WO2007119815A1 - Ｔｏｌｌ様受容体９作動薬 - Google Patents

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WO2007119815A1
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tlr9
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Hiroyuki Nagata
Michio Ichimura
Rieko Nakatsu
Shun-Ichi Ikeda
Ayako Kawabata
Toshio Ota
Masayuki Abe
Michio Takashima
Makoto Suzuki
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Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
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    • C12N2310/351—Conjugate

Definitions

  • the present invention relates to an immunostimulator, a Toll-like receptor 9 (TLR9) agonist, and the like.
  • TLR9 Toll-like receptor 9
  • TLR 9 Toll-like receptor 9
  • TLR9 is one of Toll-like receptors (for example, “Nature” ”2000, No. 408, p.740, etc.).
  • TLR9 is present, for example, in B cells and rod cells, and is known to be activated by an oligonucleotide having an unmethylated CpG motif present in bacterial or viral DNA.
  • TLR9 transmits signals into cells via adapter molecules such as MyD88, activates transcription factors such as NF- ⁇ B that controls the expression of cytoforce-in genes, and induces the production of cytoforce-ins. To do. It also enhances the expression of surface molecules such as CD40, CD80, CD86, which are costimulatory molecules important for lymphocyte activation.
  • TLR9 agonists such as CpG-oligodeoxynucleotide have immunostimulatory activity and are known to exhibit antiallergic, antitumor, and antiinfective effects (for example, EP 0468520).
  • Mononucleotide 5, -diphosphate
  • adenosine 5,-(L-glycose mouth-j8-D-mannobilanosyl) diphosphate
  • adenosine 5,-(D-glycose mouth-13 -D- Mannoheptpyranosyl) diphosphate
  • LPS lipopolysaccharide
  • Non-Patent Document 1 “Journal of Bacteriology”, 2002, 184th p.363
  • Non-Patent Document 2 "Carbohydrate Research", 2003, No. 338, p.2571
  • An object of the present invention is to provide a TLR9 agonist, an immunostimulant, an antiallergic agent, an antitumor agent, a compound having TLR9 agonist activity and the like useful as an anti-infective agent, etc. Means to solve
  • the present invention relates to the following (1) to (49).
  • n an integer from 0 to 2
  • n an integer of 0 to 5
  • X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or hydroxy
  • Y represents an oxygen atom or a sulfur atom (when n is 1 or 2, two or three Ys may be the same or different),
  • -Q 1 represents-0-, -CH-or -CF-
  • -Q 2 represents a single bond, -0-, -CH-0- or -CH-,
  • -Z- represents -0- or -CH-
  • R 3 and R 4 are each independently hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkenyloxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted lower alkenyloxy, substituted or unsubstituted aralkyloxy or substituted or unsubstituted Represents a heterocyclic alkyloxy of
  • R 2 and R 5 are each independently a hydrogen atom, hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkanoyloxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted lower alkalkoxy, substituted or unsubstituted Aralkyloxy or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyloxy
  • A is a TLR9 agonist containing, as an active ingredient, a compound represented by the following substituent group (A) representing a selected group) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • TLR9 agonist according to any one of (1) to (4), wherein R 2 is a hydrogen atom.
  • TLR9 agonist according to any one of (1) to (4), wherein R 1 and R 2 are each independently hydroxy or lower alkanoyloxy.
  • TLR9 agonist according to any one of (1) to (6), wherein X 1 and X 2 are hydroxy.
  • X 1 , X 2 , Y, QQ 2 and A are as defined above,
  • R 1A , R 3A and R 5A each independently represent hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkanoyloxy or substituted or unsubstituted lower alkoxy) or a pharmacologically acceptable salt thereof Salt.
  • a TLR9 agonist comprising, as an active ingredient, the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • An antiallergic agent comprising the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An antitumor agent comprising the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An anti-infective agent comprising the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An immunostimulant comprising the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An antiallergic agent comprising the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An antitumor agent comprising the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An anti-infective agent comprising the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • An immunostimulant comprising the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a therapeutic and Z or preventive agent for a disease involving TLR9 comprising as an active ingredient the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for activating TLR9 comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for treating allergy comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for treating a tumor comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for treating an infectious disease comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (1) to (7) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for promoting immunity comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (1) to (7) above or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for the treatment and Z or prevention of a disease involving TLR9 comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (1) to (7) above or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • Law. (32) A method for operating TLR9, comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for treating allergy comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for treating a tumor comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for treating an infectious disease comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for promoting immunity comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method for the treatment and Z or prevention of a disease involving TLR9 comprising a step of administering an effective amount of the compound according to any one of (8) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof. .
  • TLR9 agonist activity useful as, for example, TLR9 agonists, immune promoters, antiallergic agents, antitumor agents, antiinfective agents, and the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of phylogenetic analysis using the 16S rDNA partial sequence of Gram-negative bacilli used for the production of the compounds used in the present application.
  • FIG. 2 shows the activity promoting effect of NF- ⁇ B by a typical compound (I). The results are shown as luciferase activity values (RLU) at the concentration of each compound. The vertical axis represents RLU, and the horizontal axis represents test compound concentration (mol / L).
  • FIG. 3 shows the effect of compound 30 on promoting the activity of NF- ⁇ . For comparison, it is shown together with the result of Compound 16. The results are shown as luciferase activity values (RLU) at each compound concentration. The vertical axis represents RLU, and the horizontal axis represents the concentration (mol / L) of the test compound.
  • RLU luciferase activity values
  • Examples of the lower alkyl part of lower alkoxy include linear or branched alkyl having 1 to 8 carbon atoms, and specifically include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butinole, sec-butinole, tert-butinole.
  • Examples of the lower alkenyl part of the lower alkyloxy include linear or branched alkenyl having 2 to 8 carbon atoms, specifically, bur, aryl, 1-probe, Examples include methacryl, crotyl, 1-butyr, 3-butenyl, 2-pentenyl, 4-pentenyl, 2-hexyl, 5-hexyl, 2-heptyl, and 2-octatur.
  • Examples of the lower alkanoyl moiety of the lower alkanoyloxy include linear or branched alkanoyl having 1 to 7 carbon atoms, specifically, formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, Examples include pivalol, hexanol, and heptanoyl.
  • the alkylene moiety in aralkyloxy and heterocyclic alkyloxy represents a group obtained by removing one of the lower alkyl group hydrogen atoms.
  • aryl moiety of the aralkyloxy examples include monocyclic, bicyclic or tricyclic aryl having 6 to 14 carbon atoms, and specifically include phenol, indur, naphthyl, anthryl and the like.
  • heterocyclic group moiety of the heterocyclic alkyloxy examples include an aromatic heterocyclic group and an alicyclic heterocyclic group.
  • aromatic heterocyclic group for example, a 5-membered or 6-membered monocyclic aromatic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom, and sulfur nuclear power, and a 3- to 8-membered ring are condensed.
  • a bicyclic or tricyclic fused ring aromatic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur nuclear power group specifically, pyridyl, pyradyl, and the like.
  • alicyclic heterocyclic group examples include a 5-membered or 6-membered monocyclic alicyclic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom, and a 3- to 8-membered ring.
  • Specific examples include pyrrolidinyl, piperidino, Piperazinyl, morpholino, morpholinyl, thiomorpholine-containing thiomorpholinyl, homopiberidyl-containing homopiperazinyl, tetrahydropyridinyl, tetrahydroquinolinyl, tetrahydroisoquinolinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrobilanyl, dihydrobenzofuranyl, oxopiperaziryl, 2-oxopyrrolyl And so on.
  • Substituted lower alkanoyloxy, substituted lower alkoxy and substituted lower alkoxy are the same or different, for example, having 1 to 5 substitutions, preferably 1 to 5 substitutions, more preferably It has 1 to 3 substituents (a).
  • substituents (a) include hydroxy, halogen, substituted or unsubstituted lower alkoxy, lower alkanoyl, lower alkanoyloxy, carboxy, lower alkoxycarbol, strong rubamoyl, mono-lower alkylaminocarbo- And di-lower alkylaminocarbol, silane-containing mono-lower alkylamino-containing di-lower alkylamino, and the like.
  • the substituted aralkyloxy and the substituted heterocyclic alkyloxy are the same or different, for example, a substituent having 1 to 5 substituents, preferably 1 to 5 substituents, more preferably 1 to 3 substituents (b ).
  • substituent (b) include substituted or unsubstituted lower alkyl in addition to the examples of the substituent (a).
  • substituted lower alkyl and substituted lower alkoxy exemplified in the substituent (a) and the substituent (b) are the same or different, for example, a substitution having 1 to 3 substitutions, preferably 1 to 3 substitutions.
  • substituent (a), substituent (b) and substituent (i) include lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxy carbo, mono-lower alkyl amino carbo
  • the lower alkyl part of lower alkylaminocarbol, mono-lower alkylamino and di-lower alkylamino has the same meaning as the lower alkyl part of lower alkoxy
  • the lower alkanol part of lower alkanol and lower alkanoyloxy is The same as the lower alkanoyl moiety of the lower alkanoyloxy
  • halogen is iodine, bromine, chlorine or Each atom of fluorine is meant.
  • the two lower alkyl moieties of the di-lower alkylamino and di-lower alkylamino carbonate may be the same or different! /, May! /.
  • the pharmacologically acceptable salts of compound (I) include, for example, pharmacologically acceptable acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like. To do.
  • Examples of the pharmacologically acceptable acid addition salt of Compound (I) include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate and phosphate, acetate, maleate, fumarate and ken Organic acid salts such as acid salts.
  • Examples of the pharmacologically acceptable metal salt of compound (I) include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkali earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt. can give.
  • Examples of the pharmacologically acceptable ammonium salt of Compound (I) include salts such as ammonium and tetramethyl ammonium.
  • Examples of pharmacologically acceptable organic amine addition salts of compound (I) include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • Examples of the pharmacologically acceptable amino acid addition salt of compound (I) include addition salts such as glycine, ferrolanine, lysine, aspartic acid and glutamic acid.
  • Some compounds (I) used in the present invention may have various stereoisomers, positional isomers, tautomers and the like.
  • the present invention can use all these possible isomers and mixtures thereof, even in any ratio.
  • Compound (I) includes compounds that can be obtained as commercial products, but can be obtained, for example, by the production methods 1 to 4 shown below.
  • a compound (la) in which n is 1, -Q 1 -is -0-, Y and Z are oxygen atoms, and X 2 is hydroxy is obtained by the method of P. Kosma et al. Carbohydrate Research (2003), No. 338, No. 23, p.2571-2589] or a similar method.
  • Compound (la) can be produced by the following steps.
  • R la , R 3a and R 1 ⁇ 2 are each independently a substituted or unsubstituted lower alkanoyloxy.
  • R la , R 3a and R 1 ⁇ 2 are each independently a substituted or unsubstituted lower alkanoyloxy.
  • R 2a and R 5a are each independently hydrogen Atom, substituted or unsubstituted lower alkanoyloxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted aralkyloxy or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyloxy
  • R 2b and R 5b each independently represents a hydrogen atom or a hydroxy shea
  • B 1 is a mono-lower alkylamino Nyu
  • compound (Ia-i) is compound (Ilia) with 1 to 3 equivalents of compound (IVa), usually in the range of ⁇ 20 to 250 ° C. It can be obtained by reacting at a temperature between, preferably between 0 and 40 ° C. for 1 to 72 hours.
  • the solvent include pyridine, dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), dimethyl sulfoxide (DMSO), sulfolane, N-methylpyrrolidone (NMP) and the like.
  • the base include potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, triazole and the like.
  • the acid include tetrazole and the like.
  • Ilia) is used in an amount of 0.1 to 3 equivalents.
  • Compound (la-ii) in which R 3 and R 4 force hydroxy, and R 2 and R 5 are each independently a hydrogen atom or hydroxy is obtained by (1) hydrolyzing compound (Ia-i) in the presence of a base in a solvent. (2) Addition of 1 to 5 equivalents in a solvent in a hydrogen atmosphere or in the presence of a suitable hydrogen source, if necessary, with a catalyst such as palladium, platinum oxide, rhodium, or Raney nickel in a solvent.
  • the compound (Ia-i) can be obtained by hydrogenolysis in the presence of an agent at a temperature between ⁇ 20 ° C. and the boiling point of the solvent used for 5 minutes to 72 hours.
  • examples of the solvent include water-containing solvents.
  • water-containing solvents For example, methanol, ethanol, pyridine, DMF, DMA, DMSO, sulfolane, NMP, a mixed solvent thereof, or the like is used after adding water to the solvent.
  • the base examples include ammonia, triethylamine, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium bicarbonate, and the like.
  • the compound (Ia-i) includes 0.3 to 100 equivalents are used.
  • examples of the solvent include methanol, ethanol, ethyl acetate, water and the like.
  • the catalyst is preferably used in an amount of 0.001 to 10 equivalents, more preferably 0.01 to 1 equivalents, relative to compound (Ia-i).
  • the additive include a base and an acid, and the compound (Ia-i) is preferably used in an amount of 0.01 to 2 equivalents.
  • the base include ammonia and jetylamine, and examples of the acid include acetic acid.
  • Examples of the hydrogen source include formic acid, ammonium formate, sodium formate, and cyclohexenone, and these are preferably used in an amount of 2 equivalents to a large excess.
  • Compound (IVa) can be obtained as a commercial product or by the following method.
  • Compound (IVa) comprises (1) Compound (Va) in the absence of solvent or in a solvent, preferably in the presence of 0.1 to 10 equivalents of an appropriate additive, preferably 1 equivalent to a large excess of chlorinating agent. Alternatively, it is treated with a bromine agent at a temperature between -20 and 150 ° C. for 5 minutes to 72 hours. (2) The obtained compound is preferably treated with 1 to 10 equivalents of HB 1 (formula And B 1 is as defined above), in the absence of solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between -20 and 150 ° C. for 5 minutes. It can be obtained by reacting for 72 hours.
  • examples of the chlorinating agent include salt salt, salt oxalyl, oxysalt phosphorus, and the like
  • examples of the brominating agent include bromide.
  • examples include thiol and phosphorus oxybromide.
  • Examples of the additive include DMF, pyridine and the like.
  • Solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,2-dimetho carten (DME), dioxane, DMF, DMA, NMP, pyridine and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
  • examples of the base include potassium carbonate, potassium hydroxide, and sodium hydroxide.
  • solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, pyridine, water, and the like. These may be used alone or in combination.
  • compound (IVa) is a compound (Va) and preferably 1 to 5 equivalents of H- B 1 (wherein, B 1 is as defined above), in a solvent, preferably Is reacted in the presence of 1 to 5 equivalents of a condensing agent, preferably in the presence of 1 to 5 equivalents of an additive, at a temperature between -20 ° C and the boiling point of the solvent used for 5 minutes to 72 hours. Can also be obtained.
  • Examples of the condensing agent include 1,3-dicyclohexanecarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide'hydrochloride (EDC), carbodiimidazole (CDI) and the like. can give.
  • DCC 1,3-dicyclohexanecarbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide'hydrochloride
  • CDI carbodiimidazole
  • Examples of the additive include 1-hydroxybenztriazole monohydrate (HOBt).
  • solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, pyridine, water, and the like. These may be used alone or in combination.
  • Compound (Ilia) can be obtained as a commercial product or by the method described below.
  • R 7 represents lower alkyl, substituted or unsubstituted fur or Represents benzyl
  • Compound (Ilia) is compound (Via) or compound (VIb) in a solvent, preferably in the presence of 2 equivalents to a large excess of an additive, at a temperature between 0 ° C. and the boiling point of the solvent used. It can be manufactured from Kako which can be processed for 5 minutes to 72 hours.
  • Examples of the additive include acids such as hydrochloric acid, bases such as potassium carbonate, lithium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, or trimethylsilyl bromide and trimethylsilyl iodide. can give. These additives can be carried out by selecting appropriate ones according to the structure of the compound, substituents and the like.
  • solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, pyridine and the like. These can be used alone or with water added to them.
  • the compound (Ilia) is prepared by reacting the compound (Via) or the compound (VIb) with a catalyst such as palladium, platinum oxide, rhodium, or Raney nickel in a solvent, in a hydrogen atmosphere, or as appropriate. Obtained by hydrogenolysis for 5 minutes to 72 hours at a temperature between -20 and the boiling point of the solvent used, preferably in the presence of a hydrogen source, preferably in the presence of 1 to 5 equivalents of additives. Can do. For these methods, select an appropriate one according to the structure of the compound, substituents, etc. Can be implemented.
  • the catalyst is preferably used in an amount of 0.001 to 10 equivalents, more preferably 0.01 to 1 equivalent, relative to compound (Via) or compound (Vlb).
  • Examples of the hydrogen source include formic acid, ammonium formate, sodium formate, and cyclohexenone, and these are preferably used in an amount of 2 equivalents to a large excess.
  • solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, water and the like. These can be used alone or in combination.
  • Examples of the additive include bases such as ammonia and jetylamine, and acids such as acetic acid.
  • Compound (Via) or compound (Vlb) can be obtained as a commercial product or by the method described below.
  • Compound (Vla-i) or Compound (Vlb-i) can be obtained by the following method.
  • B 2 represents halogen, mono-lower alkylamino-containing di-lower alkylamino, morpholypiped piperidino or —OPO (OR 6 ) (wherein R 6 has the same meaning as above)
  • Compound (Vla-i) or Compound (Vlb-i) is usually 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 3 equivalents of Compound (Villa) or Compound (VII) in the presence of a base or acid in a solvent, respectively. It can be obtained by reacting with a compound (Vlllb). The reaction is usually carried out at a temperature between ⁇ 20 and 250 ° C., preferably at a temperature between 20 and 40 ° C. for 1 to 120 hours.
  • the solvent include dichloromethane, ethyl acetate, DMF and the like.
  • the base include triethylamine, pyridine, DMAP, triazole and the like
  • examples of the acid include tetrazole and the like, and usually 0.1 to 3 equivalents of each compound (VII) are used.
  • compound (Vla-i) or compound (V3 ⁇ 4-i) is usually 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 3 equivalents of compound (VII) in the presence of an additive in a solvent. It can also be obtained by reacting with (IXa) or compound (I Xb) followed by treatment with an oxidizing agent such as usually 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 3 equivalents of hydrogen peroxide / hydrogen peroxide. be able to.
  • the reaction of compound (VII) with compound (IXa) or compound (IXb) is usually carried out at a temperature between -20 and 250 ° C, preferably at a temperature between 20 and 40 ° C for 1 to 120 hours.
  • the treatment with an oxidant is usually carried out at a temperature between -20 and 50 ° C, preferably between 0 and 40 ° C for 1 to 120 hours.
  • Examples of the solvent include dichloromethane, ethyl acetate, DMF and the like.
  • the additive include triethylamine, pyridine, DMAP, triazole, tetrazole and the like, and usually 0.1 to 3 equivalents are used relative to compound (VII).
  • Compound (Villa) or Compound (Vlllb) and Compound (IXa) or Compound (IXb) are commercially available or the method of CC Tang et al. ["Synthetic Communication" 1998, No. 28, No. 15, p.2769] or a method based thereon.
  • B 3 is a halogen such as iodine and bromine, trifluoromethanesulfo- Represents a leaving group such as ruoxy, methanesulfo-loxy, p-toluenesulfo-loxy)
  • Compound (Via-ii) comprises (1) Compound (Vila) in a solvent, optionally in the presence of a catalytic amount to 10 equivalents of an additive, at a temperature between -20 and 150 ° C, and 1 equivalent to Treatment with a large excess of halogenating agent or 1 to 10 equivalents of sulfonating agent for 5 minutes to 72 hours gives compound (XI), (2) the compound (XI) is ⁇ 20 to 150 ° It can be obtained by treating with a solvent amount of compound (XII) for 5 minutes to 72 hours at a temperature between C and subjecting to an Arbuzov reaction.
  • examples of the halogenating agent include bromine, iodine, and odorous acid
  • examples of the sulfonating agent include trifluoromethanesulfonic anhydride, methanesulfonic anhydride, methanesulfuric chloride, Examples include P-toluene chloride.
  • Examples of the additive include bases such as triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, and triphenylphosphine.
  • Examples of the solvent include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, pyridine, and the like. Used in or mixed.
  • the compound ( ⁇ ) can be obtained as a commercial product.
  • the compound (Vlla-i) with m force ⁇ is the method of MJ Hadd et al. [“Journal of Organic Chemistry”, 1 997, Vol. 62, p.6961-6967], and the compound (VIIa_ii) in which m is 1 is prepared by the method of A. Murai et al. [“Tetrahedron”, 1998, 54 ⁇ , p.21-44].
  • the compound (Vla-iii) in which -Q 2 -is a single bond among the compounds (Via) can be obtained by the method of A. Vasella et al. ["Helvetica Chimica Acta J, 1986 69, ⁇ .25-34] or a method based thereon.
  • Compound (Via-iii) comprises (1) Compound (Vllb) in a solvent, preferably 1 to 10 equivalents of an acylating agent, preferably in the presence of a catalytic amount to 10 equivalents of a base, -20 to Compound (XIII) is obtained by treating at a temperature between 150 ° C for 5 minutes to 72 hours, and (2) compound (XIII) is dissolved in a solvent. Obtained by treatment at a temperature between -20 and 150 ° C for 5 minutes to 72 hours in the presence of 0.1 to 10 equivalents of compound (XII) and optionally a catalytic amount to 10 equivalents of additive. be able to.
  • examples of the acylating agent include saltycetyl, acetic anhydride and the like.
  • examples of the base include triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine and the like.
  • examples of the solvent include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, Examples thereof include pyridine, and these can be used alone or in combination.
  • examples of the additive include trifluoromethanesulfonic acid trimethylsilyl ether and the like, and usually 0.1 to 3 equivalents are used relative to compound (XIII).
  • Vllb can be obtained as a commercial product.
  • a compound in which m and a are 1 (Vnb-i) is prepared according to the method of RK Sood et al. [“Canadian n Journal of Chemistry”, 1994, 72nd, p. 247-251], S. Bertil et al. [“Carbohydrate Research”, 1978, 67th, p. 263-236], P. Manitto et al. Method ["Tetrahedron Let ters", 1987, Vol. 28, No. 42, p.5047-5048], or the method of Akepilotti et al. ["Acta 'Chemica' Scandinavia (Acta Chemica Scandinavica), 1972, Vol.
  • Compound (XVII) was prepared by the method of C. Mioskowski et al. [“Journal of Organic Chemistry”, 2002, 67th, No. 1, p. 146-153] or a method analogous thereto. Specifically, compound (XV) is reacted with, for example, in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a phosphine compound and preferably 1 to 10 equivalents of an azo compound, or in the presence of 1 to 10 equivalents of a phosphorane compound. Thus, it can be obtained by subjecting it to Mitsunobu reaction for 5 minutes to 72 hours at a temperature between the compound (XVI) and -78 ° C and the boiling point of the solvent used. These methods can be carried out by selecting an appropriate one according to the structure, substituent and the like of compound (XV).
  • Examples of the solvent include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, jetyl ether, THF, DME, dioxane, DMF, DMA, NMP, pyridine, and the like. These may be used alone or in combination.
  • Examples of the azo compounds include jetylazodicarboxylate (DEAD), diisopropylazodicarboxylate (DIAD), ⁇ , ⁇ , ⁇ ',, -tetramethylazadicarboxamide, 1,1,-(a Zadicarbonyl) dipiperazine, ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ , -tetraisopropylazadicarboxamide, etc., and usually 1 to 10 equivalents to compound (XV) are used.
  • DEAD jetylazodicarboxylate
  • DIAD diisopropylazodicarboxylate
  • ⁇ , ⁇ , ⁇ ', -tetramethylazadicarboxamide 1,1,-(a Zadicarbonyl) dipiperazine
  • XV tetraisopropylazadicarboxamide
  • phosphine compound examples include triphenylphosphine, tributylphosphine and the like, and usually 1 to 10 equivalents are used relative to compound (XV).
  • Examples of the phospholane compound include Kakuda reagents such as cyanomethylene tributylphosphorane and cyanomethylene trimethylphosphorane. Usually, 1 to 10 equivalents of the compound (XV) are used.
  • the compound (XV) is, for example, a compound (XV-i) in which R 9 is benzyl.
  • Compound (XVIII) can be prepared according to the method of C. Mioskowski et al. [“Journal of Organic Chemistry”, 1995, Vol. 60, p.2946-2947] or It can be obtained by a method according to it.
  • compound (XVII) is (1) treated with a tertiary amine in a solvent, or (2) a catalyst such as noradium, platinum oxide, rhodium, or Raney nickel in a solvent under a hydrogen atmosphere.
  • a suitable hydrogen source preferably in the presence of 1 to 5 equivalents of an additive, at a temperature between ⁇ 20 ° C. and the boiling point of the solvent used, for 5 minutes to 72 hours.
  • a suitable hydrogen source preferably in the presence of 1 to 5 equivalents of an additive, at a temperature between ⁇ 20 ° C. and the boiling point of the solvent used, for 5 minutes to 72 hours.
  • the reaction is usually carried out at a temperature between -20 and 250 ° C, preferably at a temperature between 70 and 120 ° C for 1 to 24 hours.
  • the solvent include toluene, DMF, dichloroethane and the like.
  • tertiary amines include quinutaridin, diazabicyclo [2,2,2] octane, N-methylmorpholine and the like, and usually 1 equivalent is used relative to compound (XVII).
  • examples of the solvent include methanol, ethanol, ethyl acetate, and water.
  • examples of the hydrogen source include formic acid, ammonium formate, sodium formate, cyclohexenone and the like, and these are preferably used in an amount of 2 equivalents to a large excess. Catalyst Preferably it is used 0.001-10 equivalent with respect to compound (XVII), More preferably, 0.01-1 equivalent is used.
  • examples of the additive include ammonia, jetylamine, acetic acid, etc., and 0.01 to 2 equivalents are preferably used relative to compound (XVII).
  • Compound (XIX) is the compound (XVIII), Mitsunobu et al's method [ “Synthesis (Synthesis)", 1981, P .l], or under the same conditions as step 2-1, is reacted with a compound (Vllb) Can be obtained.
  • Compound (lb) can be obtained by treating Compound (XIX) under the same conditions as in Step 1-1-2.
  • Compound (XIX) can also be produced, for example, by the following method.
  • Step 3-1 (wherein, a, m, R la , R 2 R 3a , R 1 ⁇ 2 , R 5a , R 9 , x X 2 and A are as defined above)
  • Compound (XX) can be obtained by reacting Compound (XV) with Compound (Vllb) under the same conditions as in Step 2-1.
  • Compound (XIX) can be obtained by reacting compound (XXI) with compound (XVI) under the same conditions as in Step 2-1.
  • Compound (1) is produced by culturing microorganisms capable of producing ADP-D-glycero-j8-D-mannoheptose in a culture medium, producing and accumulating them in the culture, Manufactured by sampling.
  • a microorganism capable of producing ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose is a microorganism belonging to the Gram-negative bacterium and capable of producing ADP-D-glycero-j8-D-mannoheptose. Can be used.
  • ADP-D-glycero- ⁇ -D is a mutant strain in which these microorganisms are mutated by human mutation methods such as ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, and treatment with mutagens. -Anything having the ability to produce mannohepto se can be used in the present invention.
  • a microorganism having the ability to produce ADP-D-glycero-jS-D-mannoheptose includes Gram-negative bacilli Massili ⁇ sp. ⁇ Y13101 belonging to the genus Mak newly isolated from the soil by the present inventors. it can.
  • any synthetic medium or natural medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and necessary growth and production promoting substances that can assimilate microorganisms.
  • the carbon source for example, glucose, starch, dextrin, mannose, fructose, sucrose, ratatose, xylose, arabinose, mannitol, molasses and the like are used alone or in combination.
  • hydrocarbons, alcohols, organic acids, etc. may be used depending on the ability of the bacteria to assimilate.
  • nitrogen sources include salt ammonium, ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dry yeast, corn 'steam' Liquor, soy flour, casamino acid and the like are used alone or in combination.
  • sodium chloride sodium, potassium salt potassium, magnesium sulfate, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, ferrous sulfate, calcium chloride salt, manganese sulfate, sulfite sulfate, sulfuric acid Inorganic salts such as copper can be added.
  • trace components that promote the growth of the bacteria used and the production and accumulation of ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose can be appropriately added.
  • a liquid culture method particularly a deep stirring culture method is suitable.
  • Culture is 16-37. C, preferably at a temperature of 25-32 ° C, pH 4-10, preferably pH 6-8, usually completed in 1-7 days and cultured with ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose It is produced and accumulated in the liquid and in the cells.
  • Aqueous ammonia or ammonium carbonate solution is used to adjust the pH of the medium. The culture is stopped when the production amount in the culture reaches the maximum.
  • ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose When isolating and purifying ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose accumulated in the culture from the culture, a method commonly used for isolating and purifying normal microbial metabolites from the culture Done according to For example, the culture is extracted with a solvent such as ethanol or 2-propanol. Next, ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose is obtained by subjecting to polystyrene adsorbent, ODS column chromatography, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, etc. It is done.
  • Isolation and purification of ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose accumulated in the culture from the culture is carried out in accordance with conventional methods for isolating and purifying normal microbial metabolites from the culture. Is called.
  • the culture is separated into a culture filtrate and cells by filtration, and cell components are extracted from the cells with a solvent such as chloroform, acetone, methanol, ethanol, and the like.
  • the extract and the culture filtrate are combined and passed through a polystyrene adsorbent such as Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical) to adsorb the active ingredients, and then acetic acid aqueous solution and acetic acid ammonium.
  • a polystyrene adsorbent such as Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical)
  • microorganisms capable of accumulating ADP-D-glycero- ⁇ -D-mannoheptose.
  • the following shows the basis of mycological characteristics and identification of Gram-negative bacilli Massilia sp. KY13101 belonging to the genus Massilia of the Proteobacteria class Beta subclass Oxalobacter group newly isolated from soil.
  • N diameter when cultured at 30 ° C for 3 days is about 8 mm.
  • Phospholipids main ingredients: phosphatidylethanolamine
  • KY13101 strain 16S ribosomal DNA (16S rDNA) partial nucleotide sequence (approximately 1.5 kb) was determined by PCR amplification and sequence alignment using known bacterial 16S rRNA or 16S rDNA sequences. The sequence was multiple aligned using the program Clustal W, and molecular phylogenetic analysis was performed by the neighbor binding method using the Phylip vers ion 3.6 program. As a result, KY1
  • the 3101 strain belongs to the Proteobacteria beta subclass Oxalobacter group and was included in the M ⁇ ili genus.
  • Fig. 1 shows the results of phylogenetic analysis using 16S rDNA partial sequences.
  • This bacterial strain is a Gram-negative aerobic motile gonococcus, and as a result of 16S ribosomal DNA molecular phylogenetic analysis, it belongs to the Proteobacteria beta subclass Oxalobacter group, Massilia timonae, which was closely related to Massilia timonae, is aerobic bacilli with motility derived from clinical samples.
  • 16S rDNA sequence similarity between KY13101 strain and Massilia timonae reference strain is 96% (1361/1405 bp) so Yes, it showed only low similarity to the same species.
  • Massilia timonae is a clinically derived bacterium, but KY13101 strain is derived from soil. The difference in habitat, the similarity of the 16S rDNA base sequence was low, and the isopower was judged to be classified into different species.
  • the KY13101 strain was identified as a new species of Gram-negative bacilli Massilia sp. Belonging to the genus Massilia of the Proteobacteria class Beta subclass Oxalobacter group.
  • the KY13101 strain was deposited on March 30, 2007, under the accession number NITE BP-348, at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kisarazu Kazusa Kamashichi, Chiba, Japan). .
  • the intermediates and target compounds in each of the above production methods should be isolated and purified by purification methods commonly used in synthetic organic chemistry, such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, and various chromatography. Can do.
  • the intermediate can be subjected to the next reaction without any particular purification.
  • compound (I) When the salt of compound (I) is obtained, if compound (I) is obtained in the form of a salt, it can be purified as it is, and if it is obtained in a free form, it can be obtained by a conventional method, that is, It may be dissolved or suspended in a suitable solvent, and a desired acid or base may be added to form a salt, followed by isolation and purification.
  • the compound (I) and pharmacologically acceptable salts thereof may be present in the form of adducts with water or various solvents. These adducts are also included in the present invention.
  • Test Example 1 NF- ⁇ B promoter-dependent transcriptional activity promotion effect
  • the NF- ⁇ B luciferase reporter plasmid pIF-luc (containing noidalomycin resistance gene expression unit) introduced into the cells was prepared by the method described in JP-A-2000-169479.
  • the plasmid was introduced into the human B cell line Namalwa (KJM-l strain) ["Cytotechnology", 1988, No. 1, p. 151], and 0.3 mg / mL hygromycin B was added. Then, neugromycin resistant cells were selected by culturing.
  • the noise A cell line hereinafter referred to as BGERKB5 cells whose luciferase activity was confirmed to be stimulated by TNF- ⁇ (10 ng / mL) stimulation was used in the following tests.
  • the NF- ⁇ activity promotion test using BGERKB5 cells can be performed as follows. However, this is an example, and the present invention is not limited to this method.
  • the BGERKB5 cells were suspended at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL using RPMI1640.
  • ITPSG medium having the following composition (hereinafter referred to as BGERKB5 cell suspension).
  • the compound was prepared as an aqueous solution by dissolving in phosphate buffer (pH 5) and diluting to the desired concentration in RPMI 1640. ITPSG medium.
  • RPMI1640 medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • concentrations or ratios hereinafter, the medium was referred to as RPMI1640 ⁇ ITPSG medium.
  • Penicillin streptomycin solution (Invitrogen, 5000 units / mL Bae - silicon down, ⁇ ⁇ g / mL streptomycin). 0 5%
  • HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
  • Insulin manufactured by Sigma: 3 ⁇ g / mL
  • Test Example 2 CD40, CD80 and CD86 upregulating effect
  • Flow cytometry methods such as CD40, CD80 and CD86, which are costimulatory molecules important for lymphocyte activity, can be performed as follows. However, this is only an example and is not limited to this method.
  • test compound group Cultured for 12 hours (test compound group).
  • test compound group As a control test, a control group to which no test compound was added was also set.
  • the following operation was performed at 4 ° C or less.
  • the cells were washed twice with 200 L of a phosphate buffer solution (PBS) containing 1% ushi serum albumin (Fraction V, Sigma) and 0.05% sodium azide. Replaced with zL.
  • PBS phosphate buffer solution
  • Fraction V 1% ushi serum albumin
  • zL 1% ushi serum albumin
  • the phycoerythrin-labeled mouse anti-human CD40 monoclonal antibody solution (BD Bioscience), phycoerythrin-labeled mouse anti-human CD80 monoclonal antibody solution (BD Bioscience) or phycoerythrin-labeled mouse anti-human CD86 is added to the cells. After adding L of a monoclonal antibody solution (BD Bioscience) and stirring, it was allowed to stand in the dark for 50 minutes.
  • the cells were washed twice with 200 ⁇ L of phosphate buffer solution (PBS) containing 1% ushi serum albumin (fraction V, Sigma) and 0.05% sodium azide. Replaced with 500 ⁇ L.
  • PBS phosphate buffer solution
  • 1% ushi serum albumin fraction V, Sigma
  • the number of cells was measured using EPICS XL-MCL (manufactured by Beckman Coulter, Inc., excitation wavelength 488 argon laser) as a flow cytometer, and the positive cell rate was calculated.
  • the measurement software used was System 2 Version 3.0 (Beckman Coulter). Table 5 shows the results of the positive cell rate.
  • CD86 53.3 78.4 According to Table 5, for example, Compound 16 and the like showed an improvement in the positive cell rate in any of CD40, CD80 and CD86. In other words, it was found that Compound (I) enhanced CD40, CD80 and CD86 expression and had a clear immune promoting effect.
  • the enzyme-labeled immunosorbent (ELISA) method of IP-10 can be performed as follows. However, this is only an example and is not limited to this method.
  • test compound is added to the suspension (3 mL) of BGERKB5 cells having a concentration of 1.1 X 10 6 cells / mL obtained in Test Example 1 to a final concentration of 50 nmol / L, and a CO incubator is added. All
  • test compound group The cells were cultured at 37 ° C for 48 hours (test compound group). A control group to which no test compound was added was also set as a control test.
  • the amount of IP-10 produced by BGERKB5 cells was measured using an Imnoassay kit (manufactured by Biosource International). A calibration curve was prepared using the sample attached to the kit, and the amount of IP-10 in the culture supernatant was measured.
  • the production amount of IP-10 was below the detection limit in the control group, whereas it was 1441 pg / mL for compound 16 and 821 pg / mL for compound 30.
  • Test Example 4 Suppression of immunostimulatory effect by knockdown of TLR9 using siRNA
  • a knockdown test of TLR9 using siRNA using BGERKB5 cells can be performed as follows. However, this is an example, and the present invention is not limited to this method. Suspension of 4 ⁇ 10 5 cells / mL BGERKB5 cells obtained according to the method described in Test Example 1 Place 0.5 mL of the solution in 6 holes of a 24-well plate (total number of cells: 1.2 X 10 6 cells), CO incubator
  • SiRNA against TLR9 (Ambion pre-designed siRNA, ID # 6055, Cat. 16704, Lot. 047951si) was introduced at 100 pmol per well using Lipofuectamine 2000 (Invitrogen).
  • the medium was changed 24 hours later, and further cultured for 48 hours, and the obtained cells were collected in a sterile tube.
  • the cells were suspended at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL (TLR9 kd group). Similarly to the “TLR9 kd group”, siRNA was not included! /, And the “Mock group” was set.
  • test compound prepared according to the method described in Test Example 1 was added (final concentration 50 nmol / L) (test compound). group).
  • test compound a test compound prepared according to the method described in Test Example 1
  • group a solvent control group to which no test compound was added was set.
  • 1 x 10 6 cells / mL cell suspension of each group (2.6 mL: total number of cells 2.6 X 10 6 cells) is 800 rpm at 4 ° C using himac C F702 centrifuge (Hitachi Koki Co., Ltd.) After centrifuging for 10 minutes, the supernatant was removed using Pipetteman, and PBS (2 mL) was added. The resulting cell suspension was further centrifuged at 800 rpm for 10 minutes at 4 ° C using a himac CF702 centrifuge (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.), and the supernatant was removed using a pipetman to obtain cells. It was.
  • RNA 5 ⁇ g is mixed with 10 mmol / L dNTPs mixed solution (1.0 ⁇ L) and 0.5 g / LO ligo (dT) primer (1.0 ⁇ L), and an aqueous solution of jetyl pyrocarbonate (DEPC) is added.
  • DEPC jetyl pyrocarbonate
  • RV 5'— TCATGAGTCCTTCCACGATAC— 3 ′ (SEQ ID NO: 2)
  • NF— ⁇ B promoter—derived NF- ⁇ B-LUC
  • RV 5 '-GGATCTCTCTGATTTTTCTTGC-3' (SEQ ID NO: 4)
  • CD80 antigen CD80
  • RV 5'— GCTACCTTCAGATCTTTTCAGC— 3' (SEQ ID NO: 8)
  • the change in the mRNA expression level of each gene when the test compound was added was shown by the ratio between the sample of the test compound group and the sample of the solvent control group. That is, measured with ABI PRISM7700 The number of cycles when the signal value reached 00 was counted, and the difference in the Ct value (A Ct) between the test compound group and the solvent control group was determined. The difference in one cycle was doubled, and the following formula The fluctuation value was calculated as “relative expression level”. Whether or not the signal obtained by the above reaction was the target amplified fragment was determined by subjecting the solution after the reaction to agarose gel electrophoresis and the size of the main amplified fragment.
  • GAPDH glycosylcholine dehydrogenase
  • the ratio of “the mRNA expression level of each gene in the test compound group” was calculated (that is, “the mRNA expression level of each gene in the solvent control group” was 1).
  • Table 7 shows the calculation results when Compound 16 was used as the test compound.
  • GPDH dehydrogenase
  • interleukin 12B (IL12B 1.4 0,6
  • CD80 antigen CD30 127 73.0
  • Table 7 the expression levels of NF- ⁇ B-LUC, IL12B, and CD80 genes were enhanced by addition of compound 16 in BGERKB5 cells. Also enhanced by compound 16 The expression level of these genes was attenuated by knocking down TLR9.
  • compound (I) increased the expression of NF- ⁇ B-LUC, IL12B, and CD80 genes, and that this transcription enhancement was mediated by TLR9.
  • Known immunostimulants include OK432 (picibanil), PSK (krestin), and lentinan, which are used clinically as antitumor agents.
  • Bacterial DNA is also known to have an immune promoting effect. Unlike the human CpG dinucleotide sequence, the CpG dinucleotide sequence present in bacterial DNA is not methylated at position 5 of the cytosine base. Also, the frequency of CpG dinucleotide sequences is low in human DNA. This non-methyl CpG motif is considered to be important for immune promotion. Synthetic oligo DNA (CpG-oligodeoxynucleotide) containing this motif has a strong immunity-promoting action similar to bacterial DNA.
  • Helper T cells include Thl cells and Th2 cells having different ability to produce cytoplasmic force.
  • Thi cells regulate cellular immunity and are strongly involved in bacterial and viral infections and exhibit cytotoxic activity (Thl immunity).
  • Th2 cells regulate humoral immunity and are involved in allergies (Th2 immunity).
  • CpG-oligooxynucleotide induces strong Thl immunity, exhibits antitumor activity, antibacterial activity, and suppresses allergic Th2 immunity.
  • These CpG-oligooxynucleotides are known for their use as anti-tumor agents, anti-infectives and anti-allergic agents, and their usefulness has been confirmed in animal models and clinical trials. Chia Reviews' Nature Reviews Drug Discovery ", 2000, Part 1, p.797;” Nature One Drugs "Nature Reviews Immunology, 2004, 4th, p. L;
  • CpG-oligodeoxynucleotides showed antitumor and life-prolonging effects in a mouse model of cervical cancer ["Tali-Cal's Cancer Cancer Research", 2003 9th, p.2693].
  • CpG-oligodeoxynucleotide increased the survival rate of surgical resection and acupuncture therapy (cyclophosphamide or topotecan) in a mouse model of rhabdomyosarcoma ["Tari -Cal 'Can “Clinical Cancer Research", 2003, 9th, p.3105].
  • a mouse model of leishmaniasis in a mouse model of leishmaniasis!
  • CpG-oligodeoxynucleotide suppressed airway inflammation, airway hyperresponsiveness, and airway remodeling [Journal 'Ob Alenoregi'"Journal of Allergy & Clinical Immunology", 2002, 110th p.867].
  • CpG-oligodeoxynucleotides also inhibited airway hyperresponsiveness and airway remodeling in the akagesal asthma model sensitized with house dust mite allergen ['American' Journal of Respirate Lee 'and' Tari Eye Force Nore 'Ke' Meinin (American Journal of Respiratory ana Critical Care Medicine), 2004, No. 1 0, ⁇ .1153] 0
  • CpG-oligodeoxynucleotides were effective against non-small cell lung cancer in combination with taxanes and platinum preparations [“American Society 1” Ob Tali-Cal Oncology 1 (American Society of Clinical Oncology: ASCO), 2005, Annual Meeting, Abstract, # 7039] 0
  • ragweed pollen antigen and CpG-oligodeoxynucleotide conjugates in clinical trials Gate enhanced Thl immunity and suppressed Th2 immunity to improve symptoms of allergic rhinitis [Journal of Allergy & Clinical Im munology, 2004 Year 113, p.235].
  • TLR 9 Toll-like receptor 9
  • TLR9 one of Toll-like receptors [Nature] , 2000, No. 408, p.740] o TLR9 is present in B cells and rod cells.
  • TLR9 transmits a signal into the cell via a single adapter molecule such as MyD88, activates transcription factors such as NF- ⁇ B that regulates the expression of cytoforce-in genes, and induces the production of cytoforce-ins.
  • lymphocyte activity It enhances the expression of surface molecules such as CD40, CD80, and CD86, which are important costimulatory molecules.
  • Chemokine IP-10 (interferon-gamma mduciole protein 10 kDa) (and X and L10) ⁇ ⁇ , known to have anti-tumor activity and have anti-angiogenic activity with ⁇ S '' (Blood ), 1997, 89, p.2635; “Journ of Experimental Medicine”, 1996, 184, p. 981; “Roykemia Lynn” Leukemia Lymphoma ", 1995, 19th, p.267;” Journal of Experimental Medicine ", 1993, 178th, ⁇ .1057). IP-10 has natural killer cell activity and T cell migration.
  • the compound (I) having TLR9 agonistic activity and Z or immune promoting activity is a TLR9 agonist, immune promoter, antiallergic agent, anti-allergic agent, It is considered useful as a tumor agent, an anti-infective agent and the like.
  • Compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof can be used as it is or in various pharmaceutical forms depending on its pharmacological action and its purpose of administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by uniformly mixing an effective amount of Compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient with a pharmacologically acceptable carrier.
  • the carrier may take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration.
  • These pharmaceutical compositions are desirably in a unit dosage form suitable for oral or parenteral administration such as ointment and injection.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, methylcellulose, starch, sodium alginate, carboxymethylcellulose strength, disintegrants such as crystalline cellulose, magnesium stearate, talc, etc.
  • a binder such as gelatin, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, hydroxypropyl cellulose, and methyl cellulose, and a surfactant such as sucrose fatty acid ester and sorbite fatty acid ester may be used according to a conventional method. Tablets containing 1 to 300 mg of active ingredient per tablet are preferred.
  • excipients such as lactose and sucrose
  • disintegrants such as starch
  • binders such as gelatin and the like
  • excipients such as lactose and mannitol
  • capsule for example, gelatin, water, sucrose, gum arabic, sorbit, glycerin, crystalline cellulose, magnesium stearate, talc and the like may be used by a conventional method.
  • Capsules containing 1 to 300 mg of active ingredient per capsule are preferred.
  • sugars such as sucrose, water, ethanol and the like may be used by a conventional method.
  • ointment bases such as petrolatum, liquid paraffin, lanolin, macrogol, emulsifiers such as sodium lauryl lactate, salt benzalcoum, sorbitan monofatty acid ester, sodium carboxymethylcellulose, gum arabic, etc.
  • ointment bases such as petrolatum, liquid paraffin, lanolin, macrogol, emulsifiers such as sodium lauryl lactate, salt benzalcoum, sorbitan monofatty acid ester, sodium carboxymethylcellulose, gum arabic, etc.
  • emulsifiers such as sodium lauryl lactate, salt benzalcoum, sorbitan monofatty acid ester, sodium carboxymethylcellulose, gum arabic, etc.
  • water physiological saline, vegetable oils (eg olive oil, peanut oil, etc.), solvents such as ethyl oleate, propylene glycol, solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, urethane,
  • solvents such as ethyl oleate, propylene glycol, solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, urethane
  • An isotonic agent such as sodium chloride and glucose, a preservative such as phenol, cresol, p-hydroxybenzoic acid ester and chlorobutanol, an antioxidant such as ascorbic acid and sodium pyrosulfite may be used in a conventional manner.
  • Compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof can be administered by an oral method, an aspiration method or a parenteral method such as an ointment or injection.
  • the effective dose and frequency of administration vary depending on the dosage form, patient age, body weight, symptoms, etc., but it is usually preferable to administer 0.0001-20 mg / kg 1 to 4 times per day! / ,.
  • Reference Examples 1 to 20 and 34 to 36 show methods for synthesizing intermediates used in the synthesis of Compound (I).
  • Participant Example 13 Synthesis of 2.3.4.6-Tetra-0-methyl-a mannopyranose (Compound K)
  • D-mannose (1.8 g, 10 mmol) was dissolved in a mixed solvent of DMSO and water (20/1, 10 mL), and the resulting solution was mixed with sodium hydroxide (4.0 g, 100 mmol) and methyl iodide (3.0 mL, 46 mmol) was added once a day at room temperature for a total of 3 times and stirred for 3 days.
  • the reaction mixture was poured into ice water and extracted with black mouth form. The organic layer was washed successively with dilute hydrochloric acid and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • Methyltriphenylphosphorobromide bromide (570 g, 1.6 mol) is suspended in THF (1.5 L), and butyllithium (12 mL, 2.6 mol / L hexane solution) is added dropwise under ice cooling. Stir for 30 minutes.
  • THF suspension 500 mL
  • the crude aldehyde obtained in Step 3 was poured, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Water was added to the reaction mixture and extracted with jetyl ether.
  • the organic layer was washed successively with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and water, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • a THF solution (11 mL, 1.0 mol / L) of borane-THF complex was added dropwise at ⁇ 20 ° C to a THF solution (100 mL) of the bull form (3.4 g, 7.4 mmol) obtained in step 4.
  • the temperature was raised to 0 ° C, and the mixture was stirred at the same temperature for 1 hour.
  • Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (11 mL) and aqueous hydrogen peroxide (1.1 mL, 30%) were added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 2.5 hr. Water was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • the reaction mixture was diluted with water and Dowex 50 (H + form) was added to adjust the pH to about 4.0.
  • Trimethylsilyl iodide (0.14 mL, 1.1 mmol) was added to a dichloromethane solution (10 mL) of the 1-0-acetyl compound obtained in step 2 (580 mg, 1.0 mmol) at 0 ° C, and the same temperature was added for 40 minutes. After stirring, the solvent was distilled off under reduced pressure, Sarakuko and toluene (1.0 mL) were added, and the solvent was distilled off again under reduced pressure. The residue was dissolved in THF (10 mL), a THF solution (1.0 mL) of cyanotetrabutylammonium (0.54 g, 2.0 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • a sodium hydroxide aqueous solution (1.2 mL, 2 mol / L) was added to an ethanol solution (5.0 mL) of the cyan compound (140 mg, 0.26 mmol) obtained in Step 3, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 12 hours.
  • the reaction mixture was poured into hydrochloric acid (10 mL, 2 mol / L) and extracted with black mouth form. The organic layer was washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to give carboxylic acid (110 mg, yield 72%).
  • Step 16 From the crude hydroxy form obtained in Step 7 (2.3 g, 3.9 mmol), benzyl bromide (0.93 mL, 7.8 mmol) and sodium hydride (55% in oil, 0.31 g, 7.8 mmol), Reference Example 16 In the same manner as in Step 1, a crude tetrabenzyl compound was obtained. Trifluoroacetic acid (1.0 mL) was added to a methylene chloride solution (10 mL) of the obtained crude tetrabenzil, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture was poured into ice-cold water and extracted with black mouth form.
  • API-MS m / z 536 (M + H20) + , 487 (M— MeO) +.
  • a THF solution (100 mL) of a, ⁇ -unsaturated ester (3.3 g, 6.4 mmol) obtained in step 3 under a nitrogen atmosphere a THF solution of lithium diisopropylaluminum hydride (13 mL. L .O mol / L) was added dropwise at -78 ° C and stirred for 1 hour at the same temperature. Further, a THF solution of lithium diisopropylaluminum hydride (13 mL. L .O mol / L) was added dropwise and the same temperature was maintained for 30 minutes. Stir.
  • reaction mixture was poured into 1.0 mol / L hydrochloric acid (50 mL) under ice cooling, stirred for 2.5 hours, and extracted with a mixed solution of ethyl acetate and hexane (1/1). The organic layer was washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to obtain an alcohol (4.1 g).
  • Acetic anhydride solution (6.0 mL) of the tetraacetoxy compound (0.25 g, 0.64 mmol) obtained in step 3
  • concentrated sulfuric acid (0.010 mL) at 0 ° C
  • the mixture was stirred for 30 minutes, poured into a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and extracted with black mouth form.
  • the organic layer was washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • the residue was dissolved in DMF (15 mL), hydrazine acetate (0.5 1 g, 5.6 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hr.
  • the reaction mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate.
  • 3 ⁇ 4- Be ⁇ ⁇ ⁇ SS): ⁇ - ⁇ 3 ⁇ 4
  • Trimethyl phosphate (0.63 mL, 5.0 mmol) and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (0.56 mL, 2.5 mmol) were added to the methylene chloride solution (20 mL) of the crude diacetyl compound obtained in Step 1 (1.2 g, 2.1 mmol).
  • methylene chloride 5.0 mL was cooled under ice-cooling and stirred at the same temperature for 2 hours.
  • the reaction mixture was poured into ice water and extracted with black mouth form.
  • the organic layer was washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • OUIUI qz '' S ⁇ ⁇ 0) ⁇ Ma-; ⁇ ⁇ / ⁇ 'N'N—Be fi OH — ⁇ fl 3 ⁇ 4- ⁇ S Be ⁇ I. raui ⁇ s ⁇ ⁇ ) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4
  • Adenosine 5,-(6-deoxy- ⁇ -D-mannoheptaviranosyl)-a. ⁇ -methylenediphosphate ( ⁇ 30)

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Abstract

　式(I)（式中、aは0または1を表し、nは0～2の整数を表し、mは0～5の整数を表し、X1およびX2はそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシを表し、Yは酸素原子または硫黄原子を表し、 -Q1-は-O-等を表し、-Q2-は-O-等を表し、-Z-は-O-等を表し、 R1、R3およびR4はそれぞれ独立して、ヒドロキシ等を表し、R2およびR5はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ等を表し、Aは6-アミノプリン-9-イル等を表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するTLR9作動薬等を提供する。

Description

明 細 書
Toll様受容体 9作動薬
技術分野
[0001] 本発明は免疫促進剤、 Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬等に関する。
背景技術
[0002] CpG-オリゴデォキシヌクレオチドは Toll様受容体の一つである Toll様受容体 9 (TLR 9)に認識されることが明ら力となっている（例えば「ネーチヤ一 (Nature)」、 2000年、第 408卷、 p.740等)。 TLR9は、例えば B細胞、榭状細胞等に存在しており、細菌やウイ ルスの DNA中に存在する非メチル化 CpGモチーフを有するオリゴヌクレオチドにより 活性ィ匕されることが知られている。つまり、 TLR9は MyD88等のアダプター分子を介し て細胞内にシグナルを伝達し、サイト力イン遺伝子発現を制御する NF- κ B等の転写 因子群を活性ィ匕し、サイト力インの産生を惹起する。また、リンパ球活性化に重要な 副刺激分子である CD40、 CD80、 CD86等の表面分子の発現を亢進させる。
[0003] また、 CpG-オリゴデォキシヌクレオチド等の TLR9作動薬は、免疫促進活性を有し、 抗アレルギー作用、抗腫瘍作用、抗感染症作用を示すことが知られている (例えば E P0468520； WO96/02555； WO98/18810； W098/37919； WO98/40100； W099/51259 ； W099/56755 ;「ネーチャ^ ~ ·レビューズ 'ドラッグ 'ディスカバリー（Nature Reviews D rug Discovery)」、 2002年、第 1卷、 p.797 ;「ネーチヤ一'レビューズ 'ィムノロジー（Nat ure Reviews Immunology)」、 2004年、第 4卷、 p.1；「タリ-カル 'キャンサー 'リサーチ（ Clinical Cancer Research)」、 2003年、第 9卷、 p.2693；「タリ-カル 'キャンサ^ ~ ·リサ一 チ（Clinical Cancer Research)」、 2003年、第 9卷、 p.3105；「ザ'ジャーナル'ォブ 'ィム ノロジー（The Journal of Immunology) J , 1998年、第 160卷、 ρ.3627 ;「プロシーディン グス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイェンシズ ·ォブ ·ザ ·ユナイテッド .ス アイツ 'オフ · 7メリ力 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unite d States of America)」、 1999年、第 96卷、 p.6970 ;「ジャーナル'ォブ'アレルギ^ ~ ·ァ ンド.タリ-カル.ィムノロジー（Journal of Allergy & Clinical Immunology)」、 2002年、 第 110卷、 p.867 ;「アメリカン 'ジャーナル'ォブ 'レスピレイトリ一'アンド'クリティカル' ケア 'メデイシン (American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine)」、 200 4年、第 170卷、 p.ll53 ;「アメリカン'ソサイエティ一'ォブ 'タリ-カル 'オンコロジ一（A merican Society of Clinical Oncology: ASCO)」、 2005年、ァニュアル'ミーティング（A nnual Meeting)、アブストラクト、 #7039 ;「ジャーナノレ'ォブ'ァレノレギ^ ~ ·アンド 'タリ- カル'ィムノロジー（Journal of Allergy & Clinical Immunology)」、 2004年、第 113卷、 p. 235；「ネーチヤ一 (Nature)」、 2000年、第 408卷、 p.740；「ブラッド（Blood)」、 1997年、 第 89卷、 p.2635 ;「ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンタル'メディシン（Journal of Experi mental Medicine)」、 1996年、第 184卷、 p.981；「ロイケミア'リンフォーマ（Leukemia Ly mphoma)」、 1995年、第 19卷、 p.267 ;「ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンタル'メデイシ ン（Journal of Experimental Medicine)」、 1993年、第 178卷、 p.1057等）。
[0004] モノヌクレオチド =5，-ジホスフェートとしては、例えばアデノシン =5， -(L-グリセ口 - j8 -D-マンノビラノシル)ジホスフェート、アデノシン =5， -(D-グリセ口- 13 -D-マンノヘプト ピラノシル)ジホスフェート等がグラム陰性細菌の細胞壁成分であるリポ多糖 (LPS)の 生合成中間体として知られており（非特許文献 1参照）、後述の表中に記載の化合物 18〜23等が市販されている。また、後述の表中に記載の化合物 9〜17等の製造法が 知られて！/ヽる (非特許文献 2参照)。
非特許文献 1：「ジャーナル'ォブ 'バタテリォロジ一（Journal of Bacteriology)」、 2002 年、第 184卷、 p.363
非特許文献 2 :「カルボハイドレイト'リサーチ（Carbohydrate Research)」、 2003年、第 338卷、 p.2571
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、例えば TLR9作動薬、免疫促進剤、抗アレルギー剤、抗腫瘍剤、 抗感染症剤等として有用な TLR9の作動活性を有する化合物等を提供することにある 課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、以下の（1)〜 (49)に関する。
(1)式 0) [0007] [化 1]
Figure imgf000005_0001
[0008] (式中、 aは 0または 1を表し、
nは 0〜2の整数を表し、
mは 0〜5の整数を表し、
X1および X2はそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシを表し、
Yは酸素原子または硫黄原子を表し (nが 1または 2のとき、 2つまたは 3つの Yは同一で も異なっていてもよい）、
- Q1-は- 0-、 -CH -または- CF -を表し、
2 2
- Q2-は単結合、 - 0-、 -CH - 0-または- CH -を表し、
2 2
- Z-は- 0-または- CH -を表し、
2
R3および R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルカノ ィルォキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アル ケニルォキシ、置換もしくは非置換のァラルキルォキシまたは置換もしくは非置換の 複素環アルキルォキシを表し、
R2および R5はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級 アルカノィルォキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低 級ァルケ-ルォキシ、置換もしくは非置換のァラルキルォキシまたは置換もしくは非 置換の複素環アルキルォキシを表し、
Aは下記の置換基群 (A)力 選ばれる基を表す)で表される化合物またはその薬理学 的に許容される塩を有効成分として含有する TLR9作動薬。
[0009] [化 2] 置換基群 (A)
Figure imgf000006_0001
[0010] (2) mが 1である前記（1)記載の TLR9作動薬。
(3) aが 1である前記（1)または (2)記載の TLR9作動薬。
(4) aが 0である前記（1)または (2)記載の TLR9作動薬。
(5) R2が水素原子である前記（1)〜 (4)の 、ずれかに記載の TLR9作動薬。
(6) R1および R2がそれぞれ独立して、ヒドロキシまたは低級アルカノィルォキシである 前記（1)〜（4)の 、ずれかに記載の TLR9作動薬。
(7) X1および X2がヒドロキシである前記（1)〜（6)の 、ずれかに記載の TLR9作動薬。
(8)式 (IA)
[0011] [化 3]
Figure imgf000006_0002
[0012] (式中、 maは 1〜5の整数を表し、
X1、 X2、 Y、 Q Q2および Aはそれぞれ前記と同義であり、
R1A、 R3A、 および R5Aはそれぞれ独立して、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級 アルカノィルォキシまたは置換もしくは非置換の低級アルコキシを表す)で表される 化合物またはその薬理学的に許容される塩。
(9) maが 1である前記 (8)記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
(10) X1および X2がヒドロキシである前記 (8)または（9)記載の化合物またはその薬理 学的に許容される塩。
(11) R1Aがヒドロキシまたは低級アルカノィルォキシである前記（8)〜（10)の ヽずれか に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
(12) Aが
[0013] [化 4]
Figure imgf000007_0001
[0014] である前記 (8)〜（11)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩。
(13)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する TLR9作動薬。
(14)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する抗アレルギー剤。
(15)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
(16)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する抗感染症剤。
(17)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する免疫促進剤。 (18)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する TLR9が関与する疾患の治療および Zまたは予防剤。
(19)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 を有効成分として含有する抗アレルギー剤。
(20)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
(21)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 を有効成分として含有する抗感染症剤。
(22)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 を有効成分として含有する免疫促進剤。
(23)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 を有効成分として含有する TLR9が関与する疾患の治療および Zまたは予防剤。
(24) Massilia sp. KY13101株（受託番号： NITE BP- 348)。
(25)前記 (24)記載の微生物を利用した前記（1)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物 の製造法。
(26)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の有効量を投与する工程を含む TLR9の作動方法。
(27)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の有効量を投与する工程を含むアレルギーの治療方法。
(28)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の有効量を投与する工程を含む腫瘍の治療方法。
(29)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の有効量を投与する工程を含む感染症の治療方法。
(30)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の有効量を投与する工程を含む免疫促進方法。
(31)前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の有効量を投与する工程を含む TLR9が関与する疾患の治療および Zまたは予防方 法。 (32)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩の有効量を投与する工程を含む TLR9の作動方法。
(33)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩の有効量を投与する工程を含むアレルギーの治療方法。
(34)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩の有効量を投与する工程を含む腫瘍の治療方法。
(35)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩の有効量を投与する工程を含む感染症の治療方法。
(36)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩の有効量を投与する工程を含む免疫促進方法。
(37)前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩の有効量を投与する工程を含む TLR9が関与する疾患の治療および Zまたは予防 方法。
(38) TLR9作動薬の製造のための、前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物また はその薬理学的に許容される塩の使用。
(39)抗アレルギー剤の製造のための、前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物ま たはその薬理学的に許容される塩の使用。
(40)抗腫瘍剤の製造のための、前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物またはそ の薬理学的に許容される塩の使用。
(41)抗感染症剤の製造のための、前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の化合物または その薬理学的に許容される塩の使用。
(42)免疫促進剤の製造のための、前記（1)〜（7)のいずれかに記載の化合物または その薬理学的に許容される塩の使用。
(43) TLR9が関与する疾患の治療および Zまたは予防剤の製造のための、前記（1) 〜（7)のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
(44) TLR9作動薬の製造のための、前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物また はその薬理学的に許容される塩の使用。
(45)抗アレルギー剤の製造のための、前記 (8)〜（12)の 、ずれかに記載の化合物 またはその薬理学的に許容される塩の使用。
(46)抗腫瘍剤の製造のための、前記 (8)〜（12)のいずれかに記載の化合物または その薬理学的に許容される塩の使用。
(47)抗感染症剤の製造のための、前記 (8)〜（12)のいずれかに記載の化合物また はその薬理学的に許容される塩の使用。
(48)免疫促進剤の製造のための、前記 (8)〜（12)のいずれかに記載の化合物また はその薬理学的に許容される塩の使用。
(49) TLR9が関与する疾患の治療および Zまたは予防剤の製造のための、前記 (8) 〜（12)のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。 発明の効果
[0017] 本発明により、例えば TLR9作動薬、免疫促進剤、抗アレルギー剤、抗腫瘍剤、抗 感染症剤等として有用な TLR9の作動活性を有する化合物等が提供される。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]図 1は、本願で使用される化合物の製造に用いたグラム陰性桿菌の 16S rDNA 部分配列を用いた系統解析の結果を示す図である。
[図 2]図 2は、代表的な化合物 (I)による NF- κ Bの活性促進効果を示したものである。 結果は、各化合物の濃度におけるルシフェラーゼ活性値 (RLU)で示す。縦軸は RLU を表し、横軸は試験化合物の濃度 (mol/L)を表す。 國ー：化合物 1、 一口一 ：化合 物 2、 一◊一 ：化合物 10、 一 X ：化合物 12、 一 + ：化合物 14、 一△一 ：化合物 16、 ー參一 ：化合物 23
[0019] [図 3]図 3は、化合物 30による NF- κ Βの活性促進効果を示したものである。比較のた めに、化合物 16の結果とともに記載してある。結果は、各化合物の濃度におけるルシ フェラーゼ活性値 (RLU)で示す。縦軸は RLUを表し、横軸は試験化合物の濃度 (mol /L)を表す。 △一 ：化合物 16、 一 T一 ：化合物 30
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、式 (I)で表される化合物をィ匕合物 (I)という。他の式番号の化合物についても同 様である。
式 (I)および式 (IA)の各基の定義において、 低級アルコキシの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分枝状の炭素数 1 〜8のアルキルがあげられ、具体的にはメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブ チノレ、 sec-ブチノレ、 tert-ブチノレ、ペンチノレ、イソペンチノレ、ネオペンチノレ、へキシノレ、 ヘプチル、ォクチル等があげられる。
[0021] 低級ァルケ-ルォキシの低級アルケニル部分としては、例えば直鎖または分枝状 の炭素数 2〜8のァルケ-ルがあげられ、具体的にはビュル、ァリル、 1-プロべ-ル、 メタクリル、クロチル、 1-ブテュル、 3-ブテニル、 2-ペンテニル、 4-ペンテニル、 2-へキ セ -ル、 5-へキセ -ル、 2-ヘプテュル、 2-オタテュル等があげられる。
低級アルカノィルォキシの低級アルカノィル部分としては、例えば直鎖または分枝 状の炭素数 1〜7のアルカノィルがあげられ、具体的にはホルミル、ァセチル、プロピ ォニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロィル、へキサノィル、 ヘプタノィル等があげられる。
[0022] ァラルキルォキシおよび複素環アルキルォキシにおけるアルキレン部分は前記低 級アルキル力 水素原子を 1つ除いた基を表す。
ァラルキルォキシのァリール部分としては、例えば炭素数 6〜14の単環式、二環式 または三環式のァリールがあげられ、具体的にはフエ-ル、インデュル、ナフチル、 アントリル等があげられる。
[0023] 複素環アルキルォキシの複素環基部分としては、例えば芳香族複素環基、脂環式 複素環基等があげられる。芳香族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子お よび硫黄原子力 選ばれる少なくとも 1個の原子を含む 5員または 6員の単環性芳香 族複素環基、 3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子およ び硫黄原子力ゝら選ばれる少なくとも 1個の原子を含む縮環性芳香族複素環基等があ げられ、具体的にはピリジル、ピラジュル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、キノリル、イソ キノリル、フタラジュル、キナゾリル、キノキサリル、ナフチリジニル、シンノリニル、ピロ リル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリァゾリル、テトラゾリル、チェ-ル、フリル、チアゾリル 、ォキサゾリル、インドリル、インダゾリル、ベンゾビラ-ル、ベンゾチェ-ル、ベンゾフ ラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリァゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾピラゾリル、 ベンゾジォキサ -ル、ベンゾォキサゾリル、プリ-ル、ベンゾジォキソラ-ル等があげ られる。脂環式複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から 選ばれる少なくとも 1個の原子を含む 5員または 6員の単環性脂環式複素環基、 3〜8 員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選 ばれる少なくとも 1個の原子を含む縮環性脂環式複素環基等があげられ、具体的に はピロリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、モルホリノ、モルホリニル、チオモルホリ入 チォモルホリニル、ホモピベリジ入ホモピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒ ドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロビラニル、ジ ヒドロベンゾフラ -ル、ォキソピペラジ -ル、 2-ォキソピロリジ -ル等があげられる。
[0024] 置換低級アルカノィルォキシ、置換低級アルコキシおよび置換低級ァルケ-ルォ キシは、同一または異なって、例えば置換数 1〜置換可能な数の、好ましくは置換数 1〜5の、より好ましくは置換数 1〜3の置換基 (a)を有する。具体的な置換基 (a)としては 、ヒドロキシ、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、低級アルカノィル、低 級アルカノィルォキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボ-ル、力ルバモイル、モノ 低級アルキルアミノカルボ-ル、ジ低級アルキルアミノカルボ-ル、シァ入アミ入モ ノ低級アルキルアミ入ジ低級アルキルアミノ等があげられる。
[0025] 置換ァラルキルォキシおよび置換複素環アルキルォキシは、同一または異なって、 例えば置換数 1〜置換可能な数の、好ましくは置換数 1〜5の、より好ましくは置換数 1 〜3の置換基 (b)を有する。具体的な置換基 (b)としては、置換基 (a)の例示に加えて置 換もしくは非置換の低級アルキル等があげられる。
該置換基 (a)および置換基 (b)で例示した置換低級アルキルおよび置換低級アルコ キシは、同一または異なって、例えば置換数 1〜置換可能な数の、好ましくは置換数 1〜3の置換基 (0を有する。具体的な置換基 (0としては、ハロゲン等があげられる。
[0026] 該置換基 (a)、置換基 (b)および置換基 (i)の例示にぉ 、て、低級アルキル、低級アル コキシ、低級アルコキシカルボ-ル、モノ低級アルキルアミノカルボ-ル、ジ低級アル キルアミノカルボ-ル、モノ低級アルキルァミノおよびジ低級アルキルァミノの低級ァ ルキル部分は、前記低級アルコキシの低級アルキル部分と同義であり、低級アルカノ ィルおよび低級アルカノィルォキシの低級アルカノィル部分は、前記低級アルカノィ ルォキシの低級アルカノィル部分と同義であり、ハロゲンはヨウ素、臭素、塩素または フッ素の各原子を意味する。ジ低級アルキルァミノおよびジ低級アルキルアミノカル ボ-ルの 2つの低級アルキル部分は同一でも異なって!/、てもよ!/、。
[0027] 化合物 (I)の薬理学的に許容される塩は、例えば薬理学的に許容される酸付加塩、 金属塩、アンモ-ゥム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。
化合物 (I)の薬理学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝 酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩等の 有機酸塩があげられる。化合物 (I)の薬理学的に許容される金属塩としては、例えば ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアル カリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。化合物 (I)の薬理学的に許 容されるアンモ-ゥム塩としては、例えばアンモ-ゥム、テトラメチルアンモ -ゥム等の 塩があげられる。化合物 (I)の薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、例え ばモルホリン、ピぺリジン等の付加塩があげられる。化合物 (I)の薬理学的に許容され るアミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フエ-ルァラニン、リジン、ァスパラギン酸 、グルタミン酸等の付加塩があげられる。
[0028] 本発明で使用される化合物 (I)の中には種々の立体異性体、位置異性体、互変異 性体等が存在し得るものがある。本発明はこれらの可能な全ての異性体およびそれ らの混合物を使用でき、その混合比にっ 、ても任意の比率でょ 、。
次に、化合物 (I)の製造法について説明する。
なお、以下に示した製造法において、定義した基が反応条件下変化する力 また は方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される方法、例えば官 能基の保護、脱保護等 [例えば、プロテクティブ'グループス'イン'オーガニック'シン センス第二版 (Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、ダリ' ~~ン (T. W.Greene)著、ジョン'ワイリ^ ~ ·アンド'サンズ 'インコーポレイテッド（John Wiley & So ns Inc.) (1999年)等]の手段に付すことにより容易に製造を実施することができる。ま た、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
[0029] 化合物 (I)は、市販品として入手することが可能なものも含まれるが、例えば以下に 示す製造法 1〜4等によって得ることができる。
Figure imgf000013_0001
化合物 (I)のうち nが 1、 - Q1-が- 0-、 Y及び Zが酸素原子、 X2がヒドロキシである化合 物 (la)は、コスマ（P. Kosma)らの方法 [「カルボハイドレイト'リサーチ（Carbohydrate R esearch)」、 2003年、第 338卷、 23号、 p.2571-2589]またはそれに準じた方法により製 造することができる。
[0030] 具体的には、以下に記載の方法等により製造することができる。
工程ト1 :
化合物 (la)は以下の工程により製造することができる。
[0031] [化 5]
Figure imgf000014_0001
[0032] [式中、 a、 m、 x Q2および Aはそれぞれ前記と同義であり、 Rla、 R3aおよび R½はそれ ぞれ独立して、置換もしくは非置換の低級アルカノィルォキシ、置換もしくは非置換 の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級ァルケ-ルォキシ、置換もしくは非置 換のァラルキルォキシまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルォキシを表し、 R2a および R5aはそれぞれ独立して、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルカノィル ォキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級ァルケ- ルォキシ、置換もしくは非置換のァラルキルォキシまたは置換もしくは非置換の複素 環アルキルォキシを表し、 R2bおよび R5bはそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキ シを表し、 B1はモノ低級アルキルアミ入ジ低級アルキルアミ入モルホリ入ピペリジノ または- OPO(OR6) (式中、 R6は水素原子、低級アルキルまたはァリールを表す)を表
2
す] 工程 1-1- 1
化合物 (la)のうち、化合物 (Ia-i)は溶媒中、必要により塩基または酸の存在下、化合 物 (Ilia)を 1〜3当量の化合物 (IVa)と通常- 20〜250 °Cの間の温度、好ましくは 0〜40 °Cの間の温度で、 1〜72時間反応させることにより得ることができる。溶媒としては、例 えばピリジン、ジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルァセタミド（DMA)、ジメチルスル ホキシド (DMSO)、スルホラン、 N-メチルピロリドン (NMP)等があげられる。塩基として は、例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水 素ナトリウム、トリァゾール等があげられ、酸としては例えばテトラゾール等があげられ 、通常、それぞれィ匕合物 (Ilia)に対して 0.1〜3当量用いられる。
工程 1-1- 2
また、化合物 (la)のうち、
Figure imgf000015_0001
R3および R4力ヒドロキシ、 R2および R5がそれぞれ独立し て水素原子またはヒドロキシである化合物 (la-ii)は、（1)溶媒中、塩基存在下、化合物 (Ia-i)の加水分解反応を行うか、または（2)溶媒中、パラジウム、酸化白金、ロジウム、 ラネーニッケル等の触媒で、水素雰囲気下、または適当な水素源の存在下、必要に より好ましくは 1〜5当量の添加剤の存在下、 -20 °Cと用いる溶媒の沸点の間の温度 で、 5分間〜 72時間、化合物 (Ia-i)を加水素分解することにより得ることができる。これ らの方法は、化合物 (Ia-i)の構造、置換基等に応じて適当なものを選択して、実施す ることがでさる。
[0033] (1)において、溶媒としては、含水溶媒があげられ、例えばメタノール、エタノール、 ピリジン、 DMF、 DMA, DMSO,スルホラン、 NMP、これらの混合溶媒等に水を添カロし て用いられる。
塩基としては、例えばアンモニア、トリェチルァミン、ナトリウムメトキシド、ナトリウムェ トキシド、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素 ナトリウム等があげられ、通常、化合物 (Ia-i)に対して 0.3〜100当量用いられる。
[0034] (2)にお 、て、溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、酢酸ェチル、水等があ げられる。
触媒は、化合物 (Ia-i)に対し、好ましくは 0.001〜10当量、より好ましくは 0.01〜1当量 用いられる。 添加剤としては、塩基または酸等があげられ、化合物 (Ia-i)に対し、好ましくは 0.01 〜2当量用いられる。塩基としては、例えばアンモニア、ジェチルァミン等があげられ 、酸としては、例えば酢酸等があげられる。
水素源としては、例えばギ酸、ギ酸アンモ-ゥム、ギ酸ナトリウム、シクロへキセノン 等があげられ、これらは好ましくは 2当量〜大過剰量用いられる。
工程ト 2 :
化合物 (IVa)は、市販品としてまたは以下の方法により得ることができる。
[化 6]
Figure imgf000016_0001
[0036] (式中、 X1、 Aおよび B1はそれぞれ前記と同義である）
化合物 (IVa)は、（1)化合物 (Va)を無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは 0.1 〜10当量の適当な添加剤の存在下、好ましくは 1当量から大過剰量の塩素化剤また は臭素ィ匕剤で、 -20〜150 °Cの間の温度で、 5分間〜 72時間処理し、（2)得られたィ匕 合物を好ましくは 1〜10当量の H-B1 (式中、 B1は前記と同義である）と、無溶媒でまた は溶媒中、必要により好ましくは 1〜10当量の塩基の存在下、 -20〜150 °Cの間の温 度で、 5分間〜 72時間反応させることにより得ることができる。
[0037] (1)にお 、て、塩素ィ匕剤としては、例えば塩ィ匕チォ -ル、塩ィ匕ォキザリル、ォキシ塩 ィ匕リン等があげられ、臭素化剤としては、例えば臭化チォ -ル、ォキシ臭化リン等が あげられる。
添加剤としては、例えば DMF、ピリジン等があげられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢 酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン（THF)、 1,2-ジメトキ シェタン（DME)、ジォキサン、 DMF、 DMA, NMP、ピリジン等があげられ、これらを単 独でまたは混合して用いられる。
[0038] (2)において、塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸化ナトリウ ム、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、 N-メチル モルホリン、ピリジン、 1,8-ジァザビシクロ [5.4.0]-7-ゥンデセン（DBU)、 4-ジメチルァ ミノピリジン (DMAP)等があげられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジク ロロェタン、トルエン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、 ジォキサン、 DMF、 DMA, NMP、ピリジン、水等があげられ、これらを単独でまたは混 合して用いられる。
[0039] また、別法として、化合物（IVa)は、化合物 (Va)を好ましくは 1〜5当量の H- B1 (式中 、 B1は前記と同義である）と、溶媒中、好ましくは 1〜5当量の縮合剤の存在下、必要 により好ましくは 1〜5当量の添加剤の存在下、 -20 °Cと用いる溶媒の沸点の間の温 度で、 5分間〜 72時間反応させることによつても得ることができる。
縮合剤としては、例えば 1,3-ジシクロへキサンカルポジイミド (DCC)、 1-ェチル -3-( 3-ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド '塩酸塩（EDC)、カルボ-ルジイミダゾール（ CDI)等があげられる。
[0040] 添加剤としては、例えば 1-ヒドロキシベンズトリアゾール '一水和物（HOBt)等があ げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジク ロロェタン、トルエン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、 ジォキサン、 DMF、 DMA, NMP、ピリジン、水等があげられ、これらを単独でまたは混 合して用いられる。
工程ト 3 :
化合物 (Ilia)は、市販品としてまたは以下の記載の方法により得ることができる。
[0041] [化 7]
Figure imgf000018_0001
[0042] (式中、 a、 m、 Rla、 R2 R3a、 R½、 R5aおよび Q2はそれぞれ前記と同義であり、 R7は低級 アルキル、置換もしくは非置換のフ -ルまたはベンジルを表す）
化合物 (Ilia)は、化合物 (Via)または化合物 (VIb)を、溶媒中、好ましくは 2当量〜大過 剰量の添加剤の存在下、 0 °Cと用いる溶媒の沸点の間の温度で、 5分間〜 72時間処 理すること〖こより製造することができる。
[0043] 添加剤としては、例えば、塩酸などの酸、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化カリ ゥム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド等の塩基、もしくは、臭化トリメチルシリル およびヨウ化トリメチルシリル等があげられる。これらの添加剤は、化合物の構造、置 換基等に応じて適当なものを選択して、実施することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジク ロロェタン、トルエン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、 ジォキサン、 DMF、 DMA, NMP、ピリジン等があげられ、これら単独か、もしくはこれら に水を添カ卩して用いられる。
[0044] また、別法として、化合物（Ilia)は、化合物 (Via)または化合物 (VIb)を溶媒中、パラ ジゥム、酸化白金、ロジウム、ラネーニッケル等の触媒で、水素雰囲気下、または適 当な水素源の存在下、必要により好ましくは 1〜5当量の添加剤の存在下、 -20でと 用いる溶媒の沸点の間の温度で、 5分間〜 72時間、加水素分解することにより得るこ とができる。これらの方法は、化合物の構造、置換基等に応じて適当なものを選択し て、実施することができる。触媒は、化合物 (Via)または化合物 (Vlb)に対し、好ましく は 0.001〜10当量、より好ましくは 0.01〜1当量用いられる。
[0045] 水素源としては、例えばギ酸、ギ酸アンモ-ゥム、ギ酸ナトリウム、シクロへキセノン 等があげられ、これらを好ましくは 2当量〜大過剰量用いられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジク ロロェタン、トルエン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、 ジォキサン、 DMF、 DMA, NMP、水等があげられ、これらを単独でまたは混合して用 いられる。
[0046] 添加剤としては例えばアンモニア、ジェチルァミン等の塩基または酢酸等の酸があ げられる。
工程ト4:
化合物 (Via)または化合物 (Vlb)は、市販品としてまたは以下に記載の方法により得 ることがでさる。
例えば、化合物 (Via)または化合物 (Vlb)のうち、 -Q2-が- 0-もしくは- CH - 0-である
2 化合物 (Vla-i)または化合物 (Vlb-i)は以下の方法により得ることができる。
[0047] [化 8]
Figure imgf000019_0001
[0048] [式中、 Q3は- CH -または単結合を表し、 a、 m、 Rla、 R2 R3a、 R4a、 R5aおよび R7はそれ
2
ぞれ前記と同義であり、 B2はハロゲン、モノ低級アルキルアミ入ジ低級アルキルアミノ 、モルホリ入ピペリジノまたは- OPO(OR6) (式中、 R6は前記と同義である）を表す]
2
化合物 (Vla-i)または化合物 (Vlb-i)は、それぞれ溶媒中、塩基または酸の存在下、 化合物 (VII)を通常 1〜10当量、より好ましくは 1〜3当量の化合物 (Villa)または化合物 (Vlllb)と反応させることにより得ることができる。反応は、通常- 20〜250 °Cの間の温度 、好ましくは 20〜40 °Cの間の温度で、 1〜120時間行われる。溶媒としては、例えばジ クロロメタン、酢酸ェチル、 DMF等があげられる。塩基としては、例えばトリェチルアミ ン、ピリジン、 DMAP、トリァゾール等があげられ、酸としては例えばテトラゾール等が あげられ、通常、それぞれィ匕合物 (VII)に対して 0.1〜3当量用いられる。
[0049] また、化合物 (Vla-i)または化合物 (V¾-i)は、それぞれ溶媒中、添加剤の存在下、 化合物 (VII)を通常 1〜10当量、より好ましくは 1〜3当量の化合物 (IXa)または化合物 (I Xb)と反応させ、続いて例えば通常 1〜10当量、より好ましくは 1〜3当量の過酸ィ匕水 素水等の酸化剤で処理することによつても得ることができる。化合物 (VII)と化合物 (IX a)または化合物 (IXb)との反応は、通常- 20〜250 °Cの間の温度、好ましくは 20〜40 °Cの間の温度で、 1〜120時間行われ、酸化剤での処理は通常- 20〜50 °Cの間の温 度、好ましくは 0〜40 °Cの間の温度で、 1〜120時間行われる。
[0050] これらの方法は、化合物 (VII)の構造、置換基等に応じて適当なものを選択して、実 施することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、酢酸ェチル、 DMF等があげられる。 添加剤としては、例えばトリェチルァミン、ピリジン、 DMAP、トリァゾール、テトラゾー ル等があげられ、通常、化合物 (VII)に対して 0.1〜3当量用いられる。
[0051] 化合物 (Villa)または化合物 (Vlllb)およびィ匕合物 (IXa)または化合物 (IXb)は、市販品 としてまたはタンダ（C. C. Tang)らの方法 [「シンセティック 'コミュニケーション（Synthe tic Communication)」、 1998年、第 28卷、第 15号、 p.2769]もしくはそれに準じた方法 により得ることができる。
工程ト 5 :
また、化合物 (Via)のうち- Q2-が- CH -である化合物 (Via- ii)は、フィールド（R.A.Fiel d)らの方法 [「テトラへドロン'レターズ（Tetrahedron Letters)」、 2001年、第 42卷、 p.2 231-2234]またはそれに準じた方法により得ることができる。
具体的には以下の方法により得ることができる。
[化 9]
Figure imgf000021_0001
(Via-ii)
[0053] (式中、 a、 m、 Rla、 R2 R3a、 R½、 R5aおよび R7はそれぞれ前記と同義であり、 B3はヨウ素 、臭素等のハロゲン、トリフルォロメタンスルホ -ルォキシ、メタンスルホ -ルォキシ、 p -トルエンスルホ-ルォキシ等の脱離基を表す）
化合物 (Via-ii)は、（1)化合物 (Vila)を溶媒中、必要に応じ触媒量〜 10当量の添カロ 剤の存在下、 -20〜150 °Cの間の温度で、 1当量〜大過剰量のハロゲン化剤または 1 〜 10当量のスルホ -ル化剤で、 5分間〜 72時間処理することにより化合物 (XI)を得、 ( 2)この化合物 (XI)を- 20〜150 °Cの間の温度で、溶媒量の化合物 (XII)で 5分間〜 72 時間処理し、アルブゾフ (Arbuzov)反応に付すことにより得ることができる。
(1)において、ハロゲン化剤としては、例えば臭素、ヨウ素、臭酸等があげられ、スル ホ-ル化剤としては、例えば無水トリフルォロメタンスルホン酸、無水メタンスルホン酸 、塩化メタンスルホ -ル、塩化 P-トルエンスルホ-ル等があげられる。
[0054] 添加剤としては、例えばトリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、ピリジンなど の塩基、トリフエ-ルホスフィン等があげられる。 溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢 酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、ジォキサン、 DMF、 DMA 、 NMP、ピリジン等があげられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
[0055] 化合物 (ΧΠ)は、市販品として得ることができる。
化合物 (Vila)のうち、例えば m力^である化合物 (Vlla-i)はヘッド（M. J. Hadd)らの方 法 [「ジャーナル ·ォブ ·オルガニック ·ケミストリ一（Journal of Organic Chemistry)」、 1 997年、第 62卷、 p.6961-6967]で、また mが 1である化合物 (VIIa_ii)は、村井 (A. Murai )らの方法 [「テトラへドロン（Tetrahedron)」、 1998年、第 54卷、 p.21-44]で合成するこ とがでさる。
工程ト 6 :
化合物 (Via)のうち- Q2-が単結合である化合物 (Vla-iii)は、バッセラ（A.Vasella)らの 方法 [「ヘルべチカ 'ケミカ 'ァクタ（Helvetica Chimica Acta) J , 1986年、第 69卷、 ρ.25 -34]またはそれに準じた方法により得ることができる。
具体的には以下の方法により得ることができる。
[0056] [化 10]
Figure imgf000022_0001
(式中、 a、 m、 Rla、 R2a、 R3a、 R½、 R5aおよび R7はそれぞれ前記と同義であり、 B4は低級 アルカノィルォキシを表す）
化合物 (Via-iii)は、（1)化合物 (Vllb)を溶媒中、好ましくは 1〜10当量のァシル化剤 で、必要に応じ好ましくは触媒量〜 10当量の塩基の存在下、 -20〜150 °Cの間の温 度で、 5分間〜 72時間処理することによりィ匕合物 (XIII)を得、（2)化合物 (XIII)を溶媒中 、 0.1〜 10当量の化合物 (XII)と必要に応じ好ましくは触媒量〜 10当量の添加剤の存 在下、 -20〜150 °Cの間の温度で、 5分間〜 72時間処理することにより得ることができ る。
[0058] (1)において、ァシル化剤としては、例えば塩ィ匕ァセチル、無水酢酸等があげられ る。塩基としては、例えばトリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、ピリジン等が あげられる。
(1)および（2)において、溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジ クロロェタン、トルエン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、 ジォキサン、 DMF、 DMA, NMP、ピリジン等があげられ、これらを単独でまたは混合し て用いられる。
[0059] (2)にお!/、て、添加剤としては、例えばトリフルォロメタンスルホン酸トリメチルシリル エーテル等があげられ、通常、化合物 (XIII)に対して 0.1〜3当量用いられる。
化合物 (Vllb)は市販品として得ることができる。 mおよび aが 1である化合物 (Vnb-i)は 、ソード（R. K. Sood)らの方法 [「カナディアン'ジャーナル'ォブ 'ケミストリー（Canadia n Journal of Chemistry)」、 1994年、第 72卷、 p.247- 251]、バーティル（S. Bertil)らの 方法 [「カルボハイドレート'リサーチ（Carbohydrate Research)」、 1978年、第 67卷、 p. 263-236]、マニット（P. Manitto)らの方法 [「テトラへドロン'レターズ（Tetrahedron Let ters)」、 1987年、第 28卷、第 42号、 p.5047- 5048]、もしくはァケピロッティ（Akepilotti) らの方法 [「ァクタ'ケミカ 'スカンジナビア（Acta Chemica Scandinavica)」、 1972年、第 26卷、 p.4143-4146]、またはそれらに準じた方法により得ることができ、 mが 2、 aが 1で ある化合物 (VIIb-ii)は、岸らの方法 [「ジャーナル ·ォブ ·アメリカン'ケミカル ·ソサイエ ティ（Journal of American Chemical Society)」、 1996年、第 118卷、第 34号、 p.7946— 7 968]もしくはボーン（J.H. van Boom)らの方法 [「オルガニック 'レターズ（Organic Lett ers)」、 2000年、第 2卷、第 9号、 ρ.1275_1277]、またはそれらに準じた方法により得る ことができる。 化合物 (I)のうち nが 1、 - Q1-が- CH -、 Q2、 Yおよび Zが酸素原子である化合物 (lb)は
2
、例えば以下に記載の方法により製造することができる。 [0060] [化 11]
Figure imgf000024_0001
[0061] (式中、 a、 m、 Rla、 R2 R3a、 R½、 R5a、 x X2および Aはそれぞれ前記と同義であり、 R9 は置換もしくは非置換のベンジルを表す）
工程 2-1：
化合物 (XVII)は、ミオスコフスキー（C. Mioskowski)らの方法 [「ジャーナル'ォブ 'ォ ーガ-ック 'ケミストリー（Journal of Organic Chemistry)」、 2002年、第 67卷、第 1号、 p. 146-153]またはそれに準じた方法により得ることができる。具体的には、化合物 (XV) を、例えば溶媒中、好ましくは 1〜10当量のホスフィン化合物および好ましくは 1〜10 当量のァゾ化合物の存在下、または 1〜10当量のホスホラン化合物の存在下で、ィ匕 合物 (XVI)と- 78 °Cと用いる溶媒の沸点との間の温度で、 5分間〜 72時間光延反応に 付すこと〖こより得ることができる。これらの方法は、化合物 (XV)の構造、置換基等に応 じて適当なものを選択して、実施することができる。
[0062] 溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、 1,2-ジクロロェタン、トルエン、酢 酸ェチル、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、 THF、 DME、ジォキサン、 DMF、 DMA 、 NMP、ピリジン等があげられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
ァゾ化合物としては、ジェチルァゾジカルボキシレート（DEAD)、ジイソプロピルァゾ ジカルボキシレート（DIAD)、 Ν,Ν,Ν' ,Ν，-テトラメチルァザジカルボキサミド、 1,1，- (ァ ザジカルボニル)ジピペラジン、 Ν,Ν,Ν' ,Ν，-テトライソプロピルァザジカルボキサミド等 があげられ、通常、化合物 (XV)に対し、 1〜10当量用いられる。
ホスフィン化合物としては、トリフエ-ルホスフィン、トリブチルホスフィン等があげられ 、通常、化合物 (XV)に対し、 1〜10当量用いられる。
また、ホスホラン化合物としては、シァノメチレントリブチルホスホラン、シァノメチレン トリメチルホスホラン等の角田試薬があげられ、通常、化合物 (XV)に対し、 1〜10当量 用いられる。
[0063] 化合物 (XV)は、例えば、 R9がべンジルである化合物 (XV-i)は、ミオスコフスキー (C.
Mioskowski)らの方法 [「ジャーナル ·ォブ ·オーガニック ·ケミストリー (Journal of Orga nic Chemistry)」、 1995年、第 60卷、 p.2946-2947]またはそれに準じた方法により得る ことができる。
工程 2- 2 :
化合物 (XVIII)は、ミオスコフスキー (C. Mioskowski)らの方法 [「ジャーナル'ォブ 'ォ ーガニック'ケミストリー（Journal of Organic Chemistry)」、 1995年、第 60卷、 p.2946-2 947]またはそれに準じた方法により得ることができる。
具体的には、化合物 (XVII)を、（1)溶媒中、 3級ァミンで処理するか、または（2)溶媒 中、ノラジウム、酸化白金、ロジウム、ラネーニッケル等の触媒で、水素雰囲気下、ま たは適当な水素源の存在下、必要により好ましくは 1〜5当量の添加剤の存在下、 -2 0 °Cと用いる溶媒の沸点の間の温度で、 5分間〜 72時間、加水素分解することにより 得ることができる。これらの方法は、化合物の構造、置換基等に応じて適当なものを 選択して、実施することができる。
[0064] (1)において、反応は通常- 20〜250 °Cの間の温度、好ましくは 70〜120 °Cの間の 温度で、 1〜24時間行われる。溶媒としては、トルエン、 DMF、ジクロロェタン等があげ られる。 3級ァミンとしては、例えばキヌタリジン、ジァザビシクロ [2,2,2]オクタン、 N-メ チルモルホリン等があげられ、通常、化合物 (XVII)に対し 1当量用いられる。
(2)において、溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、酢酸ェチル、水等があ げられる。水素源としては、例えばギ酸、ギ酸アンモ-ゥム、ギ酸ナトリウム、シクロへ キセノン等があげられ、これらを好ましくは 2当量〜大過剰量用いられる。触媒は、化 合物 (XVII)に対し、好ましくは 0.001〜10当量、より好ましくは 0.01〜1当量用いられる 。添加剤としては、アンモニア、ジェチルァミン、酢酸等があげられ、化合物 (XVII)に 対し、好ましくは 0.01〜2当量用いられる。
工程 2- 3 :
化合物 (XIX)は、化合物 (XVIII)を、光延らの方法 [「シンセシス（Synthesis)」、 1981 年、 P.l]、もしくは工程 2-1と同様な条件で、化合物 (Vllb)と反応させることにより得る ことができる。
工程 2- 4:
化合物 (lb)は、化合物 (XIX)を、工程 1-1-2と同様な条件で、処理することにより、得 ることがでさる。
靈去 3 :
化合物 (XIX)は、例えば以下の方法により製造することもできる。
[0065] [化 12]
Figure imgf000026_0001
[0066] (式中、 a、 m、 Rla、 R2 R3a、 R½、 R5a、 R9、 x X2および Aはそれぞれ前記と同義である） 工程 3-1：
化合物 (XX)は、化合物 (XV)を、工程 2-1と同様な条件でィ匕合物 (Vllb)と反応させる ことにより得ることができる。
工程 3- 2 :
化合物 (XXI)は、化合物 (XX)を、工程 2-2と同様な条件で反応させることにより得るこ とがでさる。 工程 3- 3 :
化合物 (XIX)は、化合物 (XXI)を、工程 2-1と同様な条件で、化合物 (XVI)と反応させ ることにより得ることがでさる。
[0067] 化合物 (1)、特に化合物 16 [アデノシン =5， -(D-グリセ口- 13 -D-マンノヘプトビラノシ ル)ジホスフェート： ADP- D- glycero- β - D- mannoheptose]等は、以下の培養法により 製造することちできる。
製诰法 4 :
ィ匕合物 (1)、特に化合物 16は、 ADP- D-glycero- j8 -D- mannoheptose生産能を有す る微生物を培地に培養し、培養物中に生成、蓄積させ、該培養物から採取すること によって製造される。 ADP-D-glycero- β -D- mannoheptose生産能を有する微生物と しては、グラム陰性細菌に属し、 ADP- D-glycero- j8 -D- mannoheptose生産能を有す る微生物であれば 、ずれの微生物でも用いることができる。またこれらの微生物を人 ェ的変異方法、例えば紫外線照射、 X線照射、変異誘起剤処理等によって変異させ た変異株ある 、は自然的に変異した変異株でも ADP- D- glycero- β - D- mannohepto se生産能を有するものであれば本発明に用いることができる。
例えば、 ADP-D- glycero- jS -D- mannoheptose生産能を有する微生物としては、本 発明者らが土壌より新たに分離した Ma k属に属するグラム陰性桿菌 Massili^sp. κ Y13101を挙げることができる。
本発明の ADP-D- glycero- β -D- mannoheptose生産蓄積菌の培養に際しては、通 常の微生物の培養法が適用される。培地としては、微生物の資化し得る炭素源、窒 素源、無機物および必要な生育、生産促進物質等を程よく含有する培地であれば合 成培地、天然培地いずれでも使用できる。
[0068] 炭素源としては、例えばグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、 シュクロース、ラタトース、キシロース、ァラビノース、マンニトーノレ、糖蜜等が単独また は組合せて用いられる。さらに、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有 機酸等も用いられる。
窒素源としては、例えば塩ィ匕アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、 硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン'スチープ' リカー、大豆粉、カザミノ酸等が単独でまたは組合せて用いられる。
[0069] そのほか、必要に応じて塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カル シゥム、リン酸二水素カリウム、硫酸第一鉄、塩ィ匕カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜 鉛、硫酸銅等の無機塩類が加えることができる。
さらに、使用菌の生育や ADP- D- glycero- β - D- mannoheptoseの生産蓄積を促進 する微量成分を適当に添加することができる。
培養法としては、液体培養法、特に深部攪拌培養法が適している。培養は、 16〜37 。C、好ましくは 25〜32 °Cの温度で、 pH 4〜10、好ましくは pH 6〜8で行われ、通常 1 〜7日で完了し、 ADP-D- glycero- β -D- mannoheptoseが培養液中および菌体中に 生成蓄積される。培地の pH調整にはアンモニア水や炭酸アンモ-ゥム溶液等が用い られる。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
[0070] 培養物中に蓄積した ADP-D- glycero- β -D- mannoheptoseを培養物から単離精製 するに際しては、通常の微生物代謝産物を培養物から単離精製するために常用され る方法に従って行われる。例えば、培養物をエタノール、 2-プロパノール等の溶剤で 抽出する。ついで、ポリスチレン系吸着剤、 ODSカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過ク 口マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等に 順次付すことにより、 ADP-D- glycero- β -D- mannoheptoseが得られる。
培養物中に蓄積した ADP-D- glycero- β -D- mannoheptoseの培養物からの単離精 製は、通常の微生物代謝産物を培養物から単離精製するために常用される方法に 従って行われる。例えば、培養物を濾過により培養濾液と菌体とに分け、菌体からク ロロホルム、アセトン、メタノール、エタノール等の溶剤で菌体成分を抽出する。つい で、抽出液と培養濾液とを併せて、ポリスチレン系吸着剤、例えばダイヤイオン HP-2 0 (三菱化学社製)等に通塔して活性成分を吸着させ、ついで酢酸水溶液、酢酸アン モ -ゥム水溶液、メタノール、エタノール、アセトン等で溶出する。溶出液を濃縮し、ォ クタデシル基結合型シリカゲル (ODS)〖こよるカラムクロマトグラフィー、順相または逆 相の高速液体クロマトグラフィー、シリカゲル等によるカラムクロマトグラフィー等により 、 ADP-D- glycero- β -D- mannoheptose 得る。
[0071] 以下に、 ADP- D- glycero- β -D- mannoheptose生産蓄積能を有する微生物として 本発明者らが土壌より新たに分離したプロテオバクテリア綱ベータ亜綱ォキサロバク ターグループ Massilia属に属するグラム陰性桿菌 Massilia sp. KY13101株の菌学的特 徴および同定の準拠を示す。
(A)形態的性質
普通栄養寒天培地および普通栄養液体培地で生育した KY13101株の形態学的特 徴を以下に示す。
[0072] (1)細胞の形;桿状
大きさ；0.8〜1.3 iu m x 1.4〜3.1 πι
(2)細胞の多形性;無
(3)運動性;有
(4)胞子;無
(Β) 培養的性質
(1)肉汁寒天平板培養
1.生育の様相；良好に生育し、粘性のコロニーを形成する。 30°Cで 3日培養時の n 一直径は約 8 mm。
[0073] 2.色；クリーム色
3.拡散性色素;無
(2)肉汁液体培養
1.表面生育;無
2.濁度;有
3.菌体の凝集;有
(3)リトマスミルク
1.反応;アルカリィ匕
2.凝固；無
3.液化；有
(C)生理学的性質
(1)グラム染色性;陰性
(2)硝酸塩の還元；亜硝酸塩へ還元する (3) MRテスト；陰性
(4) VPテスト；陰性
(5)インドールの生成；陰性
(6)硫ィ匕水素の生成；陰性
(7)デンプンの加水分解；陽性
(8)クェン酸の利用；弱陽性
(9)無機窒素源の利用
1.硝酸塩;陽性
2.アンモニア；陽'性
(10)色素の生成;水溶性色素は産生しない
(11)ゥレアーゼ；陰性
(12)ォキシダーゼ；陽性
(13)カタラーゼ；陽性
(14) β -ガラタトシダーゼ；陰性
(15)生育の範囲
1. ρΗ ;6〜 8
2.温度； 13〜 42°C
(16)酸素に対する態度;好気性
(17) O— Fテスト；酸ィ匕
(18)糖類からの酸生成の有無
1.酸の生成が見られる糖類; D-ァラビノース， L-ァラビノース， D-キシロース，グ ルコース，フルクトース，マンノース，アミグダリン，セロビオース，マルトース，ラタトース ,メリビオース，サリシン，トレハロース，スターチ,グリコーゲン
2.酸の生成が見られない糖類；グリセロール，エリスリトール，リボース， L-キシロ ース,アド-トール， β -メチル- D-キシロシド，ガラクトース，ソルボース，ズルシトール, イノシトール，マン-トール，ソルビトール， α -メチル - D-マンノシド， 0；-メチル-0-グ ルコシド， Ν-ァセチル—ダルコサミン，アルブチン，サリシン，ィヌリン，メレチトース，ラ フィノース，キシリトール， D-ッラノース， D-リキソース， D-タガトース， L-フコース， D- ァラビトール， L-ァラビトール
(19)エスクリンの分解;陽性
(20)アルギニンの分解；陰性
(21)塩ィ匕ナトリウムの耐性; 4%NaCl耐性なし
(22)リジンの脱炭酸反応;陰性
(23)オル-チンの脱炭酸反応;陰性
(D)化学的性質
(1)イソプレノイド'キノン；ュビキノン 8
(2) DNAの G+C含量； 65.4 mol%
(3)菌体脂質
1.リン脂質；主要成分：フォスファチヂルエタノールァミン
副成分： フォスファチヂルグリセロール、
フォスファチデノレコリン、カノレジ才リピン
2.脂肪酸；主成分: C16:l 36%,
C16:0 33%,
C18:l 8%
(E)その他の性質
KY13101株の 16Sリボゾ一マル DNA(16S rDNA)の部分塩基配列（約 1.5kb)を PCR で増幅することにより配列を決定し、既知の細菌の 16S rRNAまたは 16S rDNA配列を 用いて、配列ァライメントプログラム Clustal Wを用いて配列を多重整列し、 Phylip vers ion3.6プログラムを用いて近隣結合法により分子系統解析を行った。その結果、 KY1
3101株はプロテオバクテリア綱ベータ亜綱ォキサロバクタ一グループに属し、 M^ili 属に含まれた。 16S rDNA部分配列を用いた系統解析の結果を図 1に示す。
本細菌株は、グラム陰性好気性の運動性桿菌であり、 16Sリボゾ一マル DNA分子系 統解析の結果、プロテオバクテリア綱ベータ亜綱ォキサロバクタ一グループに属し、 Massilia属に位置した Massilia属の中では Massilia timonaeにもつとも沂縁であった Massilia timonaeは臨床サンプル由来の運動性をもつ好気性桿菌である KY13101 株と Massilia timonae基準株との間の 16S rDNA配列類似度は 96% (1361/1405 bp)で あり、同種とするには低い類似度しか示さなかった。また、 Massilia timonaeは臨床由 来の菌であるが KY13101株は土壌由来である。生息域の違い、 16S rDNA塩基配列 の類似度が低いこと、等力 両者は異なる種に分類されると判断した。
[0076] 以上の結果より、 KY13101株は、プロテオバクテリア綱ベータ亜綱ォキサロバクタ一 グループ Massilia属に属する新種のグラム陰性桿菌 Massilia sp.と同定した。 KY13101 株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター (日本国千葉 県木更津巿かずさ鎌足 2-5-8)に、受託番号 NITE BP-348として 2007年 3月 30日付け で寄託した。
[0077] 化合物 (I)における A、 X1、 X2または Aに含まれる官能基の変換は、公知の方法 [例え ば、コンプリへンシブ 'オーガニック 'トランスフォーメーションズ第 2版（Comprehensive Organic Transformations 2ηα editionノ、 R.し.フロック (Larockノ著、 Vch Verlagsgesel Ischaft Mbh (1999年)等に記載の方法]またはそれに準じた方法により行うこともでき る。
上記各製造法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される 精製法、例えば、濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等 に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次 の反応に供することも可能である。
化合物 (I)の塩を取得した 、とき、化合物 (I)が塩の形で得られる場合にはそのまま精 製すればよぐまた遊離の形で得られる場合には、通常の方法により、すなわち適当 な溶媒に溶解または懸濁し、所望の酸または塩基を添加し塩を形成させ単離精製す ればよい。
また、化合物 (I)およびその薬理学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付 加物の形で存在することもある力 これら付加物も本発明に抱含される。
以下、表 1〜表 4に本発明の TLR9作動薬、免疫促進剤等に用いられる化合物 (I)の 具体例を示すが、本発明の化合物はこれらに限定されることはない。なお各表中の A cはァセチルを表し、 Meはメチルを表す。
[0078] [表 1]
Figure imgf000033_0001
化合物番号 R1 R3 R4 R5
1 OAc OAc OAc OAc
2 OH OH OH OH
3 OAc OMe OMe OMe
4 OH OMe OMe OMe
Figure imgf000034_0001
化合物 R2
Ra
番号 b R3 R4 R5
5 H O-ADP OAc OAc OAc ト CH2OAc
6 H O-ADP OH OH OH «-CH2OH
7 O-ADP H OAc OAc OAc *-CH2OAc
8 O-ADP H OH OH OH •~CH2OH
AcO H
9 H O-ADP OAc OAc OAc
AcO. H
10 O-ADP H OAc OAc OAc
HO H
11 H O-ADP OH OH OH
HO
12 O-ADP H OH OH OH 、 H
> 。H
H Ac
13 H O-ADP OAc OAc OAc
H OAc
14 O-ADP H OAc OAc OAc ^OAc
H OH
15 H O-ADP OH OH OH
H OH
16 O-ADP H OH OH OH ] 表 3
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
25 CH20-ADP OH OH OH — CH2OH
26 CH20-ADP OAc OAc OAc — CH2CH2OAc
27 CH20-ADP OH OH OH — CH2CH2OH
28 CH2-ADP OH OH OH — CH2CH2OH
29 ADP OH OH OH — CH2CH2OH
30 O-meADP OH OH OH — CH2CH2OH
31 O-ADP OAc OAc OAc — CH2CH2CH2OAc 次に、代表的な化合物 (I)の免疫促進活性について、試験例により具体的に説明す る。
試験例 1 : NF- κ Bプロモーター依存的な転写活性の促進効果
NF- κ Bの活性を定量する評価系を構築する目的で、以下のような安定形質転換 細胞株を用いた。細胞に導入した NF- κ Bルシフェラーゼレポータープラスミド pIF-lu c (ノヽイダロマイシン耐性遺伝子発現ユニット含有）は特開 2000-169479に記載の方法 により作成した。該プラスミドをヒト B細胞株 Namalwa (KJM-l株） [「サイトテクノロジー（ Cytotechnology)」、 1988年、第 1卷、 p.151]に導入した後、 0.3 mg/mLのハイグロマイ シン Bを添加して培養することによってノヽィグロマイシン耐性細胞を選択した。該ノヽィ グロマイシン而ォ性細胞の中力も TNF- α (10 ng/mL)刺激によってルシフェラーゼ活 性の増大が確認された細胞株（以下、 BGERKB5細胞という）を以下の試験に用いた
[0083] BGERKB5細胞を利用した、 NF- κ Βの活性促進試験は以下のようにして行うことが できる。ただし、これは一例でありこの方法に限定されるわけではない。
下記の組成を有する RPMI1640. ITPSG培地を用いて、該 BGERKB5細胞を 1 X 106 細胞/ mLの濃度になるように懸濁した (以下、 BGERKB5細胞の懸濁液という）。化合 物は、リン酸バッファー（pH5)に溶解し、 RPMI1640. ITPSG培地で所望の濃度に希釈 することにより、水溶液として調製した。各試験濃度を有する化合物の水溶液（10 L )の入った 96穴プレートに、該 BGERKB5細胞の懸濁液を 90 μ Lずつ添加し、 COイン
2 キュベータ一中、 37°Cで 5時間培養した。
< RPMI1640 · ITPSG培地の組成 >
RPMI1640培地（日水製薬社製）に、該培地に対してそれぞれ下記の濃度または比 率で添カ卩した（以下、該培地を RPMI1640 · ITPSG培地という）。
[0084] 7.5%炭酸水素ナトリウム (インビトロジェン社製）： 1/40容量
200 mmol/L L-グルタミン溶液（ナカライテスタ社製） : 3%
ペニシリン.ストレプトマイシン溶液 (インビトロジェン社製、 5000 units/mLぺ -シリ ン、 δΟΟΟ μ g/mLストレプトマイシン）：0.5%
N- 2-ヒドロキシェチルピペラジン- N' -2-エタンスルホン酸（HEPES、インビトロジェン 社製）： 10 mmol/L
インシュリン（シグマ社製）： 3 μ g/mL
トランスフェリン（シグマ社製）： 5 μ g/mL
ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスタ社製） : 0.55 mg/mL
亜セレン酸 (ナカライテスタ社製）： 17 ng/mL
ガラクトース (ナカライテスタ社製）： 1 mg/mL
該 96穴プレートに、 Steady-Glo (プロメガ社製）を 100 L添加し、各穴におけるルシ フェラーゼ活性値（RLU)を、マルチラベルカウンター ARVO (パーキンエルマ一社製 )を用いて測定した。その結果を図 2および 3に示す。 図 2、 3によれば、例えば化合物 1、 2、 10、 12、 14、 16、 23および 30等で、ルシフェラ ーゼ活性の増大が確認された。つまり、化合物 (I)は NF- κ Βの活性ィ匕を促進し、明ら 力な免疫促進作用を有することが判明した。
[0085] 試験例 2： CD40、 CD80および CD86の発現亢進効果
リンパ球活性ィ匕に重要な副刺激分子である CD40、 CD80および CD86等のフローサ ィトメトリー法は以下のように行うことができる。ただし、これは一例でありこの方法に限 定されるわけではない。
試験例 1に記載の方法に準じて調製した試験化合物の水溶液 10 L (終濃度 50 n mol/L)の入った 96穴プレートに、試験例 1で得られた 1.1 x 106細胞/ mLの濃度を有 する BGERKB5細胞の懸濁液を 90 μ Lずつ添加し、 COインキュベータ一中、 37でで
2
12時間培養した (試験化合物群)。対照試験として、試験化合物を添加しない対照群 も設定した。
以下の操作は 4 °C以下で行った。 1%のゥシ血清アルブミン（フラクション V、シグマ社 製)および 0.05%のアジィ匕ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液 (PBS) 200 Lを用いて、該 細胞を 2回洗浄し、同緩衝溶液 100 /z Lで置換した。該細胞に、フィコエリスリン標識マ ウス抗ヒト CD40モノクローナル抗体溶液（BDバイオサイエンス社製）、フィコエリスリン 標識マウス抗ヒト CD80モノクローナル抗体溶液 (BDバイオサイエンス社製)またはフィ コエリスリン標識マウス抗ヒト CD86モノクローナル抗体溶液 (BDバイオサイエンス社製 )を L添加し、攪拌した後、暗所に 50分間静置した。
[0086] 1%のゥシ血清アルブミン（フラクション V、シグマ社製）および 0.05%のアジ化ナトリウ ムを含むリン酸緩衝溶液 (PBS) 200 μ Lで該細胞を 2回洗浄し、同緩衝液 500 μ Lで置 換した。
フローサイトメーターとして EPICS XL- MCL (ベックマンコールター社製、励起波長 488應アルゴンレーザー）を用いて、細胞数を測定し、陽性細胞率を算出した。測定 用ソフトウェアはシステム 2バージョン 3.0 (ベックマンコールター社製）を用いた。陽性 細胞率の結果を表 5に示す。
[0087] [表 5] ¾ 5
陽性細胞率 (*)
対照 化合物 U
CD40 8.64 93.6
CD80 0.5 45.7
CD86 53.3 78.4 表 5によれば、例えば化合物 16等は CD40、 CD80および CD86のいずれにおいても 陽性細胞率の向上がみられた。つまり、化合物 (I)は CD40、 CD80および CD86の発現 を亢進し、明らかな免疫促進作用を有することが判明した。
[0088] 試,験例 3 : TP- 10 牛謙 効菜
IP-10の酵素標識免疫吸着 (ELISA)法は以下のように行うことができる。ただし、こ れは一例でありこの方法に限定されるわけではない。
試験例 1で得られた 1.1 X 106細胞/ mLの濃度を有する BGERKB5細胞の懸濁液 (3 mL)に、試験化合物を終濃度 50 nmol/Lになるように添カ卩し、 COインキュベータ一中
2
、 37 °Cで 48時間培養した (試験化合物群)。対照試験として、試験化合物を添加しな い対照群も設定した。
BGERKB5細胞が産生した IP-10の量の測定は、ィムノアッセィキット（バイオソース インターナショナル社製)を用いて行った。キットに添付されて 、る標品を用いて検量 線を作成し、培養上清中の IP-10量を測定した。
その結果、 IP-10の産生量は対照群では検出限界以下であつたのに対し、化合物 1 6では 1441 pg/mL、化合物 30では 821 pg/mLであった。
つまり、化合物 (I)は IP-10の産生を誘導し、明らかに免疫促進作用を有することが 判明した。
[0089] 試験例 4: siRNAを用いた TLR9のノックダウンによる免疫促進作用の抑制
BGERKB5細胞を利用した、 siRNAを用いた TLR9のノックダウン試験は以下のように して行うことができる。ただし、これは一例でありこの方法に限定されるわけではない。 試験例 1に記載の方法に準じて得られた 4 X 105細胞/ mLの BGERKB5細胞の懸濁 液 0.5 mLを 24穴プレートの 6穴に播き（細胞総数 1.2 X 106細胞）、 COインキュベータ
2
一中、 37 °Cで 24時間培養した。
TLR9に対する siRNA (アンビオン社製 pre- designed siRNA, ID#6055、 Cat. 16704、 Lot. 047951si)を各穴 100 pmolずつ、リポフエクタミン 2000 (インビトロジェン社製）を用 いて導入した。
[0090] siRNA導入後、 24時間で培地を交換し、さらに 48時間培養した後、得られた細胞を 滅菌チューブに回収した。 RPMI1640 ' ITPSG培地を用いて、該細胞を 1 X 106細胞/ m Lの濃度〖こなるよう〖こ懸濁した (TLR9 kd群）。また、「TLR9 kd群」と同様にして siRNA を含まな!/、「Mock群」を設定した。
該 TLR9 kd群または Mock群の懸濁液 (3 mL)に、試験例 1に記載の方法に準じて 調製した試験化合物の水溶液を、それぞれ添加した (終濃度 50 nmol/L) (試験化合 物群)。また、対照試験として、試験化合物を添加しない溶媒対照群をそれぞれ設定 した。
各群（4群）の細胞懸濁液 3 mLのうち 400 μ Lを 100 μ Lずつ 4連で 96穴プレートにそ れぞれ播種し、 5時間培養した。 Steady— Glo (プロメガ社製）を 100 μ L添加し、各穴 におけるルシフェラーゼ活性値（RLU)を、マルチラベルカウンター ARVO (パーキン エルマ一社製）を用いて測定した。その結果を表 6に示す。表中、 Mockは siRNA非添 加の細胞、 TLR9 kdは TLR9をターゲットとする siRNAを添カ卩した細胞を意味する。
[0091] [表 6] 表 6
ルシフェラーゼ活性値 (RLU)
(平均 fit土標準誤差）
― 溶媒対照 —化合物 1 6 ―
Mock 114,6 ±7.5 7196.7+88.8
TLR9 kd 112.5 ±3.4 4918.3±86.4 表 6によれば、例えばィ匕合物 16等が有する NF- κ B活性能は、 TLR9をノックダウン することにより減弱した。つまり、化合物 (I)が有する NF- κ B活性能は TLR9を介してお り、化合物 (I)が有する免疫促進作用は明らかに TLR9を介していることが判明した。 [0092] 試験例 5： TLR関連遣伝子群につ!ヽての発現変動の確認
また、試験例 4で残った各群の細胞懸濁液 2.6 mLについても、それぞれ 15 mLの滅 菌チューブ中で 5時間培養した後、細胞を回収し、この時の glyceraldehyde-3- phosph ate dehydrogenase (uAPDH)^ mciferase (NF— κ B promoter-derived) (NF- κ B— LUし ), interleukin 12B (IL12B)、 CD80 antigen (CD80)の各遺伝子の発現量を、 SYBR- Gr eenを用いた定量 RT- PCR法 [「バイオテクニックス（BioTechniques)」、 1997年、第 22 卷、 P.130- 131, p.134- 138参照]により測定した。
つまり、上記の試験で残った各群の細胞懸濁液について、それぞれ以下の操作を 行った。
各群の 1 X 106細胞/ mLの細胞懸濁液（2.6 mL:細胞総数 2.6 X 106細胞）を himac C F702遠心機（日立工機社製）を用いて、 4 °Cで 800 rpm、 10分間遠心し、ピペットマン を用いて上清を取り除いた後、 PBS (2 mL)をカ卩えた。得られた細胞懸濁液を、さらに himac CF702遠心機（日立工機社製）を用いて 4 °Cで 800 rpm、 10分間遠心し、ピぺ ットマンを用いて上清を取り除き、細胞を得た。
[0093] 回収した細胞から、 RNeasy Mini Kit (登録商標：キアゲン社製）を用い、キット添付 のマニュアルに従って total RNAを抽出した。得られた total RNAを铸型として、 Super Script First-strand Synthesis System for RT- PC R (インビトロジェン社製）を用い、キ ット添付のマニュアルに従 、、以下のようにして cDNAを合成した。
Total RNA (5 μ g)に、 10 mmol/L dNTPs混合溶液（1.0 μ L)および 0.5 g/ L O ligo(dT) プライマー (1.0 μ L)を添カ卩し、ピロ炭酸ジェチル（DEPC)の水溶液を用
12-18
いて、全量が 10.0 μ Lとなるように希釈した。得られた溶液を 65 °Cで 5分間加熱した 後、氷上で急冷し、 1分間以上静置して変性させた。得られた mRNA溶液に、 10 X RT buffer (2.0 L)、 25 mmol/L塩化マグネシウム（4.0 L)、 0.1 mol/L DTT (2.0 μ L) および RNaseOUT (1.0 μ L)を添加し、全量を 19.0 μ Lとし、 42 °Cで 2分間保温した。 さらに Superscript II Reverse Transcriptase (インビトロジェン社製） 1.0 μ L (50 U)を カロえて、 42 °Cで 50分間の逆転写反応を行い、 70 °Cで 15分間加熱して酵素を失活さ せた。得られた混合物に RNaseH ( 1.0 μ L)を添カ卩して 37 °Cで 20分間反応した後、 T Eバッファー（pH 8.0) (アンビオン社製）を加えて全量を 200 しとした。リアルタイム P CRの反応には、該溶液を 5倍希釈して用いた。
[0094] 上記で調製した cDNA (10.0 μ L: total RNA量として 50 ngに相当）に、下記の配列 からなるフォワードプライマー（FW)およびリバースプライマー（RV)のセット（つまり、 配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 5と 6および配列番号 7と 8のセット：いずれも プロフリゴ社製)をそれぞれ終濃度が 300 nmol/Lになるようにカ卩えた。
逾 1ZS十名： giyceraldenydes- 3- phosphate dehydrogenase ( APDH)
FW: 5，— ACCAGGGCTGCTTTTAACTCT— 3，（配列番号 1)
RV: 5'— TCATGAGTCCTTCCACGATAC— 3' (配列番号 2)
遺 fc 名： luciferase (NF— κ Β promoter― derived) (NF- κ B- LUC)
FW: 5' -CCTATGATTATGTCCGGTTATG-3' (配列番号 3) RV: 5' - GGATCTCTCTGATTTTTCTTGC-3' (配列番号 4)
遺伝子名： interleukin 12B (IL12B)
FW: 5' -ATAAAGCAATTTAGGGCCACTTAC-3' (配列番号 5) RV: 5'— TGACAATTTCATGTCCTTAGCC— 3' (配列番号 6)
遺伝子名： CD80 antigen (CD80)
FW: 5' -TAGAAGGATAATTTGCTCAACCTC-3' (配列番号 7) RV: 5'— GCTACCTTCAGATCTTTTCAGC— 3' (配列番号 8)
さらに、得られた溶液に、 10 X R-PCR buffer Mg2+ free (2.0 μ L:タカラバィォ社製） 、 250 mmol/L Mg2+溶液（0.2 L)、 10 mmol/L dNTPs (0.6 μ L)、 ExTaq— PCR(0.2 L :タカラバィォ社製）、 SYBR Green I (1.0 L : BMA社製、製品原液を 2,500倍希 釈したもの）および滅菌水をカ卩えて、全量を 20.0 μしとした。得られた溶液を 94 °Cで 5 分間加熱した後、 94 °Cで 30秒間、 65 °Cで 30秒間および 72 °Cで 30秒間の組み合わ せからなる反応を 45サイクルで実施した。増幅産物にインター力レートした SYBR Gre en Iが発する蛍光強度を ABI PRISM7700 (PEアプライドバイオシステムズ社製）を用い て測定し、同機器付属のソフトウェア Sequence detector ver.1.7aによりデータ解析を 行った。
[0095] 試験化合物添カ卩時の各遺伝子の mRNA発現量の変動は、試験化合物群のサンプ ルと溶媒対照群のサンプルとの比率で示した。すなわち、 ABI PRISM7700で測定し たシグナル値力 00に達した時のサイクル数をひとし、試験化合物群と溶媒対照群と の Ct値の差（A Ct)を求め、 1サイクルの差を 2倍の差として、下記の計算式を用いて 変動値を「相対的な発現量」として算出した。尚、上記反応によって得られたシグナ ルが目的の増幅断片であるかどうかは、反応終了後の液をァガロースゲル電気泳動 に供し、主な増幅断片のサイズによって判断した。
[0096] [数 1] 各実験区での相対的な発現量 = 2 ct(c)"ctcs)
(1サイクルあたりの増幅率は 2倍として計算）
Ct(C)：溶媒対照群での Ct値
ct(s)：試験化合物群での ct
さらに、 GAPDH (glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase)を内部標準として、 つまり GAPDHを 1として試験化合物群での各遺伝子の mRNA発現量を補正した後、「 溶媒対照群における各遺伝子の mRNA発現量」に対する、「試験化合物群における 各遺伝子の mRNA発現量」の比率を計算した (つまり、「溶媒対照群における各遺伝 子の mRNA発現量」を 1とする)。試験化合物として化合物 16を用いた場合の、計算結 果を表 7に示す。
[0097] [表 7] 表 7
siRNA
¾伝子 Mock TL 9 kd
glyceraldehyde 3 phosphate 1.0 1-0
dehydrogenase (GAPDH)
luciferase (NF-i B promoter- 59.7 25.7
derived) (NF-KB- LUC)
interleukin 12B (IL12B 1.4 0,6
CD80 antigen (CD30) 127 73.0 表 7に示したとおり、 BGERKB5細胞において、 NF- κ B- LUC、 IL12Bおよび CD80の 各遺伝子の発現量が、化合物 16の添カ卩により亢進された。また、化合物 16により亢進 されたこれらの遺伝子の発現量力 TLR9をノックダウンすることにより減弱した。
つまり、化合物 (I)は NF- κ B- LUC、 IL12Bおよび CD80の各遺伝子の発現を亢進し 、この転写亢進は TLR9を介していることが判明した。
免疫促進剤としては OK432 (ピシバニール）、 PSK (クレスチン）、レンチナン等が知 られており、抗腫瘍剤として臨床で用いられている。
[0098] 細菌由来 DNAも免疫促進作用があることが知られている。細菌 DNAに存在する Cp Gジヌクレオチド配列はヒトの CpGジヌクレオチド配列と違ってシトシン塩基の 5位がメ チル化されていない。また、ヒトの DNAでは CpGジヌクレオチド配列の頻度は低い。こ の非メチルイ匕 CpGモチーフが免疫促進作用に重要と考えられて 、る。本モチーフを 含む合成オリゴ DNA (CpG-オリゴデォキシヌクレオチド）は細菌由来 DNAと同様に強 い免疫促進作用を有する。
[0099] ヘルパー T細胞にはサイト力イン産生能の異なる Thl細胞と Th2細胞が存在する。 T hi細胞は細胞性免疫を制御し、細菌 ·ウィルス感染等に関与し強 、細胞障害活性を 示す (Thl免疫)。 Th2細胞は体液性免疫を制御しアレルギー等に関与する（Th2免 疫)。 CpG-オリゴデォキシヌクレオチドは強い Thl免疫を誘導し、抗腫瘍活性ゃ抗細 菌 'ウィルス活性を示し、またアレルギー促進性の Th2免疫を抑制する。これら CpG- オリゴデォキシヌクレオチドの抗腫瘍剤、抗感染症剤および抗アレルギー剤等の医 薬用途が知られており、動物モデルおよび臨床試験で有用性が確認されて 、る [「ネ 一チヤ一 ·レビューズ 'ドラッグ ·テイスカノくリー (Nature Reviews Drug Discovery)」、 2 002年、第 1卷、 p.797 ;「ネーチヤ一'レビューズ 'ィムノロジー（Nature Reviews Immun ology)」、 2004年、第 4卷、 p. l ;
EP0468520； WO96/02555； WO98/18810； W098/37919； WO9/40100； W099/51259 ； W099/56755等」。
[0100] 例えば、子宫頸部がんのマウスモデルにおいて、 CpG-オリゴデォキシヌクレオチド は抗腫瘍効果および延命効果を示した [「タリ-カル 'キャンサー ·リサーチ (Clinical Cancer Research)」、 2003年、第 9卷、 p.2693]。また、横紋筋肉腫のマウスモデルに おいて、外科的切除およびィ匕学療法 (シクロフォスフアミドまたはトポテカン）による延 命率を CpG-オリゴデォキシヌクレオチドは併用により上昇させた [「タリ-カル 'キャン サ^ ~ ·リサーチ（Clinical Cancer Research)」、 2003年、第 9卷、 p.3105]。 例えば、リーシュマニア症のマウスモデルにお!、て CpG-オリゴデォキシヌクレオチ ドは有効であった [「ザ'ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー（The Journal of Immunology)」 、 1998年、第 160卷、 p.3627 ;「プロシーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデミ一' ォブ ·サイェンシズ ·ォブ ·ザ ·ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ ·アメリカ（Proceedings of th e National Academy of sciences of the United States of America;」、 1999年、弟 9o卷 、 p.6970] o
[0101] 例えば、 OVA感作マウス慢性喘息モデルにお!、て CpG-オリゴデォキシヌクレオチ ドは、気道炎症、気道過敏性および気道リモデリングを抑制した [「ジャーナル'ォブ · ァレノレギ一'アンド 'タリ-力ノレ'ィムノロジー (Journal of Allergy & Clinical Immunology )」、 2002年、第 110卷、 p.867]。また、ハウスダストダニアレルゲンで感作したァカゲサ ルの喘息モデルにぉ 、て、 CpG-オリゴデォキシヌクレオチドは気道過敏性および気 道リモデリングを抑制した [「アメリカン'ジャーナル ·ォブ ·レスピレイトリー 'アンド 'タリ アイ力ノレ 'ケ 'メアインン (American Journal of Respiratory ana Critical Care Medici ne)」、 2004年、第 1ァ0卷、 ρ.1153] 0
例えば、臨床試験にお ヽて CpG-オリゴデォキシヌクレオチドはタキサンおよび白金 製剤との併用で非小細胞肺がんに対して有効であった [「アメリカン'ソサイエティ一' ォブ ·タリ-カル ·オンコロジ一（American Society of Clinical Oncology : ASCO)」、 200 5年、ァ-ュアル'ミーティング (Annual Meeting)、アブストラクト、 #7039] 0また、臨床 試験においてブタクサ花粉抗原と CpG—オリゴデォキシヌクレオチドのコンジュゲート は Thl免疫を増強し Th2免疫を抑えアレルギー性鼻炎の症状を改善した [「ジャーナ ル 'ォブ 'アレルギ^ ~ ·アンド 'タリ-カル'ィムノロジー（Journal of Allergy & Clinical Im munology)」、 2004年、第 113卷、 p.235]。
[0102] CpG-オリゴデォキシヌクレオチドは Toll様受容体の一つである Toll様受容体 9 (TLR 9)に認識されることが明ら力となっている [「ネーチヤ一（Nature)」、 2000年、第 408卷 、 p.740] o TLR9は B細胞ゃ榭状細胞等に存在している。 TLR9は MyD88等のアダプタ 一分子を介して細胞内にシグナルを伝達し、サイト力イン遺伝子発現を制御する NF- κ B等の転写因子群を活性ィ匕し、サイト力インの産生を惹起する。また、リンパ球活性 化に重要な副刺激分子である CD40、 CD80や CD86等の表面分子の発現を亢進させ る。
ケモカイン IP-10 (interferon -gamma mduciole protein 10 kDa) (し Xし L10) ί^、ラ S力 な血管新生阻害作用を有し抗腫瘍活性を示すことが知られて ヽる (「ブラッド (Blood) 」、 1997年、第 89卷、 p.2635 ;「ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンタル'メディシン（Journ al of Experimental Medicine)」、 1996年、第 184卷、 p.981；「ロイケミア ·リンフォーマ（L eukemia Lymphoma)」、 1995年、第 19卷、 p.267 ;「ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンタ ル'メディシン（Journal of Experimental Medicine)」、 1993年、第 178卷、 ρ.1057)。また 、 IP-10はナチュラルキラー細胞活性ィ匕能や T細胞遊走性を有する。
[0103] これらの事実と上記の試験例 1〜5の結果から、 TLR9の作動活性および Zまたは免 疫促進活性を有する化合物 (I)は、 TLR9作動薬、免疫促進剤、抗アレルギー剤、抗 腫瘍剤、抗感染症剤等として有用であると考えられる。
[0104] 化合物 (I)またはその薬理学的に許容される塩は、その薬理作用およびその投与目 的に応じ、そのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。本発明の製薬 組成物は、活性成分として有効な量の化合物 (I)またはその薬理学的に許容される塩 を薬理学的に許容される担体と均一に混合して製造できる。この担体は投与に対し て望ましい製剤の形態に応じて、広い範囲の形態をとることができる。これらの製薬 組成物は、経口的または軟膏、注射等の非経口的投与に対して適する単位服用形 態にあることが望ましい。
錠剤の調製にあたっては、例えば乳糖、グルコース、ショ糖、マンニット、メチルセル ロース等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース力 ルシゥム、結晶セルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤 、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロー ス、メチルセルロース等の結合剤、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビット脂肪酸エステル 等の界面活性剤等を常法に従って用いればよい。錠剤 1個あたり 1〜300 mgの活性 成分を含有する錠剤が好適である。
[0105] 顆粒剤の調製にあたっては、例えば乳糖、ショ糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、 ゼラチン等の結合剤等を常法により用いればよい。粉剤の調製にあたっては、例え ば乳糖、マンニット等の賦形剤等を常法に従って用いればよい。カプセル剤の調製 にあたっては、例えばゼラチン、水、ショ糖、アラビアゴム、ソルビット、グリセリン、結 晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク等を常法により用いればよい。カプ セル 1個あたり 1〜300 mgの活性成分を含有するカプセルが好適である。
シロップ剤の調製にあたっては、例えばショ糖等の糖、水、エタノール等を常法によ り用いればよい。
軟膏の調製にあたっては、例えばワセリン、液体パラフィン、ラノリン、マクロゴール 等の軟膏基剤、ラウリル乳酸ナトリウム、塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、ソルビタンモノ脂肪 酸エステル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム等の乳化剤等を常 法により用いればよい。
注射剤の調製にあたっては、水、生理食塩水、植物油（例えばォリーブ油、落花生 油等）、ォレイン酸ェチル、プロピレングリコール等の溶剤、安息香酸ナトリウム、サリ チル酸ナトリウム、ウレタン等の可溶化剤、食塩、グルコース等の等張化剤、フエノー ル、クレゾール、 p-ヒドロキシ安息香酸エステル、クロロブタノール等の保存剤、ァスコ ルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤等を常法により用いればよい。
化合物 (I)またはその薬理学的に許容される塩は、経口的方法、吸引的方法または 軟膏、注射剤等の非経口的方法で投与可能である。その有効用量および投与回数 は投与形態、患者の年齢、体重、症状等により異なるが、投与量は通常一日当たり、 0.0001〜20 mg/kgを 1〜4回投与するのが好まし!/、。
以下、本発明を実施例および参考例によりさらに具体的に説明する力 本発明の 範囲はこれらの実施例に限定されることはない。なお、実施例および参考例で用いら れるプロトン核磁気共鳴スペクトル（1H- NMR)は、 300MHz、 400MHzまたは 500MHz で測定されたものであり、化合物および測定条件によって交換性プロトンが明瞭には 観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるも のを用いる力 brとは見かけ上幅広!/、シグナルであることを表す。
後述の実施例および参考例で用いた合成中間体の構造を表 8-1〜表 8-4に示す。 なお各表中の Meはメチルを表し、 Acはァセチルを表し、 Bnはベンジルを表し、 Phは フエニルを表す。 [0107] [表 8-1] 表 8— 1
Figure imgf000048_0001
R2 化合物番号 Rc Rd
A H OH •~CH2OAc
B H 0-PO(OH)2 •-CH2OAc
C 0-PO(OPh)2 H CH2OAc
D 0-PO(OH)2 H •~CH2OAc
AcO 、H
E H OH X^OAc
AcO
Fa H 0-PO(OPh)2 、、H
X^OAc
AcO、、H
Fb 0-PO(OPh)2 H
Figure imgf000048_0002
c
Gb 0-PO(OH)2 H AcO A
H OAc
H H OH
Figure imgf000048_0003
[0108] [表 8- 2] 表 8
化合物
番号
Figure imgf000049_0001
R3,R4,R5
H OAc
0-PO(OH)2 OAc ^OAc
H OAc
Jb 0-PO(OH)2 H OAc , ^OAc K H OH OMe »-CH2OMe
M H OMe OH «-CH2OC(Ph)3
N H OMe OBn »-CH2CH,OH
O H OH OAc *-CH2CH,0Ac
P 0-PO(OH)2 H OAc «-CH2CH,0Ac
Q H OMe OMe CH2CH2OH - 3]
Figure imgf000049_0002
0-POfOH)2 •-CH OMe
R O-PO(OH); CH,CH20Ac [0110] [表 8-4]
Figure imgf000050_0001
化合物 R2
Rd
番号 R3,R4,R5
S CH2OH H OBn •^OBn
T CH2OH H OBn
U OH H OAc 一 OAc
[0111] 参考例 1〜20および 34〜36に、化合物 (I)の合成に用いた中間体の合成法を示す。
参考例 1： 2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- a マンノピラノース（化合物 A)の合成
[工程 1]
D-マンノース（5.0 g, 28 mmol)の無水酢酸溶液（24 mL)にトリメチルシリルクロリド（0 .80 mL, 7.0 mmol)を加え、 80 °Cで 2時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =2/1)で精製し、ペンタ- 0-ァセチ ル体 (5.5 g,収率 51%)を得た。
FAB-MS m/z: 391 (M+H)+.
[工程 2]
工程 1で得られたペンタ- 0-ァセチル体（5.5 g, 14 mmol)の DMF溶液（50 mL)にヒ ドラジン酢酸塩 (2.0 g, 22 mmol)を加え、室温で 1時間攪拌した。反応混合物に水を 加え、酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで 乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢 酸ェチル =2/1)で精製し、化合物 A (3.5 g,収率 36%)を得た。
FAB-MS m/z: 349 (M+H)+.
参考例 2： 2.3.4.6-テトラ- 0-ァセチル- a -D-マンノビラノシルホスフアート（化合物 B) m
Figure imgf000051_0001
つ止縱ェ ¾翻 i
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8M8S0/.00Zdf/X3d 1-9 動 0Ζ OAV 参考例 9： 2,3,4,6,7-ペンタ- 0-ァセチル- D-グリセ口- a -D-マンノヘプトピラノース（ ィ 合物 Η)の合成
[工程 1]
D-グリセ口- D-マンノヘプトピラノース（0.1 g, 0.47 mmol)の無水酢酸溶液（0.44 mL , 0.27 mmol)より、トリェチルシラン（0.016 mL, 0.12 mmol)を用い、参考例 1の工程 1と 同様にして、へキサ- 0-ァセチル体（0.17 g,収率 78%)を得た。
FAB-MS m/z 461 (M- H)— .
[工程 2]
工程 1で得られたへキサ- 0-ァセチル体（0.17 g, 0.38 mmol)より、ヒドラジン酢酸塩 (0.22 g, 2.4 mmol)を用い、参考例 1の工程 2と同様にして、化合物 H (0.086 g,収率 5
4%)を得た。
FAB-MS m/z 421 (M+H)+.
参者例 10 :ジフエ-ル (2.3.4.6.7-ペンタ- 0-ァセチル- D-グリセロー a - D-マンノヘプ トビラノシル）ホスファート（化合物 la)およびジフ ニル (2.3.4.6.7-ペンタ- 0-ァセチル - D-グリセ口- β -D-マンノヘプトビラノシル)ホスファート（化合物 lb)の合成
ィ匕合物 H (0.42 g, 1.0 mmol)より、 DMAP (0.22 g, 1.5 mmol)およびクロ口リン酸ジフ ヱ-ル（0.31 mL, 1.5 mmol)を用い、参考例 3と同様にして、化合物 la (0.15 g, 23%)、 化合物 lb (0.12 g, 18%)および化合物 laと化合物 ¾の混合物（0.30 g, 46%)を得た。 化合物 la :
1H-NMR (500 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.39-7.30 (m, 4H), 7.26-7.18 (m, 6H), 5.85 (d
3
d, J = 6.5, 2.1 Hz, IH), 5.38 (dd, J = 9.1, 3.2 Hz, IH), 5.35 (dd, J = 9.7, 9.1 Hz, 1 H), 5.29 (dd, J = 3.2, 2.1 Hz, IH), 5.15 (ddd, J = 7.6, 3.8, 2.5 Hz, IH), 4.37 (dd, J = 12.0, 3.8 Hz, IH), 4.24 (dd, J = 9.7, 2.5 Hz, IH), 4.22 (dd, J = 12.0, 7.6 Hz, IH), 2.14 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.83 (s, 3H).
31P-NMR (202.5 MHz, CDC1 ) δ (ppm):—13.49 (br s).
3
FAB-MS m/z 653 (M+H)+.
化合物 lb :
JH-NMR (500 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.47-7.30 (m, 4H), 7.28-7.26 (m, 2H), 7.23-7. 17 (m, 4H), 5.56 (dd, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 5.44 (dd, J = 3.3, 1.7 Hz, 1H), 5.36 (m, 1H), 5.25 (dd, J = 8.6, 8.4 Hz, 1H), 5.07 (dd, J = 8.6, 3.3 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 12. 2, 3.3 Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 12.2, 6.5 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 8.6, 4.6 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.99 (s, 3H).
31P-NMR (202.5 MHz, CDC1 ) δ (ppm): -13.27 (br s).
3
FAB-MS m/z 653 (M+H)+.
[0116] 参考例 11 : 2, 3,4,6,7-ペンタ- O-ァセチル- D-グリセ口- a - D-マンノヘプトピラノシル ホスファート (化合物 Ta)の合成
化合物 Ia (0.21 g, 0.32 mmol)のエタノール溶液（2.0 mL)に酸化白金（0.10 g)をカロ え、水素雰囲気下、室温で 5日攪拌した。反応混合物から触媒を濾別し、濾液を濃縮 しィ匕合物 Ja (0.011 g,収率 45%)を得た。
FAB-MS m/z 499 (M- H)— .
参者例 12 : 2.3.4.6.7-ペンタ- 0-ァセチル- D-グリセ口- β -D-マンノヘプトピラノシル ホスファート (化合物 Tb)の合成
化合物 lb (0.21 g, 0.32 mmol)のエタノール溶液（1.0 mL)に酸化白金（0.100 g)を 加え、水素雰囲気下、室温で 5日間攪拌した。反応混合物から触媒を濾別し、濾液を 濃縮し、化合物 Jb (0.037 g,収率 73%)を得た。
FAB-MS m/z 499 (M- H)— .
[0117] 参者例 13： 2.3.4.6-テトラ- 0-メチル- a マンノピラノース（化合物 K)の合成
[工程 1]
D-マンノース（1.8 g, 10 mmol)を DMSOと水の混合溶媒（20/1 , 10 mL)に溶解し、 得られた溶液に水酸化ナトリウム（4.0 g, 100 mmol)およびヨウ化メチル（3.0 mL, 46 mmol)を室温で 1日に 1度、合計 3回加え、 3日間攪拌した。反応混合物を氷水に注ぎ いれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を希塩酸および飽和食塩水順次洗浄し、硫 酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ へキサン/酢酸ェチル = 3/1)で精製し、ペンタ- 0-メチル体（1.3 g,収率 52%)をァノ マー立体異性体の混合物（ひ / j8 = 2.5/1)として得た。
FAB-MS m/z: 273 (M+Na)+. [工程 2]
工程 1で得られたペンタ- O-メチル体（1.3 g, 5.2 mmol)の無水酢酸溶液（20 mL)に 濃硫酸 (0.050 mL)を 0 °Cで加え、同温度で 5時間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮し、粗ァセチル体（1.0 g)を得た。 FAB-MS m/z: 301 (M+Na)+.
[工程 3]
工程 2で得られた粗ァセチル体（1.0 g, 4.0 mmol)をメタノール、 30%アンモニア水お よび水の混合溶液 (3/1/1, 20 mL)に溶解し、 30分間攪拌した。反応混合物を氷水 に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液および 飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮し、化合物 K (0.88 g,収率 72%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 5.33 (br s, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.65—3.49 (m, 1
3
3H), 3.39 (s, 3H), 3.38 (m, 1H).
FAB-MS m/z: 259 (M+Na)+.
参者例 14 : 2.3.4.6-テトラ- O-メチル -D-マンノビラノシルジホスフアート（化合物し）の [工程 1]
化合物 K (0.033 g, 0.25 mmol)のジクロロメタン溶液（10 mL)に DMAP(0.033 g, 0.3 0 mmol)をカロえ、さら〖こクロ口リン酸ジフエ二ノレ（0.060 mL, 0.30 mmol)のジクロロメタン 溶液 (7.0 mL)を室温で 1時間かけて滴下し、同温度で 1時間攪拌した。反応混合物 に水を加え、酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸 ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮し、粗リン酸エステル体 (0.040 g,収率 60%)をァノ マー立体異性体の混合物（ α / 18 = 1/1)として得た。
[工程 2]
工程 1で得られた粗リン酸エステル体（0.040 g, 0.015 mmol)を酢酸ェチルとメタノー ルの混合溶媒（1/1, 5.0 mL)に溶解し、酸化白金 (0.040 g)を加え、水素雰囲気下、 室温で 1日間攪拌した。反応混合物から触媒を濾別し、濾液を濃縮し、化合物 L (0.0 ^^ ^^-Υ\^. (louiui OS 'S 32)：# べ>^—〇—(14 ^ ¾ 1¾ェ
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[6πο]
•_(H- ) SIS ζ/ω
8M8S0/.00Zdf/X3d 99 動 OAV の混合溶媒（1/1, 200 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルォロ酢酸 (20 mL)をカ卩え、室温 で 12時間攪拌した。反応混合物に炭酸カリウムを加え、析出した塩を濾別し、濾液を 濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =4/1)で 精製し、 6-ヒドロキシ体（15.2 g,収率 71%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.38-7.29 (m, 15H), 4.95(d, J = 11.1 Hz, IH),
3
4.79 (d, J = 11.8 Hz, IH), 4.70 (d, J = 1.8 Hz, IH), 4.69 (d, J = 11.8 Hz, IH), 4.66 (d, J = 11.1 Hz, IH), 4.64 (s, 2H), 4.09—3.75 (m, 5H), 3.65 (m, IH), 3.31 (s, 3H) .
FAB-MS m/z 463 (M- H)— .
[工程 3]
塩化ォキサリル（45 mL, 520 mmol)の THF溶液（135 mL)にジメチルスルフイド（41 mL, 540 mmol)の THF溶液（86 mL)を- 78 °Cで加え、同温度で 1時間攪拌した。 -78 °Cで、工程 2で得られた 6-ヒドロキシ体（120 g, 260 mmol)の THF (120 mL)溶液をゆ つくり滴下し、同温度で 1時間攪拌した。反応混合物にトリェチルァミン（150 mL, 1.1 mol)を加え、室温まで昇温し、セライトを通して濾過した。濾液を減圧濃縮し、粗アル デヒド体を得た。
[工程 4]
臭化メチルトリフエ-ルホスホ -ゥム（570 g, 1.6 mol)を THF (1.5 L)に懸濁し、氷冷 下、ブチルリチウム（12 mL, 2.6 mol/Lへキサン溶液）を滴下し、同温度で 30分間攪 拌した。反応混合物に、工程 3で得られた粗アルデヒド体の THF懸濁液 (500 mL)を 注ぎいれ、室温で 1時間攪拌した。反応混合物に水を加え、ジェチルエーテルで抽 出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および水で順次洗浄し、硫酸ナトリ ゥムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサ ン /酢酸ェチル =9/1)で精製し、ビュル体 (48 g,収率 39%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.52-7.27 (m, 15H), 6.04 (ddd, J = 17.2, 10.5,
3
6.6 Hz, IH), 5.47 (ddd, J = 17.2, 1.7, 1.2 Hz, IH), 5.29 (ddd, J = 10.5, 1.7, 1.0 Hz, IH), 4.85 (d, J = 10.8 Hz, IH), 4.79 (d, J = 12.5 Hz, IH), 4.74 (d, J = 1.9 Hz, IH), 4.72 (d, J = 12.5 Hz, IH), 4.69—4.62 (m, 3H), 4.04 (m, IH), 3.89 (dd, J = 9.4, 3.1
Hz, IH), 3.80 (dd, J = 3.1, 1.9 Hz, IH), 3.76 (t, J = 9.1 Hz, IH), 3.32 (s, 3H). FAB-MS m/z 459 (M- H)— .
[工程 5]
工程 4で得られたビュル体（3.4 g, 7.4 mmol)の THF溶液（100 mL)にボラン- THF錯 体の THF溶液（11 mL, 1.0 mol/L)を- 20 °Cで滴下した後、 0 °Cまで昇温し、同温度 で 1時間攪拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (11 mL)および過酸 化水素水（1.1 mL, 30%)を加え、室温で 2.5時間攪拌した後、水を加え、酢酸ェチル で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮 した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =2/1)で精製 し、化合物 N (2.3 g,収率 66%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.38-7.67 (m, 15H), 4.96 (d, J = 10.9 Hz, 1H),
3
4.78 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.87-3.74 (m, 6H), 3.31 (s, 3H), 2.12 (m, 1H), 1 .85 (m, 1H).
FAB-MS m/z: 501 (M+Na)+, 447 (M— MeO)+.
参者例 17 : 2.3.4.7-テトラ- O-ァセチル- 6-デヒドロ- D-マンノヘプトピラノース（化合物 0)の合成
[工程 1]
化合物 N (0.84 g, 1.8 mmol)の無水酢酸溶液（20 mL)に 0 °Cで硫酸（20 mL)を滴下 し、同温度で 30分間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ いれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥 した後、減圧濃縮した。残渣 (0.85 g)を酢酸ェチル (20 mL)に溶解し、 10%パラジウム 炭素 (0.2 g)を加え、水素雰囲気下、室温で 1日攪拌した。反応混合物から触媒を濾 別し、濾液を濃縮し、粗 2,3,4-トリオール体 (0.88 g)を得た。
FAB-MS m/z: 277 (M— H)— .
[工程 2]
工程 1で得られた粗 2,3,4-トリオール体（0.88 g)のピリジン溶液（6.0 mL)に無水酢 酸 (5.0 mL)を滴下し、 0 °Cで 1時間攪拌した後、濃縮した。残渣を DMF(10 mL)に溶 解し、ヒドラジン酢酸塩 (0.19 g, 2.0 mmol)を加え、室温で 2時間反応した。反応混合 物を冷水に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸 ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へ キサン/酢酸ェチル =2/1)で精製し、化合物 0 (0.24 g,収率 38%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 5.38 (dd, J = 10.1, 3.5 Hz, IH), 5.27 (dd, J = 3
3
.5, 1.7 Hz, IH), 5.15-5.08 (m, 2H), 4.31—4.03 (m, 3H), 2.47 (s, 3H), 2.06 (s, 6H), 1 .99 (s, 3H), 1.89-1.75 (m, 2H).
FAB-MS m/z: 385 (M+Na)+.
参考例 18： 2, 3,4,7-テトラ- O-ァセチル- 6-デォキシ- D-マンノヘプトビラノシルホスフ アート (化合物 P)の合成
[工程 1]
ィ匕合物 0 (0.24 g, 0.74 mmol)より、 DMAP(0.16 g, 1.3 mmol)およびクロ口リン酸ジフ ェ-ル（0.23 mL, 1.1 mmol)を用い、参考例 3と同様にして、りん酸エステル（0.054 g, 収率 22%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.32-7.04 (m, 10H), 5.51 (d, J = 6.2 Hz, IH),
3
5.41 (br s, IH), 5.07 (dd, J = 10.6, 9.6 Hz, IH), 4.99 (dd, J = 9.6, 2.9 Hz, IH), 4.09 -4.02 (m, J = 12.3, 5.5 Hz, 2H), 3.60 (m, IH), 2.10 (s, 3H), 2.01 (s, 6H), 1.97 (s, 3 H), 1.84-1.78 (m, 2H).
FAB-MS m/z 617 (M+Na)+.
[工程 2]
工程 1で得られたりん酸エステル（0.054 g, 0.091 mmol)より、酸化白金（0.020 g)用 い、参考例 4と同様にして、化合物 P(0.035 g,収率 88%)を得た。
FAB-MS m/z 441 (M- H)— .
参考例 19： 1,2,3,4-テトラ- 0-メチル -6-デォキシ- D-マンノヘプトピラノース（化合物 Q
)の合成
[工程 1]
化合物 M (3.9 g, 8.9 mmol)を DMSOと水の混合溶媒（20/1, 10 mL)に溶解し、水酸 化ナトリウム（7.2 g, 180 mmol)およびヨウ化メチル（3.0 mL, 46 mmol)をカ卩え、室温で 30分間攪拌した。反応混合物を氷水に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を (%fz^ 's zz'o)^ ^、ェっ 翁^； s¾io)9ii^ 拳 (%οε τ)
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1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 4.73 (d, J = 1.7 Hz, IH), 3.81 (t, J = 5.8 Hz, 1
3
H), 3.63 (dd, J = 9.4, 6.8 Hz, IH), 3.57 (dd, J = 3.4, 1.7 Hz, IH), 3.54 (s, 3H), 3.50 (s, 3H), 3.48 (s, 3H), 3.47 (dd, J = 6.8, 3.4 Hz, IH), 3.37 (s, 3H), 3.24 (dd, J = 9.4 , 9.3 Hz, IH), 2.10 (m, IH), 1.81 (m, IH).
FAB-MS m/z 251 (M+H)+.
参考例 20： 2,3,4-トリ- O-メチル -6-デォキシ- D-マンノヘプトピラノースホスファート（ ィ R)の )^
[工程 1]
化合物 Q (0.22 g, 0.88 mmol)の無水酢酸溶液（4.0 mL)に 0 °Cで硫酸（0.020 mL) を滴下し、室温で 3.5時間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に 注ぎいれ、酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウ ムで乾燥した後、減圧濃縮し、粗ジァセチル体 (0.10 g)を得た。
FAB-MS m/z 343 (M+Na)+.
[工程 2]
工程 1で得られた粗ジァセチル体（1.5 g, 14 mmol)より、ヒドラジン酢酸塩（0.10 g, 1 .1 mmol)を用い、参考例 1の工程 2と同様にして、 1-ヒドロキシ体（0.039 g,収率 16%) を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 5.24 (br s, IH), 4.25 (m, IH), 4.17 (m, IH), 3.
3
72 (td, J= 9.9, 2.4 Hz, IH), 3.60 (dd, J= 3.3, 1.7 Hz, IH), 3.539 (s, 3H), 3.535 (m , IH), 3.49 (s, 6H), 3.18 (dd, J = 9.9, 9.3 Hz, IH), 2.15 (m, IH), 2.04 (s, 3H), 1.78 ( m, IH).
FAB-MS m/z 301 (M+Na)+.
[工程 3]
工程 2で得られた 1-ヒドロキシ体（0.039 g, 0.14 mmol)のジクロロメタン溶液（1.0 mL )に DMAP(0.021 g, 0.17 mmol)をカロえ、さらにクロ口リン酸ジフエ-ノレ（0.35 mL, 0.17 mmol)のジクロロメタン溶液（1.0 mL)を室温で 1時間かけて滴下し、同温度で 1時間 攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で •ΐ '(Η9 'ΖΗ VL = f SIT '(Ηΐ '^Η 6'S 'β'ΖΪ = f 'ΡΡ) 89Τ '(ΗΖ 'ω) '(Η ΐ 'ΖΗ ε·ε 's'6 = f 'ΡΡ) 98·ε '(ΗΪ 'ω) οο^ '{ηζ sr 6ΐ· '(HI -f '(HI 'Z
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8M8S0/.00Zdf/X3d 39 動 OAV ヘプトビラノシル)ジホスフアート (化合物 9)の合成
化合物 Ga (0.11 g, 0.23 mmol)およびアデノシン =5，-ホスホモルホリデートの 4，-モ ルホリン- Ν,Ν' -ジシクロへキシルカルボキサミジ-ゥム塩（0.16 g, 0.23 mmol)より、参 考例 21と同様にして、化合物 9のアンモ-ゥム塩（0.083 g, 41%)を得た。
FAB-MS m/z 828 (M- H)— .
参考例 26：アデノシン =5 ' -(2,3,4,6,7-ペンタ- 0-ァセチル- L-グリセ口- β - D-マンノ ヘプトビラノシル)ジホスフアート（化合物 10)の合成
化合物 Gb (0.046 g, 0.10 mmol)およびアデノシン =5，-ホスホモルホリデートの 4，-モ ルホリン- Ν,Ν，-ジシクロへキシルカルボキサミジ-ゥム塩（0.070 g, 0.10 mmol)より、 参考例 21と同様にして、化合物 10のアンモ-ゥム塩（0.012 g, 15%)を得た。
FAB-MS m/z 828 (M- H)— .
参者例 27：アデノシン =5 ' -(L-グリセ口- a -D-マンノビラノシル)ジホスフアート（化合物
11)の合成
参考例 25で得られた化合物 9のアンモ-ゥム塩（0.083 g, 0.023 mmol)より、参考例 22と同様にして、化合物 11 (0.017 g, 21%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, D Ο) δ (ppm): 8.46 (s, IH), 8.21 (s, IH), 6.09 (d, J = 5.9 Hz, 1
2
H), 5.44 (dd, J = 7.5 Hz, IH), 4.75 (m, IH), 4.47 (dd, J = 5.0, 3.7 Hz, IH), 4.34 (m, IH), 4.18-4.15 (m, 2H), 3.96—3.91 (m, 2H), 3.87-3.78(m, 3H), 3.67 (dd, J = 11.4, 6.1 Hz, IH), 3.58 (dd, J = 11.4, 7.1 Hz, IH).
FAB-MS m/z 618 (M- H)— .
参考例 28：アデノシン =5 ' -(L-グリセ口- β -D-マンノビラノシル)ジホスフアート（化合物
12)の合成
参考例 26で得られた化合物 10のアンモ-ゥム塩（0.0080 g, 0.0093 mmol)をメタノー ル、重炭酸トリェチルアンモ -ゥムバッファー液（pH = 8.0, 0.1 mol/L)およびトリェチ ルァミンの混合液（14/13/1 , 7.2 mL)に溶解し、 -30 °Cで 2週間攪拌した。反応混合 物を水で希釈し Dowex 50(H+ form)をカ卩え、 pHを約 4.0に調整した。レジンを濾別し、 濾液を高速液体クロマトグラフィー [カラム； Develosil RPAQURUS (野村化学株式会 社）、直径; 4.6 mmx25 cm、検出波長； 260nm、流出溶媒； 0.5%酢酸水溶液（1.0 mL/ » - ^f -Q)- ' s=ベ ^ ： \ZWW [62 TO]
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•S '(Ηΐ 'ΖΗ Ζ·8 = f 'Ρ) SV '(Ηΐ '^Η ΐ·ΐ = f 'Ρ) SS"S '(Ηΐ '^Η 9·8 = f 'Ρ) 6Γ3 '(Η ΐ 'ΖΗ Γ3 = f 'Ρ) ΖΓ9 '(Ηΐ 's) 9ε·8 '(Ηΐ 's) ε9·8： (radd) 9 (〇 '^Η 003) Η Ν-ΗΤ
8M8S0/.00Zdf/X3d 99 動 0Z OAV の合成
[工程 1]
メチル -D-マンノピラノース（5.0 g, 26 mmol)のジォキサン溶液（15 mL)に、 80でに て水酸ィ匕カリウム (25 g, 450 mmol)の粉末を少しずつ加え、同温度で 1時間攪拌した 。反応混合物に臭化べンジル（16 mL, 130 mmol)を 40分かけて滴下した後、 3時間 還流した。反応混合物を氷水に注ぎいれ、ジェチルエーテルで抽出した。有機層を 飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =6/1)で精製し、テトラ- 0-ベンジ ル体（7.0 g,収率 49%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.38-7.26 (m, 18H), 7.19-7.16 (m, 2H), 4.89 (
3
d, J = 10.8 Hz, IH), 4.76 (d, J = 13.7 Hz, IH), 7.86 (d, J = 12.0 Hz, IH), 4.68 (d, J = 13.7 Hz, IH), 4.62 (s, 2H), 4.56 (d, J = 12.0 Hz, IH), 4.51 (d, J = 10.8 Hz, IH), 3.99 (dd, J = 9.9, 9.2 Hz, IH), 3.89 (dd, J = 9.2, 3.0 Hz, IH), 3.79 (dd, J = 3.0, 1.8 Hz, IH), 3.76-3.71 (m, 4H), 3.33 (s, 3H).
FAB-MS m/z: 555 (M+H)+.
[工程 2]
工程 1で得られたテトラ- O-ベンジル体（10 g, 18 mmol)の無水酢酸溶液（10 mL)に 濃硫酸 (0.020 mL)を 0 °Cで加え、同温度で 15分攪拌した。反応混合物を飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマト グラフィー（へキサン/酢酸ェチル = 1/1)で精製し、 1-0-ァセチル体（6.9 g,収率 63% )を得た。
JH-NMR (500 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.40 (m, IH), 7.38-7.22 (m, 17H), 7.19-7.16
3
(m, 2H), 6.21 (d, J = 2.0 Hz, IH), 4.89 (d, J = 10.7 Hz, IH), 4.78 (d, J = 12.2 Hz, IH), 4.72 (d, J = 12.2 Hz, IH), 4.65 (d, J = 12.1 Hz, IH), 4.60 (d, J = 12.0 Hz, IH),
4.56 (d, J = 12.0 Hz, IH), 4.55 (d, J = 10.7 Hz, IH), 4.53 (d, J = 12.1 Hz, IH), 4.0 7 (dd, J = 9.9, 9.6 Hz, IH), 3.88—3.82 (m, 2H), 3.78 (dd, J = 11.0, 4.7 Hz, IH), 3.7 4 (dd, J = 3.0, 2.0 Hz, IH), 3.71 (dd, J = 11.0, 1.8 Hz, IH), 2.02 (s, 3H). FAB-MS m/z: 605 (M+Na) .
[工程 3]
工程 2で得られた 1-0-ァセチル体（580 mg, 1.0 mmol)のジクロロメタン溶液（10 mL )に、ヨウ化トリメチルシリル（0.14 mL, 1.1 mmol)を 0 °Cで加え、同温度で 40分攪拌し た後、溶媒を減圧留去し、さら〖こ、トルエン（1.0 mL)を加え、再び溶媒を減圧留去し た。残渣を THF (10 mL)に溶解し、シァノテトラブチルアンモ -ゥム (0.54 g, 2.0 mmol) の THF溶液（1.0 mL)を加えて、室温で 2時間攪拌した。その後、得られた反応液に 氷水に注ぎいれ、ジェチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫 酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ へキサン/酢酸ェチル =3/1)で精製し、シァノ体 (0.30 g,収率 65%)を得た。
JH-NMR (500 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.52-7.45 (m, 2H), 7.37-7.29 (m, 16H), 7.18—
3
7.15 (m, 2H), 4.98 (d, J = 11.4 Hz, IH), 4.92 (d, J = 11.4 Hz, IH), 4.84 (d, J = 10.6 Hz, IH), 4.66 (s, 2H), 4.61 (d, J = 12.0 Hz, IH), 4.55 (d, J = 10.6 Hz, IH), 4.54 (d , J = 12.0 Hz, IH), 4.23 (d, J = 1.4 Hz, IH), 4.02 (dd, J = 2.9, 1.4 Hz, IH), 3.93 (d d, J = 9.5, 9.3 Hz, IH), 3.76—3.68 (m, 2H), 3.54 (dd, J = 9.3, 2.9 Hz, IH), 3.44 (m, IH).
FAB-MS m/z 550 (M+H)+.
[工程 4]
工程 3で得られたシァノ体（140 mg, 0.26 mmol)のエタノール溶液（5.0 mL)に水酸 化ナトリウム水溶液（1.2 mL, 2 mol/L)を加え、 80 °Cで 12時間攪拌した。反応混合物 を塩酸（10 mL, 2 mol/L)に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩 水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮し、カルボン酸（110 mg,収率 72 %)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.30-7.22 (m, 20H), 4.97 (d, J = 11.7 Hz, IH),
3
4.89 (d, J = 10.8 Hz, IH), 4.78 (d, J = 11.3 Hz, IH), 4.74 (d, J = 11.3 Hz, IH), 4.7 0 (s, 2H), 4.54 (d, J = 10.8 Hz, IH), 4.52 (d, J = 11.7 Hz, IH), 3.91 (t, J = 9.5 Hz, IH), 3.86 (d, J = 2.2 Hz, IH), 3.83—3.61 (m, 3H), 3.51—3.35 (m, 2H).
FAB-MS m/z 569 (M+H)+. [工程 5]
水素化リチウムアルミニウム（110 mg, 0.19 mmol)の THF懸濁液（20 mL)に窒素雰 囲気下、工程 4で得られたカルボン酸（110 mg, 0.19 mmol)をカ卩え、 80 °Cで 6時間攪 拌した。反応混合物を塩酸 (20 mL, 2 mol/L)に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム で乾燥した後、減圧濃縮し、化合物 S (80 mg,収率 77%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.38-7.22 (m, 20H), 4.97 (d, J = 11.7 Hz, 1H),
3
4.89 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.7 0 (s, 2H), 4.60-4.51 (m, 4H), 3.91 (dd, J = 9.6, 9.5 Hz, 1H), 3.86 (d, J = 2.5 Hz, 1 H), 3.83-3.70 (m, 2H), 3.62 (dd, J = 9.5, 2.5 Hz, 1H), 3.50—3.35 (m, 2H).
FAB-MS m/z 555 (M+H)+.
参者例 35： 1-ヒドロキシメチル- 2.3.4.7-テトラ- 0-ベンジル- 6-デォキシ- D-マンノへ プトース (化合物 T)の合成
[工程 1]
L-ガラクトース（0.51 g, 2.8 mmol)のメタノール溶液（2.0 mL)に、塩化ァセチル（0.2 6 mL)を加え、室温で 20時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗ト 0-メ チル体、臭化べンジル（2.6 mL, 4.4 mmol)および水素化ナトリウム（55% in oil, 0.53 g , 4.4 mmol)より、参考例 16の工程 1と同様にして、 1-0-メチル -2,3,4,6-テトラ- 0-ベ ンジル体 (0.69 g, 44%)をァノマー位立体異性体混合物、a l 混合比不明）として得 た。
FAB-MS m/z 555 (M+H)+.
[工程 2]
工程 1で得られたテトラベンジル体（76 g, 140 mmol)の酢酸溶液（700 mL)に、トリフ ルォロメタンスルホン酸（2.0 mol/L in water, 280 mL)を 2度に分けて加え、 80 °Cで 6 時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。その後、室温で 16時間攪拌した後、反応混 合物を氷水に注ぎいれ、酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫 酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ へキサン/酢酸ェチル =5/1)で精製し、 1-ヒドロキシ体 (48 g,収率 64%)をァノマー位 。 （％8S
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[工程 7]
水素化リチウムアルミニウム（0.16 g, 4.2 mmol)の THF懸濁液（120 mL)に窒素雰囲 気下、工程 6で得られたシリル体 (2.4 g, 3.8 mmol)を氷冷下カ卩え、同温度で 1.5時間 攪拌した。反応混合物に硫酸ナトリウム 10水和物（3,2 g, 10 mmol)を加え、室温で 1 時間攪拌した後、沈殿を濾別して、濾液を減圧濃縮し、粗ヒドロキシ体 (2.3 g)を得た
FAB-MS m/z 591 (M- H)— .
[工程 8]
工程 7で得られた粗ヒドロキシ体（2.3 g, 3.9 mmol)、臭化べンジル（0.93 mL, 7.8 m mol)および水素化ナトリウム（55% in oil, 0.31 g, 7.8 mmol)より、参考例 16の工程 1と 同様にして、粗テトラベンジル体を得た。得られた粗テトラべンジル体の塩化メチレン 溶液（10 mL)にトリフルォロ酢酸（1.0 mL)を加え、室温で 1時間攪拌した。反応混合 物を氷冷水に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮し た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =4/1)で精製し 、化合物 T (0.47 g,収率 22%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.37-7.27 (m, 20H), 4.97 (d, J = 11.4 Hz, IH),
3
4.95 (d, J = 11.4 Hz, IH), 4.79 (d, J = 11.8 Hz, IH), 4.74 (d, J = 11.8 Hz, IH), 4.6 7 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 4.51 (d, J = 12.1 Hz, IH), 4.43 (d, J = 12.1 Hz, IH), 3.85 (d , J = 2.6 Hz, IH), 3.71 (t, J = 9.5 Hz, IH), 3.68—3.56 (m, 4H), 3.43—3.31 (m, 3H), 2 .21 (m, IH), 1.79 (m, IH).
参考例 36： 2,3,4,8-テトラ- O-ァセチル- 6,7-ジデォキシ- D-ォクトース（化合物 U)の
[工程 1]
水素化ナトリウム（2.0 g, 60%, 50 mmol)の DMF懸濁液（10 mL)に、氷冷下、化合物 M (7.1 g, 16 mmol)および臭化べンジル（5.7 mL, 48 mmol)をカ卩え、室温まで昇温し 、同温度で 12時間攪拌した。反応混合物を氷水に注ぎいれ、ジェチルエーテルで抽
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1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.37-7.28 (m, 15H), 7.14 (dd, J = 15.8, 4.7 Hz
3
, 1H), 6.24 (dd, J = 15.8, 1.7 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.61 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.92 (d d, J = 9.3, 3.0 Hz, 1H), 3.82—3.71 (m, 4H), 3.62 (s, 3H), 3.15 (s, 3H).
API-MS m/z 536 (M+H20)+, 487 (M— MeO)+.
[工程 4]
工程 3で得られた a , β -不飽和エステル（3.3 g, 6.4 mmol)の THF溶液（100 mL)に 、窒素雰囲気下、水素化リチウムジイソプロピルアルミニウムの THF溶液（13 mL. l .O mol/L)を- 78 °Cで滴下し、同温度で 1時間攪拌し、さらに水素化リチウムジイソプロピ ルアルミニウムの THF溶液（13 mL. l .O mol/L)を滴下し、同温度で 30分間攪拌した。 反応混合物を氷冷下、 1.0 mol/L塩酸 (50 mL)に注ぎいれ、 2.5時間攪拌し、酢酸ェ チルとへキサンの混合液（1/1)で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナト リウムで乾燥した後、減圧濃縮し、アルコール体 (4.1 g)を得た。
得られたアルコール体（4.1 g)のメタノール溶液（20 mL)に 10%パラジウム炭素（90 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 14時間攪拌した。反応混合物から触媒を濾別し た。濾液を濃縮し、テトラヒドロキシ体（1.4 g)を得た。
得られたテトラヒドロキシ体（1.4 g)のピリジン溶液（15 mL)に無水酢酸（15 mL)を加 え、室温で 1時間攪拌した。その後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトダラ フィー（へキサン/酢酸ェチル = 3/1)で精製し、テトラァセトキシ体 (0.53 g,収率 21%) を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 5.29 (dd, J= 9.9, 3.4 Hz, 1H), 5.23 (dd, J= 3.4,
3
1.7 Hz, 1H), 5.11 (t, J= 9.9 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.75 (m, 1H), 3.39 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.05 (s, 6H), 1.99 (s, 3H) 1.71-1.54 (m, 4H).
FAB-MS m/z: 413 (M+Na)+,391 (M+H)+, 359 (M— OMe)— .
[工程 5]
工程 3で得られたテトラァセトキシ体（0.25 g, 0.64 mmol)の無水酢酸溶液（6.0 mL) に 0 °Cで濃硫酸 (0.010 mL)を加え、 30分攪拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に 注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウ ムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣を DMF(15 mL)に溶解し、ヒドラジンアセテート（0.5 1 g, 5.6 mmol)を加え、室温で 2時間攪拌した。反応混合物を水に注ぎ入れ、酢酸ェ チルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧 濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =4/1) で精製し、化合物 U (0.52 g,定量的)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 5.39 (dd, J = 9.9, 3.4 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 3.
3
4, 1.6 Hz, 1H), 5.15-5.05 (m, 2H), 4.07 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.46 (m, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.91 (m, 1H), 1.70-1.56 (m, 3H).
FAB-MS m/z: 359 (M— OH)+, 399 (M+Na)+.
参者例 37：アデノシン =5 ' -(2.3.4.6-テトラ- 0-ァセチル- β -D-マンノビラ-ルメトキシ) ジホスフアート (化合物 24)の合成
[工程 1]
ィ匕合物 S (70 mg, 0.12 mmol)、 DMAP(18 mg, 0.14 mmol)およびクロ口リン酸ジフエ -ル（0.030 mL, 0.14 mmol)より、参考例 3と同様にして、ジフエ-ルリン酸エステル（9 O mg,収率 96%)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.61-7.21 (m, 30H), 4.95 (d, J = 11.4 Hz, 1H),
3
4.85 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.5 7 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.54 (s, 2H), 4.52 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.48 (m, 1H), 4.41- 4.91 (m, 3H), 3.88 (m, 1H), 3.72—3.68 (m, 2H), 3.50 (m, 1H), 3.41 (m, 1H).
ESI-MS m/z 787 (M+H)+.
[工程 2]
工程 1で得られたジフヱ-ルリン酸エステル（90 mg, 0.12 mmol)のメタノール溶液（1 0 mL)に 10%パラジウム炭素（90 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 14時間攪拌した 。反応混合物から触媒を濾別した。濾液を濃縮し、テトラヒドロキシ体 (51 mg)を得た
ESI-MS m/z 427 (M+H) [0140] [工程 3]
工程 2で得られたテトラヒドロキシ体 (51 mg)のピリジン溶液（1.0 mL)に無水酢酸（1. 0 mL)を加え、室温で 1時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =3/1)で精製し、ァセチル体 (22 mg,収率 31%)を得た。
ESI-MS m/z 595 (M+H)+.
C工程 4]
工程 3で得られたァセチル体（22 mg, 0.037 mmol)のエタノール溶液（1.0 mL)溶液 に酸化白金 (5.0 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 5日間攪拌した。反応混合物か ら触媒を濾別し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホ ルム /メタノール =20/1)で精製し、リン酸ジエステルを得た。得られたリン酸ジエステ ルをエタノール (0.50 mL)に溶解し、酸化白金（10 mg)を加え、水素雰囲気下、室温 で 1日攪拌した。反応混合物から触媒を濾別し、濾液を濃縮し、脱フエニル体（11 mg, 収率 68%)を得た。
FAB-MS m/z 441 (M- H)— .
[工程 5]
工程 4で得られた脱フエ-ル体（11 mg, 0.026 mmol)、アデノシン =5， -ホスホモルホ リデートの 4，-モルホリン- Ν,Ν' -ジシクロへキシルカルボキサミジ-ゥム塩（11 mg, 0.0 26 mmol)およびテトラゾール（18 mg, 0.026 mmol)より、参考例 21と同様にして、化合 物 24のアンモ-ゥム塩（15 mg,収率 72%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, D 0) δ (ppm): 8.52 (s, IH), 8.23 (br s, IH), 6.13 (dd, J = 6.5, 1
2
.1 Hz, IH), 5.37 (d, J = 2.6 Hz, IH), 5.09 (dd, J = 10.1, 9.9 Hz, IH), 4.94 (m, IH), 4.67 (dd, J = 5.1, 4.4 Hz, IH), 4.49 (dd, J = 4.2, 3.9 Hz, IH), 4.29 (m, IH), 4.25—4. 15 (m, 3H), 4.00-3.82 (m, 3H), 3.53 (d, J = 3.0 Hz, IH), 2.14 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.95 (s, 3H).
FAB-MS m/z 770 (M- H)— .
[0141] 参考例 38：アデノシン =5 ' -( β -D-マンノビラ-ルメトキシ)ジホスフアート（化合物 25)の "^ェ (H邈^軍 — (louiui C600 '§ 0800·0)^マ - ¾べ 呦 z ^A ) 4— ^^ ( 、/ 。^ H ベム- a- g -^^ ^- 9)- 1 s=べ^/^ [ε ]
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[工程 1]
ィ匕合物 Τ (0.19 g, 0.33 mmol)、 DMAP(48 mg, 0.40 mmol)およびクロ口リン酸ジフエ -ル（0.082 mL, 0.40 mmol)より、参考例 3と同様にして、粗ジフエ-ルリン酸エステル (0.39 g)を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDCl ) δ (ppm): 7.37-7.17 (m, 30H), 4.93 (d, J = 11.3 Hz, IH),
3
4.91 (d, J = 10.9 Hz, IH), 4.72 (d, J = 11.7 Hz, IH), 4.66 (d, J = 11.7 Hz, IH), 4.5 5 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 4.45 (d, J = 12.1 Hz, IH), 4.39 (d, J = 12.1 Hz, IH), 4.38 (m , IH), 4.17 (m, IH), 3.86 (d, J = 2.2 Hz, IH), 3.68 (t, J = 9.5 Hz, IH), 3.59—3.51 (m , 4H), 3.35 (td, J = 9.3, 2.6 Hz, IH), 2.15 (m, IH), 1.74 (m, IH).
ESI-MS m/z 801 (M+H)+.
[工程 2]
工程 1で得られた粗ジフエ-ルリン酸エステル（0.39 g, 0.33 mmol)および 10%パラジ ゥム炭素（18 mg)より、参考例 37の工程 2と同様にして、粗テトラヒドロキシ体 (0.20 g) を得た。
JH-NMR (300 MHz, CDCl ) δ (ppm): 7.42-7.38 (m, 4H), 7.26-7.20 (m, 6H), 4.46—4.
3
36 (m, 2H), 3.82 (br s, IH), 3.71—3.65 (m, 3H), 3.42—3.39 (m, 2H), 3.22 (m, IH), 2. 08 (m, IH), 1.69 (m, IH).
ESI-MS m/z 441 (M+H)+.
[工程 3]
工程 2で得られた粗テトラヒドロキシ体 (0.20 g)、ピリジン（1.0 mL)および無水酢酸（ 1.0 mL)より、参考例 37の工程 3と同様にして、テトラァセチル体 (0.14 g,収率 70%)を 得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl ) δ (ppm): 7.38-7.30 (m, 4H), 7.22-7.18 (m, 6H), 5.45 (d,
3
J = 2.2 Hz, IH), 5.09 (dd, J = 10.0, 9.8 Hz, IH), 4.99 (dd, J = 10.0, 3.3 Hz, IH), 4 .33-4.06 (m, 4H), 3.86 (m, IH), 3.48 (m, IH), 2.11 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3 H), 1.98 (s, 3H), 1.87-1.72 (m, 2H). •6 = f 'ΡΡ) OS'S '(Ηΐ 'ΖΗ VZ '9·6 = [ 'ΡΡ) 0 ·ε '(Ηΐ 'ΖΗ 6·9 = [ ' ) ·ε '{ΗΖ 'ΖΗ ε· e '9" = [ 'ρρ) sex '(ΗΪ 'ΖΗ ε·ε = f 'ρ) 98·ε
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8M8S0/.00Zdf/X3d 08 動 0Ζ OAV 日間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ クロ口ホルム/メタノール/ 30%アンモニア水 = 7/4/1]で精製し、リン酸体（6.5 mg,収率 51%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD OD) δ (ppm): 7.44-7.20 (m, 20H), 4.97 (d, J = 10.8 Hz, IH
3
), 4.90-4.82 (m, 3H), 4.67 (d, J = 11.7 Hz, IH), 4.62 (d, J = 11.0 Hz, IH), 4.47 (d, J = 12.0 Hz, IH), 4.41 (d, J = 12.0 Hz, IH), 4.34 (d, J = 2.4 Hz, IH), 3.79 (m, IH), 3.69 (dd, J = 9.2, 2.7 Hz, IH), 3.64—3.56 (m, 3H), 2.30—2.10 (m, 2H), 1.92 (m, IH), 1.65 (m, IH).
ESI-MS m/z 631 (M- H)— .
[工程 4]
工程 3で得られたリン酸体（0.61 g, 0.96 mmol)、アデノシン =5，-ホスホモルホリデー トの 4，-モルホリン- Ν,Ν' -ジシクロへキシルカルボキサミジ-ゥム塩（0.68 g, 0.96 mmo 1)およびテトラゾール（67 mg, 0.96 mmol)より、参考例 21と同様にして、化合物 28のテ トラべンジル体のアンモ-ゥム塩（3.0 mg,収率 2.0%)を得た。
FAB-MS m/z 960 (M- H)— .
[工程 5]
工程 4で得られた化合物 28のテトラべンジル体のアンモ-ゥム塩（3.0 mg, 0.0031 m mol)のメタノール/水/酢酸混合溶液（50/50/1, 10 mL)に 10%パラジウム炭素（90 mg )を加え、水素雰囲気下、 60 °Cで 30分間攪拌した。反応混合物から触媒を濾別した 。濾液を濃縮し、残渣を高速液体クロマトグラフィー [カラム； Develosil RPAQURUS ( 野村ィ匕学株式会社)、直径; 4.6 mmx25 cm,検出波長； 260 流出溶媒; 0.5%酢酸 水溶液（1.0 mL/分)、検出時間 10-15分間]で分取精製し、化合物 28 (0.3 mg,収率 1 6%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, D 0) δ (ppm): 8.47 (s, IH), 8.23 (s, IH), 6.10 (d, J = 5.5 Hz, 1
2
H), 4.87 (m, IH), 4.46 (m, IH), 4.44 (m, IH), 4.37-4.30 (m, 2H), 4.26 (d, J = 3.1 H z, IH), 4.20 (m, IH), 4.09—4.06 (m, 2H), 3.72—3.65 (m, 3H), 3.50 (dd, J = 9.8, 9.1 Hz, IH), 3.31 (m, IH), 2.01 (m, IH), 1.88 (m, IH).
ESI-MS m/z 600 (M- H)— . 実施例 8
アデノシン =5，-(6-デォキシ- β -D-マンノヘプトピラニル)ジホスフアート（化合物 29) の合成
[工程 1]
化合物 Ν (0.98 g, 2.1 mmol)、酢酸（20 mL)および濃硫酸（0.010 mL)より、参考例 3 4の工程 2と同様にして、粗ジァセチル体（1.2 g)を得た。
FAB-MS m/z: 571 (M +Na)+.
[工程 2]
工程 1で得られた粗ジァセチル体（1.2 g, 2.1 mmol)の塩化メチレン溶液（20 mL)に トリメチルホスファート（0.63 mL, 5.0 mmol)およびトリフルォロメタンスルホン酸トリメチ ルシリル（0.56 mL, 2.5 mmol)の塩化メチレン溶液（5.0 mL)を氷冷下でカ卩え、同温度 で 2時間攪拌した。反応混合物を氷水に注ぎいれ、クロ口ホルムで抽出した。有機層 を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（へキサン/酢酸ェチル =3/1)で精製し、リン酸エステル (0 .32 g,収率 25%)を得た。
1H-NMR (500 MHz, CDC1 ) δ (ppm): 7.45-7.43 (m, 2H), 7.35-7.26 (m, 13H), 5.00 (
3
d, J = 10.7 Hz, IH), 4.94 (d, J = 10.8 Hz, IH), 4.82 (d, J = 10.7 Hz, IH), 4.76 (d, J = 11.7 Hz, IH), 4.66 (d, J = 10.8 Hz, IH), 4.65 (d, J = 11.7 Hz, IH), 4.34 (dd, J = 2 .8, 0.9 Hz, IH), 4.22-4.15 (m, 2H), 3.78-3.76 (m, 2H), 3.74—3.68 (m, 6H), 3.58 (dd , J = 9.3, 2.8 Hz, IH), 3.33 (td, J = 9.3, 2.6 Hz, IH), 2.20 (m, IH), 2.01 (s, 3H), 1. 83 (m, IH).
FAB-MS m/z 599 (M+H)+.
[工程 3]
工程 2で得られたリン酸エステル（0.32 g, 0.54 mmol)および臭化トリメチルシリル（0. 33 g, 22 mmol)より、実施例 7の工程 3と同様にして、リン酸体（0.22 g,収率 72%)を得 た。
JH-NMR (500 MHz, CD OD) δ (ppm): 7.49-7.47 (m, 2H), 7.35-7.33 (m, 2H), 7.29-
3
7.26 (m, 11H), 4.93 (d, J = 10.8 Hz, IH), 4.89 (d, J = 11.0 Hz, IH), 4.85 (d, J = 10. •(Ηΐ 'ω) Ζ9"ΐ '(Ηΐ 'ω) S οτ '(ΗΪ 'ΖΗ 9 's'6 = f 'ρ¾ εε·ε '(HI 'ΖΗ νβ 's'6 = f 'ρρ) Ζ '(ΗΙ 'ΖΗ ε·ε '9·6
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8M8S0/.00Zdf/X3d 88 動 0Z OAV ESI- MS m/z 588 (M+H)+; 586 (M- H)— .
実施例 9
アデノシン =5，-(6-デォキシ- β -D-マンノヘプトビラノシル)- a. β -メチレンジホスファ ート ( ·30)の
[工程 1]
メチレンジリン酸トリべンジル（1.1 g, 2.5 mmol)および 2，，3，-ジァセチルアデノシン（ 1.8 g, 5.0 mmol)をピリジン（1.0 mL)に溶解し、溶媒を減圧留去し、水分を完全に除 去した。残渣をピリジン（2.0 mL)に溶解し、 DIAD (10 mmol)のトルエン溶液（5.2 mL) およびトリフエニルホスフィン（2.6 g, 10 mmol)を加え、 40 °Cで 2時間攪拌した。反応 混合物を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム/メタノ ール =9/1)で精製し、テトラリン酸エステル (0.36 g,収率 18%)をジァステレオ混合物 として得た。
ESI-MS m/z 779 (M+H)+.
[工程 2]
工程 1で得られたテトラリン酸エステル（0.36 g, 0.46 mmol)の DMF溶液（5.0 mL)に キヌクリジン (48 mg, 0.43 mmol)を加え、 120 °Cで 30分間攪拌した。その後、反応混 合物を減圧濃縮し、残渣を高速液体クロマトグラフィー [カラム； ODS- 3 (GL- Science 社）、直径； 4.6 mmx25 cm、検出波長； 260nm、流出溶媒；ァセトリトリル /10 mmol/L酢 酸アンモ-ゥム水溶液 = 15/85〜45/65グラジュェント（20分間、 1.0 mL/分）、検出時 間 15- 20分間]により精製し、トリリン酸エステル (96 mg,収率 30%)をジァステレオ混合 物として得た。
ESI-MS m/z 687 (M- H)— .
[工程 3]
工程 2で得られたトリリン酸エステル（90 mg, 0.26 mmol)の THF溶液（1.0 mL)に化合 物 0 (180 mg, 0.52 mmol),トリフエ-ルホスフィン（200 mg, 0.78 mmol)、 DIAD (0.78 mmol)のトルエン溶液 (0.39 mL)を加え、室温で 1時間攪拌した。反応混合物を濃縮 し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム/メタノール =9/1)で精製 し、糖リン酸体 (82 mg,収率 61%)を得た。 ESI-MS m/z 1034 (M+H)+.
[工程 4]
工程 3で得られた糖リン酸体（82 mg, 0.079 mmol)のエタノール溶液（1.0 mL)にパ ラジウム炭素 (8.0 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 1時間攪拌した。反応混合物か ら触媒を濾別し、濾液を濃縮して、残渣をメタノール/水/トリェチルァミン (3.7 mL)に 溶解し、室温で 5時間攪拌した。次いで濾過し、濾液を濃縮し、残渣を DEAE Sephad ex A- 25カラムクロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製、酢酸で pH5.0に 調整した酢酸アンモ-ゥム溶液 0.2-0.3 mmol/Lで溶出）で精製し、化合物 30 (11 mg, 収率 17%)をァノマー位立体異性体混合物（ α： j8 = 1:2)のアンモ-ゥム塩として得た α体
JH-NMR (500 MHz, D Ο) δ (ppm): 8.62 (s, IH), 8.34 (s, IH), 6.16 (d, J = 5.5 Hz, 1
2
H), 5.45 (d, J = 7.4 Hz, IH), 4.81 (dd, J = 5.4, 5.3 Hz, IH), 4.56 (m, IH), 4.39 (m, IH), 4.19-4.18 (m, 2H), 4.01 (m, IH), 3.89 (m, IH), 3.88 (m, IH), 3.74 (m, IH), 3. 52-3.42 (m, 2H), 2.27 (dd, J = 20.8, 20.5 Hz, 2H), 2.16 (m, IH), 1.76 (m, IH).
ESI-MS m/z 600 (M- H)— .
J3体
JH-NMR (500 MHz, D O) δ (ppm): 8.62 (s, IH), 8.34 (s, IH), 6.16 (d, J = 5.5 Hz, 1
2
H), 5.29 (d, J = 8.5 Hz, IH), 4.81 (dd, J = 5.4, 5.3 Hz, IH), 4.56 (m, IH), 4.39 (m, IH), 4.19-4.18 (m, 2H), 4.05(d, J = 3.2 Ηζ, ΙΗ), 3.89 (m, IH), 3.73—3.69 (m, 2H), 3 .65 (dd, J = 9.1, 3.3 Hz, IH), 3.47—3.38 (m, 2H), 2.27 (dd, J = 20.8, 20.5 Hz, 2H), 2.09 (m, IH), 1.65 (m, IH).
ESI-MS m/z 600 (M- H)— .
実施例 10
アデノシン =5 ' -(6.7-ジデォキシ- β -D-マンノォクトビラノシル)ジホスフアート（化合物 31)の合成
[工程 1]
ィ匕合物 U (0.52 g, 1.4 mmol), DMAP (0.20 g, 1.7 mmol)およびクロ口リン酸ジフエ-
Figure imgf000088_0001
•(Ηΐ '
Of I '{HZ IS'I- 6S'I '(HI Z \ '(HS 's) 6·ΐ '(HS 's) 66·ΐ '(HS 's) SO '(
Ηε 's) srs '(HI ζε·ε '{ηζ '^) ε6·ε- 96·ε '{ηζ 9Vf-evf '(HI se^ '(HI
'ZH q- = f ') gff '(HI 'ZH S"S = f 69·， '(HI '^H 9·6 'Ζ"6 = f 'ΡΡ) 06·， '(Ηΐ 'z H Z'Z '9·6 = f 'PP) WTS '(HI '^H S"6 = f 'P) 8S"S '(HI '^H 8·ΐ = f 'P) Z S '(HI '^H
0·9 = f 'P) ZV9 '(HI 's) 2"8 '(HI 's -iq) ： ( d) 9 ( 3Q0 'z OOS) 顺- HT
(%οτ^ 9·ΐ) マ - ¾べ o) ^n^ ^^T2p}% ,^(IOUIUI 02·ο 'Sin ^ΐ) — ^4^¾QT¾: (louiui 2 <s rO)^マ -;^^ ^^ / ^ 'N'N—ベ fi OH—、 fl ¾ - {S=ベ ^ praui 02 '§ω 6)：# -ェ ^ ^^會^^键ェ
[ε ェ]
•_(H- ) SS ： z/ui S -IS3 "(Ηΐ 'ω) SS-ΐ '(HS 'ω) 9·ΐ- 8Γΐ '(Η ε <s) w\ '(Ηε 's) w s '(HS so '(HS \vz '(HI Ζ9τ '{ηζ 'ΖΗ ε·9 = f '
) 80·， '(Ηΐ 'ZH 8·6 '6·6 = f 'ΡΡ) 20"S '(Ηΐ '^Η '6·6 = f 'ΡΡ) S '(Ηΐ '^Η VI 'Ζ •8 = f 'Ρ) 0 'S '(Ηΐ 'ZH VI 'Ζ = f 'ΡΡ) SV ： ( d) g ( 3Q0 'z 00S) 顺- HT
- (%08*¾ί
Figure imgf000088_0002
C)T(Sui 02) ^^TO^QTfiOouiiii 82 'S ェ邈べ^ -ェ 键ェ
β ェ]
·+(Η+ ) 609： ζ/ω
"(HS 8S'I- ΐ9·ΐ '(Ηΐ 'ω) ΖΖ·ΐ '(HS 66·ΐ '(HS <s) ΐθ '(HS 's) 90 '(HS 's) '(Ηΐ 'ω) TST '(Η2 '^Η 0·9 = f 00·， '(Ηΐ '^Η ΐ·ε '6·6 = f 'ΡΡ) OO'S '(Ηΐ 'ΖΗ 9·6 '6·6 = f 'ΡΡ) ΪΓ3 '(Ηΐ '^Η ΐ·ε = f 'Ρ) '(Ηΐ 'ΖΗ ΐ·ΐ '8·9 = f 'ΡΡ) '(Η0ΐ 'ω) ^ΓΖ-ΐ9"Ζ： ( d) 9 ( 3Q0 'ZH 00S) H N-HT
。 '§6 ε·0 / エ邈べ ェ ¾
Figure imgf000088_0003
(IOUIUI ·Τ Ίω S )
8M8S0/.00Zdf/X3d 98 動 0Ζ OAV 実施例 11
[0152] 微生物を利用したアデノシン =5，-(D-グリセ口- β -D-マンノヘプトビラノシル)ジホスフ ァー卜 (化 16)の観告
種菌として KY13101株を用いた。該菌株を、下記の組成力 なる殺菌前の培地 (ρΗ 7.0、 10 mL :以下、種培地と呼ぶ）を入れた試験管に植菌した。レシプロシェーカー を用いた振盪培養 (220 rpm)を 28°Cで 3日間行うことにより、種培養し、第 1種培養液 を調製した。
種培地の組成：グルコース（10 g/L)、可溶性でんぷん（10 g/L)、肉エキス（3 g/L)、 酵母エキス（5 g/L)、トリプトン (5 g/L)、 KH PO (1 g/L)、 MgSO · 7Η 0 (0.5 g/L)お
2 4 4 2
よび Mg (PO ) ·8Η O (0.5 g/L)
3 4 2 2
種培地（50 mL)を入れた 300 mL三角フラスコに第 1種培養液を 2.5% (容量）の割合 で植菌し、ロータリーシェーカーを用いた振盪培養 (320 rpm)を 28 °Cで 2日間行い、 第 2種培養液を調製した。
[0153] 種培地（50 mL)を入れた 300 mL三角フラスコに第 2種培養液を 5% (容量）の割合で 植菌し、ロータリーシェーカーを用いた振擾培養 (320 rpm)を 28 °Cで 2日間行い、第
3種培養液を調製した。
下記組成の発酵培地 (2.5 L)を入れた 5 Lのジャーフアーメンターに、得られた第 3 種培養液を 5% (容量)の割合で植菌し、通気攪拌培養（回転数 400 rpm、通気量 1.2 5 L/分)を 28 °Cで行った。培養中、培地の pH値は特に制御せずに、 5日間培養を行 つた o
発酵培地の組成:グルコース（10 g/L)、可溶性でんぷん（10 g/L)、さなぎ粉（10g/L) 、酵母エキス（2 g/L)、ニトロフミン酸（0.25 g/L)、 3 モルホリノプロパンスルホン酸（ 2 g/L： MOPS) , ZnSO · 7Η O (0.01g/L)、 MnSO ·4 5H O (0.01 g/L)、 FeSO - 7H O
4 2 4 2 4 2
(0.01 g/L)、 CoCl -6H 0 (0.01 g/L)および MgSO - 7H O (0.5 g/L) (殺菌前の培地:
2 2 4 2
pH7.0、 NaOHおよび H SOで調整）
2 4
5 Lジャーフアーメンターで培養した培養物（12.3 L)を遠心分離することにより得ら れた「菌体を含む沈殿物」にエタノール (6.15 L)をカ卩え、さらに遠心分離することによ り得られた上清を抽出液として得た。この抽出液を濾過した後、 0.2%酢酸水溶液を加 え、ロータリーエバポレーターでエタノールを留去した。残渣を Diaion HP— 20 (三菱 化学社製）に通塔した。非吸着画分と 0.2%酢酸を含む水で洗浄することにより得られ た画分を DEAE Sephadex A— 25カラムクロマトグラフィー（フアルマシア社製）で精製 した（酢酸で pH 5に調整した酢酸アンモ-ゥム水溶液で、 0.1 mol/L、 0.2 mol/L、 0.3 mol/L, 0.4 mol/Lおよび 0.5 mol/Lと段階的に溶出）。 0.2 mol/Lおよび 0.3 mol/Lで 溶出された活性画分を凍結乾燥した。得られた粉末をカラムクロマトグラフィー [カラ ム； YMC- GEL ODS-AQ 120-S50 (ヮイエムシイネ土製）、流出溶媒； 0.2%酢酸水溶液（5 mL/分) ]で精製した。活性画分を凍結乾燥して得られた粉末を Toyopearl HW40 su perfine (東ソ一社製)で精製し (0.2%酢酸水溶液で溶出）、活性画分を凍結乾燥した。 得られた粉末を逆相高速液体カラムクロマトグラフィー [カラム； Develosil RPAQUEO USカラム（野村ィ匕学社製）、直径; 4.6 X 250 mm,検出波長； 260 nmの紫外吸収、流 出溶媒; 0.5%酢酸水溶液 (1 mL/分)、カラム温度; 30 °C]で精製し、活性画分 (保持 時間 13.1分)を凍結乾燥した。さらに得られた粉末を逆相高速液体カラムクロマトグ ラフィー [カラム； Develosil RPAQUEOUSカラム（野村化学社製）、直径； 4.6 x 250 mm 、検出波長； 260 nmの紫外吸収、流出溶媒； 10 mmol/L酢酸アンモニゥム水溶液とァ セトニトリルの混合溶媒 (99/1、 1 mL/分)、カラム温度; 30 °C]で精製し、化合物 16 (0 .07 mg)を得た。
産業上の利用可能性
[0154] 本発明により、 TLR9作動薬、免疫促進剤、抗アレルギー剤、抗腫瘍剤、抗感染症 剤等として有用な TLR9の作動活性を有する化合物等が提供される。
配列表フリーテキスト
[0155] 配列番号 1 人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号 2—人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号 3—人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号 4 人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号 5—人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号 6—人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号 7—人工配列の説明：フォワードプライマー 配列番号 8—人工配列の説明：リバースプライマー

Claims

請求の範囲
式 0)
[化 13]
Figure imgf000092_0001
(式中、 aは 0または 1を表し、
nは 0〜2の整数を表し、
mは 0〜5の整数を表し、
X1および X2はそれぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシを表し、
Yは酸素原子または硫黄原子を表し (nが 1または 2のとき、 2つまたは 3つの Yは同一で も異なっていてもよい）、
- Q1-は- 0-、 -CH -または- CF -を表し、
2 2
- Q2-は単結合、 - 0-、 -CH - 0-または- CH -を表し、
2 2
- Z-は- 0-または- CH -を表し、
2
R3および R4はそれぞれ独立して、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルカノ ィルォキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アル ケニルォキシ、置換もしくは非置換のァラルキルォキシまたは置換もしくは非置換の 複素環アルキルォキシを表し、
R2および R5はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級 アルカノィルォキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低 級ァルケ-ルォキシ、置換もしくは非置換のァラルキルォキシまたは置換もしくは非 置換の複素環アルキルォキシを表し、
Aは下記の置換基群 (A)力 選ばれる基を表す)で表される化合物またはその薬理学 的に許容される塩を有効成分として含有する Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬。 [化 14] 置換基群 (A)
Figure imgf000093_0001
[2] mが 1である請求項 1記載の Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬。
[3] aが 1である請求項 1または 2記載の Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬。
[4] aが 0である請求項 1または 2記載の Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬。
[5] R2が水素原子である請求項 1〜4の 、ずれかに記載の Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬
[6] R1および R2がそれぞれ独立して、ヒドロキシまたは低級アルカノィルォキシである請求 項 1〜4の 、ずれかに記載の Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬。
[7] X1および X2がヒドロキシである請求項 1〜6の!、ずれかに記載の Toll様受容体 9 (TLR
9)作動薬。
[8] 式 (IA)
[化 15]
Figure imgf000094_0001
(式中、 maは 1〜5の整数を表し、
X1、 X2、 Y、 Q Q2および Aはそれぞれ前記と同義であり、
R1A、 R3A、 および R5Aはそれぞれ独立して、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級 アルカノィルォキシまたは置換もしくは非置換の低級アルコキシを表す)で表される 化合物またはその薬理学的に許容される塩。
[9] maが 1である請求項 8記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
[10] X1および X2がヒドロキシである請求項 8または 9記載の化合物またはその薬理学的に 許容される塩。
[11] R1Aがヒドロキシまたは低級アルカノィルォキシである請求項 8〜 10のいずれかに記 載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
[12] Aが
[化 16]
Figure imgf000094_0002
である請求項 8〜： L 1のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される 塩。
[13] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬。
[14] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する抗アレルギー剤。 [15] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する抗腫瘍剤。
[16] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する抗感染症剤。
[17] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する免疫促進剤。
[18] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する Toll様受容体 9 (TLR9)が関与する疾患の治療および Zまたは 予防剤。
[19] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効 成分として含有する抗アレルギー剤。
[20] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効 成分として含有する抗腫瘍剤。
[21] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効 成分として含有する抗感染症剤。
[22] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効 成分として含有する免疫促進剤。
[23] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効 成分として含有する Toll様受容体 9 (TLR9)が関与する疾患の治療および Zまたは予 防剤。
[24] Massilia sp. KY13101株（受託番号： NITE BP- 348)。
[25] 請求項 24記載の微生物を利用した請求項 1〜12のいずれかに記載の化合物の製 造法。
[26] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む Toll様受容体 9 (TLR9)の作動方法。
[27] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含むアレルギーの治療方法。
[28] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む腫瘍の治療方法。
[29] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む感染症の治療方法。
[30] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む免疫促進方法。
[31] 請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む Toll様受容体 9 (TLR9)が関与する疾患の治療および Z または予防方法。
[32] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む Toll様受容体 9 (TLR9)の作動方法。
[33] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含むアレルギーの治療方法。
[34] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む腫瘍の治療方法。
[35] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む感染症の治療方法。
[36] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む免疫促進方法。
[37] 請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有 効量を投与する工程を含む Toll様受容体 9 (TLR9)が関与する疾患の治療および Z または予防方法。
[38] Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬の製造のための、請求項 1〜7のいずれかに記載の化 合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
[39] 抗アレルギー剤の製造のための、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはそ の薬理学的に許容される塩の使用。
[40] 抗腫瘍剤の製造のための、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理 学的に許容される塩の使用。
[41] 抗感染症剤の製造のための、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬 理学的に許容される塩の使用。
[42] 免疫促進剤の製造のための、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬 理学的に許容される塩の使用。
[43] Toll様受容体 9 (TLR9)が関与する疾患の治療および Zまたは予防剤の製造のため の、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の 使用。
[44] Toll様受容体 9 (TLR9)作動薬の製造のための、請求項 8〜 12のいずれかに記載の 化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
[45] 抗アレルギー剤の製造のための、請求項 8〜 12のいずれかに記載の化合物または その薬理学的に許容される塩の使用。
[46] 抗腫瘍剤の製造のための、請求項 8〜12のいずれかに記載の化合物またはその薬 理学的に許容される塩の使用。
[47] 抗感染症剤の製造のための、請求項 8〜12のいずれかに記載の化合物またはその 薬理学的に許容される塩の使用。
[48] 免疫促進剤の製造のための、請求項 8〜12のいずれかに記載の化合物またはその 薬理学的に許容される塩の使用。
[49] Toll様受容体 9 (TLR9)が関与する疾患の治療および Zまたは予防剤の製造のため の、請求項 8〜 12の 、ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩 の使用。
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