JP2004517620A

JP2004517620A - ダイダロス（Ｄａｅｄａｌｏｓ）による神経発生の調節方法

Info

Publication number: JP2004517620A
Application number: JP2002556231A
Authority: JP
Inventors: ブルースエイ．モーガン
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2001-10-25
Publication date: 2004-06-17
Also published as: WO2002056027A2; US20020177145A1; US6759201B2; WO2002056027A3; EP1328816A2

Abstract

本発明は、ダイダロスポリペプチド、ダイダロスポリペプチドをコードする核酸、ならびにダイダロスポリペプチドおよび核酸を用いる方法を提供する。本発明はまた、細胞内のダイダロスの発現を検出および／または調節することで神経細胞分化を診断する方法、治療する方法、検出する方法、および制御する方法についても提供する。

Description

【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／２４３１１０号によって得られる利益に関する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ダイダロス（Ｄａｅｄａｌｏｓ）核酸、ダイダロスポリペプチド、および他の関連分子、ならびにこれらを作製および使用する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
生物体の一生を通じて再生を必要とする組織の維持は、それほど分化が進んでいない幹細胞が非対称に分裂して自身で増殖すること、ならびに後に分化して臓器を再増殖する娘細胞を発生することで達成されることが多い。成熟動物で性質が最も詳細に明らかにされている幹細胞は、造血系を再生する幹細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）の産生または増殖、およびこれに続く、これに由来する発生可能性を漸進的に制限する前駆細胞の増殖は部分的にはイカロス（Ｉｋａｒｏｓ）遺伝子ファミリーの遺伝子産物による調節を受ける（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓら、（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１５５）。イカロス、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）、およびヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）は、過去に同定されたイカロス遺伝子ファミリーの成分である。これらは、保存されたジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質をコードしており、造血系列に進行中の細胞内においてさまざまなレベルで発現されている（Ｋｅｌｌｅｙら、（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：５０８）。イカロスに変異が生じると、造血幹細胞、ならびにリンパ球分化の後期に異常が生じる（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓら、（１９９４）Ｃｅｌｌ７９：１４３）が、アイオロスに変異が生じると、リンパ系列に限定された異常、特にＢ細胞を生じる下位系列に異常が生じる（Ｗａｎｇら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ９：５４３）．
【０００４】
イカロスファミリーのタンパク質を共局在化させた研究から、これらのタンパク質が、リンパ球の系統特異的な遺伝子に結合すること、また外因性シグナルに応じて、続く遺伝的に抑制された状態と活性状態との間の速やかな移行の仲介役として機能する可能性があることが示唆されている。このモデルを支持して、イカロスとアイオロスの両方が結合して少なくとも２種の異なるクロマチンリモデリング複合体となる（Ｋｉｍら、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１０：３４５）。これらのうちの一つにはＭｉ−２およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）があり、閉じた状態のクロマチンと結合することができる。このほかには、開状態のクロマチンに結合した状態のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の成分がある。イカロスファミリーのタンパク質は、Ｔ細胞成熟時における増殖反応も調節する。これは、複製機構とＤＮＡとの接触の調節によると考えられている（Ａｖｉｔａｈｌら、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１０：３３３）。以上の結果から、リンパ系列を介した進行中におけるイカロスファミリーのタンパク質の組み合わせ発現の変化が、リンパ球発生の連続した段階に関与する遺伝子発現の変化を調節しているという一般モデルが想定されている（Ｋｅｌｌｅｙら、（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：５０８〜５１５）。
【０００５】
発明の概要
本発明は部分的には、イカロスファミリーのタンパク質であるダイダロスが、神経細胞成熟のさまざまな段階で異なる発現パターンを示すという知見に基づく。ダイダロスを強制発現させると、神経細胞分化が影響を受けることがわかっている。
【０００６】
本発明は一般に、細胞（例えば神経細胞、例えば神経前駆細胞、例えば細胞試料に含まれる神経前駆細胞）の特徴を決定する方法、またはこれらを検出する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：細胞を提供する段階；および細胞内におけるダイダロス発現の有無を判定する段階（ダイダロスの発現が神経前駆細胞の存在の指標となることで、細胞（例えば神経前駆細胞）の特性の決定および検出が可能となる）。この方法は、細胞を単離する段階、または精製する段階をさらに含む場合がある。
【０００７】
一つの態様では、このような細胞試料は非神経細胞を含む。非神経細胞は任意の種類の細胞の場合がある。非神経細胞は、被験者の組織から細胞試料を抽出することによって細胞試料内に含まれる場合がある（抽出によって不均一な細胞集団が得られる）。細胞試料に含まれる非神経細胞の例には、繊維芽細胞、上皮細胞、および造血細胞などがある。この方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【０００８】
一つの態様では、ダイダロスｍＲＮＡの有無は細胞内において検出される。当業者に周知のさまざまな手法を用いてダイダロスｍＲＮＡを検出することができる。例えばダイダロスｍＲＮＡは、ダイダロスｍＲＮＡとハイブリッドを形成する核酸プローブを用いて検出することができる。この検出法では、検出可能な標識（例えば放射性標識または蛍光標識）を選択的に核酸プローブに結合させることができる。別の例では、ダイダロスｍＲＮＡはＰＣＲで検出される。ＰＣＲによる検出は、核酸プローブ（例えば標識された核酸プローブ）とＰＣＲ産物とのハイブリッドを形成させる段階をさらに含む場合がある。
【０００９】
一つの態様では、ダイダロスタンパク質の有無が検出される。ダイダロスタンパク質は、当業者に周知のさまざまな手法で検出することができる。例えば、ダイダロスタンパク質に結合する抗体を使用することができる。検出可能な標識（例えば放射性標識または蛍光標識）を、ダイダロスタンパク質に結合する抗体に結合させることができる。他の既知のタンパク質検出法には、ウエスタンブロット免疫アッセイ法、免疫組織学的方法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、または固相支持体（例えばラテックスビーズ）を用いる免疫アッセイ法などがある。
【００１０】
ダイダロスの発現をマーカーとして用いることで、細胞の特性解析、検出、分離、または精製を行うことができる。
【００１１】
別の態様では、この方法は、細胞試料中に存在する少なくとも一種の非神経前駆細胞から神経前駆細胞を分離する段階をさらに含む。この方法では、神経前駆細胞を、神経前駆細胞中に検出されるダイダロスの発現に基づいて他の細胞と分離することができる。
【００１２】
別の態様では、ダイダロスの発現は、ダイダロスの制御領域が、ダイダロス以外のタンパク質（例えばレポーター分子、例えばｌａｃＺ、または蛍光性産物、例えば緑色蛍光タンパク質）をコードする核酸と機能的に共役する細胞を提供することで検出される。発現を指標として、系内（例えば、マウス、線虫、魚類（例えばゼブラフィッシュ）、例えば、トランスジェニック動物（例えばトランスジェニックのマウス、線虫、またはゼブラフィッシュ））の発生を追跡することができる。
【００１３】
別の局面では、本発明は、神経前駆細胞を細胞集団から分離する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：細胞集団（例えば神経前駆細胞および非神経前駆細胞を含む２個またはそれ以上の細胞）を提供する段階；神経前駆細胞および非神経前駆細胞中におけるダイダロスの発現を評価する段階；およびダイダロス発現を元に神経前駆細胞を非神経前駆細胞から分離する段階。この細胞集団は神経組織（例えばグリア細胞）に由来する場合がある。またこの細胞集団は、神経細胞および非神経細胞を含む場合がある。
【００１４】
一つの態様では、神経前駆細胞は、非神経前駆細胞と比較してダイダロスの高レベルの発現を示す。
【００１５】
一つの態様では、神経前駆細胞および非神経前駆細胞で作られるダイダロスｍＲＮＡのレベルが評価される。ダイダロスｍＲＮＡのレベルは、当業者に周知のさまざまな手法で評価することができる。一例では、ダイダロスｍＲＮＡのレベルは、ダイダロスｍＲＮＡとハイブリッドを形成する核酸プローブを用いて評価される。この核酸プローブは、核酸プローブに結合させた検出可能な標識を選択的に含む場合がある。別の例では、ダイダロスｍＲＮＡは、本明細書に記載されるようにＰＣＲで検出される。またダイダロスの発現は、ダイダロスタンパク質の発現のレベルを、神経前駆細胞および非神経前駆細胞で検出することで評価される場合がある。一例では、ダイダロスタンパク質は、ダイダロスタンパク質に結合する抗体により検出される。このような抗体は、これに結合させた検出可能な標識を選択的に含む場合がある。他の既知のタンパク質検出法には、ウエスタンブロット免疫アッセイ法、免疫組織学的方法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、または固相支持体（例えばラテックスビーズ）を用いる免疫アッセイ法などがある。
【００１６】
別の局面では、本発明は、細胞の神経形成段階を特定する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：細胞を提供する段階；細胞内におけるダイダロス発現の有無を評価する段階；および細胞内におけるダイダロス発現の有無を元に細胞の神経形成段階を特定する段階。
【００１７】
一つの態様では、細胞は、細胞内において検出されるダイダロスの発現を元に神経前駆細胞であると同定される。例えば、細胞内において検出されるダイダロスの高レベルの発現を元に、細胞が神経前駆細胞であると判定することができる。別の例では、細胞は、細胞内において検出されるダイダロス発現の非存在を元に、分化した細胞であると判定することができる。
【００１８】
一つの態様では、この方法は、神経形成段階を元に第一の細胞を、異なる神経形成段階を特徴とする第二の細胞から単離する段階をさらに含む。
【００１９】
細胞内におけるダイダロス発現の有無は、本明細書に記載されているように、当業者に周知の手法で評価することができる。例えば、細胞内において作られるダイダロスｍＲＮＡのレベルは、例えば核酸プローブを用いることで、および／またはＰＣＲ解析で評価することができる。別の例では、ダイダロスの発現のレベルは、細胞内において作られるダイダロスタンパク質を検出することで評価することができる。ダイダロスタンパク質は、抗体（例えば抗体に結合させた検出可能な標識を有する抗体）を用いることで、または本明細書に記載されている他の既知の方法で検出することができる。発現は、ダイダロス調節領域の制御下にあるレポーター産物（例えばｌａｃＺまたはＧＦＰなどの蛍光産物）の発現を検出することで評価することができる。
【００２０】
別の局面では、本発明は、細胞（例えば神経前駆細胞もしくは神経幹細胞）を非分化状態に維持する方法、または細胞（例えば神経前駆細胞または神経幹細胞）の分化を阻害する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：ダイダロスの活性または発現を調節する（例えば上昇させる）ことで細胞を非分化状態に維持する段階。ダイダロスの発現は、さまざまな手法で上昇させることができる。ダイダロスの発現を上昇させる化合物は、選択的に細胞に提供することができる。ダイダロス発現を上昇させることが可能な化合物の例には以下のようなものがある：（１）ダイダロスポリペプチド、その断片、または類似体；（２）ダイダロスポリペプチド、その断片、または類似体をコードする核酸；および（３）細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる薬剤。（２）の核酸は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはゲノムＤＮＡを含む場合がある。核酸は、ダイダロスのコード領域、調節領域（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子に由来するプロモーターなど）、および例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子に由来するエンハンサーのすべてまたは一部を含む場合がある。（３）の薬剤は、細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現の上昇を引き起す場合がある。薬剤は、内因性ダイダロス遺伝子の発現を、例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子のプロモーターに結合させることで、またはダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の調節配列を改変することで直接または間接的に上昇させる場合がある。
【００２１】
ダイダロスの発現を上昇させることが可能な薬剤の例には以下のようなものがある：ダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体；（例えばダイダロスとダイダロス結合パートナー（例えばＤＮＡ、または別のイカロスファミリーのタンパク質）との結合を上昇させたり安定化させたり、またはダイダロスの核移行を亢進させたりすることで）ダイダロス活性を上昇させるダイダロスのペプチドもしくはタンパク質作用物質；例えばダイダロス遺伝子のプロモーター領域に結合することでダイダロス発現を上昇させる小分子；抗体（例えばダイダロスに結合して安定化させたり、またはダイダロスとダイダロス結合パートナー（例えば、ＤＮＡまたは別のＤＮＡ結合タンパク質、例えばダイダロスとイカロス因子、アイオロス因子、またはヘリオス因子とのホモ二量体またはヘテロ二量体の形成）との結合を補助したりする抗体）；またはダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の場合がある。このヌクレオチド配列は以下を含む場合がある：ダイダロスのコード領域；プロモーター配列（例えばダイダロス遺伝子または別の遺伝子のプロモーター配列）；エンハンサー配列；非翻訳調節配列（例えば５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列。別の好ましい態様では、ダイダロスタンパク質のレベルは、内因性ダイダロス遺伝子の発現レベルを上昇させること（例えばダイダロス遺伝子の転写を上昇させたり、もしくはダイダロスｍＲＮＡの安定性を上昇させたりすること）で上昇する。好ましい態様では、ダイダロス遺伝子の転写は以下の操作によって上昇する：内因性ダイダロス遺伝子の調節配列の改変（例えば正の調節配列（エンハンサー、もしくは転写活性化因子のＤＮＡ結合部位など）を付加すること；負の調節因子（転写抑制因子のＤＮＡ結合部位など）を欠失させること、および／または内因性調節配列、またはその内部配列を別の遺伝子と置換すること）。これによってダイダロス遺伝子のコード領域によって効率的な転写を可能となる。
【００２２】
好ましい態様では、ダイダロスの発現または活性は、神経成長因子（例えば外因性または内因性の神経成長因子）の存在下で上昇する。
【００２３】
別の局面では、本発明は、被験者における神経細胞関連疾患のリスクの有無を判定する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：被験者の細胞内におけるダイダロス発現を評価する段階；および細胞内におけるダイダロスの発現の有無を元に被験者の神経細胞関連疾患のリスクを判定する段階。この方法では、ダイダロスの発現は、神経組織に由来する細胞試料中で評価することができる。
【００２４】
一例では、神経細胞関連疾患は増殖性疾患（例えば癌）である。
【００２５】
この方法により、リスクのない被験者の細胞内におけるダイダロス発現レベルと比較した際の被験者の細胞内におけるダイダロス発現の上昇を元に被験者における神経細胞関連疾患のリスクの有無を判定することができる。被験者の細胞内におけるダイダロス発現を評価する際は、発現レベルの比較は、同じ種類の細胞（例えば健常者、例えばリスクがないと考えられている者、または神経細胞関連疾患がないと考えられている者の神経細胞）を対象に行われる場合がある。被験者の細胞内におけるダイダロスの発現は、本明細書に記載されている当業者に周知の手法（例えばダイダロスｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の検出）で評価することができる。
【００２６】
別の局面では、本発明は、細胞の分化を制御する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：細胞を提供する段階；および細胞内におけるダイダロスの発現を調節することで細胞の分化を制御する段階。細胞内におけるダイダロスの発現はインビトロまたはインビボで調節することができる。
【００２７】
一つの態様では、このような細胞は神経前駆細胞である。
【００２８】
一つの態様では、ダイダロスの発現を調節することは、細胞（例えば神経前駆細胞）の神経分化を制御する場合がある。
【００２９】
一つの態様ではダイダロスの発現は上昇する。ダイダロスの発現の上昇は、細胞の分化および／または増殖に影響する場合がある（例えばダイダロスの発現上昇は神経細胞分化を阻害する場合がある）。ダイダロスの発現は、当業者に周知のさまざまな手法で上昇させることができる。化合物が、ダイダロスの発現を上昇させる可能性のある細胞に選択的に提供される場合がある。ダイダロスの発現を上昇させる可能性のある化合物の例には以下のようなものがある：（１）ダイダロスのポリペプチド、その断片、もしくは類似体；（２）ダイダロスのポリペプチド、その断片、もしくは類似体をコードする核酸；および（３）細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる薬剤。（２）の核酸は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはゲノムＤＮＡを含む場合がある。核酸は、ダイダロスのコード領域、調節配列（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子に由来するプロモーターなど）、（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子に由来する）エンハンサーのすべてまたは一部を含む場合がある。（３）の薬剤は、細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる場合がある。薬剤が、内因性ダイダロス遺伝子の発現を、例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子のプロモーターに結合することで、またはダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の調節配列を変化させることで直接もしくは間接的に上昇させることがある。
【００３０】
別の態様では、ダイダロスの発現を低下させる化合物が細胞に提供される。ダイダロスの発現の低下は、細胞の分化および／または増殖に影響を及ぼす場合がある（例えばダイダロスの発現の低下は神経細胞分化を促進する場合がある）。ダイダロスの発現は、当業者に周知のさまざまな手法で低下させることができる。ダイダロスの発現を低下させる化合物を細胞に選択的に提供することができる。一例では、化合物（例えば、ダイダロスｍＲＮＡに結合するアンチセンス核酸またはリボザイムなどの化合物）はダイダロスの核酸配列に結合することでダイダロスの発現を低下させる。別の例では、化合物（例えば、抗体、小分子、またはペプチドなどの化合物）は、ダイダロスポリペプチドに結合することでダイダロスの発現を低下させる。別の例では、化合物（例えば、ダイダロス遺伝子のプロモーターまたは調節配列に結合する小分子、ペプチド、または核酸などの化合物）は、細胞内における内因性ダイダロス遺伝子の発現を低下させることでダイダロス発現を低下させる。別の態様では、このような化合物は例えば、ダイダロスに結合することで、また優性的に負の役割を果たすことでダイダロスの発現を低下させる場合がある。例えば、このような化合物はダイダロスポリペプチド、または二量体（例えばダイダロスとのホモ二量体もしくはヘテロ二量体）を形成可能であるがダイダロスＤＮＡの結合活性および／または転写活性に干渉する他のポリペプチド（例えばイカロスポリペプチド、ヘリオスポリペプチド、またはアイオロスポリペプチド）の場合がある。このようなポリペプチドには、Ｎ末端の１個または複数のジンクフィンガーが除去されたイカロスポリペプチド、ヘリオスポリペプチド、アイオロスポリペプチド、またはダイダロスポリペプチドなどがある。
【００３１】
別の局面では、本発明は神経前駆細胞集団を得る方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：少なくとも１個の神経前駆細胞を含む細胞試料を提供する段階；および細胞試料に含まれるダイダロスのレベルを上昇させる段階。ダイダロスの発現を上昇させる段階は、細胞の分化および／または増殖（例えば神経前駆細胞の増殖の上昇、および／または神経前駆細胞の分化の阻害）に影響する場合がある。細胞試料に含まれるダイダロスのレベルはインビトロまたはインビボで上昇させることができる。増殖、分化、および／または生存に影響を及ぼす付加的な化合物を神経前駆細胞に添加することができる。例えば、神経前駆細胞に添加された成長因子（例えばＦＧＦ−２および／またはＥＧＦ）のレベルを増加することができる。
【００３２】
好ましい態様では、ダイダロスの発現（例えばダイダロスの転写速度またはｍＲＮＡの半減期を上昇させることによるもの）、タンパク質濃度、または活性を上昇させる薬剤を細胞に投与することでダイダロスのレベルを上昇させることができる。このような薬剤は例えば、ダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体；（例えば、ダイダロスとダイダロスの結合パートナー（例えばＤＮＡまたは別のイカロスファミリーのタンパク質）との結合を上昇させたり安定化させたりすることにより、またはダイダロスの核移行を亢進させることにより）ダイダロスの活性を上昇させるペプチド、またはダイダロスのタンパク質作用物質；（例えばダイダロス遺伝子のプロモーター領域に結合することにより）ダイダロスの発現を上昇させる小分子；抗体（例えば、ダイダロスと結合して安定化させたり、またはダイダロスとダイダロス結合パートナー（例えば、ＤＮＡもしくは別のＤＮＡタンパク質（例えば、ダイダロスとイカロス因子、アイオロス因子、またはヘリオス因子間のホモ二量体もしくはヘテロ二量体））との結合を補助したりする抗体）；またはダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の場合がある。このヌクレオチドは以下を含む場合がある：ダイダロスのコード領域；プロモーター配列（例えばダイダロス遺伝子または別の遺伝子のプロモーター配列）；エンハンサー配列；非翻訳調節配列（例えば５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列。別の好ましい態様では、ダイダロスタンパク質のレベルは、内因性ダイダロス遺伝子の発現レベルを上昇させることで（例えばダイダロス遺伝子の転写を上昇させること、またはダイダロスｍＲＮＡの安定性を上昇させることで）上昇する。好ましい態様ではダイダロス遺伝子の転写は以下の操作により上昇する：例えば正の調節因子（エンハンサー、または転写活性化因子のＤＮＡ結合部位など）の付加による内因性ダイダロス遺伝子の調節配列の改変；負の調節因子（転写抑制因子のＤＮＡ結合部位など）の欠失、および／または内因性調節配列もしくはその内部配列を別の遺伝子と置換することでダイダロス遺伝子のコード領域をより効率的に転写可能とすること。
【００３３】
別の局面では、本発明は神経細胞集団を得る方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：神経前駆細胞を含む細胞試料を提供する段階；および神経前駆細胞中におけるダイダロスの発現または活性を阻害することで神経細胞を得る段階。ダイダロスの発現または活性を阻害する段階は細胞の分化および／または増殖に影響を及ぼす可能性があり、例えば神経前駆細胞の分化を促す場合がある。
【００３４】
一つの態様では、ダイダロスの発現または活性を低下させる化合物を神経前駆細胞に提供する。例えば化合物（例えば核酸またはリボザイムなどのダイダロスｍＲＮＡに結合する化合物）はダイダロスの核酸配列に結合することでダイダロスの発現を低下させる可能性がある。別の例では、化合物はダイダロスポリペプチド（例えば本明細書に記載された任意のポリペプチド）との結合により、ダイダロスの発現または活性を低下させる。別の例では、このような化合物は、細胞内における内因性ダイダロス遺伝子の発現を低下させることでダイダロスの発現を低下させる。
【００３５】
好ましい態様では、ダイダロスの発現、レベル、または活性は、ダイダロスの発現、レベル、または活性を低下させる薬剤を細胞に投与することで低下する。好ましい態様では、ダイダロスのレベル、および／または活性を阻害する薬剤は以下の一種または複数である：ダイダロス結合タンパク質（例えば、ダイダロスに結合してその活性（例えばＤＮＡ結合活性、核移行活性、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体の形成活性、または転写活性化活性）を阻害する可溶性ダイダロス結合タンパク質；ダイダロスタンパク質に特異的に結合する抗体（例えばダイダロスのもつ、ＤＮＡもしくは別の転写因子に結合する能力、核へ移行させる能力、またはＤＮＡ結合能力を破壊する抗体）；（例えばダイダロス結合パートナー（例えばＤＮＡ、もしくは別の転写因子、例えばイカロス因子、アイオロス因子、もしくはヘリオス因子）に結合するが、ダイダロス活性（例えば核移行活性もしくは転写活性化活性）を破壊する）変異型の不活性なダイダロス、またはその断片；細胞のダイダロス核酸配列（例えばｍＲＮＡ）に結合可能で、タンパク質の発現を阻害可能なダイダロス核酸分子（例えばアンチセンス分子、またはダイダロスリボザイム）；ダイダロス遺伝子の発現を低下させる薬剤（例えばダイダロスのプロモーターに結合してダイダロス遺伝子の発現を低下させる小分子）。別の好ましい態様では、ダイダロスは、内因性ダイダロス遺伝子の発現レベルを低下させることで（例えばダイダロス遺伝子の転写を低下させることで）阻害される。好ましい態様では、ダイダロス遺伝子の転写は以下の操作によって低下させることができる：（例えば負の調節配列（転写抑制因子のＤＮＡ結合部位など）を付加することで、または正の調節配列（エンハンサー、もしくは転写活性化因子のＤＮＡ結合部位）を除去することで）内因性ダイダロス遺伝子の調節配列を改変すること。
【００３６】
別の局面では、本発明は、神経細胞関連疾患を治療する方法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：神経細胞関連疾患の被験者を提供する段階；および被験者の細胞中におけるダイダロスの発現を調節することで疾患を治療する段階。神経細胞関連疾患は、神経変性疾患（例えばパーキンソン病やアルツハイマー病、虚血障害（脳卒中または脊髄外傷）、てんかん、または多発性硬化症などの場合がある。
【００３７】
好ましい態様では、ダイダロスの発現、タンパク質レベル、または活性を上昇させることで、疾患（例えばダイダロス反応性細胞の不十分な増殖、または異常な分化を特徴とする疾患）を治療する。ダイダロスの発現、タンパク質レベル、または活性は、（例えばダイダロスの転写速度またはｍＲＮＡ半減期の上昇による）ダイダロスの発現、タンパク質レベル、または活性を上昇させる薬剤を細胞に投与することで上昇させることができる。このような薬剤には例えばダイダロスのポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体；（例えばダイダロスとダイダロス結合パートナー（例えばＤＮＡもしくはクロマチン）との結合を上昇させたり安定化させたりすることで、またはダイダロスの核移行を亢進させることで）ダイダロスの活性を上昇させるペプチドもしくはダイダロスのタンパク質作用物質；例えばダイダロス遺伝子のプロモーター領域に結合することでダイダロスの発現を上昇させる小分子；抗体（例えばダイダロスに結合してダイダロスとダイダロス結合パートナー（例えば別のＤＮＡ結合タンパク質もしくはＤＮＡ）との結合を安定化させたり支持したりする抗体）；または、ダイダロスのポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列などがある。ヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の場合がある。ヌクレオチド配列は以下を含む場合がある：ダイダロスのコード領域；プロモーター配列（例えばダイダロス遺伝子または別の遺伝子のプロモーター配列）；エンハンサー配列；非翻訳調節配列（例えば５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列。別の好ましい態様では、ダイダロスタンパク質のレベルは、内因性ダイダロス遺伝子の発現レベルを上昇させることで（例えばダイダロス遺伝子の転写を上昇させること、またはダイダロスｍＲＮＡの安定性を上昇させることで）で上昇する。好ましい態様ではダイダロス遺伝子の転写は以下の操作によって上昇する：例えば正の調節配列（エンハンサー、もしくは転写活性化因子のＤＮＡ結合部位など）の添加；負の調節配列（転写抑制因子のＤＮＡ結合部位など）の欠失、および／または内因性調節配列もしくはその内部配列と別の遺伝子の対応領域との置換によってダイダロス遺伝子のコード領域をより効率的に転写可能とすることによる、内因性ダイダロス遺伝子の調節配列の改変。
【００３８】
別の態様では、ダイダロスの発現、タンパク質レベル、または活性が低下することで、疾患（例えば増殖性疾患）が治療される。好ましい態様では、ダイダロスの発現、レベル、または活性は、ダイダロスの発現、レベル、または活性を低下させる薬剤を細胞に投与することで低下する。好ましい態様では、ダイダロスのレベル、および／または活性を阻害する薬剤は以下の一種または複数である：ダイダロス結合タンパク質（例えば、ダイダロスに結合してその活性（例えばクロマチン結合活性、核移行活性、ＤＮＡ結合活性、もしくは転写活性化活性）を阻害する可溶性ダイダロス結合タンパク質；ダイダロスタンパク質に特異的に結合する抗体（例えばダイダロスのもつ、本発明に記載された結合パートナーに結合する能力、核へ移行させる能力、またはＤＮＡに結合する能力を破壊する抗体）；（例えばダイダロスの結合パートナーに結合するが、ダイダロス活性（例えば核移行活性もしくは転写活性化活性を破壊する）変異型の不活性なダイダロス、またはその断片；細胞のダイダロスの核酸配列（例えばｍＲＮＡ）に結合可能で、タンパク質の発現を阻害可能なダイダロス核酸分子（例えばアンチセンス分子、またはダイダロスリボザイム）；ダイダロス遺伝子の発現を低下させる薬剤（例えばダイダロスのプロモーターに結合してダイダロス遺伝子の発現を低下させる小分子）。別の好ましい態様では、ダイダロスは、内因性ダイダロス遺伝子の発現レベルを低下させることで（例えばダイダロス遺伝子の転写を低下させることで）阻害される。好ましい態様では、ダイダロス遺伝子の転写は以下の操作によって低下させることができる：（例えば負の調節配列（転写抑制因子のＤＮＡ結合部位など）を付加することで、または正の調節配列（エンハンサー、もしくは転写活性化因子のＤＮＡ結合部位など）を除去することで）内因性ダイダロス遺伝子の調節配列を改変すること。
【００３９】
本明細書で用いられる、「治療」または「被験者を治療する」という表現は、疾患、疾患の症状、もしくは疾患傾向を有し、このような疾患、疾患の症状、もしくは疾患傾向を治癒する（ｃｕｒｅ）、回復させる（ｈｅａｌ）、変える（ａｌｔｅｒ）、治療する（ｒｅｍｅｄｙ）、寛解させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）、または影響を及ぼす（ａｆｆｅｃｔ）という目的を伴う患者への治療薬の使用もしくは投与、またはこのような患者から単離された組織もしくは細胞系列への治療薬の使用もしくは投与と定義される。治療薬には、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
一つの態様では、神経細胞関連疾患は、不十分な神経細胞分化を特徴とする。
【００４１】
別の態様では、神経細胞関連疾患は、望ましくない、または過剰な神経細胞分化を特徴とする。
【００４２】
一つの態様では、神経細胞関連疾患は、神経細胞の増殖性疾患、例えば癌、例えば神経腫である。
【００４３】
一つの態様では、被験者の細胞内におけるダイダロスのレベルは上昇している。被験者の細胞内におけるダイダロスのレベルの上昇は、神経細胞の分化を亢進させる場合がある。
【００４４】
一つの態様では、被験者の細胞内におけるダイダロスのレベルは低下している。被験者の細胞内におけるダイダロスのレベルの低下は、神経細胞の分化を低下させる場合がある。
【００４５】
別の局面では、本発明は神経細胞の培養法を特徴とする。この方法は以下の段階を含む：神経細胞をインビトロで提供する段階；および神経細胞内におけるダイダロスの発現を調節することで神経細胞培養物を提供する段階。
【００４６】
一つの態様では、この方法は、神経細胞内におけるダイダロスの発現を上昇させる段階を含む。
【００４７】
別の態様では、この方法は、神経細胞内におけるダイダロスの発現を低下させる段階を含む。
【００４８】
本明細書で用いられる「前駆細胞」は、分裂して２個の細胞を生じることが可能な細胞である（前駆細胞は、その成熟段階が２個の細胞の少なくとも一方とは異なる）。
【００４９】
「神経細胞」は、神経系列の細胞の一つまたは複数の特徴を有する細胞である。「神経細胞」という用語は、その成熟段階にかかわらず、神経系列のすべての細胞を含む。
【００５０】
「神経前駆細胞」は、神経細胞系列の前駆細胞（例えば、通常のインビボ条件下で増殖しない細胞、および／または分化して非神経細胞を生じない細胞）である。
【００５１】
「細胞試料」は、２個またはそれ以上の細胞の集団である。細胞試料は任意の形状、例えば容器内、例えば試験管内に提供される場合がある。細胞試料は、被験者の神経組織に由来する細胞を含む場合がある。一例では、細胞試料は非神経前駆細胞（例えば分化した神経細胞）も含む。
【００５２】
「分化した神経細胞」は、分裂して、分化した神経細胞と成熟段階が異なる娘細胞を生じることができない神経細胞である。「分化した神経細胞」は終期の細胞も意味する。
【００５３】
遺伝子の「制御領域」は、転写調節配列、または調節配列の組み合わせである。例えばダイダロス遺伝子の制御領域は、プロモーター、もしくはその機能性断片、エンハンサー配列、インスレーター配列、またはこれらの組み合わせの場合がある。
【００５４】
本明細書で言及されたすべての出版物および特許は、参照として組み入れられる。
【００５５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかになる。
【００５６】
発明の詳細な説明
概要
イカロス、および関連タンパク質アイオロスおよびヘリオスは、造血幹細胞（ＨＳＣ）およびリンパ系列におけるその子孫の発生および分化を調節する。イカロス遺伝子ファミリーの別のタンパク質であるダイダロスは、発生中の中枢神経系（ＣＮＳ）で一時的に発現され、分化の最終段階で発現が下方制御される。ダイダロスの発現は、神経幹細胞を含む成体脳の領域でも認められる。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚内でダイダロスを強制発現させても、神経原性領域の特異化に影響は認められなかったが神経分化は妨げられた。ＮＧＦに応答したＰＣ１２細胞の神経分化も、ダイダロスの強制発現によって阻止された。しかし、循環性集団（ｃｙｃｌｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）として維持してもＰＣ１２細胞の挙動に影響はみられなかった。
【００５７】
ダイダロスｃＤＮＡのクローニング
イカロス遺伝子ファミリーの第四のタンパク質であるダイダロスは、縮重プライマーを用いたＰＣＲでクローニングされた（Ｍｏｒｇａｎら、（１９９７）ＥＭＢＯＪ１６：２００４；Ｈｏｎｍａら、（１９９９）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４４７：７６）。ＰＣＲによる増幅は以下の条件で実施された。４０サイクル（９５°、３０秒；４５°、１〜５分；７２°、２分）を、３ｍＭＭｇＳＯ_４を含むＰｆｕ緩衝液中で、マウスのイカロスファミリーのタンパク質の保存領域から設計された縮重プライマーＤＥＧ１０（

）を用いて実施された。この結果、９００塩基対の産物が増幅された。３’および５’のＲＡＣＥ（Ｍａｒａｔｈｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、各転写産物の残りのコード配列、ならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲに対するクローニングが行われた。
【００５８】
ダイダロスｃＤＮＡは、イカロスファミリーの他のタンパク質と相同性の高いタンパク質をコードする。ＤＮＡ結合に関与するＮ末端の４個のジンクフィンガーと、ファミリーのタンパク質間におけるホモおよびヘテロの二量体形成に必要なＣ末端の２個のジンクフィンガー（Ｓｕｎら、（１９９６）ＥＭＢＯＪ１５：５３５８）は全４種のタンパク質についてほぼ同一である（図１Ａおよび１Ｂ）。イカロス、アイオロス、およびヘリオスに共通してみられる他の複数のドメインはダイダロスでも保存されているが、他の３種に対するダイダロスの類似性は、相互の類似性と比べてやや低い（図１Ｂ）。
【００５９】
ダイダロスの発現パターン
マウスの胚発生中に実施されたインサイチュー解析の結果、ダイダロスが、妊娠７．５日目までに中程度のレベルで神経板で発現が検出される、イカロスファミリーの最初のタンパク質であることが判明した。これとは対照的にダイダロスは、妊娠１１日目まで同様のレベルで検出されない。妊娠１１日目には吻側神経版で発現がみられ、脊髄の発生に伴って尾側に広がる。神経管を通る断面をみると、ダイダロスの発現が、脳室帯から移動してきた細胞で最も高いことがわかる。胎生後期におけるダイダロスの発現は発生中のＣＮＳの多くで検出されたが、出生直後にほとんどの領域で発現が低下した。ＣＮＳにおける発現に加えて、ダイダロスは、発生中の後根神経節（ＤＲＧ）および副腎髄質に含まれる細胞のサブセットを含む胚発生中の一部の神経冠派生物でもインサイチューハイブリダイゼーションで検出された。インビボにおけるこの発現パターンと一致して、ダイダロスのｍＲＮＡは、メラニン形成細胞系列、ならびに神経原性能をもつＰＣ１２およびｎ−ｔｅｒａ２細胞でも検出された。
【００６０】
胚発生中におけるこのような発現パターンは、ダイダロスが神経形成中に機能することを示唆している。成体ＣＮＳにみられるダイダロスの発現パターンの特徴は、この結論を支持し、またダイダロスの発現が、残存する前駆細胞集団の指標となることを示唆する。発現は、神経形成が成体期を通して続く成体脳の複数の領域で維持される（Ｌｕｓｋｉｎら、（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ１１：１７３；Ｐａｌｍｅｒら、（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：３８９）。これには海馬の歯状回、および嗅球に集中する介在ニューロンを生じる前脳の脳室周囲領域も含まれる。ダイダロスの発現は、脳室を裏打ちする上衣層で、また隣接する上衣下領域（ｓｕｂｅｐｅｎｄｙｍａｌｚｏｎｅ；成体で神経幹細胞を単離した領域）で検出されている（Ｃｈｉａｓｓｏｎら、（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１９：４４６２；Ｃｏｒｏｔｔｏ、（１９９３）ＮｅｕｒｏｓｃｉＬｅｔｔｅｒ１４９：１１１；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、（１９９９）Ｃｅｌｌ９６：２５）。神経幹細胞がインビボの上衣領域、上衣下領域、またはこの両方のいずれかに存在するかは不確定であるが（Ｔｅｍｐｌｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：Ｒ３９７）、これらの細胞のサブセットにおけるダイダロスの発現は、神経細胞、または発生直後の子孫のいずれかの指標となる可能性がある。
【００６１】
神経系におけるイカロスファミリーの発現パターンは形式的には、造血系で観察されるパターンと似ており、細胞が系列段階を経て、次第に分化方向が決定される子孫の増殖および分化を調節する場合に、ファミリーのタンパク質の異なる発現がみられる（Ｋｅｌｌｅｙら、（１９９８）ＣｕｒｒＢｉｏｌ．８：５０８）。神経系におけるダイダロスの発現は、神経形成の中間段階と相関することがわかっており、最初に神経板の形成後に現れ、次に脳室周囲領域から移動してき細胞内において支配的となり、また発現は最終分化が生じる領域で消失する。このような発現パターンは、以下に挙げる一つまたは複数の可能性を示唆している：（１）ダイダロスの発現が、神経系列に至る進行の結果として活性化される；（２）ダイダロスの発現が分化状態の神経前駆細胞の維持に寄与する；および（３）ダイダロスの発現の後の抑制が最終分化に必要である。
【００６２】
インビトロにおけるダイダロスの発現の調節
上記の可能性を直接検討するために、以下の二つの実験を行って、その影響を測定した：（１）細胞内におけるダイダロスｍＲＮＡの異所的発現；および（２）発現が標準的に消失した時点以降における細胞内におけるダイダロス発現の維持。
【００６３】
ＲＮＡをアフリカツメガエル胚に注入してダイダロスの発現を変化させた。空間的に制限された転写因子の発現は、背側外胚葉における神経原性能をもたらし、およびＮｏｔｃｈによる側方阻害の影響を受ける転写因子のヒエラルキーが、これらの細胞のサブセットの神経分化を決定する。ニューロゲニン−１ｂの発現（Ｍａら、（１９９６）Ｃｅｌｌ８７：４３）、およびｘデルタ（ｘＤｅｌｔａ）−１の発現（Ｃｈｉｔｎｉｓら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７５：７６１）は、神経細胞の分化方向の決定における連続段階のマーカーとなり、また神経細胞に特異的なチューブリン２５（ｎ−チューブリン）の発現は、分化中のニューロンの指標となる（Ｃｈｉｔｎｉｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＮｅｕｒｏｂｉｏｌ．９：１８）。
【００６４】
ダイダロスのアフリカツメガエルのオーソログの部分的ｃＤＮＡを、縮重プライマーを用いたＰＣＲでクローニングした。ｃＤＮＡの末端をＲＡＣＥで決定し、これを後に行うアフリカツメガエル胚のｍＲＮＡのコード領域全体の再クローニングに必要な情報とした（図１Ｃ）。アフリカツメガエルダイダロスタンパク質の残基の８０％は、マウスダイダロスタンパク質に同一であるが、マウスのタンパク質の一部の領域は、アフリカツメガエルのタンパク質には存在しない（図１Ｃ）。欠損領域の機能的重要性は検討されていないが、同領域は、他のマウスパラログ間で保存されていないマウスダイダロスのセグメントに対応する。
【００６５】
ダイダロス転写物のＰＣＲ解析により、初期神経形成がみられる第１１期から同転写物が発現されていることが確認された。全ＲＮＡは、第１１期または第１２期に１００個のアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）胚から調製し、２ μｇを逆転写に用いた。１６５ｎｇのｃＤＮＡ産物（ヒストンＨ−４について１６．５ｎｇ）を、１．５ μＣｉの各［Ｐ３２］ｄＡＴＰおよび［Ｐ３２］ｄＣＴＰの存在下で、以下のプライマー対を用いて増幅した：
ヒストンＨ−４

Ｘダイダロス

およびニューロゲニン−１ｂ

。サイクル数は、各標的が直線的に増幅する範囲内とした。産物を５％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ホスホイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で定量を行った。インプットｃＤＮＡ量を補正して、同等のヒストンＨ−４量を得た。
【００６６】
以上の実験においては、メッセージマシーン（ｍＭｅｓｓａｇｅｍＭａｃｈｉｎｅ）（Ａｍｂｉｏｎ）およびｂ−ｇａｌに対する直線化鋳型、またはＲＮ３ベクター上に配置したアフリカツメガエルダイダロスの完全長コード配列を用いて、キャップされたｍＲＮＡを調製した。胚１個あたり約５０ｐｇを６ｎｌの容量として注入した。
【００６７】
アフリカツメガエルダイダロスをコードするＲＮＡを２細胞期のアフリカツメガエル胚へ注入しても、外側外胚葉になることが正常に決定されている細胞内においてｎ−チューブリン（ｎ＝１００）または神経原性系列の初期マーカーであるニューロゲニン１ｂ（ｎ＝４７）、もしくはデルタ−１（ｎ＝４７）のいずれにおいても異所性発現はみられなかった。したがってダイダロスは、推定に基づく表皮を神経を形成する方向に変えるために十分ではないことがわかった。
【００６８】
神経原性領域におけるダイダロスの発現の維持が神経分化の一側性の抑制を導くことは、ｎ−チューブリンの発現が抑制されることから明らかとなった。Ｎ−チューブリンの発現は、注入ＲＮＡを含む細胞で抑制された。このような細胞は、同時注入されたｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）のｍＲＮＡにコードされた活性の検出を元に同定された。ｎ−チューブリン発現の低下は、ｂ−ｇａｌトレーサーのみを注入した胚では認められなかった。ダイダロスは、この最終分化マーカーの発現を一貫して抑制したが、ニューロゲニン−１ｂの転写物もデルタ−１の転写物も、外因性ダイダロスｍＲＮＡをもつ細胞内において６１日目と７３日目の胚でともに見出された。このようなマーカーの発現は注入胚の大部分では正常であったが、注入胚の多くにおいて、その発現パターンにある程度の変化が認められた。注入胚の３８％ではニューロゲニンの発現にある程度の変化が認められ、注入胚の５０％では、注入側と非注入側の間においてデルタ−１の発現にある程度の差が認められた。これらのマーカーの正常な発現パターンは極めて動的であり、発生速度の変化を示す高感度の指標となる。ダイダロスの強制発現は、これらの神経原性マーカーの発現を妨げないが、一部の細胞内における発現に及ぼすさまざまな作用は、これらの細胞内におけるダイダロスの異時性または過剰発現によって引き起される神経系列の初期段階を通じた異常な進行を伴う干渉の存在を反映している可能性がある。
【００６９】
以上の結果は、ダイダロスの発現が神経系への分化を誘導するのではなく、むしろ、このような運命の採用の結果として活性化されることを示唆している。また、神経分化中に通常認められるダイダロス発現の下方制御が、この過程に必要な段階であることが示唆されている。この可能性をさらに調べるために、褐色細胞腫の細胞系列ＰＣ１２を対象にダイダロスの強制発現の影響を調べた。この細胞は、未分化状態で増殖する集団として維持することが可能であり、副腎のクロム親和細胞の特徴をもつ。またはＰＣ１２細胞は、培養物にＮＧＦを添加して、神経細胞の特徴を有する細胞種への分化を誘導することができる（Ｇｒｅｅｎｅら、（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３：２４２４）。したがってＰＣ１２は、ダイダロスの発現の維持が、神経分化における特定の段階に及ぼす作用を評価するために使用することができる。インビボにおいて神経前駆細胞および副腎のクロム親和性細胞の両方にみられる結果と同様に、成長培養物中に維持したＰＣ１２細胞はダイダロスのｍＲＮＡを発現する。これらの実験では、ＰＣ１２細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を、ラミニンでコートした１２ウェルのディッシュ（住友ベークライト、秋田）に分注し、５％ウシ胎児血清（三光純薬、東京）および５％ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、２３７００−０４０）で培養した。神経突起の誘導は、２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を添加して行った。
【００７０】
ＰＣ１２細胞をサブクローニングしてより均一な集団を得た後に、（１）構成的に活性なプロモーターによって駆動されるダイダロスコード配列を含むプラスミド、または（２）ベクターのみのいずれかをトランスフェクトした。各処理について４個の独立した系列を、選択培地上で成長条件下でサブクローニングし、ダイダロス発現コンストラクトをもつ系列におけるダイダロスｍＲＮＡの発現の上昇をノーザンハイブリダイゼーションで確認した。回収クローンの出現頻度、またはその成長速度に関して実験集団と対照集団の間で差は認められず、またトランスフェクトしたダイダロスｃＤＮＡを発現するクローンの形態は、成長培養物中の対照と区別できなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。したがって、ダイダロスの強制発現は、上記の細胞が増殖性「前駆細胞」として維持されている間は明らかな作用をもたらさなかった。しかし、ＮＧＦを含む培地中における培養を初めてから３日後に、対照細胞集団は、神経突起の長い枝を伸ばしていた一方で、サブクローンを発現するダイダロスは、３日後の時点では神経突起が存在したとしても極めて少数であり、さらに２週間培養しても発生は認められなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。したがって、神経分化中に通常みられるダイダロスの発現の抑制は、ＰＣ１２細胞系列における神経形態の変化に必要な段階であると思われる。
【００７１】
検出法
本発明は、細胞内におけるダイダロスの発現を元に神経細胞を検出する方法を提供する。ダイダロスは、神経前駆細胞で有意なレベルで発現されること、また分化後の神経細胞では発現がみられないか、または低レベルで発現されることがわかっている。ダイダロスのこのような発現パターンを使用することで、神経細胞を検出する方法を考案することができる。
【００７２】
一つの態様では、ダイダロスは細胞試料中に検出されるので、神経前駆細胞を含む細胞試料、および／または分化方向が決定した神経細胞を含む細胞試料を特定することができる。このような細胞試料は、インビトロまたはインビボで解析することが可能であり、また同細胞試料は、任意の身体組織（例えば神経組織）から得られる。細胞試料は、神経細胞および／または非神経細胞を含む場合がある。
【００７３】
ダイダロスの発現は、当技術分野で周知のさまざまな手法で検出することができる。例えば、細胞で作られるダイダロスのｍＲＮＡは例えばハイブリダイゼーション法またはＰＣＲで検出することができる。これらの手法はいずれも、核酸プローブに結合させた検出用標識を使用する場合がある。また細胞で作られるダイダロスタンパク質は、例えばダイダロスタンパク質に結合する検出用標識を選択的に含む抗体を用いて検出することができる。
【００７４】
このような検出法には、ダイダロス発現の有無に基づいて、一つの細胞種を別の細胞種から分離する方法をさらに含めることができる。例えば神経前駆細胞はダイダロス発現を元に同定することが可能であり、次いで細胞試料のダイダロス発現が低下した他の細胞と分離することができる。この結果、神経前駆細胞を、他の細胞種（分化した神経細胞、または分化方向が決定した神経細胞、および非神経細胞など）から分離することが可能となる。
【００７５】
別の態様では、本発明は、細胞のダイダロス発現を元に細胞の神経形成段階を特定する方法を提供する。例えば細胞は、ダイダロスの発現を元に神経前駆細胞であると同定することができる。細胞は、細胞内にダイダロスが存在すること、または非神経前駆細胞集団と比較して、細胞内におけるダイダロスのレベルが上昇していることのいずれかにより神経前駆細胞であると同定することができる。別の例では、細胞はダイダロスの発現を元に、非神経前駆細胞（例えば分化した細胞、または分化方向が決定された細胞）であると同定することができる。細胞は、細胞内にダイダロスが存在しないこと、または神経前駆細胞と比較して、細胞内におけるダイダロスのレベルが低下していることのいずれかにより非神経前駆細胞であると同定することができる。ダイダロスの発現は、本明細書に記載された方法、例えばダイダロスのｍＲＮＡまたはタンパク質を解析することで評価することができる。このような方法には、神経形成段階の差を元に一つの細胞を別の細胞から単離する段階をさらに含めることができる。
【００７６】
分離法
本発明の別の局面は、ダイダロスの発現を元に細胞を分離する方法に関する。このような方法を用いて、神経細胞集団（例えば神経前駆細胞）を他の細胞集団から分離することができる。例えば、神経前駆細胞と非神経前駆細胞の両方を含む細胞集団では、ダイダロスの発現を評価することが可能であり、またダイダロスの発現を元に、細胞を分けることができる。この例では、神経前駆細胞は、ダイダロスの発現レベルが非神経前駆細胞と比較して高い。この分離法で使用される細胞集団は例えば、神経細胞、非神経細胞、またはこれらの両方を含む場合がある神経組織から得られる。ダイダロスの発現は、この方法では、本明細書に記載された、または当技術分野で周知の任意の手法（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の解析、例えば、ウエスタンブロット免疫アッセイ法、免疫組織学的方法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、または固相支持体（例えばラテックスビーズ）を用いる免疫アッセイ法）で評価することができる。
【００７７】
診断法
本発明の別の局面は診断法に関する。この方法では、被験者の細胞内におけるダイダロスの発現を元に、被験者における神経細胞関連疾患のリスクの有無を判定することができる。この方法には、被験者の細胞をインビトロまたはインビボのいずれかで分析して、神経細胞関連疾患（例えば神経細胞増殖性疾患）に対する被験者のリスクを判定する段階が含まれる。
【００７８】
一つの態様では、ダイダロスの発現は、被験者の細胞（例えば神経組織に由来する細胞）を対象に評価される。被験者の細胞内におけるダイダロスの発現が、疾患リスクのない被験者の同細胞種におけるダイダロスの発現レベルと比較した際に上昇している場合に、被験者は神経細胞関連疾患のリスクがあると判定される場合がある。ダイダロスの発現は、本明細書に記載されている当技術分野で周知の方法、例えばダイダロスのｍＲＮＡまたはダイダロスタンパク質を検出することで検出することができる。
【００７９】
別の態様では、ダイダロス遺伝子の異常を検出することで、被験者に神経細胞関連疾患のリスクがあると判定される。例えばダイダロス遺伝子の変異（例えばミスセンス変異、ナンセンス変異、または同遺伝子の調節領域における変異）は、神経細胞関連疾患（例えば神経細胞の不適当な増殖および／または分化に関連した疾患）に関連する欠損型または不活性型のダイダロスタンパク質産物を生じる場合がある。ダイダロス遺伝子の異常は、さまざまな方法、例えば、ゲノムＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡのＰＣＲ解析、制限酵素切断断片多型解析、またはゲル電気泳動によるダイダロスタンパク質の解析で検出することができる。
【００８０】
治療法
本発明の別の局面は疾患（例えば神経細胞関連疾患）の治療法に関する。このような方法は、被験者の細胞内におけるダイダロスの発現をインビボまたはインビトロで調節する段階を含む場合がある。被験者は、疾患（例えば神経細胞関連疾患）のリスクがある場合、または罹患している場合がある。神経細胞関連疾患は、神経変性、または過剰な、もしくは望ましくない神経細胞に関連した疾患を含む場合がある。例えば神経変性の原因には、疾患、外傷、および／または老化などがある。神経変性とは、物理的な変性、および／または神経細胞死、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の異常な結合、および／または神経細胞による物質（群）（例えば神経伝達物質）の過小産生もしくは過剰産生を含むがこれらに限定されない神経細胞異常を意味する。神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、虚血障害（脳卒中または脊椎外傷）、てんかん、または多発性硬化症などを含む場合がある。過剰な神経細胞、または望ましくない神経細胞が関連する他の神経細胞関連疾患には、癌などの増殖性疾患（例えば神経腫瘍）などを含む場合がある。一例では、神経細胞関連疾患は、不十分な神経細胞分化を特徴とする。別の例では、神経細胞関連疾患は、望ましくない神経細胞分化、または過剰な神経細胞分化を特徴とする場合がある。
【００８１】
疾患（例えば神経細胞関連疾患）は、被験者の細胞内におけるダイダロスのレベルを上昇させたり低下させたりすることで治療される場合がある。例えばダイダロスのレベルを細胞内において（インビトロまたはインビボで）上昇させることで、神経細胞分化を低下させることができる。また、神経細胞の増殖を促進する薬剤を使用して、分化前の神経前駆細胞の増殖を可能とすることができる。このような方法により、例えば神経変性疾患を治療することができる。ダイダロスの発現を上昇させることで、過剰な神経細胞分化、または望ましくない神経細胞分化を特徴とする疾患を治療することができる。他の局面では、ダイダロスの発現レベルを低下させて、望ましくない、または過剰な神経細胞の増殖、および／または不十分な神経細胞の分化を低下させたり阻害したりすることができる。このような方法により、例えば神経細胞の増殖性疾患（神経腫など）を治療することができる。
【００８２】
細胞内におけるダイダロスのレベルは、さまざまな方法（例えば以下を細胞に投与すること）で上昇させることができる：（１）ダイダロスポリペプチド、その断片、もしくは類似体；（２）ダイダロスポリペプチド、その断片、もしくは類似体をコードする核酸；または（３）細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる薬剤。
【００８３】
ダイダロスポリペプチドをコードする核酸コンストラクトを遺伝子治療のプロトコルの一部として用いることで、作用物質状態または拮抗物質状態のダイダロスポリペプチドのいずれかをコードする核酸を輸送することができる。本発明は、インビボトランスフェクション用の発現ベクター、およびポリペプチドを発現させたり異所性発現させたりする細胞内においてダイダロスポリペプチドの機能を再構成し、ダイダロスポリペプチドの機能を促進し、またはダイダロスポリペプチドの機能に拮抗するための、特定の細胞種（例えば神経細胞）におけるダイダロスポリペプチドの発現を特徴とする。
【００８４】
ダイダロスポリペプチド、またはダイダロスの作用物質もしくは拮抗物質の発現コンストラクトを、任意の生物学的に有効な担体（例えば、インビボにおける対象遺伝子の細胞への効率的な輸送を可能とする任意の剤形または組成）中に含めて投与することができる。アプローチには、対象遺伝子の（組換え型のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１型を含む）ウイルスベクター、または組換え型の細菌もしくは真核生物のプラスミドへの挿入などがある。ウイルスベクターを細胞に直接トランスフェクトさせる；またプラスミドＤＮＡは、例えば陽イオンリポソーム（リポフェクチン）、または誘導体（例えば抗体コンジュゲート）、ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、または他の細胞内担体を補助的に用いて輸送することができるほか、遺伝子コンストラクトを直接注入したり、ＣａＰＯ_４沈殿法をインビボで実施することができる。
【００８５】
インビボにおける細胞への核酸の導入の好ましいアプローチでは、核酸（例えばダイダロスポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターを使用する。ウイルスベクターを細胞に感染させることは、標的細胞の大部分が核酸を受容可能であるという利点がある。またウイルスベクター（例えばウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡ）にコードされた分子は、詳しく後述するようにウイルスベクターの核酸を取り込ませた細胞内において効率的に発現される。
【００８６】
本明細書に記載された方法などのウイルス輸送法に加えて、ウイルスを使用しない方法でも、ダイダロスポリペプチド、またはダイダロスの作用物質もしくは拮抗物質の発現を哺乳類（ヒトなど）の組織中で誘導することができる。ウイルスを使用しない遺伝子輸送法の多くは、巨大分子を取り込んで細胞内輸送を行う哺乳類細胞が用いる正常な機構に基づく。好ましい態様では、ウイルスを使用しない本発明の遺伝子輸送系は、標的細胞が対象遺伝子を取り込むエンドサイトーシス経路に基づく。この種の例示的な遺伝子輸送系には、リポソームに由来する系、ポリリシンコンジュゲート、および人工ウイルスエンベロープなどがある。
【００８７】
代表的な態様では、対象は、表面に正電荷を有し、また（選択的に）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体のタグが付けられるリポソーム（例えばリポフェクチン）内に閉じこめることができる（Ｍｉｚｕｎｏら、（１９９２）、脳神経外科、２０：５４７〜５５１；国際公開公報第９１／０６３０９号；日本特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許出願公開第Ａ−４３０７５号）。
【００８８】
臨床の場では、治療用のダイダロス遺伝子、またはダイダロスの拮抗物質をコードする遺伝子の遺伝子輸送系は、当技術分野でよく知られている任意のいくつかの方法で患者に導入することができる。例えば、遺伝子輸送系の薬学的調製物は、例えば静脈内注射によって全身的に導入することが可能であり、また標的細胞内のタンパク質の選択的な形質導入は、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列に基づく、遺伝子輸送体、細胞種もしくは組織の種類に特異的な発現、またはこれらの組み合わせから提供されるトランスフェクションの特異性から主に生じる。他の態様では、組換え遺伝子の初期輸送は、かなり局在化しており、動物への導入に比較的限定されている。例えば、このような遺伝子輸送体はカテーテルで導入することができる（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）ほか、定位的注入で導入することができる（例えばＣｈｅｎら、（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４〜３０５７）。本発明の好ましい態様では、対象遺伝子は神経細胞を標的とする。
【００８９】
遺伝子治療コンストラクトの薬学的調製物は、許容される希釈液中に含まれる遺伝子輸送系を本質的に含む場合があるほか、遺伝子輸送体が埋め込まれる徐放性基質を含む場合がある。または、完全な遺伝子輸送系が組換え細胞から完全な状態で作製される場合（例えばレトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子輸送系となる一種もしくは複数の細胞を含む場合がある。
【００９０】
また、細胞内におけるダイダロス発現のレベルは、当技術分野で周知のさまざまな方法、例えば本明細書で後述するようにアンチセンス、リボザイム、抗体、小分子阻害剤、またはダイダロス遺伝子の発現を抑制する化合物によって低下させることができる。
【００９１】
したがって、本発明の修飾されたオリゴマーは、治療、診断、および研究の場において有用である。治療的応用では一般に、アンチセンス療法に適切な方法にオリゴマーが使用される。このような治療法では、本発明のオリゴマーは、さまざまな投与量（全身投与、および局所投与もしくは局部投与を含む）のものを製剤化することができる。全身投与の場合は、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、および皮下注射を含む注射が好ましく、本発明のオリゴマーは、溶液中、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液（ハンクス液またはリンガー液など）中に製剤化することができる。また、このようなオリゴマーは、固体状態で製剤化し、使用直前に溶解するか懸濁することができる。凍結乾燥させた状態も本発明に含まれる。
【００９２】
投与
ダイダロスの発現レベルを調節する薬剤を標準的な方法で被験者に投与することができる。例えば、このような薬剤は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、および経粘膜を含む任意のいくつかの異なる経路で投与することができる。一つの態様では、調節性薬剤を経口投与することができる。別の態様では、このような薬剤を注射で（例えば筋肉内または静脈内に）投与することができる。
【００９３】
タンパク質レベルを調節する薬剤（例えば、核酸分子、ポリペプチド、断片、または類似体、モジュレーター、および抗体（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる））は、被験者（例えばヒト）への投与に適した薬学的組成物に組み込むことができる。このような組成物は典型的には、核酸分子、ポリペプチド、モジュレーター、または抗体、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」という表現は、薬学的投与に適した任意の、またすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収の遅延剤などを含むことを意味する。薬学的に活性な物質に用いられる、このような溶媒および薬剤の用途は周知である。任意の従来の溶媒または薬剤が活性化合物に適合しない範囲を除き、このような溶媒は、本発明の組成物に使用することができる。補助的な活性化合物も組成物に取り込むことができる。
【００９４】
薬学的組成物を製剤化することで、意図した投与経路に適合させることができる。非経口投与、皮内投与、または経皮投与に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含む場合がある：注射用水などの無菌性希釈液、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコール、またはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または二亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウム、またはデキストロースなどの等張性調節剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口用調製物は、ガラス製もしくはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または複数回分の薬剤が入ったバイアルに充填することができる。
【００９５】
注射に適した薬学的組成物には、無菌性の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌性の注射液または分散液の即時調製用の無菌性粉末などがある。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、セレモフォアＥＬ（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ）（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などがある。いずれの場合も組成物は無菌性でなければならず、シリンジに充填しやすい程度の液状であるべきである。また製造条件および保存条件下で安定でなければならず、また、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対抗するように保存されなければならない。このような担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒の場合がある。適切な流動性は例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することで、分散液の場合には要求される粒子径を維持することで、また界面活性剤を使用することで維持される場合がある。微生物による作用の予防は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）で達成することができる。多くの場合、等張剤（例えば糖類、（マンニトール、ソルビトールなどの）多価アルコール、塩化ナトリウム）を組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチン）を組成物に含めることでもたらされる場合がある。
【００９６】
無菌性注射液は、適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば小分子、ダイダロスの核酸、ポリペプチド、または抗体）に、上述の成分の一種または組み合わせを含め、次いで必要に応じて濾過滅菌することで調製することができる。分散液は通常、塩基性分散媒を含む無菌性溶媒に活性化合物と、上述の必要な他の成分を含めることで調製される。無菌性注射液を調製するための無菌性粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分＋濾過滅菌済み溶液に由来する任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９７】
経口用組成物は一般に、不活性な希釈液、または口から摂取されても問題のない担体を含む。このような組成物はゼラチンカプセルで包まれたり、圧縮して錠剤としたりすることができる。経口治療薬投与の目的上、活性化合物は、賦形剤と混ぜ合わせ、錠剤、トローチ、またはカプセルの状態で使用することができる。経口用組成物はまた、洗口液として使用するために流動性担体を用いて調製することもできる（この場合、流動性担体に含まれる化合物は口から摂取されたり、口腔にシュッとふりかけられたり（ｓｗｉｓｈ）、喀出されたり、飲み込まれたりする）。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の任意の成分、または類似の性質をもつ化合物を含む場合がある：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンや乳糖などの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）やコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムやステローテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化珪素などの流動促進剤；ショ糖やサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。
【００９８】
全身投与は、経粘膜的または経皮的な方法で実施される場合もある。経粘膜投与または経皮投与では、透過対象の防御壁に適した浸透剤が剤形中に使用される。このような浸透剤は一般に知られており、例えば経粘膜投与用には界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体などがある。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐薬を使用することで達成することができる。経皮投与の場合は、活性化合物を、当技術分野で一般に知られている外用薬、軟膏、ゲル、またはクリーム中に製剤化する。
【００９９】
一つの態様では、活性化合物は、化合物が身体から速やかに排泄されてしまうことを防ぐ担体（インプラント、およびマイクロカプセル化された輸送系を含む徐放性製剤など）を用いて調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸などの生分解性で生物適合性のあるポリマーを使用することができる。このような製剤の調製法は当業者に明らかである。このような材料はアルザ社（ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバファーマシューティカルズ社（ＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から入手することもできる。リポソーム懸濁液（対ウイルス抗原モノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは当業者に周知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載された方法で調製することができる。
【０１００】
本明細書に記載された核酸分子は、ベクターに挿入して遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位的注射（例えばＣｈｅｎら、ＰＮＡＳ９１：３０５４〜３０５７、１９９４を参照）により被験者に輸送することができる。遺伝子治療用ベクターの薬学的調製物には、許容される希釈液に含まれる遺伝子治療用ベクターのほか、遺伝子輸送体が埋め込まれる徐放性マトリックスなどがある。または、完全な遺伝子輸送用ベクターが組換え細胞から完全な状態で作られる場合（例えばレトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、対象となる遺伝子輸送系となる一種または複数の細胞を含む場合がある。
【０１０１】
薬学的組成物は、投与法を記した指示書とともに容器、パック、またはディスペンサーに充填される場合がある。
【０１０２】
遺伝子治療
本明細書に記載された核酸、例えば本明細書に記載されたダイダロスをコードする核酸、またはアンチセンス核酸を遺伝子コンストラクトに組み込むことで、本明細書に記載された作用物質状または拮抗物質状のダイダロスのいずれかをコードする核酸を輸送する遺伝子治療プロトコルの一部として使用することができる。本発明は、細胞内における本明細書に記載されたインビボトランスフェクション用の発現ベクター、およびダイダロス分子を発現させて、ポリペプチドが異所性発現している細胞に含まれる成分の機能を再構成すること、または、同成分の機能に拮抗することを特徴とする。このような成分の発現コンストラクトは、任意の生物学的に有効な担体、例えば成分遺伝子を細胞にインビボで効率的に輸送可能な任意の剤形または組成物として投与することができる。アプローチには、組換え型レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１型を含むウイルスベクター、または組換え型の細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドへの対象遺伝子の挿入などがある。ウイルスベクターを細胞に直接トランスフェクトさせる；またプラスミドＤＮＡは、例えば陽イオンリポソーム（リポフェクチン）、または誘導体（例えば抗体コンジュゲート）、ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、または他の細胞内担体を補助的に用いて輸送することができるほか、遺伝子コンストラクトを直接注入したり、ＣａＰＯ４沈殿法をインビボで実施することができる。
【０１０３】
インビボにおける細胞への核酸の導入の好ましいアプローチでは、核酸（例えば本明細書に記載されたダイダロスをコードするｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターを使用する。ウイルスベクターを細胞に感染させることは、大標的細胞の大部分が核酸を受容可能であるという利点がある。またウイルスベクター（例えばウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡ）にコードされた分子は、ウイルスベクターの核酸を取り込ませた細胞内において効率的に発現される。
【０１０４】
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターを、外因性遺伝子をインビボで、特にヒトに輸送するために組換え型遺伝子輸送系として使用することができる。このようなベクターは、細胞内への遺伝子の効率的な輸送をもたらし、輸送された核酸は宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる。複製欠損型のレトロウイルスのみを産生する特殊化した細胞系列（「パッケージング細胞」と呼ばれる）が開発されれば、遺伝子治療におけるレトロウイルスの有用性が高くなり、また欠損型のレトロウイルスは、遺伝子治療を目的とした遺伝子輸送に使用できることを特徴とする（Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７６：２７１の総説を参照）。複製欠損型レトロウイルスは、標準的な方法でヘルパーウイルスを使用した細胞への感染に使用可能なウイルス粒子内にパッケージされる。組換え型レトロウイルス産生のプロトコル、およびこのようなウイルスのインビトロまたはインビボにおける細胞感染のプロトコルは、「分子生物学の最新プロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら編、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１０〜９．１４節、および他の実験マニュアルに記載されている。適切なレトロウイルスの例には、当業者に知られているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭなどがある。エコトロピックおよびアンフォトロピックなレトロウイルス系の両方の調製に使用される適切なパッケージングウイルス系列の例には、＊Ｃｒｉｐ、＊Ｃｒｅ、＊２、および＊Ａｍなどがある。レトロウイルスは、上皮細胞を始めとする多種多様な細胞へのインビトロおよび／またはインビボにおけるさまざまな遺伝子の導入に使用されている（例えばＥｇｌｉｔｉｓら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５〜１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０〜６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１〜６１４５；Ｈｕｂｅｒら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９〜８０４３；Ｆｅｒｒｙら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７〜８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２〜１８０５；ｖａｎＢｅｕｓｅｃｈｅｍら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０〜７６４４；Ｋａｙら、（１９９２）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１〜６４７；Ｄａｉら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２〜１０８９５；Ｈｗｕら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；国際公開公報第８９／０７１３６号；国際公開公報第８９／０２４６８号；国際公開公報第８９／０５３４５号；および国際公開公報第９２／０７５７３号を参照）。
【０１０５】
本発明に有用な別のウイルス遺伝子輸送系では、アデノウイルスに由来するベクターが使用される。アデノウイルスのゲノムは、対象遺伝子産物をコードして発現するが正常なウイルス溶解サイクルでは複製能力が活性をもたないように操作することができる。これについては例えばバークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）ら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１〜４３４；およびローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら、（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３〜１５５を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４、または他のアデノウイルス株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当技術分野で周知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染能力がないような特定の状況では有利な場合があり、また上皮細胞を始めとする多様な細胞種への感染に使用することができる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）、前記）。また、このようなウイルス粒子は比較的安定で精製および濃縮が容易であり、また上述したように、感染スペクトルに影響するように修飾することができる。また導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびこれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれずにエピソームとして維持されるので、導入ＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる、インサイチューにおける挿入変異誘発の結果生じる恐れのある問題が避けられる（例えばレトロウイルスＤＮＡ）。またアデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを保持する能力は、他の遺伝子輸送ベクターと比較して大きい（最長８ｋｂ）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前記；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。
【０１０６】
対象遺伝子の輸送に有用な、さらに別のウイルスベクター系がアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連ウイルスは天然の欠陥ウイルスであり、効率のよい複製および生産性の高い生活環をもたらすヘルパーウイルスとして別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど）を必要とする（総説はＭｕｚｙｃｚｋａら、（１９９２）Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９を参照）。これは、ウイルスＤＮＡを非分裂細胞に組み込み可能で、また高頻度の安定な組込みを示す数少ないウイルスの一種である（例えばＦｌｏｔｔｅら、（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３を参照）。３００塩基対ほどのＡＡＶを含むベクターがパッケージされて統合される場合がある。外因性ＤＮＡの入る空間は約４．５ｋｂに制限される。トラッチン（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ）ら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０に記載されているようなＡＡＶベクターを用いてＤＮＡを細胞に導入することができる。さまざまな核酸がＡＡＶベクターを用いることでさまざまな細胞種に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０を参照）。
【０１０７】
上述のウイルス輸送法に加えて、ウイルスを使用しない方法を用いることで、被験者の組織内でダイダロスの発現を誘導することもできる。ウイルスを使用しない遺伝子輸送法の多くは、哺乳類細胞が巨大分子を取り込んで細胞内に輸送する際に使用する正常な機構に基づく。好ましい態様では、本発明の非ウイルス遺伝子輸送系は、標的細胞が対象遺伝子を取り込むエンドサイトーシス経路に基づく。この種の例示的な遺伝子輸送系には、リポソームに由来する系、ポリリシンコンジュゲート、および人工ウイルスエンベロープなどがある。他の態様には、メウリ（Ｍｅｕｌｉ）ら、（２００１）ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．１１６（１）：１３１〜１３５；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、（２０００）ＧｅｎｅＴｈｅｒ７（２２）：１８９６〜９０５；またはタム（Ｔａｍ）ら、（２０００）ＧｅｎｅＴｈｅｒ７（２１）：１８６７〜７４に記載されている系のようなプラスミド注入系などが含まれる。
【０１０８】
代表的な態様では、ダイダロスをコードする遺伝子は、表面に正電荷を有し、また（選択的に）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体のタグが付けられるリポソーム（例えばリポフェクチン）内に閉じこめることができる（Ｍｉｚｕｎｏら、（１９９２）脳神経外科、２０：５４７〜５５１；国際公開公報第９１／０６３０９号；日本特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許出願公開第Ａ−４３０７５号）。
【０１０９】
臨床の場では、治療的遺伝子の遺伝子輸送系は、当技術分野でよく知られている任意のいくつかの方法で患者に導入することができる。例えば遺伝子輸送系の薬学的調製物は、例えば静脈内注射によって全身的に導入することが可能であり、また標的細胞へのタンパク質の特異的な形質導入は、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列に基づく、遺伝子輸送体、細胞種発現もしくは組織型発現、またはこれらの組み合わせから提供されるトランスフェクションの特異性から主に生じる。他の態様では、組換え遺伝子の初期輸送は、かなり局在化されて動物への導入に比較的限定されている。例えば、このような遺伝子輸送体はカテーテルで導入することができる（米国特許第５，３２８，４７０号参照）ほか、定位的注入で導入することができる（例えばＣｈｅｎら、（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４〜３０５７）。
【０１１０】
遺伝子治療コンストラクトの薬学的調製物は、許容される希釈液中に含まれる遺伝子輸送系を本質的に含む場合があるほか、遺伝子輸送体が埋め込まれる徐放性基質を含む場合がある。または、完全な遺伝子輸送系が組換え細胞から完全な状態で作製される場合（例えばレトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子輸送系となる一種または複数の細胞を含む場合がある。
【０１１１】
細胞療法
本明細書に記載されたダイダロス分子は、ダイダロスの生産を調節するヌクレオチド配列（例えばダイダロス、そのポリペプチド、または機能性断片、もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列）、プロモーター配列（例えばダイダロス遺伝子、または別の遺伝子のプロモーター配列；エンハンサー配列（例えば５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えばダイダロス遺伝子もしくは別の遺伝子の３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インスレーター配列；またはダイダロス分子の発現を調節する別の配列を細胞（例えば神経前駆細胞、神経細胞、または非神経細胞）に導入することで被験者において上昇する場合もある。このような細胞を次に被験者に導入することができる。
【０１１２】
遺伝子を改変する対象の一次細胞および二次細胞は、さまざまな組織から得られ、培養物中で増殖状態で維持可能な細胞種を含む。例えば一次細胞および二次細胞は、繊維芽細胞、グリア細胞、神経前駆細胞、神経細胞、血液の構成要素（例えばリンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞（筋芽細胞）、およびこれら体細胞の前駆細胞、角質細胞、上皮細胞（例えば乳腺上皮細胞、腸管上皮細胞）、内皮細胞を含む。一次細胞は好ましくは、遺伝的に改変された一次細胞または二次細胞が投与される者から得られる。しかし一次細胞は、ドナー（レシピエント以外）から得られる場合がある。
【０１１３】
「一次細胞」という表現は、脊椎動物の組織供給源から（プレートへの分注前、すなわちディッシュやフラスコなどの組織培養基材への結合前に）単離された細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織由来の外植片中に存在する細胞（両種の細胞とも初めてプレーティングされるもの）、およびプレーティングされた細胞に由来する細胞懸濁液を含む。「二次細胞」または「細胞株」という表現は、すべての続く培養段階にある細胞を意味する。二次細胞は、１回または複数回継代された二次細胞を含む細胞株である。
【０１１４】
脊椎動物、特に哺乳類起源の一次細胞または二次細胞には、シグナルペプチド、および／または異種核酸配列（例えばダイダロス、またはこの作用物質もしくは拮抗物質をコードする配列）をコードする核酸配列を含む外因性核酸配列をトランスフェクトすることが可能であり、またコードされた産物を安定かつ再現性よくインビトロおよびインビボで長期にわたって産生する。異種アミノ酸は、発現（例えば内因性配列の誘導性の発現または発現増加）を誘導する調節配列（例えばプロモーター）の場合もある。外因性核酸配列は、例えば内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，６４１，６７０号に記載されているように相同組換えにより一次細胞もしくは二次細胞に導入することができる。トランスフェクトされた一次細胞または二次細胞は、同定および単離を促進する、選択可能な表現型をもたらす選択マーカーをコードするＤＮＡを含む場合もある。
【０１１５】
脊椎動物の組織は、対象となる一次細胞種の組織供給源を得るパンチ生検、または他の外科的方法などの標準的な方法で得られる。例えばパンチ生検では、皮膚が繊維芽細胞または角質細胞の供給源として得られる。一次細胞の混合物は、酵素による切断、または外植などの既知の方法で組織から得られる。酵素による切断を行う場合は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ジスパーゼ、プロナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、およびキモトリプシンなどの酵素を使用することができる。
【０１１６】
結果として得られる一次細胞混合物は直接トランスフェクトすることができるほか、最初に培養して、培養プレートから剥がし、さらに再懸濁してからトランスフェクションを実施することができる。一次細胞または二次細胞を外因性核酸配列と混合して、例えばゲノムに安定に組み込み、またトランスフェクションを達成するために処理を行う。本明細書で用いられる「トランスフェクション」という表現は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムによる沈殿、微量注入、ＤＥＡＥ−デキストリントランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーション（いずれも当技術分野で常用の方法）を含む、外因性核酸を細胞内に導入するさまざまな手法を含む。
【０１１７】
トランスフェクトした一次細胞または二次細胞は十分な倍加期間を確保することで、個人に有効量の治療的タンパク質を提供する十分な規模のクローン細胞株または異種細胞株のいずれかとなる。トランスフェクトしたクローン異種細胞株に必要な細胞の数はさまざまであり、またトランスフェクトした細胞の用途、トランスフェクト細胞に含まれる外因性ＤＮＡの機能レベル、トランスフェクトした細胞の移植部位（例えば、使用可能な細胞数は移植される解剖学的部位により制限される）、および患者の年齢、体表面積、および臨床状態を含むがこれらに限定されないさまざまな因子によって変わる。
【０１１８】
トランスフェクトした細胞、例えば本明細書に記載された手順で作製された細胞は、産物が輸送される者に導入することができる。さまざまな投与経路およびさまざまな部位（例えば腎被膜下、皮下、中枢神経系（髄腔内を含む）、血管内、肝内、内臓内、腹腔内（大網内を含む）、筋肉内への移植）を採用することができる。個体に移植されたトランスフェクト細胞は、異種ＤＮＡにコードされた産物を産生するか、または異種ＤＮＡそのものによる影響を受ける。例えば神経疾患患者は、本明細書に記載されたダイダロス分子を産生する細胞の移植を受ける候補となる。
【０１１９】
免疫抑制剤（例えば薬剤または抗体）は、所望の治療効果（例えば細胞の拒絶の抑制）を十分達成する用量を被験者に投与することができる。免疫抑制剤の用量範囲は当技術分野で周知である。これについては例えばフリード（Ｆｒｅｅｄ）ら、（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４９；スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４１；ウィドナー（Ｗｉｄｎｅｒ）ら、（１９９２）ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５５６を参照されたい。投与量は、個対象の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子によって変動する場合がある。
【０１２０】
細胞の分化を制御する方法
本発明の別の局面は、細胞内におけるダイダロスの発現を調節することで細胞の分化を制御する方法に関する。このような細胞は、神経細胞（例えば神経前駆細胞）、または分化方向が決定した神経細胞、または非神経細胞のいずれかの場合がある。細胞内におけるダイダロスの発現を調節することは、細胞の神経分化の制御に使用される場合がある。
【０１２１】
一つの態様では、細胞内におけるダイダロスの発現は、例えばダイダロスの発現を上昇させる化合物で細胞を処理することで上昇する。ダイダロスの発現の上昇は、細胞内における神経分化を阻害したり拮抗したりする場合がある。これは例えば、過度の神経分化を特徴とする細胞内において、または分化を抑制することで神経前駆細胞集団を維持する手法の一部として望ましい。
【０１２２】
細胞内におけるダイダロスの発現は、さまざまな方法で上昇させることができる。例えばダイダロスのポリペプチド、その断片、または類似体を細胞に添加することができる。ペプチドは細胞に直接アプライするか、または細胞を処理してペプチドがより効率的に細胞に取り込まれるようにすることができる。
【０１２３】
別の例では、ダイダロスのポリペプチド、その断片、または類似体をコードする核酸を細胞に添加することができる。核酸の例には、遺伝子治療法に使用される、本明細書に記載された核酸ベクターがある。このような核酸は、ダイダロスのコード領域、プロモーターなどの５’調節配列（ダイダロスもしくは別の遺伝子に由来する配列）、および／またはエンハンサー（ダイダロスもしくは別の遺伝子に由来する配列）；および／または３’非翻訳領域などの３’調節配列（例えばポリアデニル化部位）の全体または一部を含む場合がある。
【０１２４】
別の例では、細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる薬剤で細胞を処理する場合がある。このような薬剤は例えば、ダイダロスのプロモーターに結合する化合物、またはダイダロス遺伝子の調節配列を変化させる化合物の場合がある
【０１２５】
別の態様では、細胞内におけるダイダロスの発現は、例えばダイダロスの発現を低下させる化合物で細胞を処理することで低下する。このようなダイダロスの発現の低下は、細胞内における神経の分化を促進させる場合がある。これは例えば、不十分な神経分化、および／または望ましくない神経細胞増殖（例えば神経腫）を特徴とする細胞において、または神経前駆細胞の分化を促進することで、分化した神経細胞の集団を作る手法の一部として望ましい。
【０１２６】
ダイダロスの発現は、さまざまな方法により細胞内において低下させることができる。一例では、ダイダロスの核酸配列に結合することによりダイダロスの発現を低下させる化合物を細胞に投与することができる。このような化合物の例には、アンチセンス核酸およびリボザイムなどがある。別の例では、化合物は、ダイダロスポリペプチドに結合することによりダイダロスの発現を低下させる場合がある。このような化合物の例には、抗体、小分子、およびペプチドなどがある。また化合物は、細胞内における内因性ダイダロス遺伝子の発現を低下させることでダイダロスの発現を低下させる場合がある。
【０１２７】
一つの態様では、本発明は神経前駆細胞集団を得る方法を提供する。このような方法により、神経前駆細胞を含む細胞試料がインビトロまたはインビボで提供され、またダイダロスのレベルが細胞試料内において上昇する。神経前駆細胞内において発現されるダイダロスのレベルを上昇させることは、例えば神経前駆細胞の分化を妨げたり、増殖を誘導したりといったさまざまな作用をもつ場合がある。このような方法は、細胞試料に含まれる他の化合物（例えばＦＧＦ−２またはＥＧＦ）のレベルを上昇させる段階を含む場合もある。このような化合物は神経前駆細胞の増殖を誘導する場合があるが、ダイダロスはその分化を妨げる。
【０１２８】
神経前駆細胞内におけるダイダロスの発現または活性を阻害することで神経細胞集団を得る方法も本発明に含まれる。神経前駆細胞内におけるダイダロスの発現または活性の阻害は、神経前駆細胞の分化を誘導する場合がある。したがって、このような方法により、分化した神経細胞、分化方向が決定した神経細胞の集団の増殖がインビトロまたはインビボで可能となる。ダイダロスの発現または活性は、本発明に記載された化合物で細胞を処理することで阻害することができる。このような化合物は例えば、細胞内においてダイダロスのｍＲＮＡ、ダイダロスのタンパク質、またはダイダロスの遺伝子と干渉する場合がある。
【０１２９】
神経細胞、例えば上述の方法でインビボまたはインビトロで増殖した分化した神経細胞は、例えば神経変性疾患の治療に使用することができる。一つの局面では、神経細胞は、インビトロで増殖させた後に、被験者の神経変性領域に導入することができる。神経細胞は、被験者の所望の位置への細胞の輸送を生じる任意の投与経路（例えば直接的な定位的注射）で被験者に導入することができる。別の局面では、上述の方法により、神経変性部位における神経前駆細胞の増殖および／または分化がインビボで可能となる。
【０１３０】
トランスジェニック動物
本発明はトランスジェニック動物を含む。このトランスジェニック動物は、ダイダロス導入遺伝子を含む（同動物の）細胞を含み、また好ましくは（選択的ではあるが）内因性または外因性のダイダロス遺伝子を１個もしくは複数の細胞内において発現する（もしくは異所性発現する）。
【０１３１】
ダイダロス導入遺伝子は、変異型ダイダロスポリペプチドをコードする場合がある。このような動物は疾患モデルとして使用することができるほか、ダイダロスの異所性発現を正すのに有効な薬剤のスクリーニングに使用することができる。またはダイダロスは、野生型タンパク質をコードする場合があるほか、その相同体（作用物質および拮抗物質の両方を含む）、ならびにアンチセンスコンストラクトをコードする場合がある。好ましい態様では、このような導入遺伝子の発現は、例えば所望のパターンで発現を制御するシス制御配列を用いる細胞または組織の特定の細胞サブセットに制限される。組織特異的な調節配列、および条件的調節配列を用いることで、導入遺伝子の発現を特定の空間的パターンで制御することができる。発現の時間的なパターンは例えば、条件的組換え系、または原核生物の転写調節配列により決まる場合がある。好ましい態様では、トランスジェニック動物は「ノックアウト」ダイダロス遺伝子、すなわち全体または一部が欠失したダイダロス遺伝子を有する。
【０１３２】
部位特異的な遺伝的操作によりインビボで調節される導入遺伝子の発現を可能とする遺伝的手法は当業者に周知である。例えば、標的配列の遺伝子組換えを触媒するリコンビナーゼの調節された発現を可能とする遺伝子系が使用される。本明細書で用いられる「標的配列」という表現は、リコンビナーゼによって遺伝的に組換えられるヌクレオチド配列を意味する。標的配列にはリコンビナーゼ認識配列が隣接しており、また一般にリコンビナーゼ活性を発現する細胞内において切り出されたり逆転したりする。リコンビナーゼが触媒する組換え事象は、標的配列の組換えが、被験者のダイダロス遺伝子の発現の活性化または抑制のいずれかを生じるように設計することができる。例えば、作用物質状の相同体をコードする配列のような、組換えダイダロス遺伝子の発現と干渉する標的配列の切り出しは、同遺伝子の発現を活性化するように設計することができる。タンパク質の発現に対するこのような干渉は、ダイダロス遺伝子をプロモーター配列や内部停止コドンから空間的に引き離すといった、さまざまな機構によって生じる場合がある。
【０１３３】
また導入遺伝子は、遺伝子のコード配列が、リコンビナーゼ認識部位と隣接して、最初にプロモーター配列に対して３’→５’方向に細胞にトランスフェクトされるように作製することができる。このような場合、標的配列の逆位により、コード配列の５’端を、プロモーターによる転写活性化を可能とするプロモーター配列に関する方向に配置することで対象遺伝子の方向が変わる場合がある。これについては例えばバクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼの系に関する記述（Ｌａｋｓｏら、（１９９２）ＰＮＡＳ８９：６２３２〜６２３６；Ｏｒｂａｎら、（１９９２）ＰＮＡＳ８９：６８６１〜６８６５）、または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼの系に関する記述（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１〜１３５５；国際公開公報第９２／１５６９４号）を参照されたい。標的配列の遺伝的組換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。リコンビナーゼの発現は、調節制御を受ける（例えば組織特異的な、発生段階特異的な、系外から添加した薬剤によって誘導されたり抑制可能であったりするプロモーター配列によって調節可能な場合がある。このような調節型制御は、リコンビナーゼの発現にプロモーター配列が関与する細胞のみにおいて標的配列の遺伝的組換えを生じる場合がある。したがって組換えダイダロス遺伝子の発現の活性化は、リコンビナーゼ発現の制御を介して調節される場合がある。
【０１３４】
同様の条件的導入遺伝子は、同時に発現させて導入遺伝子の発現を促進させるために原核生物のタンパク質を必要とする原核生物のプロモーター配列を用いて提供される場合がある。例示的なプロモーター、および対応する原核生物のトランス活性化タンパク質は、米国特許第４，８３３，０８０号に記載されている。また条件的導入遺伝子の発現は、トランス活性化タンパク質（例えばリコンビナーゼ、または原核生物のタンパク質）をコードする遺伝子を組織に輸送して細胞種に特異的に発現させる遺伝子治療様の方法により誘導することができる。この方法により、ダイダロス導入遺伝子は、トランス活性化因子の導入によって「オンの状態となる」まで成体でサイレントな状態を維持すると考えられる。
【０１３５】
検出可能なマーカー（例えば蛍光マーカーまたは発光マーカー（例えばＧＦＰ））をコードする領域に使用可能に連結されたダイダロスの制御領域を含む導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、または同動物に由来する細胞もしくは組織も含まれる。したがって検出可能なマーカーは、トランスジェニック動物におけるダイダロスの発現を評価するための指標として作用する。例えば検出可能なマーカーが蛍光マーカー（例えばＧＦＰ）の場合、マーカーの発現は、動物の組織（皮膚または神経組織）を対象とした共焦点顕微鏡で検出することができる。
【０１３６】
断片および類似体の産生
本発明は、ダイダロスポリペプチドの一次アミノ酸構造を提供する。このコア構造の例が提供されれば、当業者であれば、断片または類似体が提供されることで、また活性に関して新規に提供された構造を検討することで、開示された構造を改めることができる。断片および類似体の作製および検討を可能とする先行技術の方法の例を以下に記載する。これらの方法、または類似の方法により、少なくとも一つの生物学的活性（例えばダイダロスポリペプチドに特異的な抗体（例えばモノクローナル抗体）との反応性）を有するダイダロスポリペプチドの断片および類似体を作製したりスクリーニングを実施したりすることができる。
【０１３７】
断片の作製
タンパク質の断片は複数の方法、例えば組換え的方法により、タンパク質分解による切断により、または化学的に合成することにより作製することができる。ポリペプチドの内部または末端の断片は、ポリペプチドをコードする核酸の一端（末端断片の場合）または両端（内部断片の場合）の１個または複数のヌクレオチドを除去することで作製することができる。変異を誘発したＤＮＡ産物を発現させることでポリペプチド断片が得られる。したがって「末端から少しずつ消化する（ｅｎｄ−ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼで消化することで、一連の断片をコードするＤＮＡが得られる。タンパク質の断片をコードするＤＮＡは、無作為剪断、制限酵素による切断、または上述の方法の組み合わせによって作製することもできる。
【０１３８】
断片は、従来のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）による固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ法などの当技術分野で周知の方法で化学的に合成することもできる。例えば本発明のペプチドは、断片の重複がなく所望の長さをもつ断片に任意に分割することができるほか、所望の長さをもつ重複断片に分割することができる。
【０１３９】
改変型ＤＮＡ配列およびペプチド配列の作製：ランダム法
タンパク質のアミノ酸配列の異型は、タンパク質、またはタンパク質の特定のドメインもしくは領域をコードするＤＮＡのランダム変異誘発で調製することができる。有用な方法には、ＰＣＲによる変異誘発、および飽和的変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などがある。ランダムなアミノ酸配列の異型のライブラリーは、一連の縮重オリゴヌクレオチド配列を合成することで作製することもできる（異型のライブラリーに含まれるタンパク質のスクリーニング法については諸文献に記載されている）。
【０１４０】
ＰＣＲによる変異誘発
ＰＣＲによる変異誘発では、厳密性を低下させたＴａｑポリメラーゼを用いて、ランダムな変異をＤＮＡのクローニング断片に導入する（Ｌｅｕｎｇら、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１：１１〜１５）。これは、ランダム変異を導入する非常に強力かつ比較的迅速な方法である。変異を誘発するＤＮＡ領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の厳密性を低下させた条件下で、例えば比が５のｄＧＴＰ／ｄＡＴＰを使用し、またＭｎ^２＋をＰＣＲ反応に添加して増幅する。増幅後のＤＮＡ断片のプールを適切なクローニングベクターに挿入することで、ランダム変異体ライブラリーが得られる。
【０１４１】
飽和的変異誘発
飽和的変異誘発により、多数の１塩基置換をクローニングＤＮＡ断片に速やかに導入することができる（Ｍａｙｅｒｓら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：２４２）。この手法には、（例えばインビトロでの一本鎖ＤＮＡを対象とした化学的処理または放射線照射による）変異体の作製、および相補ＤＮＡ鎖の合成が含まれる。変異の出現頻度は、処置の強度を調整することで調節することが可能であり、また実質的にすべての置換を得ることができる。この手法では、変異型断片に対する遺伝的選択は行われないので、中立的置換、ならびに機能を変化させる置換が得られる。点突然変異の分布は、保存配列に対してバイアスが存在しない。
【０１４２】
縮重オリゴヌクレオチド
相同体のライブラリーは、一連の縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することもできる。縮重配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で行うことが可能であり、次に合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結する。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で周知である（例えばＮａｒａｎｇ、ＳＡ、（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）「組換えＤＮＡ、第３回クリーブランドシンポジウム紀要（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，Ｐｒｏｃ３ｒｄＣｌｅｖｅｌａｎｄＳｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ＡＧＷａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３〜２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１１：４７７を参照）。このような方法は、他のタンパク質の指向性進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に用いられている（例えばＳｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６〜３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ８９：２４２９〜２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ８７：６３７８〜６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，１９８，３４６号、および米国特許第５，０９６，８１５号を参照）。
【０１４３】
改変型ＤＮＡ配列およびペプチド配列の作製：指向性変異誘発法
非ランダムまたは指向性の変異誘発法により、特定の領域において特定の配列または変異を提供することができる。このような手法により、タンパク質の既知アミノ酸配列の残基の例えば欠失、挿入、または置換を含む異型を作製することができる。変異が生じる部位は例えば（１）第一のアミノ酸を保存アミノ酸と置換した後に、達成される結果に応じてさらに程度の高い選択を行うこと、（２）標的残基を欠失させること、または（３）位置する部位に隣接する同じクラスもしくは異なるクラスの残基を挿入すること、または（１）〜（３）の組み合わせにより、個別に、または連続的に修飾することができる。
【０１４４】
アラニンスキャンニング変異誘発
アラニンスキャンニング変異誘発は、変異誘発に好ましい位置もしくはドメインの所望のタンパク質の特定の残基または領域を同定する有用な方法である（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１〜１０８５、１９８９）。アラニンスキャンニングでは、標的残基の残基または官能基（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電性残基）を同定し、中性または負に帯電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）と置換する。アミノ酸を置換することで、細胞内外におけるアミノ酸と周囲の水性環境との相互作用に影響を及ぼすことが可能となる。置換に対して機能的な感受性を示すドメインは次に、さらに異型または他の異型を、置換部位または置換したい部位に導入することで改良される。したがって、アミノ酸配列の異型を導入する部位が事前に決定されるが、変異そのものの性質を事前に決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における変異実行（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆａｍｕｔａｔｉｏｎ）を最適なものとするためには、アラニンスキャンニング変異誘発、またはランダム変異誘発を標的となるコドンもしくは領域を対象に行い、発現された所望のタンパク質サブユニットの異型を対象に、所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングを行う。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発
オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発は、ＤＮＡの置換、欠失、および挿入の異型を調製する有用な方法である（例えばＡｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ２：１８３、１９８３を参照）。簡単に説明すると、所望のＤＮＡを、変異をコードするオリゴヌクレオチドとＤＮＡ鋳型とのハイブリッドを形成させることで変化させる（鋳型は所望のタンパク質の未変化または天然のＤＮＡ配列を含む一本鎖のプラスミドまたはバクテリオファージとする）。ハイブリダイゼーション後にＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の第二の相補鎖全体を合成する（これは、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込むことになり、また所望のタンパク質のＤＮＡに、選択された変化をコードすることになる）。一般に、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側で鋳型に完全に相補的な１２〜１５ヌクレオチドである。これにより、オリゴヌクレオチドが一本鎖のＤＮＡ鋳型分子と適切にハイブリッドを形成するようになる。このようなオリゴヌクレオチドは、クレア（Ｃｒｅａ）ら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ、７５：５７６５、［１９７８］）に記載されているような当技術分野で周知の手法で容易に合成される。
【０１４６】
カセット変異誘発
異型を調製する別の方法であるカセット変異導入は、ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）ら、（Ｇｅｎｅ、３４：３１５、［１９８５］）に記載された手法に基づく。出発材料は、変異を誘発させる対象となるタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異を誘発させる対象となるタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのコドンを同定する。一か所しかない制限酵素切断部位が、同定される変異部位のいずれかの側に存在しなければならない。このような制限酵素切断部位がない場合は、上述のオリゴヌクレオチドによる変異誘発で切断部位を作製し、それを所望のタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの適切な位置に導入することができる。制限酵素切断部位をプラスミドに導入した後に、同プラスミドを同部位で切断して直線状とする。制限酵素切断部位間のＤＮＡ配列をコードするが、所望の変異（群）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを標準的な手順で合成する。二本の鎖を個別に合成した後に、標準的な手法でハイブリッドを形成させる。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。カセットは、プラスミドに直接連結されるように、直線化プラスミドの末端に対応する３’端および５’端をもつように設計されている。こうして得られたプラスミドは、変異型の所望のタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む。
【０１４７】
組み合わせ変異誘発
組み合わせ変異誘発によっても、変異体、例えば核酸レベルにおける組み合わせ変異誘発で作製される異型、および雑多な構成の（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）遺伝子ライブラリーにコードされる異型を集めたライブラリーを作製することができる。例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素を用いて連結することで、配列の縮重したセットが個々のペプチドとして、または縮重配列のセットを含む一連の大型融合タンパク質として発現可能な遺伝子配列とすることができる。
【０１４８】
ペプチド断片または相同体のライブラリーをスクリーニングする一次高スループット法
当技術分野では、作製された変異遺伝子産物をスクリーニングするためのさまざまな手法が知られている。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングする手法は、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングする段階、結果として得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換する段階、および所望の活性（例えばこの場合であればダイダロスポリペプチドに特異的な抗体に対する結合）を検出する条件下で遺伝子を発現させる段階を含むことが多い。後述する個々の手法は、例えばランダム変異誘発法で作られた多数の配列をスクリーニングする高スループット解析に適している。
【０１４９】
ディスプレイライブラリー
スクリーニングアッセイ法に対する一つのアプローチでは、候補ペプチドを細胞表面またはウイルス表面に提示し、特定の細胞またはウイルス粒子が、提示された産物を介して適切な受容体タンパク質と結合する能力を、「パニングアッセイ法」で検出する。例えば遺伝子ライブラリーを、細菌細胞の表面膜タンパク質の遺伝子にクローニングし、結果として得られた融合タンパク質をパニングで検出する（Ｌａｄｎｅｒら、国際公開公報第８８／０６６３０号；Ｆｕｃｈｓら、（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０〜１３７１；およびＧｏｗａｒｄら、（１９９２）ＴＩＢＳ１８：１３６〜１４０）。同様に、検出可能な標識を付けたリガンドを用いることで、機能をもつと考えられるペプチド相同体を評点化することができる。蛍光標識リガンド（例えば受容体）を用いて、リガンド−結合活性を保持する相同体を検出することができる。蛍光標識を付けたリガンドを使用することで、蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚的に調べ、また分離することが可能となるほか、細胞の形態が許せば蛍光活性化細胞選別装置で分離することができる。
【０１５０】
遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子表面に融合タンパク質として発現させることができる。例えば繊維状ファージ系では、外来のペプチド配列を感染性ファージ表面に発現させることで、二つの重要な利点が得られる。第一の利点は、このようなファージを、アフィニティマトリックスに、ファージの個数にして１０^１３個／ｍｌを優に超える濃度でアプライできるので、多数のファージを同時にスクリーニング可能である。第二の利点は、個々の感染性ファージが遺伝子産物をその表面に提示するので、特定のファージがアフィニティマトリックスから低収率で回収される場合、そのファージをさらなる感染を行うことで増幅することができる。ほぼ同一の大腸菌の繊維状ファージＭ１３、ｆｄ、およびｆ１のグループは、ファージディスプレイライブラリーに極めて頻繁に使用されている。ファージのコートタンパク質ｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩのいずれかを使用することで、ウイルス粒子の最終的なパッケージングを損なうことなく融合タンパク質を作製することができる。外来エピトープはｐＩＩＩのＮＨ_２末端で発現させることが可能なので、このようなエピトープをもつファージを、同エピトープを欠く大過剰のファージから回収することができる（Ｌａｄｎｅｒら、国際公開公報第９０／０２９０９号；Ｇａｒｒａｒｄら、国際公開公報第９２／０９６９０号；Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７〜１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９９３）ＥＭＢＯＪ１２：７２５〜７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４〜６２８；およびＢａｒｂａｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ８９：４４５７〜４４６１）。
【０１５１】
一般的なアプローチでは、大腸菌のマルトース受容体（外膜タンパク質ＬａｍＢ）がペプチド融合パートナーとして使用される（Ｃｈａｒｂｉｔら、（１９８６）ＥＭＢＯ５、３０２９〜３０３７）。オリゴヌクレオチドを、ＬａｍＢ遺伝子をコードするプラスミドに挿入することで、同タンパク質の細胞外ループの一つに融合したペプチドが作られている。このようなペプチドは、リガンド（例えば抗体）との結合に使用することが可能であり、また細胞を動物に投与して免疫応答を誘導することができる。他の細胞表面タンパク質、例えばＯｍｐＡ（Ｓｃｈｏｒｒら、（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、３８７〜３９２）、ＰｈｏＥ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇら、（１９９０）Ｇｅｎｅ８８、３７〜４５）、およびＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ９、１３６９〜１３７２）、ならびに大型の細菌表面構造がペプチドディスプレイの輸送体として使用されている。重合して線毛（細菌間における遺伝情報の交換を担う小管）を形成するタンパク質であるピリンにはペプチドを融合させることができる（Ｔｈｉｒｙら、（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．５５、９８４〜９９３）。他の細胞との相互作用に役割を果たす線毛は、ペプチドを細胞外環境に提示する際の有用な支持体となる。ペプチドの提示に使用される別の大型表面構造が、細菌の運動性器官の鞭毛である。ペプチドを、鞭毛のサブユニットタンパク質であるフラジェリンと融合させることで、多くのペプチドの一連の濃密なコピーが宿主細胞上に得られる（Ｋｕｗａｊｉｍａら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６、１０８０〜１０８３）。他の細菌種の表面タンパク質もペプチド融合パートナーとして使用されている。このような例には、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のタンパク質Ａ、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の外膜プロテアーゼＩｇＡなどがある（Ｈａｎｓｓｏｎら、（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、４２３９〜４２４５、およびＫｌａｕｓｅｒら、（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９、１９９１〜１９９９）。
【０１５２】
上述の繊維状ファージ系およびＬａｍＢ系では、ペプチドとそれをコードするＤＮＡ間の物理的な連結が、表面にペプチドをもつ粒子（細胞またはファージ）内にＤＮＡを封じ込めることにより生じる。ペプチドを捕捉することは、粒子および内部のＤＮＡを捕捉することである。別のスキームでは、ＤＮＡ結合タンパク質ＬａｃＩを用いてペプチドとＤＮＡを連結する（Ｃｕｌｌら、（１９９２）ＰＮＡＳＵＳＡ８９：１８６５〜１８６９）。この系では、３’端にオリゴヌクレオチドクローニング部位をもつ、ＬａｃＩ遺伝子を含むプラスミドを使用する。アラビノースで誘導を制御することで、ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質が作られる。この融合物は、ＬａｃＯオペレーター（ＬａｃＯ）として知られる短いＤＮＡ配列とＬａｃＩとの天然の結合能力を保持している。２コピーのＬａｃＯを発現プラスミド上に配置することで、ＬａｃＩ−ペプチド融合物は、これをコードするプラスミドに強固に結合する。各細胞に含まれるプラスミドは、一つのオリゴヌクレオチド配列しか含まず、また各細胞は一種のペプチド配列のみを発現するので、このようなペプチドは、合成を誘導するＤＮＡ配列と特異的かつ安定に結合する。このようなライブラリーの細胞を緩やかに溶解することで、ペプチド−ＤＮＡ複合体を、固定化状態の受容体のマトリックスに曝露させ、活性ペプチドを含む複合体を回収することができる。次に、結合状態のプラスミドＤＮＡを細胞に再び導入し、増幅およびＤＮＡ配列決定を行うことでペプチドリガンドの正体を決定する。この方法は実用に耐えることが示されており、ドデカペプチドの大規模なランダムライブラリーが作製され、オピオイドペプチドであるダイノルフィンＢに対するモノクローナル抗体が選択されている。いずれもダイノルフィンＢの６残基部分に関連する共通配列に関連したペプチドコホートが回収された（Ｃｕｌｌら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９〜１８６９）。
【０１５３】
このスキームは、ペプチド−オン−プラスミドと呼ばれることがあり、二つの重要な点においてファージディスプレイ法とは異なる。第一に、このペプチドは融合タンパク質のＣ末端に結合されており、自由端であるカルボキシ末端を有するペプチドとしてライブラリー成分が提示される。繊維状ファージのコートタンパク質ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩはいずれも、そのＣ末端を介してファージに結合しており、ゲストとなるペプチドは、外向きに伸長するＮ末端ドメイン内に配置される。一部の設計では、ファージに提示されるペプチドは、融合タンパク質のアミノ末端の先端に提示される（Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８７、６３７８〜６３８２）。第二の差は、実際にライブラリー内に提示されるペプチド集団に影響を及ぼす一連の生物学的なバイアスが存在する点である。ＬａｃＩ融合分子は、宿主細胞の細胞質に局在する。ファージのコート融合物は、翻訳中に細胞質に短期間曝露されるが、内膜を介して速やかに周辺質区画内に分泌され、膜内にはＣ末端の疎水性ドメインが残され、ペプチドを含むＮ末端は周辺質に突出し、ファージ粒子内に集められるまで待機する。ＬａｃＩに含まれるペプチド、およびファージライブラリーは、異なるタンパク質分解活性に対する曝露の結果として大きく異なる場合がある。ファージのコートタンパク質は、内膜をはさむ輸送、およびシグナルペプチダーゼによるプロセシングをファージへの取り込み前に必要とする。一部のペプチドは、このような過程に有害な作用を及ぼすので、ライブラリー内でわずかにしか存在しない（Ｇａｌｌｏｐら、（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３〜１２５１）。このような特定のバイアスは、ＬａｃＩディスプレイ系に含まれる要素ではない。
【０１５４】
組換えランダムライブラリー中に存在する低分子量のペプチドの数は極めて多い。１０^７〜１０^９個の独立したクローンからなるライブラリーは問題なく調製される。１０^１１個ほどの組換え体からなるライブラリーが作製されているが、このサイズは、クローンライブラリーの実用上の限界に近い。ライブラリーの大きさに関するこの限界は、ランダムなセグメントを含むＤＮＡで、宿主である細菌細胞の形質転換を行う段階に効いてくる。このような限界を迂回するため、ポリソーム複合体中における新生ペプチドの提示に基づくインビトロ系が最近開発されている。このディスプレイライブラリー法は、現在使用可能なファージ／ファージミドライブラリー、またはプラスミドライブラリーと比べて３〜６桁大きいライブラリーを作り出す可能性がある。さらにライブラリーの構築、ペプチドの発現、およびスクリーニングは完全な無細胞系で行われる。
【０１５５】
この方法の一つの応用（Ｇａｌｌｏｐら、（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３〜１２５１）では、１０^１２個のデカペプチドをコードする分子ＤＮＡライブラリーが構築され、ライブラリーが大腸菌Ｓ３０のインビトロ転写／翻訳共役系で発現されている。条件は、ポリソームをｍＲＮＡ上で停止させ、かなりの量のＲＮＡをポリソーム中に蓄積させ、コードするＲＮＡと連結したままの新生ペプチドを含む複合体が得られるように選択された。ポリソームは、従来型に近い組換えペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニングとほぼ同じ程度に、固定化受容体上におけるアフィニティ精製に対して十分頑健である。ＲＮＡは、結合状態の複合体から回収され、ｃＤＮＡに変換され、またＰＣＲで増幅されて、後続の合成およびスクリーニングにおける鋳型となる。ポリソームディスプレイ法は、ファージディスプレイシステムと共役させることができる。複数回のスクリーニングに続き、ポリソームの濃縮プールに由来するｃＤＮＡをファージミドベクターにクローニングした。このベクターは、コートタンパク質と融合した状態のペプチドを提示するペプチド発現ベクターとして、またペプチドを同定する目的のＤＮＡ配列決定用ベクターの両方としてはたらく。ポリソームに由来するペプチドをファージ表面で発現させることで、この形式でアフィニティ選択手順を続行するか、または各クローン上におけるペプチドを対象に、ファージＥＬＩＳＡにおける結合能力、もしくは完全ファージＥＬＩＳＡにおける結合特異性を検討することができる（Ｂａｒｒｅｔら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ２０４、３５７〜３６４）。活性ペプチドの配列を同定するためには、ファージミドの宿主で作製されたＤＮＡの配列を決定する。
【０１５６】
二次スクリーニング
上述の高スループットアッセイ法に続いて二次スクリーニングを実施することで、例えば当業者による作用物質と拮抗物質の区別を可能とする別の生物学的な活性を同定することができる。使用される二次スクリーニングの種類は、検証が必要とされる所望の活性によって変わる。例えば、対象タンパク質とその各リガンド間における相互作用の阻害を可能とするアッセイ法を開発して、上述の一次スクリーニングの一つで単離されたペプチド断片の一群から拮抗物質を同定することができる。
【０１５７】
したがって、断片および類似体を作製する方法、およびそれらの活性を検討する方法は当技術分野で周知である。本明細書に記載されたダイダロスポリペプチドの一次アミノ酸配列のような対象タンパク質のコア配列が同定されれば、当業者にとって類似体および断片の入手は常用の手順で行うことができる。
【０１５８】
ダイダロスのペプチド類似体
ダイダロスポリペプチドのペプチド類似体は、好ましくは長さが４００アミノ酸、３００アミノ酸、２００アミノ酸、１５０アミノ酸、１３０アミノ酸、１１０アミノ酸、９０アミノ酸、７０アミノ酸未満、好ましくは長さが５０アミノ酸未満、最も好ましくは長さが３０アミノ酸、２０アミノ酸、または１０アミノ酸未満である。好ましい態様では、ダイダロスポリペプチドのペプチド類似体の長さは少なくとも約１０アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、または１３０アミノ酸である。
【０１５９】
ダイダロスポリペプチドのペプチド類似体は、天然のダイダロスポリペプチドと好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の相同性または配列類似性をもつ。
【０１６０】
ダイダロスポリペプチドのペプチド類似体は、天然のダイダロスポリペプチドとは少なくとも１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、５アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、または２０アミノ酸残基（かつこれらを越えない）が異なる。しかし好ましくは、天然のダイダロスポリペプチドよりも１５アミノ酸、１０アミノ酸、または５アミノ酸未満が異なる。
【０１６１】
ダイダロスポリペプチドの有用な類似体は作用物質または拮抗物質の場合がある。ダイダロスポリペプチドの拮抗物質は、イカロスファミリーのタンパク質と二量体を形成するが、いくつかの付加的な生物学的活性（神経発生を制御する遺伝子の転写活性化など）を欠く分子の場合がある。ダイダロスの拮抗物質および作用物質は、神経の成熟および機能を調節可能な（例えば阻害もしくは促進可能な）誘導体である。
【０１６２】
アンチセンス核酸の配列
本明細書に記載されたダイダロス分子をコードするヌクレオチドに対してアンチセンスの関係にある核酸分子は、ダイダロスの発現を阻害する薬剤として使用することができる。「アンチセンス」の核酸は、成分をコードする「センス」の核酸に相補的な（例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であったり、またはｍＲＮＡ配列に相補的なあったりする）ヌクレオチド配列を含む。したがってアンチセンスの核酸は、センスの核酸と水素結合を形成することができる。アンチセンス核酸は、コード鎖全体に対して、またはその一部のみに対して相補的な場合がある。例えば、成分をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスの関係にあるアンチセンスの核酸分子が使用されることがある。
【０１６３】
ダイダロスをコードするコード鎖の配列は明らかにされている。このようなタンパク質をコードするコード鎖の配列がわかれば、ワトソン−クリックの塩基対合の規則にしたがってアンチセンスの核酸を設計することができる。アンチセンスの核酸分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的な場合があるが、より好ましくはｍＲＮＡのコード領域もしくは非コード領域の一部に対してのみアンチセンスの関係にあるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に対して相補的な場合がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、例えば約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、または５０ヌクレオチドの場合がある。アンチセンスの核酸は、当技術分野で周知の手順により、化学合成法および酵素的連結反応で構築することができる。例えばアンチセンスの核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を上昇させるように、もしくはアンチセンスの核酸とセンスの核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を上昇させるように設計されたさまざまに修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することが可能であり、例えばホスホロチオエート誘導体、およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用される場合がある。アンチセンスの核酸の作製に使用可能な修飾型ヌクレオチドの例には５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンなどがある。または、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス方向にサブクローニングする発現ベクターを用いることで生物学的に作製することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、対象となる標的核酸に対してアンチセンス方向となる）。
【０１６４】
抗体
本発明は、被験者のダイダロスポリペプチドに対して特異的に反応する抗体も含む。抗タンパク質／抗ペプチドの血清またはモノクローナル抗体は標準的なプロトコルで作製することができる（例えば「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ：１９８８）を参照）。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳類は、免疫原性状態のペプチドで免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性をもたらす手法には、担体への結合、または当技術分野で周知の他の手法などがある。被験者のダイダロスポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することでモニタリングすることができる。標準的なＥＬＩＳＡ、または他の免疫アッセイ法では免疫原を抗原として用いることで抗体レベルを評価することができる。好ましい態様では、被験者の抗体は、本発明のダイダロスポリペプチドの抗原決定基に対して免疫特異的である。
【０１６５】
本明細書で用いられる「抗体」という表現は、ダイダロスポリペプチドにも特異的に反応する、その断片を含むことを意図する。抗体は従来の手法で断片化することが可能であり、断片を対象に、抗体全体に関して既に説明した同じ方法で有用性に関するスクリーニングを実施することができる。例えばＦ（ａｂ’）_２断片は、抗体をペプシンで処理して得られる。結果として得られたＦ（ａｂ’）_２断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元してＦａｂ’断片を得ることができる。
【０１６６】
ダイダロスポリペプチド、その断片もしくは類似体に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Ａｂ）、ならびにＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２などの抗体断片はいずれも、ダイダロスポリペプチドの作用をブロックする際に、また本発明のダイダロスペプチドが果たす役割を調べる際に使用することができる。
【０１６７】
ダイダロスポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体も、ダイダロスポリペプチドの発現の量およびパターンの評価を目的とした組織試料の免疫組織化学的な染色に使用される場合がある。抗ダイダロスポリペプチド抗体は、免疫沈殿、および免疫ブロッティングで診断的に使用することで、臨床検査の手順の一部として組織もしくは体液に含まれる野生型または変異型のダイダロスポリペプチドのレベルの検出および評価を行うことができる。同様に、個体におけるダイダロスポリペプチドのレベルをモニタリングする能力により、リンパ球の分化および／または増殖の調節に関連する疾患に罹患した患者を対象とする任意の治療法の効率を決定することができる。ダイダロスポリペプチドのレベルは、生検などで得られる組織を対象に測定することができる。
【０１６８】
本発明の抗ダイダロス抗体の別の応用は、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ、およびλＯＲＦ８などの発現ベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングである。正しい読み枠および方向に挿入されたコード配列を有する、この種のメッセンジャーライブラリーからは融合タンパク質が得られる場合がある。例えばλｇｔ１１は、アミノ末端にβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸を含み、またカルボキシ末端に外来ポリペプチドを含む融合タンパク質を生産する。被験者のダイダロスポリペプチドの抗原性エピトープは次に、例えば感染プレートから転写したニトロセルロースフィルターを抗ダイダロスポリペプチド抗体と反応させるように、抗体を用いて検出することができる。このアッセイ法で評点化されるファージは次に、感染プレートから単離することができる。したがって、ダイダロス相同体の存在は、他の動物から検出およびクローニングすることが可能であり、また別のイソ型（スプライシング異型を含む）をヒト供給源から検出およびクローニングすることができる。
【０１６９】
薬剤のスクリーニングアッセイ法
使用可能な精製された組換え型ダイダロスポリペプチドを作製することで本発明は、正常な細胞機能（この場合は被験者のダイダロスポリペプチド）の作用物質もしくは拮抗物質である薬剤のスクリーニングに使用可能なアッセイ法を提供する。一つの態様では、このアッセイ法は、化合物がもつ、ダイダロスポリペプチドと天然リガンド（例えばダイダロスポリペプチドに特異的な抗体）間の結合を調節する能力を評価する。さまざまなアッセイ法のフォーマットは十分であり、また本発明に関して当業者により理解されると思われる。
【０１７０】
化合物および天然の抽出物のライブラリーを検討する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、一定時間に調べられる化合物の数を最大とするために高スループットのアッセイ法が望ましい。精製されたタンパク質、もしくは半精製されたタンパク質から始める場合のある、無細胞系で行われるアッセイ法は、迅速な展開および試験化合物が介在する分子標的変化の比較的容易な検出を可能とするように作製可能である点において「一次」スクリーニングと呼ばれることが多い。また試験化合物のもつ細胞毒性および／または生物学的利用能の作用は、一般にインビトロ系では無視される場合があり、代わりにこのようなアッセイ法では、他のタンパク質との結合親和性の変化、または分子標的の酵素学的特徴の変化で明らかになる可能性のある、薬剤が分子標的に及ぼす影響に主に焦点があてられる。
【０１７１】
本出願で引用されたすべての出版物および特許は、その全体が参照として組み入れられる。
【０１７２】
同等物
当業者は、本明細書に記載された特定の方法に対する多くの同等物を認識することができると考えられ、または常用の実験法のみを用いて確かめることができる。そのような同等物は本発明の範囲内にあるとみなされ、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、配列特異的なＤＮＡ結合特性をもたらしたり、二量体化を仲介したりするジンクフィンガードメイン（黒い枠）、ならびに全４種のタンパク質間にみられる相同性を示す付加的な領域（灰色の枠）を示す、イカロスファミリータンパク質の略図である。図１Ｂは、他のイカロス遺伝子ファミリーのタンパク質ヘリオス（Ｈｅｌ；配列番号：６）、アイオロス（Ａｉｏ；配列番号：８）、およびイカロス（Ｉｋ；配列番号：１０）と並置した、ダイダロスの推定アミノ酸配列（Ｄａｅｄ；配列番号：２）を示す。イカロスファミリーのタンパク質群に保存されている残基を灰色で強調表示し、ジンクフィンガードメインを枠で囲んである。図１Ｃは、マウスのダイダロス（ｍＤａｅｄ）タンパク質（配列番号：２）のアミノ酸配列と位置した、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のダイダロス（ｘＤａｅｄ；配列番号：４）タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２Ａは、対照発現ベクターを有するＰＣ１２細胞のサブクローニングされた安定な形質移入体を示す。図２Ｂは、ダイダロス発現ベクターを有するＰＣ１２細胞のサブクローニングされた安定な形質移入体を示す。図２Ｃは、対照発現ベクターを有し、ＮＧＦを添加した培地中で２週間培養されたＰＣ１２細胞のサブクローニングされた安定な形質移入体を示す。図２Ｄは、ダイダロス発現ベクターを有し、ＮＧＦを添加した培地中で２週間培養されたＰＣ１２細胞のサブクローニングされた安定な形質移入体。

Claims

以下の段階を含む、神経前駆細胞を判定する方法：
細胞または組織の試料を提供する段階；および
試料の細胞内におけるダイダロス発現のレベルを評価する段階（対照と比較して高レベルのダイダロスの発現を示す細胞が神経前駆細胞であると判定される）。
ダイダロスの発現レベルを評価する段階が、ダイダロスｍＲＮＡを検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
ダイダロスの発現レベルを評価する段階が、ダイダロスタンパク質を検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
細胞または組織の試料が神経前駆細胞および非神経前駆細胞を含む、請求項１記載の方法。
試料が神経の細胞または組織である、請求項１記載の方法。
以下の段階を含む、細胞の神経形成段階を特定する方法：
細胞内におけるダイダロスの発現レベルを評価する段階であって、対照と比較して高レベルのダイダロスの発現を示す細胞が神経前駆細胞であると判定され、また対照と比較して低レベルのダイダロスの発現を示す細胞が分化した細胞であると判定される段階。
神経形成段階に基づき、第一の細胞を、異なる神経形成段階であることを特徴とする第二の細胞と単離する段階をさらに含む、請求項６記載の方法。
ダイダロスの発現レベルを評価する段階が、ダイダロスｍＲＮＡを検出する段階を含む、請求項６記載の方法。
ダイダロス発現レベルを評価する段階が、ダイダロスタンパク質を検出する段階を含む、請求項６記載の方法。
以下の段階を含む、細胞分化を調節する方法：
細胞を提供する段階；および
細胞内におけるダイダロスの発現、レベル、または活性を調節することで、細胞の分化を調節する段階。
ダイダロスの活性、レベル、または発現を上昇させる薬剤を細胞に投与する段階を含む、細胞が非分化状態で維持されるか、分化が阻害される、請求項１０記載の方法。
薬剤が以下からなる群より選択される、請求項１１記載の方法：ダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体；ダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体をコードする核酸；細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる核酸；および細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる小分子。
細胞が神経前駆細胞、または神経幹細胞である、請求項１１記載の方法。
ダイダロスの発現、レベル、または活性を、神経成長因子の存在下で上昇させる、請求項１１記載の方法。
薬剤がインビボで投与される、請求項１１記載の方法。
薬剤がインビトロで投与される、請求項１１記載の方法。
ダイダロスの活性、レベル、または発現を低下させる薬剤を細胞に投与する段階を含む、細胞の分化が促進される、請求項１０記載の方法。
薬剤が以下からなる群より選択される、請求項１７記載の方法：ダイダロス活性を阻害するダイダロス結合タンパク質；ダイダロス活性を阻害する抗ダイダロス抗体；ダイダロス活性を阻害する変異型ダイダロスまたはその断片；ダイダロスの発現を阻害するダイダロス核酸分子；およびダイダロスの転写または活性を阻害する小分子。
細胞が神経前駆細胞、または神経幹細胞である、請求項１７記載の方法。
ダイダロスの発現、レベル、または活性が、神経成長因子の存在下で低下される、請求項１７記載の方法。
薬剤がインビボで投与される、請求項１７記載の方法。
薬剤がインビトロで投与される、請求項１７記載の方法。
被験者の細胞内におけるダイダロスの発現、タンパク質、または活性のレベルを評価する段階を含む、被験者における神経細胞関連疾患のリスクの有無を判定する方法（対照と比較してダイダロスの発現、タンパク質、または活性の異常なレベルが、神経細胞関連疾患のリスクの存在を意味する）。
被験者の細胞が神経組織に由来する、請求項２３記載の方法。
細胞が対照と比較して、ダイダロスの発現、タンパク質、または活性が高いレベルを示す、請求項２３記載の方法。
神経細胞関連疾患が増殖性疾患である、請求項２５記載の方法。
以下の段階を含む、神経細胞集団を得る方法：
神経前駆細胞を提供する段階；
神経前駆細胞内におけるダイダロスの発現、レベル、または活性を阻害する段階；および
神経前駆細胞を分裂させることで神経細胞集団を得る段階。
ダイダロスの発現、レベル、または活性が、以下からなる群より選択される化合物を細胞に接触させることで阻害される、請求項２７記載の方法：ダイダロス活性を阻害するダイダロス結合タンパク質；ダイダロス活性を阻害するダイダロス抗体；ダイダロス活性を阻害する変異型ダイダロス、またはその断片；ダイダロスの発現を阻害するダイダロス核酸分子；およびダイダロスの転写または活性を阻害する小分子。
以下の段階を含む、神経細胞関連疾患を治療する方法：
神経細胞関連疾患の被験者を提供する段階；および
被験者の細胞内におけるダイダロスの発現、レベル、または活性を調節することで同疾患を治療する段階。
ダイダロスの発現、レベル、または活性が阻害される、請求項２９記載の方法。
ダイダロスの発現、レベル、または活性が、以下からなる群より選択される薬剤の被験者への投与によって阻害される、請求項３０記載の方法：ダイダロス活性を阻害するダイダロス結合タンパク質；ダイダロス活性を阻害する抗ダイダロス抗体；ダイダロス活性を阻害する変異型ダイダロス、またはその断片；ダイダロスの発現を阻害するダイダロス核酸分子；およびダイダロスの転写または活性を阻害する小分子。
疾患が癌である、請求項３０記載の方法。
ダイダロスの発現、レベル、または活性を上昇させる、請求項２９記載の方法。
薬剤が以下からなる群より選択される、請求項３３記載の方法：ダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体；ダイダロスポリペプチド、またはその機能性断片もしくは類似体をコードする核酸；細胞の内因性ダイダロス遺伝子の発現を上昇させる核酸；および細胞の内因性ダイダロス遺伝子発現を上昇させる小分子。