WO2007099997A1 - 免疫賦活剤とその製造方法 - Google Patents

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WO2007099997A1
WO2007099997A1 PCT/JP2007/053747 JP2007053747W WO2007099997A1 WO 2007099997 A1 WO2007099997 A1 WO 2007099997A1 JP 2007053747 W JP2007053747 W JP 2007053747W WO 2007099997 A1 WO2007099997 A1 WO 2007099997A1
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WO
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coffee
arabinogalatatan
mouse
extract
derived
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PCT/JP2007/053747
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English (en)
French (fr)
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Michihiro Takagi
Kazuya Iwai
Takemi Ueda
Nanaka Gotoda
Keiko Furuya
Original Assignee
Ucc Ueshima Coffee Co., Ltd.
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    • A23F5/24—Extraction of coffee; Coffee extracts; Making instant coffee
    • A23F5/28—Drying or concentrating coffee extract
    • A23F5/285—Drying or concentrating coffee extract by evaporation, e.g. drying in thin layers, foam drying
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to an immunostimulant comprising a coffee extract as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to an immunostimulant and its use containing arabinogalactan (AG) contained in a coffee extract as an active ingredient.
  • AG arabinogalactan
  • arabinogalatatan extracted from larch has been mainly used.
  • arabinogalatatan Larch wood AG; L-AG
  • L-AG arabinogalatatan
  • larabinogalatatan derived from larch has a molecular weight of about 15,000 to about 18000, and thus has excellent water solubility and low viscosity. Taking advantage of this feature, it can be added to foods as water-soluble dietary fiber without changing the texture, and foods that are health-conscious can be developed. Furthermore, since the solid content concentration can be increased without increasing the viscosity, the ink is imparted with properties such as improved color transfer and improved pigment stability. High-end inks used for precision printing of food packaging materials, labels, wrapping materials, etc. that require gloss and transparency improve the ink transferability, and mouth-end inks used for printing newspapers, catalogs, cardboard boxes, etc. , Pigment stability can be increased. Thus, arabinogalatatan derived from larch is a polysaccharide that can be used for various purposes.
  • coffee beans contain a lot of arabinogalatatan.
  • the arabinogalatatan derived from coffee beans is characterized by a higher molecular weight than the arabinogalatatan derived from larch. Since the molecular weight is large, the viscosity cannot be increased and the solid content concentration cannot be increased unlike arabinogalatatan derived from larch. Therefore, utilization methods such as arabinogalatatan derived from larch could not be expected.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-8616
  • An object of the present invention is to provide a safe immunostimulant that can be used as a pharmaceutical or a food material, and a method for producing the same. It also provides new ways to use coffee extraction residues.
  • the present invention provides an immunostimulant comprising a coffee extract as an active ingredient.
  • the coffee extract is an immunostimulant that is an extract containing arabinogalatatan.
  • this immunostimulatory activity is derived from the promotion of proliferation of immunocompetent cells.
  • the immunocompetent cells are the macrophage-like cell lines RAW264, J774.1, mouse spleen cells (Splenocyte), mouse peritoneal macrophages (Macrophage), and mouse rodent cells (DC). I prefer it.
  • the present invention also provides a composition containing these immunostimulators.
  • These compositions can be used as compositions such as pharmaceutical compositions, food compositions and cosmetic compositions.
  • water is added to green coffee beans, roasted coffee beans, or coffee extraction residues and heated, and the heated extract is recovered and concentrated under reduced pressure. And a step of adding ethanol to the liquid concentrated under reduced pressure to cause precipitation.
  • a step of dissolving in a sodium hydride solution a step of stirring at room temperature: for ⁇ 48 hours, followed by stirring for 1 to 48 hours at 50 ° C to 70 ° C; and a step of adjusting the pH to 7.0 to 8.0
  • the step of extracting with an organic solvent, the step of degrading protein with a proteolytic enzyme, and the step of dialysis with water may be provided.
  • the water to be used for example, deionized water, distilled water, milli-Q water or the like is preferably used, and distilled water is more preferable.
  • the pH is more preferably 7.2 to 7.8, even more preferably 7.4, or 7.4 to 7.6, and particularly (preferably 7.75 to 7.55.
  • the immunostimulant of the present invention is characterized in that the average molecular weight of arabinogalatatan is 10,000 to 3,000,000.
  • the immunostimulant of the present invention is characterized in that the specific capacity of arabinose / galactose of arabinogalatatan is SO.02-1.0.
  • the present invention provides a method for increasing the amount of interleukin 12 (IL-12) produced by mouse spleen cells or dendritic cells by adding a coffee extract as compared with the case where no coffee extract is added.
  • IL-12 interleukin 12
  • the present invention provides a method for increasing the amount of interleukin-1 12 (IL 12) in mouse blood by administration of a coffee extract compared to the case of not administering a coffee extract.
  • the present invention provides a method of increasing the proliferation promoting activity of mouse spleen cells by mitogen PMA / Ionomycin by ingesting coffee extract as compared to the case of ingestion.
  • the immunostimulant of the present invention enhances the production of 1-12, or 1 ⁇ _, and therefore has a cellular immunostimulatory effect. Therefore, it is expected to be used for cancer immunotherapy and cancer prevention.
  • the active ingredients of the immunostimulant of the present invention are conventionally used as foods such as sugar, Z and lactic acid bacteria, and are known to be safe. It is also useful.
  • the immunostimulant of the present invention contains a coffee extract as an active ingredient.
  • Coffee extraction As a material for obtaining a product, for example, raw coffee beans, residues after coffee extraction, roasted coffee beans and the like can be used.
  • coffee refers to a coffee genus plant.
  • the cultivated species of the genus Coffee which belongs to the arachnid plant, includes the three primaries of arabi power, Robusta, and Riberica, and several tens of varieties based on it. These include, but are not limited to, the force Nefoora species.
  • the degree of purification may be at any stage, such as a crude product (Crude AG), a semi-purified product (Quasi-crude AG), or a highly purified product.
  • a component having an immunostimulatory action may be contained.
  • a coffee extract can be obtained by subjecting a part of a coffee plant or a residue after coffee extraction to an extraction treatment.
  • plant parts to be extracted include, but are not limited to, the coffee bean portion that is preferably used.
  • the solvent used for the extraction is not particularly limited, and may be either a polar or nonpolar solvent.
  • Specific examples of the extraction solvent include polar solvents such as water and ethyl acetate. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the extraction solvent is preferably a polar solvent, more preferably water.
  • the extraction method is performed by adding distilled water to fresh coffee beans, roasted coffee beans, or coffee extraction residues, followed by heating. Then, concentrate the extract under reduced pressure, add 3 to 4 volumes (V / V) of ethanol, collect the precipitate, and use it as the crude extract fraction.
  • the crude extract fraction When highly purified, the crude extract fraction is dissolved in a sodium hydroxide solution, stirred for several hours at room temperature, then for several hours at 55 ° C to 60 ° C, and with an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid, pH 7. After adjusting to 0 to 8.0, extract sequentially with chloroform, ethyl acetate, and jetyl ether, cover the aqueous layer with trypsin, and react at 40 ° C for 48 hours to decompose the protein. This is dialyzed against distilled water to obtain purified arabinogalatatan.
  • the coffee extract is an extract containing arabinogalatatan (Coffee AG; Cof-AG) means that the extract contains arabinogalatatan derived from coffee.
  • the molecular weight of arabinogalatatan derived from coffee is preferably 5000 or more and 3 million or less, more preferably 10,000 or more and 3 million or less, and further preferably 20,000 or more and 3 million or less.
  • the molecular weight of the polymer is measured using HPLC (High Performance Liquid Chromatograph). And measured by gel filtration chromatography.
  • the ratio of arabinose / galactose in the coffee extract is 0 ⁇ 02-1.0, more preferably 0 ⁇ 3 to 0.5 ⁇ 5.
  • this value has a certain effect even if it is divided in any part as long as it is within the range of 0.02 to: 1.0, the preferred range can be divided with any number within this range. Can do.
  • composition containing the immunostimulant examples include pharmaceutical compositions and food compositions.
  • a pharmaceutical composition having an immunostimulatory effect is provided by blending a pharmaceutically acceptable carrier or additive together with an amount of coffee extract that can effectively exert an immunostimulatory effect.
  • the pharmaceutical composition may be a pharmaceutical or a quasi drug.
  • the pharmaceutical composition may be applied internally or externally. Therefore, the pharmaceutical composition is in the form of a preparation such as an internal preparation, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection and / or intraperitoneal injection, transmucosal application agent, transdermal application agent, etc. You can power to use.
  • a preparation such as an internal preparation, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection and / or intraperitoneal injection, transmucosal application agent, transdermal application agent, etc. You can power to use.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition can be appropriately set depending on the form of application, for example, solid preparations such as tablets, granules, capsules, powders, powders, etc .; liquid preparations such as liquids and suspensions And semi-solid agents such as ointments and gels.
  • Uses of the pharmaceutical composition include antiviral agents, anticancer agents, hepatitis prophylaxis' treatment agents, atopic dermatitis prevention 'treatment agents, pollinosis prevention' treatment agents, intestinal agents and the like.
  • a food composition having an immunostimulatory effect can be provided by blending an effective amount of a coffee extract capable of exerting an immunostimulatory effect in vivo with various foods as a food material. That is, the present invention can provide a food composition labeled as immunostimulating in the field of food.
  • the food composition in addition to general foods, foods for specified health use, nutritional supplements, functional foods, foods for hospital patients, etc. can be improved.
  • Examples of the food composition include seasonings, processed meat products, processed agricultural products, beverages (soft drinks, alcoholic beverages, carbonated beverages, milk beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutritional drinks, etc.), powdered beverages (powdered powder) Juice, powdered soup, etc.), concentrated beverages, confectionery (candy, cookie, biscuit, gum, gummi, chocolate, etc.), bread, cereal and the like.
  • beverages soft drinks, alcoholic beverages, carbonated beverages, milk beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutritional drinks, etc.
  • powdered beverages powdered beverages (powdered powder) Juice, powdered soup, etc.)
  • concentrated beverages confectionery (candy, cookie, biscuit, gum, gummi, chocolate, etc.), bread, cereal and the like.
  • dietary supplements, functional foods, etc. they may be in the form of capsules, troches, mouthfuls, granules, powders, etc.
  • the blending ratio of the coffee extract in the food composition can be appropriately determined by experiments. For example, 0.01 mg / L to 5 mgZL, more preferably 0.05 mg / L to 1 mg / L is desirable.
  • Applications of the food composition include, for example, an intestinal adjuster, a hay fever preventive / therapeutic agent, a food supplement, a food for atopic dermatitis, and the like.
  • the immunostimulant of the present invention preferably further contains lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • lactic acid bacteria lactic acid bacteria usually used for food processing and the like are used, and intestinal lactic acid bacteria living in the human intestine are particularly suitable.
  • Lactobacillus gasseri Lactobacillus' casei, Lactobacillus' acidophilus, Bifido Batterium 'Longam, Bifido Batterium' Infantace ', Bifido Batterium' Bifidum ', Bifidno Kuterium Examples include 'Breve, Bifido Batterium', Addressestes, Streptococcus' Hue Power Squirrel. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the immunostimulant of the present invention can be used to produce IL-12 of macrophages or IFN_ ⁇ of intestinal epithelial lymphocytes by using the above extract alone or in combination or as a mixture with the above lactic acid bacteria. Productivity can be enhanced.
  • Lactobacillus Z gasseri JCM1131 was inoculated into 5 ml of MRS medium (trade name Lactobacilli MRS Broth, manufactured by Dif co), which is a culture medium for lactic acid bacteria, and left to stand at 32 ° C for 24 hours.
  • MRS medium trade name Lactobacilli MRS Broth, manufactured by Dif co
  • This culture solution was inoculated to 100 ml of MRS medium to 1% and cultured at 32 ° C for 24 hours.
  • the obtained culture broth was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 20 minutes to recover the cells.
  • the cells were suspended in PBS and centrifuged at 10,000 X g for 20 minutes to recover the cells. This After the operation was repeated three times, the cells were suspended in distilled water. This suspension was sterilized by placing it at 70 ° C. for 10 minutes, and then quickly frozen in dry ice / ethanol. This was freeze-dried to obtain 0.73 g of ratatobacillus' gasser
  • RAW264 cell line (R CB00535 available from RIKEN), a macrophage-like cell line derived from mouse, in DMEM medium containing 10% FBS (Ushi Fetal Serum) so that the cell number is 20 ⁇ 10 5 / ml (Hereinafter simply referred to as medium).
  • FBS Ushi Fetal Serum
  • the coffee extract to which was obtained in Preparation Example was added to the culture medium to a concentration of 0 ⁇ 0625 / g / ml ⁇ 0. 5 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, and the capacity per well and 100 ⁇ ⁇ .
  • the larch-derived arabinogaratan fraction was added to the medium at the same concentration. Furthermore, 20 ⁇ g / ml of LPS (lipopolysaccharide) and conA (concanaparin A), which are generally known as substances that stimulate immune cells, that is, substances excellent in immune response, were added. After culturing these cells at 37 ° C for 1 to 4 hours in a 5% carbon dioxide incubator, the amount of cell growth was monitored.
  • the reagent used for the proliferation test was the Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System manufactured by Takara Bio Inc., and the MICROPLATE READER Model 550 manufactured by BI01 RAD was used as the measuring device.
  • Fig. 1 shows the results of a proliferation test using the macrophage-like cell line RAW264.
  • the mouse macrophage-like cell line when coffee-derived arabinogalatatan was added, significant growth-promoting activity was observed for the control.
  • coffee extract residue extract (Crude AG from residue; CrudeR-AG), quasi-separate product (Quasi-crude AG from green coffee beans; Q. CmdeB-AG), green bean extract ( By adding three crude extracts of Crude AG from green coffee beans (CrudeB_AG), a growth-promoting activity showing a significant difference or a tendency toward control was observed.
  • Spleen cells were prepared from mice and examined for growth promoting activity in the same manner as in Example 1.
  • the cells were diluted with RPMI1640 medium (hereinafter, simply referred to as medium) containing 10% FBS (usi fetal serum) so that the number of cells was 100 ⁇ 10 5 / ml.
  • FBS usi fetal serum
  • This was seeded at 50 ⁇ per well in a 96-well tissue culture plate and cultured for 2 hours in a 37 ° C 5% carbon dioxide incubator.
  • the coffee extract obtained in the above preparation example was added to the medium so as to have a concentration of 0.125 ⁇ gZml to 0.5 ⁇ g / ml, and the total amount per well was 100 a 1.
  • the arabinogalatatan fraction derived from larch was added to the medium at the same concentration. These were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 1 to 4 hours, and then the growth amount was monitored.
  • a reagent for conducting a proliferation test a Premix WST-l Cell Proliferation Assay System manufactured by Takara Bio Inc. was used, and as a measuring device, a MICROPLATE READER Model 550 manufactured by BIO-RAD was used.
  • Fig. 2_1 to Fig. 2_3 show the splenocyte proliferating activity of the fractions containing arabinogalatatan (crude extracts of coffee extract residue, green bean extract and semi-refined product), respectively. It has been observed that the addition of coffee-derived arabinogalatatan to inbred spleen cells significantly increases the proliferation activity compared to the control. In inbred balb / c mice, a significant difference in growth activity was confirmed between arabinogalatatan derived from larch and arabinogalatatan derived from coffee. In addition, the crude extract has a growth activity that is comparable to or higher than that of a pure product obtained by highly purifying the coffee extract.
  • the coffee extract had higher growth-promoting activity than the larch arabinogalatatan.
  • significant growth-promoting activity was observed for all of the coffee extract residue extract, semi-purified product, and green bean extract.
  • Macrophages were prepared from the mouse abdominal cavity and diluted with Hank's solution so that the number of macrophage cells was 10 ⁇ 10 5 / ml. This was seeded at 50 ⁇ per well in a 96-well tissue culture plate and cultured for 2 hours in a 37 ° C 5% carbon dioxide incubator. After culturing, the floating cells were washed away with Hanks' solution, and RPMI1640 medium (hereinafter, simply referred to as medium) containing 10% FBS (usual fetal serum) was added at 50 ⁇ l per well. To this, the coffee extract obtained in the above preparation example The medium was added to a concentration of 0.125 g / ml to 0.5 / ig / ml.
  • the arabinogalatatan fraction derived from calamatu was added to the medium at the same concentration, and the volume per well was set to 100 / l. These were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 2 to 4 hours, and then the growth amount was monitored.
  • a reagent for conducting a proliferation test a premix WST-1 Cell Proliferation Assay System manufactured by Takara Bio Inc. was used.
  • a measuring device a MICROPLATE READER Model 550 manufactured by BI01 RAD was used.
  • Mouse-derived spleen cells were prepared and examined for the expression of cytoforce in.
  • the cells were diluted with RPMI1640 medium (hereinafter, simply referred to as medium) containing 10% FBS (usi fetal serum) so that the number of cells was 60 ⁇ 10 5 / ml.
  • FBS usi fetal serum
  • This was seeded in a 24-well tissue culture plate at 500 ⁇ per well, and cultured for 2 hours in a 37 ° C 5% carbon dioxide incubator.
  • the coffee extract obtained in the above preparation example was added to the medium so as to have a concentration of 0.25 zg / ml, and the total amount per well was adjusted to 1 ml.
  • the arabinogalatatan fraction derived from larch was added to the medium at the same concentration. After culturing them in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 to 37 hours, the supernatant was recovered. (Expression) confirmation of the amount of IL 12 and the amount of IFN- ⁇ was performed using Immuno assay Kit IL 12p40 and Immuno assay Kit IFN- ⁇ (BIOSOURCE), respectively.
  • the measuring device used was a MICROPLATE READER Model 550 manufactured by BIO-RAD.
  • the floating cells were washed and removed with the medium on the 2nd and 4th days of the 1 week culture period.
  • the coffee extract obtained in the above preparation example was added to the medium to a concentration of 0.25 ⁇ g Zml, and the total amount per well was 500 a 1.
  • the arabinogalatatan fraction derived from larch was added to the medium at the same concentration.
  • Figure 4-1 to Figure 4-3, Figure 9-1, Figure 9-2 show the results of ELISA test using mouse spleen cell culture supernatant and E LISA test using mouse rod-shaped cell culture supernatant. Shown in After adding 0.25 / g / ml coffee-derived alapinogalactan to splenocytes and dendritic cells isolated from inbred balb / c mice, and culturing for 20 hours, IL- It has been observed that the concentration of IL-12 and IFN- ⁇ in the dendritic cell supernatant are both significantly increased with respect to the control. (See Figure 4-1 to Figure 4-3).
  • Macrophages (Peritoneal macrophage) were prepared from mouse abdominal cavity and examined for expression of cytodynamic force in. The cells were diluted with Hank's solution so that the number of cells was 12 ⁇ 10 5 / ml. This 2 500 ⁇ 1 was seeded per well in a 4-well tissue culture plate and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 2 hours. After culturing, floating cells were washed away with Hank's solution, and RPMI1640 medium (hereinafter simply referred to as medium) containing 10% FBS (usual fetal serum) was added at 500 ⁇ l per well.
  • medium RPMI1640 medium
  • the coffee extract obtained in the above preparation example was added to the medium to a concentration of 0.25 to 250 x gZml, and the total amount per well was adjusted to 1 ml. After culturing them in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 to 48 hours, the supernatant was recovered.
  • IL-12 and TNF-expression (expression) confirmation was performed using Immuno assay Kit IL_12p40 and Immuno assay Kit TNF-a (BIOOSURCE), respectively.
  • a MIC RO PLATE READER Model 550 manufactured by BIO-RAD was used as a measuring device.
  • FIGS. 9-3 and 9-4 The results of an ELISA test using mouse macrophages are shown in FIGS. 9-3 and 9-4.
  • Macrophages isolated from inbred balbZc mice were supplemented with 0.25-250 ⁇ g Zml of coffee-derived arabinogalatatan and incubated for 20-48 hours. A significant concentration-dependent increase was observed with respect to the control, and IL-12 also showed a tendency to increase, particularly in the crude coffee extract residue.
  • a mouse-derived macrophage-like cell line J774.1 cell line (RCB0434 available from RIKEN), was prepared with 10% FBS (u, so that the number of cells was 2.4 ⁇ 10 5 / ml. Diluted with RPMI1640 medium (hereinafter simply referred to as medium) containing fetal bovine serum. This was seeded on a 24-well tissue culture plate at 500 ⁇ 1 per well and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 1 hour. To this, the coffee extract obtained in the above preparation example was added to the medium to a concentration of 25 to 5000 ⁇ g / ml, and the total amount per well was adjusted to 1 ml.
  • medium RPMI1640 medium
  • the coffee extract obtained in the above preparation example was added to the medium to a concentration of 25 to 5000 ⁇ g / ml, and the total amount per well was adjusted to 1 ml.
  • TNF-a was cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 hours, and the supernatant was collected. (Expression) confirmation of the amount of TNF-a was performed using Immuno as say Kit TNF-HI (BIOSOURCE). As a measuring device, MICROPLATE READER Model 550 manufactured by BIO-RAD was used.
  • Fig. 9-5 shows the result of ELISA test using J774. 1 cell line. J774.
  • the TNF- ⁇ concentration in the supernatant was particularly high at 5000 ⁇ g / ml. It was observed that both were significantly enhanced relative to the control.
  • [0038] Proliferation test using mouse splenocytes after arabinogalatatan administration
  • Mouse-derived spleen cells were prepared and examined for their growth-promoting activity against the mitogen PMA / Ionomycin.
  • the cells were diluted with RPMI1640 medium (hereinafter, simply referred to as medium) containing 10% FBS (usual fetal serum) so that the number of cells was 20 ⁇ 10 5 / ml.
  • FBS usual fetal serum
  • This was seeded in a 96-well tissue culture plate at 50 ⁇ per well.
  • PMA SIGMA
  • SIGMA ionomycin
  • Figure 5-1 shows the results of a proliferation test for PMA / Ionomycin using mouse spleen cells after administration.
  • the proliferative activity was enhanced compared with the control and a significant tendency (p ⁇ 0.09) was observed.
  • p ⁇ 0.09 a significant tendency
  • Distilled water 1500-2000ml was extracted from 100g of raw coffee beans or coffee brew residue and extracted at 121 ° C for 2 hours.
  • the supernatant obtained by centrifuging the obtained extract for 20 minutes at lOOOOrpm was collected, concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator, and 3 to 4 times the amount of ethanol was added to collect the precipitate.
  • This precipitate was used as a crude product.
  • Fig. 6 (A) shows the preparation flow of arabinogalatatan from green coffee beans and (B) from the coffee extract residue.
  • coffee-derived arabinogalatatan had an average molecular weight of 27000 and the same molecular weight distribution as that of larch-derived arabinogalatatan, which was wider than that of larch-derived arabinogalatatan. It was. (See Fig. 8)
  • Example 5 shows the results of examining the effect of suppressing the total IgE antibody production in blood by the administration of coffee-derived arabinogalatatan.
  • Total serum IgE antibody by arabinogalatatan when ovalbumin (OVA, SIGMA) is administered to mice ingested with coffee-derived arabinogalatatan and larch-derived arabinogalatatan to induce IgE antibody production Inhibition of production The result is confirmed.
  • Sensitization was performed as follows. For the first sensitization, prepare 10VA of OVA per mouse and 2mg of aluminum hydroxide gel (SIGMA) as adjuvant in 0.3ml of phosphate buffered saline (PBS). Each age-old mouse was intraperitoneally administered on the first day and the fourth day of sensitization. As secondary sensitization, OVA was dissolved in PBS to 25 mgZml, and the nose of the mouse was immersed in this antigen solution for about 3 seconds. This procedure was repeated three times at a time. Secondary sensitization was performed 10 days after the first sensitization start day for 10 days, twice a day in the morning and evening.
  • SIGMA aluminum hydroxide gel
  • Coffee-derived arabinogalatatan (Cof_AG) against the fungi composing the intestinal flora is shown below, including the results of comparison with other saccharides.
  • GAM bouillon liquid medium was used for the pre-stage culture, and the test medium used was the autoclaved bacteria after adding the test sugars to the Pepton-Yeast-Fildes solution (PYF) liquid medium.
  • the PYF medium has the composition shown in Table 1 below. Fild es solution is prepared as shown in Table 2 below. [0047] [Table 1]
  • glucose control
  • coffee-derived arabinogalatatan coffee-derived arabinogalatatan
  • larch-derived arabinogalatatan were used.
  • the test strains are shown in Table 3 below.
  • the test results are shown in Table 4 and Table 5 below.
  • Bifijobs cten'um i. ngum JCM7062 Bifidobacterium hngum JCM7063 Bifidoba Gtsrium bngum JCM7054 Bifidabs cten'um iongum JCM7055 Bifid bsGterium ngum JCM7066 Bifidoba ts u hngum JCM11340
  • coffee-derived arabinogalatatan is favorably contributed to the genus Bifidobacterium, which is a useful intestinal bacterium, and Bifidobacterium longum has a arabinogalatatan derived from larch It was found that it was assimilated to the same extent, and Bifidobacterium pseudocatenulatum was assimilated better than larch-derived arabinogalatatan.
  • the genus Bifidobacterium is known as a representative species of useful intestinal bacteria in humans.
  • the immunostimulatory agent of the present invention has a cellular immunostimulatory effect in order to promote the growth of macrophages. Therefore, it is expected to be used as a therapeutic drug for cancer immunotherapy, cancer prevention, and viral disease prevention. It can also be used as an effective method of using health foods and coffee extraction residues.
  • FIG. 1 is a graph showing the growth promoting activity of a coffee extract using a macrophage-like cell line RAW264.
  • FIG. 2-1 A diagram showing the growth promoting activity (balb / c) of coffee extract using mouse spleen cells.
  • Fig. 2-2 shows the growth promotion activity (C57BL / 6) of coffee extract using mouse spleen cells.
  • Sen 2-3 This figure shows the growth-promoting activity (ICR) of coffee extract using mouse spleen cells.
  • FIG. 3-2 is a graph showing the growth promotion activity (C57BL / 6) of coffee extract using mouse peritoneal macrophages.
  • Fig. 4-1 shows the increase of IL_12 concentration by adding coffee-derived arabinogalatatan to splenocytes isolated from inbred balbZc mice.
  • This figure shows the increase in IFN- ⁇ concentration by adding coffee-derived arabinogalatatan to dendritic cells isolated from inbred balb / c mice.
  • FIG. 7 is a diagram showing a method for preparing coffee beans-derived arabinogalatatan (purified product).
  • FIG. 8 is a graph showing the average molecular weight of purified arabinogalatatan.
  • FIG. 9-1 is a diagram showing the results of an ELISA test (IL_12 production) using mouse spleen cells.
  • FIG. 9-2 is a diagram showing the results of an ELISA test (IFN_y production) using mouse spleen cells.
  • FIG. 9-3 is a diagram showing the results of an ELISA test (IL_12 production) using mouse macrophages.
  • FIG. 9_5 shows the results of ELISA test (TNF- ⁇ production) using the J774. 1 cell line.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of examining the effect of suppressing the total IgE antibody production in blood by administration of coffee-derived arabinogalatatan.

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Abstract

　医薬品、食品素材としても利用可能な安全な免疫賦活剤及びその製造方法を提供することを目的とする。また、コーヒー抽出残渣の新規な利用方法をも提供する。本発明は、コーヒー抽出物を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。好ましくは、コーヒー抽出物がアラビノガラクタンを含有する抽出物である免疫賦活剤である。また、この免疫賦活活性が、マクロファージなどの免疫担当細胞の増殖促進に由来することを特徴とする。ここで、免疫担当細胞が、マクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４、Ｊ７７４．１、マウス脾細胞、マウス腹腔マクロファージ、マウス樹状細胞のいずれかであることが好ましい。また、これらの免疫賦活剤を含有する組成物は、医薬組成物、食品組成物、化粧品組成物の組成物として利用できる。

Description

明 細 書
免疫賦活剤とその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、コーヒー抽出物を有効成分とする免疫賦活剤に関する。さらに詳しくは 、本発明は、コーヒー抽出物に含有されるァラビノガラタタン（Arabinogalactan ;AG )を有効成分として含有する、免疫賦活剤及びその利用に関する。
背景技術
[0002] 従来、ァラビノガラタタンはカラマツから抽出されたものが主として使用されてきた。力 ラマツ由来のァラビノガラタタン（Larch wood AG ; L— AG)を食品添加物として使 用する場合には、不純物を除くために高度に精製する必要があった。そこで、食経験 のある食品由来の原料から容易に精製できるァラビノガラタタン抽出物の製造方法 およびァラビノガラタタン抽出物が求められていた。
また、カラマツ由来のァラビノガラタタンは分子量が 15000〜： 18000程度であること から、水溶性に優れ、粘度が低いという特徴があった。この特徴を活かし、テクスチャ に変化を与えず食品に水溶性食物繊維として添加することができ、健康を意識した 食品が開発できる。さらに粘度を上げずに固形分濃度を上げることができるため、ィ ンクにおいては色の転写性改善、顔料安定性の向上などの特性が付与される。光沢 と透明性を必要とする食品包材、ラベル、ラップ材等の精密印刷に用いるハイエンド インクには、インクの転写性を高め、新聞、カタログ、段ボール箱等の印刷に用いる口 一エンドインクでは、顔料の安定性を増すことができる。このように、カラマツ由来のァ ラビノガラタタンは様々な用途に使用できる多糖類である。
一方、コーヒー豆中にはァラビノガラタタンが多く含まれている。コーヒー豆由来の ァラビノガラタタンは、カラマツ由来のァラビノガラタタンと比較して、その分子量が大 きいことに特徴がある。分子量が大きいことから、カラマツ由来のァラビノガラタタンの ように粘度を上げず固形分濃度を上げることができない。従ってカラマツ由来のァラ ビノガラタタンのような利用方法は期待できなかった。
従って、コーヒー生豆、コーヒー焙煎豆、コーヒー抽出後の残渣にもァラビノガラクタ ンが含有されているにもかかわらず、ァラビノガラタタンの資源としての利用はなされ てこなかった。そこで、コーヒー抽出物、特にァラビノガラタタン含有画分の新規な用 途の開発が求められていた。
一方、今後、少子高齢化が一層進み、老人が増加することが予想され、免疫力を 高める新規な医薬、食品素材が求められている。
[0003] 特許文献 1 :特開 2005— 8616号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、医薬品、食品素材としても利用可能な安全な免疫賦活剤及びその製造 方法を提供することを目的とする。また、コーヒー抽出残渣の新規な利用方法をも提 供する。
課題を解決するための手段
[0005] 上記目的を達成するため、本発明者らは、コーヒー抽出物、より詳しくはァラビノガ ラタタンを含有するコーヒー抽出物の用途に関して鋭意研究を行った結果、免疫賦 活作用があることを見出し、本発明を完成した。
[0006] 本発明は、コーヒー抽出物を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。好ましくは、 コーヒー抽出物がァラビノガラタタンを含有する抽出物である免疫賦活剤である。また 、この免疫賦活活性が、免疫担当細胞の増殖促進に由来することを特徴とする。ここ で、免疫担当細胞が、マクロファージ様細胞株 RAW264、 J774. 1、マウス脾細胞（ Splenocyte) ,マウス腹腔マクロファージ（Macrophage)、マウス榭状細胞（Dendri tic cell； DC)のレ、ずれかであることが好ましレ、。
[0007] また、本発明は、これらの免疫賦活剤を含有する組成物を提供する。これら組成物 は、医薬組成物、食品組成物、化粧品組成物等の組成物として利用できる。
また、本発明の免疫賦活剤の製造工程としては、コーヒー生豆、コーヒー焙煎豆ま たはコーヒー抽出残渣に水を添加し、加熱する工程と、加熱抽出液を回収し、減圧 濃縮する工程と、減圧濃縮した液体にエタノールを加えて沈殿させる工程とを有する ことを特徴とする。
更に、減圧濃縮した液体にエタノールをカ卩えて沈殿させる工程の後に、沈殿を水酸 化ナトリウム溶液に溶解する工程と、室温で:!〜 48時間、ついで、 50°C〜70°Cで 1 〜48時間攪拌する工程と、 pHを 7· 0〜8. 0に調製する工程と、有機溶媒で抽出す る工程と、タンパク分解酵素によりタンパク質を分解する工程と、水で透析する工程と を設けても良い。
ここで、使用する水としては、例えば、脱イオン水、蒸留水、ミリ Q水等が好ましく用 いられるが、より好ましくは蒸留水である。 pHはより好ましくは、 7. 2〜7. 8、さらに好 ましく ίま、 7. 4〜7. 6、特 (こ好ましく ίま 7. 45〜7. 55である。
[0008] また、本発明の免疫賦活剤は、ァラビノガラタタンの平均分子量が 1万〜 300万で あることを特徴とする。
また、本発明の免疫賦活剤は、ァラビノガラタタンのァラビノース/ガラクトースの比 力 SO. 02-1. 0であることを特徴とする。
また、本発明は、コーヒー抽出物を添加することによりマウス脾細胞または樹状細胞 のインターロイキン 12 (IL— 12)産生量を、コーヒー抽出物無添加の場合に比べ 増加させる方法を提供する。
また、本発明は、コーヒー抽出物投与により、マウス血中インターロイキン一 12 (IL 12)量を、コーヒー抽出物非投与の場合に比べ増加させる方法を提供する。 また、本発明は、コーヒー抽出物を摂取させることによりマウス脾細胞の、マイトジェ ン PMA/Ionomycinによる増殖促進活性を非摂取の場合に比べ高める方法を提 供する。
発明の効果
[0009] 本発明の免疫賦活剤は、 1し_ 12の産生または 1^_ の産生を増強するため、 細胞性免疫賦活作用を有する。そのため、癌の免疫療法や癌の予防への利用が期 待される。また、本発明の免疫賦活剤の有効成分は、従来から食品として用いられて レ、る糖および Zまたは乳酸菌であり、安全であることが知られているため、医薬品とし てだけでなぐ健康食品としても有用である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明の実施例について、図面を参照しながら詳細に説明していく。
本発明の免疫賦活剤は、コーヒー抽出物を有効成分として含有する。コーヒー抽出 物を得るための材料としては、例えば、コーヒーの生豆、コーヒー抽出後の残渣、コー ヒー焙煎豆等を用いることができる力 これらに限られない。
[0011] 本発明において、コーヒーとは、コーヒー属植物をいう。ァカネ科植物に属するコー ヒー属の栽培種は、ァラビ力種、ロブスタ種、リベリカ種の三原種とそれをもとにした数 十品種がある。力ネフオラ種、等が挙げられるがこれらに限られない。
[0012] また、粗精製物（Crude AG)、準精製物（Quasi— crude AG)、高度に精製され たもの等、精製度はどの段階でもよい。要するに免疫賦活作用を有する成分を含有 すればよい。
[0013] コーヒー抽出物は、コーヒー植物体の一部あるいは、コーヒー抽出後の残渣を抽出 処理することにより得られる。抽出対象となる植物部位として、例えば、前記コーヒー の豆の部分が好ましく用いられるがこれに限られなレ、。
[0014] また、抽出に使用される溶媒としては、特に制限されず、極性及び非極性溶媒のい ずれであってもよレ、。当該抽出溶媒として、具体的には、水、酢酸ェチル等の極性溶 媒が例示される。これらの溶媒は単独で用いてもよぐ二種以上を組み合わせて使用 してもよい。前記抽出溶媒として好ましくは極性溶媒であり、より好ましくは水である
[0015] 抽出方法は、粗抽出の場合は、コーヒー生豆、コーヒー焙煎豆またはコーヒー抽出 残渣に蒸留水を添加し、加熱して抽出する。その後、抽出液を減圧濃縮した後、 3〜 4倍量 (V/V)のエタノールを添加し、沈殿を回収し、粗抽出画分とする。
高度に精製する場合には、粗抽出画分を水酸化ナトリウム溶液に溶解し、室温で 数時間、ついで 55°C〜60°Cで数時間攪拌し、硫酸、塩酸等の酸により、 pH7. 0〜 8. 0に調整後、クロロフオルム、酢酸ェチル、ジェチルエーテルで順次抽出し、水層 にトリプシンをカ卩え、 40°C、 48時間反応させ、タンパク質を分解する。このものを蒸留 水に透析し、精製ァラビノガラタタンを得る。
[0016] コーヒー抽出物がァラビノガラタタン（Coffee AG ; Cof—AG)を含有する抽出物で あるとは、前記抽出物がコーヒー由来のァラビノガラタタンを含有することを意味する 。コーヒー由来のァラビノガラタタンの分子量は、好ましくは、 5000以上 300万以下、 より好ましくは、 1万以上 300万以下、さらに好ましくは、 2万以上 300万以下である。 なお、ここでレヽぅ分子量は HPLC (High Performance Liquid Chromatograph)を用レヽ てゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した値である。
[0017] コーヒー抽出物のァラビノース/ガラクトースの比率は、 0· 02-1. 0、より好ましく は 0· 3〜0· 5である。なお、この数値は、 0. 02〜： 1. 0の範囲内であればどの部分で 区切ってもそれなりの効果を発揮するため、この範囲内であれば任意の数値で好ま しい範囲を区切ることができる。
[0018] 前記免疫賦活剤を含有する組成物としては、例えば、医薬組成物、食品組成物等 が挙げられる。
[0019] (医薬組成物）
医薬の分野では、免疫賦活作用を有効に発揮できる量のコーヒー抽出物とともに、 薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、免疫賦活作用を有する医 薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても、医薬部外品であつ てもよい。
当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また、外用的に適用されてもよい。し たがって、当該医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射 及び/または腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で 使用すること力できる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば 、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤、等の固形製剤;液剤、懸濁剤等の液状 製剤、軟膏剤、ゲル剤等の半固形剤があげられる。
当該医薬組成物の用途としては、抗ウィルス剤、抗癌剤、肝炎の予防'治療剤、アト ピー性皮膚炎の予防'治療剤、花粉症予防'治療剤、整腸剤等があげられる。
[0020] (食品組成物）
食品の分野では、免疫賦活作用を生体内で発揮できる有効な量のコーヒー抽出物 を食品素材として、各種食品に配合することにより、免疫賦活作用を有する食品組成 物を提供することができる。すなわち、本発明は、食品の分野において、免疫賦活用 と表示された食品組成物を提供することができる。当該食品組成物としては、一般の 食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病院患者用食品等をあ げ'ること力 Sできる。 当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料 (清涼 飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等 )、粉末飲料 (粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類 (キャンディ、クッキ 一、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等をあげることができる。ま た、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等の場合、カプセル、トローチ、シ 口ップ、顆粒、粉末等の形状であってもよい。
当該食品組成物におけるコーヒー抽出物の配合率としては、適宜実験により決定 できるが、例えば、 0. 01mg/L〜5mgZL、より好ましくは、 0. 05mg/L~lmg/ Lが望ましい。
[0021] 当該食品組成物の用途としては、例えば整腸剤、花粉症予防 ·治療剤、食品添カロ 物、アトピー性皮膚炎用食品等が揚げられる。
[0022] 本発明の免疫賦活剤は、さらに乳酸菌を有効成分として含有することが好ましい。
乳酸菌としては、食品の加工などに通常用いられる乳酸菌類が用いられ、特に、ヒト の腸内に棲んでいる腸内乳酸菌類が好適である。代表的には、ラクトバチルス ·ガセ リ、ラクトバチルス 'カゼィ、ラクトバチルス'ァシドフィルス、ビフイドバタテリゥム'ロンガ ム、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム、ビフィドノく クテリゥム'ブレーべ、ビフイドバタテリゥム'アドレツセンテス、ストレプトコッカス'フエ力 リスなどが挙げられる。これらは、単独で用いてもよぐあるいは 2種以上を組み合わ せて用いてもよい。
[0023] 本発明の免疫賦活剤は、上記抽出物を単独でまたは組み合わせて、あるいは上記 乳酸菌との混合物として用いることにより、マクロファージの IL— 12の産生能または 腸管上皮細胞間リンパ球の IFN_ γ産生能を増強することができる。
[0024] (調製例）
乳酸菌培養培地である MRS培地（商品名 Lactobacilli MRS Broth」、 Dif co 社製） 5mlにラクトバチルス Zガセリ JCM1131を接種し、 32°Cで 24時間静置培養し た。この培養液を 100mlの MRS培地に 1 %になるように接種し、 32°Cで 24時間静置 培養した。得られた培養液を 10, 000 X gで 20分間遠心分離し、菌体を回収した。こ の菌体を PBSに懸濁し、 10， 000 X gで 20分間遠心分離し、菌体を回収した。この 操作を 3回繰り返した後、菌体を蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 70°Cに 10分間置 レ、て殺菌した後、ドライアイス一エタノール中で急速凍結した。これを凍結乾燥し、ラ タトバチルス'ガセリ乾燥死菌体 0. 73gを得た。
実施例 1
[0025] (マクロファージ様細胞株 RAW264を用いた増殖試験）
マウス由来のマクロファージ様細胞株である RAW264細胞株（理研より入手可能 R CB00535)を、細胞数が 20 X 105/mlとなるように、 10%FBS (ゥシ胎児血清）を含 む DMEM培地（以下、単に培地という）で希釈した。これを 96穴組織培養プレートに 1穴当たり 50 μ 1を播種し、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器内で 2時間培養した。これに 上記調製例で得たコーヒー抽出物を 0· 0625 / g/ml〜0. 5 μ §/πι1の濃度になる ように培地に加え、 1穴あたりの容量を 100 μ ΐとした。比較としてカラマツ由来のァラ ビノガラタタン画分を同じ濃度で培地に添加した。さらに、免疫細胞を刺激する物質、 すなわち免疫応答に優れた物質として一般に知られている LPS (リポポリサッカライド )や conA (コンカナパリン A)を 20 μ g/ml添加した。これらを 5%炭酸ガス培養器内 で 37°Cにて 1〜4時間培養後、細胞の増殖量をモニターした。増殖試験を行う試薬と しては、タカラバイオ株式会社の Premix WST- 1 Cell Proliferation Assay Systemを用レ、、計測装置としては BI〇一 RAD社製の MICROPLATE READE R Model 550を用レヽた。
[0026] マクロファージ様細胞株 RAW264を用いた増殖試験の結果を図 1に示す。マウス マクロファージ様細胞株において、コーヒー由来のァラビノガラタタンを添加すると、コ ントロールに対して有意な増殖促進活性が認められた。また、マウスマクロファージ様 細胞株において、コーヒー抽出残渣抽出物（Crude AG from residue ; CrudeR- AG)、準精 物 (Quasi— crude AG from green coffee beans ; Q. CmdeB— AG)、生豆抽出物（Crude AG from green coffee beans ; CrudeB_AG)の 3 種の粗抽出物を添加することによって、コントロールに対する有意差、または有意傾 向を示す増殖促進活性が認められた。
実施例 2
[0027] (マウス脾細胞を用いた増殖試験） マウスから脾細胞を調製し、実施例 1と同様に増殖促進活性を調べた。細胞数が 1 00 X 105/mlとなるように、 10%FBS (ゥシ胎児血清）を含む RPMI1640培地（以 下、単に培地という）で希釈した。これを 96穴組織培養プレートに 1穴当たり 50 μ ΐを 播種し、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器内で 2時間培養した。これに上記調製例で得た コーヒー抽出物を 0. 125 x gZml〜0. 5 μ g/mlの濃度になるように培地に加え、 1 穴あたりの全量を 100 a 1とした。比較としてカラマツ由来のァラビノガラタタン画分を 同じ濃度で培地に添加した。これらを 5 %炭酸ガス培養器内で 37°Cにて 1〜4時間 培養後、増殖量をモニターした。増殖試験を行う試薬としては、タカラバイオ株式会 社の Premix WST—l Cell Proliferation Assay Systemを用レヽ、計測装置 としては BIO— RAD社製の MICROPLATE READER Model 550を用レヽた。
[0028] マウス脾細胞を用いた増殖試験の結果を図 2 _ 1〜図 2 _ 3に示す。図 2_ 1〜図 2 _ 3は、それぞれァラビノガラタタン含有画分 (コーヒー抽出残渣、生豆抽出物、準精 製物のそれぞれの各粗抽出物）の脾細胞増殖活性を示す。近交系の脾細胞におい てコーヒー由来のァラビノガラタタンを添加すると、コントロールと比較して有意に増殖 活性が亢進していることが観察されている。また、近交系 balb/cマウスではカラマツ 由来のァラビノガラタタンとコーヒー由来のァラビノガラタタンとの間で増殖活性の有 意差が確認されている。また、粗抽出物についてはコーヒー抽出物を高度に精製し た純精製物と同程度力それ以上の増殖活性が認められる。
以上まとめると、カラマツのァラビノガラタタンに比べ、コーヒー抽出物の方が、増殖 促進活性は高かった。また、コーヒー抽出残渣抽出物、準精製物、生豆抽出物のい ずれに関しても有意な増殖促進活性が見られた。
実施例 3
[0029] (マウス腹腔マクロファージを用いた増殖試験）
マウス腹腔からマクロファージを調製し、マクロファージ細胞数が 10 X 105/mlとな るように、ハンクス液で希釈した。これを 96穴組織培養プレートに 1穴当たり 50 μ ΐを 播種し、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器内で 2時間培養した。培養後、ハンクス液で浮遊 細胞を洗浄除去し、 10%FBS (ゥシ胎児血清）を含む RPMI1640培地（以下、単に 培地という）を 1穴あたり 50 μ 1添加した。これに上記調製例で得たコーヒー抽出物を 0. 125 g/ml〜0. 5 /i g/mlの濃度になるように培地に加えた。比較としてカラマ ッ由来のァラビノガラタタン画分を同じ濃度で培地に添加し、 1穴あたりの容量を 100 / lとした。これらを 5%炭酸ガス培養器内で 37°Cにて 2〜4時間培養後、増殖量をモ 二ターした。増殖試験を行う試薬としては、タカラバイオ株式会社の Premix WST - 1 Cell Proliferation Assay Systemを用レヽ、計測装置としては BI〇一 RAD 社製の MICROPLATE READER Model 550を用レヽた。
[0030] マウス腹腔マクロファージを用いた増殖試験の結果を図 3 _ 1〜図 3 _ 3に示す。力 ラマツのァラビノガラタタンに比べ、コーヒー抽出物の方が、増殖促進活性は高かつ た。近交系、クローズドコロニーの両系統のマウス腹腔マクロファージにおいてコーヒ 一由来のァラビノガラタタンを添加すると、コントロールに対して有意に増殖活性が亢 進していることが観察されている。また、カラマツ由来のァラビノガラタタンの増殖活性 効果とコーヒー由来のァラビノガラタタンのそれとを比較すると有意な差が認められる 。すなわち、マウス系統の C57BL/6と ICRについて、 1 · 4倍程度のマクロファージ 増殖の活性化が観察されている。特に、マクロファージに対する粗抽出物の効果の 程度は脾細胞の時よりも顕著に純精製物を越えていた。 実施例 4
[0031] (マウス脾細胞培養上清を用いた ELIS A試験）
マウス由来の脾細胞を調製し、サイト力インの発現を調べた。細胞数が 60 X 105/ mlとなるように、 10%FBS (ゥシ胎児血清）を含む RPMI1640培地（以下、単に培地 という）で希釈した。これを 24穴組織培養プレートに 1穴当たり 500 μ ΐを播種し、 37 °Cの 5%炭酸ガス培養器内で 2時間培養した。これに上記調製例で得たコーヒー抽 出物を 0. 25 z g/mlの濃度になるように培地に加え、 1穴あたりの全量を lmlとした 。比較としてカラマツ由来のァラビノガラタタン画分を同じ濃度で培地に添加した。こ れらを 5%炭酸ガス培養器内で 37°Cにて 20〜37時間培養後、上清を回収した。 IL 12量， IFN—γ量の（発現）確認は、それぞれImmuno assay Kit IL 12p40 , Immuno assay Kit IFN— γ (BIOSOURCE)を用いて行った。計測装置とし ては BIO— RAD社製の MICROPLATE READER Model 550を用いた。
[0032] (マウス樹状細胞培養上清を用いた ELIS A試験） マウス由来の榭状細胞を調製し、サイト力インの発現を調べた。マウス下肢大腿骨 から注射器で無菌的に骨髄細胞を採取し、細胞数が 4 X 106/mlとなるように、 4ng /mlの IL - 4 (和光純薬）と 1 Ong/mlの GM-CSF (和光純薬）、 10 %FBS (ゥシ胎 児血清）を含む RPMI1640培地（以下、単に培地という）で希釈した。これを 24穴組 織培養プレートに 1穴当たり 250 μ 1を播種し、 37°Cの 5 %炭酸ガス培養器内で 1週 間培養した。
尚、 1週間の培養期間のうち 2、 4日目に培地で浮遊細胞を洗浄除去した。これに 上記調製例で得たコーヒー抽出物を 0. 25 μ gZmlの濃度になるように培地に加え、 1穴あたりの全量を 500 a 1とした。比較としてカラマツ由来のァラビノガラタタン画分を 同じ濃度で培地に添加した。
これらを 5%炭酸ガス培養器内で 37°Cにて 20時間培養後、上清を回収した。 IL- 12量の（発現）確認は Immunoassay Kit Mouse IL- 12p40 (BIOSOURCE) を、 IFN— γ量の（発現）確認は Immunoassay Kit Mouse IFN— γ (BIOSO URCE)を用いて行った。計測装置としては BIO— RAD社製の MICROPLATE R EADER Model 550を用レヽた。
[0033] マウス脾細胞培養上清を用いた ELISA試験とマウス榭状細胞培養上清を用いた E LISA試験の結果を図 4—1〜図 4— 3、図 9— 1、図 9— 2に示す。近交系 balb/cマ ウスより単離した脾細胞、及び樹状細胞に 0. 25 / g/mlのコーヒー由来のァラピノ ガラクタンを添加し、 20時間培養したところ、脾細胞上清の IL— 12の濃度がコント口 ールに対して有意傾向で、樹状細胞上清の IL 12、 IFN- γの濃度が共にコント口 ールに対して有意に亢進していることが観察されている（図 4—1〜図 4— 3を参照）。 また、同マウスより単離した脾細胞に 0. 25 x gZmlのコーヒー由来のァラビノガラタ タンを添加し、 37時間培養したところ、上清の IL_ 12、 IFN- yの濃度が共に亢進 する傾向にあり、特にコーヒー抽出残渣粗抽出物において IFN_ 産生に有意差が 認められた（図 9— 1，図 9— 2を参照）。
[0034] (マクロファージを用いた ELISA試験）
マウス腹腔からマクロファージ（Peritoneal macrophage)を調製し、サイト力インの 発現を調べた。細胞数が 12 X 105/mlとなるように、ハンクス液で希釈した。これを 2 4穴組織培養プレートに 1穴当たり 500 β 1を播種し、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器内 で 2時間培養した。培養後、ハンクス液で浮遊細胞を洗浄除去し、 10%FBS (ゥシ胎 児血清）を含む RPMI1640培地（以下、単に培地という）を 1穴あたり 500 μ 1添加し た。これに上記調製例で得たコーヒー抽出物を 0. 25〜250 x gZmlの濃度になるよ うに培地に加え、 1穴あたりの全量を lmlとした。これらを 5%炭酸ガス培養器内で 37 °Cにて 20〜48時間培養後、上清を回収した。 IL—12量， TNF—ひ量の（発現)確 言忍は、それぞれ Immuno assay Kit IL _ 12p40、 Immuno assay Kit TNF - a (BI〇S〇URCE)を用いて行った。計測装置としては BIO— RAD社製の MIC RO PLATE READER Model 550を用レヽた。
[0035] マウスマクロファージを用いた ELISA試験の結果を図 9— 3および図 9— 4に示す。
近交系 balbZcマウスより単離したマクロファージに 0. 25〜250 μ gZmlのコーヒー 由来のァラビノガラタタンを添カロし、 20〜48時間培養したところ、上清の TNF—ひの 濃度が共にコントロールに対して有意に濃度依存的に亢進していることが観察され、 IL— 12についても特にコーヒー抽出残渣粗抽出物において亢進の傾向が認められ た。
[0036] また、マウス由来のマクロファージ様細胞株である J774. 1細胞株（理研より入手可 能 RCB0434)を、細胞数が 2· 4 X 105/mlとなるように、 10%FBS (ゥシ胎児血清） を含む RPMI1640培地（以下、単に培地という）で希釈した。これを 24穴組織培養 プレートに 1穴当たり 500 β 1を播種し、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器内で 1時間培養し た。これに上記調製例で得たコーヒー抽出物を 25〜5000 μ g/mlの濃度になるよう に培地に加え、 1穴あたりの全量を lmlとした。これらを 5%炭酸ガス培養器内で 37 °Cにて 20時間培養後、上清を回収した。 TNF - a量の（発現)確認は Immuno as say Kit TNF—ひ （BIOSOURCE)を用いて行った。計測装置としては BIO— R AD社製の MICROPLATE READER Model 550を用レヽた。
[0037] J774. 1細胞株を用いた ELISA試験の結果を図 9— 5に示す。 J774. 1細胞株に 2 5〜5000 μ g/mlのコーヒー由来のァラビノガラタタンを添加し、 20時間培養したと ころ、特に 5000 μ g/mlにおいて上清の TNF— αの濃度が共にコントロールに対し て有意に亢進してレ、ることが観察された。 [0038] (ァラビノガラタタン投与後のマウス脾細胞を用いた増殖試験）
ァラビノガラタタン投与試験には 9週齢ォスの近交系 balb/cマウスを用レ、、次の投 与量および匹数 (n)で一週間実施した。
A)コーヒー由来ァラビノガラタタン純精製物 2. 5mg/日； n= 5
B)カラマツ由来ァラビノガラタタン純精製物 2. 5mgZ日； n= 5
C)コーヒー抽出残渣由来粗抽出物 2. 5mgZ日； n = 5
D)水（コントロール）； n= 6
尚、それぞれのサンプノレは水に溶解し、投与形態は自由給水とした。
マウス由来の脾細胞を調製し、マイトジェンである PMA/Ionomycinに対する増 殖促進活性を調べた。細胞数が 20 X 105/mlとなるように、 10%FBS (ゥシ胎児血 清）を含む RPMI1640培地（以下、単に培地という）で希釈した。これを 96穴組織培 養プレートに 1穴当たり 50 μ ΐを播種した。これに PMA (SIGMA)を 50ng/ml、 Io nomycin (SIGMA)を lng/mlの濃度になるように培地に加えて添加し、 1穴あたり の全量を 100 β 1とした。これらを 5%炭酸ガス培養器内で 37°Cにて 24時間培養後、 増殖量をモニターした。増殖試験を行う試薬としては、タカラバイオ株式会社の Prem ix WST- 1 Cell Proliferation Assay Systemを用レヽ、計測装置としては BI O— RAD社製の MICROPLATE READER Model 550を用いた。
[0039] (ァラビノガラタタン投与後のマウス脾細胞を用いた増殖試験）
投与マウス脾細胞を用いた PMA/Ionomycinに対する増殖試験の結果を図 5— 1に示す。コーヒー由来のァラビノガラタタン投与マウスの脾細胞にマイトジェンをカロ え 24時間培養すると、コントロールと比べて増殖活性が亢進し有意傾向（p< 0. 09) が認められた。また、コーヒー抽出残渣抽出物投与マウスの脾細胞においてはコント ロールに対し、有意な増殖活性の亢進が確認された。
[0040] (ァラビノガラタタン投与後のマウス血清を用いた ELISA試験）
上記のァラビノガラタタン投与試験終了後、マウスの血清を回収し、サイト力インの 発現を調べた。 IL— 12量の確認は Immunoassay Kit IL- 12 + p40 (BIOSOU RCE)を用いて行った。計測装置としては BIO— RAD社製の MICROPLATE RE ADER Model 550を用いた。結果を図 5— 2に示す。近交系 balbZcマウスに対 し、 1日あたり 2. 5mgのコーヒー由来ァラビノガラタタン精製物、および抽出残渣由 来粗抽出物を一週間投与したところ、血中のサイト力イン濃度がコントロールに対して 有意に亢進してレ、ることが観察されてレ、る。
[0041] (ァラビノガラタタンの調製）
コーヒー生豆または ーヒー由出残澄 100gに蒸留水 1500〜2000mlをカロ免、 12 1°Cで 2時間抽出した。得られた抽出液を、 lOOOOrpm, 20分間遠心した上清を回 収し、ロータリーエバポレータで減圧濃縮し、 3〜4倍量のエタノールを加え沈殿を回 収した。この沈殿を粗精製物として用いた。図 6 (A)にコーヒー生豆、（B)にコーヒー 抽出残渣からのァラビノガラタタンの調製フローを示す。
さらに精製する場合は、粗精製物 2. 5gを 0. 2M水酸化ナトリウム溶液 100mlに溶 解し、室温（25°C)で 3時間、 55〜60°Cで 3時間攪拌した後、硫酸で pH7. 5に調整 し、クロロフオルム、酢酸ェチル、ジェチルエーテルで順次抽出した後、水層にトリプ シンを加え、 40°C、 48時間反応させ、タンパク質を分解除去した。このものを蒸留水 に透析することにより、精製ァラビノガラタタン 1 · 4gを得た。図 7に調製フローに示す
[0042] (精製ァラビノガラタタンの平均分子量の測定）
HPLCによるゲルろ過クロマトグラフィー (カラム： TSK— GEL G6000PW φ 7. 5 mm X 300mm,ガードカラム： TSK— GUARD COLUMN PWH 7. 5 X 75mm, 移動相： 0. 1M NaCl in 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 6)、検出器: RI、検出温度： 45 °C、流速： 0. 2ml/min)により、 pullulan (昭和電工製）を標準物質として平均分子 量を測定した。その結果、コーヒー由来のァラビノガラタタンは平均分子量 27000で カラマツ由来のァラビノガラタタンと同程度であった力 分子量分布はカラマツ由来の ァラビノガラタタンよりも幅広レ、ことが分かった。 （図 8参照）
実施例 5
[0043] 実施例 5は、コーヒー由来ァラビノガラタタン投与による血中総 IgE抗体産生抑制効 果を調べた結果にっレ、て示す。コーヒー由来ァラビノガラタタンとカラマツ由来ァラビ ノガラタタンを摂取させたマウスに卵白アルブミン（以下 OVA、 SIGMA)を投与し、 I gE抗体産生を誘導した時のァラビノガラタタンによる血中総 IgE抗体産生の抑制効 果を確認したものである。
具体的には、 OVAによる IgE抗体産生誘導はメスの近交系 balb/cマウスを用レ、、 以下の (A)〜（C)の試験区及び匹数 (n)で実施した。
(A)水（コントロール）； n= 6
(B)コーヒー由来ァラビノガラタタン純精製物 2. 5mgZ日； n= 5
(C)カラマツ由来ァラビノガラタタン純精製物 2. 5mg/日； n= 5
[0044] 感作は次のように実施した。初回感作としてマウス 1匹につき OVA10 μ g及びアジ ュバントとして水酸化アルミニウムゲル（SIGMA) 2mgをリン酸緩衝生理食塩水（PB S) 0. 3mlに懸濁した〇VA溶液を準備し、 6週齢のそれぞれのマウスに感作開始初 日及び 4日目に腹腔内投与した。二次感作として OVAを 25mgZmlとなるよう PBS に溶解し、この抗原溶液にマウスの鼻部を約 3秒間浸漬した。この処置を 1回につき 3 度繰り返した。二次感作の操作は初回感作開始日より 10日後から連日 10日間、 1日 朝夕 2回実施した。
ァラビノガラタタンの投与は初回感作の 1週間前より開始した。なお、それぞれのサ ンプルは水に溶解し、自由摂取させた。
[0045] 初回感作開始から 20日後に採血を行い、血清を回収して総 IgE濃度を調べた。血 中総 IgE抗体濃度はモリナガマウス IgEキット（森永生科学研究所)により測定した。 図 10に示されるように、コーヒー由来ァラビノガラタタン純精製物 2. 5mg/日試験 区でコントロール試験区及びカラマツ由来ァラビノガラタタン純精製物試験区に対し て、総 IgE量の減少傾向が確認できた。
実施例 6
[0046] (腸内細菌の増殖試験）
コーヒー由来ァラビノガラタタン (Cof_ AG)の腸内菌叢を構成する菌類に対する 資化性を、他の糖類と比較した結果を含めて以下に示す。
前段階培養には、 GAMブイヨン液体培地を用い、試験の培地には Pepton— Yea st-Fildes solution (PYF)液体培地に供試糖類を添加した後、オートクレーブ滅 菌したものを用いた。上記 PYF培地は、下表 1の組成からなるものである。また、 Fild es溶液は、下表 2のように調製されるものである。 [0047] [表 1]
Figure imgf000017_0001
[0048] [表 2]
Figure imgf000017_0002
[0049] 上記の成分を混合し、 55°C温浴槽水中で 1夜保持し、消化させた。これに 20%Na OH溶液 12mlを加えた後、 NaOHにより ρΗ7· 6になるように調整し、フィルタ一によ る滅菌を行った。
[0050] (試験法および結果の判定法） GAMブイヨンで培養した新鮮な菌を、供試糖類を添加した PYF培地に、各菌株が 各々 107〜108CFU/チューブとなるように接種し、 37°Cで 72時間嫌気培養した。 菌数の増殖は、接種後 72時間後に、また接種後 72時間後に培地の pHの低下によ る菌増殖の判定を行った。判定基準は、 （サンプノレの pH)— (糖無添加培地の pH) = [pH]とし、 [pH] < 0. 5を（―）、 0. 5≤[ρΗ] < 1. 0を（土）、 1. 0≤[pH] < 1. 5を（+ )、 1. 5≤[pH]を（++)とした。
なお、試験法および判定法に関しては、文献「Suzuki et al, Utilization by Intestin al Bacteria and Digestibility of Arabino— oligosaccharides In Vitro(J. Japan. Soc.Hort. Sci.73(6) ： 574-579,2005)」を参照レ、ただきたレ、。
炭素源に関しては、表 1に示すように、グルコース（対照）、コーヒー由来ァラビノガ ラタタン、カラマツ由来ァラビノガラタタンを用いた。また、供試菌株については、下表 3に示す。試験結果を、下表 4および表 5に示す。
[表 3]
Bfdobs ctenurn sda/escentis JC 1275
Figure imgf000019_0001
Bifidoba ct^rium br^v^ JCM1192 Bifidoba ctsriu breve JCM7016 Bsfidabs Gterium t^nu/s turn JC 1194 Bifi oba tenu'm dwiu C 1195
Bifidob3 cterium ^slli um M8224
Bifidoba ctenum infantis JCM1 22 Bifidoba Oteriufm hngum JCM1217
Bifijobs cten'um i。ngum JCM7062 Bifidobacterium hngum JCM7063 Bifidoba Gtsrium bngum JCM7054 Bifidabs cten'um iongum JCM7055 Bifidひ bsGterium ngum JCM7066 Bifidoba ts u hngum JCM11340
Bifidobs cten'um iongum JC 1 I J41
Bfidabs ctsriuni hngum JCM11343
Bifidoba Gtsriurr ps sudous t sr?uls turn JCM1200 Ent ro σσσσ^ fs ecs/is NBR。100480 Lsetobsc/j/ijs aado Mus NBRC13951
LsGtobsGi s gs- s- en JC Ml 131
arses set JCIVB130
La^tobacilius plsntarum NBRC3070
LsGtabscf'iius rhsmno- us- NB C3425 La^tabacillus ssJivsr/'us JC 1231 Ls。to。。GGus la^tis NB C100Θ33
ObstHdJum but r u NBRC3315
GbstridJu kainsntol NBRC3353 Cbstri su parBputirifiuum JCt\/l1 93
Ohstridsu rsmosu JCM1298 Gbstridu s orogvnes NBRC13950
Es(7 anc js coii NB C3301
[0052] [表 4]
Figure imgf000019_0002
[0053] [表 5] Strains gluco se Cof-AG L-AG
Clostrj' surn b utyncur N BRC3315 + 一 一
Clostridium kainantof N BRC3353 + 一 一
Clos n'd para utiri^c .1 CM 1293 + 一 一
Clostridium ra osiin JC 1298 + 一 一
Clostridium sporogenes IJ BRC13950 ++ 一 一
Escherichia coli N ERC3301 + 一 一
[0054] 上記表 4から明らかなように、コーヒー由来ァラビノガラタタンは、腸内有用細菌であ る Bifidobacterium属に良好に資ィ匕され、 Bifidobacterium longumにはカラマツ 由来ァラビノガラタタンと同程度に資化され、 Bifidobacterium pseudocatenulat umにはカラマツ由来ァラビノガラタタンよりもよく資化されたことがわかる。
また表 5の結果より、コーヒー由来ァラビノガラタタンは腸内有害菌とされている Clos tridium属ゃ Escherichia coliに対してほとんど資化されなかった。
ここで、 Bifidobacterium属はヒトにおける腸内有用細菌の代表的な菌種として知 られている。
以上のことから、コーヒー由来ァラビノガラタタンを摂取することにより腸内環境が改 善されるなどのプレバイオテイクス効果が期待できることが理解されるであろう。
産業上の利用可能性
[0055] 本発明の免疫賦活剤は、マクロファージの増殖を促進するため、細胞性免疫賦活 作用を有する。そのため、癌免疫療法や癌予防、ウィルス疾患の予防'治療薬として の利用が期待される。また、健康食品、コーヒー抽出残渣の有効利用法としても利用 可能である。
図面の簡単な説明
[0056] [図 1]マクロファージ様細胞株 RAW264を用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性を 調べた図である。
[図 2-1]マウス脾細胞を用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性 (balb/c)を調べた 図である。
[図 2-2]マウス脾細胞を用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性 (C57BL/6)を調べ た図である。 園 2-3]マウス脾細胞を用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性 (ICR)を調べた図で ある。
園 3-1]マウス腹腔マクロファージを用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性 (balb/c )を調べた図である。
[図 3-2]マウス腹腔マクロファージを用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性（C57BL /6)を調べた図である。
園 3-3]マウス腹腔マクロファージを用いたコーヒー抽出物の増殖促進活性 (ICR)を 調べた図である。
[図 4-1]近交系 balbZcマウスより単離した脾細胞にコーヒー由来のァラビノガラタタン を添加し、 IL_ 12濃度の増加を調べた図である。
園 4-2]近交系 balbZcマウスより単離した樹状細胞にコーヒー由来のァラビノガラタ タンを添加し、 IL— 12濃度の増加を調べた図である。
園 4-3]近交系 balb/cマウスより単離した樹状細胞にコーヒー由来のァラビノガラタ タンを添加し、 IFN- γ濃度の増加を調べた図である。
園 5-1]近交系 balb/cマウスに対し、コーヒー由来ァラビノガラタタン精製物を一週 間投与し、その脾細胞を用いた PMA/Ionomycinに対する増殖試験の結果を示 す図である。
園 5-2]近交系 balb/cマウスに対し、コーヒー由来ァラビノガラタタン精製物を一週 間投与し、血中のサイト力イン濃度の増加を調べた図である。
園 6]コーヒー生豆、コーヒー抽出残渣からのァラビノガラタタンの調製方法を示した 図である。
園 7]コーヒー豆由来のァラビノガラタタン (精製物）の調製方法を示した図である。 園 8]精製ァラビノガラタタンの平均分子量を示した図である。
[図 9-1]マウス脾細胞を用いた ELISA試験（IL_ 12産生）の結果を示す図である。
[図 9-2]マウス脾細胞を用いた ELISA試験（IFN_ y産生）の結果を示す図である。
[図 9-3]マウスマクロファージを用いた ELISA試験（IL_ 12産生）の結果を示す図で ある。
[図 9-4]マウスマクロファージを用いた ELISA試験（TNF—ひ産生）の結果を示す図 である。
[図 9_5]J774. 1細胞株を用いた ELISA試験 (TNF— α産生）の結果を示す図であ る。
園 10]コーヒー由来ァラビノガラタタン投与による血中総 IgE抗体産生抑制効果につ いて調べた結果を示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] コーヒー抽出物を有効成分とする、免疫賦活剤。
[2] コーヒー抽出物がァラビノガラタタン（Arabinogalactan ;AG)を含有する抽出物で ある請求項 1の免疫賦活剤。
[3] 免疫賦活活性が、マクロファージなどの免疫担当細胞の増殖促進に由来することを 特徴とする、請求項 1の免疫賦活剤。
[4] 免疫担当細胞力 マクロファージ様細胞株 RAW264、J774. 1、マウス脾細胞（Sp lenocyte) ,マウス腹腔マクロファージ（Macrophage)、マウス榭状細胞（Dendritic cell ; DC)のいずれかである、請求項 3の免疫賦活剤。
[5] 請求項 1乃至 4のいずれか 1項に記載の免疫賦活剤を含有する組成物。
[6] 前記組成物が医薬組成物である、請求項 5に記載の組成物。
[7] 前記組成物が食品組成物である、請求項 5に記載の組成物。
[8] コーヒー由来のァラビノガラタタン（Coffee AG ; Cof—AG)を有効成分とする免疫 賦活剤。
[9] コーヒー生豆、コーヒー焙煎豆、またはコーヒー抽出残渣に、
水を添加し、加熱する工程と、
加熱抽出液を回収し減圧濃縮する工程と、
減圧濃縮した液体にエタノールを加えて沈殿させる工程と、
を有することを特徴とするコーヒー抽出物の製造方法。
[10] コーヒー生豆またはコーヒー抽出残渣に、
水を添加し、加熱する工程と、
加熱抽出液を回収し、減圧濃縮する工程と、
減圧濃縮した液体にエタノールを加えて沈殿させる工程と、
沈殿を水酸化ナトリウム溶液に溶解する工程と、
室温で:!〜 48時間、ついで、 50°C〜70°Cで：!〜 48時間攪拌する工程と、 pHを 7· 0〜8· 0に調製する工程と、
タンパク分解酵素により、タンパク質を分解する工程と、
水で透析する工程と、 を有することを特徴とするコーヒー抽出物の製造方法。
[11] ァラビノガラタタンの平均分子量が 10, 000-3, 000, 000である請求項 1乃至 8 のレ、ずれか 1項に記載の免疫賦活剤。
[12] ァラビノガラタタンのァラビノース/ガラクトースの比が 0. 02〜： 1. 0である請求項 1 乃至 8のレ、ずれか 1項に記載の免疫賦活剤。
[13] 乳酸菌を配合した、請求項 5乃至 7のいずれか 1項に記載の組成物。
[14] コーヒー抽出物を添カ卩することにより、マウス脾細胞または樹状細胞のインターロイ キン— 12産生量を無添加の場合に比べ増加させる方法。
[15] コーヒー抽出物を投与することにより、マウス血中インターロイキン一 12量を非投与 マウスに比べ増加させる方法。
[16] コーヒー抽出物を摂取させることによりマウス脾細胞のマイトジヱン PMA/Ionomy cinによる増殖促進活性を非摂取の場合に比べ高める方法。
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