WO2007101365A1 - Nouveau composé de flavane et ses utilisations - Google Patents

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WO2007101365A1
WO2007101365A1 PCT/CN2006/000337 CN2006000337W WO2007101365A1 WO 2007101365 A1 WO2007101365 A1 WO 2007101365A1 CN 2006000337 W CN2006000337 W CN 2006000337W WO 2007101365 A1 WO2007101365 A1 WO 2007101365A1
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test
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cells
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PCT/CN2006/000337
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Xinsheng Yao
Rongrong Wu
Yaolan Li
Bo Liyuan
Xiaoyu Guo
Jiechang Huang
Jiekun Xu
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Lifetech Pharmaceuticals Ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/60—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P37/08—Antiallergic agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine, and in particular to novel flavanoids and their use for anti-inflammatory, anti-allergic, anti-oxidative and anti-viral. Background technique
  • Chinese herbal medicine monkey earrings [Pithecellobium clypearia enth. /Archidendron clypearia (Jack) . Nielsen] is a genus of mimosa. Monkey earrings are arbor, distributed in tropical Asia. Monkey earrings are also known as eucalyptus trees, chicken trees, etc. Their leaves, seeds and fruits can be used as medicine, and folks are used for the treatment of burns and burns.
  • the monkey earring anti-inflammatory tablet made from the water extract of the monkey earrings has been published in the sixth volume of the Chinese Medicine Prescription Standard of the Ministry of Health of the People's Republic of China.
  • the object of the present invention is to isolate an active ingredient from a plant of the genus Champion, and to develop its use in the fields of medicine and the like.
  • the technical scheme of the present invention is: a flavan compound which can be represented by the following chemical formula is isolated from an ethyl acetate extract of a 60% ethanol extract of Pithecellobium clypearia enth./Archidendron clypearia (Jack). Nielsen. :
  • the chemical name is (a)-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate, [(-)-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate ].
  • the compound has anti-inflammatory, anti-allergic, anti-oxidant and anti-viral effects, can be used for the preparation of anti-inflammatory or anti-allergic or anti-viral drugs, and can be used as an antioxidant additive for pharmaceuticals or foods or cosmetics.
  • the present invention uses the twigs and leaves of the monkey earrings [Pithecellobium clypearia enth./Archidendron clypearia (Jack). Nielsen] as raw materials, extracts with 60% ethanol, and then is dissolved in ethyl acetate, followed by Liquid-liquid extraction, macroporous resin column, octadecyl bonded silica reverse phase column, dextran gel column and the like are separated by various column chromatography methods to obtain a flavan compound represented by the above formula (I).
  • Their structures were identified by physicochemical constants and modern spectroscopy (IR, MS, NMR).
  • the macrophage NO release inhibitory activity DPPH free radical scavenging activity, oxygen free radical scavenging ability (ORAC), histamine release inhibitory activity test and in vitro antiviral experiment were used to investigate the anti-inflammatory, anti-allergic and anti-drug resistance of the compound. Oxidation and antiviral effects.
  • the compound showed strong activity, which was stronger than the control drug resvermtrol; in the inhibition activity of histamine released from mast cells, the compound Shows strong inhibitory activity; in the 1,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity experiment, the compound showed strong activity, stronger than the positive control drug vitamin C; in oxygen free radicals In the clearance test, the compound was more active than the control drug vitamin C.
  • the compound has a strong inhibitory effect on the syncytial virus and the parainfluenza virus, and has a certain inhibitory effect on influenza virus and enterovirus. '
  • the (-)-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate compound provided by the invention can be used for oral administration, or can be administered orally, or can be used as medicine, food or Cosmetic additives, the amount of use can vary depending on the drug and the different uses. Dosage: Adults l ⁇ 1000mg per day is more suitable, external dose 0.1 ⁇ 100mg is more suitable.
  • the compound is formulated into a tablet with a conventional pharmaceutical carrier such as an excipient, a disintegrating agent, a binder, an emulsifier, a lubricant, a surfactant, a stabilizer, a coating agent, and the like.
  • a conventional pharmaceutical carrier such as an excipient, a disintegrating agent, a binder, an emulsifier, a lubricant, a surfactant, a stabilizer, a coating agent, and the like.
  • Oral preparations such as capsules, granules, and emulsions; when administered orally, injections, infusions, or ointments may be prepared, and the above preparations may be prepared by conventional pharmaceutical preparation techniques.
  • DRAWINGS Figure 1 is an infrared absorption spectrum of Compound I
  • Figure 3 is a hydrogen-nuclear magnetic resonance spectrum of compound I
  • Figure 4 shows the 13 carbon-nuclear magnetic resonance spectrum of compound I.
  • FIG. 5 is a structural diagram of Compound I showing hydrocarbon remote correlation (HMBC correlation)
  • the monkey earrings were harvested with 7.6 kg of leaves, extracted twice with 60% ethanol, and each time for 2 hours, the ethanol was recovered under reduced pressure to obtain 1.5 kg of extract.
  • the 1.2 kg extract was dispersed with 12.0 L of water and extracted with chloroform and ethyl acetate in that order.
  • the ethyl acetate extract was passed through a large pore resin column modeled on Diaion HP-20, and 9 fractions were obtained by gradient elution with methanol-water.
  • the third fraction was passed through a gel of the type MCI GEI CHP 20P.
  • the column was separated by gradient elution with methanol-water to obtain 6 sub-slips.
  • the second sub-slip was separated by a hydroxypropyl dextran gel column of type Sephadex LH-20, using methanol. - Water was subjected to gradient elution, and 7 sub-slips were obtained. The sixth sub-segment was separated by octadecyl-bonded silica gel reverse phase column, gradient elution with methanol-water, thin layer inspection The eluate was collected, concentrated, dried and recrystallized from 40% methanol to give compound. The structure was identified by physicochemical constants and modern spectroscopy (IR, MS, NMR), and the compounds of the following table were obtained. Name formula formula formula
  • the 3% FeCl 3 ethanol solution showed blue spots on the ink, suggesting the presence of phenolic hydroxyl groups in the structure.
  • the structure of the compound was identified as (-)-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate, and the name was (-) -5,3 ',4 ',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate.
  • the compound is a new flavan compound.
  • HAM's F12 medium glutamic acid and 50 mL fetal calf serum were added to 500 mL.
  • Interferon- ⁇ supplied by Genzyme/Techne.
  • p-Aminobenzenesulfonamide and N-1-naphthyl-ethylenediamine hydrochloride were supplied by Wako Corporation.
  • Test sample The compound prepared in Example 1 was formulated with dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 100 mM, 30 mM, 10 mM and 3 mM, and stored at low temperature and protected from light.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • RAW264.7 cells adjusted to a cell concentration of 1.2 ⁇ 10 6 /mL, 200 ⁇ M per well: added to a 96-well culture plate, 5% CO 2 , 37 ⁇ , and cultured for 2 hours. Then, the test sample 0.4 (final concentration: 3 ⁇ , ⁇ , 30 ⁇ , ⁇ ) and lipopolysaccharide (final concentration: 100 ng/mL) 2 and interferon- ⁇ (final concentration: 0.33 ng / mL) 2 were added together. The cytosol (0.2% of the dimethyl sulfoxide of the dissolved sample relative to the medium) was cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • the inhibition rate of NO released by macrophages was calculated according to the following formula - tender inhibition rate - ( 1- OD average - blank control group OD Ping Cong, X awake negative control group OD average - blank control group OD average
  • the activity of the compound is expressed by the half-inhibitory concentration (IC 5Q ), that is, the linear inhibition of the NO release inhibition rate of the test sample at different concentrations, and the concentration of the test product required to suppress the NO release rate of 50% is obtained. Small, the more active the test product is.
  • Test results The inhibitory effect of this compound on the release of NO from rat macrophages was tested by the above experimental method. Resveratrol was selected as a positive control drug. The half-inhibitory concentration (IC 50 ) of the compound is shown below. table. Compound IC 50 (unit: ⁇ )
  • the experiment used 8-week-old male SD rats weighing 220-250 g. After the rats were decapitated, 50-100 ml of heparin-containing monocyte conditioned medium (abbreviation: MCM) solution was injected into the rat abdominal cavity and the abdomen was massaged for 2 min. After full massage, the rat peritoneal fluid was aspirated, centrifuged at 580 rpm for 7 min at 4 ° C, the supernatant was discarded, and the precipitate was washed twice with 35 ml of heparin-containing MCM solution in the same manner to obtain peritoneal mast cells. Mast cells were suspended in 10 ml of heparin-free MCM solution, and trypan blue staining was performed under a microscope to adjust the cell concentration to lx10 5 /ml.
  • MCM monocyte conditioned medium
  • Test sample Compound I prepared in Example 1 was formulated into a solution of 50 ⁇ l/ml, 25 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 and 12.5 g/ml in 10% methanol solution.
  • the mast cell suspension was divided into 500 ⁇ /tube, shaken in a constant temperature water bath at 36-37 ° C for 5 min, 250 mM CaCl 2 4 ⁇ was added to each tube in turn, and the constant temperature oscillation was continued for 5 min, and 5 L of the sample to be tested was added, and the solvent was set at the same time. Control group. After constant temperature oscillation for 10 min, add 0.5 mg/mL mast cell degranulation release histamine stimulant (abbreviation: Compound 48/80) 5 L, and set the histamine natural release group, that is, replace the Compound 48/80 o with physiological saline.
  • Compound 48/80 histamine stimulant
  • histamine release inhibition rate was calculated according to the following formula - the experimental group histamine release value - the test article naturally released histamine value
  • the experimental results show that the compound has strong anti-inflammatory activity of mast cells and has good anti-inflammatory and anti-allergic effects.
  • the ORAC method is a method for determining the total antioxidant capacity of a substance, and a water-soluble analog of ⁇ -tocopherol-Trolox, (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylbenzodihydropyrrol) Carboxy-2-carboxylic acid) as a standard control.
  • Sodium fluorescein was formulated into a stock solution of 63 ⁇ M with 75 mM potassium phosphate buffer (75 mM K3 ⁇ 4P0 4 , 75 mM K 2 HP0 4 ), stored at 4 ⁇ in the dark, and diluted 100-fold with the buffer before the test.
  • [2,2'-Azo(dimercaptopropane)hydrogen dichloride] A solution of 18.3 mM was prepared with 75 mM potassium phosphate buffer before the experiment.
  • Trolox was formulated into a ⁇ stock solution using 75 mM potassium phosphate buffer and diluted to the desired concentration with the buffer before testing.
  • Compounds I and V c are positive drug 75mM potassium phosphate buffer, formulated in lOOmM stock solution, diluted to the desired concentration prior to testing with this buffer.
  • DPPH* was formulated into 2 ⁇ 10_ 4 ⁇ solution with absolute ethanol and stored at 4 ° C in the dark.
  • Test sample The compound I of Example 1 and the positive drug Vc were all prepared into a 1 mg/mL stock solution with absolute ethanol, and diluted to the desired concentration with absolute ethanol before the test.
  • D PPH free drunk (%) ( ⁇ control OD average) X l , half effective concentration (EC 5 o) is calculated by the test clearance rate at different concentrations, indicating the activity of the test sample. -
  • syncytial virus (RSV) was used, the cells were HEP-2; influenza virus (FluA), cells were MDCK cells; parainfluenza type 3 (PIV-3), cells were Hep-2 cells; enterovirus (Cox B3) , the cells are Hep-2 cells.
  • RSV syncytial virus
  • the positive control drug was ribavirin; the cells were grown in MEM medium supplemented with 10% calf serum (FBS); the maintenance medium was 1% FBS in MEM medium.
  • Hep-2 cells or MDCK cells are cultured in a 96-well culture plate. After the monolayer cells are grown, the sample diluted with the maintenance solution (concentration from 250 to 8 ⁇ ⁇ / ⁇ ) is added at 37 ° C, 5 Incubate for 3 days in the %C0 2 incubator. The ⁇ ⁇ solution (5 mg/ml, configured with PSB) was added and incubation was continued for 4 hours.
  • the maintenance solution concentration from 250 to 8 ⁇ ⁇ / ⁇
  • the sample solution was aspirated, dimethyl sulfoxide was added, and the 96-well plate was shaken in a microplate oscillator for 10 minutes at room temperature.
  • Hep-2 cells or MDCK cells were cultured in a 96-well culture plate. After the monolayer cells were grown, a 100 TCID 5 o virus solution diluted with a maintenance solution was added, and a series of concentration samples diluted with the maintenance solution were added ( Let CC be the initial concentration of dilution at the maximum non-toxic concentration). Incubate for 5 days at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator.
  • CPE degree of cytopathic effect
  • compositions comprising the compounds provided herein.
  • composition Formulation Example 1 Tablet
  • Magnesium stearate 2g made of 1000 tablets 10 grams of flavanoids and other excipients in the prescription were sieved through a 100 mesh sieve and dried at 60 ° C. 10 g of the above compound was weighed with microcrystalline cellulose, pregelatinized starch and lactose, and the same amount was added. Mix well, use a suitable amount of 10% PVP ethanol solution (50%) to make soft material, use sieved granules, dry at 50 ⁇ 60 °C for 1 hour, add the prescribed amount of magnesium stearate, and sieve the granules. The above pellets were compressed with an 8 mm die, and the average die weight was about 200 mg, and each tablet contained 10 mg of xanthine. Then use a roll spray method to coat.

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Description

新的黄烷化合物和它的用途 技术领域
本发明涉及医药领域， 具体涉及新的黄烷类化合物和它具有抗炎症、 抗过敏、 抗氧化和抗病毒的用途。 背景技术
中药材猴耳环 [Pithecellobium clypearia enth. /Archidendron clypearia (Jack) . Nielsen]为豆科含羞草诞树属植物。 猴耳环为乔木， 分布于热带亚洲。 猴耳环又名围涎树、 鸡三树等， 其叶、 种子和果实均可入药， 民间用于烧伤、 烫伤 的治疗。 由猴耳环嫩枝叶的水提物制成的猴耳环消炎片已公开于 "中华人民共和国 卫生部药品标准"中成药方剂第六册， 在临床上用于治疗上呼吸道感染、 急性咽喉 炎、急性扁桃体炎、急性肠炎和细菌性痢疾等疾病，临床药效反映良好，被誉为 "中 药抗生素"， 具有很好的市场前景。
但是，至今为止对猴耳环药理活性和化学成分的研究还是一片空白。在文献 "猴 耳环中某酸性成分的分离和鉴定" [广东医学院学报 1994， 12 ( 1 ) ： 40〜41]报道 了没食子酸为猴耳环抗菌消炎的活性成分， 猴耳环植物中其它的有效成分及其它们 的用途是值得进一步研究和开发利用。 发明内容
本发明的目的是从中药猴耳环属植物中分离有效成分和开发其在医药等领域 中的应用。
本发明的技术方案是： 从猴耳环属植物猴耳环 [Pithecellobium clypearia enth./Archidendron clypearia (Jack) .Nielsen]60%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中 分离得到可用下列化学式表示的黄烷化合物：
Figure imgf000003_0001
化学名为 (一)-5，3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯， [(— )-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate]。 该化合物具有抗炎、 抗过敏、 抗氧化及抗病毒作用， 可应用于制备抗炎或抗过 敏或抗病毒的药物， 并可用作于药品或食品或化妆品的抗氧化添加剂。
具体地说， 本发明用猴耳环属植物猴耳环 [Pithecellobium clypearia enth./Archidendron clypearia (Jack) .Nielsen]的小枝和叶为原料， 用 60%乙醇提取 后转溶于乙酸乙酯中， 随后用液液萃取， 大孔树脂柱、 十八烷基键合硅胶反相柱、 葡聚糖凝胶柱等多种柱色谱方法进行分离，得到了上列通式（I)表示的黄烷化合物， 通过理化常数和现代波谱学手段 （IR、 MS、 NMR) 鉴定了它们的结构。 继而釆用 大鼠巨噬细胞 NO 释放抑制活性、 DPPH 自由基清除活性、 氧自由基清除能力 (ORAC)、组织胺释放抑制活性试验以及体外抗病毒实验考察了化合物的抗炎、抗 过敏、 抗氧化以及抗病毒的作用。 在对大鼠巨噬细胞 NO释放抑制活性实验中， 该 化合物显示了很强的活性， 强于对照药物白藜芦醇 （resvamtrol); 在对肥大细胞释 放组织胺的抑制活性试验中， 该化合物显示很强的抑制活性； 在 1, 1-二苯基 -2-苦基 苯肼自由基清除活性实验中， 该化合物显示了很强的活性， 强于阳性对照药物维生 素 C; 在氧自由基清除能力试验中， 该化合物的活性强于对照药物维生素 C。 在体 外抗病毒实验中， 该化合物对合胞病毒、 副流感病毒有较强的抑制作用， 对流感病 毒和肠病毒有一定的抑制作用。 '
本发明提供的 (- )-5,3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯化合物可用于口服给药， 也可不经口给药， 也可以作药品、 食品或化妆品的添加剂， 使用量可视不同的药物 与不同的用途而不同。剂量：成人每天 l〜1000mg比较合适，外用剂量 0.1〜100mg 比较合适。
制备药物时， 用该化合物与常规的药用载体， 如赋形剂、 崩解剂、 黏合剂、 乳 化剂、润滑剂、表面活性剂、稳定剂、包衣剂等， 将其制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、 乳剂等口服制剂； 不经口给药时， 可以制备成注射剂、 输液、 或软膏剂等， 制备以 上制剂可采用常规的药物制剂技术。
作食品或化妆品的抗氧化添加剂时用量以 0.01 %→.\ %比较适合。可釆用常规 的食品和化妆品制备技术， 在食品或化妆品基质中添加适量的本发明的化合物即 可。 附图说明 图 1为化合物 I的红外线吸收光谱图
图 2为化合物 I的质谱图
图 3为化合物 I的氢一核磁共振谱图
图 4为化合物 I的 13碳一核磁共振谱图
图 5为化合物 I的结构图 图中 表示碳氢远程相关 （HMBC correlation )
·' 、表示立体空间相关（NOESY correlation )
下面通过具体实施方式结合附图详细阐述本发明的技术方案。 具体实施方式
实施例 1、 从猴耳环植物中分离制备新的黄烷类化合物
取猴耳环嫩枝叶 7.6 kg， 用 60%乙醇回流提取 2次， 每次 2小时， 减压回收乙 醇得浸膏 1.5 kg。将 1.2 kg浸膏用 12.0 L水分散， 依次用氯仿、 乙酸乙酯进行萃取。 乙酸乙酯萃取物通过型号为 Diaion HP-20的大孔树脂柱， 采用甲醇-水迸行梯度洗 脱得到了 9个溜分；取第三个溜分通过型号为 MCI GEI CHP 20P的凝胶柱层离，采 用甲醇 -水进行梯度洗脱，得到了 6个亚溜分，取第二个亚溜分经过型号为 Sephadex LH-20的羟丙基葡聚糖凝胶柱层离，利用甲醇 -水进行梯度洗脱，又得到了 7个次溜 分，取第六个次溜分通过了十八烷基键合硅胶反相柱层离，用甲醇 -水进行梯度洗脱， 薄层检查， 收集洗脱液， 浓縮， 干燥， 用 40%甲醇溶液重结晶得到化合物。 通过理 化常数和现代波谱学手段 （IR、 MS、 NMR) 鉴定了其结构， 得出下表的化合物。 名称 分子式 结构式
分子量
(-) -5,3',4',5'-四羟基黄烷 C22Hi8O10
-7-没食子酸酯 442
(—)-5，3',4',5'-tetra
Figure imgf000005_0001
hydroxyflavan-7-gallate 本发明 ll供的化合物为白色无定形粉末， [α] = -2.6° (MeOH, c. 1.0), 熔点 172— 174。C。 3%FeCl3乙醇溶液显墨蓝色斑点， 提示结构中存在酚羟基。 UV图谱 (MeO^ og e) !^: 210 (4.97)， 280 (4.31), 446 (3.45)， 473 (3.45), 提示有苯环 存在。 如附图 1所示， IR图谱 [(KBr) Vmax CnT i] 3244示有羟基存在， 1732为羰基的 特征吸收， 1620、 1535和 1443示有苯环存在。如附图 2所示， ESI-MS (positive and negative)给出准分子离子峰 τη ζ 465 [M + Na]+， 443 [M + H]+, 441 [M - H]", 提示分 子量为 442。 HR-TOF-ESI-MS: m/z 443.0948 [M + H]+ , 计算值为 443.0975 (C22H1901Q)。再结合 1H-和 13C-NMR确定分子式为 C22H1801Q，计算不饱和度为 14。
如附图 3所示， 1H-NMR (400MHz, acetone-^ ) 中可以观察到 11个氢信号。 低场区有 6个芳香氢信号 [δ 7.24 (2Η, s, H-2", 6"), 6.51 (2H, s, Η-2', 6'), 6.31 (1Η, d, J = 2.2 Hz, H-6), 6.23 (1H, d， J= 2.2 Hz, H-8)]， 其中根据 2个氢信号 δ 6.31和 6.23偶 合裂分的情况， 推测结构中存在一个 1， 3 , 4， 5-四取代的苯环。此外， 结合 HMQC 谱发现有 1个连氧的次甲基的氢信号 δ 4.87 (1H, dd, J= 9.9, 2.2 Hz, H-2)以及 2个亚 甲基的氢信号 δ 2.73 (2Η, m, H-4)、 2.17 (1H, m, Η-3β)和 1.95 (1H, m， H-3a)。 通过 1H-1H COSY谱可以看到，氢信号 δ 4.87与氢信号 δ 2.17和 1.95有相关，氢信号 δ 2.73 与氢信号 δ 2.17和 1.95有相关，说明结构中存在一个在 -( H-CH2-CH2-的结构片断。 如附图 4所示； 13C-NMR ( 100MHz, acetone-i 6) 中共有 22个碳信号。 结合 DEPT135和 HMQC谱可知， 低场区有 1个羰基碳信号（δ 165.3 )和 18个芳香碳信 号 (5 157.4—101.5 ) , 其中 δ 146.5、 146.2、 110.3和 106.1为两个碳的重叠碳信号; 此外， 有 1个次甲基的碳信号 （δ 78.3 ) 和 2个亚甲基的碳信号 （δ 30.0， 20.1 )。 综 合以上信息， 该化合物结构中有三个苯环和一个环状的结构片断。
在 HMBC谱中， 通过芳香氢的相关信号确定该化合物的结构中也存在与化合 物 I中相同的苯环结构。 再从脂肪氢的相关信号出发， 发现 Η-2与 C-9、 C-l'、 C-2' 和 C-6'有相关， Η-3β与 C-10有相关， Η-4与 C-9和 C-10有相关， 说明 Α环和 Β 环通过 C3结构单元连接起来， 从而构建出黄垸的骨架结构。 此外， H-2"和 H-6"都 与羰基碳 （δ 165.3 ) 有相关， 说明结构还存在一个没食子酰基。 从化合物的分子式 考虑， 上述的黄烷结构片断应该与没食子酰基形成酯。 根据酰化位移的特点判断没 食子酰基与黄垸的 C-7位成酯。 从而确定了该化合物的结构， 并将全部的碳、 氢核 磁数据全部进行了归属见下表。 在 NOESY谱中， Η-3与 H-2'和 H-6'有相关， Η-2 与 H-2'和 H-6'有相关， 因此说明 Η-2与 Η-3α处于六元环的异侧。关键的 HMBC和 NOESY的相关信号见附图 3-5所示。
综上所述， 将化合物的结构鉴定为 (- )-5,3'，4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯， 文名为 (-) -5,3 ',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallate。 化合物为一个新的黄烷化合物。
化合物的 iH-NMR and I3C-NMR数据（ in acetone-^)"
化合物
序号
δΗ
2 4.87 (1Η, dd, J= 9.9, 2.2) 78.3
2.17 (lH, m)
3^ 30.0
1.95 (lH，m)
4 2.73 (2H, m) 20.1
5 156.8
6 6.31 (1H, d, J= 2.2) 101.5
7 151.3
8 6.23 (1H, d, J= 2.2) 102.5
9 157.4
10 108.1
Γ 133.9
2', & 6.51 (lH each, s) 106.1
3', 5' 146.5
4' 133.1
1" 121.1
2", 6" 7.24 (1H each, s) 110.3
3", 5" 146.2
4" 139.4
-CO- 165.3
a δ in ppm, J (in parentheses) in Hz. 实施例 2、 生物活性测试
1、 抑制大鼠巨噬细胞释放氧化氮的抗炎试验
(1)细胞的培养和供试品、 反应试剂的配制 RAW 264.7大鼠巨噬细胞源于美国某公司。在 37 °C， 5%C02的湿热培养箱中， 用含有 10%胎牛血清的 HAM's F12培养基培养。
HAM's F12培养基： 500mL中加入谷氨酸以及 50mL胎牛血清。
干扰素 -γ： Genzyme/Techne公司提供。
对氨基苯磺酰胺和盐酸 N-1-萘基-乙二胺由 Wako公司提供。
Griess试剂： 盐酸 N-1-萘基-乙二胺 5 mg用注射用水 5 mL溶解； 对氨基苯磺 酰胺 50 mg加入 250 磷酸后用注射用水稀释到 5 mL。
供试品： 用实施例 1 制得的化合物用二甲基亚砜 （DMSO)配成浓度分别为 lOOmM, 30mM, 10mM和 3mM的供试液， 低温避光保存。
(2)活性的测定
RAW264.7细胞， 调整细胞浓度到 1.2xl06/mL， 以每孔 200μΐ:加入于 96孔培 养板中， 5%C02, 37Ό,培养 2小时。然后将供试品 0.4 (终浓度： 3 μΜ, ΙΟμΜ, 30μΜ, ΙΟΟμΜ)与脂多糖（终浓度： 100ng/mL) 2 和干扰素 -γ (终浓度： 0.33 ng /mL) 2 —同加入到细胞液中 （溶解样品的二甲基亚砜相对于培养基的含量为 0.2%),共同在 37°C下培养 16小时。随后取上清液 lOO L, 加入事先调好的 Griess 试药， 用酶联免疫检测仪在 570nm (对照 655nm)测定吸光度。 本实验选用白藜芦醇 作为阳性对照，以未加入测试样品和诱导剂并加入适量 DMSO的细胞培养液作为空 白对照， 以未加样品并加入适量 DMSO的细胞液作为阴性对照。按如下公式计算供 试样品对巨噬细胞释放 NO的抑制率- 嫩抑制率 - ( 1- OD平均值 -空白对照组 OD平聰 、 X醒 阴性对照组 OD平均值一空白对照组 OD平均值 化合物活性以半数抑制浓度（IC5Q)表示， 即以不同浓度下供试品的 NO释放抑 制率进行线性回归， 求得抑制 NO释放率为 50%时所需的供试品浓度， 该浓度越小， 供试品活性越强。
(3)试验结果： 采用上述实验方法对该化合物的抑制大鼠巨噬细胞 NO释放 活性进行了测试， 选择白藜芦醇作为阳性对照药， 该化合物的半数抑制浓度（IC50) 值见下表。 化合物 IC50 (单位： μΜ)
C")-5,3',4',5'-四羟基黄垸 -7-没食子酸酯 18.9
白藜芦醇 28.6 实验结果表明该化合物具有较强的抗炎活性， 活性强于阳性对照药白藜芦醇。
2、 抑制肥大细胞释放组胺的抗炎、 抗过敏实验
(1)细胞的培养和供试品、 反应试剂的配制
实验采用 8周龄雄性 SD大鼠，体重 220-250g。将大鼠断头处死后，将 50-100ml 含肝素的单核细胞条件培养液 （缩写： MCM ) 溶液注入大鼠腹腔并按摩大鼠腹部 2min。 充分按摩后抽取大鼠腹腔液， 4°C 580rpm离心 7min， 弃去上清， 并以同样 方法用 35ml含肝素的 MCM溶液洗涤沉淀 2次， 得腹腔肥大细胞。 将肥大细胞混 悬在 10ml不含肝素的 MCM溶液中， 台盼蓝染色在显微镜下进行细胞计数后调整 细胞浓度为 l x l05/ml。
供试品：用实施例 1制得的化合物 I用 10%的甲醇溶液配成 50 μ /ml ,25μ§/ηι1 和 12.5 g/ml三个浓度的溶液。
(2)活性的测定
将肥大细胞悬液分装成 500 μΐ/管， 36-37°C恒温水浴振荡 5min， 在每管中依次 加入 250mM CaCl2 4 μΐ, 继续恒温振荡 5min， 添加待测样品 5 L， 同时设置溶剂 对照组。再恒温振荡 lOmin,加入 0.5mg/mL肥大细胞脱颗粒释放组织胺刺激剂（缩 写： Compound 48/80 ) 5 L，同时设置组胺自然释放组，即以生理盐水代替 Compound 48/80 o加入刺激剂 Compound 48/80 lOmin后，冰浴冷却， 4°C 6000 rpm离心 2.5min， 取上清液 40(^L至新管中。 同时， 取未经任何处理的肥大细胞悬液 400 μΙ7管， 添 加 2(^L 60% 高氯酸 /管后， 室温放置 20min， 加入 400 生理盐水， 在 4°C 13000 rpm离心 2.5min后， 取上清液经微孔滤膜过滤后高效液相测定组胺释放值， 以峰面 积进行定量。
按如下公式计算组胺释放抑制率- 实验组组胺释放值一供试品自然释放组胺值
组胺释放抑制率（％) = ( 1 ) X 100% 溶剂组胺释放值一溶剂自然释放组胺值 化合物活性以半数抑制浓度 （IC5Q)表示， 即以不同浓度下供试品组胺释放抑 制率进行线性回归，求得抑制组胺释放率为 50%时所需的供试品浓度，该浓度越小， 供试品活性越强。
(3 ) 实验结果
釆用上述实验方法对该化合物的抑制大鼠腹腔肥大细胞组胺释放活性进行了 测试， 该化合物的半数抑制浓度 IC5G值见下表。
Figure imgf000010_0001
实验结果表明该化合物具有较强的抑制肥大细胞释放组胺的活性， 具有较好的 抗炎和抗过敏作用。
3、 体外抗氧化能力实验： 采用氧自由基清除能力 （缩写： ORAC ) 法
ORAC法是一种测定物质总抗氧化能力的方法，以一种 α-生育酚的水溶性类似 物一 Trolox, (6-羟基 -2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃 -2-羧酸） 作为标准对照。
(1)反应试剂和供试品溶液的配制
将荧光素钠用 75mM的磷酸钾缓冲液（75mM K¾P04、 75mM K2HP04)配成 63μΜ的储备液， 置于 4Ό避光保存， 测试前用该缓冲液稀释 100倍。 ΑΑΡΗ [2,2'- 偶氮 (二眯基丙烷)二氯化氢]于实验前用 75mM的磷酸钾缓冲液配成 18.3mM的溶 液。 Trolox用 75mM的磷酸钾缓冲液配成 ΙΟμΜ的原液， 测试前用该缓冲液稀释成 所需浓度。 化合物 I和阳性药 Vc均用 75mM的磷酸钾缓冲液配成 lOOmM的原液， 测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。
(2)活性的测定 . 本实验釆用的 ORAC测定参照本实验采用的 ORAC测定，参照文献 [Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity (oxygen radical absorbance capacity (ORACFL)) of plasma and other biological and food samples [J]. J. Agric. Food Chem. 2003, 51(11): 3273-3279]方法进行。
实验 96孔板每个孔中加入不同浓度的待测样品溶液 20μί， 再加入 75mM磷酸 钾缓冲液 2(^L和 AAPH 14(^L (终浓度 12.8mM)， 最后加入荧光物质 2(^L (终浓 度 63nM)启动反应，迅速将 96孔板置于荧光酶标仪（预置温度 37°C )中开始测定， 每组平行设 3个复孔。 采用动力学方式， 每 2 min测定一个点， 至荧光强度衰减为 零为止。 测定结果表达为 ORAC值， ORAC值越大，抗氧化能力越强。 ORAC值的计算 式为： 供品荧光衰退曲线下面积一溶剂荧光衰退曲线下面积 样品 ORAC值 （U/ml) -样品稀释倍数 X
Trolox荧衰退曲线下面积一溶剂荧光衰退曲线下面积
(3) 实验结果见下表
Figure imgf000011_0001
实验结果表明： 该化合物具有抗氧化活性， 抗氧化活性与维生素 c相当。
4、 体外抗氧化活性评价法： 采用 1, 1-二苯基 -2-苦基苯肼 （DPPH 自由基清除法
(1) DPPH_溶液和供试品溶液的配制
DPPH*用无水乙醇配成 2χ10_4Μ的溶液， 置于 4°C避光保存。
供试品： 取实施例 1的化合物 I和阳性药 Vc均用无水乙醇配成 lmg/mL的原 液， 测试前用无水乙醇稀释成所需浓度。
(2)活性的测定
将不同浓度的供试品溶液 ΙΟΟμί和 2xlO—4M DPPH，溶液 ΙΟΟμί加入 96孔板各 孔中， 同时以不加 DPPH. (以 ΙΟΟμΙ^无水乙醇代替 DPPH*)的供试品溶液各浓度作 为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰， 并设 DPPH_阴性对照（以 ΙΟΟμί 无水乙醇代替供试品），每组平行设 4个复孔。将 96孔板放入酶标仪中，震荡 lmin， 并于此条件下保存 （室温、 避光）， 30min后测试其在 517nm处的吸光度 OD值， 按如下公式计算供试品的自由基清除率。 阴性对照组 OD平均值一实验组 OD平均值
DPPH自由纏醉( %)=( 瞧对照组 OD平均值 )X l, 半数有效浓度 （EC5o)通过不同浓度下供试品清除率计算得出， 表示供试品的 活性。 -
(3) 实验结果见下表 化合物 EC5o (MM)
(-)-5,3',4',5'-四羟基黄垸 -7-没食子酸酯 0. 6
维生素 C 1. 8
结论表明： 该化合物具有较强的抗氧化能力， 抗氧化能力强于维生素。。
上述试验证明本发明的化合物可用作于药品、食品、化妆品中的抗氧化添加剂。
5、 体外抗病毒实验
本实验选用合胞病毒（RSV)，细胞为 HEP-2;流感病毒（FluA)，细胞为 MDCK 细胞； 副流感 3型（PIV-3 ), 细胞为 Hep-2细胞； 肠病毒（Cox B3 )， 细胞为 Hep-2 细胞。
阳性对照药为利巴韦林；细胞生长在 10%小牛血清（FBS)的 MEM培养基中； 维持液为 1%FBS的 MEM培养基。
( 1 )用四唑盐 （MTT) 比色法测定化合物的细胞毒性
将 Hep-2细胞或 MDCK细胞培养在 96孔培养板中， 等单层细胞长好后， 加入 用维持液稀释好的样品 （浓度从 250〜8 μ§/πύ), 在 37°C， 5%C02培养箱中培养 3 天。 加入 ΙΟμΙ ΜΤΤ溶液（5mg/ml， 用 PSB配置）， 继续培养 4小时。
吸出样品溶液， 加入二甲亚砜， 室温下， 将 96孔板置于微空孔板振荡器中振 荡 10分钟。 '
用酶标仪检测各孔 OD值（λ =570ηπι)。 每组设 4个平衡孔， 每组实验重复 3 次。 计算结果， 画出曲线， 求出半数毒性浓度 （CC50)。
(2)通过观察样品对细胞病变效应的抑制程度（cytopathic effect reduction assay) 求测定抗病毒活性
将 Hep-2细胞或 MDCK细胞培养在 96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入 用维持液稀释好的 100TCID5o的病毒液，再加入用维持液稀释好的系列浓度样品（以 最大无毒性浓度讓 CC为稀释的起始浓度）。 在 37°C， 5%C02培养箱中培养 5天。
每天于倒置显微镜下观察细胞病变效应 （CPE) 的程度， 并记录： 一表示无 CPE; 十表示 0〜25%细胞有 CPE; 2十表示 25〜50%细胞有 CPE; 3十表示 50〜 70%细胞有 CPE; 4十表示 75〜100%细胞有 CPE。最后估计出半数抑制浓度（IC50) 和治疗指数 （TI) =CC5o/IC
(3)实验结果见下表
Figure imgf000013_0001
结果表明：（-)-5,3',4',5'-四羟基黄焼 -7-没食子酸酯化合物对合胞病毒、副流感病毒有 较强的抑制作用， 对流感病毒和肠病毒有一定的抑制作用。
下面的实施例说明包含本发明提供的化合物的组合物。
组合物的具体实施例 制剂实施例 1、 片剂
处方 （-) -5, 3' , 4' , 5' -四羟基黄垸 -7-没食子酸酯 10g
微 晶 纤维素 83g
乳 糖 25g
预胶化淀粉 80g
10%PVP乙醇 （50%) 适量
硬脂酸镁 2g 制成 1000片 将黄烷类化合物 10克及处方中其它辅料分别过 100目筛， 置 60°C烘干， 称取 上述化合物 10克与微晶纤维素、 预胶化淀粉和乳糖， 釆用等量递加法混合均匀， 用适量 10%PVP乙醇溶液 （50%)制软材， 用筛制粒， 50~60°C干燥 1小时， 加入 处方量的硬脂酸镁，用筛整粒。取上述颗粒用 8mm冲模压片，平均裸片重约 200mg， 每片含黄垸类化合物 10 mg。 再釆用滚转喷雾法包衣。
制剂实施例 2、 胶囊剂
处方 （- )-5,3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯 20g
微 晶 纤维素 83g
乳 糖 25g
预胶化淀粉 80g
10%PVP乙醇 （50%) 适量
硬脂酸镁 2g 制成 1000粒
将 (-) -5,3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯 10克及处方中其它辅料分别过 100目 筛， 置 60Ό烘干， 称取上述化合物 10克与微晶纤维素、 预胶化淀粉和乳糖， 采用 等量递加法混合均匀，用适量 10%FVP乙醇溶液（50%)制软材，用筛制粒， 50~60°C 千燥 1小时， 加入处方量的硬脂酸镁， 用筛整粒。 取制备好的颗粒， 装 2号胶囊， 每粒含 (- )-5,3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯化合物 20 mg。
制剂实施例 3 注射剂
( 1 ) 取注射用水 3000ml, 加甘露醇 400g， 加热搅拌使甘露醇溶解；
(2)按其体积加入 0.05%药用碳， 搅拌均匀， 静置 10分钟后， 用布氏漏斗过 滤至澄清；
(3 ) 加 (-)-5,3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯化合物 20g (以无水物计）， 在 60°C搅拌使溶解；
(4) 调溶液 pH至 8.0;
(5) 加注射用水至 5000ml, 滤至澄明， 得溶液 A;
(6) 检测溶液 A含量；
(7)溶液 A含量检测合格后， 分装， 冷冻干燥制得冻干粉针 1000瓶。 制剂实施例 4 驱斑霜
处方： （- )-5,3',4',5'-四羟基黄烷 -7-没食子酸酯 lg 硬脂酸 15g 甘油 15g 氢氧化钾 0.5g 尼泊金甲酯 0.15g 尼泊金乙酯 0.15g 水 70g 香精 少许 制备： 按上述处方量投料采用常规法制成霜剂备即得。

Claims

权利要求书
1、 一种新的黄垸化合物， 其特征是以下化学式（ I ) 表示的化合物， 化学名 称为 （-) -5, 3' , 4' , 5' -四羟基黄烷- 7-没食子酸酯，
Figure imgf000016_0001
( I )
2、 权利要求 1所述的化合物在制备抗炎药物或抗过敏药物或抗病毒药物中的 应用。
3、 权利要求 1所述的化合物用作于药品或食品或化妆品中的抗氧化添加剂。
4、 一种组合物， 其中含有权利要求 1所述的黄烷化合物， 并含有常规的药用 载体或食品添加剂或常规的化妆品基质。
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