ES2341455T3 - Tratamiento de hidrocefalia. - Google Patents

Abstract

Un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para el uso en el tratamiento de la hidrocefalia en un medicamento a ser administrado intraventricularmente.

Description

Tratamiento de hidrocefalia.

1. Campo de la tecnología

La presente invención se refiere a un tratamiento de la hidrocefalia. Más particularmente, la presente invención se refiere a un factor de crecimiento para la administración intraventricular de un factor de crecimiento para tratar la hidrocefalia.

2. Descripción de la técnica relacionada

La hidrocefalia sigue a veces a la meningitis y a la hemorragia intracraneal, especialmente después de meningitis bacteriana o hemorragia subaracnoidea (SAH) (Di Rocco, C., et al., J. Neurol Sci, 1977. 33(3): p. 437-452; Yasargil, M. G., et al., J Neurosurg,1973. 39(4): p. 474-479; Almuneef, M., et al., J Infect, 1998. 36(2): p. 157-160; Dacud, A. S., et al., J Trop Pediatr., 1998. 44(3): p. 167-169; Gomes, I., et al., Arq Neuropsiquiatr, 1996. 54(3): p. 407-411; Grimwood, K., et al., Pediatrics, 1995. 95(5): p. 646-656). Los pacientes con hidrocefalia presentan signos de presión intracraneal elevada tales como dolor de cabeza y vómitos en la fase aguda, y presentan cambios de carácter en su comportamiento y disminución del rendimiento escolar en la fase crónica (Youmans, J. R., ed. Neurological Surgery, fourth edition ed. C. Saint Rose. Vol. 2. 1996, W.B. Saunders Company: Philadelphia, p. 890-926). Los pacientes ancianos con hidrocefalia presentan trastornos de memoria, trastornos de la forma de andar e incontinencia urinaria sin dolor de cabeza; esto es ampliamente conocido como "hidrocefalia normotensa" (Adams, R. D., et al., The New England Journal Of Medicine, 1965. 273(1965): p. 117-126; Graff-Radford, N. R., et al., Arch Neurol, 1989. 46(7): p. 744-752; Pfister, H. W., Feiden, W., y Einhaupl, K. M., Arch Neurol, 1993. 50(6): p. 575-581). La demencia reversible es uno de los síntomas mejor conocidos de la hidrocefalia normotensa en los seres humanos (Youmans, J. R., ed. Neurological Surgery, fourth edition ed. C. Saint Rose. Vol. 2. 1996, W.B. Saunders Company: Philadelphia, p. 890-926).

En la hidrocefalia comunicante, se establece una comunicación entre los ventrículos y una cavidad de drenaje tal como el peritoneo (Youmans, J. R., ed. Neurological Surgery, fourth edition ed. C. Saint Rose. Vol. 2. 1996, W.B. Saunders Company: Philadelphia, p. 890-926), por contraste con la hidrocefalia obstructiva, que implica la compresión u obliteración de la ruta del fluido cerebroespinal (CSF) por un tumor cerebral o por una membrana. Las causas de la hidrocefalia comunicante no han sido clarificadas todavía. Se han encontrado signos histológicos de fibrosis de las vellosidades aracnoideas y del espacio subaracnoide en muchos estudios de autopsia (Lobato, R. D., et al., J. Neurosurg, 1981. 55(5): p. 786-793; Torvik, A., Bhatia, R., y Murthy, V. S., Acto Neurochir(Wien), 1978. 41(1-3): p. 137-146; Akai, K., et al., Acta Pathol Jpn, 1987. 37(1): p. 97-110). Algunos informes de autopsias dan a entender que una posible causa es la proliferación de células de la capa aracnoidea de gránulos aracnoides, pero no hay evidencia conclusiva de que esto sea específico para los pacientes hidrocefálicos (Massicotte, E. M. and Del Bigio, M. R., J Neurosurg, 1999. 91(1): p. 80-84; Motohashi, O., et al., Acta Neurochir (Wien), 1995. 136(1-2): p. 88-91). Por tanto, es razonable especular que la fibrosis del espacio subaracnoideo y de las vellosidades aracnoideas causa un gradiente de presión medio a través de la vía de flujo del CSF, y que es un factor principal en el desarrollo de la hidrocefalia. Actualmente, una derivación es la única terapia definitiva para la hidrocefalia comunicante. Sin embargo, hay muchas complicaciones potenciales para las personas que sufren cirugía de derivación (Kang, J. K. and Lee, I. W., Child's Nervous System, 1999. 15(11-12): p. 711-717). Los padres de los pacientes a los que se ha realizado una derivación en la infancia, deben ser conscientes de los posibles problemas debidos a la derivación. Incluso con pacientes que han estado estables durante un largo periodo de tiempo, pueden surgir importantes problemas clínicos durante la edad adulta. Estos problemas requieren el reemplazo del sistema de derivación (Joon-Ki and I. W. Lee, Child's Nervous System, 1999. 15: p. 711-717). Es esencial para los neurocirujanos hacer seguimiento de los pacientes con derivaciones durante un largo tiempo (Sgouros, S., et al., Pediatr Neurosurg, 1995. 23(3): p. 127-132), y el coste social de mantenimiento de dichos pacientes en buenas condiciones puede ser considerable (DelBigio, M. R., Can J Neurol Sci, 1998. 25(2): p. 123-126).

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se identificó originalmente y se clonó como un potente mitógeno para hepatocitos maduros (Nakamura, T. et al., Nature, 1989. 342(6248): p. 440-443; Miyazawa, K. et al., J. Biol Chem, 1993. 268(14): p. 10024-10028). Este factor tiene una potente capacidad para reducir la fibrosis en muchos órganos, y se espera que llegue a ser un material terapéutico para diferentes enfermedades fibróticas, incluyendo la fibrosis pulmonar, la cirrosis hepática y la insuficiencia renal aguda (Dohi, M. et al., Am J Respir Crit Care Med,2000. 162(6): p. 2302-2307; Matsuda, Y. et al., J Biochem (Tokyo), 1995. 118(3): p. 643-649; Fujimoto, J., J Gastroenterol Hepatol, 2000. 15 Suppl: p. D33-D36; Vargas, G. A., Hoeflich, A., y Jehle, P. M., Kidney Int, 2000. 57(4): p. 1426-1436). El HGF es un factor de crecimiento multi-potente que tiene efectos mitógenos, motógenos y morfogénicos en diferentes células epiteliales y es producido por el mesénquima. Actúa sobre los tejidos epiteliales en el hígado, riñones y pulmones, y contrarresta el efecto inductor de la fibrosis del TGF-\beta1 (Rosen, E. M., Nigam, S. K. and Goldberg, I. D., J Cell Biol, 1994. 127(6 Pt 2): p. 1783-1787; Brtintamann, V. et al., J Cell Biol, 1995. 131(6 Pt 1): p. 1573-1586; Ohmichi, H. et al., Development, 1998. 125(7): p. 1315-1324; Matsumoto, K., Mizuno, S. and Nakamura, T., Curr Opin Nephrol Hypertens, 2000. 9(4): p. 395-402). La neutralización del HGF por anticuerpos lleva a la aceleración de la insuficiencia renal/fibrosis, y la administración de HGF exógeno lleva a una marcada atenuación de la insuficiencia renal/fibrosis (Matsumoto, K., Mizuno, S. and Nakamura, T., Curr Opin Nephrol Hypertens, 2000. 9(4): p. 395-402).

La presente invención se dirige a los problemas mencionados. Un objeto de la presente invención es proporcionar un tratamiento mejor de la hidrocefalia utilizando el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). A este fin, se ha ensayado un modelo de hidrocefalia en ratones administrando factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF-\beta1) humano recombinante (hr) (Tada, T., Kanaji, M. and Kobayashi, S. J Neuroimmunol, 1994. 50(2): p. 153-158); dichos ratones hidrocefálicos presentan un claro deterioro de la capacidad de aprendizaje espacial en un test del laberinto de agua. En el presente modelo de hidrocefalia, el deterioro del aprendizaje es reversible, lo que es muy particular para dichos modelos, y es similar a la hidrocefalia normotensa humana. La presente invención por tanto presenta una alternativa a la derivación como una terapia para la hidrocefalia.

Sumario de la invención

Para alcanzar los objetivos mencionados, la presente invención proporciona un tratamiento de la hidrocefalia en un animal, que comprende la etapa de la administración intraventricular del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

La presente invención proporciona además un compuesto para uso en el tratamiento de la hidrocefalia, que comprende HGF y un vehículo adecuado. En una realización preferida, el HGF es HGF recombinante humano (hrHGF).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa imágenes del cerebro por tratamiento de la imagen por resonancia magnética nuclear MRI de ratones inyectados con TGF-\beta1 humano recombinante (hr).

La Figura 2 ilustra el ciclo del material de contraste inyectado intraventricularmente en ratones normales e hidrocefálicos.

La Figura 3 representa imágenes potenciadas en T2 de la sección coronal del cerebro de ratones hidrocefálicos con y sin administración de HGF humano recombinante (hr).

La Figura 4 ilustra el diseño experimental del laberinto de agua de Morris y la estela demostrable de cada ratón en el test de transferencia.

La Figura 5 representa los resultados del test de transferencia de cinco ratones hidrocefálicos a los que se administró HGF (hr) utilizando una bomba de infusión osmótica durante 7 días. (A) es el cuadrante en el que se puso la plataforma, y los restantes cuadrante, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, son (B), (C), y (D) respectivamente.

La Figura 6 es un histograma que ilustra el tiempo del paso de tinta a través de los diferentes grupos: ratones normales no tratados (n=5); ratones con operación simulada (inyectados con BSA-PBS al 0,1%) (n=5); ratones hidrocefálicos inyectados con BSA-PBS al 0,1% con la bomba osmótica durante 7 días (n=4); ratones hidrocefálicos, a los que se administró HGF humano recombinante, utilizando la bomba de infusión durante 7 días (n=5).

La Figura 7 representa la tinción de las meninges en ratones hidrocefálicos. (A) tinción con hematoxilina-eosina (HE) de las meninges de los ratones hidrocefálicos con operación simulada; (B) tinción con HE de las meninges de los ratones hidrocefálicos a los que se administró (hr)-HGF; (C) la tinción de Malory-Azan muestra las meninges fibrosas alrededor del tronco encefálico de los ratones hidrocefálicos en comparación con los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF. (D) los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF presentan una clara reducción de las fibras de colágeno en las meninges. (E, F) Aumento de la fibrosis meníngea en el tronco encefálico (C, 0, respectivamente).

La Figura 8 presenta imágenes microscópicas electrónicas después del test de paso de tinta. (A) Meninges de ratón normal con operación simulada; (B) Meninges de los ratones hidrocefálicos; (C) Meninges de los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención proporciona un compuesto farmacéutico para uso en el tratamiento de la hidrocefalia en un animal, que comprende la etapa de la administración intraventricular del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). En una realización preferida, el HGF es HGF humano recombinante (hrHGF). La presente invención proporciona además un compuesto farmacéutico útil para el tratamiento de la hidrocefalia, que comprende HGF y un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier vehículo, diluyente, excipiente, agente humectante, agente tampón, agente de suspensión, agente lubricante, adyuvante, vehículo, o sistema de administración que sea adecuado para uso en una composición farmacéutica. En una realización muy preferida, el HGF del compuesto es hrHGF.

A modo de ejemplo y no de limitación, se proporcionan los siguientes ejemplos.

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Animales y reactivos

Se adquirieron el factor de crecimiento transformante \beta1 humano recombinante (hrTGF-\beta1) y un péptido asociado a la latencia (LAP) humano recombinante, de R & D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). El HGF humano recombinante (hrHGF) fue preparado por los inventores, Matsumoto y Nakamura en la Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka, Japan. Se compraron ratones C57BL/6 preñados de Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan); se utilizaron en este experimento ratones de diez días de edad.

Los ratones se enjaularon en una jaula de policarbonato en la Shinshu University Animal House, y se alimentaron con una dieta comercial (MF, Oriental Yeast Co. Ltd., Tokyo, Japan). Todos los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de 12:12 horas de luz-oscuridad (luces encendidas a las 9:00 am). Se mantuvo la sala a 24 \pm 2ºC y una humedad relativa de 55 \pm 10%. Este estudio se llevó a cabo según las Recomendaciones para animales de experimentación de la Shinshu University School of Medicine.

Hidrocefalia inducida por hrTGF-\beta1: Un modelo animal de hidrocefalia comunicante

Los niveles de TGF-\beta1 en el fluido cerebroespinal (CSF) se doblan después de la hemorragia subaracnoidea, como se muestra por el ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El primer pico aparece antes de un día después del ictus, e implica la liberación de TGF-\beta1 desde las plaquetas. El segundo pico aparece en la segunda semana después del ictus, e implica la liberación de TGF-\beta1 de los neutrófilos y linfocitos en el CSF y en los plexos coroideos (Flood, C. et al., J Cereb Blood Flow Metab, 2001. 21(2): p. 157-162; Takizawa, T. et al., Neurol Res, 2001. 23(7): p. 724-730). En la segunda semana después del ictus, los niveles de TGF-\beta1 son más altos en el CSF de los pacientes con hidrocefalia que en los pacientes sin hidrocefalia (Kitazawa, K. and Tada, T., Stroke, 1994. 25(7): p. 1400-1404). Hasta 10 semanas después del ictus, los niveles de los metabolitos de la síntesis de colágeno (procolágeno tipo I y tipo III) en el CSF son también más altos en los pacientes con hidrocefalia (Sajanti, J., Heikkinen, E. and Majamaa, K., Neurology, 2000. 55(3): p. 359-363). El nivel de TGF-\beta es también elevado en el CSF de pacientes con meningitis bacteriana. Algunos hallazgos clínicos dan a entender que el nivel elevado de TGF es una de las causas de hidrocefalia después de meningitis bacteriana (Ossege, L. M. et al., J Neurol Sci, 1996. 144(1-2): p. 1-13; Huang, C.C. et al., J Neurol, 1997. 244(10): p. 634-638). Las observaciones anteriores sugieren claramente que el TGF-\beta1 desempeña un importante papel en la generación de la hidrocefalia después de meningitis y hemorragia subaracnoidea.

En 1994, los inventores administraron experimentalmente hrTGF-\beta1 a la cabeza de ratones C57BL/6, produciendo una condición hidrocefálica. Los ventrículos laterales se continuaron dilatando hasta 6 semanas después de la administración de hrTGF-\beta1, y permanecieron dilatados hasta 12 semanas después de la administración (Tada, T., Kanaji, M. and Kobayashi, S. J Neuroimmunol, 1994. 50(2): p. 153-158). La microscopía electrónica reveló una abundante deposición de fibras de colágeno en el espacio inter-celular de las leptomeninges (Nitta, J. and Tada, T., Neurol Med Chir (Tokyo), 1998. 38(12): p. 819-824). Los ratones transgénicos que expresan el gen TGF-\beta1 desarrollan hidrocefalia comunicante, y la proteína de la matriz extra-celular se deposita en sus meninges (Galbreath, E. et al., J Neuropathol Exp Neurol, 1995. 54(3): p. 339-349; Wyss-Coray, T. et al., Am J Pathol, 1995. 147(1): p. 53-67; Cohen, A. R. et al., J Neurosurg, 1999. 91(6): p. 978-988; Stoddart, J. J. Jr. et al., J Cell Biochem, 2000. 77(1): p. 135-148; Hayashi, N., Leifer, D. W.and Cohen, A. R., Pediatr Neurosurg, 2000. 33(4): p. 182-187). Debido a que estos ratones transgénicos mueren pronto después de su nacimiento, son difíciles de utilizar en experimentos.

En el presente estudio, se ha observado también la estasis del CSF utilizando cisternografía CT. El material de contraste inyectado intraventricularmente permaneció claramente en la fisura interhemisférica al menos 120 minutos después de la inyección en los ratones hidrocefálicos. En los ratones normales, el material de contraste había dejado la fisura interhemisférica antes de 15 minutos, y toda la cabeza (incluyendo los tejidos blandos circundantes) pudo ser procesada con el material de contraste reciclado a los 120 minutos después de la inyección. Estos resultados sugirieron claramente que la fibrosis intermeníngea es una causa principal de la hidrocefalia inducida por hrTGF-\beta1.

En adición al examen morfológico, se evaluó la función de memoria de los ratones inyectados con TGF-\beta1. La demencia reversible es un síntoma característico de la hidrocefalia normotensa en pacientes ancianos. Los pacientes con hidrocefalia normotensa a los que se ha realizado una derivación se recuperan bien. Para estimar la capacidad de aprendizaje de los ratones con hidrocefalia inducida por hrTGF-\beta1, se utiliza el test del laberinto de agua de Morris, que indica que aproximadamente la mitad de los ratones inyectados con TGF-\beta1 tenían trastornos del aprendizaje espacial. El trastorno del aprendizaje espacial de los ratones hidrocefálicos continuó durante al menos 4 semanas después del primer laberinto de agua de Morris. Debido a estas observaciones, los ratones inyectados con TGF-\beta1 con trastorno del aprendizaje espacial y dilatación ventricular se caracterizan de aquí en adelante como hidrocefálicos.

Laberinto de agua de Morris

Se examinó la capacidad de aprendizaje espacial con un test de transferencia en un laberinto de agua de Morris modificado, como se ha descrito previamente (Morris, R. G. M., Learning and motivation, 1981. 12: p. 239-260; Samyai, Z. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(26): p.14731-14736). Brevemente, se colocó una plataforma de plástico transparente (8 cm de diámetro) en un cuadrante de una piscina (88 cm de diámetro), y se sumergió 1 cm por debajo de la superficie del agua. El cuadrante en el que se colocó la plataforma y los restantes cuadrantes, se denominaron, siguiendo el sentido de las agujas del reloj a partir del primero, (A), (B), (C) y (D), respectivamente. El entrenamiento consistió en 12 ensayos cada día durante 3 días consecutivos. Se dejó que el ratón buscara la plataforma durante 60 segundos en el entrenamiento. Una vez que el ratón localizó la plataforma, se permitió que se quedara sobre ella durante 30 segundos. Se examinó la capacidad de aprendizaje espacial después de la última sesión de entrenamiento. Se obligó a los ratones a nadar en la piscina sin la plataforma durante 60 segundos. Se registró la natación mediante una cámara de video, y el tiempo que los ratones pasaron nadando en cada cuadrante se midió como la puntuación.

Anestesia

Los animales fueron sedados mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de hidrocloruro de ketamina (2,5 mg/ratón) y medetomidina (0,025 mg/ratón). Para invertir la anestesia, se inyectó hidrocloruro de antipamezol (0,125 mg/ratón) (Cruz, J. I., Loste, J. M. and Burzaco, O. H., Lab Anim, 1998. 32(1): p. 18-22).

Imagen por resonancia magnética

Se examinaron las cabezas de los ratones con un equipo de resonancia magnética (MR) de 1,5 teslas para todo el cuerpo (Signa Advantage, General Electric, Milwaukee, Wis.), utilizando un hardware de gradiente estándar con una bobina de superficie redonda (7,62 cm de diámetro). Se obtuvieron imágenes potenciadas en T2 con secuencias (plano coronal; trozo, 0,5 cm; TE, 90 msec; TR, 2000 msec). Se utilizaron imágenes incluyendo el tálamo para comparación, porque estas imágenes tenían el espacio ventricular más amplio y fueron comunes en las series de imágenes MR. Se utilizó la imagen NIH (ver.1.61) para calcular los píxeles que representan la sección coronal completa del cerebro y los píxeles totales de alta intensidad que representan los ventrículos laterales bilaterales y las partes superior e inferior del tercer ventrículo. La tasa de píxeles de alta intensidad entre los píxeles totales de la sección coronal se definió como el tamaño ventricular.

Preparación de ratones hidrocefálicos

Como se ha descrito previamente, se inyectaron ratones de diez días en el subcráneo con hrTGF-\beta1 (60 ng/cabeza) (Tada, T., Kanaji, M. and Kobayashi, S. J Neuroimmunol, 1994. 50(2): p. 153-158). Se examinó la capacidad de aprendizaje espacial de todos los ratones inyectados con hrTGF-\beta1 con el laberinto de agua de Morris en la jaula del animal 6 semanas después de la inyección. Se examinó con MRI el tamaño ventricular de los ratones con trastornos de aprendizaje espacial. Los ratones con trastorno del aprendizaje espacial y ventrículos dilatados se designaron como hidrocefálicos.

Administración de hrHGF

Se administró hrHGF intraventricularmente en lugar de sistémicamente, porque el hrHGF no pasa la barrera sangre-CSF (Kern, M. A. et al., Cytokine, 2001. 14(3): p. 170-176). La posología se basó en los resultados de un estudio previo, en el cual se administraron 30 \mug de hrHGF en el ventrículo lateral del cerebro de jerbo utilizando una bomba osmótica (Miyazawa, T. et al., J Cereb Blood Flow Metab, 1998. 18(4): p. 345-348). La administración de HGF en ratas durante varias semanas no tuvo efectos secundarios negativos que pudieran descartar la aplicación de HGF en los casos de enfermedad hepática u otras enfermedades orgánicas (Matsuda, Y. et al., J Biochem (Tokyo), 1995. 118(3): p. 643-649).

Se administró de modo continuo un total de 30 \mug de hrHGF por ratón utilizando minibombas osmóticas tipo infusión de 7 días y 14 días. Se administró hrHGF a 30 \mug por ratón con dos modelos de minibomba osmótica (Modelos 1007D y 1002; Alza Co, Palo Alto, Calif.). El Modelo 1007D y el Modelo 1002 pueden infundir de modo continuo el contenido durante 7 y 14 días, respectivamente. Se puso el ratón en un marco estereotáxico (Modelo 900, Pembroke Pines, Fla.). Se hizo un agujero en el cráneo, de 0,6 mm caudal desde la sutura coronal y 1 mm lateral desde la línea media. Se insertó intracranealmente una cánula de acero inoxidable de calibre 28 en forma de L a una profundidad de 4 mm. Se conectó cada cánula a una bomba osmótica, y se llenó con 30 \mug de HGF en solución de BSA-PBS al 0,1%, por detrás mediante un tubo catéter. Los ratones con operación simulada se inyectaron con BSA-PBS al 0,1% solamente, utilizando la bomba osmótica Modelo 1007D. La bomba se separó inmediatamente después de la administración de hrHGF.

Test del paso de tinta

Aunque las características de la hidrocefalia inducida por hrTGF-\beta1 en ratones son muy similares a las de la hidrocefalia humana, los roedores y los seres humanos tienen sistemas de drenaje del CSF muy diferentes. El CSF de las ratas drena principalmente hasta los nódulos linfáticos cervicales profundos, a través de los vasos linfáticos nasales, mientras que, en los seres humanos, el CSF drena principalmente hasta las vellosidades aracnoideas (Weller, R. O., Kida, S. and Zhang, E. T., Brain Pathol, 1992. 2(4): p. 277-284; Kida, S., Pantazis, A. and Weller, R. O., Neuropathol Appl Neurobiol, 1993. 19(6): p. 480-488). Por los presentes inventores (Moinuddin, S. M. and Tada, T., Neurol Res, 2000. 22(2): p. 215-222) se ha desarrollado un método sencillo para detectar el trastorno del flujo de CSF midiendo el tiempo que necesitan los nódulos linfáticos cervicales profundos para volverse negros después de la inyección de tinta. Este test de la tinta es muy simple, pero indica claramente la dinámica del flujo de CSF de los ratones. Se inyecta la tinta en el ventrículo lateral, y llega a los nódulos linfáticos cervicales profundos en unos minutos en los ratones normales. En los ratones con hidrocefalia inducida con hrTGF-\beta1, no hubo cambios histológicos en la lámina cribosa, pero el movimiento de la tinta hasta los nódulos linfáticos cervicales profundos necesitó más de 10 minutos.

El método consiste en inyectar tinta negra en el ventrículo lateral, para evitar el escape de la tinta al extra-cráneo a través de un agujero de trepanación. Brevemente, se abre el cuello del ratón anestesiado y se exponen los nódulos linfáticos cervicales profundos. Después, se pone el ratón en el marco estereotáxico, y se inyectan 10 \mul de tinta negra (tamaño de partícula, 20-50 nm; Pelikan AG, Hanover, Germany) en el ventrículo lateral. Después de la inyección de la tinta, se examinan los nódulos linfáticos cervicales profundos para evaluar los cambios de color. El tiempo que necesitan los nódulos linfáticos para volverse negros después de la inyección de tinta se registra como el tiempo de paso
de la tinta. Se sacrifican los ratones para exámenes por microscopio óptico y microscopio electrónico después del test.

Cisternografía tomográfica computarizada

Se examinaron pares de ratones anestesiados (uno hidrocefálico y uno normal en cada par) con cisternografía tomográfica computarizada (CT). Los tiempos de los exámenes fueron 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección intraventricular de 10 \mul de lopamiron al 50% (Dai-ichi Pharma. Tokyo, Japan).

Microscopía óptica

Se fijó el cerebro con formaldehido al 10% tamponado para examen histológico. Se seccionó coronalmente, se embebió en parafina, y se tiñó utilizando hematoxilina/eosina (HE) y los métodos de Malory-Azan.

Microscopía electrónica

Se fijaron muestras del tejido de las meninges, del área de convexidad contralateral a la inyección, en glutaraldehído al 2,5%, se fijaron de nuevo en OsO_{4} (tetróxido de osmio) al 1%, y después se embebieron en una mezcla de Epon-Araldite. Se tiñeron secciones ultra-finas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y después se observaron con un microscopio electrónico JEM-I200EX (Nippon Electric Co., Tokyo, Japan).

Análisis estadístico

Los datos del laberinto de agua de Morris se expresaron como la media \pm SEM. El análisis estadístico de los datos del laberinto de agua de Morris se realizó utilizando un procedimiento de análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas. Se evaluaron las comparaciones posteriores (post hoc) utilizando el método de Tukey - -Kramer. Los otros resultados experimentales se presentaron como la media \pm S.D., y el análisis estadístico se realizó utilizando el test de Student para muestras pareadas o independientes. Un valor P <0,05 indica significancia estadística.

Resultados: Ratones hidrocefálicos

Veinticinco de los 44 ratones inyectados con TGF-\beta1 (56,7%) presentaron claros trastornos de aprendizaje espacial en el laberinto de agua de Morris a las 6 semanas después de la inyección. Esto es significativamente diferente de los resultados de los ratones inyectados con BSA-PBS al 0,1%, en los cuales 13 de los 14 ratones presentaron clara desviación de su estela en el cuadrante A. El tamaño ventricular de los 25 ratones inyectados con TGF-\beta1 con trastornos de aprendizaje espacial se examinó utilizando MRI, y su tamaño ventricular se comparó con el de los ratones inyectados con LAP como testigos. Los tamaños ventriculares de los ratones inyectados con TGF-\beta1 y de los ratones inyectados con LAP fueron 13,8 \pm 5,0% (n=25) y 5,9 \pm 1,8% (n=9), respectivamente; la diferencia fue significativa a la sexta semana (p<0.005) (Figura 1). Se compararon las imágenes potenciadas en T2 de la sección coronal del cerebro incluyendo el tálamo. La tasa de los píxeles de alta intensidad que indican los ventrículos lateral y tercero entre los píxeles totales del cerebro se definió como el tamaño ventricular de la sección coronal. Los ratones con trastornos del aprendizaje espacial y ventriculomegalia se designaron como hidrocefálicos. Cada imagen superior en una imagen demostrable.

Se observó también la recogida de fluido subcutáneo cerca del agujero de trepanación en la segunda MRI de 3 ratones hidrocefálicos con operación simulada. Esto indica que el CSF no fluyó fácilmente a lo largo de la ruta ordinal, y se escapó del agujero de inyección de la corteza y del agujero de trepanación. Tal recogida anormal de fluido no se vio en ninguno de los ratones a los que se administró hrHGF, lo que indica la normalización del flujo de CSF.

Resultados: Cisternografía CT

Para examinar la estasis del flujo de CSF en los ratones hidrocefálicos, se realizó una cisternografía CT de los ratones hidrocefálicos. La Figura 2 muestra las imágenes tomadas a los 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección intra-ventricular del material de contraste. Se examina un par de ratones hidrocefálicos y normales con cisternografía tomográfica computarizada (CTC) después de la inyección intra-ventricular del material de contraste. En los ratones normales, el material de contraste fluyó detrás de la fisura inter-hemisférica frontal antes de 30 min (flecha), y se recicló en todo el cuerpo en 120 minutos; todo el cuerpo pudo ser procesado con el material de contraste.

En los ratones hidrocefálicos, el material de contraste permaneció en la fisura inter-hemisférica frontal hasta 120 minutos (flecha). El material de contraste inyectado intraventricularmente permaneció claramente en la fisura inter-hemisférica al menos 120 minutos después de la inyección en los ratones hidrocefálicos. Estos resultados sugieren claramente que la fibrosis intermeníngea es una causa principal de la hidrocefalia inducida con hrTGF-\beta1.

Resultados: El tamaño ventricular en la sección coronal I. Administración de hrHGF durante 14 días con una bomba de infusión Modelo 1002

Se administró a cada uno de cinco ratones hidrocefálicos 30 \mug de hrHGF utilizando una bomba de infusión durante 14 días. La MRI demostró que el tamaño ventricular disminuyó desde 10,7 \pm 2,5% antes de la administración de hrHGF hasta 7,4 \pm 2,1% a las 4 semanas después del comienzo de la administración de HGF; esta diferencia fue significativa (p<0,013). La pared lateral del ventrículo lateral se curvó hacia dentro; la forma de expansión del ventrículo lateral cambió claramente a una forma hundida. La tendencia a disminuir el tamaño ventricular estuvo en claro contraste con los ratones hidrocefálicos inyectados con BSA-PBS al 0,1% (Figura 3). Por contraste, la ventriculomegalia continuó en los ratones hidrocefálicos sin administración de hrHGF.

II. Administración de hrHGF durante 7 días con una bomba de infusión Modelo 1007D

Se administró a cada uno de otros 5 ratones hidrocefálicos 30 \mug de hrHGF utilizando una bomba de infusión durante 7 días. El tamaño ventricular era de 18,5 \pm 0,6% antes de la administración de hrHGF, y disminuyó hasta 15,3 \pm 2,9% a las 4 semanas después del comienzo de la administración de hrHGF. Tendió a disminuir, pero esto no fue significativo (p=0,085).

Los tamaños pre- y post-ventriculares de los ratones hidrocefálicos con operación simulada, que fueron inyectados con BSA-PBS al 0,1% utilizando una bomba Modelo 1007D, fueron 13,8 \pm 5,0% y 13,8 \pm 4,8%, respectivamente. El tamaño ventricular no cambió estadísticamente, pero la segunda MRI mostró una recogida subcutánea de fluido cerca del agujero de trepanación en 3 de 7 ratones. No hubo recogida anormal de fluido en los ratones a los que se administró HGF (Tabla 1).

Resultados: Laberinto de agua de Morris

Los ratones normales con operación simulada, que fueron inyectados con BSA-PBS al 0,1% dos veces en un intervalo de 6 semanas, demostraron una significativa desviación de la estela en el cuadrante A en el primero y segundo test del laberinto. Los ratones hidrocefálicos con operación simulada no mostraron ninguna desviación de la estela en ningún cuadrante en cualquiera de los tests. Los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF utilizando una bomba osmótica de 14 días tampoco presentaron ninguna desviación en ningún cuadrante. Los ratones a los que se administró hrHGF utilizando una bomba osmótica de 7 días no mostraron ninguna desviación de la estela en ningún cuadrante antes de la administración de HGF, y recuperaron completamente su capacidad de aprendizaje espacial en el segundo test. La Figura 4 muestra las estelas demostrables de los mismos ratones, y la Figura 5 muestra los resultados de los tests de transferencia de los 5 ratones.

Con respecto a la Figura 4, los segundos tests se realizaron 4 semanas después del comienzo de la administración de HGF humano recombinante (hr). A es el cuadrante de la piscina en el que se colocó inicialmente la plataforma sumergida, y B, C y 0 son los 3 cuadrantes restantes, ordenados en la dirección de las agujas del reloj. Los ratones normales con operación simulada mostraron una distinta lateralidad para nadar en el cuadrante A en ambos tests. Los ratones hidrocefálicos con operación simulada (inyectados con BSA-PBS al 0,1%) no mostraron ninguna lateralidad continua de sus estelas en los cuadrantes. Los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF recuperaron la capacidad de aprendizaje en el segundo test de transferencia.

Con respecto a la Figura 5, se exigió a los ratones que nadaran en la piscina sin la plataforma durante 60 segundos. Se midió el tiempo que los ratones pasaron nadando en cada cuadrante como una puntuación. Los ratones con operación simulada normal, que fueron inyectados con BSA-PBS al 0,1% dos veces en un intervalo de 6 semanas, mostraron una fina capacidad de aprendizaje espacial; desviación de la estela en el cuadrante A, 2 veces (n=5). Los ratones hidrocefálicos con operación simulada, que fueron inyectados con BSA-PBS al 0,1% en lugar de HGF humano recombinante (hr), todavía tenían trastornos del aprendizaje espacial a las 4 semanas después de la administración (n=5). Los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF recuperaron claramente la capacidad de aprendizaje espacial.

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Resultados: Tiempo de paso de la tinta

Los ratones CSF drenan principalmente a los ductos linfáticos submucosales nasales a través del orificio del etmoides. Se inyectó la tinta negra (10 \mul) en el ventrículo lateral, y después se expusieron los nódulos linfáticos cervicales profundos. El tiempo requerido para que los nódulos linfáticos se vuelvan negros después del comienzo de la inyección de tinta se registró como el tiempo de paso de la tinta. El tiempo de paso de la tinta fue de 1,6 \pm 0,7 min en los ratones normales no tratados (n=5), y fue de 1,4 \pm 0,2 min en los ratones normales con operación simulada inyectados con BSA-PBS al 0,1% dos veces en un intervalo de 6 semanas (n=5). Por contraste, el tiempo de paso de la tinta fue de 20,3 \pm 12,1 minutos en los ratones hidrocefálicos que fueron inyectados con BSA-PBS al 0,1% con la bomba de infusión de 7 días (n=4). El tiempo fue de 1,8 \pm 1,1 minutos en los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF utilizando la bomba de infusión de 7 días (n=5). El tiempo de paso de la tinta de los ratones hidrocefálicos con operación simulada fue más largo que los de otros ratones y fue estadísticamente significativo (p\leq0,01). El tiempo de paso de la tinta fue completamente normalizado en ratones a los que se administró hrHGF (Figura 6).

Resultados: Histología

Las meninges de ratones inyectados con tinta, teñidas con HE presentaron diferencias aparentes en los modelos de distribución de las partículas de carbón entre los ratones con operación simulada y los ratones a los que se administró hrHGF. Las meninges cerca de la arteria carótida de los ratones hidrocefálicos con operación simulada presentaron una clara localización de negro de carbón en el interior de las meninges (Figura 7A). Por contraste, las meninges de una región similar en ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF presentaron una amplia distribución de tinta negra a lo largo de la capa meníngea (Figura 7B).

La tinción de Malory-Azan mostró claramente la diferencia entre ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF y BSA-PBS al 0,1%. Las figuras 7C, D muestran las meninges que rodean el tronco encefálico de los ratones hidrocefálicos con operación simulada y de los ratones a los que se administró hrHGF, respectivamente. La Figura 7C demuestra que la tinción de Malory-Azan mostró las meninges fibrosas alrededor del tronco encefálico de los ratones hidrocefálicos en comparación con los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF. Los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF presentaron una clara reducción de las fibras de colágeno en las meninges (Figura 7D). El tejido de colágeno en las meninges era claramente más delgado en los ratones a los que se administró hrHGF que en los ratones hidrocefálicos con operación simulada. Las figuras 7E, F son imágenes ampliadas del tejido de colágeno.

La Figura 8A muestra las células de las meninges de un ratón normal a nivel del microscopio electrónico después del test de inyección de tinta. Las células de las meninges tenían procesos citoplasmáticos finos, que forman estructuras lamelares en las meninges. Se observaron muchas partículas de carbón en el espacio celular intermeníngeo. Algunas de las partículas de carbón fueron fagocitadas por macrófagos que migraron en el espacio. El examen por microscopio electrónico también mostró diferencias entre los ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF y los ratones hidrocefálicos con operación simulada después del test de la tinta. La Figura 8B muestra las meninges obtenidas a partir de un ratón hidrocefálico con operación simulada. Hubo un aparente aumento en la celularidad del tejido meníngeo; el espacio intercelular estaba ausente en las meninges; y las partículas de tinta fueron difíciles de detectar. Por contraste, las meninges obtenidas a partir de ratones hidrocefálicos a los que se administró hrHGF mostraron una estructura lamelar de células meníngeas que era muy similar a la de los ratones normales con operación simulada; se observaron muchas partículas de carbón en el espacio celular intermeníngeo (Figura 8C).

Se cree que los presentes resultados son útiles para consideraciones que incluyen el desarrollo de un ensayo clínico de tratamiento con HGF recombinante en la hidrocefalia humana.

Aunque la presente invención ha sido descrita en conexión con las realizaciones preferidas de la misma, con referencia a los dibujos adjuntos, se debe observar que para los expertos en la técnica quedarán claros diferentes cambios y modificaciones. Dichos cambios y modificaciones se deben entender como incluidos dentro del alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones adjuntas, a menos que se separen de las mismas.

Claims (8)

1. Un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para el uso en el tratamiento de la hidrocefalia en un medicamento a ser administrado intraventricularmente.

2. El HGF para uso según la reivindicación 1, en el que el HGF es para ser administrado intraventricularmente por medio de una bomba de infusión osmótica.

3. El HGF para uso según la reivindicación 1, en el que el HGF es HGF humano recombinante.

4. El HGF para uso según la reivindicación 1, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. El HGF para uso según la reivindicación 4, en el que el vehículo es un agente diluyente, excipiente, agente humectante, agente tampón, agente de suspensión, agente lubricante, adyuvante, vehículo, o sistema de administración farmacéutico.

6. El uso de un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para la preparación de productos farmacéuticos para el tratamiento de la hidrocefalia, que es para ser administrado intraventricularmente.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el HGF es para ser administrado intraventricularmente por medio de una bomba de infusión osmótica.

8. El uso según la reivindicación 6, en el que el HGF es HGF humano recombinante.