CN1817873A - 新的黄烷类化合物和用途 - Google Patents

Abstract

新的黄烷类化合物和用途，涉及新的黄烷类化合物和它具有抗炎症、抗过敏和抗氧化的用途。本发明提供的以下列通式I表示的黄烷类化合物：(上式(1))其中：R₁为H或(上式(2))，R₂为H或OH。该类化合物具有抗炎、抗过敏及抗氧化作用，可应用于制备抗炎或抗过敏药物，并可用作于药品或食品或化妆品的抗氧化添加剂。

Description

新的黄烷类化合物和用途

                          技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及新的黄烷类化合物和它具有抗炎症、抗过敏和抗氧化的用途。

                          背景技术

中药材猴耳环[Pithecellobium clypearia enth./Archidendronclypearia(Jack).Nielsen]为豆科含羞草涎树属植物。猴耳环为乔木，分布于热带亚洲。猴耳环又名围涎树、鸡三树等，其叶、种子和果实均可入药，民间用于烧伤、烫伤的治疗。由猴耳环嫩枝叶的水提物制成的猴耳环消炎片已公开于“卫生部药品标准”中成药方剂第六册，在临床上用于治疗上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃体炎、急性肠炎和细菌性痢疾等疾病，临床药效反映良好，被誉为“中药抗生素”，具有很好的市场前景。

但是，至今为止国内外对猴耳环药理活性和化学成分的研究还是一片空白。在文献“猴耳环中某酸性成分的分离和鉴定”广东医学院学报1994，12(1)：40～41报道了没食子酸为猴耳环抗菌消炎的活性成分，猴耳环植物中其它的有效成分及其它们的用途是值得进一步研究和开发利用。

                          发明内容

本发明的目的是从中药猴耳环属植物中分离有效成分和开发其在医药等领域中的应用。

本发明的技术方案是：从猴耳环属植物猴耳环[Pithecellobiumclypearia enth./Archidendron clypearia(Jack).Nielsen]60％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离得到可用下列通式I表示的黄烷类化合物：

其中：R₁为H或 R₂为H或OH。

其中优选R₁为H，R₂为H时化学名为5，7，3′，4′，5′-五羟基黄烷，简称化合物1；或R₁为 (没食子酰基)，R₂为OH，化学名为(-)-(2R，3R)-表没食子儿茶素-7-没食子酸酯，简称化合物2[(-)-(2R，3R)-epigallocatechin-7-gallate]；

或R₁为

(没食子酰基)，R₂为H，化学名为(-)-5，3′，4′，5′-四羟基黄烷-7-没食子酸酯，简称化合物3[(-)-5，3′，4′，5′-tetrahydroxyflavan-7-gallate]

该类化合物具有抗炎、抗过敏及抗氧化作用，可应用于制备抗炎或抗过敏药物，并可用作于药品或食品或化妆品的抗氧化添加剂。具体的说，我们用猴耳环属植物猴耳环[Pithecellobium clypeariaenth./Archidendron clypearia(Jack).Nielsen]的小枝和叶为原料，用60％乙醇提取后转溶于乙酸乙酯中，随后用液液萃取，大孔树脂柱、十八烷基键合硅胶反相柱、葡聚糖凝胶柱等多种柱色谱方法进行分离，得到了上列通式表示的黄烷类化合物I，通过理化常数和现代波谱学手段(IR、MS、NMR)鉴定了它们的结构。继而采用大鼠巨噬细胞NO释放抑制活性、DPPH自由基清除活性、氧自由基清除能力(ORAC)、组织胺释放抑制活性试验以及抑制刀豆蛋白(ConA)诱导的T淋巴细胞增殖活性等多种活性指标，考察了上述3个单体化合物的抗炎、抗过敏及抗氧化作用。在对大鼠巨噬细胞NO释放抑制活性实验中，化合物3显示了很强的活性，强于对照药物白藜芦醇(resvaratrol)；在对肥大细胞释放组织胺的抑制活性试验中，化合物1和化合物3显示很强的抑制活性；在对ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性的抑制试验中，化合物2的IC₅₀为4.4μM，显示了最强的抑制活性；在1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基清除活性实验中，化合物2，化合物3均显示了很强的活性，强于阳性对照药物维生素C；在氧自由基清除能力试验中，化合物1，化合物3的活性强于对照药物维生素C。

本发明发现的黄烷类化合物可口服给药，也可不经口给药，也可以作药品、食品或化妆品的添加剂，使用量可视不同的药物与不同的用途而不同。剂量：成人每天1～1000mg比较合适，外用剂量0.1～100mg比较合适。

制备药物时，用该化合物与常规的药用载体，如赋形剂、崩解剂、黏合剂、乳化剂、润滑剂、表面活性剂、稳定剂、包衣剂等，将其制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、乳剂等口服制剂；不经口给药时，可以制备成注射剂、输液、或软膏剂等，制备以上制剂可采用常规的药物制剂技术。

作食品或化妆品的抗氧化添加剂时用量以0.01％～0.1％比较适合。可采用常规的食品和化妆品制备技术，在食品或化妆品基质中添加适量的本发明的化合物即可。

                         附图说明

图1-1.为化合物1的红外线吸收光谱图

图1-2.为化合物1的质谱图

图1-3.为化合物1的氢-核磁共振谱图

图1-4.为化合物1的结构图

图中

表示碳氢远程相关(HMBC correlatiom)

表示立体空间相关(NOESY correlatiom)

图2-1.为化合物2的氢-核磁共振谱图

图2-2为化合物2的结构图

图中 表示碳氢远程相关(HMBC correlatiom)表示立体空间相关(NOESY correlatiom)

图3-1.为化合物3的红外线吸收光谱图

图3-2.为化合物3的质谱图

图3-3.为化合物3的氢-核磁共振谱图

图3-4为化合物3的13碳-核磁共振谱图

图3-5.为化合物3的结构图

图中

表示碳氢远程相关(HMBC correlatiom)表示立体空间相关(NOESY correlatiom)

下面通过具体实施方式结合附图详细阐述本发明的技术方案。

                       具体实施方式

实施例1、从猴耳环植物中分离制备新的黄烷类化合物

取猴耳环嫩枝叶7.6kg，用60％乙醇回流提取2次，每次2小时，减压回收乙醇得浸膏1.5kg。将1.2kg浸膏用12.0L水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯萃取物通过型号为Diaion HP-20的大孔树脂柱，采用甲醇-水进行梯度洗脱得到了9个溜分；取第三个溜分通过型号为MCI GEI CHP20P的凝胶柱层离，采用甲醇-水进行梯度洗脱，得到了6个亚溜分，再取第一个亚溜分通过型号为Sephadex LH-20的羟丙基葡聚糖凝胶柱以及十八烷基键合硅胶反相柱，采用甲醇-水溶液进行梯度洗脱，薄层检查，收集洗脱液，浓缩，干燥，用40％甲醇溶液重结晶得到化合物1；另取第二个亚溜分经过型号为Sephadex LH-20的羟丙基葡聚糖凝胶柱层离，利用甲醇-水进行梯度洗脱，又得到了7个次溜分，取其中第五个次溜分，通过型号为Toyopearl HW-40F的大孔树脂柱，用甲醇-水进行梯度洗脱，薄层检查，收集洗脱液，浓缩，干燥，用40％甲醇溶液重结晶得到化合物2；取第六个次溜分通过了十八烷基键合硅胶反相柱层离，用甲醇-水进行梯度洗脱，薄层检查，收集洗脱液，浓缩，干燥，用40％甲醇溶液重结晶得到化合物3。通过理化常数和现代波谱学手段(IR、MS、NMR)鉴定了它们的结构，得出下表的化合物。

化合物1

白色无定性粉末，

(MeOH，c.1.0)，熔点245-247℃。3％FeCl₃乙醇溶液呈墨蓝色斑点，提示结构中存在酚羟基。UV图谱(MeOH)λ_max(logε)nm：214(4.96)，270(3.69)提示结构中有苯环存在。如附图1-1所示的IR图谱[(KBr)v_maxcm^-1]3294示有羟基存在，1624、1520和1474为苯环的特征吸收。

如附图1-2所示的ESI-MS图(positive and negative)给出准分子离子峰m/z313[M+Na]⁺，289[M-H]^-，提示分子量为290。HR-ESI-TOF-MS：m/z 291.0869[M+H]⁺，理论值为291.0871(C₁₅H₁₅O₆)。结合¹H-NMR和¹³C-NMR确定分子式为C₁₅H₁₄O₆，计算不饱和度为9。

如附图1-3所示的¹H-NMR(400MHz，acetone-d₆)图中可以观察到9个氢信号。低场区有4个芳香氢信号[δ6.48(2H，s，H-2′，6′)，6.00(1H，d，J＝2.4Hz，H-6)，5.88(1H，d，J＝2.4Hz，H-8)]，其中2个间位偶合的氢信号δ6.00和5.88提示结构中存在一个1，3，4，5-四取代的苯环。结合HMQC谱可知，在偏低场有1个连氧次甲基的氢信号δ4.78(1H，dd，J＝9.7，2.4Hz，H-2)。此外，高场区还有2个亚甲基的氢信号δ2.62(2H，m，H-4)、2.10(1H，m，H-3β)和1.88(1H，m，H-3α)。在¹H-¹H COSY谱中，氢信号δ4.78与氢信号δ1.88、氢信号δ2.62与氢信号δ2.10和1.88有相关，说明结构中存在一个 结构片断。

¹³C-NMR(100MHz，acetone-d₆)共有15个碳信号，结合DEPT 135和HMQC谱发现，低场区共有12个芳香碳信号(δ157.7-95.8)，其中δ146.4和106.0均分别为两个碳的重叠碳信号；此外有1个次甲基的碳信号(δ78.0)和2个亚甲基的碳信号(δ30.4，19.8)。以上信息说明，化合物I的结构中存在两个苯环和一个环状的结构片断。

在HMBC中，由4个芳香氢的相关信号出发，可以确定两个苯环分别具有1，2，4，5-四取代的结构(A环)和1，3，4，5-四取代的对称结构(B环)。同时观察到，H-3和H-4都与C-10相关，H-2分别与C-2′，C-6′和C-8相关，说明A环和B环通过上述三碳的片断结构

连接起来，构成了黄烷的骨架结构。综合考虑，确定C-5、C-7、C-3′、C-4′和C-5′都连有羟基。从而确定该化合物的结构为5，7，3′，4′，5′-五羟基黄烷。在NOESY谱中，H-2与H-2′和H-6′有相关，H-3α与H-2′和H-6′有相关，说明H-2与H-3α处于六元环的异侧。综上，鉴定该化合物的结构如图1-4所示为(-)-5，7，3′，4′，5′-五羟基黄烷，英文名为(-)-5，7，3′，4′，5′-pentahydroxyflavan。化合物1为一个新的黄烷类化合物。

化合物2

白色无定形粉末， (MeOH，c.1.0)，熔点212-214℃。3％FeCl₃乙醇溶液显墨蓝色斑点，提示结构中存在酚羟基。UV图谱(MeOH)λ_max(logε)nm：211(5.09)，280(4.44)，提示有苯环存在。IR图谱[(KBr)v_maxcm^-1]3244示有羟基存在，1697为羰基的特征吸收，1620、1512和1454示有苯环存在。ESI-MS(positive and negative)给出准分子离子峰m/z 481[M+Na]⁺，459[M+H]⁺，457[M-H]^-，提示分子量为458。再结合¹H-和¹³C-NMR确定分子式为C₂₂H₁₈O₁₁，计算不饱和度为14。

如附图2-1所示，¹H-NMR(400MHz，acetone-d₆)中共显示出10个氢信号。低场区有6个芳香氢信号[δ7.25(2H，s，H-2″，6″)，6.62(2H，s，H-2′，6′)，6.34(1H，d，J＝2.2 Hz，H-6)，6.28(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)]，其中根据2个氢信号δ6.34和6.28偶合裂分的情况，判断结构中存在一个1，3，4，5-四取代的苯环。结合HMQC谱可知，在偏低场有2个次甲基的氢信号[δ4.92(1H，brs，H-2)，4.28(1H，brs，H-3)]；此外还有1个亚甲基上的两个偕偶氢信号δ2.96(1H，dd，J＝17.0，4.3 Hz，H-4ax)和2.88(1H，dd，J＝17.0，2.7Hz，H-4eq)。根据¹H-¹H COSY谱中所提供的信息，说明结构中存在

的结构片断。

¹³C-NMR(100MHz，acetone-d₆)中共有22个碳信号。结合DEPT135和HMQC谱，知低场区有1个羰基碳信号(δ165.3)，18个芳香碳信号(δ157.2-101.7)，其中δ146.1、146.0、110.2和106.8为两个碳的重叠碳信号；此外还有2个次甲基的碳信号(δ79.5，66.5)和1个亚甲基的碳信号(δ29.0)。由以上信息可知，化合物2的结构中有三个苯环和一个环状的结构片断，并具有黄烷类化合物的结构特点。

在HMBC谱中，从芳香氢H-2′、H-6′以及H-2″、H-6″的相关信号入手，可以确定结构中存在两个1，3，4，5-四取代的对称苯环结构；通过芳香氢H-6和H-8的相关信号，能够确定另一个1，3，4，5-四取代的苯环结构。同时，可以看到在结构片断 中，H-2与C-9、C-1′、C-2′和C-6′相关，H-3与C-10相关，H-4ax和H-4eq都与C-10和C-9相关，因此确定该化合物的结构中存在一个与化合物1结构相同的黄烷-3-醇的骨架结构。在余下的苯环中，H-2″和H-6″都与羰基碳(δ165.3)有相关，说明该苯环的C-1″位连有羰基，从而构成了没食子酰基的结构片断，其¹³C-NMR的数据与文献报道的没食子酰基基本一致。从化合物2的分子式考虑，上述结构中黄烷-3-醇的结构片断应该与没食子酰通过氧原子相连，进而构成黄烷-3-醇的没食子酰酯的结构。这时将化合物2与化合物1的¹³C-NMR的数据进行比较，发现在化合物2中C-7的化学位移值向高场位移了6.4ppm，C-6、C-8和C-10位分别向低场位移了5.5、6.5和6.2ppm，同时C-5和C-9仅向高场位移了0.4和0.3ppm，根据酰化位移的规律，确定没食子酰基与黄烷-3-醇的C-7成酯。于是最终确立了该化合物的结构，并将全部的碳、氢核磁数据进行了归属，见下表2-1。在NOESY谱中，H-2与H-4ax、H-2′和C-6′有相关，H-3与H-2′和C-6′有相关，因此确定该化合物的结构如附图2-2所示，结构具有2R，3R的相对构型。

综上述，化合物2的¹H-NMR、¹³C-NMR及比旋光度，最终鉴定化合物2的结构为(-)-(2R，3R)-表没食子儿茶素-7-没食子酸酯，英文名为(-)-(2R，3R)-epigallocatechin-7-gallate，是一种新的黄烷类化合物。

表2-1  化合物2的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(inacetone-d₆)^a

序号	化合物2
			δH	δC
	234eq ax5678910	4.92(1H，brbs)4.28(1H，brbs)2.96(1H，dd，J＝17.0，4.3)2.88(1H，dd，J＝17.0，2.7)6.34(1H，d，J＝2.2)6.28(1H，d，J＝2.2)			79.566.529.0157.2101.7151.2102.2156.8106.0

1′2′，6′3′，5′4′1″2″，6″3″，5″4″-CO-

6.62(1 each，s)7.25(1 each，s)

131.1106.8146.0132.9121.0110.2146.1139.4165.3

^aδin ppm，J(in parentheses)in Hz.

^bBroad signals are reported with“br”.

化合物3

白色无定形粉末， (MeOH，c.1.0)，熔点172-174℃。3％FeCl₃乙醇溶液显墨蓝色斑点，提示结构中存在酚羟基。UV图谱(MeOH)λ_max(logε)nm：210(4.97)，280(4.31)，446(3.45)，473(3.45)，提示有苯环存在。如附图3-1所示，IR图谱[(KBr)v_maxcm^-1]3244示有羟基存在，1732为羰基的特征吸收，1620、1535和1443示有苯环存在。如附图3-2所示，ESI-MS(positive andnegative)给出准分子离子峰m/z 465[M+Na]⁺，443[M+H]⁺，441[M-H]^-，提示分子量为442。HR-TOF-ESI-MS：m/z 443.0948[M+H]⁺，计算值为443.0975(C₂₂H₁₉O₁₀)。再结合¹H-和¹³C-NMR确定分子式为C₂₂H₁₈O₁₀，计算不饱和度为14。

如附图3-3所示，¹H-NMR(400MHz，acetone-d₆)中可以观察到11个氢信号。低场区有6个芳香氢信号[δ7.24(2H，s，H-2″，6″)，6.51(2H，s，H-2′，6′)，6.31(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)，6.23(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)]，其中根据2个氢信号δ6.31和6.23偶合裂分的情况，推测结构中存在一个1，3，4，5-四取代的苯环。此外，结合HMQC谱发现有1个连氧的次甲基的氢信号δ4.87(1H，dd，J＝9.9，2.2Hz，H-2)以及2个亚甲基的氢信号δ2.73(2H，m，H-4)、2.17(1H，m，H-3β)和1.95(1H，m，H-3α)。通过¹H-¹H COSY谱可以看到，氢信号δ4.87与氢信号δ2.17和1.95有相关，氢信号δ2.73与氢信号δ2.17和1.95有相关，说明结构中存在一个在

的结构片断。

如附图3-4所示，¹³C-NMR(100MHz，acetone-d₆)中共有22个碳信号。结合DEPT135和HMQC谱可知，低场区有1个羰基碳信号(δ165.3)和18个芳香碳信号(δ157.4-101.5)，其中δ146.5、146.2、110.3和106.1为两个碳的重叠碳信号；此外，有1个次甲基的碳信号(δ78.3)和2个亚甲基的碳信号(δ30.0，20.1)。综合以上信息，该化合物结构中有三个苯环和一个环状的结构片断，结构特点与化合物2相似。

在HMBC谱中，通过芳香氢的相关信号确定该化合物的结构中也存在与化合物2中相同的苯环结构。再从脂肪氢的相关信号出发，发现H-2与C-9、C-1′、C-2′和C-6′有相关，H-3β与C-10有相关，H-4与C-9和C-10有相关，说明A环和B环通过C₃结构单元连接起来，从而构建出黄烷的骨架结构。此外，H-2″和H-6″都与羰基碳(δ165.3)有相关，说明结构还存在一个没食子酰基。从化合物3的分子式考虑，上述的黄烷结构片断应该与没食子酰基形成酯。这时比较化合物3与化合物1的¹³C-NMR的数据，发现化合物3中的C-7位向高场位移了6.4 ppm，C-6、C-8和C-10分别向低场位移了5.7、6.6和6.2ppm，C-5和C-9分别向高场位移了0.2和0.1 ppm，根据酰化位移的特点判断没食子酰基与黄烷的C-7位成酯。从而确定了该化合物的结构，并将全部的碳、氢核磁数据全部进行了归属见下表3-1。在NOESY谱中，H-3与H-2′和H-6′有相关，H-2与H-2′和H-6′有相关，因此说明H-2与H-3α处于六元环的异侧。关键的HMBC和NOESY的相关信号见附图3-5所示。

综上所述，将化合物3的结构鉴定为(-)-5，3′，4′，5′-四羟基黄烷-7-没食子酸酯，英文名为(-)-5，3′，4′，5′-tetrahydroxyflavan-7-gallate。化合物3为一个新的黄烷类化合物。

    表3-1  化合物1和3的¹H-NMR and ¹³C-NMR数据(in acetone-d₆)^a

序号	化合物1		化合物III
					δH	δC	δH	δC
	2	4.78(1H，dd，J＝9.7，2.4)	78.0	4.87(1H，dd，J＝9.9，2.2)					78.3

3α β456789101′2′，6′3′，5′4′1″2″，6″3″，5″4″-CO-

2.10(1H，m)1.88(1H，m)2.62(2H，m)6.00(1H，d，J＝2.4)5.88(1H，d，J＝2.4)6.48(1H each，s)

30.419.8157.095.8157.795.9157.5101.9134.4106.0146.4133.0

2.17(1H，m)1.95(1H，m)2.73(2H，m)6.31(1H，d，J＝2.2)6.23(1H，d，J＝2.2)6.51(1H each，s)7.24(1H each，s)

30.020.1156.8101.5151.3102.5157.4108.1133.9106.1146.5133.1121.1110.3146.2139.4165.3

^aδin ppm，J(in parentheses)in Hz.

实施例2、生物活性测试

1、抑制大鼠巨噬细胞释放氧化氮的抗炎试验

(1)细胞的培养和供试品、反应试剂的配制

RAW 264.7大鼠巨噬细胞源于美国某公司。在37℃，5％CO₂的湿热培养箱中，用含有10％胎牛血清的HAM’sF12培养基培养。

HAM’sF12培养基：500mL中加入谷氨酸以及50mL胎牛血清。

干扰素-γ：Genzyme/Techne公司提供。

对氨基苯磺酰胺和盐酸N-1-萘基-乙二胺由Wako公司提供。

Griess试剂：盐酸N-1-萘基-乙二胺5mg用注射用水5mL溶解；对氨基苯磺酰胺50mg加入250μL磷酸后用注射用水稀释到5mL。

供试品：用实施例1制得的各单体化合物1、2、3分别用二甲基亚砜配成浓度分别为100mM，30mM，10mM和3mM的供试液，低温避光保存。

(2)活性的测定

RAW264.7细胞，调整细胞浓度到1.2×10⁶/mL，以每孔200μL加入于96孔培养板中，5％CO₂，37℃，培养2小时。然后将供试品0.4μL(终浓度：3μM，10μM，30μM，100μM)与脂多糖(终浓度：100ng/mL)2μL和干扰素-γ(终浓度：0.33 ng/mL)2μL一同加入到细胞液中(溶解样品的二甲基亚砜相对于培养基的含量为0.2％)，共同在37℃下培养16小时。随后取上清液100μL，加入事先调好的Griess试药，用酶联免疫检测仪在570nm(对照655nm)测定吸光度。本实验选用白藜芦醇作为阳性对照，以未加入测试样品和诱导剂并加入适量DMSO的细胞培养液作为空白对照，以未加样品并加入适量DMSO的细胞液作为阴性对照。按如下公式计算供试样品对巨噬细胞释放NO的抑制率：

化合物活性以半数抑制浓度(IC₅₀)表示，即以不同浓度下供试品的NO释放抑制率进行线性回归，求得抑制NO释放率为50％时所需的供试品浓度，该浓度越小，供试品活性越强。

(3)试验结果：采用上述实验方法对3个单体化合物的抑制大鼠巨噬细胞NO释放活性进行了测试，选择白藜芦醇作为阳性对照药，3个单体化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)值见下表。

化合物	IC50(单位：μM)
		1	＞100
2	78.0
		3	18.9
白藜芦醇	28.6

实验结果表明化合物1、2、3具有较强的抗炎活性，化合物3的活性强于阳性对照药白藜芦醇。

2、抑制肥大细胞释放组胺的抗炎、抗过敏实验

(1)细胞的培养和供试品、反应试剂的配制

实验采用8周龄雄性SD大鼠，体重220-250g。将大鼠断头处死后，将50-100ml含肝素的单核细胞条件培养液(缩写：MCM)溶液注入大鼠腹腔并按摩大鼠腹部2min。充分按摩后抽取大鼠腹腔液，4℃580rpm离心7min，弃去上清，并以同样方法用35ml含肝素的MCM溶液洗涤沉淀2次，得腹腔肥大细胞。将肥大细胞混悬在10ml不含肝素的MCM溶液中，台盼蓝染色在显微镜下进行细胞计数后调整细胞浓度为1×10⁵/ml。

供试品：用实施例1制得的各单体化合物1、2、3用10％的甲醇溶液配成50ug/ml、25ug/ml和1 2.5ug/ml三个浓度的溶液。

(2)活性的测定

将肥大细胞悬液分装成500ul/管，36-37℃恒温水浴振荡5min，在每管中依次加入250mM CaCl₂ 4μL，继续恒温振荡5min，添加待测样品5μL，同时设置溶剂对照组。再恒温振荡10min，加入0.5mg/mL肥大细胞脱颗粒释放组织胺刺激剂(缩写：Compound 48/80)5μL，同时设置组胺自然释放组，即以生理盐水代替Compound 48/80。加入刺激剂Compound 48/80 10min后，冰浴冷却，4℃6000 rpm离心2.5min，取上清液400μL至新管中。同时，取未经任何处理的肥大细胞悬液400μL/管，添加20μL 60％高氯酸/管后，室温放置20min，加入400μL生理盐水，在4℃，13000rpm离心2.5min后，取上清液经微孔滤膜过滤后高效液相测定组胺释放值，以峰面积进行定量。

按如下公式计算组胺释放抑制率：

化合物活性以半数抑制浓度(IC₅₀)表示，即以不同浓度下供试品组胺释放抑制率进行线性回归，求得抑制组胺释放率为50％时所需的供试品浓度，该浓度越小，供试品活性越强。

(3)实验结果

采用上述实验方法对3个单体化合物的抑制大鼠腹腔肥大细胞组胺释放活性进行了测试，3个单体化合物的半数抑制浓度IC₅₀值见下表。

化合物	IC50(单位：μM)
		1	29.9
2	----
		3	45.2

实验结果表明化合物1、3具有较强的抑制肥大细胞释放组胺的活性。

实验结果表明化合物1、3有较好的抗炎和抗过敏作用。

3、评价免疫调节活性的实验——抑制ConA诱导T淋巴细胞增殖

免疫调节剂可针对机体过高或过低的免疫反应，从神经、体液和细胞分子水平等方面调节机体免疫功能，防御感染而引起的炎症。

(1)小鼠脾细胞的制备

取标准体重的昆明种小鼠，放血处死，无菌取出脾脏放入冰浴玻璃平皿(直径5cm)中，平皿中盛有约3mL无菌的RPMI 1640培养基，轻轻将脾细胞挤出，再加入7mL培养基，用移液管反复吹打分散至单细胞悬液。400目过滤，收集细胞悬液，1000rpm离心5min(4℃)。弃上清后脾细胞加入10mL的Tris-NH₄Cl，静置2-3min，1000rpm离心5min(4℃)，去除红细胞。弃上清后，再用RPMI 1640洗涤两次，用RPMI 1640培养基配成一定浓度的脾细胞悬液。

(2)MTT法测定脾细胞增殖

将脾细胞悬液加入96孔板中，浓度5×10⁵个/孔，同时加入不同浓度的供试药物及ConA(5μg/ml)，于37℃，5％CO₂条件下培养72h，实验均设三复孔。然后向96孔板中培养的各孔细胞中分别加入5mg/mL的MTT溶液20μl，继续培养4h，1000rpm离心10min，弃上清。加入200μL的二甲基亚砜，待沉淀溶解完全后，用酶标仪测定其在540nm的吸光度。并以未加样品和诱导剂ConA的细胞液作为正常对照，以未加样品的细胞液作为阴性对照。

(3)数据处理

ConA组及ConA+化合物组与正常对照组的吸光度(OD)值比值为刺激指数。

按下式求得化合物抑制T细胞增殖的百分率：

抑制率(％)＝(Con A组刺激指数-化合物组刺激指数)/(Con A组刺激

            指数-1)×100％

半数抑制浓度(IC₅₀)通过不同浓度下供试品抑制率计算得出，表示供试品的活性。

4)实验结果见下表

化合物	IC50(单位：μM)
		123	21.94.425.0

实验结果表明：化合物1、2、3均有抑制T淋巴细胞增殖的活性，化合物2具有较强的抑制T淋巴细胞增殖的活性。即化合物1、2、3均具有免疫调节能力，从而提高防御感染而引起的炎症的能力。

以上试验说明本发明提供的化合物可应用于制备抗炎、抗过敏药物。

4、体外抗氧化能力实验：采用氧自由基清除能力(缩写：ORAC)法ORAC法是一种测定物质总抗氧化能力的方法，以一种α-生育酚的水溶性类似物-Trolox，(6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)作为标准对照。

(1)反应试剂和供试品溶液的配制

将荧光素钠用75mM的磷酸钾缓冲液(75mM KH₂PO₄、75mM K₂HPO₄)配成63μM的储备液，置于4℃避光保存，测试前用该缓冲液稀释100倍。AAPH[2，2′-偶氮(二眯基丙烷)二氯化氢]于实验前用75mM的磷酸钾缓冲液配成18.3mM的溶液。Trolox用75mM的磷酸钾缓冲液配成10μM的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。3个单体化合物1、2、3和阳性药V_C均用75mM的磷酸钾缓冲液配成100mM的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。

(2)活性的测定

本实验采用的ORAC测定参照本实验采用的ORAC测定，参照文献[Assaysfor hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity(oxygen radical absorbancecapacity(ORAC_FL))of plasma and other biological and food samples[J].J.Agric.FoodChem.2003，51(11)：3273-3279]方法进行。

实验96孔板每个孔中加入不同浓度的待测样品溶液20μL，再加入75mM磷酸钾缓冲液20μL和AAPH 140μL(终浓度12.8mM)，最后加入荧光物质20μL(终浓度63nM)启动反应，迅速将96孔板置于荧光酶标仪(预置温度37℃)中开始测定，每组平行设3个复孔。采用动力学方式，每2 min测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。

测定结果表达为ORAC值，ORAC值越大，抗氧化能力越强。ORAC值的计算式为：

(3)实验结果见下表

化合物	0.78μM时供试品的ORAC值
		1	0.54
2	0.78
		3	0.56
维生素C	0.69

实验结果表明：化合物1、2、3均具有抗氧化活性，化合物2的抗氧化活性强于维生素C。

5、体外抗氧化活性评价法：采用1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)自由基清除法

(1)DPPH·溶液和供试品溶液的配制

DPPH·用无水乙醇配成2×10^-4M的溶液，置于4℃避光保存。

供试品：取实施例1的化合物1、2、3和阳性药Vc均用无水乙醇配成1mg/mL的原液，测试前用无水乙醇稀释成所需浓度。

(2)活性的测定

将不同浓度的供试品溶液100μL和2×10^-4M DPPH·溶液100μL加入96孔板各孔中，同时以不加DPPH·(以100μL无水乙醇代替DPPH·)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设DPPH·阴性对照(以100μL无水乙醇代替供试品)，每组平行设4个复孔。将96孔板放入酶标仪中，震荡1min，并于此条件下保存(室温、避光)，30min后测试其在517nm处的吸光度OD值，按如下公式计算供试品的自由基清除率。

半数有效浓度(EC₅₀)通过不同浓度下供试品清除率计算得出，表示供试品的活性。

(3)实验结果

化合物	EC50(μM)
		1	4.0
2	1.6
		3	0.6
维生素C	1.8

结论表明：化合物2、3均有较强的抗氧化能力，且化合物3的抗氧化能力强于维生素C。

从上述试验证明本发明的化合物可用作于药品、食品、化妆品中的抗氧化添加剂。

下面的实施例说明包含本发明提供的化合物的组合物。

具体实施例：

制剂实施例1、片剂

处方    黄烷类化合物1                     10g

        微晶纤维素                        83g

        乳    糖                          25g

        预胶化淀粉                        80g

        10％PVP乙醇(50％)                 适量

        硬脂酸镁                          2g

                                          制成1000片

将黄烷类化合物10克及处方中其它辅料分别过100目筛，置60℃烘干，称取上述化合物10克与微晶纤维素、预胶化淀粉和乳糖，采用等量递加法混合均匀，用适量10％PVP乙醇溶液(50％)制软材，用筛制粒，50~60℃干燥1小时，加入处方量的硬脂酸镁，用筛整粒。取上述颗粒用8mm冲模压片，平均裸片重约200mg，每片含黄烷类化合物10mg。再采用滚转喷雾法包衣。

制剂实施例2、胶囊剂

处方  黄烷类化合物2                       20g

      微晶纤维素                          83g

      乳    糖                            25g

      预胶化淀粉                          80g

      10％PVP乙醇(50％)                   适量

      硬脂酸镁                            2g

                                          制成1000粒

将黄烷类化合物10克及处方中其它辅料分别过100目筛，置60℃烘干，称取上述化合物10克与微晶纤维素、预胶化淀粉和乳糖，采用等量递加法混合均匀，用适量10％PVP乙醇溶液(50％)制软材，用筛制粒，50~60℃干燥1小时，加入处方量的硬脂酸镁，用筛整粒。取制备好的颗粒，装2号胶囊，每粒含黄烷类化合物20mg。

制剂实施例3  注射剂

(1)取注射用水3000ml，加甘露醇400g，加热搅拌使甘露醇溶解。

(2)按其体积加入0.05％药用碳，搅拌均匀，静置10分钟后，用布氏漏斗过滤至澄清。

(3)加黄烷类化合物3 20g(以无水物计)，在60℃搅拌使溶解

(4)调溶液pH至8.0。

(5)加注射用水至5000ml，滤至澄明，得溶液A。

(6)检测溶液A含量。

(7)溶液A含量检测合格后，分装，冷冻干燥制得冻干粉针1000瓶。

制剂实施例4  驱斑霜

处方：硬脂酸       15g                甘油              15g

      氢氧化钾     0.5g               黄烷类化合物3     0.02g

      尼泊金甲酯   0.15g              尼泊金乙酯        0.15g

      水           70g                香精              少许

制备：按上述处方量投料采用常规法制成霜剂备即得。

Claims (7)

1、一种新的黄烷类化合物，是以下结构式(I)表示的化合物：

其中：R₁为H或

R₂为H或OH。

2、根据权利要求1所述的化合物，其特征在于其中R₁为H，R₂为H，化学名称为5，7，3’，4’，5’-五羟基黄烷的化合物(1)。

3、根据权利要求1所述的化合物，其中R₁为

R₂为OH，化学名称为(-)-(2R，3R)-表没食子儿茶素-7-没食子酸酯的化合物(2)。

4、根据权利要求1的化合物，其中R₁为 R₂为H，化学名称为(-)-5，3′，4′，5′-四羟基黄烷-7-没食子酸酯的化合物(3)。

5、权利要求1所述的化合物在制备抗炎药物或抗过敏药物中应用。

6、权利要求1所述的化合物用作于药品或食品或化妆品中的抗氧化添加剂。

7、一种组合物，其中含有权利要求1的黄烷类化合物，并含有常规的药用载体或食品添加剂或常规的化妆品基质。

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