WO2007111534A1 - Procédé de production d'une préparation d'interleukine-2, et préparation obtenue à l'aide dudit procédé - Google Patents

Procédé de production d'une préparation d'interleukine-2, et préparation obtenue à l'aide dudit procédé Download PDF

Info

Publication number
WO2007111534A1
WO2007111534A1 PCT/RU2007/000128 RU2007000128W WO2007111534A1 WO 2007111534 A1 WO2007111534 A1 WO 2007111534A1 RU 2007000128 W RU2007000128 W RU 2007000128W WO 2007111534 A1 WO2007111534 A1 WO 2007111534A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
water
preparation
cells
acetone
suspension
Prior art date
Application number
PCT/RU2007/000128
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mikhail Nikolaevich Smirnov
Zoya Kalenikovna Nikolaeva
Vera Sergeevna Yakovleva
Original Assignee
Mikhail Nikolaevich Smirnov
Zoya Kalenikovna Nikolaeva
Vera Sergeevna Yakovleva
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mikhail Nikolaevich Smirnov, Zoya Kalenikovna Nikolaeva, Vera Sergeevna Yakovleva filed Critical Mikhail Nikolaevich Smirnov
Priority to EP07747858A priority Critical patent/EP1882744A4/en
Publication of WO2007111534A1 publication Critical patent/WO2007111534A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2

Definitions

  • the invention relates to the field of immunomodulating drugs biotechnological methods and can be used in the pharmaceutical industry.
  • this invention relates to a method for producing the preparation of Interleukin-2.
  • Such a drug can be used for immuno-oriented therapy, and, in particular, in the treatment of cancer, infectious, autoimmune and allergic diseases.
  • IL-2 Interleukin-2
  • E. coli E. coli
  • E. coli is a conditionally pathogenic flora. Therefore, IL-2 preparations from E. coli require thorough cleaning and can be toxic. Yeast cells are more attractive producers of heterologous IL-2.
  • the objective of the invention is to provide a more technologically advanced method of obtaining the drug IL-2, which would allow to obtain a drug that is not inferior in activity and therapeutic capabilities well-known drugs, while providing the possibility of large-scale production and not too high cost.
  • the problem is solved by the fact that a method for producing the preparation of Interleukin-2 is proposed, in which, with the preservation of the target protein, the cells of the yeast producer IL-2 are destroyed, in which the synthesis of the target protein (IL-2) is carried out and which does not secrete this target protein, and the water-insoluble is separated fraction, and in the preparation, water-insoluble components of the destroyed cells are retained.
  • the yeast producer is a strain of Sasshotus servisiae deposited in the All-Union Collection of Industrial Microorganisms under the number Y-791, which is a producer of human Internet-2.
  • the authors of the present invention unexpectedly found that preserving the remnants of the cell walls of yeast in the preparation of recombinant IL-2 not only simplifies its production scheme and obtains a cheaper drug, but also allows to obtain a very effective drug, therapeutic the properties of which in some situations are superior to those of the known IL-2 preparations.
  • the implementation of the method of obtaining the drug without extraction (transfer) of IL-2 into the liquid phase and its subsequent extraction from the liquid phase leads to an unexpected result for this stage exclusion.
  • the result of the method is not a poorly refined product, but a completely new preparation of IL-2.
  • the remains of the insoluble fraction of the yeast cell walls that are preserved in the preparation not only do not interfere with the effect of IL-2, but also serve as a kind of adjuvant, that is, an auxiliary substance that stimulates the activation of the T-cell immunity of mammals.
  • the transfer of water-insoluble IL-2 into the liquid phase with its subsequent extraction was considered absolutely necessary before the creation of this invention, and the efforts of the developers had previously been aimed at developing ways to improve cleaning. After creating this of the invention, it becomes clear that the preparation IL-2 should be obtained without separation from the water-insoluble fraction of the cell walls of the yeast, and efforts can then be focused on improving the quality of the fraction of the cell walls.
  • IL-2 is in an inactive form, which ensures the possibility of its long-term storage.
  • a solubilizer and water must be added to the drug. It is advisable to destroy cells in the presence of protease inhibitors, since it is the proteases released during the destruction of yeast cells that can cause the destruction of the target protein.
  • the separated water-insoluble fraction is dried. Drying can be carried out immediately after separation or after washing.
  • the water-insoluble fraction after separation of the water-insoluble fraction, it is treated with acetone, followed by removal of the acetone fraction. In this case, the destroyed yeast cells are dehydrated. This stage also allows you to get rid of the lipid components of the water-insoluble fraction, which leads to the preparation with improved physical properties, it is convenient to use and more pleasant for therapeutic use.
  • acetone a suspension of a water-insoluble fraction in water is prepared, the suspension is poured into acetone with a volume to suspension ratio of acetone from 1: 5 to 1: 20, preferably 1: 10, to obtain a suspension in acetone, the suspension obtained is filtered and the residue remaining on the filter is dried.
  • the water-insoluble fraction Before treatment with acetone, the water-insoluble fraction can be washed, that is, the washing is carried out after separation of the water-insoluble fraction before preparing its suspension in water.
  • a dry solubilizer is added to this dried fraction.
  • the preparation is obtained in the form of a composition of a dried water-insoluble fraction and a solubilizer.
  • IL-2 is also in an inactive form, which ensures the possibility of its long-term storage.
  • water To activate IL-2, water must be added to such a preparation. With such addition of a solubilizer concentration 'in the solution becomes optimal, which ensures formation of correct protein conformation and preparation of a medicament having biological activity. It is advisable to use sodium dodecyl sulfate as a solubilizer.
  • water is added to the preparation of IL-2 after the addition of the solubilizer.
  • the invention also provides the preparation of Interleukin-2, obtained by the above method in any of its possible variants.
  • the resulting preparation has a lower cost and can be used in oral therapy, which is always more preferable from the point of view of the patient.
  • it was also found that such a drug exhibits therapeutic effects superior to the effects of a drug based on purified IL-2 obtained by known methods.
  • the yeast producers of IL-2 are known, can be obtained at depositories or created anew.
  • the most common yeast producer is Sassarotus servisiuse, such producers can be any other non-pathogenic yeast, for example Sassharotus bilardi or yeast of the genus Rischia, e.g. .
  • the technology for producing recombinant plasmids containing the IL-2 gene, in particular human IL-2, is well known.
  • the technology for preparing strains containing such recombinant plasmids is also well known.
  • an example of a yeast producer of human IL-2 is the strain of Sassharotus servisiae, deposited in the All-Union Collection of Industrial Microorganisms under the number Y-791. This strain is a producer of human IL-2.
  • the design of the expression vector introduced into the yeast strain is such that the cells do not secrete the target protein. Any other strain producing heterologous IL-2 can also be used.
  • the optimal conditions under which the synthesis of IL-2 will occur are known.
  • the synthesis of IL-2 may be constitutive or require induction or derepression, which is determined by the genetic design of the producer strain.
  • the specialist is able to choose the cultivation conditions that will lead to the culture of yeast cells in which IL-2 is synthesized.
  • the synthesis of IL-2 is inhibited by the presence of phosphate in the culture medium.
  • a second medium Sd2 medium or PEP medium (peptone 20 g / l, glucose 20 g / l) can be used for cultivation.
  • the cells can be separated from the culture medium by centrifugation or filtration. All further manipulations are carried out with the cells, and the culture medium is discarded.
  • strain Y-791 receive, as a rule, from 8 to 12 g of cells per 1 liter of culture medium.
  • the resulting biomass can also be used immediately or frozen, in order to be used later in the proposed method. It was noted that a preparation containing intact cells possesses only trace activity of IL-2 in comparison with a preparation from destroyed cells.
  • Destruction of yeast cells can be carried out by any known methods that ensure the preservation of the target protein.
  • physical methods for example, using a high-speed grinder with glass balls, using high pressure, by the method of freezing and thawing.
  • the preservation of the target product is achieved by adding protease inhibitors to the suspension of destructible cells so that the proteases released during the destruction of yeast cells do not destroy IL-2.
  • An enzymatic method of destruction of yeast cells is also possible if it is possible to avoid the proteolytic effect of the used agent on the target protein.
  • Ensuring the safety of the target product is also achieved by carrying out the method at low temperatures, for example, at temperatures from +2 to +8 0 C, in particular at + 4 ° C.
  • An example of a high-speed shredder with glass balls is the DupoMill disintegrator.
  • the destruction is preferably carried out at a temperature of from +2 to +10 0 C and a screw rotation speed of from 4000 to 6000 rpm.
  • Phenylmethylsulfonyl fluoride is traditionally used as an inhibitor of yeast proteases; however, it can be used any other inhibitor or cocktail of protease inhibitors. It is enough to use PMSF in an amount of 1 mM, however, another suitable amount of a protease inhibitor can be used, which can be established by monitoring the content of IL-2 in the preparation by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the separation of the water-insoluble fraction is carried out by centrifugation. In this case, almost all water-soluble components of yeast cells pass into the supernatant (supernatant), which is discarded, and water-insoluble components remain in the sediment. Centrifugation removes proteases, soluble proteins, RNA, chromosomal and plasmid DNA, etc.
  • the separation of the water-insoluble fraction can be carried out by other available methods, in particular, filtration. It is advisable to carry out centrifugation at low temperatures, for example, at +4 0 C, and rotor speed from 4000 to 10000 thousand rpm.
  • a water-insoluble fraction it is possible to carry out additional processing of a water-insoluble fraction to more completely remove water-soluble components, namely, rinse it with a buffer solution.
  • a buffer solution 0.005 M Tris-HCl buffer solution, pH 7.2 can be used.
  • the dried preparation contains the remains of the yeast shells together with the target protein.
  • the stages of extraction of the target protein from the water-insoluble fraction are excluded, which is an unexpected decision in the art, since usually a lot of effort is concentrated at this stage. All water-insoluble components preserved in the preparation not only do not prevent the preparation from manifesting its target properties under certain conditions, but sometimes also potentiate these properties. Lyophilization drying is usually used, but any other suitable methods can also be used.
  • the water-insoluble fraction Before treatment with acetone, the water-insoluble fraction can be pre-washed with a buffer solution.
  • Acetone treatment is as follows. A suspension in water is prepared from the water-insoluble fraction and mixed with acetone by pouring the suspension into acetone with stirring. The ratio of the volume of the aqueous suspension and acetone is from 1: 5 to 1: 20, mainly 1: 10. The suspension should have a sufficient density of about 60-80%, preferably 75%. Treatment with acetone is carried out at a temperature of -2O 0 C.
  • the destroyed yeast cells thus dehydrated are separated from acetone by vacuum filtration or centrifugation at a temperature of from -10 0 C to -30 0 C and revolutions from 2000 to 5000 rpm.
  • the resulting pellet of destroyed yeast cells can be washed with two to ten times (preferably five times) volume of acetone and again separated from acetone by vacuum filtration or centrifugation at a temperature of from -10 0 C to -30 0 C and revolutions from 2000 to 5000 rpm.
  • the precipitate is dried in a fume hood at room temperature for 20 to 30 hours. Acetone dehydrates the cell preparation; therefore, freeze drying is not required to obtain a dry preparation.
  • the preparation is prepared as a composition of a dried water-insoluble fraction of destroyed cells and a dry solubilizer.
  • a solubilizer is a substance that promotes the dissolution of water-insoluble substances in water. Recombinant IL-2, synthesized inside the yeast cell, is water insoluble and bound to the cell wall. It was found that the solubilizer also allows you to separate IL-2 from the cell wall.
  • sodium dodecyl sulfate, lauryl sarcosinate, deoxycholate, urea, Triton-X100 can be used. If sodium dodecyl sulfate is used as a solubilizer, it is added in an amount of 4.0% up to 20.0% by weight of the dry water-insoluble fraction, preferably 12%.
  • the preparation of IL-2 When the preparation of IL-2 is presented as a composition of a dried water-insoluble fraction of destroyed cells and a solubilizer, it can be prepared for use by adding water. It is enough to add from 1 to 10 ml, preferably 5 ml, of water to 100 mg of the drug. A dry preparation can be stored at temperatures from +4 to -20 0 C for 2 years without the addition of special stabilizing or preserving components. Adding water to the drug should be carried out immediately before use.
  • the method according to the invention can, in particular, be carried out in one of the following options: destruction of yeast cells, separation of the water-insoluble fraction and its drying; or destruction of yeast cells, separation of a water-insoluble fraction, washing and drying of this fraction; or destruction of yeast cells, separation of the water-insoluble fraction, possibly washing it, treating with acetone to remove the acetone fraction and drying the residue; in any of the options, it is preferable, after drying, to prepare the preparation in the form of a composition with a dry solubilizer.
  • the biological activity of the obtained IL-2 preparation can be assessed in an international standard test with a culture of IL-2-dependent tumor-specific cytotoxic T-lymphocytes of the mouse CTLL-2 line (Hammagliipg U. et al. "Development apd validatiop bioassau for interleukin-2". / J. Rhartaseut. & Bioshet. Apalysis, - 1992. - vol. 10. - p. 547. Gearing AJ. H. apt Thorre R. / J. Immopol. Methods. - 1984. - vol. 74. - p. 39). Biologically active recombinant IL-2 should stimulate the proliferation of these cells.
  • the amount of IL-2 can be determined by any standard method for determining the target protein, for example, by the method of polyacrylamide gel electrophoresis (Laemli U. "Cleavage /11f strutimetural ITAot Food ⁇ s duri ⁇ g ⁇ réelle mattersss,mblêt redesignf t Food head THERf b Vintaget Food für Congress impart founded. 22. - p. 680-685) or using an enzyme-linked immunosorbent assay (Gehmap L.O. and Robb RJ. "An ELLSA-based assau forquapitatiopof humap interleukin-2.” // J. Immopolit. Methods. - 1984. - vol. .74. - p. 39), and others.
  • the method of the invention can alternatively include, consist of or essentially consist of any suitable steps disclosed herein, and such a method of the invention can additionally or alternatively exclude any step or object that is used in the method known from the prior art, or which is not necessary to achieve the technical result of the present invention.
  • preparation according to the invention which in principle can alternatively include, consist or essentially consist of any suitable components disclosed in this description, and such a preparation according to the invention can additionally or alternatively be prepared so that it is excluded from which any component, material, ingredient or object that is used in a preparation known from prior art, or which is not necessary to achieve the technical result of the present invention.
  • the ratio of cell mass to volume of Sd1 medium is approximately 0.2 g to 1 liter.
  • the inoculum thus obtained is transferred to a tenfold larger volume of medium
  • cells are separated from the culture medium by centrifugation. Receive 10 g of cells from 1 l of culture medium. All further manipulations are carried out with the cells, and the culture medium is discarded.
  • composition of the nutrient medium Sd2 The composition of the nutrient medium Sd2
  • step 1.2 The suspension obtained in step 1.2. Is centrifuged at a temperature of + 4 ° C and a rotor speed of 10,000 rpm for 45 minutes. The supernatant is discarded.
  • the precipitate is dried in an apparatus for freeze drying for 24 hours. 100 mg of lamellar vitreous and rather fragile grayish-beige lyophilisate are obtained from 1 gram of grown cells.
  • Stage 1.1.-1.3 from Example 1 is carried out. Next, the precipitate is washed with 0.005 M Tris-HCl buffer solution, pH 7.2, and then centrifuged again at a temperature of +4 0 C and a rotor speed of 10,000 rpm. The supernatant is discarded. Next, carry out the stage, as described in 1.4.
  • Stage 1.1.-1.3 from Example 1 is carried out.
  • the precipitate is washed with 0.005 M Tris-HCl buffer solution, pH 7.2, and then centrifuged again at a temperature of +4 0 C and a rotor speed of 10,000 rpm.
  • the supernatant is discarded.
  • a 75% suspension of the obtained pellet of destroyed cells is prepared in water cooled to +4 0 C, for example, 0.3 ml of water is added to 1 g of pellet.
  • the suspension is prepared in an ice bath.
  • all dishes and acetone are cooled to a temperature of -10 0 C to -30 0 C.
  • the ratio of the volume of the suspension to acetone is 1: 10, for example, 10 ml of acetone is required for 1 ml of suspension.
  • a suspension of destroyed yeast cells is slowly poured into acetone and homogenized for 5 minutes.
  • destroyed yeast cells are separated from acetone by filtration at a temperature of from -10 0 C to -30 0 C. Wash the resulting pellet of destroyed yeast cells with a five-fold volume of acetone and again filter it at a temperature of from -1O 0 C to -30 0 C.
  • the precipitate is transferred to an enamel container and dried in a fume hood at room temperature for 18 hours.
  • Example 5 Adding water.
  • Example 6 Preparation of the suspension to determine the quantity and activity of IL-2.
  • the suspension obtained in example 5 is centrifuged for 5 minutes at
  • Example 7 Polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate.
  • test solutions of bovine serum albumin are also added to the gel to build calibration line in quantities of 1, 2, 4, 6 and 8 ⁇ g per well, as well as molecular weight markers of proteins 94, 67, 43, 30, 20.1 and 14.4 kfl.
  • the analysis of the electrophoregram confirms the presence in the sample of IL-2 with a molecular weight of 15.3 kDa (compared with the molecular weight markers of proteins) and allows you to determine the amount of IL-2 using a calibration line for bovine serum albumin.
  • Example 8 The biological activity of the obtained drug IL-2
  • a sample of IL-2 calibrated according to the international reference reagent is stored at -70 0 C and thawed only once.
  • 100 ⁇ l of washed 1640 CTLL-2 cells washed with RPMI medium (1x10 5 live cells per ml) are added and the plate is closed with a loose cap. Incubated at 37 ° C for 42 hours. In samples containing IL-2, proliferation of CTLL-2 cells takes place. After incubation, 10 ⁇ l of MTT solution is added to each well and incubated for another 6 hours. In viable cells stimulated by IL-2, water-insoluble dark blue formazan crystals form.
  • the plates are centrifuged for 5 minutes at 2000 rpm and the supernatant is removed from the wells by sharp shaking of the liquid. 100 ⁇ l of DMSO is added to each well and the plates are shaken on a shaker until crystals of formazan are completely dissolved (about 15 minutes). Based on spectrophotometric data for the standard and test samples, the activity of IL-2 in the extract is calculated, its activity is calculated per 100 mg of powder, which is, on average, 4-5 million
  • Example 9 The treatment of food allergies with the preparation of Example 3.
  • the preparation of Example 4 in an amount of 100 mg was diluted with 5 ml of water and given to a patient suffering from a green apple allergy.
  • the course of treatment was 5 days according to the scheme: contact with the allergen was made every other day, however, at the time of the onset of allergic symptoms, the patient took the composition according to the invention.
  • Contact with a green apple and taking the drug according to the invention was carried out 3 times.
  • the drug obtained by the method according to the invention was successful in the treatment of the disease, which before its creation could not be completely cured, since all the drugs known so far have offered only symptomatic treatment.
  • the treatment of food allergies by some previously known recombinant IL-2-based drugs has also not been carried out since it was assumed that it will either be ineffective or the side effects inherent in these drugs will exceed the expected benefits.
  • Example 10 Monotherapy of HIV infection using the drug from example 4.
  • the first two courses were carried out with the drug "Roncoleukin ® dry for injection” (Biotech, Russia), which is a purified protein, the second two courses with the drug obtained by the method according to the invention, taken orally.
  • a significant improvement in the dynamics of the CD4 + content when using the drug obtained by the method according to the invention, compared with pure IL-2 for injection, can be caused by the fact that the drug according to the invention has the property not only to enhance the proliferation of cells of the immune system, but also has the ability to activate them , since it is precisely the absence of an activation factor that sometimes leads to a lack of effect from the administration of IL-2.
  • the drug obtained by the method according to the invention, along with biologically active interleukin-2 also contains a set of adjuvant-type substances that allow using this drug in case of treatment failure using pure IL-2.
  • the preparation was obtained in a technologically advanced way; the method for its preparation does not require excessive expenditures of time and special equipment.
  • the resulting preparation is active when administered orally.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИHTEPЛEЙKИHA-2 И ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ
Изобретение относится к области получения иммуномодулирующих лекарственных средств биотехнологическими методами и может быть использовано в фармацевтической промышленности. В частности, данное изобретение относится к способу получения препарата интepлeйкинa-2.
Такой препарат может быть использован в целях иммуноориентированной терапии, и, в частности, при лечении онкологических, инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний.
История открытия интepлeйкинa-2 (ИЛ-2) начинается с 1960-х годов, когда многочисленные исследования iп vitrо показали, что активированные лимфоциты выделяют медиатор, стимулирующий множество иммунных реакций iп vitrо и iп vivо. Лишь в 1976 году этот медиатор идентифицировали как Т-клеточный ростовой фактор, получивший в 1979 году название ИЛ-2. Разработанные технологии получения его в культуре активированных лимфоцитов человека и очистки позволили получить первые препараты ИЛ-2 для исследовательских и клинических целей. Эти препараты получили название "лимфоцитарный" или "натуральный" ИЛ-2. В то же время, ограниченные возможности масштабирования его производства не позволили его широко использовать до 1983 года, когда были разработаны технологии получения рекомбинантных белков, в частности, ИЛ-2, с использованием генной инженерии и биотехнологии. Известны способы получения препаратов ИЛ-2 из донорской крови. Однако, препарат, содержащий компоненты крови человека, относится к потенциально опасным.
Известны также генноинженерные способы получения ИЛ-2. Многочисленные фирмы (Сеtus Соrр., Аmgеп, Iпс, Ноffmап-Lа Rосhе, Iпс.) использовали методы генной инженерии и биотехнологии для получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве лекарственного препарата для лечения разных типов онкологических заболеваний. В одном из способов получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве продуцента используют Е.соli (кишечную палочку). Кишечная палочка представляет собой условно-патогенную флору. Поэтому препараты ИЛ-2 из Е.соli требуют тщательной очистки и могут быть токсичными. Дрожжевые клетки являются более привлекательными продуцентами гетерологичного ИЛ-2.
Известен (EP 0162898 A1 , опубликованный 04.12.1985) способ получения препарата ИЛ-2 с использованием дрожжевого продуцента. В этом способе ИЛ-2 секретируется в культуральную среду и затем должен быть выделен из культуральной среды с помощью хроматографии, фильтрации, экстракции и т.п. Недостатком указанного способа является то, что секретируемые дрожжами белки гликозилируюfся, т.е. в их структуре в процессе секреции появляются дрожжевые углеводные остатки. Такие гликопротеины являются сильно иммуногенными для человека, что создает проблемы при дальнейшем применении их в терапии, например, накопление у человека антител к таким гликозилированным белкам.
Известен также (EP 0152358, опубликованный 21.08.1985) способ получения препарата ИЛ-2, при котором разрушают клетки дрожжевой культуры, в которой был осуществлен синтез ИЛ-2, центрифугируют эти разрушенные клетки, обрабатывают осадок, полученный в результате центрифугирования, раствором додеци л сульфата натрия, для того, чтобы перевести ИЛ-2 в жидкую фазу, и экстрагируют ИЛ-2 из жидкой фазы. Экстракция ИЛ-2, осуществляемая в данном способе, является трудоемкой операцией и требует значительных затрат времени, оборудования и/или реактивов. В целом, все известные до сих пор препараты рекомбинантного ИЛ-2 являются чрезвычайно дорогими, и существенный вклад в их стоимость вносит технология их выделения из клеток-продуцентов.
Задачей данного изобретения является создание более технологичного способа получения препарата ИЛ-2, который позволил бы получить препарат, не уступающий по активности и терапевтическим возможностям известным препаратам, при этом обеспечивающий возможность масштабного производства и не слишком высокой себестоимости.
Задача решается тем, что предложен способ получения препарата интepлeйкинa-2, при котором с обеспечением сохранности целевого белка разрушают клетки дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2) и который не секретирует этот целевой белок, и отделяют водонерастворимую фракцию, причем в препарате сохраняют водонерастворимые компоненты разрушенных клеток. В частности, в данном способе дрожжевой продуцент представляет собой штамм Sассhаrотусеs сеrеvisiае, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791 , который является продуцентом человеческого интepлeйкинa-2. Вопреки сложившемуся мнению о необходимости тщательной очистки рекомбинантного белка, авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что сохранение остатков клеточных стенок дрожжей в препарате рекомбинантного ИЛ-2 не только позволяет упростить его схему производства и получить более дешевый препарат, но также позволяет получить очень эффективный препарат, терапевтические свойства которого в некоторых ситуациях превосходят свойства известных препаратов ИЛ-2. Осуществление способа получения препарата без экстракции (перевода) ИЛ- 2 в жидкую фазу и его последующей экстракции из жидкой фазы приводит к неожиданному для такого исключения стадии результату. Результатом способа является не плохо очищенный продукт, а совершенно новый препарат ИЛ-2. Сохранившиеся в препарате остатки нерастворимой фракции клеточных стенок дрожжей не только не препятствуют эффекту ИЛ-2, но и служат своего рода адъювантом, то есть вспомогательным веществом, стимулирующим активацию Т-клеточного звена иммунитета млекопитающих. Перевод водонерастворимого ИЛ-2 в жидкую фазу с его последующей экстракцией считался до момента создания данного изобретения совершенно необходимым, и усилия разработчиков ранее были направлены на разработку способов улучшения очистки. После создания данного изобретения становится ясно, что препарат ИЛ-2 следут получать без отделения от водонерастворимой фракции клеточных стенок дрожжей, и усилия далее могут быть сосредоточены на улучшении качества самой фракции клеточных стенок. В препарате, полученном таким способом, ИЛ-2 находится в неактивной форме, что обеспечивает возможность его длительного хранения. Для активации ИЛ-2 к препарату необходимо добавить солюбилизатор и воду. Целесообразно разрушать клетки в присутствии ингибиторов протеаз, так как именно протеазы, освобождающиеся при разрушении дрожжевых клеток, могут явиться причиной разрушения целевого белка.
Предпочтительно разрушать клетки с помощью высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками в присутствии ингибиторов протеаз, так как в этом случае достигается хорошая степень разрушения клеток и не происходит разрушение целевого продукта. В предпочтительном случае после отделения водонерастворимой фракции ее промывают для более полного удаления водорастворимых компонентов. При этом происходит более полное удаление водорастворимых протеаз, других дрожжевых белков, РНК, хромосомной и плазмидной ДНК и др. Предпочтительно отделенную водонерастворимую фракцию высушивают. Высушивание может быть осуществлено сразу после отделения или после промывания.
В более препочтительном случае после отделения водонерастворимой фракции ее обрабатывают ацетоном с последующим удалением ацетоновой фракции. При этом разрушенные дрожжевые клетки обезвоживаются. Эта стадия позволяет также избавиться от липидных составляющих водонерастворимой фракции, что приводит к получению препарата с улучшенными физическими свойствами, он удобен в обращении и приятнее при терапевтическом применении. При указанной обработке ацетоном готовят суспензию водонерастворимой фракции в воде, приливают эту суспензию к ацетону при соотношении объемов суспензии и ацетона от 1:5 до 1 :20, предпочтительно 1 :10, с получением суспензии в ацетоне, фильтруют полученную суспензию и оставшийся на фильтре остаток высушивают. Перед обработкой ацетоном водонерастворимую фракцию можно промыть, то есть промывку осуществляют после отделения водонерастворимой фракции перед приготовлением ее суспензии в воде. В предпочтительном воплощении способа после стадии высушивания водонерастворимой фракции к этой высушенной фракции добавляют сухой солюбилизатор. Таким образом, получают препарат в виде композиции высушенной водонерастворимой фракции и солюбилизатора. В препарате, полученном таким способом, ИЛ-2 также находится в неактивной форме, что обеспечивает возможность его длительного хранения. Для активации ИЛ-2 к такому препарату необходимо добавить воду. При таком добавлении концентрация солюбилизатора' в растворе становится оптимальной, что обеспечивает образование правильной конформации белка и получение препарата, обладающего биологической активностью. Целесообразно в качестве солюбилизатора использовать додецилсульфат натрия.
В одном из воплощений способа при получении препарата ИЛ-2 после добавления солюбилизатора добавляют воду. При таком способе получают препарат, в котором ИЛ-2 является активным, находится в оптимальной конформации и готов к непосредственному использованию.
Согласно изобретению также предлагается препарат интepлeйкинa-2, полученный вышеописанным способом в любом из его возможных вариантов. Полученный препарат имеет меньшую себестоимость и может использоваться в терапии перорально, что всегда с точки зрения пациента является более предпочтительным. Неожидано также обнаружилось, что такой препарат проявляет терапевтические эффекты, превосходящие эффекты препарата на основе очищенного ИЛ-2, получаемого известными способами. На современном этапе развития биотехнологии и генной инженерии дрожжевые продуценты ИЛ-2 известны, могут быть получены в депозитариях или созданы заново. Хотя наиболее распространенным дрожжевым продуцентом является Sассhаrотусеs сеrеvisiае, такими продуцентами могут быть любые другие непатогенные дрожжи, например Sассhаrотусеs bиlаrdi или дрожжи рода Рiсhiа, например, Рiсhiа раstоris, рода Кlиуvеrотусеs, например, Кlиуvеrотусеs lасtis, рода Напsепиlа, например, Напsепиlа роlутоrрhа, и тому подобные. Технология получения рекомбинантных плазмид, содержащих ген ИЛ-2, в частности человеческого ИЛ-2, хорошо известна. Также хорошо известна технология получения штаммов, содержащих такие рекомбинантные плазмиды. В частности, примером дрожжевого продуцента человеческого ИЛ-2 является штамм дрожжей Sассhаrотусеs сеrеvisiае, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791. Этот штамм является продуцентом человеческого ИЛ-2. Конструкция вектора экспрессии, введенного в штамм дрожжей, такова, что клетки не секретируют целевой белок. Может быть использован также любой другой штамм, продуцирующий гетерологичный ИЛ-2.
Для каждого штамма-продуцента известны оптимальные условия, в которых будет происходить синтез ИЛ-2. Синтез ИЛ-2 может быть конститутивным или требовать индукции или дерепрессии, что определяется генетической конструкцией штамма-продуцента. В общем, с учетом особенностей выбранного штамма, специалист способен выбрать условия культивирования, которые приведут к получению культуры дрожжевых клеток, в которых синтезирован ИЛ-2. В частности, штамм Y-791 сначала выращивают с подавлением синтеза ИЛ-2 на минимальной минеральной среде ScM с гистидином до достижения оптической плотности ОDбоо от 2,5 до 4,0, предпочтительно ODбoo= 3,0. Синтез ИЛ-2 подавляется наличием в среде культивирования фосфата. Затем пересевают полученный инокулят в больший объем второй среды для культивирования, в которой синтез ИЛ-2 дерепрессирован, и культивируют до достижения фазы раннего стационара, то есть до оптической плотности OD6Oo от 6,0 до 9,0, предпочтительно OD6oo= 7,5. В качестве второй среды для культивирования можно использовать среду Sd2 или среду ПЕП (пептон 20 г/л, глюкоза 20 г/л).
По окончании культивирования клетки можно отделить от культуральной среды центрифугированием или фильтрованием. Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают. При использовании штамма Y-791 получают, как правило, от 8 до 12 г клеток на 1 литр питательной среды.
Полученную биомассу также можно использовать сразу или заморозить, для того чтобы использовать в дальнейшем в предложеном способе. Отмечено, что препарат, содержащий неразрушенные клетки, обладает лишь следовой активностью ИЛ-2 по сравнению с препаратом из разрушенных клеток.
Разрушение дрожжевых клеток можно осуществлять любыми известными способами, обеспечивающими сохранение целевого белка. В частности физическими способами, например с использованием высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками, с использованием высокого давления, методом замораживания - оттаивания. При этом обеспечение сохранности целевого продукта достигается добавлением к суспензии разрушаемых клеток ингибиторов протеаз, чтобы протеазы, выделяющиеся при разрушении дрожжевых клеток, не разрушили ИЛ-2. Ферментативный способ разрушения дрожжевых клеток также возможен, если удастся избежать протеолитического действия используемого агента на целевой белок. Обеспечение сохранности целевого продукта достигается также проведением способа при пониженных температурах, например при температурах от +2 до +80C, в частности, при +4°C.
Примером высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками является дезинтегратор DупоМill. Разрушение предпочтительно приводить при температуре от +2 до +100C и скорости вращения шнэка от 4000 до 6000 об/мин.
В качестве ингибитора дрожжевых протеаз традиционно используется фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), однако, может быть использован любой другой ингибитор или коктейль ингибиторов протеаз. Достаточно использовать ФМСФ в количестве 1мM, однако, может быть использовано иное подходящее количество ингибитора протеаз, которое может быть установлено по результатам контроля содержания ИЛ-2 в препарате методом электрофореза в полиакриламидном геле.
Отделение водонерастворимой фракции осуществляется с помощью центрифугирования. При этом практически все водорастворимые компоненты дрожжевых клеток переходят в надосадочную жидкость (супернатант), который отбрасывается, а в осадке остаются водонерастворимые компоненты. При центрифугировании удаляются протеазы, растворимые белки, РНК, хромосомная и плазмидная ДНК и т.п. Отделение водонерастворимой фракции может быть осуществлено и другими доступными методами, в частности, фильтрацией. Центрифугирование целесообразно осуществлять при пониженных температурах, например при +40C, и скорости вращения ротора от 4000 до 10000 тысяч об/мин.
В предлагаемом способе можно осуществить дополнительную обработку водонерастворимой фракции для более полного удаления водорастворимых компонентов, а именно промыть ее буферным раствором. В качестве такого буферного раствора можно использовать 0,005 M трис-НСI буферный раствор, рН 7,2.
Препарат целесообразно высушить. Высушивание препарата осуществляют для обеспечения возможности его хранения до последующего использования. В высушенном препарате находятся остатки дрожжевых оболочек вместе с целевым белком. В данном способе исключены стадии экстракции целевого белка из водонерастворимой фракции, что является неожиданным решением в данной области техники, так как обычно масса усилий сосредоточена именно на этой стадии. Все сохранившиеся в препарате водонерастворимые компоненты не только не препятствуют проявлению препаратом при определеных условиях своих целевых свойств, но иногда также потенцируют эти свойства. Обычно применяют сушку лиофилизацией, но можно также использовать любые другие подходящие методы.
В предлагаемом способе можно также осуществить дополнительную обработку водонерастворимой фракции ацетоном. Перед обработкой ацетоном водонерастворимую фракцию можно предварительно промыть буферным раствором. Обработка ацетоном заключается в следующем. Из водонерастворимой фракции готовят суспензию в воде, и смешивают ее с ацетоном путем вливания суспензии в ацетон при перемешивании. Соотношение объемов водной суспензии и ацетона составляет от 1 :5 до 1 :20, преимущественно 1 :10. Суспензия должна иметь достаточную густоту, примерно, 60-80%, предпочтительно 75%. Обработку ацетоном проводят при температуре -2O0C. Отделяют обезвоженные таким образом разрушенные дрожжевые клетки от ацетона путем вакуумной фильтрации либо центрифугированием при температуре от -100C до -300C и оборотах от 2000 до 5000 об/мин. Полученный осадок разрушенных дрожжевых клеток можно промыть двух - десятикратным (предпочтительно, пятикратным) объемом ацетона и вновь отделить от ацетона вакуумной фильтрацией либо центрифугированием при температуре от -100C до -300C и оборотах от 2000 до 5000 об/мин. Осадок сушат в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 20 - 30 часов. Ацетон обезвоживает препарат клеток, поэтому для получения сухого препарата не требуется лиофильная сушка. В одном из воплощений способа препарат готовят в виде композиции высушенной водонерастворимой фракции разрушенных клеток и сухого солюбилизатора. Солюбилизатор представляет собой вещество, которое способствует растворению в воде водонерастворимых веществ. Рекомбинантный ИЛ-2, синтезируемый внутри дрожжевой клетки, является водонерастворимым и связан с клеточной стенкой. Было обнаружено, что солюбилизатор также позволяет отделить ИЛ-2 от клеточной стенки. В качестве солюбилизатора могут быть использованы додецилсульфат натрия, лаурилсаркозинат, дезоксихолат, мочевина, Triton-X100. Если в качестве солюбилизатора используется додецилсульфат натрия, его добавляют в количестве от 4,0% до 20,0% от массы сухой водонерастворимой фракции, предпочтительно 12%.
Когда препарат ИЛ-2 представлен в виде композиции высушенной водонерастворимой фракции разрушенных клеток и солюбилизатора, он может быть подготовлен к применению путем добавления воды. Достаточно к 100 мг препарата добавить от 1 до 10 мл, предпочтительно 5 мл, воды. Сухой препарат может храниться при температуре от +4 до -200C в течение 2 лет без добавления специальных стабилизирующих или консервирующих компонентов. Добавление воды к препарату должно осуществляться непосредственно перед употреблением.
При желании в препарат можно добавить стабилизаторы, антиоксиданты, наполнители или другие вещества, которые позволят придать препарату удобную фармацевтическую форму. Таким образом, способ по изобретению может быть, в частности, осуществлен в одном из следующих вариантов: разрушение клеток дрожжей, отделение водонерастворимой фракции и ее высушивание; либо разрушение клеток дрожжей, отделение водонерастворимой фракции, промывание и высушивание этой фракции; либо разрушение клеток дрожжей, отделение водонерастворимой фракции, возможно, ее промывание, обработка ацетоном с удалением ацетоновой фракции и высушивание остатка; в любом из вариантов предпочтительно после высушивания приготовить препарат в виде композиции с сухим солюбилизатором. Оценку биологической активности полученного препарата ИЛ-2 можно провести в международном стандартном тесте с культурой ИЛ-2-зaвиcимыx опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Наmmегliпg U. еt аl. «Development апd vаlidаtiоп biоаssау fоr interleukin-2». // J. Рhаrтасеut. & Вiосhет. Апаlуsis, - 1992. - vоl. 10. - р.547. Gearing AJ. H. апd Тhоrре R. «The iпtеmаtiопаl stапdаrd fоr humап iпterleukiп-2. Саlibrаtiоп bу iпtеmаtiопаl соllаbоrаtivе study.» // J. Immuпоl. Меthоds. - 1984. - vоl. 74. - р.39). Биологически активный рекомбинантный ИЛ-2 должен стимулировать пролиферацию этих клеток. Определение биологической активности проводят с использованием колориметрического метода с тетразолиевым красителем MTT. Жизнеспособные клетки, стимулированные ИЛ-2, поглощают краситель и накапливают в цитоплазме нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана (восстановленный MTT). После удаления культуральной среды и полного растворения кристаллов в диметилсульфоксиде измеряют оптическую плотность полученного раствора на компьютеризованном фотометре при длине волны 530 и 690 нм. Тёмно- синее окрашивание раствора в пробах, содержащих ИЛ-2, должно быть зависимым от концентрации ИЛ-2, внесённого в культуральную среду. Сравнивая оптическую плотность пробы и стандарта активности ИЛ-2, определяют биологическую активность ИЛ-2 в инкубационной пробе. Количество ИЛ-2 можно определить любым стандартным способом определения целевого белка, например, методом электрофореза в полиакриламидном геле (Lаеmmli U. "Сlеаvаgе оf struсturаl рrоtеiпs duriпg thе аssеmblу оf thе hеаd оf bасtеriорhаgе T4". // Nаturе. - 1970. - 227. - р. 680-685) или с применением иммуноферментного анализа (Gеhmап L.О. and Robb RJ. "An ЕLlSА-bаsеd аssау fоr quапtitаtiоп оf humап interleukin-2." // J. Immuпоl. Меthоds. - 1984. - vol.74. - р.39), и др.
В общем, способ по изобретению альтернативно может включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих стадий, раскрытых в данном описании, и такой способ по изобретению может дополнительно или альтернативно исключать какую-либо стадию или объект, который использован в способе, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения.
То же самое касается препарата по изобретению, который в принципе альтернативно может включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих компонентов, раскрытых в данном описании, и такой препарат по изобретению может дополнительно или альтернативно быть приготовлен так, что из него исключен какой-либо компонент, материал, ингредиент или объект, который использован в препарате, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения.
Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают данное изобретение.
Пример 1. Получение препарата интepлeйкинa-2
1.1. Получение биомассы дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2)
Берут аликвоту штамма дрожжей Sассhаrоmусеs сеrеvisiае Y-791 , хранящуюся при -700C в глицерине, и засевают в питательную среду Sd1 , содержащую 50 мг/л гистидина. Состав среды Sd1 : 0,67% Yеаst пitrоgеп bаsе
("Difсо Lаbоrаtогiеs", Dеtrоit, Ml), 2% глюкозы. Соотношение массы клеток к объему среды Sd1 приблизительно составляет 0,2 г к 1 литру.
Культивирование в среде Sd1 ведут до значения оптической плотности OD6oo от 2,5 до 4,0, предпочтительнее OD6oo =3,0.
По достижении требуемого значения оптической плотности переносят полученный таким образом инокулят в десятикратно больший объем среды
Sd2 и ведут культивирование до значения OD6oo = 7,5.
По окончании культивирования в среде Sd2 клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием. Получают 10 г клеток из 1 л питательной среды. Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают.
Состав питательной среды Sd2
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
1.2. Разрушение клеток дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2)
Готовят 50%-нyю суспензию клеток клеток на буферном растворе А с добавлением ФМСФ (фенилметилсульфонилфторида) до конечной концентрации 1 mМ. Раствор А представляет собой 0,005 M трис-НСI буферный раствор, рН 7,2. Проводят разрушение дрожжевых клеток на дезинтеграторе Dyno MiII при температуре от +2 до +100C и скорости вращения шнэка 3000 об/мин. Суспензию разрушенных клеток собирают в стаканы для центрифугирования. 1.3. Отделение водонерастворимой фракции
Суспензию, полученную на стадии 1.2., центрифугируют при температуре +4°C и скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 45 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают.
1.4. Высушивание водонерастворимой фракции
Осадок сушат в апарате для лиофильной сушки в течение 24 часов. Из 1 грамма выращенных клеток получают 100 мг пластинчатого стекловидного и довольно хрупкого лиофилизата серовато-бежевого цвета.
Пример 2. Получение препарата интepлeйкинa-2
Осуществляют стадии 1.1.-1.3 из примера 1. Далее осадок промывают 0,005 M трис-НСI буферным раствором, рН 7,2, после чего вновь центрифугируют при температуре +40C и скорости вращения ротора 10000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Далее осуществляют стадию, как описано в 1.4.
Пример 3. Получение препарата интepлeйкинa-2
Осуществляют стадии 1.1.-1.3 из примера 1. Осадок промывают 0,005 M трис-НСi буферным раствором, рН 7,2 , после чего вновь центрифугируют при температуре +40C и скорости вращения ротора 10000 об/мин.
Надосадочную жидкость отбрасывают.
Готовят 75% суспензию полученного осадка разрушенных клеток на охлажденной до +40C воде, например, к 1 г осадка добавляют 0,3 мл воды. Приготовление суспензии проводят в ледяной бане.
Для проведения дальнейших манипуляций всю посуду и ацетон охлаждают до температуры -100C до -300C. Соотношение объемов суспензии и ацетона составляет 1 :10, например, для 1 мл суспензии требуется 10 мл ацетона.
Суспензию разрушенных дрожжевых клеток медленно вливают в ацетон и гомогенизируют в течение 5 минут.
Затем отделяют разрушенные дрожжевые клетки от ацетона фильтрованием при температуре от -100C до -300C. Промывают полученный осадок разрушенных дрожжевых клеток пятикратным объемом ацетона и вновь подвергают фильтрованию при температуре от -1O0C до -300C.
Осадок переносят в эмалированную емкость и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 18 часов.
В результате из 10 г сырых клеток дрожжей получают 1 г высушенного осадка разрушенных дрожжевых клеток в виде тонкого однородного беловато-бежевого порошка.
Пример 4. Добавление солюбилизатора
К 1 г порошка, полученного в примере 3, добавляют 120 мг додецилсульфата натрия (ДСН) и перемешивают.' Препарат, полученный на этой стадии, для применения требует добавления воды.
Пример 5. Добавление воды.
К 100 мг препарата, полученного в примере 4, добавляют 5 мл воды и перемешивают до получения суспензии.
Пример 6. Подготовка суспензии к определению количества и активности ИЛ- 2.
Суспензию, полученную в примере 5, центрифугируют в течение 5 минут при
10000 об/мин и отбирают супернатант, т.е. экстракт. Осадок отбрасывают.
Для анализа полученного экстракта на специфическую активность и количественное содержание pИЛ-2 отбирают его аликвоту, например, 10 мкл. Наличие и количество ИЛ-2 в полученном экстракте подтверждают методом электрофореза, а его биологическую активность - в стандартном тесте на линии клеток CTLL-2.
Пример 7. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
Помимо пробы экстракта для определения концентрации ИЛ-2 в гель также вносят тест-растворы бычьего сывороточного альбумина для построения калибровочной прямой в количествах 1 , 2, 4, 6 и 8 мкг в лунку, а также маркеры молекулярных масс белков 94, 67, 43, 30, 20.1 и 14.4 кflа. Анализ электрофореграммы подтверждает присутствие в пробе ИЛ-2 с молекулярной массой 15,3 кДа (по сравнению с маркерами молекулярных масс белков) и позволяет определить количество ИЛ-2, используя калибровочную прямую по бычьему сывороточному альбумину.
Пример 8. Биологическая активность полученного препарата ИЛ-2
В качестве стандарта для определения активности испытываемого ИЛ-2 в экстракте, полученном в примере 6, используют откалиброванный по международному эталонному реагенту образец ИЛ-2, хранящийся при температуре -700C и размораживаемый только один раз. Во все лунки со стандартом и пробами, содержащими 10 мкл экстракта, полученного в примере 6, добавляют по 100 мкл отмытых средой RPMI 1640 клеток CTLL-2 (1x105 живых клеток в мл) и закрывают планшет неплотной крышкой. Инкубируют при 370C в течение 42 часов. В пробах, содержащих ИЛ-2, имеет место пролиферация клеток CTLL-2. После инкубации в каждую лунку вносят 10 мкл раствора MTT и инкубируют еще 6 часов. В жизнеспособных клетках, стимулированных ИЛ-2, образуются нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана.
Планшеты центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об/мин и удаляют супернатант из лунок резким стряхиванием жидкости. В каждую лунку добавляют по 100 мкл ДМСО и встряхивают планшеты на шейкере до полного растворения кристаллов формазана (около 15 мин). На основании спектрофотометрических данных для стандартного и испытуемых образцов вычисляют активность ИЛ-2 в экстракте, рассчитывают его активность на 100 мг порошка, которая составляет, в среднем, 4-5 млн.
Пример 9. Лечение пищевой аллергии препаратом из примера 3 Препарат из примера 4 в количестве 100 мг разбавляли 5 мл воды и давали пациенту, страдающему аллергией на зеленое яблоко. Курс лечения составлял 5 дней по схеме: контакт с аллергеном производился через день, при этом в момент появления аллергической симптоматики пациент принимал композицию по изобретению. Контакт с зеленым яблоком и прием препарата по изобретению был осуществлен 3 раза.
На 15-й день после начала испытания РRIСК-тест показал отсутствие реакции на зеленое яблоко. Контроль через 6 месяцев дал те же результаты.
Таким образом, препарат, полученный способом по изобретению, оказался успешным при терапии заболевания, которое до его создания не удавалось излечить полностью, так как все известные до сих пор препараты предлагали лишь симптоматическое лечение. Лечение пищевой аллергии некоторыми известными до сих пор препаратами на основе рекомбинантного ИЛ-2 ранее также не осуществлялось, так как предполагалось, что оно либо будет неэффективным, либо побочные эффекты, свойственные этим препаратам, превысят ожидаемую пользу.
Пример 10. Монотерапия ВИЧ-инфекции с использованием препарата из примера 4
Первые два курса проведены с препаратом «Poнкoлeйкин® сухой для инъeкций» (Биотех, Россия), представляющим собой очищенный белок, вторые два курса с препаратом, полученный способом по изобретению, принимаемым перорально.
Динамика CD4+ и вирусной нагрузки ВИЧ
Figure imgf000019_0001
Динамика как первого этапа лечения (с Ронколейкином®), так и второго (с препаратом по изобретению) является хорошей.
Существенное улучшение по динамике содержания CD4+ при применении препарата, полученного способом по изобретению, по сравнению с чистым ИЛ-2 для инъекций, может быть вызвано тем, что препарат по изобретению обладает свойством не только усиливать пролиферацию клеток иммунной системы, но также обладает способностью их активировать, поскольку именно отсутствие фактора активации иногда приводит к отсутствию эффекта от введения ИЛ-2. Таким образом, препарат, полученный способом по изобретению, наряду с биологически активным интepлeйкинoм-2, содержит также набор веществ адъювантного типа, которые позволяют использовать этот препарат при неудаче лечения с помощью чистого ИЛ-2.
При этом препарат получен технологичным способом, способ его получения не требует чрезмерных затрат времени и особого оборудования.
Полученный препарат активен при пероральном введении.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения препарата интepлeйкинa-2 (ИЛ-2), при котором с обеспечением сохранности целевого белка разрушают клетки дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2) и который не секретирует этот целевой белок, и отделяют водонерастворимую фракцию, отличающийся тем, что в препарате сохраняют водонерастворимые компоненты разрушенных клеток.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что дрожжевой продуцент представляет собой штамм Sассhаrотусеs сеrеvisiае, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791 , который является продуцентом человеческого интepлeйкинa-2.
3. Способ по п.1 , отличающийся тем, что клетки разрушают в присутствии ингибиторов дрожжевых протеаз.
4. Способ по п.1 , отличающийся тем, что клетки разрушают с помощью высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками.
5. Способ по п.1 , отличающийся тем, что отделенную водонерастворимую фракцию промывают для более полного удаления водорастворимых компонентов.
6. Способ по п.1 , отличающийся тем, что отделенную водонерастворимую фракцию высушивают.
7. Способ по п.1 , отличающийся тем, что отделенную водонерастворимую фракцию обрабатывают ацетоном с последующим удалением ацетоновой фракции.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что после отделения водонерастворимой фракции готовят ее суспензию в воде, приливают эту суспензию к ацетону при соотношении объемов суспензии и ацетона от 1 :5 до 1 :20 с получением суспензии в ацетоне, фильтруют полученную ацетоновую суспензию и оставшийся на фильтре остаток высушивают.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что после отделения водонерастворимой фракции перед приготовлением ее суспензии в воде ее промывают для более полного удаления водорастворимых компонентов.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что после высушивания отделенной водонерастворимой фракции к сухому остатку добавляют сухой солюбилизатор.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что солюбилизатор представляет собой додецилсульфат натрия.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что после добавления солюбилизатора добавляют воду.
13. Препарат интepлeйкинa-2, полученный способом по любому из п. п. 1-12.
PCT/RU2007/000128 2006-03-27 2007-03-16 Procédé de production d'une préparation d'interleukine-2, et préparation obtenue à l'aide dudit procédé WO2007111534A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07747858A EP1882744A4 (en) 2006-03-27 2007-03-16 PROCESS FOR PRODUCTION OF INTERLEUKIN-2 PREPARATION AND PREPARATION OBTAINED BY SAID METHOD

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006110508/13A RU2304586C1 (ru) 2006-03-27 2006-03-27 Препарат интерлейкина-2 и способ его получения
RU2006110508 2006-03-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007111534A1 true WO2007111534A1 (fr) 2007-10-04

Family

ID=38511912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000128 WO2007111534A1 (fr) 2006-03-27 2007-03-16 Procédé de production d'une préparation d'interleukine-2, et préparation obtenue à l'aide dudit procédé

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1882744A4 (ru)
CN (1) CN101410529A (ru)
RU (1) RU2304586C1 (ru)
WO (1) WO2007111534A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2322452C2 (ru) * 2006-03-27 2008-04-20 Михаил Николаевич Смирнов Иммуномодулирующая композиция
RU2565553C2 (ru) * 2013-04-09 2015-10-20 Общество с ограниченной ответственностью "Стратегия" Способ получения препарата интерлейкина-2, препарат интерлейкина-2 и фармацевтический иммуномодулирующий препарат
CN106520778A (zh) * 2015-09-09 2017-03-22 北京锤特生物科技有限公司 改造的白介素12及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0152358A1 (fr) 1984-02-16 1985-08-21 Transgene S.A. Vecteur d'éxpression dans les levures de l'interleukine-2 levures transformées et procédé de préparation de l'interleukine-2
EP0162898A1 (en) 1983-11-14 1985-12-04 Chiron Corporation Interleukin-2 production using cloned genes for interleukin-2 and yeast alpha-factor
RU2140283C1 (ru) * 1998-12-15 1999-10-27 Товарищество с ограниченной ответственностью "Биотех" Фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 (варианты)
RU2230781C1 (ru) * 2002-12-27 2004-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "Биотех" Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae 1-60-д578 (msil), - продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и способ его получения

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4569790A (en) * 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
EP0229108B1 (en) * 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4748234A (en) * 1985-06-26 1988-05-31 Cetus Corporation Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts
RU2322452C2 (ru) * 2006-03-27 2008-04-20 Михаил Николаевич Смирнов Иммуномодулирующая композиция

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0162898A1 (en) 1983-11-14 1985-12-04 Chiron Corporation Interleukin-2 production using cloned genes for interleukin-2 and yeast alpha-factor
EP0152358A1 (fr) 1984-02-16 1985-08-21 Transgene S.A. Vecteur d'éxpression dans les levures de l'interleukine-2 levures transformées et procédé de préparation de l'interleukine-2
RU2140283C1 (ru) * 1998-12-15 1999-10-27 Товарищество с ограниченной ответственностью "Биотех" Фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 (варианты)
RU2230781C1 (ru) * 2002-12-27 2004-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "Биотех" Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae 1-60-д578 (msil), - продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и способ его получения

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEARING A.J.H.; THORPE R.: "The international standard for human interleukin-2. Calibration by international collaborative study", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 74, 1984, pages 39
GEHMAN L.O.; ROBB R.J.: "An ELISA-based assay for quantitation of human interleukin-2.", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 74, 1984, pages 39, XP023900497, DOI: doi:10.1016/0022-1759(84)90365-X
HAMMERLING U. ET AL.: "Development and validation bioassay for interleukin-2", J. PHARMACEUT. & BIO- CHEM. ANALYSIS, vol. 10, 1992, pages 547
LAEMMLI U.: "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", NATURE, vol. 227, 1970, pages 680 - 685, XP055108426, DOI: doi:10.1038/227680a0
See also references of EP1882744A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101410529A (zh) 2009-04-15
EP1882744A4 (en) 2009-03-25
EP1882744A1 (en) 2008-01-30
RU2304586C1 (ru) 2007-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10034906B2 (en) Polysaccharides from prasinococcales
US11241470B2 (en) Phaseolus vulgaris extracts, their use and formulations containing them
KR20130044195A (ko) 어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물
KR20110118724A (ko) 면역 증강 조성물 및 그것을 제조하는 방법
WO2007111534A1 (fr) Procédé de production d'une préparation d'interleukine-2, et préparation obtenue à l'aide dudit procédé
US4645667A (en) Antitumor agent and process for manufacturing said agent
EP0179679B1 (fr) Polysaccharides membranaires utiles notamment comme médicament et procédé pour leur préparation
JPH0365362B2 (ru)
RU2322452C2 (ru) Иммуномодулирующая композиция
KR101105632B1 (ko) 꽃송이버섯 추출물 및 그것의 항암제로서의 용도
TW201607551A (zh) 得自於一稻作物的稻殼的精製產物及其製備方法與用途
RU2565553C2 (ru) Способ получения препарата интерлейкина-2, препарат интерлейкина-2 и фармацевтический иммуномодулирующий препарат
CN110093335B (zh) 一种沙蚕激酶的提取方法
CN113995766A (zh) 地高辛在制备治疗和/或预防巨噬细胞m1型极化相关疾病的药物中的用途
KR100397793B1 (ko) 느릅나무로부터 분리된 신규의 미생물 및 그를 이용한항암 면역활성의 세포밖 당화합물의 제조방법
CN1171630C (zh) 从香菇菌丝体的提取物来源的lak活性增强剂和含有此提取物的lak活性增强配方
TW201619390A (zh) 一種製備具有抗凝血活性的海藻寡糖的方法
KR102424333B1 (ko) 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법
CN116462778B (zh) 一种银耳多糖的提取方法
CN111393522B (zh) 胶原蛋白及其应用
KR20100119659A (ko) 항암 및 면역 활성을 갖는 다당류를 생산하는 신규한 펠리누스 균주
EP0433127A2 (fr) Nouveau dérivé sulfaté du galactanne extrait de Klebsiella, procédé de préparation, application à titre de médicaments et compositions pharmaceutiques le renfermant
JP4148483B2 (ja) 酵母菌由来タンパク質
JP2009091288A (ja) ほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物、飲食品、医薬品並びに医薬部外品
JP2008081457A (ja) ｔ−ＰＡ亢進物質及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007747858

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07747858

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2007747858

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780011484.8

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE