシャー の最小有意差法 (PLSD)を用いる分散分析で評価した。
各グループのデータは、解析ソフト Statview 5. 0 (SAS Institute, Inc.製)で分析 した。 p< 0. 05の確率値の違いを統計的有意差ありとした。
[0072] 8. HSV導入に伴う HGF発現
HGFの in vivo発現を、免疫組織ィ匕学的に分析した。 9週令 (HSV— HGF又は H SV— LacZ注射 5週後)において、 HGFの免疫反応性力 R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスと比較して、 R6Z2 (HSV—HGF)マウスの線条体で増加し た(図 la— d)。
ELISAを用いた線条体における HGF蛋白質濃度は以下の通りであった。線条体 における HGF蛋白質濃度は、 HSV— HGFを投与した野生型同腹子マウスでは、 H SV— HGF注射 3曰後に 47. 07± 5. 81ng/gとなり、 R6/2マウスの HGFの約 3 倍に増加した。 9週令において、 R6Z2(HSV— HGF)マウス線条体における HGF 蛋白質濃度は R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスと比較して有意に増 加した。また、 13週令においても、 R6Z2(HSV— HGF)マウス線条体における HG F蛋白質濃度は R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV— LacZ)マウスと比較して増加をみ たが、 9週令と比較するとその程度は低下して 、た(図 le)。
[0073] 9.体重変化
ウィルス挿入後、経時的にマウス体重を測定した。
R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスの体重は、 9週令の野生型同腹子 マウスと比較して有意に減少した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスの体重は、 R6Z2マ ウスの体重と比較して差は認められな力つた(図 2)。
[0074] 10.生存曲線
R6Z2マウス、 R6Z2(HSV—HGF)マウスの生存曲線は、 Kaplan— Meier法に より分析し、 Statview 5. 0 (SAS Institute, Inc.製)を用いてログランク検定(log— r ank test)を行なった。
その結果を図 3に示した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスの寿命は平均 100. 4±2. 6日であり、 R6Z2マウスへの HSV—HGFの注射は、 R6Z2マウスの平均寿命(91 . 3±3. 8日)及び R6Z2(HSV—LacZ)マウスの平均寿命(88. 6 ±3. 8日)を延 長させた。 (図 3)。
[0075] 11.クラスビングテストに対する HGFの作用
クラスビングテストのため、マウスは 30秒間尻尾を持って釣り上げ、フット'クラスピン グ (手足を広げられな!/、姿勢)度をスコア化した。
フット'クラスピング度は Tanaka Mらの方法(Nat. Med,第 10卷, p. 148-154, Epub . 2004年, Jan 2018)に従い、フット'クラスビング時間力 表 1のようにスコア化した。
[0076] [表 1]
[0077] 図 4の R6Z2マウスの姿勢がフット'クラスビングの特徴的な表現型である。野生型 同腹子マウスは、フット'クラスビングの表現型を示さなかった(図 4;野生型同腹子)。 クラスビングスコアの経時変化を図 5に示す。 R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV—Lac Z)マウスは 6週令からずっとクラスビングの表現型を示した。 R6Z2 (HSV-HGF) マウスではフット'クラスビングの表現型を 8週令まで示さず、その後も 12週令まで、フ ット 'クラスビング時間 (スコア)の抑制が認められた。
[0078] 12.ロタロッドテストに対する HGFの作用
前肢及び後肢運動機能とバランスの測定のためにロタロッド装置を使用した。ロタ口 ッドテストは、 Ferrante RJらの方法(J. Neurosci, 2000年,第 20卷, p. 4389- 4397)に 従って行なった。すなわち、試験は、ロタロッド装置を用い、 lOrpmで回転する棒の 上に 180秒マウスをのせ、棒から落ちる時間を記録し、分析した。
図 6にロタロッドテストの経時変化を示した。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV—Lac Z)マウスでは野生型同腹子マウスと比較してロタロッドテストにおいてその機能が経 時的に低下した。 R6Z2(HSV—HGF)マウスでは、 R6Z2マウス及び R6Z2(HS
V— LacZ)マウスと比較してロタロッドテストの成績が有意に改善された。
[0079] 13.フットプリントテストに対する HGFの作用
フットプリントテストは、 Carter RJらの方法(J. Neurosci, 1999年,第 19卷, p. 3248- 3257)に従って行なった。フットプリントパターンを分析するために、前肢と後肢の足 の運びは、 Carter RJらの方法に従い、歩行の間、赤 (前肢)インクと黒 (後肢)インクで 記録した。動物を、長さ 50cm、幅 10cmの通路にそって歩かせた。歩幅の長さは、 各歩幅間における前肢の動きの平均間隔として測定した。左又は右前肢フットプリン ト、又は後肢のフットプリントの重なりは、歩幅の変化の均一性を測定するために使用 した。
図 7、 8にフットプリントテストの経時変化を示した。 R6Z2マウス及び R6Z2(HSV LacZ)マウスでは野生型同腹子マウスと比較してフットプリントテストにおいてその 歩幅の間隔が経時的に小さくなり、前肢 Z後肢の重なりが経時的に低下し、前肢と 後肢が分離した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスでは、 R6Z2マウスと比較して歩幅の 間隔が大きくなり(図 7)、前肢 Z後肢の重なりの分離が減少した (図 8)。
[0080] 14.組織学的及び免疫組織化学的分析結果
組織学的及び免疫組織化学的分析結果を以下に示した。
(1)脳萎縮と脳重量
発明者らは、脳部分のニッスル染色法を使用して R6Z2マウスにおける脳萎縮に 対する HGFの作用を評価した (図 9)。 9週令において、 R6Z2マウス及び R6Z2 (H SV— LacZ)マウスでは、線条体の萎縮による脳室の拡大が認められた。一方、 R6 Z2 (HSV— HGF)マウスでは、この脳室の拡大が抑制された。 9週令のマウスの脳 重量を図 10に示す。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスの脳重量は、 野生型同腹子マウスの脳重量と比較して減少した。しかし、 R6Z2(HSV— HGF)マ ウスでは、この脳重量の減少が抑制された。
[0081] (2) NeuN陽性細胞数に対する HGFの作用
9週令におけるマウス線条体中の神経細胞の総数を、神経細胞のマーカー(Neu N)を指標に算出した。 NeuNは、 NeuN抗体を用いて免疫組織ィ匕学的染色を行い 検出し(図 11)、検出された細胞数 (NeuN陽性細胞数)をカウントした(図 12)。 R6
Z2マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスにおける NeuN陽性細胞数は、野生型 同腹子マウスと比較して有意に減少した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスでは、 R6Z2 マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスと比較して NeuN陽性細胞数の有意な増加 が認められた。
[0082] (3)リン酸化 c Metに対する HGFの作用
R6Z2マウスを用いて、 c MetZHGF受容体が該マウスに発現するかどうか解 明した。免疫組織化学的分析は、 c— MetZHGF受容体が、野生型同腹子マウスと 同様に R6Z2マウスにおいても NeuN陽性細胞に局在することを示した(図 13のリン 酸化 c Met/NeuN)。 HGFで誘発される c Metチロシンリン酸化反応を調べる ために、発明者らは線条体におけるリン酸化 c Metの免疫染色を施行した(図 13) 。 c Metの活性化を反映して!/、るリン酸化 c Met免疫反応性のレベルが R6Z2 ( HSV-HGF)マウスにお 、て、他のグループのマウスのそれと比較して増加した。
[0083] (4)カスパーゼに対する HGFの作用
カスパーゼー 3は、ハンチントン舞踏病で活性化されることが知られている (Zhang Yら, J, Neurochem, 2003年,第 87卷, p. 1184-1192)。発明者らは、 HGFの神経保 護作用を分析するために、 HGFが活性ィ匕カスパーゼー 3の誘導に変化をもたらすか どうかを調べた。発明者らは活性ィ匕カスパーゼ— 3の免疫染色を用いて、線条体に おけるカスパーゼの活性ィ匕に対する HSV—HGFの作用を評価した。
9週令マウスにおける免疫組織ィ匕学的分析の結果は、以下のとおりであった。すな わち活性化カスパーゼー 3は、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスの線 条体(主として NeuN陽性細胞;図 14の活性ィ匕カスパーゼ 3ZNeuN)に認められ た力 野生型同腹子マウスの線条体には認められな力つた。 R6/2 (HSV-HGF) マウスでは、該活性化カスパーゼ 3の免疫反応性が減少した (図 14)。
[0084] 活性化カスパーゼー 3の定量分析のために、カスパーゼー 3のウェスタンブロット解 析を施行した (図 15)。 R6Z2(HSV— LacZ)マウスにおいて、カスパーゼー 3の顕著 な活性ィ匕を認めた。一方、 R6/2 (HSV— HGF)マウスでは、カスパーゼ— 3の活性 化が R6Z2マウスや R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに比べ抑制された。ウェスタンブロ ット分析における活性ィ匕カスパーゼー 3のバンド強度を定量的に測定すると、 R6Z2
(HSV-HGF)マウスでは、カスパーゼ 3の活性化が R6Z2 (HSV—LacZ)マウ スを 10%とすると、その 23%にまで抑制されていた(図 16)。カスパーゼ一 3の活性 の測定結果も同様であった(図 17)。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウス では、野生型同腹子マウスに比べカスパーゼ 3の活性は高値を示した力 R6/2 ( HSV— HGF)マウスでは野生型同腹子マウスと同レベルまでカスパーゼー 3の活性 が抑制された。
[0085] また、カスパーゼ 1は、ハンチントン舞踏病患者及び R6Z2マウスの脳で活性ィ匕 されることが知られている(Zhang Yら、 J Neurochem, 2003年、第 87卷、 p. 1184-1192 )。そこで、 R6/2マウス線条体におけるカスパーゼ 1のウェスタンブロットを検討し た(図 18)。カスパーゼ一 1のウェスタンブロット分析は、プロフォームとアクティブフォ ームを認識する抗体を用いて行なった。ウェスタンプロット分析における活性ィ匕カス パーゼー 1のバンド強度(R6Z2 (HSV— LacZ)マウスに対する0 /0)は、 R6Z2 (HS V-HGF)マウス線条体で 40%にまで抑制された (図 19)。カスパーゼー 1の活性の 測定結果も同様であった(図 20)。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV—LacZ)マウスで は、野生型同腹子マウスに比べカスパーゼ 1の活性は高値を示した力 R6/2 (H SV— HGF)マウスでは野生型同腹子マウスと同レベル近くまでカスパーゼー 1の活 性が抑制された。
[0086] 〔試験例 2〕
ハンチントン舞踏病遺伝子導入形質転換マウスにおける脳神経細胞の新生に対す る HGFの作用
試験例 1と同様に作成した R6Z2マウス、 R6Z2(HSV— LacZ)マウス、 R6Z2( HS V— HGF)マウス及び野生型同腹子マウスを用 ヽた。
1. Ki—67細胞に対する HGFの作用
脳室下帯(subventricular zone; SVZ)及び線条体での神経細胞増殖を検討した。 増殖細胞のマーカーとして Ki—67を選択し、 Ki—67の免疫染色を行い、脳室下帯 及び線条体での Ki—67陽性細胞数を測定した。線条体において、 R6Z2 (HSV- HGF)マウスでの Ki 67陽性細胞数は、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ) マウスにおけるそれと比較して有意に増加した。(図 21) .
[0087] 2. BrdU取り込みに対する HGFの作用
5週令マウスに BrdU (4 X 75mgZkg 腹腔内投与,生理食塩液に溶解、 2時間毎 に合計 4回)を投与し、 BrdU注射 28日後(9週令)に屠殺した。マウスに麻酔し、心 臓力 PBSを流入してマウスの全身を灌流し、次 、で 4%パラホルムアルデヒド含有 PBSで灌流固定した。脳を段階的に 10%及び 20%シユークロースで凍結保護した 後、凍結し、その後凍結した脳を、 20 mの連続切片とした。
BrdU免疫組織化学的染色のために、凍結切片は、 1N塩酸で 60°C、 30分インキ ュペートし、 10%ャギ血清を含む PBSに 1時間浸漬した。その後、凍結切片は、抗 B rdU (ラットモノクロナール抗体; Oxford Biotechnology社製;カタログ番号 OBT003 0)と共に 4°Cで 36時間インキュベートした。二重染色は蛍光色素アレクサ 488と蛍光 色素アレクサ 546をコンジュゲートした 2次抗体(Molecular Probes社製)で視覚化し 、かつ切片は TO PRO - 3 (Molecular Probes社製)で核を対比染色した。蛍光画 像は、 Zeiss LSM— 510共焦点蛍光顕微鏡で検出した。
結果:
脳室下帯及び線条体における BrdU陽性細胞数を測定した結果、脳室下帯にお いて、各群間に BrdU陽性細胞数の有意な差は認められな力つた。しかし、線条体に おいて、 R6Z2(HSV—HGF)マウスの BrdU陽性細胞数は、 R6Z2マウス及び R6 Z2 (HSV— LacZ)マウスと比較して有意に増加した(図 22)。これらのデータは、 H SV— HGF処置により神経細胞増殖が増強されることを示す。
[0088] 3.ネスチンと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
ネスチン(Nestin)は、神経幹細胞のマーカーである。ネスチンは、試験例 1におけ る免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、ネスチン抗体 [マウスポリク ロナール抗体(BD Biosciences社製;カタログ番号 556309)を 100倍希釈して使用 ]を用いた。
ネスチンと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。脳室下帯及び線条体に おいて、 R6Z2 (HSV—HGF)マウスにおけるネスチンと BrdUの両者が陽性である 細胞は、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスのそれと比較して有意に増 加した(図 23)。
[0089] 4.ダブルコルチンと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用 ダブルコルチン(doublecortin;DCX)は遊走神経芽細胞のマーカーである。 DCX は、試験例 1における免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、 DCX 抗体 [ャギポリクロナール抗体(Santa Cruz Biotechnology社製;カタログ番号 sc— 8 066)を 100倍希釈して使用]を用いた。
DCXと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV—HGF)マウ スにおける DCXと BrdUにおける両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体に お!、て、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスのそれと比較して有意に増 加した(図 24)。
[0090] 5. PSA— NCAMと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
PSA— NCAMは、遊走神経芽細胞のマーカーである。 PSA— NCAMは、試験 例 1における免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、 PSA— NCAM 抗体 [マウスモノクロナール抗体 (AbCys S. A.社製;カタログ番号 AbC0019)を 80 0倍希釈して使用]を用いた。
PSA— NCAMと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV— H GF)マウスにおける PSA— NCAMと BrdUの両者が陽性である細胞は、脳室下帯 及び線条体にぉ 、て R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスのそれと比較し て有意に増加した(図 25)。
[0091] 6. j8 IIIチューブリンと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
β IIIチューブリンは、神経細胞の初期〜分ィ匕型マーカーである。 β IIIチューブリン は、試験例 1に記載の免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、 jS III チューブリン抗体 [TuJ 1、マウスモノクロナール抗体 (R&Dシステムズ社製;カタログ 番号 MAB1195)を 200倍希釈して使用]を用いた。
β IIIチューブリンと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV— HGF)マウスにおける 13 IIIチューブリンと BrdUの両者が陽性である細胞は、脳室下 帯及び線条体にぉ 、て、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV—LacZ)マウスのそれと比 較して有意に増加した(図 26)。
[0092] 7. NeuNと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
NeuNは分化した神経細胞のマーカーである。 NeuNは、試験例 1に記載の抗体 を用い、試験例 1と同様に免疫組織ィ匕学的染色を行なった。
NeuNと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV— HGF)マウ スにおける NeuNnと BrdUの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体にお V、て、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスのそれと比較して有意に増加 した(図 27)。
[0093] 8.リン酸化 c— Metとネスチンの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用 神経細胞新生における HGFの役割を検討するために、ネスチン陽性細胞にお!ヽ て、 HGFが c— Metのチロシンリン酸ィ匕反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン 酸化 c Met及びネスチンは、試験例 1に記載の抗体を用い、試験例 1と同様に免疫 組織ィ匕学的染色を行なった。
R6Z2 (HSV— HGF)マウスでは、ネスチンとリン酸化 c Metの両者が陽性であ る細胞力 他のグループと比較して有意に増加した(図 28)。
[0094] 9.リン酸化 c— Metと DCXの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
神経細胞新生における HGFの役割を検討するために、 DCX陽性細胞にぉ 、て、 HGFが c— Metのチロシンリン酸ィ匕反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸 ィ匕 c Met及び DCXは、上記と同様に免疫組織ィ匕学的染色を行なった。
R6Z2 (HSV— HGF)マウスでは、リン酸化 c Metと DCXの両者が陽性である細 胞カ 他のグループと比較して有意に増加した(図 29)。
[0095] 〔試験例 3〕
HGF蛋白質をコードする DNA含有ベクターの脊髄投与による脊髄における HGF の発現
1.ベクターの構築、製造及び精製
(1) HGF蛋白質をコードする DNA挿入 HSV— 1ベクター
HGF遺伝子を挿入した I型単純へルぺスウィルス (HSV- 1)ベクターとしては、試 験例 1で作成した HSV1764Z— 4ZpRl 9HGFウィルスベクターを用 、た。該べク ターを以下、 HSV— HGFと略記する。
(2) HGF蛋白質をコードする DNA挿入 AAV— 2ベクター及び AAV— 4ベクター
AAV Helper -Free System (Stratagene, USA;カタログ番号 # 240071)キット中 に含まれる pCMV— MCSのマルチクロー-ングサイトにラット HGF— KT3 [ラット H GFをコードする DNA (配列番号 5)の C末端に KT3タグ配列(3,—CCGCCCGAG CCAGAGACT— 5,;配列番号 7)を付加したもの; Sun, Funakoshiら, J. Neurosci. , 2002年,第 22卷, p. 6537-6548]を挿入した。挿入が正しいことをシークェンスによ り確認した。 Notlサイトでベクターを 2つのフラグメントに開裂し、ラット HGF— KT3 含む断片を pAAV— MCSを同様にして開列したものと入れ替えることで、 AAV2— HGF作成のための pAAV—ラット HGF—KT3を作製した。 AAV4—HGF作成の ためには pAAV— MCSを AAV4用に改変したものを用いることで同様に処理し、 p AAV4—ラット HGF— KT3を作製した(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000年,第 97 卷, p. 3428-3432) o次いで上記キットに含まれる HEK193細胞に、ラット HGF— KT 3が挿入された pAAV—MCSをキットの使用説明書に従い導入した。該細胞におけ るラット HGF—KT3の発現とその活性は、 ELISA法及び MDCK細胞に対する散乱 分析法により確認した。得られたベクターを AAV2— HGF及び AAV4— HGFと略 記する。
[0096] 2.脊髄実質への投与による HGFの発現
成体雌性 SDラットの腰髄部の脊髄実質に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液 (H SV-HGF: 3 X 107pfu、 3 X 107pfu; AAV2— HGF: 3 X 10npfu;又は AAV4 - HGF : 3 X 10npfu) 5 μ Lを定位注射した。その 5日後に、動物をペントバルビター深 麻酔下に屠殺した。速や力に脊髄を取り出し、脊髄の上部 (upper spinal;吻側; U)、 中部(middle spinal;中央部; M)及び下部(lower spinal;尾側; L)の 3つの領域に 分け、それぞれの脊髄断片を、前記の方法でホモゲナイズした。 ELISA法にて HG F蛋白質量を測定した。
その結果を図 30に示す。ベクターを腰髄部の脊髄実質に注射すると、注射部位だ けでなく脊髄の吻側、中央部においても HGFの発現が認められた。発現の強度は、 尾側 (腰髄を含む) > =中央部 >吻側であった。なお、 HSV— HGFでは、濃度依存 的に HGFの発現量が増加した。
[0097] 3.脊髄腔への投与による HGFの発現
成体雌性 SDラットの腰髄部の脊髄腔に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液 (HS V— HGF: 3 X 107pfu、 3 X 107pf u; AAV2 - HGF: 3 X 10upfu;又は AAV4— H GF : 3 X 10npfu) 5 μ Lを定位注射した。その 5日後に、上記脊髄実質への投与に おける方法と同様に、脊髄を取り出し、脊髄の吻側、中部及び尾側の HGF蛋白質量 を測定した。
その結果を図 31に示す。ベクターを腰髄部の脊髄腔に注射すると、注射部位だけ でなく脊髄の吻側、中央部においても HGFの発現が認められた。発現の強度は、脊 髄実質への注射より HGFの発現量は低かったが、脊髄のいずれの部位 [尾側 (腰髄 を含む)、中央部、吻側]において、ほぼ同じ程度であった。即ち、脊髄腔への投与 では、広範囲な神経細胞への HGFの供給が可能であった。これは、脊髄実質にベ クタ一を投与した場合に比べ、脊髄液により、ベクターが脊髄全体に拡散されたため であると考えられた。なお、 HSV— HGFでは、濃度依存的に HGFの発現量が増加 した。
〔試験例 4〕
変異 HDェキソン 1遺伝子産物のプロセシングに対する HGFの作用
試験例 1と同様に作成した R6Z2マウス、 R6Z2(HSV— LacZ)マウス、 R6Z2( HSV— HGF)マウス及び野生型同腹子マウスを用いた。各マウスを 9週齢で屠殺し 、試験例 1のウェスタンブロッテイングの項に記載の方法と同様に線条体ホモゲナイ ズを調製した後、 SDS— PAGEで蛋白質を分離し、分離した蛋白質を PVDF膜に 転写した。転写した PVDF膜は、室温で 2時間、 10質量%スキムミルクでブロッキン グ後、抗ハンチンチン抗体でブロットした。抗ハンチンチン抗体は、ハンチンチン蛋 白質の C末端部位を認識するャギポリクロナール抗体 (Santa Cruz社製;カタログ番 号 sc— 8678)を 100倍希釈したものを使用した。次いで、 2次抗体(DakoCytomation 社製)をコンジュゲートしたホースラディッシュ ·ペルォキシダーゼ(HRP)と共にイン キュベーシヨンし、製品説明書に従って ECL reagents (製品番号 RPN2106,アマ シャム ·バイオサイエンス社製)で発色させた。
バンドの強度は、 Wayre Rasband氏によって開発された NIH (National Institutes o f Health)イメージソフトウェアを使用して解析された。
[0099] ウェスタンブロット分析の結果を図 32に示す。野生型同腹子では、ハンチンチン蛋 白質が発現されたが、ハンチンチン蛋白質が断片化された C末端フラグメントは殆ど 検出されなかった。 R6Z2では野生型同腹子に対して、ハンチンチン蛋白質に相当 する部位にバンドは殆ど認められず、該蛋白質が断片化された C末端フラグメントが 強く検出された。このことは、 R6Z2では変異 HDェキソン 1遺伝子産物のプロセシン グによりハンチンチン蛋白質が断片化されることを示している。 HSV— LacZ投与群 も R6Z2と同様であった。一方、 HSV— HGF投与群では、野生型同腹子における ハンチンチン蛋白質と同位置にバンドが検出された力 ハンチンチン蛋白質の C末 端フラグメントの発現は強く抑制された。
[0100] ウェスタンブロット分析における C末端フラグメントのバンド強度を、 Wayre Rasband 氏によって開発された NIH (National Institutes of Health)イメージソフトウェアを使 用して定量解析した。その結果を図 33に示す。定量解析の結果、 HSV— HGFを投 与した R6Z2群では、 HSV— LacZ (コントロールベクター)を投与した R6Z2群を 1 00%とした時の 30%未満に C末端フラグメントへの断片化が抑制された。この結果 は、 HGFが変異 HDェキソン 1遺伝子産物のプロセシングを抑制させることを示すも のである。本結果からも、 HGFはハンチントン舞踏病の発病を抑制させることが明ら カゝとなった。
産業上の利用可能性
[0101] 本発明の治療剤又は発病抑制剤は、ポリグルタミン病の治療又は発病抑制のため の薬剤として有用である。