WO2007122976A1 - ポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤 - Google Patents

ポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤 Download PDF

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WO2007122976A1
WO2007122976A1 PCT/JP2007/057218 JP2007057218W WO2007122976A1 WO 2007122976 A1 WO2007122976 A1 WO 2007122976A1 JP 2007057218 W JP2007057218 W JP 2007057218W WO 2007122976 A1 WO2007122976 A1 WO 2007122976A1
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hgf protein
protein
dna
hgf
peptide
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PCT/JP2007/057218
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Toshikazu Nakamura
Hiroshi Funakoshi
Daisuke Miyazawa
Kunio Iwatani
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Osaka University
Kringle Pharma Inc.
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    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent or a disease suppressant for polyglutamine disease, and more specifically, a hepatocyte growth factor (hereinafter abbreviated as HGF) or a DNA containing the DNA encoding the same as an effective component.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the present invention relates to a therapeutic agent or a disease inhibitor for polyglutamine disease.
  • Polyglutamine disease is an autosomal dominant progressive neurodegenerative disease.
  • Polyglutamine disease has a repeat sequence of cytosine 'adenine.guanine (CAG) that encodes polyglutamine that is abnormally extended to the corresponding gene of polyglutamine disease, and a causative gene that has the CAG repeat sequence that is abnormally extended It develops from the fact that is translated and expresses the gene product causing polyglutamine disease.
  • CAG cytosine 'adenine.guanine
  • CAG CAG repeat sequence that is abnormally extended It develops from the fact that is translated and expresses the gene product causing polyglutamine disease.
  • the huntingtin gene has been identified as the causative gene on the short arm of chromosome 4 (Non-patent document 1) o
  • the huntingtin gene is a huntingtin protein of 3145 amino acid residues Code.
  • This protein itself is expressed in various tissues, and the full-length protein is mainly present in the cytoplasm and is non-pathogenic.
  • CAG repeat in the first exon of the huntingtin gene.
  • This CAG repeat is a virulence gene that causes Huntington's disease if the repeat of CAG is about 30 or more when it is less than about 30 repeats in the case of non-pathogenicity.
  • a protein (mutant huntingtin) with a long continuous N-terminal glutamine (polyglutamine) in the huntingtin protein is produced from the nontintin gene with CAG repeats increased to about 30 or more. Such mutated huntingtin with a long polyglutamine is prone to aggregation.
  • Huntington's disease usually begins in middle age and dies 15 to 20 years after onset. The symptoms are characterized by characteristic muscle movement modulation, cognitive decline and psychiatric symptoms. muscle Modulation of movement is thought to be due to loss of coordination of spontaneous voluntary movements, including chorea and myopathy, and abnormal involuntary movements.
  • HGF was first identified as a powerful mitogen for mature hepatocytes, and its gene cloning was made in 1989 (see Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Administration of HGF is known to prevent endotoxin-induced lethal liver injury in mice with fulminant hepatitis due to its anti-apoptotic activity, and HGF gene therapy can improve survival in rats with fatal cirrhosis (See Non-Patent Documents 4 and 5).
  • many recent studies on expression and functional analysis including the knockout Z knock-in mouse technique have revealed that HGF is a novel neurotrophic factor (see Non-Patent Documents 6 and 7).
  • HGF is known as one of the most powerful survival promoting factors for exercise-euron comparable to glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in vitro (see Non-Patent Document 8).
  • the GDNF production promoter is known as a therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis (ALS), which is one of neurodegenerative diseases (see Patent Document 1), and HGF (including gene) is also an ALS transformation model. It is known to delay disease progression and prolong survival in mice (transformed mice expressing SOD 1 G93 A, the causative gene of human ALS) (see Patent Document 2 and Non-Patent Document 9). ).
  • Alzheimer's disease and Parkinson's disease including ALS and polyglutamine diseases such as Huntington's chorea have completely different etiology, pathology, pathogenesis, etc. Indicates that they cannot be handled in the same row.
  • Patent Document 3 a rat mesencephalic substantia nigra donomin-euron that is specifically killed by drug administration is deduced by Parkinson's disease.
  • An example of behavioral and histological examination of the effects on rat brain substantia nigra dopamine neuron cell death induction is shown, and midbrain dopamine-euron is neurotoxin by pre-administration of HGF gene.
  • HGF gene is not only for Parkinson's disease, but also for Alzheimer's disease, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, striatal nigra degeneration, spinal cord degeneration.
  • Muscular atrophy Huntington's disease, Shy 'Drager syndrome, Charcot' Marie 'Tooth disease, Friedreich ataxia, myasthenia gravis, Willis arterial obstruction, amyloidosis, Pick disease, SMON disease, dermatomyositis Polymyositis, Creutzfeldt-Jakob disease, Behcet's disease, systemic lupus erythematosus, sarcoidosis, periarteritis, posterior longitudinal ligament ossification, extensive spinal stenosis, mixed connective tissue disease, diabetic peripheral neuritis, It can also be applied to the treatment of neurological diseases such as ischemic cerebrovascular disorders (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.), and Huntington's chorea is also one of the powerful neurological diseases Gerare to have.
  • neurological diseases such as ischemic cerebrovascular disorders (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.), and Huntington's chorea is also one of
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease where dopaminergic activity in the midbrain substantia nigra-a specific species of euron-is selectively lost, whereas polydaltamin disease is as described above. It is a neurodegenerative disease that develops when a causative gene product containing a long glutamine chain (polyglutamine) is expressed.
  • the mechanism of neuronal degeneration or cell death induced by 6-OHDA is completely different from the mechanism of neurodegeneration or cell death caused by polyglutamine disease-causing gene products. 6- Is unlikely to protect against neuronal degeneration or cell death in polyglutamine disease.
  • Parkinson's disease there is no causal relationship between Parkinson's disease and polyglutamine disease, both of which are both neurodegenerative diseases, only showing completely different pathologies. Also, the impaired neurons are completely different. For this reason, from the above experimental results of Parkinson's disease model rats alone, there is no report that the HGF protein or the DNA encoding it is effective for the treatment of polyglutamine disease.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-47206
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-87983
  • Patent Document 3 International Publication No. 2003Z045439 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 The Huntingtons 'Dizzies' Collaborative Research Group ( The Huntington's Disease Collaborative Research Group), Celle, 1993, 72, p. 971-983
  • Non-Patent Document 2 Nakamura et al., Biochemical and Biophysical 'and' Research 'Communications, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, pp. 12450-1459
  • Non-Patent Document 3 Nakamura et al., Nature, 1989, No. 342, p. 44 0-443
  • Non-Patent Document 4 Kosai et al., Hepatology, 1999, 30th, p. 151-159
  • Non-Patent Document 5 Ueki et al., N. Med., 1999, 5th, p. 226-230.
  • Non-Patent Document 6 Matsumoto et al., Ciba Foundation. Symp., 1997, No. 212, p. 198- 211; Discussion 211- 194
  • Non-Patent Document 7 Funakoshi (Funakoshi) et al., Tari force 'Chim. Acta.', 200 3rd, 327th, p. 1-23
  • Non-Patent Document 8 Neuron, 1996, Vol. 17, p. 1157- 1172
  • Non-Patent Document 9 Sun et al., Brain Research, Molecilla, Brain Research (Brain.
  • Non-Patent Literature 10 Popovic N et al., Expermental Neurology, 2005, No. 193, p. 65—74
  • An object of the present invention is to provide a drug effective for treating or suppressing polyglutamine disease.
  • the present inventors have found that the HGF protein or a partial peptide of the HGF protein and a peptide having substantially the same quality of activity as the HGF protein ( In the following, it may be referred to as HGF protein, etc.)
  • a DNA that encodes a protein that has the same or substantially the same activity as the HGF protein has found that the contained DNA (hereinafter sometimes referred to as the HGF gene) has an excellent therapeutic effect on polyglutamine disease, and have further studied and completed the present invention.
  • the present inventors first transformed with a mutation (length of CAG repeat, pathogenic mutation) huntingtin exon 1 (mutant HD exon 1), which is a model mouse of polyglutamine disease including Huntington's disease. Using mouse (R6Z2 mouse), the involvement of HGF protein etc. or HGF gene in polyglutamine disease was examined.
  • a mutation length of CAG repeat, pathogenic mutation
  • huntingtin exon 1 mutant HD exon 1
  • the inventors of the present invention used a vector (type I simple herpesvirus (HSV-1) vector) that has neurotropism and lacks replication ability in the striatum of the transformed mouse (R6Z2).
  • An R6Z2 transgenic mouse that introduces the HGF gene and expresses rat HGF protein in the striatum is prepared, and whether or not the HGF gene actually has an effect on polyglutamine disease is examined using the mouse. did.
  • HGF-1 vector type I simple herpesvirus (HSV-1) vector
  • R6Z2 transgenic mouse that introduces the HGF gene and expresses rat HGF protein in the striatum is prepared, and whether or not the HGF gene actually has an effect on polyglutamine disease is examined using the mouse. did.
  • mice introduced with the rat HGF gene the onset of the phenomenon that the limbs that cannot be spread are delayed, the life is prolonged, and the motor dysfunction is improved. became.
  • the expression of HGF protein has a therapeutic effect and a disease-s
  • HGF protein or the like or the HGF gene has found that at least the activity of caspase 3 and Z or caspase 1 in the striatum It was found that the HGF protein or HGF gene has a useful effect on polyglutamine disease through two new mechanisms of neuronal cell neogenesis, along with the inhibitory effect of ⁇ .
  • the HGF protein or the like or the HGF gene suppresses the neurodegeneration or cell death in the striatum by suppressing the activity of caspase 3 and / or caspase 1 and suppresses atrophy of the striatum and the brain.
  • HGF protein or HGF gene exerts an effect of improving motor function and prolonging life span in polyglutamine disease through the two actions of suppressing neuronal degeneration or cell death and renewing neurons.
  • the present inventors focused on the fact that the long polyglutamine possessed by the mutant huntingtin acquires neurotoxicity by fragmentation (processing), and examined the effect of the HGF protein or HGF gene on the processing. did.
  • the present inventors have fragmented the huntingtin protein in the transgenic mouse (R6Z2 mouse) introduced with the mutant HD exon 1, but in the R6Z2 transformed mouse introduced with the HGF gene, It was found that fragmentation is suppressed.
  • the present invention provides:
  • a therapeutic agent for polyglutamine disease comprising, as an active ingredient, DNA comprising a DNA or a protein encoding a protein or peptide that is noblyzed under stringent conditions and has substantially the same activity as HGF protein, or Disease inhibitor,
  • the active ingredient is (i) DNA encoding HGF protein or (mouth) DNA encoding partial peptide of HGF protein and having substantially the same activity as HGF protein or (c) A DNA encoding a protein or peptide that has the same or similar activity to that of a HGF protein under the conditions of stringent DNA and complementary DNA sequence complementary to the DNA.
  • DNA strength encoding HGF protein (a) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 5 or (b) DNA having base sequence strength complementary to the base sequence of (a) above The DNA according to the above [2], wherein the DNA comprises a DNA that encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with the protein and has substantially the same activity as the HGF protein.
  • a therapeutic agent or a disease inhibitor
  • the active ingredient is (i) HGF protein or (mouth) HGF protein partial peptide having substantially the same activity as HGF protein or a salt thereof [1] ]
  • HGF protein power (a) The protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 4 or 6, or (b) a protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence.
  • the therapeutic agent or disease suppressant according to [5] is a protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence.
  • Polyglutamine disease is Huntington's disease, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia type 1, spinocerebellar ataxia type 2, spinocerebellar ataxia type 3, spinocerebellar ataxia type 6, spinocerebellar ataxia [1] to [6], wherein the disease is at least one disease selected from the group consisting of symptomatitis type 7, spinocerebellar ataxia type 12 and dentate nucleus red nucleus pallidal louis atrophy
  • a therapeutic agent or disease suppressant according to
  • [11] (1) (i) HGF protein or (oral) peptide that is a partial peptide of HGF protein and has substantially the same activity as HGF protein, or a salt thereof, or (2) (i) HGF protein DNA encoding DNA or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same quality of activity as HGF protein, or (c) DNA and string having a base sequence complementary to DNA An inhibitor of cerebral ventricular enlargement characterized by comprising, as an active ingredient, DNA comprising a DNA or a protein encoding a protein or peptide that has been hybridized under a gentle condition and has substantially the same activity as HGF protein, [12] (1) (i) HGF protein or (oral) peptide or partial salt of HGF protein having substantially the same activity as HGF protein, or a salt thereof, or (2) (i) HGF protein DNA encoding DNA or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same quality of activity as HGF protein, or (c)
  • HGF protein or (mouth) HGF protein partial peptide having substantially the same activity as HGF protein or a salt thereof or (2) (i) HGF protein DNA encoding DNA or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same quality of activity as HGF protein, or (c) DNA and string having a base sequence complementary to DNA Caspase 3 and Z in nerve cells characterized by comprising DNA containing a DNA or a protein encoding a protein or peptide that is noble under severe conditions and has substantially the same activity as HGF protein Caspase 1 activation inhibitor,
  • HGF protein or (mouth) HGF protein partial peptide having substantially the same activity as HGF protein or a salt thereof or (2) (i) HGF protein DNA encoding DNA or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same quality of activity as HGF protein, or (c) DNA and string having a base sequence complementary to DNA Processing of polyglutamine disease-causing gene products, characterized by comprising DNA containing a DNA or a protein encoding a protein or peptide that is normally hybridized under the same conditions as HGF protein.
  • Inhibitor characterized by comprising DNA containing a DNA or a protein encoding a protein or peptide that is normally hybridized under the same conditions as HGF protein.
  • [20] (1) (i) HGF protein or (oral) peptide or partial salt of HGF protein having substantially the same activity as HGF protein or a salt thereof, or (2) (ii) HGF protein DNA encoding DNA or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same quality of activity as HGF protein, or (c) DNA and string having a base sequence complementary to DNA Use of a DNA containing a DNA or a protein encoding a protein or peptide that is normally hybridized under severe conditions and having substantially the same activity as that of the HGF protein, for the manufacture of a therapeutic agent or a disease-inhibiting agent for polyglutamine disease,
  • a method of treating or suppressing polyglutamine disease comprising administering to a mammal a DNA containing a protein or peptide encoding a protein or peptide that is nobbridized under a gentle condition and has substantially the same activity as the HGF protein, and
  • the present invention relates to the use of a DNA comprising a DNA encoding a protein or peptide having the above activity as a therapeutic agent or a disease inhibitor for polyglutamine diseases.
  • the present invention also relates to (1) (i) an HGF protein or (mouth) HGF protein partial peptide having substantially the same activity as the HGF protein, or a salt thereof, or (2) ( B) DNA encoding HGF protein or (oral) DNA encoding a peptide that is a partial peptide of HGF protein and having substantially the same activity as HGF protein, or A ventricle characterized by administering to a mammal a DNA comprising a protein or peptide encoding a protein or peptide that is nobbridated under stringent conditions and has substantially the same activity as the HGF protein
  • a method of suppressing the spread of polyglutamine disease, a method of suppressing neuronal degeneration or cell death dependent on polyglutamine disease, a method of suppressing the activation of caspase 3 and Z or caspase 1, or polyg The processing of glutamic disease causes the gene product to a method of inhibiting.
  • the present invention provides a drug that suppresses expansion of the ventricle, a drug that suppresses polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal cell degeneration or cell death, caspase 3 and Z, or activity of caspase 1
  • HGF protein or (mouth) HGF protein partial peptide which is substantially the same as HGF protein, for the production of a suppressive drug or a drug that suppresses the processing of polyglutamine disease causative gene products
  • (2) (i) DNA encoding HGF protein or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same activity as HGF protein.
  • DNA comprising a DNA encoding the quality or peptide.
  • the present invention relates to a drug that suppresses expansion of the ventricle, a drug that suppresses polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal cell degeneration or cell death, caspase 3 and Z or caspase 1 activity.
  • Suppressing drugs or polyglutamine disease causative gene products (1) (i) HGF protein or (oral) peptide or partial salt of HGF protein having substantially the same activity as HGF protein or a salt thereof, or (2) ( B) DNA encoding HGF protein or (oral) DNA encoding a partial peptide of HGF protein and a peptide having substantially the same activity as HGF protein or (c) a base sequence complementary to the DNA
  • the present invention relates to the use of a DNA comprising a DNA encoding a protein or peptide that is substantially homologous to the HGF protein, and that is hybridized under stringent conditions.
  • the therapeutic agent or disease-suppressing agent of the present invention is polyglutamine disease, for example, Nontington's chorea, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia type 1, spinocerebellar ataxia type 2, spinocerebellar ataxia 3 Type, spinocerebellar ataxia type 6, spinocerebellar ataxia type 7, spinocerebellar ataxia type 12 or dentate nucleus To do.
  • FIG. 1 is a diagram showing expression of HGF in R6Z2 mouse striatum after HSV-HGF transduction.
  • a is the wild-type littermate mouse striatum
  • b is the R6Z2 mouse striatum
  • c is the R6Z2 (HSV—LacZ) mouse striatum
  • d is the R6Z2 (HSV—HGF) mouse striatum.
  • the tissue image is shown.
  • e indicates the amount of HGF of each mouse striatum measured by ELISA.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in body weight over time after transduction of HSV-HGF or HSV-LacZ into the striatum of R6Z2 mice.
  • FIG. 3 is a view showing a survival curve after transduction of HSV-HGF or HSV-LacZ into the striatum of R6Z2 mice.
  • FIG. 4 is a view showing the posture of a mouse in a clasping test.
  • FIG. 5 is a diagram showing a change with time of a score in a classing test.
  • Fig. 6 is a diagram showing a temporal change in motor function in the rotarod test.
  • Fig. 7 is a diagram showing the change over time of the average interval of the stride in the footprint test.
  • Figure 8 shows the time course of separation of overlap of forelimb Z and hindlimbs in the footprint test. It is a figure.
  • FIG. 9 is a view showing a coronal cross section of a mouse brain.
  • Ctx is the cerebral cortex
  • CC is the corpus callosum
  • Str is the striatum
  • Lv is the lateral ventricle.
  • FIG. 10 is a graph showing the brain weight of 9-week-old mice.
  • A shows wild type littermates
  • B shows R6Z2 mice
  • C shows R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D shows R6Z2 (HSV—HG F) mice.
  • FIG. 11 is a diagram showing NeuN positive cells in the striatum.
  • FIG. 12 is a diagram showing the number of NeuN positive cells in the striatum.
  • A shows wild-type littermates
  • B shows R6Z2 mice
  • C shows R6Z2 (HSV-LacZ) mice
  • D shows R6Z2 (HSV-HGF) mice.
  • FIG. 13 shows the expression of phosphorylated c-Met in the striatum.
  • FIG. 14 is a view showing an immunostained image of active caspase 3 in the striatum
  • FIG. 15 is a view showing the results of Western blot analysis of caspase-3.
  • 1, 2 are wild type littermates, 3, 4 are R6Z2 mice, 5, 6 are R6Z2 (HSV-LacZ) mice, and 7, 8 are R6Z2 (HSV-HGF) mice.
  • FIG. 16 is a graph showing the band intensity of active caspase 3 in Western blot analysis.
  • A is wild-type litter
  • B is R6Z2 mouse
  • C is R6Z2 (HS)
  • V—LacZ mice V—LacZ mice
  • D R6 / 2 (HSV—HGF) mice.
  • FIG. 17 is a graph showing the activation rate of caspase 3 in R6 Z2 mice versus the activity of caspase 3 in wild-type littermate mice.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of Western blot analysis of caspase-1.
  • 1, 2 are wild type littermates, 3, 4 are R6Z2 mice, 5, 6 are R6Z2 (HSV-LacZ) mice, and 7, 8 are R6Z2 (HSV-HGF) mice.
  • FIG. 19 is a graph showing the band intensity of active caspase 1 in Western blot analysis.
  • A is wild-type litter
  • B is R6Z2 mouse
  • C is R6Z2 (HS)
  • V—LacZ mice V—LacZ mice
  • D R6 / 2 (HSV—HGF) mice.
  • FIG. 20 shows R6 against caspase 1 activity in wild-type littermate mice. It is a figure which shows the activation rate of caspase 3 in Z2 mouse
  • FIG. 21 shows immunostained images of Ki-67-positive cells in the striatum of R6Z2 (HSV—HGF) mice and wild-type littermates.
  • Str indicates the striatum
  • LV indicates the ventricle
  • SVZ indicates the subventricular zone.
  • FIG. 22 is a graph showing the number of BrdU positive cells in the mouse subventricular zone and the striatum.
  • A shows wild type littermates
  • B shows R6Z2 mice
  • C shows R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D shows R6Z2 (HSV—HGF) mice. * Indicates significant difference for wild-type littermates ( ⁇ ⁇ 0. 05), * * indicates significant difference for R6Z2 (HSV—LacZ) mice (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 23 is a graph showing the number of cells that are positive for both nestin and BrdU in the mouse subventricular zone and striatum.
  • A shows wild type littermates
  • B shows R6Z2 mice
  • C shows R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D shows R6Z2 (HSV—HGF) mice. ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) from R6Z2 (HSV-LacZ) mice.
  • FIG. 24 is a graph showing the number of cells positive for both DCX and BrdU in the mouse subventricular zone and striatum.
  • A shows wild type littermates
  • B shows R6Z2 mice
  • C shows R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D shows R6Z2 (HSV—HGF) mice.
  • * * R 6/2 (HSV-LacZ) shows significant difference (p ⁇ 0. 05) compared to mice.
  • FIG. 25 is a graph showing the number of cells positive for both PSA-NCAM and BrdU in the mouse subventricular zone and the striatum.
  • A shows wild-type littermates
  • B shows R6Z2 mice
  • C shows R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D shows R6Z2 (HSV—HGF) mice.
  • * Indicates a significant difference (P ⁇ 0.05) for wild-type littermates
  • FIG. 26 is a graph showing the number of cells positive for both ⁇ III tubulin and BrdU in the mouse subventricular zone and striatum.
  • A represents wild-type littermates
  • B represents R6Z2 mice
  • C represents R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D represents R6Z2 (HSV—HGF) mice. ** indicates a significant difference (p 0.05) compared to R6Z2 (HSV—LacZ) mice.
  • FIG. 27 is a diagram showing the number of cells in which both NeuN and BrdU are positive in the mouse subventricular zone and striatum.
  • A is a wild-type litter
  • B is an R6Z2 mouse
  • C Represents R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • D represents R6Z2 (HSV—HGF) mice. ** indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) from R6Z2 (HSV-LacZ) mice.
  • FIG. 28 shows immunostained images of cells positive for both nestin and phosphorylated c-Met in the mouse striatum.
  • FIG. 29 shows immunostained images of cells positive for both DCX and phosphorylated c-Met in mouse striatum.
  • Fig. 30 shows HSV—HGF, AAV2- inserted with DNA encoding HGF protein.
  • FIG. 5 shows the expression levels of HGF in the spinal cord 5 days after injection of three types of HGF and AAV4-HGF into the spinal cord parenchyma of the rat lumbar spinal cord.
  • U is the rostral side of the spinal cord
  • M is the central part
  • L is the caudal side. * Indicates a significant difference from the control (p ⁇ 0. 05).
  • FIG. 31 shows HSV—HGF, AAV2-inserted DNA encoding HGF protein.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of HGF in the spinal cord 5 days after injection of three types of HGF and AAV4-HGF into the spinal cavity of the rat lumbar spinal cord.
  • U is the rostral side of the spinal cord
  • M is the central part
  • L is the caudal side. * Indicates a significant difference from the control (p ⁇ 0. 05).
  • FIG. 32 shows the results of Western blot analysis of huntingtin protein.
  • FIG. 33 shows the results of quantitative analysis of the C-terminal fragment in Western blot analysis of huntingtin protein.
  • * indicates a significant difference (P ⁇ 0.05) from R6Z2 (HSV-LacZ) mice.
  • DNA encoding HGF protein refers to DNA capable of expressing HGF protein.
  • DNA containing DNA encoding HGF protein include, for example, Nature, 342, 440 (1989); Japanese Patent No. 2777678; Biochem. Biophys, Res. Commun., 198, 163, p. 967- 973; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, No. 88 (No. 16), p. 7001-7005 etc., for example, Accession No. M60718, M73240, AC004960, GeneBank / EMBL / DDBJ A DNA encoding a human-derived HGF protein registered as AY246560, M29145 or M73240 is preferred.
  • the DNA encoding the HGF protein of the present invention includes a base sequence complementary to the DNA.
  • DNA encoding the HGF protein include, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or complementary to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • Preferred DNA is DNA that can be hybridized under stringent conditions with DNA having a sufficient base sequence ability and that encodes a protein having substantially the same activity as the HGF protein, such as mitogenic activity, motogenic activity, etc. It is done.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the base sequence Nos. 73 to 2259 of Accession No. M60718, and the DNA encodes the HGF protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 3. Corresponds to DNA.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to nucleotides 66 to 2237 of Accession N 0. M73240, and the DNA corresponds to DNA encoding the HGF protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. To do.
  • a DNA having a base sequence ability complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a DNA that hybridizes under stringent conditions are, for example, colony hybridizers using the partial sequence of the DNA as a probe. It means DNA obtained by using the Chillon method, plaque hybridization method or Southern blot hybridization method.
  • hybridization was performed at about 65 ° C in the presence of about 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then about 0 to By washing the filter under a condition of about 65 ° C using a SSC solution of 1 to 2 times the concentration (the composition of the SSC solution of 1 time concentration consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). List DNA that can be identified.
  • the stringent conditions are the same in the following.
  • DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a DNA that is hybridized under stringent conditions is specifically represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Hybrididation can be performed by a known method, for example, Molecular Cloning (Molecular Cloning). , A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor
  • the DNA encoding the HGF protein of the present invention is not limited to the above, and as long as the expressed protein is a DNA encoding a protein having substantially the same action as the HGF protein, the HGF protein of the present invention Can be used as DNA encoding proteins.
  • DNA encoding a partial peptide of the HGF protein and encoding a peptide having substantially the same activity as the HGF protein can be preferably used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the HGF protein may be any DNA that has the base sequence encoding the partial peptide and encodes a peptide having substantially the same activity as the HGF protein! /.
  • Specific examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include (a) a DNA having a partial base sequence of a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and an HGF protein and a substance. (B) DNA and a string comprising a complementary base sequence to a DNA having a partial base sequence of the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. And DNA that hybridizes under gentle conditions and encodes a protein having substantially the same activity as the HGF protein.
  • such DNA includes, for example, the base sequence from the 94th force to the 630th base sequence of human HG F represented by SEQ ID NO: 1 (the first sequence from the N-terminal hairpin loop of HGF).
  • the DNA having the DNA up to the kringle domain) and the 94th force of the human HGF base sequence represented by SEQ ID NO: 1 are also the base sequence from the N-terminal hairpin loop of the HGF to the second kringle.
  • Preferred examples include DNA having a DNA that encodes a peptide up to a domain.
  • DNA encoding HGF protein or a partial peptide of HGF protein and encoding a peptide having substantially the same quality of activity as HGF protein can be obtained by, for example, the usual hybridization method or PCR method.
  • the DNA can be obtained with reference to basic documents such as Molecular 'Cloning 3rd Edition'. I can.
  • the DNA used in the present invention and encoding the HGF protein or a partial peptide of the HGF protein and containing a DNA encoding a peptide having substantially the same activity as the HGF protein includes genomic DNA, Preferred examples include genomic DNA libraries, cDNA derived from cells or tissues, single cDNA libraries derived from cells or tissues, or synthetic DNA. Examples of vectors for cloning genomic DNA fragments in the library include nocteriophages, plasmids, cosmids, or phagemids.
  • RNA encoding the HGF protein used in the present invention or RNA encoding a partial peptide of the HGF protein, and an RNA encoding a peptide having substantially the same activity as the HGF protein is also reverse transcriptase.
  • Any HGF protein or partial peptide can be used in the present invention.
  • the RNA include RNA obtained by preparing an mRNA fraction from a cell or tissue and amplified by RT-PCR, and are within the scope of the present invention.
  • the RNA can also be obtained by known means.
  • the HGF protein used in the present invention is a known substance, and any one prepared by various methods can be used as long as it is purified to the extent that it can be used as a medicine.
  • the HGF protein can be obtained, for example, by culturing primary cultured cells or established cells that produce the HGF protein, separating and purifying it from the culture supernatant and the like.
  • the gene encoding the HGF protein is incorporated into an appropriate vector by genetic engineering techniques, inserted into an appropriate host cell, transformed, and the desired recombinant from the culture supernatant of this transformant. It can also be obtained by separating the HGF protein. (See, for example, JP-A-5-111382, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, No. 163, p. 967).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques such as Escherichia coli, yeast or animal cells can be used.
  • the HGF protein thus obtained has substantially the same action as the natural HGF protein, one or more of its amino acid sequences (for example, 2 to 20 and preferably 2 or more are preferred).
  • the amino acid may be substituted, deleted or added, and the sugar chain may be substituted, deleted or added. It may be.
  • HGF protein include the following 5-amino acid deficient HGF protein.
  • “one or more amino acids are deleted, substituted or added” means that they occur by well-known technical means such as genetic engineering methods, site-directed mutagenesis methods, or the like. It means that a large number (one to several) is deleted, substituted or added.
  • An HGF protein in which a sugar chain is substituted, deleted or added is, for example, an HGF protein in which a sugar chain added to a natural HGF protein is treated with an enzyme or the like to delete the sugar chain, or a sugar chain is not added.
  • the amino acid sequence of the glycosylation site is mutated, or the amino acid sequence is mutated so that the sugar chain is added to a site different from the natural glycosylation site. Specifically, for example, for human HGF of Accession No.
  • NP-001010932 registered in NCBI database, 289 position Asn of Gin, 397 position Asn Gin, 471 position Thr HGF [Fukuta K et al., Biochemical Journal, 388, 555-562 (2005), in which glycans are not attached by replacing Asn with Gly, Asn at position 561, and Gin at position 648, respectively. )] And the like.
  • a protein having at least about 80% homology with the amino acid sequence of the HGF protein preferably a protein having about 90% or more homology, more preferably a protein having about 95% or more homology.
  • a protein having substantially the same activity as the HGF protein is also included in the HGF protein used in the present invention.
  • “homologous” means the degree of coincidence of amino acid residues constituting the respective sequences by comparing the primary structures of the proteins.
  • HGF protein examples include those derived from humans represented by the amino acid sequence represented by Accession No. P14210 (SEQ ID NO: 3) or Accession No. NP-001010932 (SEQ ID NO: 4) registered in the NCBI database, for example. And the like are preferably mentioned.
  • the HGF protein represented by SEQ ID NO: 4 is a 5-amino acid deficient HGF protein from which the five amino acid residues 161 to 165 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 have been deleted.
  • the proteins having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 are both human-derived natural HGF proteins, and have mitogenic activity, motogenic activity, etc. as HGF.
  • the protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is at least about 80% or more, preferably about 90% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4. More preferably, a protein comprising an amino acid sequence having about 95% or more identity, and having substantially the same activity as the HGF protein, for example, from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, -Amino acid sequence in which a plurality of amino acid residues are inserted or deleted, Amino acid sequence in which one to a plurality of amino acid residues are replaced with another amino acid residue, or one to a plurality of amino acid residues are modified A protein containing an amino acid sequence or the like, and preferably a protein having substantially the same activity as the HGF protein.
  • the amino acid to be inserted or substituted may be an unnatural amino acid other than the 20 types of amino acids encoded by the gene.
  • the unnatural amino acid may be any compound as long as it has an amino group and a carboxyl group, and examples thereof include ⁇ -aminobutyric acid.
  • proteins may be used alone or as a mixed protein thereof.
  • Examples of the protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 include human-derived HGF such as Accession No. BAA14348 or AAC71655 registered in the NCBI database. Power is not limited to these.
  • the HGF protein or DNA encoding the same used in the present invention is preferably the above-mentioned human-derived one when applied to humans, but mammals other than humans (for example, monkeys, ushi, u, etc.).
  • Examples of such HGF are registered in the NCBI database, for example, mouse-derived HGF (eg, Accession No. AAB31855, NP-034557, B AA01065, BAAO 1064, etc.), rat-derived HGF [eg, Accession No.
  • NP — 5871 3 protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 6
  • Hushi-derived HGF eg, Accession No. NP— 001026921, XP874086, BAD02475, etc.
  • cat-derived HGF eg, Accession No. NP
  • Inu-derived HGF eg Accession No. NP—001002964, BAC57560, etc.
  • chimpanzee-derived HGF eg, Accession No. XP519174, etc.
  • the C-terminus has a carboxyl group (one COOH), a carboxylate [—COOM (M represents a metal)], an amide (—CONH) or an ester (—C
  • R in the ester is, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
  • Phenyl a C6-12 aryl group such as naphthyl, for example, a phenyl C12 alkyl group such as benzyl or phenethyl, or a C7-14 aralkyl group such as an at naphthyl C12 alkyl group such as ⁇ -naphthylmethyl C2-6 alkanoylmethyl groups such as acetyloxymethyl and bivalyloxymethyl are used.
  • the HGF protein used in the present invention has a carboxyl group or carboxylate other than the C-terminus
  • the HGF protein in the present invention includes those in which a strong carboxyl group or carboxylate is amidated or esterified. It is.
  • the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the methionine residue at the terminus is a protecting group (for example, C 1-6 such as C2-6 alkanoyl group such as formyl group and acetyl). ⁇ protected by a 6-acyl group, etc.
  • the terminal side is cleaved in vivo and the generated dartamyl group is pyroglutamate, or the reactive group on the side chain of the amino acid in the molecule (e.g.- ⁇ , —SH, amino group, imidazolyl group, indolyl group, guazino group, etc.) are suitable protecting groups (eg C2-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) What is protected is a complex protein such as a so-called glycoprotein having a sugar chain bound thereto.
  • the above-mentioned HGF protein part As a partial peptide of the HGF protein used in the present invention and having substantially the same activity as the HGF protein (hereinafter sometimes abbreviated as HGF partial peptide), the above-mentioned HGF protein part. Any peptide may be used as long as it has substantially the same activity as the HGF protein.
  • the number of amino acids of the HGF partial peptide is an amino acid sequence of at least about 20 or more, preferably about 50 or more, more preferably about 100 or more of the above-mentioned amino acid sequences of the HGF protein. Peptides that contain it are preferred.
  • the human represented by SEQ ID NO: 3 A peptide represented by the amino acid sequence from the 32nd amino acid to the 210th amino acid from the N-terminal side of the HGF amino acid sequence (the NGF hairpin loop strength of HGF is also the sequence up to the first kringle domain) or the sequence represented by SEQ ID NO: 3 Preferred examples include peptides represented by the amino acid sequence from the 32nd amino acid to the 288th amino acid from the N-terminal side of the human HGF amino acid sequence (sequence from the N-terminal hairpin loop force of the HGF to the second kringle domain). .
  • the C-terminus is carboxyl group (—COOH), carboxylate [—COOM (M is as defined above)], amide (—CONH) or ester.
  • HGF partial peptide As in the above-described HGF protein, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protective group, and Gin produced by cleaving the N-terminal side in vivo is generated.
  • Pyrodaltaminates, V in which the substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, or complex peptides such as glycopeptides with sugar chains attached included.
  • Examples of the salt of HGF protein or a partial peptide thereof used in the present invention include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid
  • succinic acid malic acid
  • the HGF protein partial peptide or salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the HGF protein with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, even if it has a protecting group capable of constituting an HGF protein, it may have a partial peptide or amino acid and a protecting group, but if it is condensed with the remaining part and the product has a protecting group, The desired peptide can be produced by removing the protecting group.
  • Known condensation methods and removal of protecting groups include, for example, M.
  • peptide 'Peptide Synthesis Interscience Publ Examples include methods described in ishers, New York (1966), Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965), and the like.
  • a partial peptide of HGF protein can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, crystallization or recrystallization. If the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method. Conversely, if it is obtained by a salt, it is converted to a free form by a known method. can do.
  • polyglutamine disease refers to transcription and translation of a causative gene containing about 30 or more cytosine / adenine / guanine (CAG: glutamine codon) sequences contained in the base sequence of the causative gene.
  • CAG cytosine / adenine / guanine
  • causative gene products containing abnormally elongated glutamine chains can be accumulated or aggregated abnormally in nerve cells, resulting in neuronal degeneration or cell death or abnormal function, such as modulation of muscle movement (e.g. chorea or muscle)
  • Typical examples include inherited neurodegenerative diseases that cause cognitive decline or psychiatric symptoms.
  • polyglutamine diseases include, for example, Northington's chorea, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia type 1, spinocerebellar ataxia type 2, spinocerebellar ataxia type 3, spinocerebellar ataxia Examples include type 6, spinocerebellar ataxia type 7, spinocerebellar ataxia type 12, or dentate nucleus red nucleus pallidal bulbar atrophy.
  • treatment refers to ameliorating or completely ameliorating the symptoms of polyglutamine disease, and more specifically, for example, neuronal degeneration or cell death in polyglutamine disease. It includes suppressing or preventing the functional abnormality by suppressing or delaying it and normalizing it. In addition, the treatment includes the formation of nerve cells at a site where nerve cell degeneration or cell death is induced.
  • onset suppression refers to neurodegeneration induced by the expression of a causative gene having about 30 or more CAG repeats of polyglutamine disease and generation of the causative gene product.
  • Suppressing the progression includes suppressing or preventing the causative gene having about 30 or more CAG repeats of polyglutamine disease from being expressed and the causative gene product being produced and accumulated.
  • Examples of the causative gene include noontintin gene.
  • the huntingtin gene has a CAG repeat sequence in its first exon. In the case of a non-pathogenic huntingtin gene, the CAG repeat sequence present in the first exon is less than about 30. As a virulence gene, the CAG repeat sequence is about 30 or more. Can be mentioned.
  • Examples of methods for suppressing the onset of polyglutamine disease include (l) suppression or prevention of expression of a causative gene having 30 or more CAG repeats, or (2) suppression of generation of a causative gene product having 30 or more CAG repeats or Prevention, (3) suppression or prevention of the accumulation of causative gene products having 30 or more of the generated CAG, (4) suppression of progression of neurodegeneration caused by polyglutamine disease causative gene products, or (5) CAG Causes of having 30 or more repeats include suppression of gene product processing. It is preferable to suppress or prevent (1) to (5) V, deviation, or two or more.
  • the polyglutamine disease therapeutic agent or disease-suppressing agent of the present invention is not limited to humans and mammals other than humans (for example, monkeys, horses, horses, pigs, hidges, dogs, cats, rats, mice). , Usagi, Hamster, Guinea pig, Chimpanzee, etc.).
  • the therapeutic agent or disease-suppressing agent of the present invention When the therapeutic agent or disease-suppressing agent of the present invention is administered to a patient, its administration form, administration method, dosage, etc. are the same as when the active ingredient is HGF protein and when it encodes DNA encoding HGF protein. May be slightly different!
  • the preparation of the present invention can be used in various preparation forms, for example, liquids, solids, etc.
  • HGF protein or an injection with a conventional carrier is used.
  • it is preferably formulated into a propellant, sustained-release preparation (for example, depot) and the like.
  • the injection may be either an aqueous injection or an oily injection.
  • an aqueous solvent water for injection, purified water, etc.
  • a pharmaceutically acceptable additive for example, an isotonic agent (salt sodium, salt potassium, Glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol, etc.), buffer (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, tris) Buffer, glutamic acid buffer, epsilon aminocaproic acid buffer, etc.), preservatives (methyl paraoxybenzoate, ethyl oxyoxybenzoate, propyl oxyhydroxybenzoate, Butyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalcolic chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax, etc.), thickener (Hydrochichechinoreceno
  • HGF protein is added as appropriate to the HGF protein and then sterilized by filtration through a filter etc., and then filled into an aseptic container. It can be prepared from this. Further, an appropriate solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) or nonionic surfactant (polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, etc.) is further added. Also good. In the case of an oily injection, for example, sesame oil or soybean oil may be used as the oily solvent, and benzyl benzoate or benzyl alcohol may be added as a solubilizer. The prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule or vial.
  • solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) or nonionic surfactant (polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, etc.) is further added. Also good.
  • the HGF protein content in the injection can be adjusted to usually about 0.0002-0. 2 wZv%, preferably about 0.001-0. LwZv%. It should be noted that liquid preparations such as injections are preferably stored after removing moisture by freezing or lyophilization. The freeze-dried product is used by re-dissolving and adding distilled water for injection at the time of use.
  • Propellants can also be prepared by conventional means in pharmaceutical preparations. When manufactured as a propellant, any additive that is generally used in inhalation preparations can be used as an additive to be added to the propellant. Solvents, preservatives, stabilizers, tonicity agents, PH adjusters, etc. may be added.
  • the propellant include a liquefied gas propellant or a compressed gas.
  • the liquefied gas propellant include fluorinated hydrocarbons (alternative chlorofluorocarbons such as HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a, and HCFC142), liquefied petroleum, dimethyl ether, and the like.
  • the compressed gas include soluble gas (carbon dioxide gas, nitrous oxide gas, etc.) or insoluble gas (nitrogen gas, etc.).
  • the HGF protein used in the present invention is a sustained-release preparation together with a biodegradable polymer.
  • the sustained release product can be produced according to a known method.
  • the biodegradable polymer used in the sustained-release preparation can be appropriately selected from the forces of known biodegradable polymers. For example, polysaccharides such as starch, dextran, and chitosan; collagen, gelatin, etc.
  • Polyamino acid such as polyglutamic acid, polylysine, polyleucine, polyalanine or polymethionine
  • polylactic acid polydalicolic acid, lactic acid-glycolic acid copolymer
  • poly force prolacton poly j8-hydroxybutyric acid
  • polymalic acid poly Polyesters such as acid anhydrides or fumaric acid 'polyethylene glycol.bulurpyrrolidone copolymers
  • polyorthoesters or polyalkyl cyanoacrylic acids such as polymethyl- ⁇ -cyanoacrylic acid
  • polycarbonates such as polyethylene carbonate or polypropylene carbonate .
  • Polyester is preferable, and polylactic acid or lactic acid-glycolic acid copolymer is more preferable.
  • a lactic acid-glycolic acid copolymer When a lactic acid-glycolic acid copolymer is used, its composition ratio (lactic acid-glycolic acid) (mol%) varies depending on the sustained release period.
  • the sustained release period is about 2 weeks to 3 months, preferably about In the case of 2 weeks to 1 power month, about 100 ZO to 50-50 is preferable.
  • the weight average molecular weight of the polylactic acid or lactic acid-glycolic acid copolymer is generally preferably about 5,000 to 20,000.
  • Polylactic acid or lactic acid-glycolic acid copolymer can be produced according to a known production method, for example, the production method described in JP-A-61-28521.
  • the mixing ratio of the biodegradable polymer and the HGF protein is not particularly limited.
  • the HGF protein is preferably about 0.01 to 30 wZw% with respect to the biodegradable polymer.
  • an injection or a spray is directly injected into a lesion site of polyglutamine disease (intrathecal or spinal parenchyma, intrathecal continuous administration by a sustained-release pump, etc.) or spray. It is preferable to embed a sputum or a sustained-release preparation (depot agent) in a site close to the tissue having the lesion site of polyglutamine disease.
  • the dose is appropriately selected according to the dosage form, the degree of disease, age, etc., but is usually 1 / ⁇ to 50011 ⁇ , preferably 10 / ⁇ 8 to 50 ⁇ 8 , more preferably Is 1-25 mg.
  • the number of administrations is appropriately selected according to the dosage form, the degree of disease, age, etc., and the administration can be continued at a powerful interval for a single administration.
  • the dose interval may be once a day once every several months.
  • a sustained-release preparation depot
  • intrathecal continuous administration with a sustained-release pump several months It may be once.
  • conventional methods such as separate experimental medicine, basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996, separate experimental medicine, gene introduction & expression analysis experiment method, Yodosha 1997, The Gene Therapy Society of Japan, Gene Therapy Development Research Handbook, NTS, 1999, etc.
  • Specific administration methods include, for example, a method of locally injecting a recombinant expression vector incorporating the HGF gene into a tissue (for example, spinal nerve, brain, etc.) of a lesion site of polyglutamine disease, or a patient After removing the tissue or spinal cord isotropic cells at the lesion site in the body and introducing the recombinant expression vector incorporating the HGF gene into the cells for transformation, the transformed cells are treated with the patient's lesion. For example, a method of transplanting to a site or spinal cord.
  • Expression vectors include naked plasmids, detoxified retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses (type I herpes simplex virus, etc.), vaccinia virus, box viruses, polioviruses, symbiosis Examples include, but are not limited to, DNA viruses or RNA viruses such as Suinores, Sendai virus, SV40, or immunodeficiency virus (HIV).
  • DNA viruses or RNA viruses such as Suinores, Sendai virus, SV40, or immunodeficiency virus (HIV).
  • HGF type I herpes simplex virus
  • AAV adeno-associated virus
  • the HSV-1 vector is a neurotropic vector.
  • HSV-1 vectors have a large (152 kb) genome that incorporates multiple genes (up to 30 kb) and are capable of potentially infecting neurons for life. I like it.
  • Specific HSV-1 vectors include HSV-1 which is not capable of replication due to the deletion of three genes encoding ICR4, ICP34.5 and VP16 (vmw65) for viral replication.
  • HSV1764Z4-ZpR19 (Coffin RS, et al, J. Gen. Virol. 1998, 79th, p. 3019-3026; Palmer JA, et al, J. Virol., 2000, 74th, p. 5604-5618; Lilley CE, et al., J.
  • AAV vectors belong to non-pathogenic viruses, are highly safe, and can efficiently introduce genes into non-dividing cells such as neurons.
  • the Examples of AAV vectors include AAV-2, AAV-4, and AAV-5. These HSV-1 vectors and AAV vectors can express the target gene in nerve cells for a long time. Since polyglutamine disease completes its pathological state after a long period of time, HSV-1 vectors and AAV vectors that enable long-term expression are particularly preferred as the vectors used in the present invention.
  • HGF human endothelial growth factor
  • AAV vector was used to transduce the HGF gene into the lesion site of polyglutamine disease, such as striatum, intrathecal space, etc. I prefer to do it.
  • various known dosage forms suitable for each of the above administration forms [for example, injections, sprays, sustained-release preparations (depots), microcapsules, etc.] can be taken. it can. Injections, sprays, and sustained-release preparations (depots) can be prepared in the same way as for HGF protein.
  • a microcapsule for example, a host cell into which an expression plasmid containing an HGF gene is introduced as a core substance is used as a known method (for example, a coacervation method, an interfacial polymerization method or a double nozzle method).
  • fine particles having a diameter of about 1 to 500, preferably about 100 to 400 ⁇ m can be produced.
  • film materials include carboxymethyl cellulose, cellulose acetate phthalate, ethyl cellulose, alginic acid or a salt thereof, gelatin, gelatin 'gum arabic, nitrocellulose, polybulal alcohol or hydroxypropylcellulose, polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid.
  • -Glycolic acid copolymer chitosan alginate, cellulose sulfate poly (dimethyldiallyl) ammonium chloride, hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate, chitosan carboxymethylcellulose, alginate-polylysine alginate, etc.
  • the content and dose of DNA in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient.
  • the dose varies depending on the type of HGF gene transfer vector, but it is usually 1 X 10 6 pfu to 1 X 10 12 pfu, preferably 1 10 7 to 2 10 11 in terms of HGF gene transfer vector. preferably 1. preferably administered once 5 X 10 7 pfu ⁇ l. 5 X 10 u pfu few days to several months.
  • the agent of the present invention is a polyglutamine disease such as Northington's chorea, bulbar spinal muscular atrophy, Spinocerebellar ataxia type 1, Spinocerebellar ataxia type 2, Spinocerebellar ataxia type 3, Spinocerebellar ataxia type 6, Spinocerebellar ataxia type 7, Spinocerebellar ataxia type 12, or red nucleus of the nucleus
  • a polyglutamine disease such as Northington's chorea, bulbar spinal muscular atrophy, Spinocerebellar ataxia type 1, Spinocerebellar ataxia type 2, Spinocerebellar ataxia type 3, Spinocerebellar ataxia type 6, Spinocerebellar ataxia type 7, Spinocerebellar ataxia type 12, or red nucleus of the nucleus
  • It can be used for the treatment of Louis body atrophy, preferably Huntington's chorea, or the prevention of the onset of polyglutamine disease. 10 ⁇ , p. 148
  • an HGF protein or a partial peptide of the HGF protein which has substantially the same activity as the HGF protein (such as an HGF protein), or a DNA encoding the HGF protein.
  • a DNA that encodes a peptide that is a partial peptide of the HGF protein and has substantially the same activity as the HGF protein or a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA that is complementary to the DNA.
  • HGF gene HGF protein
  • Enlargement of the ventricles includes brain atrophy, particularly striatal atrophy (eg, striatal atrophy based on striatal cell death).
  • the HGF protein or the like or the HGF gene according to the present invention can suppress symptoms caused by enlargement of the ventricle, for example, motor dysfunctions such as limb disorders such as difficulty in walking, language disorders, memory disorders or neurological symptoms.
  • Polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal degeneration or cell death includes those caused by the expression and accumulation of a polyglutamine disease-causing gene product in neural tissues such as the striatum.
  • the HGF protein or the like or the HGF gene according to the present invention can suppress polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal degeneration or cell death, particularly polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal degeneration or cell death in the striatum.
  • Cell death includes apoptosis and necrosis. For this reason, cell death suppression If the death of the cell itself is suppressed, apoptosis may be suppressed, necrosis may be suppressed, or both of them may be suppressed.
  • the HGF protein or the like or the HGF gene according to the present invention can suppress the activation of proteases such as caspases, particularly caspase 1 or caspase 3, which are involved in the induction of cell death.
  • proteases such as caspases, particularly caspase 1 or caspase 3, which are involved in the induction of cell death.
  • caspases there are about 10 to 20 types of caspases, and when a certain force spase is activated, it causes a cascade reaction that other caspases are activated by that caspase, thereby inducing cell death.
  • caspase 3 is known as an enzyme that performs cell death at the final stage of caspase activity.
  • caspase 3 is known to be activated in Huntington's chorea (Zhang Y et al., J, Neurochem, 2003, 87th, p. 1184-1192).
  • Caspase 3 is a protease that performs cell death by degrading various intracellular proteins, and can be activated when nerve cell degeneration or cell death is induced in nerve cells.
  • the suppression of caspase 3 or caspase 1 activity refers to the suppression of caspase 3 or caspase 1 activity.
  • the activity of caspase 3 or caspase 1 is suppressed by a known method or a method equivalent thereto (for example, Trends Biochem. Sci., 1997, No. 22, p. 388-393; Biochem. J., 1997). , 326, p. 1-16; Anal. Biochem., 1997, 251, p. 98-102, etc.) and methods described in, for example, test examples described later Etc. can be measured.
  • the HGF protein or the like or the HGF gene according to the present invention is involved in neurogenesis.
  • Neurogenesis includes the proliferation of neuroblasts and neural stem cells that differentiate into neurons.
  • cell division In order for new nerve cells to be born, cell division must be performed. During cell division, DNA is synthesized to copy genetic information. Examples of substances that can be used as a clue to know whether or not DNA has been synthesized include BrdU (bromodeoxyuridine).
  • BrdU bromodeoxyuridine
  • BrdU bromodeoxyuridine
  • the neurogenesis effect can be measured using, for example, the method described in the method of measuring BrdU incorporated into brain neurons with the index, the test example described later, and the like.
  • the HGF protein or the like or the HGF gene according to the present invention may be a polyglutamine disease causative gene. Involved in the processing of offspring. Processing refers to the process in which the transcription product of a gene undergoes partial degradation by intracellular proteolytic enzymes, etc., and matures into a protein with a specific localization and function in the process of expressing the gene causing polyglutamine disease.
  • the present invention includes fragmentation of the causative gene product.
  • a common feature of polyglutamine disease is that all the causative genes recognize the elongation (over 30) of polyglutamine present in the causative gene.
  • Neurotoxicity manifestations in polyglutamine diseases include fragmentation of causative gene products that have 30 or more CAG repeats.
  • the causative gene product (mutant huntingtin) is processed during the process of expression of the huntingtin gene in which the CAG repeat contained in the causative gene (northintin gene) is increased to 30 or more. It is fragmented. Fragmented mutant huntingtin is thought to be pathogenic and neurotoxic.
  • the ability of huntingtin protein to suppress processing by assessing whether the efficiency of huntingtin protein to be processed into fragmented antintin is suppressed by the HGF gene. Can be evaluated.
  • the inhibitory effect on the processing can be measured using, for example, a method described in a test example described later.
  • the use of the present invention is (1) (i) HGF protein or (oral) HGF protein partial peptide having substantially the same activity as HGF protein or a salt thereof, or (2 (I) HGF protein-encoding DNA or (mouth) HGF protein partial peptide that encodes a peptide having substantially the same activity as HGF protein or (c) a base complementary to the DNA As a therapeutic agent or suppressor of polyglutamine disease of DNA containing DNA encoding a protein or peptide that has the same or similar activity as HGF protein under stringent conditions with DNA that also has sequence power Is the use of.
  • the component (1) or (2) is used for the production of a therapeutic agent or a disease inhibitor for polyglutamine disease.
  • the method for treating or suppressing polyglutamine disease of the present invention is a method of administering the above-mentioned component (1) or (2) to a mammal.
  • the use of the present invention is the use of the above component (1) or (2) as a ventricular expansion inhibitor.
  • the production of a ventricular enlargement inhibitor of the above component (1) or (2) It is for use.
  • the method for inhibiting cerebral ventricular expansion according to the present invention is a method of administering the above-described component (1) or (2) to a mammal.
  • the use of the present invention is the use of the above component (1) or (2) as a polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal degeneration or cell death inhibitor.
  • the component (1) or (2) is used for the production of a polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal degeneration or cell death inhibitor.
  • the polyglutamine disease-causing gene product-dependent neuronal degeneration or cell death suppression method of the present invention is a method of administering the above component (1) or (2) to a mammal.
  • the use of the present invention is the use of the component (1) or (2) as an inhibitor of caspase-3 and Z or caspase-1 activity in nerve cells. Further, the use of the above component (1) or (2) for the production of an activation inhibitor of caspase 3 and Z or caspase 1 in nerve cells.
  • the method for suppressing the activity of caspase 3 and Z or caspase 1 in nerve cells of the present invention is a method of administering the above-mentioned component (1) or (2) to a mammal.
  • the use of the present invention is the use of the above component (1) or (2) as a processing inhibitor of polyglutamine disease-causing gene products.
  • the component (1) or (2) is used for the production of a polyglutamine disease-causing gene product processing inhibitor.
  • the method for inhibiting the processing of the polyglutamine disease-causing gene product of the present invention is a method of administering the component (1) or (2) above to a mammal.
  • the medicament and method of the present invention include polyglutamine diseases such as noctonington's chorea, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia type 1, spinocerebellar ataxia type 2, spinocerebellar ataxia type 3, spinal cord cerebellum Ataxia type 6, spinocerebellar ataxia type 7, spinocerebellar ataxia type 12 or dentate nucleus red nucleus paleoglobulosus atrophy, etc.
  • polyglutamine diseases such as noctonington's chorea, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia type 1, spinocerebellar ataxia type 2, spinocerebellar ataxia type 3, spinal cord cerebellum Ataxia type 6, spinocerebellar ataxia type 7, spinocerebellar ataxia type 12 or dentate nucleus red nucleus paleoglobulosus atrophy, etc.
  • it is preferably used for patients with Huntington's chorea.
  • the gene system is determined by PCR analysis of the genomic DNA extracted from the force of the tail tissue, and a mouse having the TgN62Gpb gene is abbreviated as a Northington chorea model mouse R6 / 2 mouse (hereinafter abbreviated as R6Z2 mouse). ).
  • R6Z2 mouse Northington chorea model mouse
  • the mouse was used as a wild-type littermate without the TgN (mutant HD exon 1) 62Gpb gene in the same litter as the R6Z2 mouse.
  • the GFP (green fluorescent protein; green: i: phototank) gene of pRl 9GFPWPRE (Lilley CE et al., J. Virol, 2001, Vol. 75, p. 4343-4356) CDNA (Sun W et al., J. Neurosci, 2002, 22nd, p. 6537-6548) with KT3 tag (3'—CCGCCCGAGCCAGAGA CT 5,; SEQ ID NO: 7) added to full length (ratHGF; SEQ ID NO: 5) PR19ratHGFKT3WPRE was constructed.
  • the sequence of this vector (pRl 9ratHGFKT3WPRE) was confirmed by analysis using an ABI 310 capillary sequencer.
  • homologous recombination was carried out using M49 cells by co-transformation of plasmid pR19ratHGF KT3WPRE DNA and HSV1764 / -4 / pRl 9LacZ virus DNA.
  • White plaques were selected, purified three times, and non-replicating viruses were propagated according to the method of Palmer JA et al. (J. Virol, 2000, 74, p. 5604-5618).
  • Rat HGF expression was confirmed by immunostaining. The expression was further confirmed by Western plotting and rat HGF enzyme antibody immunoassay (ELISA). .
  • HSV1764Z-4ZpR19HGF virus vector HGF expression vector; hereinafter abbreviated as HSV-HGF
  • HSV-HGF HGF expression vector
  • titer 1 to 2 X 10 9 pfu (plaque 'forming unit) ZmL for use in this study
  • HSV-LacZ HGF non-expression vector having a titer of 1 to 1.5 ⁇ 10 9 pfuZmL was prepared.
  • mice Four-week-old R6 / 2 mice were deeply anesthetized with 50 mg / kg of pentobarbital intravenously injected.
  • the mouse In order to inject into the striatum (around 0.4 mm, ⁇ 1.8 mm medial / lateral direction, and 3.5 mm dorsoventral direction), the mouse was placed in a Kopf brain stereotaxic apparatus and fixed. The mice were injected with 5 / z L HSV—LacZ (5 ⁇ 10 6 pfu) or HSV—HGF (3 ⁇ 10 5 pfu). The injection was performed at a rate of 0.3 ⁇ L / min using a 10 ⁇ L Hamilton syringe in the striatum of the mouse.
  • mice injected with HSV—LacZ are referred to as R6Z2 (HSV—LacZ) mice
  • mice injected with HSV—HGF are referred to as R6Z2 (HSV—HGF) mice!
  • mice were deeply anesthetized, and ice-cold phosphate buffered saline (PBS) was injected into the heart force to perfuse the whole body of the mice, and then fixed by perfusion with PBS containing 4% paraformaldehyde.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the brain was cryoprotected with 10% and 20% sucrose in stages, then frozen and then frozen into 20 m serial sections. The obtained frozen sections were stained with cresyl violet to stain the nissle material.
  • Immunohistochemical staining was performed by washing frozen sections with PBS, immersing in PBS containing 10% goat or donkey serum for 1 hour, and then incubating with antibodies at 4 ° C.
  • Mouse monoclonal antibody (Chemicon International; catalog number MAB377) was used after being diluted 500 times.
  • SP260 Usagi polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology; catalog number) No. sc-162) was diluted 50 times and used.
  • Usagi polyclonal antibody (manufactured by Biosource; catalog number 44-888G) was diluted 100 times and used.
  • Usagi polyclonal antibody (Promega; catalog number G748) was diluted 125 times and used.
  • Tissue HGF was measured using an anti-HGF polyclonal antibody (Tokushu Meneki) as described in Sun W et al., Brain Res Mol Brain Res, 2002, Vol. 103, p. 36-48.
  • Homogenization of mouse striatum is 50 mM Tris—HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% (WZV) Triton X-100, ImM PMSF (Fuel Methane Sulfol Fluoride; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ), 2 / z gZmL Antinoin (Peptide Institute), 2 ⁇ g / mL Leupeptin (Peptide Institute), 2 ⁇ g / mL Pepstatin (Peptide Institute) .
  • the same amount of protein 120 ⁇ g Z lane was subjected to 15% SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the anti-caspase-3 antibody or anti-caspase-1 antibody is then incubated with a horseradish 'peroxidase (HRP) conjugated with a secondary antibody (DakoCytomation) and ECL reagents (Product No. RPN2106, Amersham') according to the product instructions. Color was developed using Bioscience.
  • the band strength is measured by NIH (National Institutes o developed by Wayre Rasband. f Health) was analyzed using image software.
  • HGF HGF-HGF
  • HGF protein concentrations in the striatum using ELISA were as follows. The concentration of HGF protein in the striatum was 47.07 ⁇ 5.81 ng / g 3 hours after HSV-HGF injection in wild-type littermate mice treated with HSV—HGF, about 3% of R6 / 2 mice. Doubled. At 9 weeks of age, the HGF protein concentration in the striatum of R6Z2 (HSV—HGF) mice was significantly increased compared to R6Z2 mice or R6Z2 (HSV-LacZ) mice.
  • the mouse body weight was measured over time.
  • the body weight of R6Z2 mice or R6Z2 (HSV-LacZ) mice was significantly reduced compared to 9-week-old wild-type littermate mice.
  • the weight of R6Z2 (HSV-HGF) mice was stronger than that of R6Z2 mice (Fig. 2).
  • mice were picked up with their tails for 30 seconds and scored for the degree of foot's class pinning (unable to spread limbs! /, Posture).
  • the foot's clapping degree was scored as shown in Table 1 according to the method of Tanaka M et al. (Nat. Med, Vol. 10, p. 148-154, Epub. 2004, Jan 2018). .
  • the posture of the R6Z2 mouse in FIG. 4 is a characteristic phenotype of foot-classing. Wild-type littermate mice did not show a foot's classing phenotype (Figure 4; wild-type littermates).
  • Figure 5 shows the time course of the classing score.
  • R6Z2 mice or R6Z2 (HSV-Lac Z) mice had a clasping phenotype since 6 weeks of age.
  • R6Z2 (HSV-HGF) mice the foot cruising phenotype was not shown until 8 weeks of age, and after that, suppression of foot cruising time (score) was observed until 12 weeks of age.
  • a rotarod device was used to measure forelimb and hindlimb motor function and balance.
  • the rotapad test was conducted according to the method of Ferrante RJ et al. (J. Neurosci, 2000, Vol. 20, p. 4389-4397). That is, in the test, a rotarod apparatus was used, a mouse was placed on a bar rotating at lOrpm for 180 seconds, and the time of dropping from the bar was recorded and analyzed.
  • FIG. 6 shows the time course of the rotarod test.
  • R6Z2 and R6Z2 HV-Lac Z mice showed a decline in function over time in the rotarod test compared to wild-type littermates.
  • R6Z2 HGF mice
  • R6Z2 mice and R6Z2 HS The results of the rotarod test were significantly improved compared to V-LacZ mice.
  • the footprint test was performed according to the method of Carter RJ et al. (J. Neurosci, 1999, Vol. 19, p. 3248-3257). To analyze the footprint pattern, forelimb and hindlimb foot movements were recorded in red (forelimb) ink and black (hindlimb) ink during walking according to Carter RJ et al. The animals were walked along a 50 cm long and 10 cm wide passage. The length of the stride was measured as the average interval of forelimb movement between each stride. The overlap of left or right forelimb footprints or hindlimb footprints was used to measure the uniformity of stride changes.
  • Figures 7 and 8 show the time course of the footprint test.
  • the step interval in the footprint test was reduced with time in the footprint test, and the overlap of the forelimb Z hindlimbs decreased with time, and the forelimb and hindlimb were separated.
  • R6Z2 HSV—HGF mice
  • the stride interval was larger than in R6Z2 mice (Fig. 7), and the separation of overlap of the forelimb Z and hindlimbs was reduced (Fig. 8).
  • R6Z2 and R6Z2 HGF-LacZ mice
  • enlargement of the ventricle due to striatal atrophy was observed.
  • R6 Z2 HGF
  • Figure 10 shows the brain weight of 9-week-old mice.
  • the brain weights of R6Z2 mice and R6Z2 (HSV—LacZ) mice were decreased compared to the brain weights of wild-type littermate mice. However, this decrease in brain weight was suppressed in R6Z2 (HSV—HGF) mice.
  • the total number of neurons in the mouse striatum at 9 weeks of age was calculated using the marker (Neu N) of the neurons.
  • NeuN was detected by immunohistochemical staining using NeuN antibody (FIG. 11), and the number of detected cells (number of NeuN positive cells) was counted (FIG. 12).
  • R6 The number of NeuN positive cells in Z2 mice and R6Z2 (HSV-LacZ) mice was significantly reduced compared to wild-type littermate mice.
  • R6Z2 (HSV—HGF) mice showed a significant increase in the number of NeuN positive cells compared to R6Z2 mice and R6Z2 (HSV-LacZ) mice.
  • Caspase 3 is known to be activated in Huntington's disease (Zhang Y et al., J, Neurochem, 2003, 87th, p. 1184-1192).
  • HGF Huntington's disease
  • the inventors investigated whether HGF caused a change in the induction of active caspase-3.
  • the inventors evaluated the effect of HSV-HGF on caspase activity in the striatum using immunostaining of active caspase-3.
  • Caspase 1 is also known to be active in the brains of Huntington's disease patients and R6Z2 mice (Zhang Y et al., J Neurochem, 2003, 87th, p. 1184-1192). ). Therefore, western blotting of caspase 1 in R6 / 2 mouse striatum was examined (Fig. 18). Western blot analysis of caspase-11 was performed using antibodies that recognize the proform and the active form. Band intensity of activity I spoon scum Paze 1 in Western plot analysis (R6Z2 (HSV- LacZ) 0/ 0 to mouse) was inhibited up to 40% R6Z2 (HS V-HGF) mice striatum (Fig. 19 ).
  • R6Z2 mice, R6Z2 (HSV—LacZ) mice, R6Z2 (HSV—HGF) mice and wild-type littermate mice prepared in the same manner as in Test Example 1 were used.
  • BrdU X 75 mgZkg ip, dissolved in physiological saline, 4 times every 2 hours
  • the mice were anesthetized, and the whole body of the mice was perfused by injecting cardiac force PBS, and then fixed by perfusion with PBS containing 4% paraformaldehyde.
  • the brain was cryoprotected with 10% and 20% sucrose in stages, then frozen and then frozen into 20 m serial sections.
  • Nestin is a marker for neural stem cells.
  • Nestin was stained according to immunohistochemical staining in Test Example 1.
  • As an antibody a nestin antibody [mouse polyclonal antibody (BD Biosciences; catalog number 556309) diluted 100 times] was used.
  • PSA—NCAM is a marker for migrating neuroblasts.
  • PSA—NCAM was stained according to the immunohistochemical staining in Test Example 1.
  • PSA-NCAM antibody mouse monoclonal antibody (AbCys S. A., catalog number AbC0019) diluted 800-fold and used] was used.
  • PSA The number of cells positive for both NCAM and BrdU was measured. Cells that are positive for both PSA—NCAM and BrdU in R6Z2 (HSV—HGF) mice, compared to those in R6Z2 and R6Z2 (HSV—LacZ) mice, in the subventricular zone and striatum. There was a significant increase (Figure 25).
  • ⁇ III tubulin is an early to minute marker of neurons.
  • ⁇ III tubulin was stained according to the immunohistochemical staining described in Test Example 1.
  • jS III tubulin antibody [TuJ 1, mouse monoclonal antibody (manufactured by R & D Systems; catalog number MAB1195) diluted 200 times] was used.
  • HSV1764Z-4ZpRl9HGF virus vector prepared in Test Example 1 was used as the type I herpes simplex virus (HSV-1) vector into which the HGF gene was inserted. This vector is hereinafter abbreviated as HSV-HGF.
  • pAAV-rat HGF-KT3 for AAV2-HGF production was created.
  • pAAV 4 —rat HGF—KT3 was prepared in the same manner using pAAV—MCS modified for AAV4 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000). (Year 97, p. 3428-3432) o
  • pAAV-MCS into which rat HGF-KT3 was inserted was introduced into HEK193 cells contained in the kit according to the instructions for the kit. The expression and activity of rat HGF-KT3 in the cells were confirmed by ELISA and scatter analysis on MDCK cells.
  • the resulting vectors are abbreviated as AAV2-HGF and AAV4-HGF.
  • a vector suspension (HSV-HGF: 3 X 10 7 pfu, 3 X 10 7 pfu; AAV2-HGF: 3 X 10 n pfu; or AAV4-HGF: 3 ⁇ 10 n pfu) 5 ⁇ L was stereotaxically injected. Five days later, the animals were sacrificed under pentobarbiter deep anesthesia. Take out the spinal cord with speed and force and divide it into three areas: upper spinal (rostral side; U), middle (middle spinal; middle part; M) and lower part (lower spinal; caudal side; L). The spinal cord fragments were homogenized by the method described above. The amount of HG F protein was measured by ELISA.
  • R6Z2 mice, R6Z2 (HSV—LacZ) mice, R6Z2 (HSV—HGF) mice and wild-type littermate mice prepared in the same manner as in Test Example 1 were used. Each mouse was sacrificed at 9 weeks of age, and striatum homogenization was prepared in the same manner as described in the Western blotting section of Test Example 1, and then the protein was separated by SDS-PAGE. Transferred to the membrane. The transferred PVDF membrane was blocked with 10% by weight skim milk for 2 hours at room temperature and then blotted with an anti-huntingtin antibody.
  • the anti-huntingtin antibody used was a 100-fold diluted goat polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz; catalog number sc-8678) that recognizes the C-terminal part of the huntingtin protein. Subsequently, it was incubated with a horseradish peroxidase (HRP) conjugated with a secondary antibody (DakoCytomation) and developed with ECL reagents (Product No. RPN2106, Amersham Biosciences) according to the product instructions.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the therapeutic agent or disease-suppressing agent of the present invention is useful as a drug for treating or suppressing polyglutamine disease.

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Abstract

　本発明は（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤である。

Description

ポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤
技術分野
[0001] 本発明はポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤に関し、更に詳しくは肝細胞増 殖因子（以下、 HGFと略記する。）又はそれをコードする DNAを含む DNAを有効成 分とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤に関する。
背景技術
[0002] ポリグルタミン病は常染色体優性進行性神経変性疾患である。ポリグルタミン病は、 ポリグルタミン病の該当遺伝子に異常に伸長したポリグルタミンをコードするシトシン' アデニン.グァニン (CAG)の繰り返し配列を有し、その異常に伸長した CAGの繰り 返し配列を有する原因遺伝子が翻訳されポリグルタミン病原因遺伝子産物を発現す ること〖こより発症する。ポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病において、原因遺 伝子としてハンチンチン遺伝子が第 4染色体短腕上に同定されている（非特許文献 1 ) oハンチンチン遺伝子は 3145アミノ酸残基のハンチンチン蛋白質をコードする。こ の蛋白質自体は様々な組織で発現し全長蛋白質は主に細胞質に存在し非病原性 である。ハンチンチン遺伝子の第 1ェクソンには CAGの繰り返し配列が存在する。こ の CAGの繰り返し配列は非病原性の場合では約 30未満の反復である力 CAGの 繰り返しが約 30以上にもなるとハンチントン舞踏病を惹起する病原性遺伝子となる。 CAGの繰り返しが約 30以上に増加したノヽンチンチン遺伝子からはハンチンチン蛋 白質の N末端側グルタミンの連続 (ポリグルタミン）が長くなつた蛋白質 (変異ハンチン チン）が作られる。このようなポリグルタミンが長くなつた変異ハンチンチンは凝集を起 こしゃすくなつている。また長いポリグルタミンは他の蛋白質との相互作用に影響する こと、ハンチンチン蛋白質自身の切断 (プロセシング)を促進することなどが報告され ている。切断されたノヽンチンチン蛋白質は核に多く存在し、このことが細胞に対する 毒性を発揮し、ハンチントン舞踏病を惹起すると考えられている。ハンチントン舞踏病 は、一般に中年で発病し、発病から 15— 20年で死に至る。その症状は特徴的な筋 肉運動の変調、認識力の低下及び精神科の症状等によって特徴づけられる。筋肉 運動の変調は、舞踏病や筋失調症を含む自発的随意運動と異常不随意運動の調 整喪失によると考えられて 、る。
[0003] 一方、 HGFは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、 198 9年にその遺伝子クロー-ングがなされた (非特許文献 2、 3参照)。 HGFの投与は、 抗アポトーシス活性によって劇症肝炎を伴うマウスにおけるエンドトキシン誘発致死 的肝障害を予防し、 HGF遺伝子治療は致命的な肝硬変を持つラットの生存率を改 善し得ることが知られている（非特許文献 4、 5参照)。また、ノックアウト Zノックインマ ウスの手法を含む発現及び機能的解析における近年の多数の研究により、 HGFは 新規な神経栄養因子であることも明らかにされた (非特許文献 6、 7参照)。とりわけ H GFは、 in vitroでグリア細胞株由来神経栄養因子 (GDNF)に匹敵する運動-ユー ロンに対する最も強力な生存促進因子の一つとして知られている（非特許文献 8参照 )。前記 GDNFの産生促進剤は、神経変性疾患の一つである筋委縮性側索硬化症（ ALS)の治療剤として知られ (特許文献 1参照）、 HGF (遺伝子も含む)も ALS形質 転換モデルマウス（ヒト ALSの原因遺伝子である SOD 1 G93 Aを発現させた形質転 換マウス）の病気の進行を遅らせ、生存率を延長することが知られている（特許文献 2 、非特許文献 9参照)。
一方、ハンチントン舞踏病遺伝子で形質転換した R6Z2マウスにレンチウィルスべ クタ一を用いて GDNF遺伝子が導入された力 GDNF遺伝子の導入は該マウスに 対して有用な効果を示さな力 たことが知られている (非特許文献 10参照)。
これらのことは、神経変性疾患であっても、 ALSを含めアルツハイマー病やパーキ ンソン病等とハンチントン舞踏病等のポリグルタミン病とは、その病因や、病態、発病 方法等が全く異なり、これら疾患を同列に扱うことは出来ないことを示している。
[0004] また、特許文献 3には、パーキンソン病で変性する中脳黒質ドーノミン-ユーロンを 薬剤投与により特異的に死滅させる中脳黒質ドーノミン-ユーロン細胞死誘導ラット を用いて、 HGF遺伝子の中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットへの作用 効果を行動学的に及び組織学的に検討した実施例が示されており、 HGF遺伝子の 前投与により中脳黒質ドーパミン-ユーロンを神経毒 6— OHDAから保護し、中脳黒 質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットの症状を抑えたとの実験結果が示されてい る。そして、この特許文献 3では、このような実験結果に基づいて、 HGF遺伝子がパ 一キンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線 条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン舞踏病、シャイ'ドレーガー症候群 、シャルコー 'マリー'トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸 閉塞症、アミロイド一シス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎'多発性筋炎、クロイツフエ ルド ·ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、結節性 動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱狭窄症、混合性結合組織病、糖尿病性 末梢神経炎、虚血性脳血管障害 (脳梗塞、脳出血等)などの神経疾患の治療にも適 用できるとし、力かる神経疾患の 1つとしてハンチントン舞踏病も挙げられている。 し力しながら、パーキンソン病は中脳黒質部のドーパミン作動性-ユーロンという特 定種の-ユーロンが選択的に脱落する神経変性疾患であるのに対して、ポリダルタミ ン病は上記したように長鎖のグルタミン鎖 (ポリグルタミン)を含む原因遺伝子産物を 発現することにより発症する神経変性疾患である。 6— OHDAによる神経細胞変性 又は細胞死惹起メカニズムとポリグルタミン病原因遺伝子産物による神経細胞変性 又は細胞死メカニズムは全く異なるものであり、 6— OHDAに対して神経保護作用を 示したからといって HGFがポリグルタミン病における神経細胞変性又は細胞死を保 護するとは到底予測できない。臨床的には、共に神経変性疾患であってもパーキン ソン病とポリグルタミン病とは、全く異なる病態を示すだけでなぐ両疾患に因果関係 は認められない。また、障害神経細胞も完全に異なっている。このため、パーキンソン 病モデルラットの上記実験結果のみから、 HGF蛋白質又はそれをコードする DNA がポリグルタミン病の治療に有効であるとは到底 、えず、また有効であったとする報 告もない。
上記のように、ハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病に対する治療方法は確立 されておらず、困難を極めているのが現状である。
特許文献 1：特開 2002— 47206号公報
特許文献 2 :特開 2002— 87983号公報
特許文献 3：国際公開第 2003Z045439号パンフレット
非特許文献 1：ザ ·ハンチントンズ 'ディジーズ 'コラボレイティブ ·リサーチ ·グループ（ The Huntington's Disease Collaborative Research Group) ,セノレ (Cell) , 1993 年，第 72卷， p. 971 - 983
非特許文献 2：中村 (Nakamura)ら，バイオケミカル ·アンド ·バイオフィジカル 'アンド' リサーチ 'コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 1984年，第 12 2卷， p. 1450- 1459
非特許文献 3 :中村（Nakamura)ら，ネイチヤー（Nature) , 1989年，第 342卷， p. 44 0-443
非特許文献 4 :コウサイ（Kosai)ら，へノ トロジー（Hepatology) , 1999年，第 30卷， p. 151 - 159
非特許文献 5 :ウエキ（Ueki)ら，ネィチヤ一'メデイシン（Nat. Med. ) , 1999年，第 5 卷， p. 226 - 230.
非特許文献 6：松本（Matsumoto)ら，チバ ·フアウンディション ·シンポジウム（C¾a Fou nd. Symp. ) , 1997年，第 212卷， p. 198— 211；ディスカッション 211— 194 非特許文献 7 :船越（Funakoshi)ら，タリ-力 'チミ力'ァクタ (Clin. Chim. Acta. ), 200 3年，第 327卷， p. 1 - 23
非特許文献 8 :二ユーロン（Neuron) , 1996年，第 17巻， p. 1157— 1172 非特許文献 9：サン（Sun)ら，ブレイン ·リサーチ ·モレキユラ ·ブレインリサーチ（Brain.
Res. Mol. Brain. Res. ) , 2002年，第 103卷， p. 36—48
非特許文献 10 :ポポビック 'ェヌ（Popovic N)ら，ェクスペリメンタル'ニューロジー（Exp . Neurol. ) , 2005年，第 193卷， p. 65— 74
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、ポリグルタミン病を治療又は発病抑制するのに有効な薬剤を提 供するものである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、 HGF蛋白質もしく は HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有す るペプチド (以下において、 HGF蛋白質等ということもある。）、あるいはそれらをコー ドする DNA又は前記 DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条 件下でノ、イブリダィズする DNAであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有 する蛋白質をコードする DNAを含む DNA (以下にお 、て、 HGF遺伝子と ヽうことも ある。）がポリグルタミン病に対して優れた治療効果を奏することを見出し、さらに検討 を重ねて本発明を完成するに至った。
[0008] 本発明者らは、まずハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病のモデルマウスであ る変異 (CAGリピートの長 、病因変異)ハンチンチンェキソン 1 (変異 HDェキソン 1) を導入した形質転換マウス (R6Z2マウス）を用いて、 HGF蛋白質等又は HGF遺伝 子のポリグルタミン病への関与を検討した。
本発明者らは、神経向性を有し複製能を欠如したベクター (I型単純へルぺスウイ ルス (HSV- 1)ベクター）を用いて上記形質転換マウス (R6Z2)の線条体にラット H GF遺伝子を導入し、線条体においてラット HGF蛋白質を発現する R6Z2形質転換 マウスを作製し、当該マウスを用いて、実際に HGF遺伝子がポリグルタミン病に対し て効果を示すか否かを検討した。その結果、ラット HGF遺伝子の導入されたマウスで は、驚くべきことにクラスビングという手足を広げられない現象の開始が遅延され、寿 命が延び、また運動機能障害が改善されることが明らかとなった。これらの知見により 、 HGF蛋白質の発現はハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病に対して治療効 果、発病抑制効果をもたらすことが、初めて明らかとされた。
[0009] 次に本発明者らは、 HGF蛋白質等又は HGF遺伝子によるポリグルタミン病の治療 効果又は発病抑制効果のメカニズムを検討した結果、少なくとも線条体におけるカス パーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性ィ匕抑制作用と共に、神経細胞の新生 作用という 2つの新たなメカニズムにより、 HGF蛋白質又は HGF遺伝子がポリグルタ ミン病に有用な効果をもたらすことを見出した。 HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、 カスパーゼー 3及び/又はカスパーゼー 1の活性ィヒを抑制することにより線条体にお ける神経細胞変性又は細胞死を抑制し、線条体の萎縮を抑制すると共に脳室拡大 を抑制することができる。すなわち HGF蛋白質又は HGF遺伝子は、神経細胞変性 又は細胞死を抑制すると共に神経細胞を新生するという 2つの作用を通して、ポリグ ルタミン病における運動機能の改善効果と寿命の延長効果を奏する。 [0010] また、本発明者らは、変異ハンチンチンが有する長いポリグルタミンが断片化 (プロ セシング）により神経毒性を獲得することに注目し、前記プロセシングに及ぼす HGF 蛋白質又は HGF遺伝子の効果を検討した。本発明者らは、変異 HDェキソン 1を導 入した形質転換マウス (R6Z2マウス)では、ハンチンチン蛋白質は断片化されるが、 これに HGF遺伝子を導入した R6Z2形質転換マウスでは、ハンチンチン蛋白質の 断片化が抑制されることを知見した。
このような、 HGF蛋白質又は HGF遺伝子の効果は本発明において初めて見出さ れたものであり、発明者らはこれら知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成す るに至った。
[0011] すなわち、本発明は、
[1] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病 の治療剤又は発病抑制剤、
[2] 有効成分が、（ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口) HGF蛋白質の部 分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードす る DNA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな 条件下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 もしくはペプチドをコードする DNAであることを特徴とする前記 [1]記載の治療剤又 は発病抑制剤、
[3] HGF蛋白質をコードする DNA力 （a)配列番号 1、 2又は 5で表される塩基配 列からなる DNA又は (b)前記 (a)の塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性 を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [2]記載 の治療剤又は発病抑制剤、
[4] DNAが、 I型単純へルぺスウィルス (HSV- 1)ベクター、アデノウイルスベクタ 一又はアデノ随伴ウィルスベクターに組み込まれていることを特徴とする前記 [2]又 は [3]記載の治療剤又は発病抑制剤、
[5] 有効成分が、（ィ) HGF蛋白質もしくは（口) HGF蛋白質の部分ペプチドであつ て HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを 特徴とする前記 [1]記載の治療剤又は発病抑制剤、
[6] HGF蛋白質力 （a)配列番号 3、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一又は (b )前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴と する前記 [5]記載の治療剤又は発病抑制剤、
[7] ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1 型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失 調症 7型、脊髄小脳失調症 12型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等よりなる群 から選択される少なくとも 1の疾患であることを特徴とする前記 [ 1]〜 [6]の ヽずれか に記載の治療剤又は発病抑制剤、
[8] ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病であることを特徴とする前記 [ 1]〜 [6]の V、ずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
[9] 治療剤又は発病抑制剤が、ポリグルタミン病の病変部位への局所投与用であ ることを特徴とする前記 [ 1]〜 [8]の ヽずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、 [10] 局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする前記 [9]記載の治療剤又は 発病抑制剤、
[11] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とする脳室の拡大抑制剤、 [12] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝 子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤、
[13] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とする神経細胞におけるカスバ ーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性化抑制剤、
[14] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝 子産物のプロセシング抑制剤、
[15] 治療又は発病抑制が、脳室の拡大抑制によるものであることを特徴とする前 記 [ 1]〜 [ 10]の ヽずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
[16] 脳室の拡大が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物による線条体神経細胞変性 又は細胞死によるものであることを特徴とする前記 [15]記載の治療剤又は発病抑制 剤、
[17] 線条体神経細胞変性又は細胞死がカスパーゼ 3及び Z又はカスパーゼ 1の活性ィ匕によるものであることを特徴とする前記 [16]記載の治療剤又は発病抑制 剤、
[18] 治療又は発病抑制が、神経新生によるものであることを特徴とする前記 [1]〜
[10]のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
[19] 治療又は発病抑制が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制 によるものであることを特徴とする前記 [1]〜 [10]の 、ずれかに記載の治療剤又は 発病抑制剤、
[20] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤の製造の為の使 用、
[21] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAを哺乳動物に投与するポリグルタミン病の治療又は発病抑制 方法、及び、
[22] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) H GF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコード する DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤としての使用、 に関する。
[0013] また、本発明は（1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口) HGF蛋白質の部分ペプチドであ つて HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは (2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドで あって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は（ ノ、）それら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノヽィ ブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはぺプ チドをコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投与することを特徴とする脳室の拡 大抑制方法、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑 制する方法、カスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性化を抑制する方法、 又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシングを抑制する方法に関する。
[0014] さらに、本発明は、脳室の拡大を抑制する医薬、ポリグルタミン病原因遺伝子産物 依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する医薬、カスパーゼー 3及び Z又はカスバ ーゼ 1の活性ィ匕を抑制する医薬、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシ ングを抑制する医薬を製造するための（1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口) HGF蛋白質 の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又は これらの塩、あるいは（2) (ィ） HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白 質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドを コードする DNA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの使用に関する。
[0015] さらに、本発明は、脳室の拡大を抑制する医薬、ポリグルタミン病原因遺伝子産物 依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する医薬、カスパーゼー 3及び Z又はカスバ ーゼ 1の活性ィ匕を抑制する医薬、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシ ングを抑制する医薬としての（ 1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分べ プチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩 、あるいは（2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分べ プチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする D NA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もし くはペプチドをコードする DNAを含む DNAの使用に関する。
発明の効果
[0016] 本発明の治療剤又は発病抑制剤は、ポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病 、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状 核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等に対して極めて優れた治療効果又は発病抑制効果を 発揮するものである。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、 HSV— HGF形質導入後の R6Z2マウス線条体における HGFの発現 を示す図である。図中 aは野生型同腹子マウス線条体を、 bは R6Z2マウス線条体を 、 cは R6Z2(HSV— LacZ)マウス線条体を、 dは R6Z2 (HSV— HGF)マウス線条 体の組織像を示す。 eは ELISAにより測定した各マウス線条体の HGF量を示す。
[図 2]図 2は、 R6Z2マウスの線条体に HSV— HGF又は HSV— LacZ形質導入後 の体重の経時変化を示す図である。
[図 3]図 3は、 R6Z2マウスの線条体に HS V— HGF又は HSV— LacZ形質導入後 の生存曲線を示す図である。
[図 4]図 4は、クラスビングテストにおけるマウスの姿勢を示す図である。
[図 5]図 5は、クラスビングテストにおけるスコアの経時変化を示す図である。
[図 6]図 6は、ロタロッドテストにおける運動機能の経時変化を示す図である。
[図 7]図 7は、フットプリントテストにおける歩幅の平均間隔の経時変化を示す図である
[図 8]図 8は、フットプリントテストにおける前肢 Z後肢の重なりの分離の経時変化を示 す図である。
[図 9]図 9は、マウス脳の冠状断面を示す図である。図中、 Ctxは大脳皮質を、 CCは 脳梁を、 Strは線条体を、 Lvは側脳室（Lateral ventricle)を示す。
[図 10]図 10は、 9週令マウスの脳重量を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV— LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HG F)マウスを示す。
[図 11]図 11は、線条体における NeuN陽性細胞を示す図である。
[図 12]図 12は、線条体における NeuN陽性細胞数を示す図である。図中、 Aは野生 型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 ( HSV-HGF)マウスを示す。
[図 13]図 13は、線条体におけるリン酸化 c - Metの発現を示す図である。
[図 14]図 14は、線条体における活性ィ匕カスパーゼー 3の免疫染色像を示す図である
[図 15]図 15は、カスパーゼ— 3のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。図 中、 1, 2は野生型同腹子を、 3, 4は R6Z2マウスを、 5, 6は R6Z2(HSV—LacZ) マウスを、 7, 8は R6Z2 (HSV—HGF)マウスを示す。
[図 16]図 16は、ウェスタンブロット分析における活性ィ匕カスパーゼ 3のバンド強度 を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HS
V— LacZ)マウスを、 Dは R6/2 (HSV— HGF)マウスを示す。
[図 17]図 17は、野生型同腹子マウスにおけるカスパーゼー 3の活性ィ匕に対する R6 Z2マウスにおけるカスパーゼー 3の活性化率を示す図である。
[図 18]図 18は、カスパーゼ— 1のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。図 中、 1, 2は野生型同腹子を、 3, 4は R6Z2マウスを、 5, 6は R6Z2(HSV—LacZ) マウスを、 7, 8は R6Z2 (HSV—HGF)マウスを示す。
[図 19]図 19は、ウェスタンブロット分析における活性ィ匕カスパーゼ 1のバンド強度 を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HS
V— LacZ)マウスを、 Dは R6/2 (HSV— HGF)マウスを示す。
[図 20]図 20は、野生型同腹子マウスにおけるカスパーゼー 1の活性ィ匕に対する R6 Z2マウスにおけるカスパーゼー 3の活性化率を示す図である。
[図 21]図 21は、 R6Z2 (HSV— HGF)マウス及び野生型同腹子の線条体における Ki— 67陽性細胞の免疫染色像を示す図である。図中、 Strは線条体を、 LVは脳室 を、 SVZは脳室下帯を示す。
[図 22]図 22は、マウス脳室下帯及び線条体における BrdU陽性細胞数を示す図で ある。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ) マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 *は野生型同腹子に対する有 意差（ρ< 0. 05)を、 * *は R6Z2 (HSV— LacZ)マウスに対する有意差（p< 0. 0 5)を示す。
[図 23]図 23は、マウス脳室下帯及び線条体におけるネスチンと BrdUの両者が陽性 である細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 * * は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに対する有意差（p< 0. 05)を示す。
[図 24]図 24は、マウス脳室下帯及び線条体における DCXと BrdUの両者が陽性で ある細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 C は R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 * *R 6/2 (HSV-LacZ)マウスに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 25]図 25は、マウス脳室下帯及び線条体における PSA— NCAMと BrdUの両者 が陽性である細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マ ウスを、 Cは R6Z2 (HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示 す。 *は野生型同腹子に対する有意差 (Pく 0. 05)を、 * *は R6Z2 (HSV— Lac Z)マウスに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 26]図 26は、マウス脳室下帯及び線条体における β IIIチューブリンと BrdUの両 者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2 マウスを、 Cは R6Z2 (HSV— LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを 示す。 * *は R6Z2 (HSV— LacZ)マウスに対する有意差（pく 0. 05)を示す。
[図 27]図 27は、マウス脳室下帯及び線条体における NeuNと BrdUの両者が陽性で ある細胞の数を示す図である。図中、 Aは野生型同腹子を、 Bは R6Z2マウスを、 C は R6Z2(HSV—LacZ)マウスを、 Dは R6Z2 (HSV— HGF)マウスを示す。 * * は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに対する有意差（p< 0. 05)を示す。
[図 28]図 28は、マウス線条体におけるネスチンとリン酸化 c— Metの両者が陽性であ る細胞の免疫染色像を示す図である。
[図 29]図 29は、マウス線条体における DCXとリン酸化 c— Metの両者が陽性である 細胞の免疫染色像を示す図である。
[図 30]図 30は、 HGF蛋白質をコードする DNAを挿入した HSV— HGF、 AAV2-
HGF及び AAV4— HGFの 3種のベクターをラット腰髄の脊髄実質に注射し、 5日後 の脊髄における HGFの発現量を示す図である。図中、 Uは脊髄の吻側を、 Mは中央 部を、 Lは尾側を示す。 *はコントロールに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 31]図 31は、 HGF蛋白質をコードする DNAを挿入した HSV— HGF、 AAV2-
HGF及び AAV4— HGFの 3種のベクターをラット腰髄の脊髄腔に注射し、 5日後の 脊髄における HGFの発現量を示す図である。図中、 Uは脊髄の吻側を、 Mは中央 部を、 Lは尾側を示す。 *はコントロールに対する有意差 (p< 0. 05)を示す。
[図 32]図 32は、ハンチンチン蛋白質のウェスタンブロット分析の結果を示す図である
[図 33]図 33は、ハンチンチン蛋白質のウェスタンブロット分析における C末端フラグメ ントを定量解析した結果を示す図である。図中 *は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに 対する有意差 (P< 0. 05)を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明において「HGF蛋白質をコードする DNA」とは、 HGF蛋白質を発現し得る DNAをいう。 HGF蛋白質をコードする DNAを含む DNAとしては、例えば、 Nature, 342, 440 (1989)；特許第 2777678号公報； Biochem. Biophys, Res. Commun. , 198 9年,第 163卷， p. 967-973 ;Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 1991年,第 88卷（16号 ) , p. 7001- 7005等に記載され、例えば、 GeneBank/EMBL/DDBJに Accession No. M60718、 M73240、 AC004960、 AY246560, M29145又は M73240等とし て登録されているヒト由来の HGF蛋白質をコードする DNA等が好ましく挙げられる。 また、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAには、前記 DNAと相補的な塩基配列 力もなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 HGF 蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋 白質をコードする DNA等が包含される。
[0019] HGF蛋白質をコードする DNAの具体例としては、例えば、配列番号 1又は 2で表 わされる塩基配列を有する DNA、若しくは配列番号 1又は 2で表わされる塩基配列 を有する DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノ、イブ リダィズする DNAであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン 活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードする DNA等が好ましく挙げられる。 ここで、配列番号 1で表される塩基配列は、 Accession No. M60718の塩基配列第 7 3乃至 2259に相当し、該 DNAは配列番号 3で表されるアミノ酸配列力もなる HGF蛋 白質をコードする DNAに相当する。配列番号 2で表される塩基配列は、 Accession N 0. M73240の塩基配列第 66乃至 2237〖こ相当し、該 DNAは配列番号 4で表される アミノ酸配列からなる HGF蛋白質をコードする DNAに相当する。
[0020] 配列番号 1又は 2で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、例えば上記 DNAの部分配列を プローブとして、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイブリダィゼーシヨン法 あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNA を意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定ィ匕したフィル ターを用いて、約 0. 7〜1. 0Mの塩化ナトリウム存在下、約 65°Cでハイブリダィゼー シヨンを行った後、約 0. 1〜2倍の濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は 、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約 65°Cの 条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAを挙げることができる。ストリ ンジ ントな条件は、以下において同様である。
[0021] 上記の配列番号 1又は 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAとして具体的には、配列番号 1又 は 2で表わされる塩基配列と約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を有する DNA等が挙げられる。ハイブリダィ ゼーシヨンは、公知の方法、例えば、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング（Molecular Cloning , A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor
Lab. Press, 2001 :以下、モレキュラー 'クローユング第 3版と略す。）に記載の方法 等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用 説明書に記載の方法に従って行うことができる。
[0022] さらに、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAは上記に限定されず、発現する蛋 白質が HGF蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードする DNAである限 り、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAとして使用できる。例えば HGF蛋白質の 部分ペプチドをコードする DNAであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有す るペプチドをコードする DNA等も好ましく使用できる。
[0023] HGF蛋白質の部分ペプチドをコードする DNAとしては、上記した部分ペプチドを コードする塩基配列を有しかつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するぺプチ ドをコードする DNAであれば!/、かなるものであってもよ!/、。具体的な本発明の部分 ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、（a)配列番号 1又は 2で表わされる塩基 配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAであって、かつ HGF蛋白質と実 質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA、 (b)配列番号 1又は 2で表 わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配 列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA等が挙げられ る。このような DNAとしては、より具体的には、例えば、配列番号 1で表されるヒト HG Fの塩基配列の第 94番目力 第 630番目までの塩基配列 (HGFの N末端ヘアピン ループから第 1クリングルドメインまでのペプチドをコードする DNA)を有する DNAや 、配列番号 1で表されるヒト HGFの塩基配列の第 94番目力も第 864番目までの塩基 配列（HGFの N末端ヘアピンループから第 2クリングルドメインまでのペプチドをコー ドする DNA)を有する DNA等が好ましく挙げられる。
[0024] HGF蛋白質をコードする DNA又は HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNAは、例えば通常のハ イブリダィゼーシヨン法や PCR法等により容易に得ることができ、該 DNAの取得は具 体的には例えば前記モレキュラー 'クローニング第 3版等の基本書等を参考にして行 うことができる。
[0025] なお、本発明で用いられる HGF蛋白質をコードする DNA又は HGF蛋白質の部分 ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNAを含む DNAとしては、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリー、細胞もしくは組 織由来の cDNA、細胞もしくは組織由来の cDNAライブラリ一又は合成 DNA等が好 ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノム DNA断片がクローユングされるベクター としては、ノ クテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。 また、本発明で用いられる HGF蛋白質をコードする RNA又は HGF蛋白質の部分 ペプチドをコードする RNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有 するペプチドをコードする RNAも、逆転写酵素により HGF蛋白質又は部分ペプチド を発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該 RNAとしては 、例えば細胞又は組織より mRNA画分を調製して、 RT— PCR法によって増幅した R NA等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該 RNAも公知の手段により得ること ができる。
[0026] 本発明で使用される HGF蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に 精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
HGF蛋白質は、例えば HGF蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養 し、培養上清等から分離、精製して該 HGF蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝 子工学的手法により HGF蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、 これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清液から目 的とする組換え HGF蛋白質を分離すること等により得ることもできる。（例えば、特開 平 5— 111382号公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989年、第 163卷， p. 96 7等を参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用 いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることが できる。このようにして得られた HGF蛋白質は、天然型 HGF蛋白質と実質的に同じ 作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数個（複数個とは例えば、 2〜2 0個、好ましくは 2〜： L0個、より好ましくは 2〜5個；以下同様である。）のアミノ酸が置 換、欠失若しくは付加されていてもよぐまた同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加さ れていてもよい。そのような HGF蛋白質として、下記する 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白 質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法 等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数（1〜複数個）が、欠失、 置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加した HGF蛋白質とは、例えば天然の HGF蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し 糖鎖を欠損させた HGF蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸 配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が 付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。具体的には、例えば NCBI のデータベースに登録されている Accession No. NP— 001010932のヒト HGFに 対し、糖鎖付カ卩部位の 289位 Asnを Ginに、 397位 Asnを Ginに、 471位 Thrを Gly に、 561位 Asnを Ginに、 648位 Asnを Ginにそれぞれ置換することによって糖鎖が 付カ卩しないようにした HGF[Fukuta K et al. , Biochemical Journal, 388, 555-562 (2005) ]等を挙げることができる。
さらに、 HGF蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上の相同性を有する蛋白 質、好ましくは約 90%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 95%以上の 相同性を有する蛋白質であって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質も本発明に使用される HGF蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列につ 、て「 相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するァ ミノ酸残基の一致の程度の意味である。
上記 HGF蛋白質としては、例えば NCBIのデータベース等に登録されている例え ば Accession No. P14210 (配列番号 3)又は Accession No. NP— 001010932 ( 配列番号 4)で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来の蛋白質等が好ましく挙げら れる。配列番号 4で表される HGF蛋白質は、配列番号 3で表されるアミノ酸配列の第 161〜165番目の 5個のアミノ酸残基が欠失している 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白質で ある。配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来 の天然 HGF蛋白質であって、 HGFとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有 する。 配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む 蛋白質としては、配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上、 好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば 配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列から、 1〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は 欠失させたアミノ酸配列、 1〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させた アミノ酸配列又は 1〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白 質であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質であることが好まし い。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる 20種類 のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、ァミノ基とカルボ キシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えば γ—ァミノ酪酸等が挙げ られる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。配列番号 3又は 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質とし ては、例えば NCBIのデータベースに登録されている Accession No. BAA14348 又は AAC71655等のヒト由来 HGFが挙げられる力 これらに限定されない。
なお、本発明で用いられる HGF蛋白質又はそれをコードする DNAは、ヒトに適用 する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例え ばサル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ノヽムスター、モル モット、チンパンジー等）に由来する HGF蛋白質又はそれをコードする DNAであつ てもよい。このような HGFとしては、例えば NCBIのデータベース等に登録されている 例えば、マウス由来 HGF (例えば Accession No. AAB31855, NP— 034557, B AA01065, BAAO 1064等）、ラット由来 HGF [例えば Accession No. NP— 5871 3 (配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質)等]、ゥシ由来 HGF (例えば A ccession No. NP— 001026921、 XP874086, BAD02475等;)、ネコ由来 HGF ( 例えば Accession No. NP— 001009830、 BAC10545, BAB21499等）、ィヌ由 来 HGF (例えば Accession No. NP— 001002964、 BAC57560等）又はチンパン ジー由来 HGF (例えば Accession No. XP519174等）などが挙げられるが、これら に限定されない。
[0029] 本発明に用いられる HGF蛋白質は、 C末端がカルボキシル基（一 COOH)、カル ボキシラート [― COOM (Mは金属を示す）]、アミド（― CONH )又はエステル（― C
2
OOR)のいずれであってもよい。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、 ェチル、 n—プロピル、イソプロピルもしくは n—ブチル等の C1— 6アルキル基、例え ば、シクロペンチル、シクロへキシル等の C3— 8シクロアルキル基、例えば、フエ-ル 、 a ナフチル等の C6— 12ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチル等のフエ- ルー C 1 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチル等の at ナフチルー C1 2アル キル基等の C7— 14ァラルキル基のほ力 ァセチルォキシメチル、ビバロイルォキシ メチル等の C2— 6アルカノィルメチル基等が用いられる。本発明で用いられる HGF 蛋白質が、 C末端以外にカルボキシル基又はカルボキシラートを有している場合、力 ルボキシル基又はカルボキシラートがアミド化又はエステル化されているものも本発 明における HGF蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C 末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられる HGF蛋白質には、上 記した蛋白質において、 Ν末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、ホルミ ル基、ァセチル等の C2 - 6アルカノィル基等の C 1 - 6ァシル基等）で保護されて!ヽ るもの、 Ν末端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸ィ匕した もの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基 (例えば、― ΟΗ、― SH、アミノ基、イミ ダゾリル基、インドリル基、グァ-ジノ基等）が適当な保護基 (例えば、ホルミル基、ァ セチル等の C2— 6アルカノィル基等の C1 6ァシル基等）で保護されて!ヽるもの、あ ¾ ヽは糖鎖が結合した 、わゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
[0030] 本発明で用いる HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質 の活性を有するペプチド (以下、 HGF部分ペプチドと略記する場合がある。）として は、上記した HGF蛋白質の部分ペプチドであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の 活性を有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、 HGF部 分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した HGF蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なく とも約 20個以上、好ましくは約 50個以上、より好ましくは約 100個以上のアミノ酸配 列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号 3で表されるヒト HGFアミノ酸配列の N末端側から 32番目のアミノ酸から 210番目のアミノ酸までのァ ミノ酸配列（HGFの N末端ヘアピンループ力も第 1クリングルドメインまでの配列）で 示されるペプチドや、配列番号 3で表されるヒト HGFアミノ酸配列の N末端側から 32 番目のアミノ酸から 288番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（HGFの N末端ヘアピン ループ力 第 2クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチド等が好ましく挙げら れる。
本発明の HGF部分ペプチドにおいては、 C末端がカルボキシル基（― COOH)、 カルボキシラート [― COOM (Mは上記と同意義）]、アミド（― CONH )又はエステ
2
ル（一COOR;Rは上記と同意義）のいずれであってもよい。さらに、 HGF部分ぺプ チドには、上記した HGF蛋白質と同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護 基で保護されて ヽるもの、 N末端側が生体内で切断され生成した Ginがピロダルタミ ン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されて V、るもの、あるいは糖鎖が結合した 、わゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれ る。
[0031] 本発明に用いられる HGF蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基 との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩 が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素 酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、 マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン 酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。
[0032] 本発明に用いられる HGF蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチド の合成法に従って、あるいは HGF蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによ つて製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合 成法のいずれでも良い。すなわち、 HGF蛋白質を構成し得る保護基を有していても ょ 、部分ペプチドもしくはアミノ酸と保護基を有して 、てもよ 、残余部分とを縮合させ 、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製 造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、 M. Bodansz ky及び M. A. Ondetti、ペプチド 'シンセシス（Peptide Synthesis) , Interscience Publ ishers, New York (1966年）、 Schroeder及び Luebke、ザ ·ペプチド（The Peptide) , A cademic Press, New York (1965年）等に記載された方法等が挙げられる。反応後は 通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグ ラフィー、結晶化又は再結晶等を組み合わせて HGF蛋白質の部分ペプチドを精製 単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公 知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公 知の方法によって遊離体に変換することができる。
[0033] 本発明における、「ポリグルタミン病」としては、原因遺伝子の塩基配列に含まれる シトシン ·アデニン ·グァニン（CAG；グルタミンのコドン）配列の繰り返し配列を約 30 以上含む原因遺伝子が転写、翻訳されてできる異常に伸長したグルタミン鎖 (ポリグ ルタミン)を含む原因遺伝子産物が神経細胞に異常蓄積又は凝集して神経細胞変 性又は細胞死や機能異常、例えば筋肉運動の変調 (例えば舞踏病や筋失調症等） 、認識力の低下又は精神化症状等を引き起こす遺伝性神経変性疾患が典型例とし て挙げられる。
ポリグルタミン病としては、具体的には、例えばノヽンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎 縮症、脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳 失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状核赤核淡蒼球ル ィ体萎縮症等が挙げられる。
[0034] 本発明にお ヽて、「治療」とは、ポリグルタミン病の症状を緩解、又は完治させること をいい、より具体的には、例えば、ポリグルタミン病における神経細胞変性又は細胞 死を抑制又は遅延させることによって、前記機能異常を抑制又は防止し、正常化さ せることを含む。また、該治療には、神経細胞変性又は細胞死が誘発される部位に おいて、神経細胞を新生させること等も包含される。
[0035] 本発明にお 、て、「発病抑制」とは、ポリグルタミン病の CAGの繰り返しを約 30以上 有する原因遺伝子が発現し、該原因遺伝子産物が生成されて誘発される神経変性 又はその進行を抑えることを 、 、、ポリグルタミン病の CAGの繰り返しを約 30以上有 する原因遺伝子が発現し、該原因遺伝子産物が生成され蓄積されるのを抑制又は 防止することを包含する。 原因遺伝子としては、例えばノヽンチンチン遺伝子等が挙げられる。該ハンチンチン 遺伝子はその第 1ェクソンに CAGの繰り返し配列を有する。なお、ハンチンチン遺伝 子は非病原性の場合では前記第 1ェクソンに存在する CAGの繰り返し配列が約 30 未満である力 病原性遺伝子としては前記 CAGの繰り返し配列が約 30以上になるも のが挙げられる。
[0036] ポリグルタミン病の発病抑制の方法としては、例えば（l) CAGの繰り返しを 30以上 有する原因遺伝子の発現抑制又は防止、（2) CAGの繰り返しを 30以上有する原因 遺伝子産物の生成抑制又は防止、（3)生成された CAGの繰り返しを 30以上有する 原因遺伝子産物の蓄積抑制又は防止、（4)ポリグルタミン病原因遺伝子産物に起因 しておこる神経変性の進行抑制、あるいは（5) CAGの繰り返しを 30以上有する原因 遺伝子産物のプロセシングの抑制等が挙げられる。前記（1)乃至（5) V、ずれかある いは 2つ以上を抑制又は防止することが好ま 、。
[0037] 本発明のポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳 動物（例えば、サル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ハム スター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。
[0038] 本発明の治療剤又は発病抑制剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方 法、投与量等は、有効成分が HGF蛋白質の場合と、 HGF蛋白質をコードする DNA の場合と若干異なってもよ!/、。
例えば、有効成分が HGF蛋白質である場合の本発明の製剤は、種々の製剤形態 、例えば液剤、固形剤等をとりうる力 一般的には HGF蛋白質のみを又はそれを慣 用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤 (例えば、デポ剤)等に製剤されるのが 好ましい。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射 剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒 (注射用水、精製水等）に、 医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤 (塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、グリセリン 、マン-トール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩 衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリ ス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤 (パラ ォキシ安息香酸メチル、ノ ラオキシ安息香酸ェチル、ノ ラオキシ安息香酸プロピル、 パラォキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化べンザル コ-ゥム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒド 口キシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリ エチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト 酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又 は pH調整剤 (塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等)等を適宜添加した溶液に、 H GF蛋白質を溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充 填すること〖こより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（ エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又 は非イオン界面活性剤（ポリソルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等)等 をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油 又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はべンジルアルコ 一ル等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル 等に充填される。注射剤中の HGF蛋白質含量は、通常約 0. 0002-0. 2wZv%、 好ましくは約 0. 001-0. lwZv%に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、 凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製 剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
[0039] 噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する 場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添 加剤であればいずれのものであってもよぐ例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保 存剤、安定化剤、等張化剤、 PH調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス 噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化 水素（HCFC22、 HCFC— 123、 HCFC— 134a、 HCFC142等の代替フロン類等 )、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性 ガス (炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等)又は不溶性ガス（窒素ガス等)等が挙げられる。
[0040] また、本発明で用いられる HGF蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤
(例えばデポ剤）とすることもできる。 HGF蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬 回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製 剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内 分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のな力から適宜選択できるが、例え ばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類;コラーゲン又はゼラチン等の蛋白 質;ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチォニン等のポ リアミノ酸;ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸ーグリコール酸共重合体;ポリ力プロラクト ン、ポリ j8—ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸'ポリエチレ ングリコール .ビュルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル又はポ リメチルー α シァノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカー ボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ま しくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸ーグリコール酸共重合体である 。乳酸ーグリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸 Ζグリコール酸）（ モル％)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約 2週間ないし 3力月、好 ましくは約 2週間ないし 1力月の場合には、約 100ZO乃至 50Ζ50が好ましい。該ポ リ乳酸又は乳酸ーグリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約 5, 00 0乃至 20, 000が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸—グリコール酸共重合体は、公知の製 造法、例えば特開昭 61— 28521号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体 分解性高分子と HGF蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性 高分子に対して、 HGF蛋白質が約 0. 01〜30wZw%が好ましい。
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接ポリグルタミン病の病変部位に直 接注射 (髄腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等)も しくは噴霧するカゝ、あるいは徐放性製剤（デポ剤）をポリグルタミン病の病変部位のあ る組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又 は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、 1回当たり1 /^〜50011^、好ましくは 1 0/ζ 8〜50πι8、さらに好ましくは l〜25mgである。また、投与回数も剤形、疾患の程 度又は年齢等に応じて適宜選択され、 1回投与とする力 ある間隔をおいて持続投 与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は 1日 1回力も数ケ月に 1回でよく、 例えば、徐放性製剤 (デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の 場合は、数ケ月に 1回でもよい。 [0042] 一方、 HGF遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子 治療の基礎技術，羊土社， 1996、別冊実験医学，遺伝子導入 &発現解析実験法， 羊土社， 1997、 日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ 'テ ィー 'エス， 1999等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、 HGF遺伝子が組み込まれた組換え発現べク ター等をポリグルタミン病の病変部位の組織 (例えば脊髄神経、脳等)へ局所注射す る方法、又は、患者の病変部位の組織又は脊髄等力 細胞を体外に取り出して、該 細胞に HGF遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後 に、形質転換された前記細胞を、患者の病変部位又は脊髄に移植する方法等が挙 げられる。
[0043] 発現ベクターとしては、 nakedプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス 、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス（I型単純へルぺスウィルス等）、ワクシニアゥ イノレス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスゥイノレス、センダイウィルス、 SV40 又は免疫不全症ウィルス (HIV)等の DNAウィルス又は RNAウィルス等が挙げられ るが、これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞 に組換えウィルスを感染させることにより、細胞内に HGF蛋白質をコードする DNAを 導入することが可能である。中でも、 I型単純へルぺスウィルス（HSV— 1)ベクター、 アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクター等が好まし!/、。
前記 HSV— 1ベクターは神経向性を有するベクターである。 HSV- 1ベクターとし ては、多重遺伝子（30kbまで）が組み込まれている大きな（152kb)ゲノムを有し、か つ生涯にわたり潜在的に神経細胞に対して感染を榭立する能力を有するものが好ま しい。具体的な HSV— 1ベクターとしては、ウィルス複製のための ICR4, ICP34. 5 及び VP16 (vmw65)をエンコードする 3つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態 にある複製能力のない HSV—1 (HSV1764Z4— ZpR19)ベクター（Coffin RS, e t al, J. Gen. Virol. 1998年,第 79卷， p. 3019- 3026 ; Palmer JA, et al, J. Virol., 2000年,第 74卷, p. 5604- 5618 ; Lilley CE, et al., J. Virol, 2001年,第 75卷, p. 4 343-4356)等が挙げられる。また、 AAVベクターは、非病原性ウィルスに属し、安全 性が高ぐまた神経細胞等の非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるベクターであ る。 AAVベクターとしては、 AAV— 2、 AAV— 4、 AAV— 5等が挙げられる。これら HSV- 1ベクターや AAVベクターは目的遺伝子を神経細胞等において長期間発 現させ得る。ポリグルタミン病は長期間を経て病態を完成するので、本発明に使用さ れるベクターとしては、長期発現を可能とする HSV— 1ベクターや AAVベクターがと りわけ好ましい。
HGFのポリグルタミン病に対する効果の評価のためには、例えば、 HSV—1ベクタ 一、 AAVベクターを使用して HGF遺伝子をポリグルタミン病の病変部位、例えば線 条体ゃ髄腔内等へ形質導入するのが好まし ヽ。
[0044] 製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態 [例えば、 注射剤、噴霧剤、徐放性製剤 (デポ剤）、マイクロカプセル剤等]をとり得ることができ る。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤 (デポ剤）は HGF蛋白質の場合と同様にして調製 できる。また、マイクロカプセル剤を製造する場合、例えば HGF遺伝子を含む発現プ ラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法 (例えばコアセルべ ーシヨン法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直 径約 1〜500、好ましくは約 100〜400 μ mの微粒子として製造することができる。被 膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ェチ ルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン 'アラビアゴム、ニトロセル ロース、ポリビュルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコ ール酸、乳酸ーグリコール酸共重合体、キトサン アルギン酸塩、硫酸セルロース ポリ（ジメチルジァリル）アンモ-ゥムクロライド、ヒドロキシェチルメタクリレートーメチル メタタリレート、キトサン カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩—ポリリジン アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中の DNAの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により 適宜調節することができる。また投与量は、 HGF遺伝子導入ベクターの種類により異 なるが、 HGF遺伝子導入ベクターに換算して、通常 1 X 106pfu〜l X 1012pfu、好ま しくは1 107 〜2 1011 、さらに好ましくは 1. 5 X 107pfu〜l. 5 X 10upfuを 数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。
[0045] 本発明の剤は、ポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、 脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎 縮症等、好ましくはハンチントン舞踏病の治療又は発病の抑制に用いることができる ポリグルタミン病の治療又は発病の抑制効果は、公知の方法 [例えば、クラスビング テスト（Nat. Med,第 10卷， p. 148—154, Epub. 2004年， Jan. 2018)；ロタロッドテスト（J . Neurosci, 2000年，第 20卷， p. 4389-4397)；フットプリントテスト（J. Neurosci, 1999 年，第 19卷， p. 3248-3257)等]やそれに準じる方法、例えば、後述する試験例等に 記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0046] また、本発明によれば、 HGF蛋白質もしくは HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド (HGF蛋白質等）、ある 、は H GF蛋白質をコードする DNAもしくは HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は前記 DNAと相 補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAを 含む DNA(HGF遺伝子）を、脳室の拡大抑制、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依 存神経細胞変性又は細胞死抑制、神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又は力 スパーゼー 1の活性ィ匕抑制又は神経細胞新生に使用し得る。
[0047] 脳室拡大は、脳の萎縮、特に線条体萎縮 (例えば、線条体細胞死に基づく線条体 萎縮）によるものが含まれる。本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、脳 室拡大により生じる症状、例えば歩行困難等の四肢障害等の運動機能障害、言語 障害、記憶障害又は神経科症状等を抑制し得る。
[0048] ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死は、神経組織、例 えば線条体等においてポリグルタミン病原因遺伝子産物が発現して蓄積するために 生じるものが含まれる。本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、ポリグルタ ミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死、特に線条体におけるポリグ ルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑制し得る。なお、細胞 死は、アポトーシス及びネクローシスを包含する。このため細胞死抑制というときは、 細胞自体の死が抑制されればよぐアポトーシスを抑制してもよぐまたネクローシス を抑制してもよく、ある 、はその両方を抑制してもよ 、。
[0049] また、本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、前記細胞死の誘導に関 与する、プロテアーゼ、例えばカスパーゼ、とりわけカスパーゼー 1又はカスパーゼー 3の活性化を抑制し得る。ヒトには、カスパーゼは約 10〜20種類存在し、ある種の力 スパーゼが活性ィ匕されるとそのカスパーゼによって他のカスパーゼが活性ィ匕されると いうカスケード反応を生じ、細胞死を誘導する。これらカスパーゼ中でカスパーゼー 3 はカスパーゼ活性ィ匕の最後の段階で細胞死を実行する酵素として知られて 、る。ま た、カスパーゼ 3は、ハンチントン舞踏病で活性化されることが知られている (Zhang Yら， J, Neurochem, 2003年，第 87卷， p. 1184-1192)。カスパーゼ 3は種々の細 胞内蛋白質を分解することによって細胞死を実行するプロテアーゼであって、神経細 胞にお ヽて神経細胞変性又は細胞死が誘導される際に活性化され得る。カスパー ゼー 3又はカスパーゼー 1の活'性ィヒ抑制とは、前記カスパーゼー 3又はカスパーゼー 1の活性ィ匕を抑制することをいう。カスパーゼー 3又はカスパーゼー 1の活性ィ匕抑制 作用は、公知の方法あるいはそれに準じる方法（例えば、 Trends Biochem. Sci. , 19 97年，第 22卷， p. 388-393 ； Biochem. J. , 1997年，第 326卷， p. 1-16 ; Anal. Bioche m. , 1997年，第 251卷， p. 98-102等に記載の方法)や例えば、後述する試験例等に 記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0050] また、本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、神経細胞新生に関与する 。神経細胞新生は、神経細胞に分化する神経芽細胞や神経幹細胞等の増殖を含む 。新しい神経細胞が生まれるには、細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂 時には、遺伝情報をコピーするために DNAが合成さる。 DNAが合成されたかどうか を知る手がかりとなる物質としては、例えば BrdU (ブロモデォキシゥリジン)等が挙げ られる。例えば、 BrdUを体内に注入すると新しく生まれる細胞には、この BrdUが取 り込まれるのでこの BrdUを指標に神経細胞の新生を判定できる。従って、神経細胞 新生作用は、例えば脳神経細胞に取り込まれる BrdUを指標に測定する方法や後述 する試験例等に記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0051] また、本発明に係る HGF蛋白質等又は HGF遺伝子は、ポリグルタミン病原因遺伝 子産物のプロセシングに関与する。プロセシングは、ポリグルタミン病原因遺伝子発 現過程において、該遺伝子の転写産物が細胞内の蛋白分解酵素等により部分分解 等を受け固有の局在性や機能をもつ蛋白質に成熟していく過程をいうが、本発明に おいては該原因遺伝子産物が断片化されることをも含む。ポリグルタミン病では、い ずれの原因遺伝子も原因遺伝子中に存在するポリグルタミンの伸張（30以上）を認 めることを共通の特徴とする。ポリグルタミン病における神経毒性発現には、 CAGの 繰り返しを 30以上有する原因遺伝子産物が断片化されることが含まれる。例えばノヽ ンチントン舞踏病においては、原因遺伝子 (ノヽンチンチン遺伝子）に含まれる CAGの 繰り返しが 30以上に増加したハンチンチン遺伝子が発現される過程においてプロセ シングにより、該原因遺伝子産物 (変異ハンチンチン)が断片化される。断片化され た変異ハンチンチンは、病原性を有し、神経毒性を発現すると考えられている。これ らのことを背景にして、ハンチンチン蛋白質がプロセシングを受けて断片化されたノヽ ンチンチンになる効率が HGF遺伝子により抑制されるかどうかを評価することで、プ ロセシングを抑制する力否かを評価することができる。前記プロセシングの抑制作用 は例えば後述する試験例に記載されて 、る方法等を用いて測定することができる。
[0052] 本発明の使用は（1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドで あって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるい は（2) (ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口) HGF蛋白質の部分ペプチド であって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又 は (ハ）それら DNAと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジ ントな条件下で ノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくは ペプチドをコードする DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制 剤としての使用である。また、上記の（1)あるいは（2)の成分のポリグルタミン病の治 療剤又は発病抑制剤の製造の為の使用である。
[0053] 本発明のポリグルタミン病の治療又は発病抑制方法は哺乳動物に上記の（1)ある いは（2)の成分を投与する方法である。
[0054] さらに、本発明の使用は上記の（1)あるいは（2)の成分の脳室の拡大抑制剤として の使用である。また、上記の（1)あるいは（2)の成分の脳室の拡大抑制剤の製造の 為の使用である。
[0055] 本発明の脳室の拡大抑制方法は哺乳動物に上記の（1)あるいは（2)の成分を投 与する方法である。
[0056] さらに、本発明の使用は上記の（1)あるいは（2)の成分のポリグルタミン病原因遺 伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤としての使用である。また、上記の（ 1)あるいは（2)の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細 胞死抑制剤の製造の為の使用である。
[0057] 本発明のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制方 法は哺乳動物に上記の（1)あるいは（2)の成分を投与する方法である。
[0058] さらに、本発明の使用は上記の（1)あるいは（2)の成分の神経細胞におけるカスバ ーゼ— 3及び Z又はカスパーゼ— 1の活性ィ匕抑制剤としての使用である。また、上記 の（1)あるいは（2)の成分の神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又はカスパー ゼ— 1の活性化抑制剤の製造の為の使用である。
[0059] 本発明の神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性ィ匕抑 制方法は哺乳動物に上記の（1)あるいは（2)の成分を投与する方法である。
[0060] さらに、本発明の使用は上記の（1)あるいは（2)の成分のポリグルタミン病原因遺 伝子産物のプロセシング抑制剤としての使用である。また、上記の（1)あるいは（2) の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤の製造の為の使用 である。
[0061] 本発明のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制方法は哺乳動物に 上記の（1)ある 、は（2)の成分を投与する方法である。
[0062] 本発明の医薬及び方法はポリグルタミン病、例えばノヽンチントン舞踏病、球脊髄性 筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1型、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄 小脳失調症 6型、脊髄小脳失調症 7型、脊髄小脳失調症 12型又は歯状核赤核淡蒼 球ルイ体萎縮症等、好ましくはハンチントン舞踏病の患者への使用が好適である。 実施例
[0063] 以下に試験例を用いて本発明を説明する力 本発明はこれらに限定されるもので はない。 [0064] 〔試験例 1〕
ハンチントン舞踏病遺伝子導入形質転換マウスにおける HGFの作用
1.実験動物
B6CBA—TgN (変異 HDェキソン l) 62GpbZj雌性マウス（Mangiarini Lら， Cell , 1996年，第 87卷， p. 493-506)から摘出した卵巣が移植された B6CBAF1ZJ雌性 マウスは、 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から入手し、 B6CBAF1ZJ雄性 マウスと共に飼育し、交配した。
交配した子は、その尾組織力ゝら抽出したゲノム DNAの PCR解析により遺伝子系を 決定し、 TgN62Gpb遺伝子を有するマウスをノヽンチントン舞踏病モデルマウス R6/ 2マウス（以下、 R6Z2マウスと略記する。）とした。また、前記 R6Z2マウスと同腹で T gN (変異 HDェキソン 1) 62Gpb遺伝子を持たな 、マウスを野生型同腹子マウスとし て使用した。
全ての実験は大阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべて の取り組みはできるだけ動物の負担を少なくし、できるだけ少な 、数の動物を使用し た。
[0065] 2.ベクターの構築、製造及び精製
pRl 9GFPWPRE (Lilley CEら， J. Virol, 2001年，第 75卷， p. 4343- 4356)の GFP (green fluorescent protein;緑色: i:光タンノ ク)遺伝子を、ラット HGFをコードする D NAの全長（ratHGF ;配列番号 5)に KT3タグ（3'— CCGCCCGAGCCAGAGA CT 5， ；配列番号 7)を付加した cDNA (Sun Wら， J. Neurosci, 2002年，第 22卷， p. 6537- 6548)で置換し、 pR19ratHGFKT3WPREを構築した。このベクター（pRl 9ratHGFKT3WPRE)のシークェンスは、 ABI 310キヤピラリーシークェンサ一を 使用する分析により確認した。次いで、 M49細胞を用いて、プラスミド pR19ratHGF KT3WPREの DNAと、 HSV1764/ - 4/pRl 9LacZウィルス DNAとのコトランス フエクシヨンにより相同組換えを行なった。白色プラークを選択し、 3回精製し、 Palmer JAらの方法 (J. Virol, 2000年，第 74卷， p. 5604-5618)に従い、複製能力のないウイ ルスを増殖させた。ラット HGFの発現を、免疫染色によって確認した。該発現を更に ウェスタンプロット法及びラット HGFの酵素抗体免疫測定法 (ELISA)により確認した 。本試験に使用するために、タイター (titer)が l〜2 X 109 pfu (プラーク 'フォーミング •ユニット） ZmLである HSV1764Z—4ZpR19HGFウィルスベクター（HGF発現 ベクター；以下、 HSV—HGFと略記する）と、タイターが 1〜1. 5 X 109pfuZmLで ある HS VI 764Z - 4ZpRl 9LacZウィルスベクター（HGF非発現ベクター；以下、 HSV— LacZと略記する）を調製した。
[0066] 3.脳内への HSV挿入（In vivo)
4週令の R6/2マウスに、ペントバルビタールを 50mg/kg静脈注射して深く麻酔 した。線条体（一 0. 4mm前後， ± 1. 8mm内外側方向、及び 3. 5mm背腹方向） へ注射するために、該マウスを Kopf脳定位固定装置に入れ固定した。 5 /z L HSV — LacZ (5 X 106pfu)又は HSV— HGF (3 X 105pfu)を該マウスに注射した。注射 は、マウスの前記線条体に 10 μ Lのハミルトンシリンジを用いて速度 0. 3 μ L/min で実施された。以下、 HSV— LacZを注射したマウスを R6Z2 (HSV— LacZ)マウス 、 HSV— HGFを注射したマウスを R6Z2 (HSV— HGF)マウスと!/、う。
[0067] 4.組織学的及び免疫組織化学的分析
マウスに深く麻酔し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS)を心臓力 流入してマウス の全身を灌流し、次いで 4%パラホルムアルデヒド含有 PBSで灌流固定した。脳を段 階的に 10%及び 20%シユークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳 を、 20 mの連続切片とした。得られた凍結切片は、ニッスル物質を染色するためク レシル ·バイオレットで染色した。
免疫組織化学的染色は、凍結切片を、 PBSで洗浄し、 10%ャギ又はロバ血清を含 む PBSに 1時間浸漬し、次いで抗体と共に 4°Cでー晚インキュベートすることによって 行なわれた。
[0068] 抗体は、以下を使用した。
(1) NeuN抗体
マウスモノクロナール抗体（Chemicon International社製；カタログ番号 MAB377) を 500倍希釈して使用した。
( 2) c— Met抗体
SP260、ゥサギポリクロナール抗体（Santa Cruz Biotechnology社製；カタログ番 号 sc— 162)を 50倍希釈して使用した。
(3)リン酸化 c Met抗体
ゥサギポリクロナール抗体， （Biosource社製；カタログ番号 44— 888G)を 100倍希 釈して使用した。
(4)活性化カスパーゼ 3抗体
ゥサギポリクロナール抗体 (プロメガ社製;カタログ番号 G748)を 125倍希釈して使 用した。
[0069] 5.酵素抗体免疫測定 (ELISA)法
組織の HGFは、 Sun Wら、 Brain Res Mol Brain Res, 2002年，第 103卷， p. 36- 48に記載のように抗 HGFポリクロナール抗体（Tokushu Meneki製）を用いて測定し た.
[0070] 6.ウェスタンブロッテイング
マウスの脳線条体のホモゲナイズは、 50mMトリス— HCl (pH7. 4)、 150mM N aCl、 1% (WZV)トリトン X— 100、 ImM PMSF (フエ-ルメタンスルホ-ルフルォ ライド;和光純薬工業株式会社製)、 2 /z gZmLアンチノ イン (ペプチド研究所製)、 2 μ g/mLロイぺプチン（ペプチド研究所製）、 2 μ g/mLぺプスタチン（ペプチド研究 所製)を用いて調製された。同量の蛋白質（120 μ gZレーン)を 15%SDS ポリア クリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)に付した。分離後、蛋白質をポリビ-リデ ンジフルオリド（polyvinylidene difluoride； PVDF)膜（BIO—RAD社製）へ電気的に 転写した。転写した PVDF膜は、室温で 2時間、 10質量％スキムミルクでブロッキン グ後、抗カスパーゼ 3抗体 (ゥサギポリクロナール抗体；カタログ番号 C9598, Sigma 社製)又は抗カスパーゼ— 1 (ρ20)抗体 (ゥサギポリクロナール抗体;カタログ sc— 12 18— R, Santa Cruz Biotechnology社製）でブロットした。次いで、抗カスパーゼ— 3 抗体又は抗カスパーゼー 1抗体は、 2次抗体（DakoCytomation社製）をコンジユゲー トしたホースラディッシュ 'ペルォキシダーゼ（HRP)と共にインキュベーションし、製品 説明書に従って ECL reagents (製品番号 RPN2106,アマシャム'バイオサイエンス 社製)で発色させた。
バンドの強度は、 Wayre Rasband氏によって開発された NIH (National Institutes o f Health)イメージソフトウェアを使用して解析された。
[0071] 7.統計的分析
データは平均値士標準偏差 (SD)で示し、統計学的有意差の検定は、フィッシャー の最小有意差法 (PLSD)を用いる分散分析で評価した。
各グループのデータは、解析ソフト Statview 5. 0 (SAS Institute, Inc.製）で分析 した。 p< 0. 05の確率値の違いを統計的有意差ありとした。
[0072] 8. HSV導入に伴う HGF発現
HGFの in vivo発現を、免疫組織ィ匕学的に分析した。 9週令 (HSV— HGF又は H SV— LacZ注射 5週後）において、 HGFの免疫反応性力 R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスと比較して、 R6Z2 (HSV—HGF)マウスの線条体で増加し た（図 la— d)。
ELISAを用いた線条体における HGF蛋白質濃度は以下の通りであった。線条体 における HGF蛋白質濃度は、 HSV— HGFを投与した野生型同腹子マウスでは、 H SV— HGF注射 3曰後に 47. 07± 5. 81ng/gとなり、 R6/2マウスの HGFの約 3 倍に増加した。 9週令において、 R6Z2(HSV— HGF)マウス線条体における HGF 蛋白質濃度は R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスと比較して有意に増 加した。また、 13週令においても、 R6Z2(HSV— HGF)マウス線条体における HG F蛋白質濃度は R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV— LacZ)マウスと比較して増加をみ たが、 9週令と比較するとその程度は低下して 、た（図 le)。
[0073] 9.体重変化
ウィルス挿入後、経時的にマウス体重を測定した。
R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV-LacZ)マウスの体重は、 9週令の野生型同腹子 マウスと比較して有意に減少した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスの体重は、 R6Z2マ ウスの体重と比較して差は認められな力つた（図 2)。
[0074] 10.生存曲線
R6Z2マウス、 R6Z2(HSV—HGF)マウスの生存曲線は、 Kaplan— Meier法に より分析し、 Statview 5. 0 (SAS Institute, Inc.製）を用いてログランク検定（log— r ank test)を行なった。 その結果を図 3に示した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスの寿命は平均 100. 4±2. 6日であり、 R6Z2マウスへの HSV—HGFの注射は、 R6Z2マウスの平均寿命（91 . 3±3. 8日）及び R6Z2(HSV—LacZ)マウスの平均寿命（88. 6 ±3. 8日）を延 長させた。 （図 3)。
[0075] 11.クラスビングテストに対する HGFの作用
クラスビングテストのため、マウスは 30秒間尻尾を持って釣り上げ、フット'クラスピン グ (手足を広げられな!/、姿勢)度をスコア化した。
フット'クラスピング度は Tanaka Mらの方法（Nat. Med,第 10卷， p. 148-154, Epub . 2004年， Jan 2018)に従い、フット'クラスビング時間力 表 1のようにスコア化した。
[0076] [表 1]
Figure imgf000037_0001
[0077] 図 4の R6Z2マウスの姿勢がフット'クラスビングの特徴的な表現型である。野生型 同腹子マウスは、フット'クラスビングの表現型を示さなかった（図 4；野生型同腹子)。 クラスビングスコアの経時変化を図 5に示す。 R6Z2マウス又は R6Z2 (HSV—Lac Z)マウスは 6週令からずっとクラスビングの表現型を示した。 R6Z2 (HSV-HGF) マウスではフット'クラスビングの表現型を 8週令まで示さず、その後も 12週令まで、フ ット 'クラスビング時間 (スコア）の抑制が認められた。
[0078] 12.ロタロッドテストに対する HGFの作用
前肢及び後肢運動機能とバランスの測定のためにロタロッド装置を使用した。ロタ口 ッドテストは、 Ferrante RJらの方法（J. Neurosci, 2000年，第 20卷， p. 4389- 4397)に 従って行なった。すなわち、試験は、ロタロッド装置を用い、 lOrpmで回転する棒の 上に 180秒マウスをのせ、棒から落ちる時間を記録し、分析した。
図 6にロタロッドテストの経時変化を示した。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV—Lac Z)マウスでは野生型同腹子マウスと比較してロタロッドテストにおいてその機能が経 時的に低下した。 R6Z2(HSV—HGF)マウスでは、 R6Z2マウス及び R6Z2(HS V— LacZ)マウスと比較してロタロッドテストの成績が有意に改善された。
[0079] 13.フットプリントテストに対する HGFの作用
フットプリントテストは、 Carter RJらの方法（J. Neurosci, 1999年，第 19卷， p. 3248- 3257)に従って行なった。フットプリントパターンを分析するために、前肢と後肢の足 の運びは、 Carter RJらの方法に従い、歩行の間、赤 (前肢)インクと黒 (後肢)インクで 記録した。動物を、長さ 50cm、幅 10cmの通路にそって歩かせた。歩幅の長さは、 各歩幅間における前肢の動きの平均間隔として測定した。左又は右前肢フットプリン ト、又は後肢のフットプリントの重なりは、歩幅の変化の均一性を測定するために使用 した。
図 7、 8にフットプリントテストの経時変化を示した。 R6Z2マウス及び R6Z2(HSV LacZ)マウスでは野生型同腹子マウスと比較してフットプリントテストにおいてその 歩幅の間隔が経時的に小さくなり、前肢 Z後肢の重なりが経時的に低下し、前肢と 後肢が分離した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスでは、 R6Z2マウスと比較して歩幅の 間隔が大きくなり（図 7)、前肢 Z後肢の重なりの分離が減少した (図 8)。
[0080] 14.組織学的及び免疫組織化学的分析結果
組織学的及び免疫組織化学的分析結果を以下に示した。
(1)脳萎縮と脳重量
発明者らは、脳部分のニッスル染色法を使用して R6Z2マウスにおける脳萎縮に 対する HGFの作用を評価した (図 9)。 9週令において、 R6Z2マウス及び R6Z2 (H SV— LacZ)マウスでは、線条体の萎縮による脳室の拡大が認められた。一方、 R6 Z2 (HSV— HGF)マウスでは、この脳室の拡大が抑制された。 9週令のマウスの脳 重量を図 10に示す。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスの脳重量は、 野生型同腹子マウスの脳重量と比較して減少した。しかし、 R6Z2(HSV— HGF)マ ウスでは、この脳重量の減少が抑制された。
[0081] (2) NeuN陽性細胞数に対する HGFの作用
9週令におけるマウス線条体中の神経細胞の総数を、神経細胞のマーカー（Neu N)を指標に算出した。 NeuNは、 NeuN抗体を用いて免疫組織ィ匕学的染色を行い 検出し（図 11)、検出された細胞数 (NeuN陽性細胞数)をカウントした（図 12)。 R6 Z2マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスにおける NeuN陽性細胞数は、野生型 同腹子マウスと比較して有意に減少した。 R6Z2(HSV— HGF)マウスでは、 R6Z2 マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスと比較して NeuN陽性細胞数の有意な増加 が認められた。
[0082] (3)リン酸化 c Metに対する HGFの作用
R6Z2マウスを用いて、 c MetZHGF受容体が該マウスに発現するかどうか解 明した。免疫組織化学的分析は、 c— MetZHGF受容体が、野生型同腹子マウスと 同様に R6Z2マウスにおいても NeuN陽性細胞に局在することを示した（図 13のリン 酸化 c Met/NeuN)。 HGFで誘発される c Metチロシンリン酸化反応を調べる ために、発明者らは線条体におけるリン酸化 c Metの免疫染色を施行した（図 13) 。 c Metの活性化を反映して!/、るリン酸化 c Met免疫反応性のレベルが R6Z2 ( HSV-HGF)マウスにお 、て、他のグループのマウスのそれと比較して増加した。
[0083] (4)カスパーゼに対する HGFの作用
カスパーゼー 3は、ハンチントン舞踏病で活性化されることが知られている (Zhang Yら， J, Neurochem, 2003年，第 87卷， p. 1184-1192)。発明者らは、 HGFの神経保 護作用を分析するために、 HGFが活性ィ匕カスパーゼー 3の誘導に変化をもたらすか どうかを調べた。発明者らは活性ィ匕カスパーゼ— 3の免疫染色を用いて、線条体に おけるカスパーゼの活性ィ匕に対する HSV—HGFの作用を評価した。
9週令マウスにおける免疫組織ィ匕学的分析の結果は、以下のとおりであった。すな わち活性化カスパーゼー 3は、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスの線 条体（主として NeuN陽性細胞；図 14の活性ィ匕カスパーゼ 3ZNeuN)に認められ た力 野生型同腹子マウスの線条体には認められな力つた。 R6/2 (HSV-HGF) マウスでは、該活性化カスパーゼ 3の免疫反応性が減少した (図 14)。
[0084] 活性化カスパーゼー 3の定量分析のために、カスパーゼー 3のウェスタンブロット解 析を施行した (図 15)。 R6Z2(HSV— LacZ)マウスにおいて、カスパーゼー 3の顕著 な活性ィ匕を認めた。一方、 R6/2 (HSV— HGF)マウスでは、カスパーゼ— 3の活性 化が R6Z2マウスや R6Z2 (HSV-LacZ)マウスに比べ抑制された。ウェスタンブロ ット分析における活性ィ匕カスパーゼー 3のバンド強度を定量的に測定すると、 R6Z2 (HSV-HGF)マウスでは、カスパーゼ 3の活性化が R6Z2 (HSV—LacZ)マウ スを 10%とすると、その 23%にまで抑制されていた（図 16)。カスパーゼ一 3の活性 の測定結果も同様であった（図 17)。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウス では、野生型同腹子マウスに比べカスパーゼ 3の活性は高値を示した力 R6/2 ( HSV— HGF)マウスでは野生型同腹子マウスと同レベルまでカスパーゼー 3の活性 が抑制された。
[0085] また、カスパーゼ 1は、ハンチントン舞踏病患者及び R6Z2マウスの脳で活性ィ匕 されることが知られている（Zhang Yら、 J Neurochem, 2003年、第 87卷、 p. 1184-1192 )。そこで、 R6/2マウス線条体におけるカスパーゼ 1のウェスタンブロットを検討し た（図 18)。カスパーゼ一 1のウェスタンブロット分析は、プロフォームとアクティブフォ ームを認識する抗体を用いて行なった。ウェスタンプロット分析における活性ィ匕カス パーゼー 1のバンド強度（R6Z2 (HSV— LacZ)マウスに対する0 /0)は、 R6Z2 (HS V-HGF)マウス線条体で 40%にまで抑制された (図 19)。カスパーゼー 1の活性の 測定結果も同様であった（図 20)。 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV—LacZ)マウスで は、野生型同腹子マウスに比べカスパーゼ 1の活性は高値を示した力 R6/2 (H SV— HGF)マウスでは野生型同腹子マウスと同レベル近くまでカスパーゼー 1の活 性が抑制された。
[0086] 〔試験例 2〕
ハンチントン舞踏病遺伝子導入形質転換マウスにおける脳神経細胞の新生に対す る HGFの作用
試験例 1と同様に作成した R6Z2マウス、 R6Z2(HSV— LacZ)マウス、 R6Z2( HS V— HGF)マウス及び野生型同腹子マウスを用 ヽた。
1. Ki—67細胞に対する HGFの作用
脳室下帯（subventricular zone； SVZ)及び線条体での神経細胞増殖を検討した。 増殖細胞のマーカーとして Ki—67を選択し、 Ki—67の免疫染色を行い、脳室下帯 及び線条体での Ki—67陽性細胞数を測定した。線条体において、 R6Z2 (HSV- HGF)マウスでの Ki 67陽性細胞数は、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ) マウスにおけるそれと比較して有意に増加した。（図 21) . [0087] 2. BrdU取り込みに対する HGFの作用
5週令マウスに BrdU (4 X 75mgZkg 腹腔内投与，生理食塩液に溶解、 2時間毎 に合計 4回）を投与し、 BrdU注射 28日後（9週令）に屠殺した。マウスに麻酔し、心 臓力 PBSを流入してマウスの全身を灌流し、次 、で 4%パラホルムアルデヒド含有 PBSで灌流固定した。脳を段階的に 10%及び 20%シユークロースで凍結保護した 後、凍結し、その後凍結した脳を、 20 mの連続切片とした。
BrdU免疫組織化学的染色のために、凍結切片は、 1N塩酸で 60°C、 30分インキ ュペートし、 10%ャギ血清を含む PBSに 1時間浸漬した。その後、凍結切片は、抗 B rdU (ラットモノクロナール抗体； Oxford Biotechnology社製；カタログ番号 OBT003 0)と共に 4°Cで 36時間インキュベートした。二重染色は蛍光色素アレクサ 488と蛍光 色素アレクサ 546をコンジュゲートした 2次抗体（Molecular Probes社製）で視覚化し 、かつ切片は TO PRO - 3 (Molecular Probes社製）で核を対比染色した。蛍光画 像は、 Zeiss LSM— 510共焦点蛍光顕微鏡で検出した。
結果：
脳室下帯及び線条体における BrdU陽性細胞数を測定した結果、脳室下帯にお いて、各群間に BrdU陽性細胞数の有意な差は認められな力つた。しかし、線条体に おいて、 R6Z2(HSV—HGF)マウスの BrdU陽性細胞数は、 R6Z2マウス及び R6 Z2 (HSV— LacZ)マウスと比較して有意に増加した（図 22)。これらのデータは、 H SV— HGF処置により神経細胞増殖が増強されることを示す。
[0088] 3.ネスチンと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
ネスチン（Nestin)は、神経幹細胞のマーカーである。ネスチンは、試験例 1におけ る免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、ネスチン抗体 [マウスポリク ロナール抗体（BD Biosciences社製；カタログ番号 556309)を 100倍希釈して使用 ]を用いた。
ネスチンと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。脳室下帯及び線条体に おいて、 R6Z2 (HSV—HGF)マウスにおけるネスチンと BrdUの両者が陽性である 細胞は、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスのそれと比較して有意に増 加した（図 23)。 [0089] 4.ダブルコルチンと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用 ダブルコルチン（doublecortin;DCX)は遊走神経芽細胞のマーカーである。 DCX は、試験例 1における免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、 DCX 抗体 [ャギポリクロナール抗体（Santa Cruz Biotechnology社製；カタログ番号 sc— 8 066)を 100倍希釈して使用]を用いた。
DCXと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV—HGF)マウ スにおける DCXと BrdUにおける両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体に お!、て、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスのそれと比較して有意に増 加した（図 24)。
[0090] 5. PSA— NCAMと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
PSA— NCAMは、遊走神経芽細胞のマーカーである。 PSA— NCAMは、試験 例 1における免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、 PSA— NCAM 抗体 [マウスモノクロナール抗体 (AbCys S. A.社製；カタログ番号 AbC0019)を 80 0倍希釈して使用]を用いた。
PSA— NCAMと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV— H GF)マウスにおける PSA— NCAMと BrdUの両者が陽性である細胞は、脳室下帯 及び線条体にぉ 、て R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV— LacZ)マウスのそれと比較し て有意に増加した（図 25)。
[0091] 6. j8 IIIチューブリンと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
β IIIチューブリンは、神経細胞の初期〜分ィ匕型マーカーである。 β IIIチューブリン は、試験例 1に記載の免疫組織ィ匕学的染色に従って染色した。抗体としては、 jS III チューブリン抗体 [TuJ 1、マウスモノクロナール抗体 (R&Dシステムズ社製；カタログ 番号 MAB1195)を 200倍希釈して使用]を用いた。
β IIIチューブリンと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV— HGF)マウスにおける 13 IIIチューブリンと BrdUの両者が陽性である細胞は、脳室下 帯及び線条体にぉ 、て、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV—LacZ)マウスのそれと比 較して有意に増加した（図 26)。
[0092] 7. NeuNと BrdUの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用 NeuNは分化した神経細胞のマーカーである。 NeuNは、試験例 1に記載の抗体 を用い、試験例 1と同様に免疫組織ィ匕学的染色を行なった。
NeuNと BrdUの両者が陽性である細胞数を測定した。 R6Z2 (HSV— HGF)マウ スにおける NeuNnと BrdUの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体にお V、て、 R6Z2マウス及び R6Z2 (HSV-LacZ)マウスのそれと比較して有意に増加 した（図 27)。
[0093] 8.リン酸化 c— Metとネスチンの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用 神経細胞新生における HGFの役割を検討するために、ネスチン陽性細胞にお!ヽ て、 HGFが c— Metのチロシンリン酸ィ匕反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン 酸化 c Met及びネスチンは、試験例 1に記載の抗体を用い、試験例 1と同様に免疫 組織ィ匕学的染色を行なった。
R6Z2 (HSV— HGF)マウスでは、ネスチンとリン酸化 c Metの両者が陽性であ る細胞力 他のグループと比較して有意に増加した（図 28)。
[0094] 9.リン酸化 c— Metと DCXの両者が陽性である細胞に対する HGFの作用
神経細胞新生における HGFの役割を検討するために、 DCX陽性細胞にぉ 、て、 HGFが c— Metのチロシンリン酸ィ匕反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸 ィ匕 c Met及び DCXは、上記と同様に免疫組織ィ匕学的染色を行なった。
R6Z2 (HSV— HGF)マウスでは、リン酸化 c Metと DCXの両者が陽性である細 胞カ 他のグループと比較して有意に増加した（図 29)。
[0095] 〔試験例 3〕
HGF蛋白質をコードする DNA含有ベクターの脊髄投与による脊髄における HGF の発現
1.ベクターの構築、製造及び精製
(1) HGF蛋白質をコードする DNA挿入 HSV— 1ベクター
HGF遺伝子を挿入した I型単純へルぺスウィルス (HSV- 1)ベクターとしては、試 験例 1で作成した HSV1764Z— 4ZpRl 9HGFウィルスベクターを用 、た。該べク ターを以下、 HSV— HGFと略記する。
(2) HGF蛋白質をコードする DNA挿入 AAV— 2ベクター及び AAV— 4ベクター AAV Helper -Free System (Stratagene, USA;カタログ番号 # 240071)キット中 に含まれる pCMV— MCSのマルチクロー-ングサイトにラット HGF— KT3 [ラット H GFをコードする DNA (配列番号 5)の C末端に KT3タグ配列（3，—CCGCCCGAG CCAGAGACT— 5，；配列番号 7)を付加したもの； Sun, Funakoshiら， J. Neurosci. , 2002年，第 22卷， p. 6537-6548]を挿入した。挿入が正しいことをシークェンスによ り確認した。 Notlサイトでベクターを 2つのフラグメントに開裂し、ラット HGF— KT3 含む断片を pAAV— MCSを同様にして開列したものと入れ替えることで、 AAV2— HGF作成のための pAAV—ラット HGF—KT3を作製した。 AAV4—HGF作成の ためには pAAV— MCSを AAV4用に改変したものを用いることで同様に処理し、 p AAV4—ラット HGF— KT3を作製した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000年，第 97 卷， p. 3428-3432) o次いで上記キットに含まれる HEK193細胞に、ラット HGF— KT 3が挿入された pAAV—MCSをキットの使用説明書に従い導入した。該細胞におけ るラット HGF—KT3の発現とその活性は、 ELISA法及び MDCK細胞に対する散乱 分析法により確認した。得られたベクターを AAV2— HGF及び AAV4— HGFと略 記する。
[0096] 2.脊髄実質への投与による HGFの発現
成体雌性 SDラットの腰髄部の脊髄実質に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液 (H SV-HGF： 3 X 107pfu、 3 X 107pfu； AAV2— HGF： 3 X 10npfu；又は AAV4 - HGF : 3 X 10npfu) 5 μ Lを定位注射した。その 5日後に、動物をペントバルビター深 麻酔下に屠殺した。速や力に脊髄を取り出し、脊髄の上部 (upper spinal;吻側; U)、 中部（middle spinal;中央部； M)及び下部（lower spinal;尾側； L)の 3つの領域に 分け、それぞれの脊髄断片を、前記の方法でホモゲナイズした。 ELISA法にて HG F蛋白質量を測定した。
その結果を図 30に示す。ベクターを腰髄部の脊髄実質に注射すると、注射部位だ けでなく脊髄の吻側、中央部においても HGFの発現が認められた。発現の強度は、 尾側 (腰髄を含む） > =中央部 >吻側であった。なお、 HSV— HGFでは、濃度依存 的に HGFの発現量が増加した。
[0097] 3.脊髄腔への投与による HGFの発現 成体雌性 SDラットの腰髄部の脊髄腔に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液 (HS V— HGF: 3 X 107pfu、 3 X 107pf u； AAV2 - HGF： 3 X 10upfu;又は AAV4— H GF : 3 X 10npfu) 5 μ Lを定位注射した。その 5日後に、上記脊髄実質への投与に おける方法と同様に、脊髄を取り出し、脊髄の吻側、中部及び尾側の HGF蛋白質量 を測定した。
その結果を図 31に示す。ベクターを腰髄部の脊髄腔に注射すると、注射部位だけ でなく脊髄の吻側、中央部においても HGFの発現が認められた。発現の強度は、脊 髄実質への注射より HGFの発現量は低かったが、脊髄のいずれの部位 [尾側 (腰髄 を含む）、中央部、吻側]において、ほぼ同じ程度であった。即ち、脊髄腔への投与 では、広範囲な神経細胞への HGFの供給が可能であった。これは、脊髄実質にベ クタ一を投与した場合に比べ、脊髄液により、ベクターが脊髄全体に拡散されたため であると考えられた。なお、 HSV— HGFでは、濃度依存的に HGFの発現量が増加 した。
〔試験例 4〕
変異 HDェキソン 1遺伝子産物のプロセシングに対する HGFの作用
試験例 1と同様に作成した R6Z2マウス、 R6Z2(HSV— LacZ)マウス、 R6Z2( HSV— HGF)マウス及び野生型同腹子マウスを用いた。各マウスを 9週齢で屠殺し 、試験例 1のウェスタンブロッテイングの項に記載の方法と同様に線条体ホモゲナイ ズを調製した後、 SDS— PAGEで蛋白質を分離し、分離した蛋白質を PVDF膜に 転写した。転写した PVDF膜は、室温で 2時間、 10質量％スキムミルクでブロッキン グ後、抗ハンチンチン抗体でブロットした。抗ハンチンチン抗体は、ハンチンチン蛋 白質の C末端部位を認識するャギポリクロナール抗体 (Santa Cruz社製；カタログ番 号 sc— 8678)を 100倍希釈したものを使用した。次いで、 2次抗体（DakoCytomation 社製）をコンジュゲートしたホースラディッシュ ·ペルォキシダーゼ（HRP)と共にイン キュベーシヨンし、製品説明書に従って ECL reagents (製品番号 RPN2106,アマ シャム ·バイオサイエンス社製)で発色させた。
バンドの強度は、 Wayre Rasband氏によって開発された NIH (National Institutes o f Health)イメージソフトウェアを使用して解析された。 [0099] ウェスタンブロット分析の結果を図 32に示す。野生型同腹子では、ハンチンチン蛋 白質が発現されたが、ハンチンチン蛋白質が断片化された C末端フラグメントは殆ど 検出されなかった。 R6Z2では野生型同腹子に対して、ハンチンチン蛋白質に相当 する部位にバンドは殆ど認められず、該蛋白質が断片化された C末端フラグメントが 強く検出された。このことは、 R6Z2では変異 HDェキソン 1遺伝子産物のプロセシン グによりハンチンチン蛋白質が断片化されることを示している。 HSV— LacZ投与群 も R6Z2と同様であった。一方、 HSV— HGF投与群では、野生型同腹子における ハンチンチン蛋白質と同位置にバンドが検出された力 ハンチンチン蛋白質の C末 端フラグメントの発現は強く抑制された。
[0100] ウェスタンブロット分析における C末端フラグメントのバンド強度を、 Wayre Rasband 氏によって開発された NIH (National Institutes of Health)イメージソフトウェアを使 用して定量解析した。その結果を図 33に示す。定量解析の結果、 HSV— HGFを投 与した R6Z2群では、 HSV— LacZ (コントロールベクター）を投与した R6Z2群を 1 00%とした時の 30%未満に C末端フラグメントへの断片化が抑制された。この結果 は、 HGFが変異 HDェキソン 1遺伝子産物のプロセシングを抑制させることを示すも のである。本結果からも、 HGFはハンチントン舞踏病の発病を抑制させることが明ら カゝとなった。
産業上の利用可能性
[0101] 本発明の治療剤又は発病抑制剤は、ポリグルタミン病の治療又は発病抑制のため の薬剤として有用である。

Claims

請求の範囲
[1] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病の 治療剤又は発病抑制剤。
[2] 有効成分が、（ィ) HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口) HGF蛋白質の部分 ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も しくはペプチドをコードする DNAであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の治 療剤又は発病抑制剤。
[3] HGF蛋白質をコードする DNA力 （a)配列番号 1、 2又は 5で表される塩基配列か らなる DNA又は (b)前記 (a)の塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有 する蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 2項 記載の治療剤又は発病抑制剤。
[4] DNAが、 I型単純へルぺスウィルス (HSV- 1)ベクター、アデノウイルスベクター又 はアデノ随伴ウィルスベクターに組み込まれて 、ることを特徴とする請求の範囲第 2 項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[5] 有効成分が、（ィ) HGF蛋白質もしくは（口) HGF蛋白質の部分ペプチドであって H GF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴 とする請求の範囲第 1項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[6] HGF蛋白質が、（a)配列番号 3、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一又は (b)前 記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする 請求の範囲第 5項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[7] ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症 1型 、脊髄小脳失調症 2型、脊髄小脳失調症 3型、脊髄小脳失調症 6型、脊髄小脳失調 症 7型、脊髄小脳失調症 12型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等よりなる群か ら選択される少なくとも 1の疾患であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の治療 剤又は発病抑制剤。
[8] ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病であることを特徴とする請求の範囲第 1項記 載の治療剤又は発病抑制剤。
[9] 治療剤又は発病抑制剤が、ポリグルタミン病の病変部位への局所投与用であること を特徴とする請求の範囲第 1項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[10] 局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする請求の範囲第 9項記載の治療剤 又は発病抑制剤。
[11] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とする脳室の拡大抑制剤。
[12] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝子 産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤。
[13] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とする神経細胞におけるカスパー ゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性ィヒ抑制剤。
[14] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝子 産物のプロセシング抑制剤。
[15] 治療又は発病抑制が、脳室の拡大抑制によるものであることを特徴とする請求の範 囲第 1項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[16] 脳室の拡大が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物による線条体神経細胞変性又は 細胞死によるものであることを特徴とする請求の範囲第 15項記載の治療剤又は発病 抑制剤。
[17] 線条体神経細胞変性又は細胞死がカスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の 活性ィ匕によるものであることを特徴とする請求の範囲第 16項記載の治療剤又は発病 抑制剤。
[18] 治療又は発病抑制が、神経新生によるものであることを特徴とする請求の範囲第 1 項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[19] 治療又は発病抑制が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制による ものであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の治療剤又は発病抑制剤。
[20] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤の製造の為の使用
[21] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを哺乳動物に投与するポリグルタミン病の治療又は発病抑制方 法。
[22] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAの脳室の拡大抑制剤の製造の為の使用。
[23] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを哺乳動物に投与する脳室の拡大抑制方法。
[24] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAのポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細 胞死抑制剤の製造の為の使用。
[25] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを哺乳動物に投与するポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神 経細胞変性又は細胞死抑制方法。
[26] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAの神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1 の活性ィヒ抑制剤の製造の為の使用。
[27] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを哺乳動物に投与する神経細胞におけるカスパーゼー 3及び Z又はカスパーゼー 1の活性化抑制方法。
[28] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAのポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤の製 造の為の使用。
[29] (1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白 質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋 白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードす る DNAを含む DNAを哺乳動物に投与するポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロ セシング抑制方法。
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