WO2007108152A1 - 高機能性二重特異性抗体 - Google Patents

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WO2007108152A1
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bispecific antibody
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Izumi Kumagai
Ryutaro Asano
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Tohoku University
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to a humanized highly functional bispecific antibody that can be used for cancer-specific immunotherapy, a single-chain polypeptide constituting the antibody, a nucleic acid encoding the polypeptide, The present invention relates to methods for producing antibodies and their use as pharmaceuticals.
  • Cancer-specific immunotherapy refers to a treatment method in which cytotoxic activity acts only on cancer cells. It binds an antibody and a drug exhibiting cytotoxic activity to make the drug target-targeting, and is now also called missile therapy.
  • an antigen that targets the substance that is abnormally expressed in cancer cells or that changes slightly as the cells become cancerous, and that can exert the ability of the antibody with minimal side effects Research is progressing in the direction.
  • Such an antigen is called a cancer-associated antigen.
  • Bispecific antibodies one of the multispecific antibodies, can specifically bind to two different antigens.
  • a diabody (Db) is the smallest unit of such a bispecific antibody, and each variable region (V region) of a heavy chain (H chain) derived from the same parent antibody (referred to as “VH”).
  • VH heavy chain
  • VL variable region
  • Such diabody-type bispecific antibodies are characterized by low molecular weight (molecular weight of about 60,000), low immunogenicity and high permeability to tumor tissues, Low-cost mass production using microorganisms such as colon bacteria is possible, and genetic engineering is used. It can be mentioned that functional modification is easy.
  • the present inventors have heretofore described a diabodies bispecific antibody (Ex3) prepared using an anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Herl) antibody 528 and an anti-CD3 antibody OKT3, and the antibody. It has been found that a diabody-type bispecific antibody obtained by humanization of the antibody has an extremely strong antitumor effect (Patent Document 1: In this document, “hExh3” is indicated. ) Furthermore, in order to demonstrate the above-mentioned excellent effects by comparing the diabody-type bispecific antibody produced with other antibodies, the hExh3 antibody exhibits a humanized 528 antibody and a humanized OKT3 antibody. It was speculated that the structural stability of these variable regions themselves and their combination were very important.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-242638
  • Non-Patent Document 2 Lu D, et.al.A fully human recombinant IgG- like bispecific antibody to both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor recep tor for enhanced antitumor activity.J Biol Chem., 280, 19665 -72. (2005) Disclosure of the Invention
  • the main object of the present invention is to provide a bispecific antibody having such an excellent function.
  • a humanized dibody-type bispecific antibody composed of two types of single-chain polypeptides (OH5L) and (5HOL) is mediated by either single-chain polypeptide via the hinge region.
  • VH and VL of the antibody respectively, the humanized variable region of the humanized H chain of the anti-human epidermal growth factor receptor antibody 528 and the single chain Fv (including the humanized variable region of the L chain) 5HL), or an antibody obtained by substituting the humanized variable region of the heavy chain of anti-CD3 antibody OKT3 and the single chain Fv (OHL) containing the humanized variable region of the L chain;
  • 5H, 5L, OH, and OL above are each substituted with one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28, or the amino acid sequence,
  • the humanized highly functional bispecific antibody wherein the amino acid sequence is a deleted, inserted, or added amino acid sequence, and the variable region is an amino acid sequence having substantially the same antigen binding property. .
  • Aspect 2 The humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 1 having the structure of (ii), wherein the humanized diabody-type bispecific antibody is hinged via a protease cleavage site.
  • the humanized highly functional bispecific antibody wherein the antibody is bound to a region.
  • Aspect 3 The humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 1 having the structure of (iii), wherein the single-chain polypeptide is bound to the hinge region via a protease cleavage site.
  • the humanized highly functional bispecific antibody characterized by the above.
  • Aspect 4 Among the two types of polypeptides constituting the humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 1 having the structure of (ii), a polypeptide force hinge region consisting of OH5L or 5HOL is used. A polypeptide that binds to Fc of a human antibody.
  • Aspect 7 The humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 1 having the structure of (i) or the single-chain polypeptide according to any one of Aspects 4, 5 or 6 Nucleic acid molecules.
  • Aspect 11 The host cell according to Aspect 10, which is a mammalian cell.
  • Aspect 12 The host cell according to Aspect 11 is cultured to express the nucleic acid in the host cell, and the polypeptide according to any one of Aspect 4, 5 or 6 is recovered and purified.
  • [Aspect 13] 2 obtained by culturing the host cell according to Aspect 11 to express the nucleic acid in the host cell, and collecting and purifying the polypeptide according to any one of Aspect 4, 5 or 6.
  • Aspect 14 Cleavage of the Fc region and the hinge region by digesting the humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 2 or 3 with a protease, respectively, OH5L And a humanized diabody-type bispecific antibody composed of two types of polypeptides of 5HOL, or a method for producing a humanized highly functional bispecific antibody according to aspect 1 having the structure of (i).
  • a pharmaceutical composition comprising the humanized highly functional bispecific antibody according to any one of aspects 1 to 3 as an active ingredient.
  • Aspect 16 The pharmaceutical composition according to Aspect 15, characterized in that it is used to eliminate, kill, injure and reduce or reduce tumor cells.
  • the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention is one in which ⁇ 3 is further enhanced. That is, the humanized highly functional bispecific antibody provided by the present invention has a markedly improved cytotoxic activity, improved stability, and antibody-dependent cytotoxicity ( (ADCC) and cell-dependent site force-in (CDC) induction ability are newly added, can bind bivalently to each antigen, and has dual specificity that minimizes additional sequences such as Tag by protease digestion Antibody can be easily prepared, and can be easily purified with protein A.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC cell-dependent site force-in
  • FIG. 1 shows the structure and main features of the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 2 shows an outline of an expression vector encoding a polypeptide constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 3-1 shows an example of amino acid sequences of variable regions 5H and 5L that are domains constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 3-2 shows an example of amino acid sequences of variable regions OH and OL, which are domains constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 3-3 shows an example of the amino acid sequence of CH1, CH2 & CH3, PreSission recognition sequence, and Hinge sequence that are domains constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 3-4 shows an example of the amino acid sequences of CL, various linkers, signal peptides, and c-myc & His tag, which are domains constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • ⁇ 4-1 Pictures of SDS-PAGE and Western blotting showing the purification of the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 5 shows the binding test results by flow cytometry.
  • FIG. 6 shows PBMC proliferation asssay results.
  • the bar graphs at the concentration of each BsAb added are lOpmol / ml, lpmol / ml, 0.1 pmol / ml, and 0.01 pmol / ml in order from left to right.
  • FIG. 7 shows the results of cytotoxicity tests using T-LAK.
  • FIG. 8 shows the results of cytotoxicity test using PBMC.
  • FIG. 10 shows antigen-specific cytotoxicity of Ex3 scFv-Fc.
  • the bar graph at each concentration of Ex3 scFv-Fc shows Colo-Tc, EGFR / CHO and CHO in order from left to right.
  • FIG. 12 is an electrophoresis photograph showing the result of purifying Ex3 and Ex3 scDb after protease digestion of Ex3-Fc and Ex3 scDb-Fc.
  • FIG. 15 shows the results of functional evaluation of Ex3 scFv-Fc by in vivo treatment experiments.
  • FIG. 17 shows Ex3 tandem scFv and Ex3t andem scFv-Fc structures, humanized highly functional bispecific antibodies of the present invention, and the results of in vitro cytotoxicity test of MTS assay using them. .
  • the bar graphs for each antibody concentration are Ex3, Ex3 tandem scFv in order from left to right.
  • the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention (hereinafter also referred to as "the present invention BsAb") is an anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her 1) antibody 528 heavy chain.
  • Fig. 1 Humanized variable region
  • OH typed variable region
  • OL humanized variable region
  • the first type (i) (Ex3 scDb) of BsAb of the present invention has a structure represented by (OH5L) ⁇ (peptide linker) ⁇ (5H OL). That is, OH5L and 5HOL, which are two types of polypeptide chains constituting Ex3, are further combined by a peptide linker to form a single polypeptide chain as a whole. As a result, the structure of the BsAb molecule is more stable than Ex3. Furthermore, only one expression vector is required for producing this BsAb, and as a result, a more uniform BsAb molecule can be prepared compared to Ex3. “ScDb” means a single chain diabodies.
  • the peptide linker has a length as long as OH and OL, and 5H and 5L are associated with each other to form an antigen-binding site capable of specifically reacting with each antigen.
  • the peptide linker may be, for example, a polypeptide having 1 to about 20 amino acids, preferably a polypeptide having about 1 to about 15 amino acids, and more preferably about 2 to about 10 amino acids. And the like.
  • the peptide linker may be inserted between 5H and 5L or between OH and OL. Furthermore, in each Ex3 unit, either VH or VL may be located on the N-terminal side of the polypeptide chain. That is, the first type of BsAb of the present invention is (1) N-terminal side: OH-5L- (peptide linker) -5H-OL: C-terminal side (Example), (2) N-terminal side: 5H- OL- (Peptide Linker) —OH— 5L: C End, (3)?
  • the first type (ii) (Ex3-Fc) of the BsAb of the present invention comprises two types of polypeptide, OH5L and 5HOL.
  • a humanized diabody-type bispecific antibody (Ex3) consisting of a peptide is bound to two Fc regions of a human antibody via a hinge region by one of the polypeptides. Specifically, either one of the two polypeptides constituting Ex3 bound to the Fc region of a human antibody via the hinge region (for example, (5HOL) hinge region—Fc region), And it is comprised from 2 types of polypeptide of other polypeptide (for example, (OH5L)) which comprises Ex3.
  • the antibody can be produced by co-expressing these two types of single-chain polypeptides and then associating them.
  • the “Fc region” means two domains (CH2 and CH3) on the C-terminal side of the H chain constituting the constant region (C region).
  • either the 5HOL or OH5L polypeptide can be bound to the Fc region of a human antibody via the hinge region, and the heavy chain variable contained in each single-chain polypeptide Either the region or the light chain variable region may be bound to the hinge region.
  • the third type (m) (Ex3 scDb-Fc) of the present BsAb is the first type Ex3 of the present BsAb in place of Ex3 in the second type (ii) of the BsAb of the present invention.
  • scDb, the fifth type (V) of the following BsAb of the present invention, or the sixth type (V) of the BsAb of the present invention which binds to the Fc region of a human antibody via the hinge region. have.
  • the number of domains constituting the first type (ii) and the third type (iii) of the BsAb of the present invention is the same as that of an IgG type immunoglobulin molecule, and these antibodies are close to the immunoglobulin molecule. It is considered that it has a cubic structure. Further, in the first type (ii) and the third type (iii) of these BsAbs of the present invention, these BsAbs can be digested with protease by interposing a protease cleavage site between Ex3 or Ex3 scDb and the hinge region. Thereafter, Ex3 or Ex3 scDb can be easily produced by appropriately performing various purification operations described later.
  • the fourth type (iv) (Ex3 scFv-Fc) of the BsAb of the present invention comprises the antibody (immunoglobulin molecule) VH and VL, respectively, the anti-epidermal growth factor receptor antibody 528 heavy chain and Replace with single chain Fv (scFv) (5HL) containing humanized variable region of L chain or single chain Fv (OHL) containing humanized variable region of anti-CD3 antibody OKT3 H chain and L chain Antibody.
  • the antibody is a polypeptide formed by binding either OHL or 5HL, which is scFv, to the N-terminal side of the CH 1 domain that constitutes the constant region of the H chain in an IgG-type immunoglobulin molecule.
  • two types of single chain polypeptide forces of a polypeptide formed by binding the other scFv to the N-terminal side of the constant region CL of the L chain are also constructed.
  • either the H chain variable region or the L chain variable region contained in scFv may be bound to the hinge region. Therefore, the antibody can be produced by co-expressing these two types of (single chain) polypeptides and then associating them.
  • the BsAbs of the second type (ii), third type (iii) and fourth type (iv) of the present invention all have a human Fc region, protein A It is easy to purify, and can induce antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) and cell-dependent site force-in (CDC). Furthermore, it can bind to each antigen bivalently. This is an effect not seen in Ex3.
  • the fifth type (V) of the present invention BsAb has a structure represented by (OH5H) ⁇ (peptide linker) ⁇ (5LOL). That is, each of two types of polypeptide chains having H chain strength and two types of polypeptide chains having L chain strength are further combined by a peptide linker to form a single polypeptide chain as a whole.
  • the length of the peptide linker is not limited as long as OH and OL and 5H and 5L are associated with each other to form an antigen-binding site capable of specifically reacting with each antigen.
  • the peptide linker may be, for example, a polypeptide having 1 to about 20 amino acids, preferably a polypeptide having about 1 to about 15 amino acids, and more preferably about 2 to about 10 amino acids. And the like.
  • the peptide linker is either between 5H and 5L, or between OH and OL. May be inserted. Furthermore, in each single polypeptide chain, any terminal may be located on the N-terminal side. That is, the fifth type of the present BsAb is (1) N-terminal side: OH-5H- (peptide linker) -5L-OL: C-terminal side, (2)? ⁇ -Terminal side: 51 ⁇ -01 ⁇ — (Peptide Linker) OH— 5H: C end, (3)?
  • the sixth type (vi) (Ex3 tandem scFv) of the present invention BsAb has a structure represented by (5L5H) ⁇ (peptide linker) 1 (OHOL). That is, a single-chain Fv (528 scFv) (5HL) containing humanized variable regions of the H and L chains of anti-human epidermal growth factor receptor antibody 528 and the H and L chains of anti-CD3 antibody OKT3.
  • a single-chain Fv (OKT3 scFv) containing a humanized variable region is connected in tandem with a polypeptide linker to form a single polypeptide chain as a whole.
  • the polypeptide linker is the same as that used in the fifth form of the BsAb of the present invention.
  • 528 scFv or OKT3 scFv may be on the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • each of the H chain and L chain is N-terminal. May be on the side.
  • the sixth type of the BsAb of the present invention contains a total of eight types of single chain polypeptides.
  • linker refers to an oligopeptide that functions to give a single-chain polypeptide by binding the variable region (VH) of the H chain and the variable region (VL) of the L chain. It points to a polypeptide.
  • the peptide linker is not particularly limited as long as it can functionally link two polypeptides to give one single-chain polypeptide, for example, those widely known in the art or the It is possible to select and use a modified known linker.
  • the peptide linker may be, for example, a peptide having 1 to about 50 amino acids, preferably a peptide having about 2 to 30 amino acids, and more preferably about 2 to 20 amino acids. Peptides are mentioned.
  • “functionally linked” means that the polypeptide is properly folded and the original tongue is folded. Tertiary that can mimic part or all of the function of the protein (the polypeptide is derived from the original protein or the original protein is also induced), such as biological activity It means a bond that gives a fusion protein with the original structure.
  • the length of the linker is not limited so long as it gives a desired activity to a single-chain polypeptide (or a fusion protein) that generates force depending on the property of the peptide to be bound.
  • the length of the linker should be long enough so that the resulting single-chain polypeptide is properly folded to obtain the desired biological activity.
  • the length of the linker can also be determined experimentally by testing a series of single-stranded polypeptides linked with various lengths of linker for the desired biological activity.
  • VL-Linker-VH construct any of the ones with VH on the terminal side, linker, followed by VL (VH-Linker-VL construct) may be used.
  • the sequence Examples include the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, and SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 ( Figure 3-2).
  • the constant region or Fc region contained in the BsAb of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a human antibody.
  • CL may be derived from either the kappa or lambda chain.
  • Fc region or H chain constant region those derived from the IgG ⁇ chain are usually used.
  • CH1, CH2 and CH3, and CL include those having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 33, respectively (Figs. 3-3-, Fig. 3 4) .
  • the PreSission sequence is a sequence including a protease cleavage site.
  • protease There are no particular restrictions on the type of protease to be used.
  • enzymes known to those skilled in the art such as Thrombin and Factor Xa can be used, and an amino acid sequence containing a protease cleavage site can be appropriately selected accordingly.
  • amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and the polymorphism consisting of the original amino acid sequence
  • Amino acid sequences that substantially retain the functional 'activity of the peptide, for example, the antigen specificity of the variable region can also be used as the polypeptide constituting the BsAb of the present invention.
  • the amino acids to be deleted, substituted, inserted or added are preferably substituted for homologous amino acids (polar / nonpolar amino acids, hydrophobic, hydrophilic amino acids, positive and negative charged amino acids, aromatic amino acids, etc.).
  • polypeptides having such deleted, substituted or added amino acids include, for example, site-directed mutagenesis (point mutagenesis, cassette mutagenesis, etc.), gene homologous recombination, primer extension, and It can be easily prepared by appropriately combining methods known to those skilled in the art such as PCR.
  • the amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99%, relative to the total length of the original amino acid sequence. It can also be said to show sequence homology of% or more.
  • a typical example of a nucleic acid molecule (oligonucleotide) encoding each region or sequence contained in the single-chain polypeptide constituting the BsAb of the present invention has a base sequence shown in each of the above SEQ ID NOs. is there.
  • a nucleic acid molecule comprising a base sequence that exhibits a sequence homology of 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 99% or more with the entire length of the base sequence described in each SEQ ID NO.
  • these nucleic acid molecules are also included in the nucleic acid of the present invention.
  • sequence homology between two amino acid sequences or base sequences the sequences are pre-processed to an optimal state for comparison. For example, by inserting a gap in one sequence Then, the alignment with the other sequence is optimized. The amino acid residues or bases at each site are then compared. When the same amino acid residue or base as the corresponding site of the second sequence is present at a site in the first sequence, the sequences are identical at that site. Sequence homology between the two sequences is expressed as a percentage of the total number of sites (all amino acids or all bases) of the number of sites that are identical between the sequences.
  • homology means that each amino acid residue in the polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence) constitutes the chain, and each amino acid residue or each Means the amount (number) of bases that can be determined to be identical in each other's fitness, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences It is. Homology can be easily calculated.
  • each nucleic acid molecule described above is subjected to a stringent condition with a DNA having a complementary base sequence ability to a DNA consisting of the base sequence represented by each SEQ ID NO. Under stringent conditions. It includes DNA encoding a polypeptide having substantially the same function 'activity of each polypeptide indicated.
  • hybridization can be performed according to a method known in the art such as the method described in Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) or a method analogous thereto. .
  • a commercially available library it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual.
  • Hybridization is described, for example, in Current Protocol in Molecular Biology (.edited by Frederick M. Ausubel et al, 1987). It can be carried out according to a method known in the art such as the method described, or a method analogous thereto, and when a commercially available library is used, it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual.
  • stringent conditions in DNA hybridization are defined by an appropriate combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. Defined. That is, stringency increases with decreasing salt concentration, increasing organic solvent concentration, or increasing hybridization temperature. In addition, the washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature.
  • the stringency of washing increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • “stringent conditions” means the degree of homology between base sequences, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. This means that the hybrid is specifically formed only between the base sequences having high homology.
  • the conditions include a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and a pH of 6 to 8 at a temperature of 60 ° C to 68 ° C.
  • stringent conditions include 5 X SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 1% SDS, 5 X Denhardt's solution 50% formaldehyde, and 42 Hybridization is performed under the condition of ° C, and washing is performed under the conditions of 0.1 X SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate), 0.1% SDS, and 55 ° C.
  • Humanization refers to at least a part of the complementarity-determining region (CDR) residues in the variable region of human immunoglobulin (recipient antibody). Alternatively, it refers to an antibody that is a non-human animal (donor antibody) such as a rabbit and is substituted with residues from CDRs having the desired specificity, affinity, and ability. In some cases, Fv framework (FR) residues of human immunoglobulins may be replaced by corresponding non-human residues. Furthermore, humanized antibodies may contain residues that are not found in either the recipient antibody and the introduced CDR or framework sequences. These modifications are made to further improve or optimize antibody performance.
  • CDR complementarity-determining region
  • variable region of an antibody can be performed according to a method known to those skilled in the art.
  • humanized antibodies are prepared by analyzing various conceptual humanized products using a three-dimensional immunoglobulin model of recipient and donor antibodies. Three-dimensional immunoglobulin models are well known to those skilled in the art. More details! You can refer to W092 / 22653.
  • an example of a humanized variable region is an antibody in which the complementarity determining region (CDR) in the variable region is derived from a mouse antibody and the other part is derived from a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • humanization since humanization may cause a decrease in the function of the antibody itself, a frame that may affect an appropriate site in the single-chain polypeptide, for example, the CDR structure.
  • the function of the humanized antibody can be improved by causing site-specific mutation at a site in the work (FR), for example, canonical sequence or veriner sequence.
  • bacterial enterotoxins represented by staphylococcal enterotoxin, Escherichia coli enterotoxin and cholera enterotoxin or the like It is also possible to enhance the cytotoxic activity by binding various derivatives thereof. However, it is known that these superantigens may cause site force-in-dependent toxic shock syndrome due to strong affinity for MHCclass II. Furthermore, for the purpose of facilitating the detection and purification of the produced single-chain polypeptide, various peptide tags known to those skilled in the art (for example, cm yc tag and His-tag) should be included at the ends thereof. I can do it.
  • the nucleic acid encoding the single-chain polypeptide of the present invention or each region contained therein can be obtained by a method known to those skilled in the art, and its base sequence can be determined. For example, it can be performed by using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the gene encoding the heavy and light chains of the mouse antibody (R. Orlandi et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA 86: 3833-3837 (1993)).
  • the hybridoma cells producing the monoclonal antibodies described above can be used as a source of DNA in such methods.
  • the nucleic acid encoding the single-chain polypeptide of the present invention may be a single-chain Fv ((single-chain Fv) or "scFv") or an already constructed and known to those skilled in the art.
  • scFv single-chain Fv
  • the nucleic acid encoding the diabody-type bispecific antibody described in Patent Document 1 it can be prepared by replacing VH or VL therein with one derived from an antibody having another specificity.
  • scFv refers to the one containing the VH and VL domains of a certain antibody, wherein the domains are in one polypeptide chain.
  • the Fv polypeptide further contains a polypeptide linker between the VH and VL domains, making it possible to give the structure necessary for antigen binding.
  • scFv reference can be made to Rosenbrg and Moore (Ed.), The Pharmacology of Monoclonal Antioodies, Vol. 113, Spnnger-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
  • nucleic acid when a nucleic acid encoding a humanized variable region in a single-chain polypeptide is produced, as described in the following examples, a pre-designed amino acid sequence is used. Based on this, total synthesis can be performed by overlap PCR.
  • nucleic acid is a molecule that encodes a single-chain polypeptide
  • its chemical structure and acquisition route are not particularly limited, for example, those containing gDNA, cDNA, chemically synthesized DNA, mRNA, etc. It is.
  • telomere can be isolated from a cDNA library based on sequences described in literatures by hybridization or by polymerase chain reaction (PCR) technology. -Once isolated, the DNA is placed in an expression vector, which is then transferred to an E. coli cell, COS cell, Chinese nosester ovary cell (CHO cell), or myeloma cell that does not produce immunoglobulin, etc.
  • the host cells can be transfected, and monoclonal antibodies can be synthesized in the recombinant host cells.
  • the PCR reaction can be performed by a method known in the art, or a method or modification method substantially similar thereto. For example, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R.
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can be carried out according to the protocol specified by the kit manufacturer or the kit vendor.
  • kit manufacturer or the kit vendor For information on the noisy hybridization, see L. Grossman et al. (Ed.), "Methods in Enzymolo gy, Vol. 29 (Nucleic Acids and Protein Synthesis, Part E), Academic Press, New York (1974).
  • DNA sequencing such as DNA can be performed with reference to Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977).
  • the thus obtained single-stranded polypeptide constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention or the nucleic acid encoding each region contained therein is known to those skilled in the art depending on the purpose. By such means, it can be appropriately modified so as to encode a desired peptide or amino acid.
  • Techniques for genetically altering or modifying DNA in this way are described in a review in Mutagenesis: a Practical Approach, MJ Mcpherson (Ed.), (IRL Press, Oxford, UK (1991). Examples include site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis), cassette mutagenesis, and polymerase chain reaction (PCR) mutagenesis.
  • modification for example, there is a method of altering the amino acid sequence itself constituting a single-chain polypeptide by replacing a codon encoding an original amino acid residue with a codon encoding another amino acid residue. In this way, a single-chain polypeptide constituting the humanized diabodies bispecific antibody of the present invention can be obtained.
  • a single-stranded polymorph is used so that the codon (optimum codon) suitable for the host cell is used without changing the amino acid itself.
  • the nucleic acid encoding the peptide can also be modified. By changing to the optimal codon in this way, the expression efficiency of the single-chain polypeptide in the host cell can be improved.
  • linker and the superantigen, etc. are used for genetic engineering techniques such as recombinant technology and peptidic peptides. Using any technical means known to those skilled in the art, such as chidonic synthesis, it can be appropriately introduced into the single-chain polypeptide constituting the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention. .
  • Single-chain polypeptides can be produced by methods known to those skilled in the art, for example, various means such as genetic engineering techniques or chemical synthesis.
  • genetic engineering techniques for example, a replicable cloning vector or expression vector containing the above-mentioned nucleic acid is prepared, a host cell is transformed with this vector, the transformed host cell is cultured, and the host cell is cultured. It can be produced by expressing the nucleic acid in it, recovering it and purifying it.
  • the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention is composed of two types of single-chain polypeptides, such vectors usually have! /, One of them. Nucleic acids encoding single-stranded polypeptides are included! In such a case, it is preferable to introduce the two types of vectors obtained into the same host cell.
  • two types of nucleic acids encoding each of two types of single-chain polypeptides can be contained in the same vector.
  • replicable expression vector and "expression vector” refer to a piece of DNA (usually double-stranded), DNA can insert foreign DNA fragments into it.
  • Foreign DNA is defined as heterologous DNA, which is DNA that is not found naturally in the target host cell.
  • Vectors are used to carry foreign or heterologous DNA into appropriate host cells. -Once in the host cell, the vector can replicate independently of the host chromosomal DNA, and several copies of the vector and its inserted (foreign) DNA can be generated.
  • the vector contains the elements essential to allow translation of the foreign DNA into a polypeptide. Thus, many molecules of polypeptides encoded by foreign DNA can be rapidly synthesized.
  • Such vectors can be expressed in appropriate control sequences so that the DNA sequence is expressed in a suitable host.
  • a DNA construct containing DNA sequences operably linked ie, capable of expressing foreign DNA. I taste it.
  • control sequences include a promoter for transcription, any operator sequence to control such transcription, sequences encoding appropriate mRNA ribozyme binding sites, enhancers, reardenylation sequences, and Examples include sequences that control the end of transcription and translation.
  • the vector may appropriately contain various sequences known to those skilled in the art, for example, restriction enzyme cleavage sites, marker genes (selection genes) such as drug resistance genes, signal sequences, leader sequences and the like as necessary. I can do it.
  • marker genes selection genes
  • the vector can be in any form, such as a plasmid, a phage particle, or simply a genomic insert. -And when introduced into an appropriate host by transformation, the vector can replicate or function independently of the resident genome. Alternatively, the vector may be one that is integrated into the genome.
  • a host cell any cell known to those skilled in the art can be used.
  • typical host cells include prokaryotic cells such as E. coli and Chinese hamster ovary cells (CHO). Cell), mammalian cells such as human-derived cells, and eukaryotic cells such as yeast and insect cells.
  • the single-chain polypeptide obtained by such expression in a host cell is generally recovered from the culture medium as a secreted polypeptide when it is directly produced without a secretion signal Can be recovered from the host cell lysate. If the single-chain polypeptide is membrane-bound, it can be released from the membrane using an appropriate detergent (eg, Triton-X100).
  • an appropriate detergent eg, Triton-X100
  • the purification operation can be performed by appropriately combining known methods known to those skilled in the art. For example, centrifugation, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, fractionation on ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, chromatography on silica, chromatography on heparin sepharose, anion or It is suitably purified by cation purity chromatography (polyaspartic acid column etc.), chromatofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation, and affinity chromatography. Affinity chromatography determines the affinity of a single-chain polypeptide with a peptide tag. It is one of the refining technologies because it is highly efficient.
  • the purification operation is performed after the single-chain polypeptide is dissolved and denatured. I prefer that.
  • This solubilization treatment can be performed using any agent known to those skilled in the art as a dissociating agent such as alcohols such as ethanol, guanidine hydrochloride and urea.
  • the two types of single-chain polypeptides thus purified are associated (unwound), and the formed antibody molecules are separated and recovered, whereby the humanized highly functional bifunctional polypeptide of the present invention is recovered.
  • Bispecific antibodies can be produced.
  • the association treatment means returning a single single-chain polypeptide to a state having a desired biological activity by returning it to an appropriate spatial arrangement. Therefore, the association treatment also has a meaning when the polypeptides or domains are brought back to an associated state, and therefore can be referred to as “reassociation” and has a desired biological activity. It can be called reconfiguration in the sense of making things, or it can be called refolding.
  • the association treatment can be performed by any method known to those skilled in the art. For example, the concentration of a denaturing agent (eg, guanidine hydrochloride) in a buffer solution containing a single-chain polypeptide can be stepped by, for example, dialysis. The method of lowering is preferable. In this process, the oxidation reaction can be promoted by appropriately adding an aggregation inhibitor and an oxidant to the reaction system. Separation and recovery of the formed humanized highly functional bispecific antibody can also be performed by any method known to those skilled in the art.
  • a denaturing agent
  • the pharmaceutical composition of the present invention was selected from the group consisting of the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention, a single-chain polypeptide, a nucleic acid, a vector, and a transformed host cell. It contains the above as an active ingredient. As shown in the examples below, the active ingredient has a function of significantly eliminating (positive) tumor cells that express the epidermal growth factor receptor in vitro and in vivo. ! Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an antitumor agent for such tumor cells.
  • the humanized high-functional bispecific antibody of the present invention is treated with a cell having phagocytosis or cytotoxic activity and a human epidermal growth factor receptor.
  • Phagocytosis or cells by coexisting with expressing tumor cells in vivo or in vitro Since it is possible to increase the production amount of cytodynamic force (eg, IFN- ⁇ , GM-CSF, TFN- ⁇ , etc.) in cells having cytotoxic activity, the humanized highly functional dual specificity of the present invention
  • An antibody or a pharmaceutical composition containing it as an active ingredient can also be used for this purpose.
  • in vitro it is possible to increase the production of cyto force-in by adding the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention to a culture system containing the above two types of cells.
  • the effective amount of the active ingredient of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art depending on, for example, the therapeutic purpose, the type of tumor, site and size of the subject to be administered, various conditions of the patient, and the administration route. .
  • a typical single dose or daily dose is first determined in vitro, depending on the conditions described above, if possible, for example using assays known for the survival or growth of tumor cells known in the art. And then the appropriate dose range can be determined with an appropriate animal model that can extrapolate the dose range for human patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method'purpose, pathological condition to be administered, etc.
  • pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method'purpose, pathological condition to be administered, etc.
  • Various acceptable components for example, carriers, excipients, buffers, stabilizers, etc. can be added as appropriate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a tablet, solution, powder, gel, spray, or microcapsule, colloidal distribution system (ribosome, microemulsion, etc.), depending on the various conditions described above. And various pharmaceutical forms such as macroemulsion.
  • Administration methods include intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intraspinal, intramuscular, intraocular, intraarterial, in particular intrabiliary or intralesional injection or injection, and sustained release system formulations.
  • the method according to this is mentioned.
  • the active substance of the present invention can be administered continuously by infusion or by mass injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered, it is preferably administered together with cells having phagocytosis or cytotoxic activity.
  • the antibody is preliminarily bound to the cells by mixing the active ingredient such as the humanized highly functional bispecific antibody of the present invention with the cells. Is preferred
  • Sustained release formulations generally release the active substance of the present invention therefrom for a certain period of time.
  • Suitable examples of sustained-release preparations include a semi-permeable carrier of a solid hydrophobic polymer containing protein, which carrier is a molded article such as a film or microcapsule, for example. It is in the form.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by methods known to those skilled in the art, for example, edited by the Japanese Pharmacopoeia Editorial Board, 13th revision Japanese Pharmacopoeia, July 10, 1996, They can be manufactured by selecting them as needed from the descriptions of the company Yodogawa Shoten.
  • Anti-EGFR antibody-producing mouse B cell Hypridoma 528 (ID: TKG0555) was distributed from Tohoku University Rikiguchi Medical Research Center for Medical Cell Resources, and mRNA was extracted using ISOGEN (Nibbon Gene), First-Strand cDNA was prepared by cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). PCR was performed using a cloning primer synthesized from this cDNA based on Reference Paper 1, and the sequences of 528 variable regions VH (5H) and VL (5L) were clarified. It should be noted that Ibridomoma producing 528 antibody is stored as ATCC No. HB-8509 in the American 'Type' Culture 'Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository institutions.
  • ATCC American 'Type' Culture 'Collection
  • Ex3 diabody (hereinafter Ex3), has two molecular forces, 5HOL and OH5L.
  • An expression vector has already been constructed by the present inventors! It was prepared based on an Mx3 diabody (hereinafter referred to as Mx3) expression vector targeting MUC1 and CD3 (see International Publication No. WO02 / 06486 A1). Specifically, 5H was amplified by PCR using an AB primer with a restriction enzyme site and then digested with Ncol-Eagl.
  • pSNE4- MHOL anti-MUCl antibody MUSEll VH (hereinafter MH) -GGGGGS (hereinafter Gl ) -Anti-CD3 antibody OKT3 VL (hereinafter referred to as OL) was replaced with MH to prepare pRA-5HOL.
  • 5L was amplified using CD primer, digested with EcoRV-SacII, and pSNE4-OHML (OKT3 VH (hereinafter referred to as OH) -PRA-OH5L was prepared by replacing ML of Gl-MUSEll VL (hereinafter ML).
  • c-myc peptide tag for detection and His-tag His-tag (Hisx6: histidine hexamer for purification) were prepared.
  • the anti-CD3 antibody OKT3 ID: TKG0235 was distributed from the Medical Cell Resource Center attached to the Research Institute for Aging Medicine, Tohoku University. Bridoma is the ATCC No. in the American Type ⁇ Culture ⁇ Collection (ATCC).
  • the humanized ⁇ 3 variable region has already been reported, and it has been confirmed that it retains sufficient activity compared to mouse ⁇ 3 (Reference Paper 2). Based on the amino acid sequence of the humanized ⁇ 3 variable region described in Reference Paper 2, total gene synthesis was performed by the overlap PCR method. At this time, the optimal codon in E. coli was used. An increase in the expression level in E. coli by using a total synthetic gene substituted with an optimal codon has already been reported.
  • Humanized Ex3 diabody is made from two humanized molecules, 5HOL and OH5L.
  • An expression vector was prepared based on each expression vector constituting Ex3.
  • humanized 5H was amplified by PCR using EF primers into which restriction enzyme sites were introduced, and then Nco NEagl. Digested and replaced with pRA-5HOL 5H.
  • humanized OL (hereinafter simply referred to as “OL”) was amplified using GH primers, digested with EcoRV-SacII, and replaced with OL to prepare pRA-5HOL (human type IV).
  • humanized OH was amplified using IJ primer, then digested with NcotoEagl, replaced with OH of pRA-OH5L, humanized 5L was amplified with KL primer, and replaced with 5L with EcoRV-Sad I pRA-OH5L ( Humanized) was prepared.
  • a c-myc peptide tag for detection and a His-tag (Hisx6: histidine hexamer tag) for purification are introduced in parallel on the C-terminal side.
  • 5HOL (humanized, the same applies hereinafter) is amplified by PCR using the a_b primer into which the restriction enzyme site has been introduced, then digested with BamH and Xhol, and the animal cell expression vector pKH to Neo Inserted into. Subsequently, OH5L was amplified using cd primer, and then 2nd PCR was performed using e_f7 ° limer, digested with Nhel and BamHI, and inserted upstream of 5HOL to produce pKHI-Ex3 scDb. On the C-terminal side, c-myc peptide tag for detection and His-tag (Hisx6: histidine hexamer tag) for purification are introduced in parallel!
  • Ex3-Fc is composed of OH5L and 5HOL-Fc, only the latter was newly prepared.
  • 5HOL and OH-Fc were amplified using g-h primer and i_j primer, respectively.
  • PCR products were mixed, further PCR amplified with ej primers, digested with Nhel and Xhol, and replaced with Ex3 scDb of pKHI-Ex3 sc Db to prepare pKHI-5HOL-Fc.
  • 5HOL-Fc was amplified using aj primer and digested with BamH and Xhol, and replaced with 5HOL of pKH ⁇ Ex3 sc Db to prepare pKHI-Ex3 scDb-Fc. All Ex3-Fc ⁇ Ex3 scDb-Fc introduce a PreScission protease cleavage site upstream of Fc.
  • Ex3 scFv-Fc consists of OHL-Fc and 5HL-CL.
  • 2nd PCR was performed using e-k primer, digested with Nhel and Xhol, and replaced with OH of pKHI-OH-Fc to prepare pKHI-OHL-Fc.
  • 5HL was amplified with g-1 primer, then 2nd PCR was performed with e-1 primer, digested with Nhel and Narl, and replaced with OL of pKHI-OL-CL to prepare pKHI-5HL-CL.
  • the pKHI-Neo and pKHI-Hyg vectors are the Invitrogen pcDNA3.1-Neo and pcDNA3.1-Hyg cloning sites, respectively, and a secretory signal sequence for animal cell expression and Kozak for increasing transcription efficiency. An array is introduced.
  • Ex3 scDb Expression vector pKHI-Ex3 scDb is introduced into CHO cells, screened with a selective antibiotic medium containing G418, subjected to limiting dilution, and stable production by cytotoxicity test (hereinafter MTS assay) and flow cytometry The stock was crawled. Serum-free culture was performed using a roller bottle, and the culture supernatant was dialyzed against PBS and then purified by metal chelate affinity chromatography (hereinafter IMAC). Purification was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as SDS-PAGE) and Western blotting (FIG. 41).
  • MTS assay cytotoxicity test
  • IMAC metal chelate affinity chromatography
  • Ex3-F expression vectors pKHI-OH5L and pKHI-5HOL-Fc were co-introduced into CHO cells, screened with a selective antibiotic medium containing G418 and Hygromycin, followed by similar cloning and protein A column chromatography. (Fig. 41).
  • Ex3 scDb-F expression vector Ex3 scDb-Fc was introduced into CHO cells, screened with a selective antibiotic medium containing G418, and prepared in the same manner as Ex3-Fc (Fig. 4-2).
  • Ex3 scFv-F expression vectors pKHI-OHL-Fc and pKHI-5HL-CL were co-introduced into CHO cells and prepared in the same manner as Ex3-Fc after screening with a selective antibiotic medium containing G418 and Hygromycin ( Figure 4—2).
  • the target molecules are prepared with a high degree of purification.
  • the yield after purification was approximately 1 mg per culture medium.
  • Ex3 scDb 200 pmol as the primary antibody against the target cells
  • other psAb 100 pmol, 30 min, left at 4 ° C
  • PBMC Peripheral blood lymphocytes
  • MTS assay was used to determine how much TFK_1 cells were damaged by T_LAK cells.
  • the cells were counted and adjusted to 5 ⁇ 10 3 cells per RPMI lOOmL, dispensed lOOmL into a 96-well plate, and allowed to stand at 37 ° C.
  • Incubate at 37 ° C for 48 hours. Remove plate culture, wash with PBS, add MTS, PMS, RPMI and incubate at 37 ° C for 30-60 min. Absorbance of 49 Onm was measured with a plate reader.
  • MTS reagent CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, manufactured by Promega
  • PMS CellTiter 9b Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, manufactured by Promega
  • Ex3 scDb was confirmed to have cytotoxicity depending on the same concentration as that of conventional Ex3, and Ex3-Fc and Ex3 scDb-Fc were equivalent to each other and about 10 times more effective than Ex3. Furthermore, Ex3 scFv-Fc showed the same effect at a concentration of about 1/1000 of Ex3 (Fig. 7). As a result of the same MTS assay using PBMC, Ex3 scDb was equivalent to Ex3, and Ex3-Fc, Ex3 scDb-Fc, and Ex3 scFv-Fc showed stronger cytotoxic activity in this order. The effect of PBMC is also expected to have a high degree of expectation S in the single effect for clinical application (Figure 8).
  • Ex3-Fc and Ex3 scDb-Fc are designed so that two molecules of Ex3 and Ex3 scDb can be prepared by cleaving the Fc region by PreScission protease digestion, respectively (Figs. 1 and 11).
  • PreScission was removed by column chromatography using Glutathione-immobilized resin. Next, remove the cleaved Fc region and undigested Ex3-Fc and Ex3 scDb-Fc using protein A column chromatography, prepare Ex3 and Ex3 scDb, and confirm the molecules at each step by SDS-PAGE. did. The yield was 49% for Ex3 and 68% for Ex3 scDb, and the purity was high, indicating the usefulness of the new preparation method for Ex3 and Ex3 scDb using PreScission protease (Fig. 12).
  • TFK-1 cells were injected subcutaneously into the mice. 10 days after TFK-1 cell transplantation (tumor diameter of about 4 mm to 6 mm), 2xl0 6 T-LAK cells, IL-20 (500IU) and Ex3, and Ex3 scFv_Fc alone were injected from the tail vein for 4 consecutive days did. The tumor diameter was measured every week, and the tumor volume was estimated from the major axis and minor axis.
  • Herceptin As shown in Figs. 7 and 8, bispecific antibodies that induce cytotoxicity by cross-linking of lymphocytes and cancer cells are stronger and more effective when T-LAK cells are used as effector cells than PBMCs. Show. Herceptin's main mechanism of action is ADCC via the Fc region. Therefore, stronger effects were seen when PBMC containing many Fc receptor positive cells were used as effector cells (Fig. 16). However, Ex3 scFv-Fc showed a significant effect on Herceptin regardless of which cell was used as the effector cell.
  • Each expression vector was prepared based on the 5LH (528 scFv LH type) and OHL (OKT3 scFv) ⁇ OH-Fc (OKT3 H chain) expression vectors already constructed by the present inventors. All variable regions are those after humanization).
  • 5LH and OHL were amplified with m-n primer and o-b primer, respectively.
  • the PCR products were mixed, further amplified with e-b primers, digested with Nhel and Xhol, and inserted into pKHI-Neo to produce the expression vector pKHI-Ex3 tandem scFv.

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Description

明 細 書
高機能性二重特異性抗体
技術分野
[0001] 本発明は、がん特異的免疫療法に使用することのできるヒト型化高機能性二重特異 性抗体、それを構成する一本鎖ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該 抗体の製造方法、及び、それらの医薬として用途等に関する。
背景技術
[0002] 力 Sん (悪性腫瘍）に対する主な治療法として、外科的除去、化学療法、放射線療法 、及び免疫療法等が組み合わされて用いられている。この中で、免疫療法は未だ開 発途上ではあるが多くの可能性を秘めており、これ力 の進展が期待されている。
[0003] がん特異的免疫療法は、がん細胞にのみ細胞傷害活性が働く治療法のことを指す 。抗体と細胞傷害活性を示す薬物とを結合させ、薬物に標的指向性を持たせるもの で、現在ではミサイル療法とも呼ばれる。現在、がん細胞において異常に発現してい る物質または細胞のがん化に伴い多少の変化が起こる物質を標的にして、副作用を 最小限にして抗体の能力を発揮できる抗原を使用するといつた方向で研究が進めら れている。このような抗原はがん関連抗原と呼ばれる。
[0004] 多重特異性抗体のうちの一つである二重特異性抗体 (Bispecific Antibody: BsAb)は 2つの異なる抗原に対して特異的に結合することが可能であるため、この特性を生か して特異的な抗腫瘍効果を持った治療薬としての利用法が可能であるとして、その 研究が盛んに行われている。ダイァボディ (diabody:Db)とはこのような二重特異性抗 体の最小単位であり、それぞれ同じ親抗体由来の重鎖 (H鎖)の可変領域 (V領域）（ 「VH」と表わされる）と軽鎖 (L鎖)の可変領域 (V領域） (「VL」と表わされる) VLとが互 いに非共有結合によりへテロ二量体を形成するという性質を利用し考案されたもので ある（Hollinger, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993)。
[0005] このようなダイァボディ型二重特異性抗体の特徴としては、低分子 (分子量約 60,00 0)であることによる低免疫原性及び腫瘍組織への高浸透性、更には、例えば、大腸 菌等の微生物を利用した安価な大量製造が可能であること、又、遺伝子工学を利用 した機能改変が容易であることを挙げることができる。
[0006] 本発明者等は、これまでに、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体 1 (Herl)抗体 528及び 抗 CD3抗体 OKT3を用いて作製したダイァボディ型二重特異性抗体 (Ex3)及び該 抗体をヒト型化したダイァボディ型二重特異性抗体は極めて強力な抗腫瘍効果を有 していることを見出している（特許文献 1 :尚、該文献中においては、「hExh3」と標記さ れている）。更に、他の抗体を用いて作製したダイァボディ型二重特異性抗体との比 較により、該 hExh3が上記の優れた効果を発揮する為には、ヒト型化 528抗体及びヒ ト型化 OKT3抗体の可変領域自身の構造的安定性、及びこれらの組み合わせが非 常に重要であることが推測された。
[0007] 又、ダイァボディ型二重特異性抗体以外の二重特異性抗体の調製等は、以下の 非特許文献 1及び非特許文献 2に記載されている。
特許文献 1：特開 2004— 242638号公報
特干文献 1： Alt M, et. al. Novel tetravalent and bispecific IgG— Ike antibody molec ules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gamma 1 Fc or CH3 r egion. FEBS Lett., 454, 90-4. (1999)
非特許文献 2 : Lu D, et. al. A fully human recombinant IgG- like bispecific antibody t o both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor recep tor for enhanced antitumor activity. J Biol Chem., 280, 19665-72. (2005) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] しかしながら、このヒト型化 Ex3を治療薬として更に展開させるためには、構造的な安 定性の向上や活性化リンパ球 (T-LAK)を共投与することなぐ単独で十分な効果を 発揮するための更なる改変、改良が望まれている。従って、本発明の主な目的は、こ のような優れた機能を有する二重特異性抗体を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、上記課題を解決すベぐヒト型化 Ex3の高機能化に向けて鋭意研究の 結果、 6種のヒト型化二重特異性抗体 (BsAb)を作製することに成功し、本発明を完 成した。尚、以下に記載する本発明においては、ヒト型化 Ex3を単に「Ex3」と標記する 即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
[態様 1]抗ヒト上皮細胞成長因子受容体 1抗体 528の H鎖のヒト型化可変領域 (5 H)及び L鎖のヒト型化可変領域（5L)、並びに、抗 CD3抗体 OKT3の H鎖のヒト型 化可変領域 (OH)及び L鎖のヒト型化可変領域 (OL)を含み、以下の ヽずれかの構 造：
(i) (OH5L) （ペプチドリンカ一） (5HOL)；
(ii) (OH5L)及び（5HOL)の 2種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるヒト型化ダ ィァボディ型二重特異性抗体がいずれか一方の一本鎖ポリペプチドによりヒンジ領 域を介してヒト抗体の 2つの Fc領域に結合して成る抗体；
(iii) (OH5L) - (ペプチドリンカ一） - (5HOL)、（OH5H) - (ペプチドリンカ一） - (5LOL)、又は（5L5H) - (ペプチドリンカ一） - (OHOL)力も成る一本鎖ポリぺプ チドがヒンジ領域を介してヒト抗体の 2つの Fc領域に結合して成る抗体；
(iv)抗体の VH及び VLを、夫々、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体 528のヒト型 化 H鎖のヒト型化可変領域及び L鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖 Fv(5HL)、又 は抗 CD3抗体 OKT3の H鎖のヒト型化可変領域を及び L鎖のヒト型化可変領域を含 む一本鎖 Fv (OHL)で置換して成る抗体、；
(v) (OH5H) - (ペプチドリンカ一） - (5LOL)；又は
(vi) (5L5H) （ペプチドリンカ一）一（OHOL)を有するヒト型化高機能性二重特異 性抗体であって、
上記の 5H、 5L、 OH、及び OLが、夫々、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、 及び配列番号 28に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一個又は数 個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって当該可変 領域を実質的に同等の抗原結合性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、前 記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[態様 2] (ii)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であ つて、該ヒト型化ダイァボディ型二重特異性抗体がプロテアーゼ切断部位を介してヒ ンジ領域に結合して 、ることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。 [態様 3] (iii)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であ つて、一本鎖ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合して ヽ ることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[態様 4] (ii)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構 成する 2種類のポリペプチドのうち、 OH5L又は 5HOLから成るポリペプチド力ヒンジ 領域を介してヒト抗体の Fcに結合して成るポリペプチド。
[態様 5] (iii)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構 成するポリペプチド。
[態様 6] (iv)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構 成する 2種類のポリペプチドのいずれか一方のポリペプチド。
[態様 7] (i)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体、又は 、態様 4、 5若しくは 6のいずれか一項に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸 分子。
[態様 8]態様 7記載の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現 ベクター。
[態様 9]プラスミドベクターである、態様 8記載のベクター。
[態様 10]態様 8又は 9記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[態様 11]哺乳動物細胞である態様 10記載の宿主細胞。
[態様 12]態様 11記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、態 様 4、 5又は 6のいずれか一項に記載のポリペプチドを回収し、精製することを特徴と する、 ( の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方 法。
[態様 13]態様 11記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ 、態様 4、 5又は 6のいずれか一項に記載のポリペプチドを回収し精製して得られた 2 種類のポリペプチドを会合せしめて、抗体分子を形成させることを特徴とする、（ii)又 は (iV)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方法。
[態様 14]態様 2又は 3に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体をプロテアーゼ で消化することにより Fc領域及びヒンジ領域を切断することから成る、夫々、 OH5L 及び 5HOLの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイァボディ型二重特異 性抗体、又は (i)の構造を有する態様 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体の 製造方法。
[態様 15] 態様 1〜3のいずれか一項に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗 体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
[態様 16]腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び Ζ又は減少せしめるた めのものであることを特徴とする態様 15記載の医薬組成物。
発明の効果
[0011] 本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体は、 Εχ3が更に高機能化されたものであ る。即ち、本発明によって提供されるヒト型化高機能性二重特異性抗体は、 Εχ3に比 ベて、細胞傷害活性が格段に向上し、安定性が向上し、更に、抗体依存性細胞傷害 (ADCC)及び細胞依存性サイト力イン (CDC)の誘導能が新たに付与され、各抗原 に対して二価で結合可能であり、プロテアーゼ消化により Tag等の付加配列を最小限 にした二重特異性抗体が容易に調製され、更には、プロテイン Aによる簡易精製が可 能となるものである。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体の構造及びその主な特徴を示す。
[図 2]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成するポリペプチドをコードす る発現ベクターの概略を示す。
[図 3-1]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成するドメインである可変領 域 5H及び 5Lのアミノ酸配列の一例を示す。
[図 3-2]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成するドメインである可変領 域 OH及び OLのアミノ酸配列の一例を示す。
[図 3-3]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成するドメインである CH1、 CH2&CH3、 PreSission認識配列、 Hinge (ヒンジ）配列のアミノ酸配列の一例を示 す。
[図 3-4]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成するドメインである CL、各 種リンカ一、シグナルペプチド、及び c-myc &His tagのアミノ酸配列の一例を示す。 圆 4-1]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体の精製の様子を示す SDS-PAGE 及び Western blottingの写真である。
圆 4-2]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体の精製の様子を示す SDS-PAGE 及び Western blottingの写真である。
[図 5]Flow cytometryによる結合試験結果を示す。
[図 6]PBMC proliferation asssay結果を示す。尚、各 BsAbの添カ卩濃度における棒グラ フは、夫々、左から右の順に、 lOpmol/ml, lpmol/ml, 0.1pmol/ml, 0.01pmol/mlであ る。
[図 7]T-LAKを用いた細胞傷害試験結果を示す。
[図 8]PBMCを用いた細胞傷害試験結果を示す。
圆 9]IgGによる傷害性阻害試験結果を示す。
[図 10]Ex3 scFv-Fcの抗原特異的な細胞傷害性を示す。 Ex3 scFv-Fcの各濃度にお ける棒グラフは、夫々、左から右の順に、 Colo-Tc, EGFR/CHO及び CHOを示す。
[図 l l]Ex3-Fc及び Ex3 scDb-Fc力 2分子の Ex3及び Ex3 scDbの調製の概念図を 示す。
[図 12]Ex3- Fc及び Ex3 scDb- Fcをプロテアーゼ消化した後、 Ex3及び Ex3 scDbを精 製した結果を示す電気泳動の写真である。
[図 13]Ex3- Fc及び Ex3 scDb- Fc力 調製した Ex3及び Ex3 scDbの細胞傷害試験結 果を示す。
[図 14]Ex3- Fc及び Ex3 scDb- Fc力 調製した Ex3及び Ex3 scDb比較検討結果を示 す。
[図 15]in vivo治療実験による Ex3 scFv-Fcの機能評価の結果を示す。
圆 16]市販抗体医薬との比較実験による Ex3 scFv- Fcの機能評価を示す。
[図 17]本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体である Ex3 tandem scFv及び Ex3 t andem scFv-Fc構造、及びそれらを用いた MTS assayの in vitro細胞傷害試験の結 果を示す。各抗体濃度の棒グラフは、夫々、左から右の順に、 Ex3, Ex3 tandem scFv
, Ex3-Fc,及び Ex3 tandem scFv-Fcを示す。
発明を実施するための最良の形態 [0013] 本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体 (以下、「本発明 BsAb」とも称す)は、抗ヒ ト上皮細胞成長因子受容体 1 (Her 1)抗体 528の H鎖のヒト型化可変領域 (5H)及 び L鎖のヒト型化可変領域 (5L)、並びに、細胞傷害性 T細胞で発現される表面抗原 の一種である CD3に対する抗 CD3抗体 OKT3の H鎖のヒト型化可変領域（OH)及 び L鎖のヒト型化可変領域 (OL)を含むものであり、それらの構造及びその主な特徴 は図 1に示されている。
[0014] 本発明 BsAbの第一の型（i) (Ex3 scDb)は、（OH5L) - (ペプチドリンカ一） - (5H OL)で示される構造を有する。即ち、 Ex3を構成する 2種類のポリペプチド鎖である O H5L及び 5HOLが更にペプチドリンカ一により結合されて、全体としてシングルポリ ペプチド鎖となったものである。この結果、 BsAb分子の構造が Ex3に比べてより安定 ィ匕される。更に、この BsAbを製造する際に必要な発現ベクターは一種で済み、その 結果、 Ex3に比べてより均一な BsAb分子を調製することが可能である。尚、「scDb」は 一本鎖 (Single Chain)ダイァボディ抗体を意味する。
[0015] 上記ペプチドリンカ一は、 OH及び OL、並びに、 5H及び 5L同士を会合させて、夫 々の抗原と特異的に反応し得る抗原結合部位が形成されるものである限り、その長さ などに特に制限はなぐ例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカ 一を改変したものの中力も選択して使用することが可能である。該ペプチドリンカ一 は、例えば 1〜約 20個のアミノ酸力もなるポリペプチドであってよぐ好ましくは約 1〜 約 15個のアミノ酸力もなるポリペプチド、さらに好ましくは約 2〜約 10個のアミノ酸か らなるポリペプチドが挙げられる。
[0016] 尚、上記ペプチドリンカ一は、 5H及び 5Lの間、又は、 OH及び OLの間のいずれか に挿入されていても良い。更に、各 Ex3単位において、 VH又は VLのいずれがポリべ プチド鎖の N末側に位置していても良い。即ち、本発明 BsAbの第一の型は、（1) N 末側： OH— 5L— (ペプチドリンカ一） - 5H-OL : C末側（実施例）、 (2) N末側： 5H -OL- (ペプチドリンカ一）—OH— 5L : C末側、（3) ?^末側：51^— 011—（ペプチド リンカ一）— OL— 5H : C末側、又は、（4) N末側： OL— 5H— (ペプチドリンカ一）—5 L-OH : C末側の 、ずれかの順で各可変領域を含んで成るものである。
[0017] 本発明 BsAbの第-の型（ii) (Ex3- Fc)は、 OH5L及び 5HOLの二種類のポリぺプ チドから構成されるヒト型化ダイァボディ型二重特異性抗体 (Ex3)カ^ヽずれか一方の ポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の 2つの Fc領域に結合しているもので ある。即ち、具体的には、ヒンジ領域を介してヒト抗体の Fc領域と結合した Ex3を構成 する 2種類のポリペプチドの何れか一方のポリペプチド（例えば、 (5HOL) ヒンジ領 域— Fc領域）、及び、 Ex3を構成するもう一方のポリペプチド (例えば、（OH5L) )の 2 種類のポリペプチドから構成されるものである。該抗体はこれら 2種類の一本鎖ポリべ プチドを共発現させた後に会合せしめることによって製造することが出来る。尚、「Fc 領域」とは、定常領域 (C領域)を構成する H鎖の C末端側の 2個のドメイン (CH2及 び CH3)を意味する。
[0018] この型の抗体において、 5HOL又は OH5Lの何れかのポリペプチドをヒンジ領域を 介してヒト抗体の Fc領域に結合させることができ、更に、各一本鎖ポリペプチドに含ま れる H鎖可変領域又は L鎖可変領域の何れがヒンジ領域と結合して ヽても良 ヽ。
[0019] 本発明 BsAbの第三の型（m) (Ex3 scDb-Fc)は、本発明 BsAbの第-の型（ii)にお いて、 Ex3の代わりに本発明 BsAbの第一の型 Ex3 scDb、下記の本発明 BsAbの第五 の型 (V)、又は本発明 BsAbの第六の型 (V)力も成る一本鎖ポリペプチドがヒンジ領域 を介してヒト抗体の Fc領域に結合した構造を有している。尚、ヒンジ領域には、（OH 5L) - (ペプチドリンカ一） - (5HOL)、 (OH5H) - (ペプチドリンカ一） - (5LOL) 、又は、（5L5H) - (ペプチドリンカ一） - (OHOL)力も成る一本鎖ポリペプチドに含 まれる 2種類の H鎖可変領域又は L鎖可変領域の何れがヒンジ領域と結合していて も良い。
[0020] 本発明 BsAbの第-の型 (ii)及び第三の型 (iii)を構成するドメインの数は IgGタイプ の免疫グロブリン分子と同じであり、これらの抗体は該免疫グロブリン分子に近い立 体的構造を有しているものと考えられる。更に、これら本発明 BsAbの第-の型 (ii)及 び第三の型（iii)において、 Ex3又は Ex3 scDbとヒンジ領域の間にプロテアーゼ切断 部位を介在させることにより、これらの BsAbをプロテアーゼ消化し、その後、後述する 各種精製操作を適宜行うことによって、 Ex3又は Ex3 scDbを容易に製造することが可 能となる。又、こうしたプロテアーゼ消化によって得られた Ex3又は Ex3 scDbは、従来 の方法で作製したものと比較してより高い細胞傷害活性を示す。 [0021] 本発明 BsAbの第四の型（iv) (Ex3 scFv-Fc)は、抗体（免疫グロブリン分子）の VH 及び VLを、夫々、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体 528の H鎖及び L鎖のヒト型 化可変領域を含む一本鎖 Fv(scFv) (5HL)又は抗 CD3抗体 OKT3の H鎖及び L 鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖 Fv (OHL)で置換して成る抗体である。即ち、該 抗体は、 IgGタイプの免疫グロプリン分子にお 、て H鎖の定常領域を構成する CH 1ド メインの N末端側に scFvである OHL又は 5HLのいずれか一方が結合してなるポリ ペプチド、及び L鎖の定常領域 CLの N末端側にもう一方の scFvが結合してなるポリ ペプチドの 2種類の一本鎖ポリペプチド力も構成されるものである。尚、 scFvに含ま れる H鎖可変領域又は L鎖可変領域の何れがヒンジ領域と結合して ヽても良 ヽ。従 つて、該抗体はこれら 2種類の（一本鎖)ポリペプチドを共発現させた後に会合せしめ ることによって製造することが出来る。
[0022] 以上の本発明の第二の型 (ii)、第三の型 (iii)及び第四の型 (iv)の BsAbは何れもヒ ト Fc領域を有しているために、プロテイン Aによる精製が容易であり、又、抗体依存性 細胞傷害 (ADCC)及び細胞依存性サイト力イン (CDC)を誘導することが出来、更 には、各抗原に対して二価で結合することが可能、という Ex3には見られない効果を 奏する。
[0023] 本発明 BsAbの第五の型（V)は、（OH5H) - (ペプチドリンカ一） - (5LOL)で示さ れる構造を有する。即ち、夫々、 2種類の H鎖力 成るポリペプチド鎖、及び 2種類の L鎖力 成るポリペプチド鎖が更にペプチドリンカ一により結合されて、全体としてシ ングルポリペプチド鎖となったものである。
[0024] 上記ペプチドリンカ一は、 OH及び OL、並びに、 5H及び 5L同士を会合させて、夫 々の抗原と特異的に反応し得る抗原結合部位が形成されるものである限り、その長さ などに特に制限はなぐ例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカ 一を改変したものの中力も選択して使用することが可能である。該ペプチドリンカ一 は、例えば 1〜約 20個のアミノ酸力もなるポリペプチドであってよぐ好ましくは約 1〜 約 15個のアミノ酸力もなるポリペプチド、さらに好ましくは約 2〜約 10個のアミノ酸か らなるポリペプチドが挙げられる。
[0025] 尚、上記ペプチドリンカ一は、 5H及び 5Lの間、又は、 OH及び OLの間のいずれか に挿入されていても良い。更に、各シングルポリペプチド鎖において、いずれの末端 が N末側に位置していても良い。即ち、本発明 BsAbの第五の型は、（1) N末側： OH - 5H- (ペプチドリンカ一）—5L— OL : C末側、（2) ?^末側：51^— 01^—（ペプチドリ ンカー） OH— 5H : C末側、（3) ?^末側：511— 011— (ペプチドリンカ一） OL— 5 L： C末側、又は、（4) N末側： OL— 5L— (ペプチドリンカ一） 5H— OH： C末側の いずれかの順で各可変領域を含んで成るものである。
[0026] 本発明 BsAbの第六の型（vi) (Ex3 tandem scFv)は、（5L5H) - (ペプチドリンカ一） 一（OHOL)で示される構造を有する。即ち、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体 5 28の H鎖及び L鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖 Fv (528 scFv) (5HL)と抗 CD3 抗体 OKT3の H鎖及び L鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖 Fv (OKT3 scFv)とを ポリペプチドリンカ一で縦列に連結させて、全体としてシングルポリペプチド鎖となつ たものである。ポリペプチドリンカ一は本発明 BsAbの第五の型に使用するものと同様 なものである。尚、 528 scFv又は OKT3 scFvのいずれかが一本鎖ポリペプチドにおけ る N末端側になっても良ぐ更に、 528 scFv及び OKT3 scFvの夫々において、各 H鎖 及び L鎖のいずれが N末端側になっても良い。その結果、夫々 2種類ある H鎖及び L 鎖の順序を考慮すると、本発明 BsAbの第六の型は総計 8種類の一本鎖ポリペプチド を含むものとなる。
[0027] 尚、本発明の BsAbの構成要素である Ex3を構成する 2つのポリペプチドの少なくとも 一方において、 H鎖の可変領域と L鎖の可変領域とを連結するリンカ一を含有してい る。本明細書中、「リンカ一 (linker)」とは、 H鎖の可変領域 (VH)と L鎖の可変領域 (V L)とを結合して一本鎖ポリペプチドを与える働きをするオリゴペプチド又はポリぺプ チドを指している。該ペプチドリンカ一は、二つのポリペプチドを機能的に結合せしめ て一つの一本鎖ポリペプチドを与えることのできるものであれば特に限定されず、例 えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカ一を改変したものの中から 選択して使用することが可能である。該ペプチドリンカ一は、例えば 1〜約 50個のアミ ノ酸カもなるペプチドであってよぐ好ましくは約 2〜30個のアミノ酸力もなるペプチド 、さらに好ましくは約 2〜20個のアミノ酸力 なるペプチドが挙げられる。ここで「機能 的に結合」せしめるとは、ポリペプチドを適切に折り畳み (folding)、オリジナルのタン ノ ク質（当該ポリペプチドは該オリジナルのタンパク質に由来するものあるいは該オリ ジナルのタンパク質力も誘導されたものである）の機能、例えば生物活性などの一部 あるいはその全てを模擬することができる三次元構造を持った融合タンパク質を与え るような結合を意味する。
[0028] また、当該リンカ一の長さは、結合されるペプチドの性状にもよる力 生成する一本 鎖ポリペプチド (ある 、は融合タンパク質）に所望の活性を与えるものであればょ 、。 該リンカ一の長さは、生成せしめられる一本鎖ポリペプチドが適切に折り畳まれて所 望の生物活性を得るに十分な長さのものであるべきである。また該リンカ一の長さは、 所望の生物活性について各種の長さのリンカ一で結合した一連の一本鎖ポリべプチ ドをテストすることにより実験して決定することができる。リンカ一については、上記ダ ィァボディ及びその製造技術に関連して挙げられた文献などを参照することができる
[0029] 尚、一本鎖ポリペプチドにおける VLと VHの配置は、 N-末端側が VLでそれにリンカ 一、続いて VHと配置されているもの (VL- Linker- VH構築体）でも、 N-末端側が VH でそれにリンカ一、続いて VLと配置されているもの (VH- Linker-VL構築体）のいず れであってもよい。
[0030] 本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体のドメインを構成する、 4種類のヒト型化 可変領域、即ち、 5H、 5L、 OH、及び OLの代表例として、夫々、配列番号 25及び 配列番号 26、並びに、配列番号 27及び配列番号 28 (図 3— 2)に示されるアミノ酸配 列を挙げることが出来る。
[0031] 本発明 BsAbに含まれる定常領域又は Fc領域はヒト抗体に由来するものである限り特 に制限はない。例えば、 CLは κまたは λ鎖の何れに由来するものでも良い。又、 Fc 領域又は H鎖定常領域は、通常、 IgGの γ鎖に由来するものが使用される。 CH1、 CH2及び CH3、並びに CLの一例として、夫々、配列番号 29及び配列番号 30、配 列番号 33に示したアミノ酸配列を有するものを挙げることができる（図 3— 3—、図 3 4)。
[0032] 更に、本発明 BsAbを構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる、 PreSission配列、ヒン ジ領域、ペプチドリンカ一、シグナルペプチド等のアミノ酸配列の代表例も図 3— 3及 び図 3— 4に示した。尚、 PreSission配列はプロテアーゼ切断部位を含む配列である 。使用するプロテアーゼの種類に特に制限はなぐ例えば、 Thrombin及び Factor Xa 等の当業者に公知の酵素を使用することが出来、それに応じて、プロテアーゼ切断 部位を含むアミノ酸配列を適宜選択することが出来る。
[0033] 更に、上記の各配列番号で示される各アミノ酸配列において、一個又は数個のァミノ 酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって、元のアミノ酸配列か らなるポリペプチドの機能'活性、例えば、可変領域の抗原特異性と実質的に保持し ているアミノ酸配列も本発明の BsAbを構成するポリペプチドとして使用することが出 来る。欠失、置換、挿入若しくは付加されるアミノ酸は、好ましくは、同族アミノ酸 (極 性 ·非極性アミノ酸、疎水性，親水性アミノ酸、陽性，陰性荷電アミノ酸、芳香族ァミノ 酸など）同士が置換される力、又は、アミノ酸の欠失若しくは付カ卩によって、蛋白質の 三次元構造及び Z又は局所的電荷状態に大きな変化が生じない、又は、実質的に それらが影響を受けないようなものが好ましい。このような欠失、置換又は付加される アミノ酸を有するポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法 (点突然変異導入 及びカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及び PCR 法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作製することが可能であ る。尚、これらの一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミ ノ酸配列は、元のアミノ酸配列全長に対して、 90%以上、好ましくは 95%以上、更に 好ましくは 99%以上の配列相同性を示すものということもできる。
[0034] 本発明 BsAbを構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる各領域又は配列をコードする 核酸分子 (オリゴヌクレオチド)の代表例は、上記の各配列番号に示された塩基配列 を有するものである。その他に、各配列番号に記載の塩基配列の全長と 90%以上、 好ましくは 95%以上、更に好ましくは 99%以上の配列相同性を示すような塩基配列 から成る核酸分子は、上記の各領域又は配列と実質的に同等の活性又は機能を有 するポリペプチドをコードしていると考えられるので、これらの核酸分子も上記の本発 明の核酸に含まれる。
[0035] 2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は 比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることによ り、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸 残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当す る部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位にお いて同一である。 2つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数 の全部位 (全アミノ酸又は全塩基)数に対する百分率で示される。
ここで、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド 配列（あるいは塩基配列）における 2本の鎖の間で該鎖を構成して 、る各アミノ酸残 基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなも のの量 (数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間 の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポ リヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られ ており、「相同性」（「同一性」とも言われる)なる用語は、当業者には周知である（例え 【 、 Lesk, A. M. (Ed.), し omputational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projec ts, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Compute r Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gri bskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M- Stockton Press, New York, (1991)等）。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、 Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (19 94);Carillo, H. & Lipman, D.， SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)等に開示され ているものが挙げられる力 これらに限定されるものではない。相同性を測定するた めの好まし!/、方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得 るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとし て組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための 好ましいコンピュータープログラム法としては、 GCGプログラムパッケージ（Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984))、 BLASTP、 BLASTNゝ FASTA ( Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol, 215: 403 (1990》等が挙げられる力 これらに 限定されるものでなぐ当該分野で公知の方法を使用することができる。
[0037] 更に、上記の各核酸分子は、各配列番号で表される塩基配列からなる DNAと相補 的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ上記 配列番号で示された各ポリペプチドの機能'活性と実質的に同じものを有するポリべ プチドをコードする DNAを含むものである。
[0038] ここで、ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab.Press, 2001)に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法 に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用 説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
[0039] ハイブリダィゼーシヨンは、例えば、カレント 'プロトコーノレズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイ ォロン■ ~" (Current protocols in molecular biology (.edited by Frederick M. Ausubel et al, 1987) )に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従 つて行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。
[0040] 本明細書にぉ 、て、 DNAのハイブリダィズにおける「ストリンジェント（stringent)な条 件」は、塩濃度、有機溶媒 (例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の 適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃 度を増加させる力、またはハイブリダィゼーシヨン温度を上昇させるかによつてストリン ジエンシー（stringency)は増加する。更に、ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件も ストリンジエンシーに影響する。この洗净条件もまた、塩濃度と温度によって定義され
、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジエンシーは増加する。
[0041] 従って、「ストリンジ ントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度力 例えば、全 体の平均で約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上である ような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成される ような条件を意味する。具体的には、例えば、温度 60°C〜68°Cにおいて、ナトリウム 濃度 150〜900mM、好ましくは 600〜900mM、 pH 6〜8であるような条件を挙げること が出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、 5 X SSC (750 mM NaCl、 75 m Mクェン酸三ナトリウム)、 1% SDS、 5 Xデンハルト溶液 50%ホルムアルデヒド、及び 42 °Cの条件でハイブリダィゼーシヨンを行い、 0.1 X SSC (15 mM NaCl、 1.5 mMクェン 酸三ナトリウム)、 0.1% SDS、及び 55°Cの条件で洗浄を行うものである。
[0042] 本発明の 6種の新規 BsAbを構成する一本鎖ポリペプチドを製造する為に使用する各 種の発現ベクターは、当業者であれば、当該技術分野における公知技術を用いて容 易に作製することが出来る。その一例として、ダイァボディ型二重特異性抗体の作製 に関して記載されている上記の特許文献 1の記載、特に、実施例 2、 11及び 12の 記載を挙げることが出来る。尚、本明細書の実施例に記載された 5HOL、 OH5L、 5H L (528 scFv)、 OHL (OKT3 scFv)、 OH- Fc (ヒト型化 OKT3抗体 Fc領域)、及び OL- C L (ヒト型化 OKT3抗体 L鎖)の各種発現ベクターに含まれる可変領域は全て、特許文 献 1に記載されて 、る方法でヒト型化されたものである。ヒト型化 OKT3抗体を構成す る定常領域、 CH1、 CH2、 CH3、及び CLはヒト IgGl抗体由来のものである。
[0043] 「ヒト型化」とは、ヒト免疫グロブリン (レシピエント抗体)の可変領域における相補性 決定領域 (complementarity-determining region; CDR)の残基の少なくとも一部にお いて、マウス、ラット、またはゥサギといったような非ヒト動物（ドナー抗体)であり且つ所 望の特異性、親和性、および能力を有する CDRに由来する残基によって置換されて いる抗体を意味する。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンの Fvフレームヮー ク (FR)残基が対応する非ヒト残基によって置換される場合もある。さらに、ヒト型化抗 体は、レシピエント抗体および導入された CDRまたはフレームワーク配列のいずれに おいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに優れた ものあるいは最適なものとするために行われる。更に詳しくは、 Jones et al.， Nature 3 21, 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature 332, 323—329 (1988);EP—B— 239400; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593—596(1992);および EP—B— 451216を参照する ことができる。
[0044] このような抗体の可変領域のヒト型化は当業者に公知の方法に従って実施すること が出来る。例えば、レシピエント抗体及びドナー抗体の 3次元ィムノグロブリンモデル を使用し、種々の概念的ヒト型化生成物を分析する工程により、ヒト型化抗体が調製 される。 3次元ィムノグロブリンモデルは、当業者にはよく知られている。更に詳細に つ！、ては、 W092/22653を参照することができる。 [0045] 従って、ヒト型化された可変領域の例として、可変領域における相補性決定領域 (C DR)がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来である抗体を挙げること ができる。
[0046] 本発明では更に、ヒト型化によって抗体自身の機能低下等が生起する場合がある ので、一本鎖ポリペプチド中の適当な部位、例えば、 CDR構造に影響を与える可能 性があるフレームワーク（FR)中の部位、例えば、 canonical配列又は veriner配列に おいて部位特異的変異を起こさせることによってヒト型化抗体の機能の改善をするこ とが出来る。
[0047] 本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成する各種一本鎖ポリペプチドに 、更に、ブドウ球菌ェンテロトキシン、大腸菌ェンテロトキシン及びコレラ菌ェンテロト キシンに代表される細菌性ェンテロトキシンまたはそれらの各種誘導体等を結合させ て細胞傷害活性を高めることも出来る。但し、これらのスーパー抗原は MHCclassII に対する強力な親和力によるサイト力イン依存性トキシックショック症候群を起こす可 能性があることが知られている。更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出及び精製 等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ (例えば、 c m ycタグ及び His— tag)をその末端等に含むことが出来る。
[0048] 本発明の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は当業 者に公知の方法で取得し、その塩基配列を決定することが出来る。例えば、マウス抗 体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌタレ ォチドプローブを使用することにより行うことができる（R. Orlandi et al.， Proc. Natl. A cad. Sci. USA 86: 3833-3837 (1993))。上記したモノクローナル抗体を産生するハイ プリドーマ細胞は、こうした方法における DNAの供給源として使用することが出来る。
[0049] より具体的には、本発明の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸は、既に構築され 当業者に公知である、一本鎖 Fv ((single-chain Fv)又は「scFv」）又は特許文献 1〖こ 記載されたダイァボディ型二重特異性抗体をコードする核酸に基づき、その中の VH ないし VLを別の特異性を有する抗体由来のものと夫々入れ換えることによって調製 することが出来る。ここで「scFv」とは、ある抗体の VHと VLのドメインを含有している もので、該ドメインが一本のポリペプチド鎖中にあるものを指している。一般的には該 Fvポリペプチドはさらに VHと VLのドメイン間にポリペプチドリンカ一を含有し、抗原 結合のために必要な構造を与えることを可能にしている。 scFvについては、 Rosenbu rg and Moore (Ed.), The Pharmacology of Monoclonal Antioodies , Vol. 113, Spnn ger-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照することができる。
[0050] 更に、一本鎖ポリペプチドにおけるヒト型化された可変領域をコードする核酸を作 製する場合には、以下の実施例に記載されているように、予め設計されたアミノ酸配 列に基づきオーバーラップ PCR法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一 本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制 限はなぐ例えば、 gDNA、 cDNA、化学合成 DNA及び mRN A等を含むものもので ある。
[0051] 具体的には、 cDNAライブラリーから、文献記載の配列に基づ!/、てハイブリダィゼー シヨンにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション (PCR)技術により単離されうる。 ー且単離されれば、 DNAは発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌 . c oli )細胞、 COS細胞、チャイニーズノヽムスター卵巣細胞 (CHO細胞）、またはィムノグ ロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフエクシヨンさせ、該組 換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。 PCR反応は、当該 分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことがで きるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 2 39: 487, 1988； H. A. Erlich ed.， PCR Technology, Stockton Press, 1989； D. M. Gl over et al. ed., "DNA Cloning , 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IR L Press, Oxford University Press (1995)； M. A. Innis et al. ed., PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPh erson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxf ord (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998—9002 (1988 )などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことが できる。また、 PCR法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製 造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施する ことちでさる。 [0052] ノヽイブリダィゼーシヨンについては L. Grossman et al. (ed.), "Methods in Enzymolo gy , Vol. 29 (Nucleic Acids and Protein Synthesis, Part E), Academic Press, New Yo rk (1974)などを参考にすることができる。 DNAなど核酸の配列決定は、例えば Sange r et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)などを参考にすることがで きる。また一般的な組換え DNA技術は、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (e d.)， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition) , Cold bpnng Harbor L aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び D. M. Glover et al. (ed. ), "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)などを参考にできる。
[0053] こうして取得された本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成する一本鎖 ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者 に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変すること ができる。この様に DNAを遺伝子的に改変又は修飾する技術は、 Mutagenesis: a Pr actical Approach, M.J. Mcpherson (Ed.), (IRL Press, Oxford, UK(1991)における総 説において示されており、例えば、位置指定変異導入法 (部位特異的変異導入法） 、カセット変異誘発法及びポリメラーゼチェインリアクション (PCR)変異生成法を挙げ ることがでさる。
[0054] ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸にぉ 、て、アミノ酸残基をコ ードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。 例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードす るコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を 改変する方法がある。このようにして、本発明のヒト型化されたダイァボディ型二重特 異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドを得ることが出来る。
[0055] 又は、本明細書の実施例に記載されているように、アミノ酸自体は変更せずに、そ の宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコー ドする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿 主細胞内における一本鎖ポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
[0056] 尚、リンカ一及びスーパー抗原等は、組換え技術等の遺伝子工学的手法及びぺプ チドィ匕学合成等の当業者に公知の任意の技術手段を用いて、本発明のヒト型化高 機能性二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド内に適宜導入することが出来 る。
[0057] 一本鎖ポリペプチドは、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化 学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、 例えば、上記核酸を含有する複製可能なクローユングベクター又は発現ベクターを 作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を 培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、それを回収し、精製することによって製 造することが出来る。本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体が 2種類の一本鎖 ポリペプチドから構成されている場合には、通常、このようなベクターにはそれらのう ちの!/、ずれか一方の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸が含まれて!/、る。このよう な場合には得られる 2種類のベクターは同一の宿主細胞に導入することが好ましい。 或いは、 2種類の一本鎖ポリペプチドの夫々をコードする 2種類の核酸を同一のベタ ターに含有させることも可能である。
[0058] ここで、「複製可能な発現ベクター (replicable expression vector)]および「発現べク ター (expression vector)」は、 DNA (通常は二本鎖である）の断片 (piece)をいい、該 D NAは、その中に外来の DNAの断片を挿入せしめることができる。外来の DNAは、異 種 DNA (heterologous DNA)として定義され、このものは、対象宿主細胞においては 天然では見出されない DNAである。ベクターは、外来 DNAまたは異種 DNAを適切 な宿主細胞に運ぶために使用される。ー且、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主 染色体 DNAとは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入さ れた（外来） DNAのいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来 DNA のポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来 DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる このようなベクターは、適切な宿主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配 列 (control sequence)とそれが機能するように (operably) (即ち、外来 DNAが発現でき るように）連結せしめられた DNA配列を含有する DNA構築物 (DNA construct)を意 味している。そうした制御配列としては、転写 (transcription)させるためのプロモータ 一、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切な mRNAリボソ一 ム結合部位をコードしている配列、ェンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻 訳 (translation)の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、、当業者に 公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺 伝子 (選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが 出来る。これらの各種配列又は要素は、外来 DNAの種類、使用する宿主細胞、培養 培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。
[0060] 該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体 (genomic i nsert)等の任意の形態が可能である。ー且、適切な宿主の中に形質転換で導入せし められると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得 る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
[0061] 宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、 代表的な宿主細胞としては、大腸菌 coli)等の原核細胞、及び、チャイニーズハム スター卵巣細胞 (CHO細胞）、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等 の真核細胞が挙げることができる。
[0062] このような宿主細胞における発現等により得られた一本鎖ポリペプチドは一般に分 泌されたポリペプチドとして培養培地から回収される力 それが分泌シグナルを持た ずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。一本鎖 ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤 (例えば、トライトン- X100)を 使用して膜から遊離せしめることができる。
[0063] 精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例え ば、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン 交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相 HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、 へパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン榭旨クロマトダラ フィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、 SDS-PAGE、硫酸アン モ -ゥム沈殿、及びァフィ二ティクロマトグラフィーによって好適に精製される。ァフィ 二ティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するペプチドタグとの親和力を 利用した効率が高 、好ま 、精製技術の一つである。
[0064] 尚、回収された一本鎖ポリペプチドは不溶性画分に含まれていることも多いために 、精製操作は、一本鎖ポリペプチドを可溶ィ匕し変性状態にした上で行うことが好まし い。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、グァ-ジン塩酸塩、尿素な どの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。
[0065] 更に、こうして精製された 2種類の一本鎖ポリペプチドを会合 (巻き戻し)せしめ、形 成された抗体分子を分離して回収することによって、本発明のヒト型化高機能性二重 特異性抗体を製造することが出来る。
[0066] 会合処理は、単独の一本鎖ポリペプチドを適切な空間的配置に戻すことによって、 所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリぺプ チド同志ある 、はドメイン同志を会合した状態に戻すと 、う意味も有して 、るので「再 会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構 成ということもでき、或いは、リフォールデイング（refolding)とも呼ぶことが出来る。会合 処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、 一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グァ-ジン)の濃 度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応 系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成され たヒト型化高機能性二重特異性抗体の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法 で行うことが出来る。
[0067] 本発明の医薬組成物は、本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体、一本鎖ポリ ペプチド、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたも のを有効成分として含有することを特徴とする。カゝかる有効成分は、以下の実施例に 示されているように、インビトロ及びインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（ 陽性)腫瘍細胞を有意に排除'殺傷 ·傷害する作用を有して！/、るので、本発明の医薬 組成物はこのような腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤として使用することが出来る。
[0068] 更に、以下の実施例に示されているように、本発明のヒト型化高機能性二重特異性 抗体を食作用又は細胞傷害活性を有する細胞及びヒト上皮細胞成長因子受容体を 発現する腫瘍細胞とインビボ又はインビトロで共存させることにより、食作用又は細胞 傷害活性を有する細胞におけるサイト力イン (例えば、 IFN— γ、 GM— CSF、 TFN — α等)の生産量を増カロさせることが出来るので、本発明のヒト型化高機能性二重特 異性抗体又はそれを有効成分として含有する医薬組成物はこの目的の為に使用す ることも出来る。例えば、インビトロでは、上記 2種類の細胞を含む培養系に本発明の ヒト型化高機能性二重特異性抗体を添加することによってサイト力インの生産を増加 させることがでさる。
[0069] 本発明の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等 の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜 決めることが出来る。典型的な 1回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可 能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使 用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る 適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
[0070] 本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法'目的、投与対 象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し 得る各種成分 (例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等)を適宜添加すること が出来る。
[0071] 本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、 噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リボソーム、マイクロエマルジョ ン等）、及びマクロエマルジヨン等の種々薬剤形態をとり得る。
[0072] 投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特に は胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤に よる方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注 射〖こより投与されることができる。尚、本発明の医薬組成物を投与する場合には、食 作用又は細胞傷害活性を有する細胞と共に投与することが好ましい。或いは、投与 前に本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体のような有効成分と上記細胞とを混 合することによって、投与前に該抗体を予め該細胞に結合させておくことが好ましい
[0073] 持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出 することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固 体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロ カプセル等の成型物の形態のものである。
[0074] 本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委 員会編、第十三改正 日本薬局方解説書、平成 8年 7月 10日発行、株式会社廣川書 店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造すること ができる。
[0075] なお、明細書及び図面において、用語は、 IUPAC-IUB Commission on Biochemica 1 Nomenclatureによる力、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意 味に基づくものである。
[0076] 以下に参考例及び実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に 本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである 。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本 願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。 本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解され るべさである。
[0077] 全ての参考例及び実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用 いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で 慣用的なものである。尚、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体 的な操作並びに処理条件などは、 DNAクローユングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning , 2nd ed.,し old Spring Harbor Laboratory.Cola Spring Harbor, N. Y. (1989)及び D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1 995)；特に PCR法では、 H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989； D. M. Glover et al. ed.,"DNA Cloning , 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach S eries), IRL Press, Oxford University Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed.,"PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、 また市販の試薬あるいはキットを用いて 、る場合はそれらに添付の指示書 (protocols) や添付の薬品等を使用して 、る。
[0078] 参者例 1 杭卜.皮細朐 容体 (EGFR)杭体のクローニング
抗 EGFR抗体産生マウス B細胞ハイプリドーマ 528 (ID:TKG0555)を東北大学力口 齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分譲して頂き、 ISOGEN (ニッボンジー ン社)を用い mRNAを抽出、 First- Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Biosciences 社)により cDNAを調製した。この cDNAを参考論文 1に基づき合成したクロー-ングプ ライマーを用い PCRを行い 528可変領域 VH (以下 5H)、 VL (以下 5L)の配列を明らかに した。尚、 528抗体を産生するノ、イブリドーマはアメリカン'タイプ'カルチャー'コレク シヨン（ATCC)において ATCC No.HB-8509として保管されており、かかる寄託機関 からも容易に入手可能である。
[0079] 〇参考論文 1 - Kreober, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable a omains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997).
[0080] 参者例 2 Ex3 diabodv発現ベクターの作製
ダイァボディ型二重特異性抗体である Ex3 diabody (以下 Ex3)は 5HOLと OH5Lの二 つの分子力 作製される。発現ベクターはすでに本発明者らによって構築されて!、る MUC1及び CD3を標的とした Mx3 diabody (以下 Mx3)発現ベクターを基に作製した（国 際公開第 WO02/06486 A1参照)。即ち、制限酵素部位を導入した A-Bプライマーを 用い PCR法により 5Hを増幅後 Ncol-Eaglで消化し、 Mx3発現ベクターの一つ pSNE4- MHOL (抗 MUCl抗体 MUSEll VH (以下 MH)- GGGGS (以下 Gl)-抗 CD3抗体 OKT3 V L (以下 OL》の MHと入れ換え pRA-5HOLを作製した。同様に C-Dプライマーを用い 5 Lを増幅後 EcoRV- SacIIで消化し、 pSNE4-OHML(OKT3 VH (以下 OH)- Gl- MUSEll VL (以下 ML》の MLと入れ換え pRA- OH5Lを作製した。 C末端側には検出のための c - mycペプチドタグ、並びに精製のための His-tag (Hisx6:ヒスチジン 6量体 tag)が並列 に導入されている。尚、抗 CD3抗体 OKT3 (ID :TKG0235)は東北大学加齢医学研 究所付属医用細胞資源センターより分譲して頂いた。又、 OKT3抗体を産生するハイ ブリドーマはアメリカン ·タイプ ·カルチヤ一 ·コレクション (ATCC)において ATCC No.
CRL-8001として保管されており、力かる寄託機関からも容易に入手可能である。 [0081] A Ncol- 5H back primer 5'-nnnccatggcccaggtccagctgcagcagtctg-3'
ほ己列番号: 1〕
B 5H— agl forward primer 5 -nnncggccgaggagactgtgagagtggt-3
ほ己列番号: 2〕
し EcoRV— 5L back primer 5 -nnngatatcctaatgacccaatctcc-3
ほ己列番号: 3〕
D 5L-¾acII forward primer 5 - nnnccgcggcacgtttgatttccagcttg- ύ'
ほ己列番号: 4〕
[0082] 参考例 3 ヒト型化 Εχ3遣伝子の作製
ヒト型化 ΟΚΤ3可変領域はすでに報告されており、マウス ΟΚΤ3に比べて十分に活 性を保持して 、ることも確かめられて 、る (参考論文 2)。参考論文 2に記載されて 、る ヒト型化 ΟΚΤ3可変領域のアミノ酸配列を基に、オーバーラップ PCR法により遺伝子 の全合成を行った。この際にコドンは大腸菌における至適コドンを用いた。至適コド ンに置換した全合成遺伝子を用いることでの大腸菌における発現量の増加はすでに 報告されている。
[0083] 528可変領域のヒト型化は CDR grafting法により行った。まず VH、 VLそれぞれ相同 性恢索を打い、各 CDR(complementarity determining region
)の長さ等を考慮した上でもっとも相同性の高い FR(frame work)をもつヒト抗体配列を 選択する。選択したヒト抗体の CDRを 528の CDRと入れ換えたアミノ酸配列を設計し、 対応するコドンについては先と同様に大腸菌至適コドンを用い、オーバーラップ PCR 法により遺伝子の全合成を行った。
[0084] u 考 g ^文 2 - Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-humanし D3 mon oclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994).
[0085] 参考例 4 ヒト型化 Ex3発現ベクターの作製
ヒト型化 Ex3 diabodyはヒト型化された 5HOLと OH5Lの二つの分子から作製される。 発現ベクターは Ex3を構成する各々の発現ベクターを基に作製した。即ち、制限酵素 部位を導入した E-Fプライマーを用い PCR法によりヒト型化 5Hを増幅後 Nco卜 Eaglで 消化し、 pRA- 5HOLの 5Hと入れ換えた。引き続きヒト型化 OL (以下、単に「OL」）を G- Hプライマーを用い増幅後 EcoRV-SacIIで消化し、 OLと入れ換え pRA-5HOL (ヒト型 ィ匕)を作製した。同様に I-Jプライマーを用いヒト型化 OHを増幅後 Ncoト Eaglで消化、 pRA- OH5Lの OHと入れ換え、 K-Lプライマーを用いヒト型化 5Lを増幅後 EcoRV- Sad Iで 5Lと入れ換え pRA-OH5L (ヒト型化）を作製した。 Ex3発現ベクターと同様 C末端側 には検出のための c-mycペプチドタグ、並びに精製のための His-tag (Hisx6:ヒスチジ ン 6量体 tag)が並列に導入されて 、る。
[008り」 E Ncoト 5H back primer 5 -nnnccatggcccaggtgcaactggttcagagc-3'
ほ己列番号: 5〕
F 5H- Eagl forward primer 5 - nnncggccgagctcacggtaaccagcgta-
〔配列番号: 6〕
G EcoRV—〇L back primer 5 -nnngatatccagatgacccagag-3
ほ己列番号: 7〕
H OL- SacII forward primer 5'- nnnccgcggcgcgggtaatctgc- 3'
ほ己列番号: 8〕
I Ncoト OH back primer 5 '-nnnccatggcccaggtgcaactggtg-3 '
〔配列番号: 9〕
J OH- Eagl forward primer 5 ' -nnncggccgagctaacggt cacc-3 '
〔配列番号: 10〕
K EcoRV- 5L back primer 5し mmgatatcgtgatgacccagagccc- ほ己列番号: 11〕
L 5L— SacII forward primer 5 -nnnccgcggcgcgtttaatttccactttggtgccac-3
〔配列番号： 12〕
実施例 1
[0087] 本発明 BsAb発現ベクターの作製 (闵 1及び 2参照)
(1)第一の型
制限酵素部位を導入した a_bプライマーを用い PCR法により 5HOL (ヒト型化されたも の、以下、同様）を増幅後 BamHト Xholで消化し、動物細胞発現ベクター pKHト Neo に挿入した。続いて c-dプライマーを用い OH5Lを増幅後、更に e_f7°ライマーを用い て 2nd PCRを行い Nhelと BamHIで消化、 5HOLの上流に挿入し pKHI- Ex3 scDbを作 製した。 C末端側には検出のための c-mycペプチドタグ、並びに精製のための His-ta g (Hisx6:ヒスチジン 6量体 tag)が並列に導入されて!、る。
[0088] (2)第二の型
Ex3-Fcは OH5L、 5HOL-Fcから構成されるため後者のみ新たに作製した。まず 5HO L、及び OH- Fcをそれぞれ g-hプライマー、 i_jプライマーで増幅を行った。続いて PCR 産物を混合し、さらに e- jプライマーで PCR増幅後 Nhelと Xholで消化し、 pKHI-Ex3 sc Dbの Ex3 scDbと入れ換え pKHI- 5HOL- Fcを作製した。
[0089] (3)第三の型
続いて a- jプライマーを用い 5HOL- Fcを増幅後 BamHト Xholで消化し、 pKH卜 Ex3 sc Dbの 5HOLと入れ換え pKHI- Ex3 scDb- Fcを作製した。 Ex3- Fcゝ Ex3 scDb- Fcはいず れも Fcの上流に PreScissionプロテアーゼ切断部位を導入している。
[0090] (4)第四の型
Ex3 scFv-Fcは OHL- Fcと 5HL- CLから構成される。 c-kプライマーを用い OHLを増幅 後、さらに e-kプライマーを用いて 2nd PCRを行い Nhelと Xholで消化し、 pKHI-OH-Fc の OHと入れ換え pKHI- OHL- Fc作製した。続いて g- 1プライマーで 5HLを増幅後、さら に e-1プライマーを用いて 2nd PCRを行い Nhelと Narlで消化し、 pKHI-OL-CLの OLと 入れ換え pKHI- 5HL- CLを作製した。尚、 pKHI- Neo、 pKHI- Hygベクターはそれぞれ Invitrogen社製の pcDNA3.1- Neo、 pcDNA3.1- Hygのマルチクロー-ングサイトに動物 細胞発現用分泌シグナル配列、及び転写効率を上げるための Kozak配列を導入した ものである。
[0091] a G2 linker- 528H back primer:ほ己列番号： 13〕
を TLしたるですで 5'-ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtgcaactggttcagagc -3 ' b c-myc & His— tag— Xhol forward primer:〔酉歹 U番号： 14〕
5 ' -nnncggccgaggagactgtgagagtggt-3 ' c signal H-〇H back primer: 〔酉己列番号： 15〕
5'-gtaactgcaggtgtccactcccaggtgcaactggtgcagag-3' d 5L-G3 linker forward primer: 〔酉己列番号： 16〕
5'-ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctgcagccgcggcgcgtttaatttccacttt ggt-3'
e Nheト signal H back primer: 〔酉己列番号： 17〕
5'-nnngctagccaccatggattgggtgtggaccttgctattcctgttgtcagtaactgcaggtgtccactcc-^ f G4 linker- BamHI forward primer:〔配列番号： 18〕
5， - nnnggatccaccaccaccggagccgccgccgccagaacc-3， g signal H- 5H back primer: 〔目己列番号： 19〕
5， - gtaactgcaggtgtccactcccaggtgcaactggttcagag-3， h OL-precission forward primer:〔酉己歹' J番 ： 20J
5， - cccctggaacagaacttccagggcgcgggtaatctgcagttt-3，
1 prescission- hinge back primer:〔酉己列番 ：21〕
5'- ctggaagttctgttccaggggcccgacaaaactcacacatgc-3' j CH3- Xhol forward primer:〔配列番号： 22〕
5， - nnnctcgagtcatttacccggagacagggagag-3， k hOL-XhoI forward primer:〔配列番号： 23〕
5，― nnnctcgagcgggtaatctgcagtttggta-3，
1 h528L-NarI forward primer:〔配列番号： 24〕 5 '— nnnggcgccgccacagtgcgtttaatttccactttggtgcc—3 実施例 2
[0092] 動物細胞を用いた 4糠の BsAbの調製
Ex3 scDb :発現ベクター pKHI-Ex3 scDbを CHO細胞に遺伝子導入し、 G418を含む 選択抗生剤培地でスクリーニング後、限界希釈法を行い、細胞傷害試験 (以下 MTS a ssay)とフローサイトメトリーにより安定産生株のクローユングを行った。ローラーボトル を用いて無血清培養を行い、培養上清を PBSに透析後、金属キレートァフィユティー クロマトグラフィー (以下 IMAC)により精製した。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ 以下 SDS- PAGE)、及び Western blottingにより精製を確認した（図 4 1)。
Ex3- F 発現ベクター pKHI- OH5L、 pKHI- 5HOL- Fcを CHO細胞に共遺伝子導入 し、 G418、及び Hygromycinを含む選択抗生剤培地でスクリーニング後、同様にクロ 一ユングを行 、プロテイン Aカラムクロマトグラフィーにより精製した（図 4 1)。
Ex3 scDb- F 発現ベクター Ex3 scDb- Fcを CHO細胞に遺伝子導入し、 G418を含 む選択抗生剤培地でスクリーニング後、 Ex3-Fcと同様に調製した（図 4— 2)。
Ex3 scFv- F 発現ベクター pKHI- OHL- Fc、 pKHI- 5HL- CLを CHO細胞に共遺伝 子導入し、 G418、及び Hygromycinを含む選択抗生剤培地でスクリーニング後、 Ex3- Fcと同様に調製した（図 4— 2)。
それぞれ、精製度が高く目的の分子が調製されている様子が分かる。精製後の収量 は培養液 1じ当たりそれぞれ約 1 mgであった。
実施例 3
[0093] 4糠の BsAbの機能評価（1) - Flow cytometric analysis
Flow cytometryにより 4種の BsAbと Ex3の各細胞に対する結合を調べた。標的細胞 に対し一次抗体として Ex3、 Ex3 scDbを 200 pmol、それ以外の BsAbは 100 pmol加え 3 0分、 4°Cで静置後、 0.1%NaN /PBSで 2回 Washし、続いて検出抗体として anti- c- myc
3
饥体、あるいは anti- human Fc
抗体を加え同様の操作を行！、蛍光を測定した。ネガティブコントロール (以下 NC)は 検出抗体以降の操作を行い、ポジティブコントロール (以下 PC)には検出抗体として T - LAK細胞に対しては OKT3 IgG、 TFK-1細胞に対しては 528 IgGをそれぞれ用いた 。結果はどちらの細胞に対しても結合することが分かり、特に二価性を有する BsAbは それぞれ IgGに匹敵、あるいは若干上回る強 、結合が見られた（図 5)。
実施例 4
[0094] 4糠の BsAbの機能評価（2) - PBMC proliferation assay
末梢血リンパ球 (PBMC)を 5 X 104個 /50 ml/wellとなるように 96穴プレートにまき、濃度 調整した各 BsAbを加えて、 37 °Cで 48 hrインキュベートを行った。続いて、 5-ブロモ- デォキシゥリジン (BrdU)をカ卩え、その取り込み量を 450 nmの吸光度を測定することで 増殖した PBMCを定量した。結果、ヒト Fc領域を融合した Ex3- Fc、 Ex3 scDb- Fc、 Ex3 scFv-Fcにおいてのみ PCの PHAをカ卩えた時に匹敵する強力な PBMCの増殖作用が 確認された。これは、ヒト Fc領域が PBMCに含まれる NK細胞等に存在する Fcレセプタ 一に結合し、活性ィ匕シグナルが伝達されたためであると考えられる（図 6)。
実施例 5
[0095] 4種の BsAbの機能評価（3) - in vitro細朐傷害試験 (MTS assay)
MTS assayにより、 TFK_1細胞が T_LAK細胞によりどれほど傷害されたかを測定した 。セルカウントを行い、 RPMI lOOmLあたり細胞 5 X 103個になるよう調整し、 96穴プレ ートに lOOmLずつ分注、 37°Cでー晚静置した。 目的蛋白質を目的濃度になるように R PMIで希釈、前日準備したプレートに蛋白質を 50mLずつ分注。 LAK細胞を目的 E/T 比になるように RPMIで希釈し、 50mLずつ分注（E/T比： effector(T- LAK細胞)/ targe t(TFK-l細胞)比)。 37°Cで 48時間培養。プレートの培養液を取り除き、 PBSにより洗 浄、 MTS、 PMS、 RPMIを加え、 37°Cで 30〜60分インキュベート。プレートリーダーで 49 Onmの吸光度を測定した。
(注） MTS試薬 (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Pr omega社製)、 PMS(CellTiter 9b Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega社製)
結果は、 Ex3 scDbは従来の Ex3と同等の濃度に依存した細胞傷害性が確認され、ま た、 Ex3- Fc、 Ex3 scDb- Fcはそれぞれ同等、かつ Ex3の約 10倍の効果を示した。さら に、 Ex3 scFv-Fcは Ex3の約 1/1000の濃度で同等の効果を示した（図 7)。 PBMCを用いた MTS assayも同様に行った結果、 Ex3 scDbは Ex3と同等、また Ex3- Fc 、 Ex3 scDb- Fc、 Ex3 scFv- Fcの順により強い細胞傷害活性が見られた。 PBMCでの 効果は、臨床応用に向けた単独での効果に期待力 Sもたれる（図 8)。
さらに Ex3 scFv-Fcに関して、各種 IgGをカ卩えた阻害試験では、親抗体である OKT3、 及び 528 IgGでは濃度に依存した傷害性の低下が見られた力 系に無関係の OKT8 、 MUSE11 IgGの添加では全く傷害性の阻害が見られな力つた（図 9)。
実施例 6
[0096] Ex3 scFv- Fcの機能評価 - in vitro細朐傷害試験 release assay)
in vitroでの細胞傷害性の評価は MTS assayにより簡便に行える力 これは腫瘍細胞 の成長阻害 (growth inhibition)を評価する方法でまた付着細胞にしか用いることがで きない。このため直接的な傷害活性 (cytotoxicity)を調べるため51 Cr release assayを 行った。
結果は Ex3 scFv-Fcの濃度、及び抗原に依存した傷害性が見られ、また Ex3に比べ て約 1/500の濃度で同等の傷害性が見られた（図 10)。
実施例 7
[0097] Ex3- Fc、 Ex3 scDb- Fcから 2分子の Ex3、 Ex3 scDbの調製
Ex3-Fc及び Ex3 scDb-Fcは、 PreScissionプロテアーゼ消化により Fc領域を切断す ることで、それぞれ二分子の Ex3、 Ex3 scDbを調製できるように設計している（図 1、図 11)。
Ex3- Fc及び Ex3 scDb- Fcを GST- tagが付カ卩した PreScissionでプロテアーゼ消後、 Glu tathione固定化榭脂を用いたカラムクロマトグラフィーを用いて PreScissionを除去し た。続いて、プロテイン Aカラムクロマトグラフィーを用いて切断された Fc領域及び未 消化の Ex3- Fc、 Ex3 scDb- Fcを除去し、 Ex3及び Ex3 scDbを調製、 SDS- PAGEにより 各操作段階の分子を確認した。収率は、 Ex3が 49%、 Ex3 scDbが 68%であり、純度も高 く PreScissionプロテアーゼを用いた Ex3、 Ex3 scDbの新規調製法の有用性が示され た（図 12)。
実施例 8
[0098] Ex3- Fc、_Ex3 scDb- Fcか レた Ex3 Ex3 scDbの機能評価 Ex3- Fc、 Ex3 scDb- Fcからプロテアーゼ消化により調製した Ex3、 Ex3 scDbと従来の 単独発現させ IMACにより調製した Ex3、 Ex3 scDbとの機能の比較を行うために細胞 傷害性試験を行った。結果、プロテアーゼ消化により調製した 2種類の分子は同等の 傷害性を有しており、かつ従来の方法で調製した Ex3、 Ex3 scDbより高い効果を示し た（図 13)。
更に Fcを融合した BsAbとの比較により Ex3- Fc、 Ex3 scDb- Fcとほぼ同等の細胞傷害 性を有していることも明らかになった（図 14)。この高い効果は、従来の IMAC精製に は必要であった tag等のペプチドの付加を最小限に抑えたこと、新規精製法による精 製度の高さ等が考えられ、プロテアーゼを用いた Ex3、 Ex3 scDbの調製法の有用性 が示された。
実施例 9
[0099] Ex3 scFv-Fcの機能評価 - in vivo治療実験
SCIDマウスを納入後、 10数日後に 5xl06個の TFK-1細胞をマウスに皮下注射した。 TFK-1細胞移植後 10日後 (腫瘍径約 4 mmから 6 mm)、 2xl06個の T- LAK細胞及び IL- 20 (500IU)と Ex3、並びに Ex3 scFv_Fc単独を 4日連続で尾静脈より注入した。一週間 ごとに腫瘍径を測定し、長径と短径から腫瘍体積を概算した。
結果、腫瘍が成長し続けた T-LAK細胞単独投与群に比べ、 Ex3を g/mouse/d ay投与した群では、以前の結果を再現する腫瘍の縮退効果が見られた (図 15)。一方 、 Ex3 scFv-Fcは T-LAK細胞を共投与しなくても単独で十分な効果を示した。これは 価数の増加、あるいは Fc領域によって ADCCが誘導されたことに起因すると考えられ 、単独での有意な効果は臨床応用に大いに期待力 Sもたれる。
実施例 10
[0100] Ex3 scFv-Fcの機能評価 市販杭体医薬 の比較実験
巿販抗体医薬ハーセプチンが認識する HER2と Ex3 scFv-Fcが認識する EGFRの両 抗原が陽性のヒト乳がん細胞株 SK-BR3を用いて比較実験を行った。リンパ球とがん 細胞との架橋により細胞傷害性を誘導する二重特異性抗体は図 7及び図 8に示すよ うにエフェクター細胞として PBMCより T-LAK細胞を用いた方がより強 、効果を示す。 ハーセプチン（Herceptin)の主な作用機序の一つは Fc領域を介した ADCCとされて いるため Fcレセプター陽性細胞が多く含まれる PBMCをエフェクター細胞として用い た方がより強い効果が見られた (図 16)。し力しながらいずれの細胞をエフェクター細 胞として用いても Ex3 scFv-Fcはハーセプチンに対し有意な効果を示した。
実施例 11
[0101] Rx3 某盤 する亲斤親二重特虽件^: ：の構 機 評
Ex3を基盤とする更に高機能な二重特異性抗体の構築を目指して、図 17に示すよう なさらに二種の分子を設計した。即ち、 528 scFvと OKT3 scFvをポリペプチドリンカ一 で縦列に連結させた Ex3 tandem scFv (第六の型）、及び、更にこれに Fcを付カ卩させ た Ex3 tandem scFv- Fc (第三の型）を構築し、比較検討を行った。
それぞれの発現ベクターは、本発明者等によりで既に構築されている 5LH (528 scFv LH型)、 OHL (OKT3 scFv)ゝ OH- Fc (OKT3 H鎖)発現ベクターを基に作製した (ここ ではすベての可変領域はヒト型化後のものである)。まず 5LH、及び OHLをそれぞれ m-nプライマー、 o-bプライマーで増幅を行った。続いて PCR産物を混合し、さらに e-b プライマーで PCR増幅後 Nhelと Xholで消化し、 pKHI-Neoに挿入することで、発現べ クタ一 pKHI- Ex3 tandem scFvを作製した。続いてこの Ex3 tandem scFv、及び OH- Fc をそれぞれ e-hプライマー、 ·プライマーで増幅を行った。続いて PCR産物を混合し、 さらに e-jプライマーで PCR増幅後 Nhelと Xholで消化し、 pKHI-Neoに挿入することで 、発現ベクター pKHI- Ex3 tandem scFv- Fcを作製した。
それぞれ、 CHO細胞に遺伝子導入し、 G418を含む選択抗生剤培地でスクリーニン グ後、上記同様にクローユングを行いプロテイン Aカラムクロマトグラフィーにより精製 した。
続いて MTS assayにより in vitro細胞傷害試験を行ったところ、どちらも Ex3-Fcと同等 、あるいはそれ以上の、 Ex3を遙かに凌駕する効果が見られた。以上のことから、 Ex3 を基盤とする二重特異性抗体が 、ずれも利用価値が高 、ことが示されたと 、える。
[0102] m signal H- 5L back primer:〔配列番号： 39〕
5し gtaactgcaggtgtccactccgatatcgtgatgacccagagccc-3' n 5H-G1-OH forward primer:〔配列番号： 40〕 5'- ctgcgaaccgcccccgccggccgagctcacggtaacca -3 o 5H-G1-OH back primer:〔配列番号： 41〕
5'- ccggcgggggcggttcgcaggtgcaactggtgcagagc -3'
産業上の利用可能性
本発明のヒト型化高機能性二重特異性抗体によって、活性化リンパ球 (T-LAK)を共 投与することなぐ単独で十分な効果を発揮することが出来る抗体医薬の開発が可 能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 抗ヒト上皮細胞成長因子受容体 1抗体 528の H鎖のヒト型化可変領域 (5H)及び L鎖 のヒト型化可変領域（5L)、並びに、抗 CD3抗体 OKT3の H鎖のヒト型化可変領域（ OH)及び L鎖のヒト型化可変領域 (OL)を含み、以下の 、ずれかの構造：
(i) (OH5L) （ペプチドリンカ一） (5HOL)；
(ii) (OH5L)及び（5HOL)の 2種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるヒト型化ダ ィァボディ型二重特異性抗体がいずれか一方の一本鎖ポリペプチドによりヒンジ領 域を介してヒト抗体の 2つの Fc領域に結合して成る抗体；
(iii) (OH5L) - (ペプチドリンカ一） - (5HOL)、（OH5H) - (ペプチドリンカ一） - (5LOL)、又は、（5L5H) - (ペプチドリンカ一） - (OHOL)力も成る一本鎖ポリべ プチドがヒンジ領域を介してヒト抗体の 2つの Fc領域に結合して成る抗体；
(iv)抗体の VH及び VLを、夫々、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体 528のヒト型 化 H鎖のヒト型化可変領域及び L鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖 Fv(5HL)、又 は抗 CD3抗体 OKT3の H鎖のヒト型化可変領域を及び L鎖のヒト型化可変領域を含 む一本鎖 Fv (OHL)で置換して成る抗体、；
(v) (OH5H) - (ペプチドリンカ一） - (5LOL)；又は
(vi) (5L5H) （ペプチドリンカ一） (OHOL)
を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、
上記の 5H、 5L、 OH、及び OLが、夫々、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、 及び配列番号 28に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一個又は数 個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって当該可変 領域を実質的に同等の抗原結合性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、前 記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[2] (ii)の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、該ヒ ト型化ダイァボディ型二重特異性抗体がプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域 に結合して!/、ることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[3] (iii)の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、一 本鎖ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを 特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[4] (ii)の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成する 2 種類のポリペプチドのうち、 OH5L又は 5HOLから成るポリペプチド力ヒンジ領域を 介してヒト抗体の Fcに結合して成るポリペプチド。
[5] (iii)の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成するポ リペプチド。
[6] (iv)の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を構成する 2 種類のポリペプチドのいずれか一方のポリペプチド。
[7] (0の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体、又は、請求項
4、 5若しくは 6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
[8] 請求項 7記載の核酸を含有する複製可能なクローユングベクター又は発現ベクター
[9] プラスミドベクターである、請求項 8記載のベクター。
[10] 請求項 8又は 9記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[11] 哺乳動物細胞である請求項 10記載の宿主細胞。
[12] 請求項 11記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、請求項 4 、 5又は 6のいずれか一項に記載の一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを特 徴とする、（0の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体の製 造方法。
[13] 請求項 11記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、請求項 4 、 5又は 6の 、ずれか一項に記載のポリペプチドを回収し精製して得られた 2種類の ポリペプチドを会合せしめて、抗体分子を形成させることを特徴とする、（ii)又は (iv) の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方法。
[14] 請求項 2又は 3に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体をプロテアーゼで消化す ることにより Fc領域及びヒンジ領域を切断すること力も成る、夫々、 OH5L及び 5HO Lの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイァボディ型二重特異性抗体、 又は (i)の構造を有する請求項 1記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方 法。
[15] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体を有効成 分として含有することを特徴とする医薬組成物。
[16] 腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び Z又は減少せしめるためのものであ ることを特徴とする請求項 15記載の医薬組成物。
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