WO2007097443A1 - Ｄｎａ塩基配列を決定する方法 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列を決定する方法 Download PDF

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WO2007097443A1
WO2007097443A1 PCT/JP2007/053461 JP2007053461W WO2007097443A1 WO 2007097443 A1 WO2007097443 A1 WO 2007097443A1 JP 2007053461 W JP2007053461 W JP 2007053461W WO 2007097443 A1 WO2007097443 A1 WO 2007097443A1
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WO
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dna
base
probe
protruding end
analyzed
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/053461
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeharu Nagai
Tomomi Tani
Ippei Kotera
Ekkei Yoneda
Original Assignee
National University Corporation Hokkaido University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the base sequence of DNA. More specifically, the present invention relates to a method for determining the base sequence of DNA by detecting a DNA base deletion chain reaction by a restriction enzyme and a DNA ligating enzyme at a single molecule level.
  • the Maxam-Gilbert method and the Sanger method are known as methods for determining the base sequence of DNA.
  • the following steps are required to determine the DNA base sequence, for example.
  • the length of a DNA fragment that can be cloned at one time is several thousand to several tens of thousands of base pairs. Therefore, for example, in order to determine the base sequence of the whole genome of about 3 billion base pairs of humans, at least 10 million times of cloning are required.
  • the conventional DNA base sequence determination methods require a great amount of labor and time and enormous costs to determine the DNA base sequence.
  • the genome information of higher organisms is in the billions of base pairs, so for example, a national project is required to determine the base sequence of the total genomic DNA for one human. Hot. Disclosure of the invention
  • the present inventors have obtained a recognition sequence comprising a probe having a single base overhang end and an identification label according to the type of base at the overhang end.
  • a probe containing a restriction enzyme recognition sequence that is separated from the cleavage site, the DNA base sequence extracted from the cell can be determined without cloning, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following DNA base sequence determination method, probe, DNA base sequence determination kit, and the like.
  • the probe includes four probes having one or two base protruding ends complementary to A (adenine), T (thymine), C (cytosine ⁇ , or G (guanine), respectively.
  • A adenine
  • T thymine
  • C cytosine ⁇
  • G guanine
  • the distance between the restriction enzyme recognition sequence of the probe and the protruding end is the restriction enzyme.
  • identification label is a fluorescent label, a quantum dot, or a metal colloid.
  • the identification type is identified by single molecule observation.
  • restriction enzyme is an enzyme that produces a 1-base or 2-base protruding end at the 3 ′ end.
  • the enzyme is Bmrl, Bmul, B fi I, AsuHP I, Hph I, B ci VI, B ful, Hpy AV, M bo II, N cu I, M n 1 I, A sp 26H I, A sp 27H I, A sp 35H I, A sp 36 HI, A sp 40 HI, As p 50H I, B ce 83 I, B cgl, BmaH I, B pm l, B puE I, B s aMI, B sc CI, B sell, B se 3D I, B se GI, B se eMI, B se NI, B sgl, B sm l, B s pKT5 I, B srl, B sr DI, B sr SI , B stlll, B st F 5 I, B tsl, B ts CI, C sp CI, C s tMI, E
  • the enzyme is Ac lWI, A lwl, B inl, B sp PI, B st H9 I, B st 31 TI, E acl, B cc I, H pyC l I, B eef I, P lel, P psl, Ac il, B c eA I, Bme 585 I, B s cA I, B stl 9 I, B st FZ438 I, Faul, Smu I and S si I, described in (17) above Method.
  • a probe that has a protruding end and is identified and labeled according to the type of base at the protruding end, and contains a recognition sequence for a restriction enzyme in which the recognition sequence is separated from the cleavage site.
  • the probe comprises at least 4 types of probes each having a 1-base or 2-base protruding end complementary to A, T, C or G.
  • the measuring cell comprises: (a) a DNA to be analyzed having a protruding end, immobilized on a base material, and having a protruding end, and is identified according to the type of base at the protruding end A labeled probe comprising a restriction enzyme recognition sequence having a recognition sequence and a cleavage site separated from each other by a DNA ligase; and (c) the DNA to be analyzed and the probe An apparatus comprising means for cleaving a linked body with a probe with a restriction enzyme in which the recognition sequence is separated from the cleavage site.
  • the present invention has the following effects.
  • the base sequence of DNA can be determined very quickly.
  • the characteristics of (1) and (2) greatly reduce the time required to determine the entire genome sequence, and bring about revolutionary changes in various fields such as genomic biology, genetics, medicine, and pharmacology. be able to.
  • a wide range of applications in the clinical field can be considered. For example, diseases involving genes (eg, gene mutations, polymorphisms)
  • FIG. 1 is a schematic view for explaining one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining a fluorescent label identification method and the like.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of the piotinylated DNA used in Example 1, in which piotin is bound to the DNA to be analyzed.
  • FIG. 4 is a diagram showing the observation results of beads to which the analysis target DNA in Example 1 was bound.
  • FIG. 5 is a diagram showing the structure of a quantum dot DNA probe used in Example 2 and biotinylated DNA in which biotin is bound to DNA to be analyzed.
  • FIG. 6 is a diagram showing an observation apparatus and observation results of the quantum dot / DNA probe in Example 2.
  • FIG. 7 is a diagram showing the observation results of the quantum dot probe linked to the DNA to be analyzed in Example 3.
  • (2) shows an enlarged image of part of (1).
  • (3) is a diagram showing an image in which a continuous sequence of the same part of (2) is arranged.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention is a probe having a single base protruding end and discriminating and labeling according to the type of base at the protruding end, wherein the recognition sequence and the cleavage site are separated from each other.
  • the present invention relates to a probe containing a recognition sequence of a restriction enzyme, a method for determining a DNA base sequence using the probe, a kit for determining a DNA base sequence containing the probe, and the like.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for determining a DNA base sequence, comprising the following steps (a) to (c).
  • Step (a) is a step of linking the DNA to be analyzed and the probe with a DNA ligating enzyme.
  • the DNA to be analyzed is not particularly limited, and may be derived from genomic DNA or cDNA.
  • the DNA base sequence determination method of the present invention is particularly preferably used for determining the base sequence of genomic DNA extracted from cells because the base sequence of one molecule of DNA can be determined without cloning. be able to.
  • genomic DNA-derived DNA can be preferably used as the DNA to be analyzed.
  • the length of the DNA to be analyzed is not particularly limited, but is usually 1 to 5000 bases, preferably 2 to 1000 bases, more preferably 5 to 500 bases, and particularly preferably 10 to 100 bases.
  • the DNA to be analyzed of the present invention is prepared by Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 3rd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 to 38, John Wiley and Sons (1987-1997), DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) and the like.
  • genomic DNA is prepared by extracting and purifying DNA from the tissues and cells of the organism to be analyzed.
  • the genomic DNA is cleaved with a restriction enzyme to prepare a DNA fragment.
  • the thus obtained DNA fragment can be used as the DNA to be analyzed of the present invention without cloning.
  • the DNA to be analyzed is immobilized on the substrate.
  • the substrate is not particularly limited as long as it does not inhibit the sequencing.
  • a material that fixes a biomolecule can be used.
  • Substrates Glass containers, quartz glass containers, plastic containers, etc .; membranes made of materials such as cellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF), and the like.
  • the substrate is preferably plate-shaped, for example, glass substrate, quartz glass substrate, silicon substrate, aluminum substrate, light-transmitting single crystal substrate (for example, A 1 2 0 3 , S i ⁇ 2 ).
  • the base material is preferably light-transmitting, and more preferably a light-transmitting plate-like material, particularly a glass substrate, a quartz glass substrate.
  • silicon substrate, a light-transmitting single crystal substrate e.g., A 1 2 0 3, S i O
  • the glass substrate even in the name or preferred.
  • the means for immobilizing the analysis target DNA on the substrate may be any means that does not hinder the determination of the base sequence of the analysis target DN A, and means for immobilizing directly or indirectly may be used.
  • immobilization can be performed indirectly by using the analysis target DNA and the binding portion provided on the substrate.
  • a binding moiety a combination of substances forming an affinity bond, or a chemical bond using a crosslinking agent can be used. Examples of combinations of substances that form an affinity bond include avidin or streptavidin, "Piotin, antibody or antibody fragment / antigen molecule (epitorp)", etc., and avidin or streptavidin.
  • one substance of the combination is bound to (or is inherently part of) the substrate and the other substance is analyzed.
  • avidin or streptavidin is bound to (or is inherently part of) the substrate, and vivid tin is bound to the analyte DNA.
  • avidin or streptavidin and biotin form an affinity bond, and the DNA to be analyzed is immobilized on the substrate. .
  • the site for immobilizing the DNA to be analyzed on the substrate is not particularly limited as long as it does not inhibit the base sequence determination of the DNA to be analyzed, but it is opposite to the protruding end (that is, the end to which the probe is linked).
  • the terminal is preferred.
  • the number of analysis target DNAs immobilized on the substrate is not particularly limited. In the present invention, for example, 1 to about 100, about 100 to about 1 000, about 1 000 to about 10 000, about 10 000 to about 50, 000, about 50 000 to about
  • the analysis target DNA of 100,000, about 100,000 to about 500,000 can be fixed to the substrate and processed. From the viewpoint of determining the base sequence quickly, the solution to be immobilized on the substrate
  • the number of DNA to be analyzed is preferably 100 or more.
  • a protruding end is formed at the non-immobilized end of the DNA to be analyzed.
  • the protruding end is formed so that the probe used can be linked. Specifically, when a probe having a 3 ′ protruding end is used, the protruding end of the DNA to be analyzed is also a 3 ′ protruding end. When using a probe with a 5 'protruding end, the protruding end of the DNA to be analyzed is also a 5' protruding end. When using a probe with a single base overhang, the overhang of the DNA to be analyzed is also a single base overhang. If the probe has 2 base overhangs or more, the DNA to be analyzed is correspondingly 2 base overhangs or longer.
  • the protruding end of the analysis target DNA is also a 3 ′ protruding end with a single base.
  • the protruding end of the DNA to be analyzed is also a 5' overhang with a single base overhang.
  • overhangs can be formed using appropriate restriction enzymes.
  • the analysis target DNA contains the recognition sequence for the restriction enzyme used in step (c), which will be described in detail later, it will be the same as the restriction enzyme recognition sequence used in step (c).
  • the protruding end can be formed by using a restriction enzyme that recognizes the same sequence, and the protruding end may be formed by the restriction enzyme used in step (c). Formation of the protruding end of the analysis target DNA is preferably performed after immobilizing the analysis target DNA on the substrate. If the analysis target DNA contains the recognition sequence for the restriction enzyme used in step (c), the restriction enzyme recognizes the recognition sequence and cleaves the DNA to be analyzed in step (c). Therefore, it becomes an obstacle to base sequence determination. Therefore, before the step (a) is performed, it is preferable to perform the treatment for avoiding the above-described cleavage of the DNA to be analyzed, such as treatment with the restriction enzyme used in the step (c) in advance. (Probe)
  • the probe of the present invention contains a protruding end, an identification label corresponding to the type of base at the protruding end, and a restriction enzyme recognition sequence.
  • the probe of the present invention may be a probe in which two single-stranded DNAs are annealed (sometimes referred to as “bimolecular probe” in this specification), or one single-stranded DNA.
  • a probe having a hairpin structure in which DNA is annealed in the molecule in this specification, “monomolecular Sometimes referred to as “probe”. It may be.
  • the bimolecular probe one having a protruding end or an end opposite to the end of the restriction enzyme cleavage site is preferably labeled. If the end of the probe is labeled, the labeled end can be either the 5 'end or the 3, end.
  • As the monomolecular probe one having a hairpin structure labeled is preferable.
  • the protruding end of the probe used is the same as the protruding end of the DNA to be analyzed, the strand of the protruding end (5 'or 3') and the number of bases of the protruding end.
  • a probe having a 3 ′′ protruding end with a single base is used.
  • the overhanging end of the DNA to be analyzed is a 5 ′ overhang with a single base overhang
  • a probe having a 5 ′ overhang with a single base overhang is used.
  • the base of the protruding end of the probe used is a base complementary to the base that can form the protruding end of the DNA to be analyzed.
  • the overhanging end is a single base overhanging end, for example, the base of the overhanging end is adenine (A), thymine (T), cytosine (C) or guanine (G).
  • the protruding end is a two-base protruding end, for example, the protruding end base is AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC Or 16 probes, GG, are used.
  • the protruding ends are 1 or 2 base protruding ends, especially A single base overhang is preferred.
  • probes whose end is N ie, NA, NT, NG, NC with the left end
  • probes with A, T, G, or C on the left end ie, with the left end, AN, AT, AG, and AC).
  • N is preferred on the terminal side because the base sequence of the DNA to be analyzed can be determined from the terminal.
  • N is a base site into which a mixture of adenine (A), thymine (T), cytosine (C) or guanine (G) was incorporated during the synthesis of oligo DNA forming the probe.
  • a mixture of adenine (A), thymine (T), cytosine (C) and guanine (G) mixed at the same ratio is preferable.
  • N It is preferable that any base of nin (A), thymine (T), cytosine (C) or guanine (G) is present with the same probability.
  • 3 or more bases such as probes with 3 base overhangs such as NNA, NNT, NNG, NNC, probes with 4 base overhangs such as NNNA, NNNT, NNNG, NNNC, etc. instead of NA, NT, NG, NC
  • a probe having a protruding end of can also be preferably used.
  • Such a probe having a protruding end of 3 bases or more is preferable in terms of efficiency of annealing.
  • a probe having a 3-5 base protruding end is preferable, and a probe having a 4 base protruding end is particularly preferable.
  • the labeling substance used for the identification label may be any labeling substance that can identify the protruding terminal base.
  • the labeling substance for example, various labeling substances such as a fluorescent substance, a chemical light emitting substance, and a labeling substance capable of measuring a change in polarization can be used, and among these, a fluorescent substance is preferably used.
  • the fluorescent substance used in the present invention is not particularly limited as long as it can be detected that the fluorescent substance is labeled with the fluorescent substance.
  • fluorescent substances used for labeling nucleic acids can be used as the fluorescent substance.
  • quantum dots examples include Qdot (registered trademark) 525 ITK TM Car boxy 1 Quantum Dots, Qdot (registered trademark) 545 ITK TM Carboxyl Quantum Dots (Qdot (registered trademark) 565 ITK TM Carboxyl Quantum Dots, Qdot (registered trademark) 585 ITK TM Carboxyl Quantum Dots, Qdot (registered trademark) 605 ITK TM Carboxyl Quantum Dots ⁇ Qdot (registered trademark) 655 ITK TM Carboxyl Quantum Dots, Qdot (registered trademark) 705 ITK TM Carboxyl Quantum Dots, Qdot (registered trademark) 800 ITK TM Carboxyl Quantum Dots ⁇ Qdot (registered trademark) 525 ITK TM Amino (PEG) Quantum Dots, Qdot (registered trademark) 545
  • the probe is labeled with a labeling substance that can be distinguished from each other for each type of base at the protruding end so that the type of base at the protruding end can be identified.
  • a labeling substance that can be distinguished from each other for each type of base at the protruding end so that the type of base at the protruding end can be identified.
  • the protruding end is a one-base protruding end, for example, four types each having a one-base protruding end complementary to four types of DNA bases (A, T, C, G).
  • the overhanging end is a two-base overhanging end
  • each of the six probes with two base overhanging ends complementary to the type of base at the two-base overhanging end of the DNA can be distinguished from each other. Just label it with an identification substance!
  • the protruding end of the probe protrudes more than 3 bases, labeling with a labeling substance that can be distinguished from each other for each type of base at the protruding end Good.
  • the labeling of the probe can be performed directly or indirectly by a known method such as chemical modification.
  • the restriction enzyme recognition sequence contained in the probe has a base sequence corresponding to the type of restriction enzyme (restriction enzyme in which the recognition sequence and the cleavage site are separated) used in step (C), which will be described in detail later. is doing.
  • the restriction enzyme used in step (c) is the cleavage site that forms the protruding end of the probe used, the protruding end strand (5 'or 3') and the protruding end with the same number of bases. It is a restriction enzyme having Specifically, for example, when the protruding end of the probe is 3 with a 1 base overhang, a restriction enzyme having a cleavage site that generates a 1 base overhang at the 3 ′ end is used. When the protruding end of the probe is a 5 ′ protruding end with a single base overhang, a restriction enzyme having a cleavage site that generates a 1 base overhang at the 5 ′ end is used.
  • the distance between the recognition sequence and the protruding end is shorter than the distance between the restriction enzyme recognition sequence used in step (c) and the cleavage site by the number of bases determined at one time in step (b). Therefore, if the number of DNA bases protruding at the protruding end is equal to the number of bases determined at the same time in step (b), the distance between the recognition sequence and the protruding end is used in step (c). The distance between the restriction enzyme recognition sequence and the cleavage site is shorter by the number of DNA bases protruding from the protruding end.
  • the protruding end is a one base protruding end
  • the number of bases determined at a time in step (b) is also one base, so the distance between the recognition sequence and the protruding end is One base shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site.
  • the protruding end is a 2 base protruding end and the sequence is determined by 2 bases
  • the distance between the recognition sequence and the protruding end is 2 bases shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site.
  • the protruding end is a two-base protruding end, for example, when a sequence is determined one by one using a probe having two-base protruding ends of NA, NT, NG, and NC, the recognition sequence and The distance between the protruding ends is one base shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site.
  • the base in the DNA to be analyzed is separated every 2 bases (by 1 base). ) Can also be analyzed.
  • the distance between the recognition sequence and the protruding end is two bases shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site (ie, the protrusion).
  • the number of bases is the same as the number of bases at the end
  • NNNA, NNNT S NNNG, and NNNC have 4 base protruding ends, and the distance between the recognition sequence and the protruding end is 4 bases shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site (that is, the number of bases at the protruding end)
  • the bases in the DNA to be analyzed can be analyzed every 4 bases (by 3 bases).
  • the base in the DNA to be analyzed can be analyzed every 3 or 2 bases.
  • the base in the DNA to be analyzed can be analyzed every 5 or 6 bases.
  • n represents an integer of 1 or more
  • m represents an integer of 2 or more
  • the bases in the DNA to be analyzed can be analyzed every m bases (m-1 bases skipped).
  • the analysis target DN A is identified by referring to the base sequence database (ie, analysis). To determine what kind of gene the target DNA is).
  • the length of the probe is preferably 300 bases or less.
  • the length of the probe is preferably 100 base pairs or less, 80 base pairs or less, 60 base pairs or less, 50 base pairs or less, 40 base pairs or less, 35 base pairs or less, 30 base pairs or less, 25 bases 24 base pairs or less, 23 base pairs or less, 22 base pairs or less, 21 base pairs or less, 20 base pairs or less, 19 base pairs or less, 18 base pairs or less, 17 base pairs or less, 16 base pairs Below, 15 base pairs or less, 14 base pairs or less, 13 base pairs or less, 1 2 base pairs or less, 1 1 base pairs or less, or 10 base pairs or less.
  • the probe of the present invention can be synthesized according to a known method such as a chemical synthesis method.
  • step (a) the DNA to be analyzed and the probe are linked by a DNA ligating enzyme.
  • the DNA to be analyzed, the probe, and the DNA ligating enzyme are reacted, the DNA to be analyzed and the base of the protruding end are complementary to the base of the protruding end of the DNA to be analyzed (complementary May be referred to as probes).
  • the DNA ligation enzyme used is not particularly limited as long as it can link DNA fragments having protruding ends. Examples of the DNA ligating enzyme include T4 DNA ligase, Piu DNA ligase, Taq DNA ligase, TTH DNA ligase and the like.
  • Step (b) is a step of identifying the type of identification label of the probe linked to the DNA to be analyzed in step (a).
  • the probe is labeled (discriminating label) with a labeling substance that can be distinguished from each other for each type of base at the protruding end, by identifying the type of the identifying label, The type of base at the protruding end can be identified. Furthermore, since the base at the protruding end of the probe is complementary to the base at the protruding end of the DNA to be analyzed linked to the probe, it is linked to the probe by identifying the base at the protruding end of the probe. It is possible to identify the type of base at the protruding end of the DNA to be analyzed.
  • the base of the 3' terminal of the DNA to be analyzed is identified, and the protruding ends of the DNA to be analyzed and the probe are 5 'protruding ends.
  • the base at the 5 'end of the DNA to be analyzed is identified.
  • a method that can detect the signal obtained according to the labeling substance used and identify the type of labeling substance.
  • a method for identifying the type of such identification label a method capable of distinguishing a probe linked to the DNA to be analyzed and a (free) probe not linked to the DNA to be analyzed is preferable.
  • the probe connected to the analysis target DN A can be distinguished from the free probe.
  • Examples of the method include a method based on single molecule observation. According to single-molecule observation, only probes fixed on the glass surface are detected as bright spots, and free probes are detected as weak uniform background noise. I can do it.
  • the type of fluorescent label can be identified by detecting the fluorescence wavelength of the fluorescent label and identifying the type of fluorescent label, such as fluorescence spectroscopy. Analytical methods are used. Furthermore, as a method for distinguishing the probe linked to the analysis target DNA from the free probe, for example, single molecule fluorescence spectroscopy is used.
  • Single-molecule fluorescence spectroscopy includes, for example, a single-molecule fluorescence spectroscopy microscope, a commercially available single-molecule fluorescence analysis system (for example, MS 20 (manufactured by Olympus Pass)), a spectroscopic optical system using a prism or a diffraction grating, System combining multiple CCD cameras and filters, high-speed filter switching device, 3 CCD cameras, single-plate color CCD camera, digital CCD camera (eg EM—CCD camera), Quad-View TM (Roper Bioscience), Dual -View TM (Roper Bioscience), Dual-Cam TM (Roper Bioscience) and Double-View can be used.
  • a single-molecule fluorescence spectroscopy microscope for example, MS 20 (manufactured by Olympus Pass)
  • a spectroscopic optical system using a prism or a diffraction grating for example, MS 20 (manufactured by Olympus Pass)
  • single-molecule fluorescence spectroscopy used in the present invention include fluorescence correlation spectroscopy (see, for example, Biopolymers, 13, 29-61 (1974)), fluorescence intensity multi-distribution analysis ( Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis) (for example, Biophysical Journal, 79, 2858-2866 (2000), Special Table 2 0 1-50 20 6 2 Publication, Special Table 200 1— 5 1 8 3 0 7 Publication, Special Publication Table 2 00 2-50 5 74 2).
  • fluorescence correlation spectroscopy see, for example, Biopolymers, 13, 29-61 (1974)
  • fluorescence intensity multi-distribution analysis Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis
  • Light sources used to excite fluorescent labels include arc lamps such as mercury lamps and xenon lamps, LEDs, Ar lasers, He Ne lasers, LD lasers, He C d lasers, N d Y AG lasers
  • a known light source such as a laser light source such as a K r A r laser can be used.
  • the wavelength of the light source is selected according to the excitation wavelength of the fluorescent label used.
  • a band-pass filter include a dielectric bandpass filter and a metal bandpass filter.
  • fluorescence and light other than fluorescence such as excitation light and scattered light.
  • separation of fluorescence and other light can be performed using a dichroic mirror, an absorption filter, or the like.
  • a dichroic mirror having a wavelength characteristic that reflects excitation light and transmits fluorescence according to the excitation wavelength and fluorescence wavelength of the fluorescent label may be selected.
  • an absorption filter a filter that transmits fluorescence and absorbs scattered light may be selected.
  • An example of a detector for detecting the fluorescence of the fluorescent label is a CCD camera. From the viewpoint of noise reduction, a cooled C C D D camera is preferably used. When detecting fluorescence using a CCD camera, it is preferable to obtain a fluorescence spectrum using a spectroscopic element such as a prism in order to identify the fluorescent label.
  • the image obtained as described above may be angulated using commercially available image analysis software such as MetaMorph (Universal Imaging Corporation).
  • the conjugate of the DNA to be analyzed and the probe ligated in step (a) is treated with a restriction enzyme. It is a process of cutting. As described above, since the distance between the recognition sequence of the probe and the protruding end is shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site, the cleavage site appears on the DNA to be analyzed when the DNA to be analyzed and the probe are linked. Will do.
  • the distance between the probe recognition sequence and the protruding end is one base shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site. Therefore, when the DNA to be analyzed and the probe are connected, a cleavage site appears between the first and second bases from the end of the DNA to be analyzed. By cleaving this DNA-probe conjugate with the analysis target with a restriction enzyme, one base at the end of the analysis DNA is deleted, and a new one-base protruding end is generated.
  • the restriction enzyme used in the present invention is a restriction enzyme in which the recognition sequence and the cleavage site are separated from each other, and generates a protruding end.
  • the overhang generated is 3 'overhang It may be at the end or 5 ′ protruding end.
  • the number of protruding bases is not particularly limited, but the protruding ends to be generated are preferably 1 or 2 base protruding ends, particularly preferably 1 base protruding ends.
  • Such restriction enzymes are selected from, for example, class IIS restriction enzymes.
  • Bmr I and its isoschizomers for example, B fi I, Bmul, etc.
  • Asu HPI and its isosizomers 1 for example, H ph I), B ci VI and its isoschizomer (eg, B fu I), HpyAV and its isoschizomer, Mbo II and its isoschizomer (eg, 'N cu I), Mn 1 I and its
  • BmrI, BciVI, MboII and HphI are preferable, and BmrI is particularly preferable.
  • Restriction enzymes that generate a 1 base overhanging 5 'overhang include A c 1 WI and its isoschizomers (eg A 1 w I, B in I, B sp PI, B st H9 I, B st 3 1 TI , E acl, etc.), B cc I and its isoschizomers (eg Hp y C 1 I), B cef I and its isosizomers, P 1 e I and its isosizomers (eg P ps I etc.), etc.
  • Alwl, Plel, Bcefl, and HpyC1I are preferable, and A1wI and P1eI are particularly preferable.
  • Ac i I and its isoschizomer eg, S si I
  • B ce AI and its isosizomer Bme 585 I and its isoschizomer (for example)
  • B st FZ 4 38 1, F au I, S mu I etc. B sc AI and its isoschizomer (eg B st 19 I etc.) etc. are mentioned.
  • a sp 26 HI and its isoschizomers eg, A sp 27H I, A sp 35H I, A sp 36H I, A sp 40H I, A sp 50H I, Bma HI N B s aMI, B sc CI, B sml, M va 1 26 91, Pct I, etc., B ce 83 I and its isoschizomers (eg B puE I, etc.), B cg I and its isoschizomers, Bpm l and its isoschizomers (eg G su I), B se 1 I and its isosizomers (eg B seN I, B srl, B sr SI, B stlll, T spll, etc.
  • B se 1 I and its isosizomers eg B seN I, B srl, B sr SI, B stlll, T spll, etc.
  • B se 3 DI and its isoschizomers eg B seM I, B sr DI B se GI and its isoschizomers (eg B st F 5 I, B ts CI, etc.), B sg I and its isoschizomers, B sp KT 5 I and its isoschizomers, B ts I and its isoschizomers, C sp CI and its isoschizomer, C s tM I and its isoschizomer, E ci I and its isoschizomer, Eco 57M I and its isoschizomer, T s pDT I and its isoschizomer, T sp GW I 'and its isoschizomer Et al.
  • the restriction enzyme used in the present invention is selected according to the probe used in step (a). Specifically, it has a protruding end of the probe used in step (a), a protruding end strand (5 ′ or 3 ′ ′), and a cleavage site that forms the protruding end with the same number of bases at the protruding end. Restriction enzymes are used. Specifically, for example, when the protruding end of the probe is a 3 ′′ protruding end with a single base, a restriction enzyme having a cleavage site that generates a single base protruding at the 3 ′ end is used.
  • the protruding end of the probe is a 5 ′ protruding end with a single base overhang
  • a restriction enzyme having a cleavage site that generates a one base overhang at the 5 ′ end is used.
  • the restriction enzyme used is such that the distance between the recognition sequence and the cleavage site is longer than the distance between the recognition sequence of the probe used and the protruding end by the number of bases determined at a time in step (b). Therefore, when the number of bases determined at a time in step (b) is equal to the number of DNA bases protruding at the protruding end, the distance between the recognition sequence and the cleavage site is the recognition sequence of the probe used.
  • the protruding end of the probe used is a single base protruding end
  • the number of bases determined at a time in step (b) is also one base, so the distance between the recognition sequence and the cleavage site.
  • a restriction enzyme that is one base longer than the distance between the recognition sequence and the protruding end is used. For example, if the protruding end is a two-base protruding end and the number of bases determined at one time is two, the distance between the recognition sequence and the cleavage site is two bases longer than the distance between the recognition sequence and the protruding end.
  • Restriction enzymes are used.
  • the protruding end is a two-base protruding end, for example, when the sequence is determined one base at a time using a probe having a two-base protruding end of NA, NT, NG, or NC, A restriction enzyme in which the recognition sequence and the cleavage site are one base longer than the distance between the recognition sequence and the protruding end is used.
  • the base in the DNA to be analyzed is analyzed every 2 bases.
  • step (a) the DNA to be analyzed is linked to the probe, and in step (b), the base at the protruding end of the DNA to be analyzed is identified.
  • step (c) a new protruding end is generated in the DNA to be analyzed.
  • the DNA to be analyzed in which a new overhanging end is generated can be further used in steps (a) to (c), and steps (a) to (c) can be repeated in the same manner. .
  • steps (a) to (c) can be repeated as long as they can be cleaved by the restriction enzyme in step (c).
  • the base sequence of the DNA to be analyzed can be determined (or analyzed) by sequentially identifying the bases at the protruding ends of the DNA to be analyzed. Specifically, when the protruding end of the DNA to be analyzed is a 3 ′ protruding end, the base sequence of the DNA to be analyzed can be sequentially determined (or analyzed) from the 3 ′ side. If the overhanging end of the DNA to be analyzed is a 5 'overhang, the nucleotide sequence of the DNA to be analyzed can be determined sequentially from the 5' side. If the overhanging end of the DNA to be analyzed is a single base overhanging end, it can be determined one base at a time.
  • steps (a) to (c) are repeated by performing the reaction (1) in step (a), step (b) and step (c) after exchanging the reaction solution.
  • steps (a) to (c) can also be performed by a chain reaction in the presence of the analysis target DNA, probe, DNA-linked enzyme, and restriction enzyme.
  • the repetition of steps (a) to (c) is preferably a chain reaction from the viewpoint of analysis speed.
  • step (b) and step (c) as in the above (1), for example, the micro flow path and temperature control
  • the reaction solution is exchanged after performing the reaction 1 or 2 of step (a), step (b) and step (c) as in the above (1), for example, the micro flow path and temperature control
  • the reaction solution is exchanged with a pump or the like in a system that combines devices. Since the optimal reaction conditions differ between the DNA ligation reaction and the DNA cleavage reaction, each reaction can be performed by alternately changing the reaction conditions so that the optimal conditions for each reaction are obtained.
  • the DNA to be analyzed has its end opposite to the protruding end immobilized indirectly on the substrate via an avidin-nobiotin bond.
  • the upper strand of the DNA to be analyzed is the 5 'end on the left and the 3' end on the right. Therefore, the overhanging end of the DNA to be analyzed is the 3 'end of the 1 base overhang.
  • the bases of the DNA to be analyzed are represented as the first base, the second base, and the third base in order from the base at the 3 ′ protruding end.
  • the end of the probe opposite to the protruding end is labeled with a fluorescent substance that can be distinguished from each other for each type of base at the protruding end.
  • probe 1 whose protruding terminal base is T is labeled with fluorescent substance 1.
  • probes 2, 3, and 4 whose bases at the protruding ends are A, C, and G, respectively, are labeled with fluorescent substances 2, 3, and 4, respectively.
  • the lower strands of probes 1 to 4 are the 3 'end on the left and the 5' end on the right. Therefore, the overhanging end of the probe is the 3 'end with a one base overhang, similar to the DNA to be analyzed.
  • the probe contains a recognition sequence for Bmr I restriction enzyme. The distance between the recognition sequence and the protruding end is one base shorter than the distance between the recognition sequence of the Bmr I restriction enzyme and the cleavage site.
  • probe 1 having a complementary T at the protruding end is ligated by DN.A ligation enzyme, as shown in Fig. 1 (2). A conjugate as shown is generated.
  • the fluorescent label (Fluorescent substance 1) is identified.
  • a fluorescence spectroscopic analyzer as shown in FIG. 2 (1) is used.
  • light of a wavelength necessary for excitation of the fluorescent substance is extracted from the light emitted from the light source by a bandpass filter.
  • the excitation light extracted in this way is reflected by the dichroic mirror and applied to the sample.
  • the fluorescent label of the probe is excited by the irradiated excitation light and emits fluorescence. firefly
  • the fluorescence emitted from the light label is transmitted through a dichroic mirror, dispersed by a prism, and then observed by a cooled CCD.
  • a single-molecule fluorescence spectroscopic analysis is performed using a magnifying optical system such as a fluorescence microscope.
  • the probe linked to the DNA to be analyzed and the free probe can be distinguished from each other based on the magnitude of fluctuations. Therefore, single-molecule fluorescence spectroscopy is used. I like it. In this way, for example, it is identified that the probe linked to the analysis target DNA A shown in FIG.
  • the base at the protruding end of the analysis target DNA is identified as the base (A) complementary to the base (T) at the protruding end of probe 1.
  • a sample in which a plurality of analysis target DNAs are immobilized on a base material can be used.
  • single-molecule fluorescence spectroscopy a large number (eg, several hundred to several thousand) of fluorescence can be observed at the same time.
  • multiple (for example, several hundred to several thousand) base sequences of DNAs to be analyzed can be determined.
  • the distance between the recognition sequence of the probe and the protruding end is one base shorter than the distance between the recognition sequence and the cleavage site, so that the first DNA of the target DNA is analyzed by connecting the target DNA and the probe.
  • a cleavage site appears between the base and the second base (Fig. 1 (2)). Therefore, when this ligated DNA / probe 1 is cleaved with the Brm I restriction enzyme, the first base of the DNA to be analyzed is cleaved with the probe 1 and the DNA to be analyzed is One base is cut short. As a result, a new one-base protruding end with a protruding second base is generated in the analysis target DNA (Fig. 1 (3)).
  • the analysis target DNA having a new one-base protruding end (second base (C)) thus generated can be further subjected to steps (a) to (c). That is, probe 4 having a complementary G at the protruding end is linked to the DNA to be analyzed in which the second base (C) protrudes by a DNA ligating enzyme (step (a)).
  • step (a) DNA ligating enzyme
  • steps (b) and (c) can be performed, and the steps (a) to (c) can be repeated in the same manner.
  • steps (a) to (c) should be repeated as long as cleavage by the restriction enzyme in step (c) is possible. Can do.
  • the base sequence of the DNA to be analyzed is sequentially determined one by one from the 3 ′ side.
  • a probe having a protruding end, which is discriminated and labeled according to the type of base at the protruding end, wherein the recognition sequence of the restriction enzyme is separated from the recognition site.
  • a kit for determining the base sequence of DNA containing the probe is provided.
  • the probe of the present invention examples include the same probes as described above, and the same probes as described above are preferable.
  • the protruding end is a 3 ′ protruding end and the 5 ′ protruding end is mentioned.
  • the protruding end is a single-base protruding end.
  • the distance between the recognition sequence and the single nucleotide protruding end is one base shorter than the distance between the recognition sequence and the base cleavage site.
  • the recognition sequence is preferably a recognition sequence for a class I I S restriction enzyme.
  • the DNA sequence determination kit of the present invention is used for determining the DNA sequence by the method comprising the steps (a) to (c) described above.
  • Examples of the probe contained in the kit of the present invention include the probe of the present invention described above, and the same probes as described above are preferable.
  • a kit containing at least four types of probes each having a one-base protruding end complementary to A, T, C, or G is preferable.
  • the kit of the present invention may further contain a restriction enzyme.
  • the restriction enzyme contained in the kit of the present invention include the restriction enzyme used in the above step (c) and the restriction enzyme for forming a protruding end in the analysis target DNA.
  • examples of such a restriction enzyme include those described above, and those similar to the above are preferable.
  • the kit of the present invention may further contain a DNA ligating enzyme.
  • a DNA ligating enzyme examples include those described above, and those similar to the above are preferable.
  • a measurement cell (i) optical means, (iii) means for converting optical information into an identification signal, and (iv) converting the identification signal into base sequence information Means for determining the base sequence of DNA
  • the measurement cell has (a) a DNA to be analyzed having a protruding end, immobilized on a substrate, a protruding end, and the protruding end (C) means for ligating a probe discriminatingly labeled according to the type of base with a DNA-ligating enzyme, which comprises a restriction enzyme recognition sequence in which the recognition sequence is separated from the cleavage site; and
  • the present invention relates to a device comprising means for cleaving the ligated body of the DNA to be analyzed and the probe with a restriction enzyme that separates the recognition sequence from the cleavage site.
  • the DNA base sequence determination apparatus of the present invention first, (i) in a measurement cell, (a) a DNA to be analyzed having a protruding end and immobilized on a substrate, and a protruding end And a probe that is labeled according to the type of base at the protruding end, and that contains a recognition sequence of a restriction enzyme that is separated from the recognition sequence by a DNA ligation enzyme. Is done. Next, (i i) Optical information (for example, color information) is obtained from the identification label of the probe linked to the analysis target DNA by the optical means.
  • Optical information for example, color information
  • the obtained optical information is converted into an identification signal (for example, an electrical signal) that can identify the identification mark of the probe by means of (ii i) a means for converting the optical information into an identification signal.
  • This identification signal is converted into (iv) a base sequence by means for converting the identification signal into base sequence information.
  • a reaction of cleaving the ligated body of the analysis target DNA and the probe with a restriction enzyme in which the recognition sequence is separated from the cleavage site can be sequentially determined by repeating the above steps. Each of the above steps can be performed according to the above-described DNA sequence determination method of the present invention.
  • the measurement cell has a substrate on which the DNA to be analyzed is immobilized, an input port for supplying probes, buffers, restriction enzymes, and the like, and an exhaust port for discharging them.
  • the material of the measurement cell is preferably a light-transmitting material when fluorescent materials, quantum dots, metal colloids, etc. are used for the probe identification label, and glass, quartz glass, silicon ', light transmission Single crystal (For example, A 1 2 0 3 , S i 0 2 ) and the like are preferable.
  • the measurement cell itself may be used as a base material for immobilizing the DNA to be analyzed.
  • the optical means includes an optical system that can obtain optical information (for example, color information) that can identify the probe identification mark.
  • the optical system used when the label is a fluorescent label or a quantum dot includes, for example, a fluorescence microscope, preferably a single molecule fluorescence spectroscopy microscope.
  • the optical means used in the present invention may include a spectroscopic optical system using a prism or a diffraction grating, a high-speed filter switching device, and the like.
  • the means for converting optical information (for example, color information) into an identification signal (for example, electrical signal) is the optical information that can identify the probe identification mark obtained by the above (ii) optical means. It is a means for converting the identification mark of the probe into an identification signal that can be identified (for example, an electrical signal).
  • optical information that can identify the probe identification mark is imaged on different pixels of different CCDs or one CCD after spectroscopy, and from the pixels in the imaging part. Based on the luminance information, there is a means for converting the identification mark of the probe into an identification signal (for example, an electrical signal) that can be identified.
  • C C D digital C C D is usually used.
  • the identification signal can be obtained as a digital signal. Since the digital signal is suitable for processing by a computer, it is preferable to automate the following (iv) means for converting the identification signal into base sequence information using a computer. In addition, if optical information is converted into a luminance signal after spectroscopy using a different CCD, the luminance information from each CCD chip can be distinguished, so the probe signal can be easily detected on the computer from the obtained identification signal. The type of identification mark can be identified. Therefore, the following (iv) means for converting to base sequence information can be easily automated. Therefore, it is preferable to use different C CD (for example, 3 C CD) as the means for converting optical information into an identification signal.
  • different C CD for example, 3 C CD
  • the means for converting the identification signal into the base sequence information includes the above (iii) optical information as the identification signal. It is a means to convert the identification signal (for example, an electrical signal) obtained by the means for converting into DNA base sequence information.
  • each probe has a label (identification label) that can be distinguished from each other for each type of base at the protruding end, by identifying the type of the identification label, the protruding end of the probe is identified. Can be identified. Furthermore, since the base at the protruding end of the probe is complementary to the base at the protruding end of the analysis target DNA linked to the probe, by identifying the base at the protruding end of the probe, the base The type of base at the protruding end of the DNA to be analyzed linked to the probe can be identified.
  • the identification signal corresponding to the identification label of each probe can be obtained by (iii) above, the type of base at the protruding end of the analysis target DNA is identified from the identification signal obtained in (iii) above. Can do.
  • the identification signal obtained in (iii) above is a commonly used component (for example, a storage unit such as a RAM, ROM, or hard disk, a program stored in the storage unit, or an input unit such as a keyboard). Since it can be obtained as an electrical signal that can be processed by a computer equipped with a calculation unit such as a CPU, means for converting the identification signal into base sequence information can be easily automated.
  • the base sequence information converted by the computer can be displayed or output by a display unit such as a monitor or an output unit such as a printer.
  • SEQ ID Nos in the present specification indicate the following sequences.
  • Example 1
  • a fluorescent DNA probe that specifically binds to a DNA sequence having a single base overhang was detected, and the DNA sequence was determined by reacting alternately with a C Iass ISS restriction enzyme and a DNA ligase.
  • Biotinylated DNA consisting of avidin and agarose beads (Sigma, A 9 2 0 7) (suspended in 30 ⁇ 1 slurry in 1 x PBS) with biotin bound to the analysis target D ⁇ ( Figure 3) IJ number: 9: 5, biotin-GCTACGTAAGCTTCATGAATTCGACACTGTGTCAGCA3 ', sequence number: 10: 5, GCTGACACAGTGTCGAATTCATGAAGCTTACGTAGC3',) (10 ⁇ M) are mixed for 1 hour, Immobilized to.
  • the beads obtained in (1) above, on which the DNA to be analyzed is immobilized, are washed with 1 XPBS. It washed twice, further washed once with T4 DNA ligase buffer (50mM T ris- HC l, 1 OraM Mg C l 2, 10 mM DTT), fluorescent DNA probes (1 0 ⁇ , 50 mM ⁇ ris- HC 1, 1 0 mM Mg C 1 2, 1 OmM DTT) (10 ⁇ 1), T4 DNA ligase (T oyobo, L igationhigh, LGK- 1 01) (10 ⁇ 1), a mix of the above Agaro Subizu Incubate at 20 for 1 hour and wash twice with 1XPBS to link the DNA to be analyzed and the fluorescent DNA probe.
  • T4 DNA ligase buffer 50mM T ris- HC l, 1 OraM Mg C l 2, 10 mM DTT
  • fluorescent DNA probes (1 0 ⁇
  • the fluorescent DNA probe used had the same structure as probes 1, 3 and 4 shown in Fig. 1 (1).
  • FITC was used as fluorescent substance 1 (fluorescence 1)
  • Cy 5 was used as fluorescent substance 3 (fluorescence 3)
  • Cy 3 was used as fluorescent substance 4 (fluorescence 4).
  • Quantum dots (5 25, 60 5) using crosslinker (EDC) (Q21341MP Qdot® 525 ITK TM Carboxyl Quantum Dots ⁇ Q21301MP Qdot® 605 ITK TM Carboxyl Quantum Dots, Invitrogen Corporation) Were covalently bonded to the 5 ′ amino group of DNA described below to prepare a quantum dot DNA probe.
  • EDC crosslinker
  • Quantum dot 605 (Fig. 5 (l b)):
  • Biotinylated DNA (Figure 5 (2)), (sequence number: 1 5: 5 'biotin-actcggcatgcgccagagagagagagagag3' ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 J number " ⁇ : 1 ⁇ : 5 'tctctctctctggcgcatgccgagt3') (1 00 ⁇ M) was added and allowed to stand for 1 hour to immobilize the analysis target D ⁇ on the cover glass.
  • the base sequence of DNA was identified by observing a single molecule of the chain reaction of restriction enzymes and ligation enzymes.
  • Oligo DNA 50 pmo 1 / ⁇ 1
  • 200 ⁇ 1 (Hokkaido system 10 ⁇ T 4 polynucleotidekinaseb uffer (NEB) 22 ⁇ 1 s ATP (100 mM) 5 ⁇ 1, ⁇ 4 po 1 ynucleotidekinase (NEB) 10 ⁇ was added to the solution and incubated at 37 ° C for 5 hours.
  • the biotinylated DNA substrate (DNA to be analyzed) is a base sequence in which two or more (about 10 to about 10,000) base sequences selected from the base sequences consisting of rtcaaj, rtcatj, “tcag” and “tcac” are linked. It has a base sequence including The biotinylated DNA substrate was also phosphorylated by the same method as in (1) above.
  • the length of the DNA to be analyzed is usually at least about 1 O bp and at most about 10,000 bp, and about 1000 bp is particularly preferable.
  • the quantum dots with carboxyl groups (525, 565, 605, 655) were covalently bonded to the 5 'amino groups of the following oligo DNA probes as follows.
  • a DNA probe was prepared.
  • Quantum dot 525 (Oligo DNA probe bonded to each carboxyl grouped quantum dot) Quantum dot 525:
  • Quantum dots 6 0 5
  • the strength bar glass was ultrasonically cleaned with a strong detergent (Scat 20 X, Daiichi Clean Chemikanore), then with methanol and air dried. After drying, the cover glass was treated with a hydrophilic linker bonded with biotin to coat the glass surface. 20 ng / m 1 avidin (Av i d i n, S i gma) was applied to the surface of a cover glass (fixed glass) coated with piotin, treated for 15 minutes, and then washed with Hepes ⁇ . After washing, the biotinylated DNA substrate (analysis target DNA) prepared in (2) was applied, treated for 15 minutes, and then washed with He, pes-K OH.
  • a strong detergent Scat 20 X, Daiichi Clean Chemikanore
  • quantum dots ⁇ DN A probe T4 DNA ligase (2 ⁇ 1, NEB, M0202M ), ATP (1 00 mM), 10 x reaction buffer (NEB uffer 2, NEB), C 1 ass IIS restriction enzyme (NEB, F okl), put ultrapure water on the surface of the cover glass, and with an inverted fluorescence microscope (Nikon TE 2000 E) and EM—CCD camera (R oper Caseade II) (see Fig. 6 (1)), DNA to be analyzed Quantum dots and DNA probes that bind to the chain were observed.
  • the optical system and image analysis software used for the observation of quantum dots and DNA probes are as follows.
  • the results are shown in Fig. 7 (1).
  • An enlarged image of part of Fig. 7 (1) is shown in Fig. 7 (2).
  • Figure 7 (3) shows an image of the same sequence in Fig. 7 (2). The uptake of quantum dots and DNA probes according to the base sequence of the DNA to be analyzed was observed at the single molecule level. Industrial applicability
  • the DNA base sequence determination method of the present invention has features such that DNA base sequence can be determined efficiently and DNA extracted from cells can be directly observed without cloning.
  • This method is particularly useful as a method for determining the nucleotide sequence of DNA, particularly as a method for determining the nucleotide sequence of genomic DNA.

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Abstract

本発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法を提供する。本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法によれば、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列を含有するプローブを用いて、多数の解析対象ＤＮＡについて、同時に、解析対象ＤＮＡの末端塩基とプローブの連結および解析対象ＤＮＡの末端塩基の切断を連鎖反応で行い、１分子蛍光分光分析法によって塩基配列を順次決定することができるので、効率的にＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる

Description

明細書
D N A塩基配列を決定する方法 技術分野
本発明は、 DN Aの塩基配列を決定する方法に関する。 より具体的には、 本発 明は、 制限酵素と D N A連結酵素による D N A塩基削除連鎖反応を 1分子レベル で検出することによって、 DN Aの塩基配列を決定する方法に関する。 背景技術
従来より、 DNAの塩基配列を決定する方法として、 マクサム ·ギルバート法 やサンガー法が知られている。 例えば、 マクサム ·ギルバート法においては、 D NAの塩基配列を決定するために、 例えば、 以下のような工程を要する。
(1) 細胞から抽出した DNAを断片化し、 遺伝子組換え技術などを用いて大腸 菌などに D N A断片を組み込む。
(2) 大腸菌などを培養し、 組み込まれた DNA断片を増幅する （クローニン グ） 。
(3) 大腸菌などを溶解し、 組み込まれた DNA断片を生化学的に分離し、 純度 の高い DN A精製を行う。
(4) PCR技術を用い、 精製された DNA断片を基に 1塩基ずつ長さの異なる DNA断片を作成する。 この工程で、 4種類の塩基に応じた 4種類の標識を DN
A断片に付加する。
(5) (4) の反応産物を精製する。
(6) 電気泳動法により、 1塩基ずつ長さの異なる DNA断片を分子量の大きさ により分離し、 蛍光を検出することで DN Aの塩基配列を決定する。
上記のような方法はクローユングを必要とするが、 一度にクローニングできる DN A断片の長さは、 数千から数万塩基対である。 従って、 例えば、 約 30億塩 基対のヒ トの全ゲノムの塩基配列を決定するためには、 最低でも 1 0万回程度の クロ一二ングが必要である。
このように、 従来から用いられている DNAの塩基配列決定方法では、 DNA の塩基配列を決定するために大変な労力と時間、 それに莫大な費用が必要である という問題があった。 特に、 高等生物のゲノム情報は数十億塩基対にものぼるた め、 例えば、 ヒ ト 1人分の全ゲノム DNAの塩基配列を決定するためには、 国家 的なプ口ジェク トが必要であつた。 発明の開示
このような状況下、 煩雑な操作を必要とせず、 短時間に DNAの塩基配列を決 定することができる方法の開発が望まれていた。 また、 クローニングを必要とし ない D N Aの塩基配列決定方法の開発が望まれていた。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 一塩基突出末 端を有し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであつ て、 認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプロ一ブ を用いることによって、 細胞から抽出した DNAの塩基配列を、 クローニングす ることなく決定できることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 以下のような DNAの塩基配列決定方法、 プローブ、 D NAの塩基配列決定用キットなどを提供する。
(1) (a) 突出末端を有する、 基材に固定化された解析対象 DNAと、 突出 末端を有し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであ つて、 認識配列と切断部位とが離れてレ、る制限酵素の認識配列を含有するプロ一 ブとを、 DNA連結酵素で連結する工程；
(b) 前記解析対象 DNAと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定す る工程；及び
(c) 前記解析対象 DN Aと前記プローブとの連結体を、 前記認識配列と切断部 位とが離れている制限酵素で切断する工程
を含む、 DN Aの塩基配列決定方法。
(2) 前記解析対象 DNAの突出末端および前記プローブの突出末端が、 いず れも一塩基突出末端である上記 （1) 記載の方法。
(3) 前記プローブが、 それぞれ A (アデニン） 、 T (チミン） 、 C (シトシ ンぅ または G (グァニン) に相補的な 1塩基又は 2塩基突出末端を有する 4種の プローブを含む、 上記 （1) または （2) に記載の方法。
(4) 前記プローブの制限酵素の認識配列と突出末端との距離が、 前記制限酵 素の認識配列と切断部位との距離より一塩基短い、 上記 （2) または （3) に記 載の方法。
(5) 前記各工程が連鎖反応で行われる、 上記 （1) 〜 （4) のいずれかに記 載の方法。
(6) 前記識別標識が、 蛍光標識、 量子ドッ ト又は金属コロイ ドである上記 (1) 〜 （5) のいずれかに記載の方法。
(7) 前記識別標識の種類の同定が、 1分子観察で行われる上記 （ 1 ) 〜
(6) のいずれかに記載の方法。
(8) 前記識別標識の種類の同定が、 前記蛍光標識の蛍光波長の検出により行 われる上記 （6) 記載の方法。
(9) 前記蛍光波長の検出が、 1分子蛍光分光顕微鏡を用いて行われる上記
(8) 記載の方法。
(1 0) 同時に複数の解析対象 DNAの塩基配列を決定する、 上記 （1) 〜
(9) のいずれかに記載の方法。
(1 1) 前記制限酵素が、 1塩基又は 2塩基突出末端を生成する酵素である、 上記 （1) 〜 （1 0) のいずれかに記載の方法。
(12) 前記酵素が、 クラス I I S制限酵素である、 上記 （1 1) 記載の方法。
(13) 前記解析対象 DN Aの突出末端と、 前記プローブの突出末端が、 いず れも 3 ' 突出末端である上記 （1) 〜 （1 2) のいずれかに記載の方法。
(14) 前記制限酵素が、 3' 末端に 1塩基又は 2塩基突出末端を生成する酵 素である、 上記 （1) 〜 （1 3) のいずれかに記載の方法。
(15) 前記酵素が、 Bmr l、 Bmu l、 B f i I、 A s uHP I、 Hp h I、 B c i V I、 B f u l、 Hp y AV、 M b o I I、 N c u I、 M n 1 I、 A s p 26H I、 A s p 27H I、 A s p 35H I、 A s p 36 H I , A s p 40 H I、 As p 50H I、 B c e 83 I、 B c g l、 BmaH I、 B pm l、 B p uE I、 B s aMI、 B s c C I、 B s e l l、 B s e 3D I、 B s e G I、 B s eMI、 B s e N I、 B s g l、 B sm l、 B s pKT5 I、 B s r l、 B s r D I、 B s r S I、 B s t l l l、 B s t F 5 I、 B t s l、 B t s C I、 C s p C I、 C s tMI、 E c i l、 E c o 57MI、 G s u I、 Mv a l 269 I、 P c t I、 T s p l I、 T s pDT Iおよび T s p GW Iから選択される、 上記 （14) 記載の方法。
(16) 前記解析対象 DN Aの突出末端と、 前記プローブの突出末端が、 いず れも 5' 突出末端である上記 （1) 〜 （12) のいずれかに記載の方法。
(1 7) 前記制限酵素が、 5' 末端に 1塩基又は 2塩基突出末端を生成する酵 素である、 上記 （1) 〜 （1 2) および （1 6) のいずれか記載の方法。
(1 8) 前記酵素が、 Ac lWI、 A l w l、 B i n l、 B s p P I、 B s t H9 I、 B s t 31 T I、 E a c l、 B c c I、 Hp yC l I、 B e e f I , P l e l、 P p s l、 Ac i l、 B c eA I、 Bme 585 I、 B s cA I、 B s t l 9 I、 B s t FZ438 I、 F a u l、 Smu Iおよび S s i Iから選択さ れる、 上記 （17) 記載の方法。
(1 9) 前記基材が、 光透過性を有する材料から形成されている上記 （1) 〜 (18) のいずれかに記載の方法。
(20) 突出末端を有し、 該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプロ ーブであって、 認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有す るプロ一ブ。
(21) 前記突出末端が、 1 塩基又は 2塩基突出末端である上記 （20) 記載 のフ。ローブ。
(22) 前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、 前記認識配列と前記 切断部位との距離より一塩基短い、 上記 （2 1) 記載のプローブ。
(23) 前記突出末端が、 3' 突出末端である上記 （20) 〜 （22) のいず れかに記載のプローブ。
(24) 前記突出末端が、 5' 突出末端である上記 （20) 〜 （22) のいず れかに記載のプローブ。
(25) 前記認識配列が、 クラス I I S制限酵素の認識配列である、 上記 （2 0) 〜 （24) のいずれかに記載のプローブ。
(26) 上記 （20) 〜 （25) のいずれかに記載のプローブを含む、 DNA の塩基配列決定用キット。
(27) 前記プローブが、 それぞれ A、 T、 Cまたは Gに相補的な 1塩基又は 2塩基突出末端を有する少なくとも 4種のプローブを含む、 上記 （26) 記載の キット。 (28) さらに、 制限酵素および DNA連結酵素を含む、 上記 （26) または (27) に記載のキット。
(29) (i) 測定セル'； （ii) 光学手段； （iii) 光学情報を識別信号に変換 する手段；および （iv) 識別信号を塩基配列情報に変換する手段を備える、 DN Aの塩基配列決定装置であって、 前記測定セルは、 （a) 突出末端を有する、 基 材に固定化された解析対象 DNAと、 突出末端を有し、 かつ該突出末端の塩基の 種類に応じて識別標識されたプローブであって、 認識配列と切断部位とが離れて いる制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、 DN A連結酵素で連結する手 段；及び （c) 前記解析対象 DNAと前記プローブとの連結体を、 前記認識配列 ； と切断部位とが離れている制限酵素で切断する手段を備える装置。 本発明は次のような効果を奏する。
(1) DNAの塩基配列決定を極めて迅速に行うことができる。 ,
(2) 細胞から抽出した DNAを直接観察できる。 つまり、 後述のように、 ク ローニングが必要がでない。
( 3 ) 比較的小型かつ単純な装置で実現できる。
(1) と （2) の特徴から、 全ゲノム塩基配列の決定に要する時間を大幅に短 縮し、 ゲノム生物学、 遺伝学、 医学、 薬理学など、 様々な領域に革命的変革をも たらすことができる。 また、 （2) と （3) の特徴から、 臨床分野での幅広い応 用も考えられ,る。 たとえば、 遺伝子が関わる疾患 （例えば、 遺伝子の変異、 多型
(例えば、 SNP sなど） などが関わる疾患） においては、 患者 1人 1人のゲノ ム情報に応じたテーラ一メード医療へ利用することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の 1つの実施態様を説明するための概略図である。
図 2は、 蛍光標識の同定方法などを説明するための概略図である。
図 3は、 実施例 1で用いた、 解析対象 DNAにピオチンを結合したピオチン化 DNAの構造を示す図である。
図 4は、 実施例 1における解析対象 DN Aを結合させたビーズの観察結果を示 す図である。 図 5は、 実施例 2で用いた、 量子ドッ ト . DN Aプローブと、 解析対象 DNA にビォチンを結合したビォチン化 D N Aの構造を示す図である。
図 6は、 実施例 2における量子ドット · DN Aプローブの観察装置と観察結果 を示す図である。
図 7は、 実施例 3における解析対象 DNAと連結された量子ドットプローブの 観察結果を示す図である。 （2) は、 （1) の一部を拡大した画像を示す図であ る。 （3) は、 （2) の同じ箇所の連続シーケンスを並べた画像を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 本発明は、 一塩基突出末端を有し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別 標識されたプローブであって、 認識配列と切断部位とが離れてレ、る制限酵素の認 識配列を含有するプローブ、 前記プローブを用いた D N Aの塩基配列決定方法、 前記プローブを含有する D N Aの塩基配列決定用キットなどに関する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1. DN Aの塩基配列決定方法
本発明の第 1の態様は、 下記工程 （a) 〜 （c) を有する、 DNAの塩基配列 決定方法に関する。
(a) 突出末端を有する、 基材に固定化された解析対象 DNAと、 突出末端を有 し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、 認 識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、 DN A連結酵素で連結する工程；
( b ) 前記解析対象 D N Aと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定す る工程；
(c) 前記解析対象 DNAと前記プローブとの連結体を、 前記認識配列と切断部 位とが離れてレ、る制限酵素で切断する工程。
以下、 各工程の詳細について説明する。 _(1) 工程 （a) ：解 j斤対象 DNAとプローブとの DNA連結酵素による連結 工程 （a) は、 解析対象 DNAとプローブを DNA連結酵素で連結する工程で ある。
(解析対象 DNA)
解析対象となる DNAは、 特に制限はなく、 ゲノム DNA由来であってもよく、 c DNA由来であってもよい。 本発明の DNAの塩基配列決定方法は、 1分子の DNAの塩基配列を、 クローユングすることなく決定することができるので、 細 胞から抽出したゲノム DN Aの塩基配列を決定するのに特に好ましく用いること ができる。 すなわち、 解析対象 DNAとしては、 ゲノム DNA由来の DNAを好 ましく用いることができる。
解析対象 DNAの長さには特に制限はないが、 通常 1〜5000塩基、 好まし くは 2〜 1000塩基、 より好ましくは 5〜 500塩基、 特に好ましくは 1 0〜 100塩基である。
本発明の解析対象 D N Aの調製は、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (以下、 モレキュ ラークローニング第 3版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38， John Wiley and Sons (1987-1997)、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。 具体的には、 例えば、 ゲノム DNA由来の DNAを用いる場合には、 まず、 解析対象となる生 物の組織、 細胞から DNAを抽出 '精製してゲノム DNAを調製する。 次に、 ゲ ノム D N Aを制限酵素などを用いて切断して D N A断片を調製する。 このように して得られた D N A断片を、 クロー二ングすることなく本発明の解析対象 D N A として用いることができる。
解析対象 DNAは基材に固定化される。 基材は、 塩基配列決定を阻害しないも のであればよく、 特に制限はない。 基材としては、 生体分子を固定する基材とな るものを用いることができ、 例えば、 ガラス基板、 石英ガラス基板、 石英基板、 シリコン基板、 プラスチック基板、 金属基板 （例えば、 金箔基板） 等の基板；ガ ラス容器、 石英ガラス容器、 プラスチック容器等の容器；ュトロセルロース、 ポ リビエリデンフルオリ ド （PVDF) 等の材料からなるメンブレンなどが挙げら れる。 複数の解析対象 DN Aを固定化し、 同時に複数の解析対象 DN Aの塩基配 列決定を行うためには、 基材は板状であるのが好ましく、 例えば、 ガラス基板、 石英ガラス基板、 シリコン基板、 アルミ基板、 光透過性単結晶基板 （例えば、 A 1 203、 S i〇2) などが挙げられる。 後述するプローブの識別標識に蛍光物質 を用いる場合には、 基材としては光透過性を有するものが好ましく、 さらに光透 過性を有する板状のものが好ましく、 特に、 ガラス基板、 石英ガラス基板、 シリ コン基板、 光透過性単結晶基板 （例えば、 A 1 203、 S i O ) が好ましく、 な かでもガラス基板が好ましい。
解析対象 DN Aを基材に固定化する手段は、 解析対象 DN Aの塩基配列決定に 障害とならない手段であればよく、 直接的に、 または間接的に固定化する手段を 用いることができる。 好ましくは、 解析対象 DN Aと基材に設けられた結合部分 を使用することによって間接的に固定化することができる。 このような結合部分 としては、 親和性結合を形成する物質の組合せや、 架橋剤などを利用した化学結 合を用いることができる。 親和性結合を形成する物質の組合せとしては、 例えば、 ァビジンまたはストレブトァビジン， "ピオチン、 抗体または抗体断片/抗原分子 (ェピトープ） などの組合せが挙げられ、 ァビジンまたはストレプトァビジン. ビォチンの組合せが好ましく用いられる。 このような親和性結合を形成する物質 の組合せを用いる場合、 組合せの一方の物質が基材に結合され （または本来的に その一部である） 、 もう一方の物質が解析対象 DNAに結合される。 好ましくは、 ァビジンまたはストレブトァビジンが基材に結合され （または本来的にその一部 である） 、 ビ才チンが解析対象 DNAに結合される。 これらを接触させることに より、 アビジンまたはストレプトァビジンとビォチンとが親和性結合を形成し、 解析対象 D N Aが基材に固定化される。
解析対象 D N Aを基材に固定化する部位は、 解析対象 D N Aの塩基配列決定を 阻害しない部位であればよく、 特に制限はないが、 突出末端 （すなわちプローブ が連結される末端） とは反対の末端であるのが好ましい。
基材に固定化する解析対象 DN Aの数は、 特に制限はない。 本発明においては、 例えば、 1〜約 1 00、 約 1 00〜約 1 000、 約 1 000〜約 1 0， 000、 約 1 0 , 000〜約 50, 0 00、 約 5 0, 000〜約 1 0 0, 000、 約 1 0 0， 000〜約 500 , 00 0の解析対象 DN Aを基材に固定化して処理するこ とができる。 迅速に塩基配列を決定するという観点からは、 基材に固定化する解 析対象 DNAの数は、 100以上であるのが好ましい。
解析対象 DNAの固定化されない末端には、 突出末端が形成されている。 突出 末端は、 用いられるプローブが連結できるように形成される。 具体的には、 3' 突出末端を有するプローブを用いる場合には、 解析対象 DNAの突出末端も 3' 突出末端ときれる。 5' 突出末端を有するプローブを用いる場合には、 解析対象 DNAの突出末端も 5' 突出末端とされる。 1塩基突出末端を有するプローブを 用いる場合には、 解析対象 DNAの突出末端も 1塩基突出末端とされる。 プロ一 ブが 2塩基突出またはそれ以上である場合には、 解析対象 DNAも、 これに対応 して、 2塩基突出またはそれ以上とされる。 より具体的には、 1塩基突出の 3' 突出末端を有するプローブを用いる場合には、 解析対象 DN Aの突出末端も 1塩 基突出の 3' 突出末端とされる。 1塩基突出の 5' 突出末端を有するプローブを 用いる場合には、 解析対象 DNAの突出末端も 1塩基突出の 5 ' 突出末端とされ る。
このような突出末端は、 適切な制限酵素を用いて形成することができる。 例え ば、 解析対象 DN A中に、 後で詳述する工程 （c) で用いられる制限酵素の認識 配列が含まれている場合には、 工程 （c) で用いられる制限酵素の認識配列と同 じ配列を認識する制限酵素を用いて突出末端を形成することができ、 工程 （c) で用いる制限酵素によって突出末端を形成してもよい。 解析対象 DN Aの突出末 端の形成は、 好ましくは解析対象 DNAを基材に固定化した後に行われる。 なお、 解析対象 DN A中に、 工程 （c) で用いられる制限酵素の認識配列が含 まれていると、 工程 （c) において、 制限酵素がその認識配列を認識して解析対 象 DNAを切断してしまうため、 塩基配列決定の障害となる。 そこで、 工程 (a) を行う前に、 あらかじめ工程 （c) で用いる制限酵素によって処理するな ど、 前記した解析対象 DNAの切断を回避する処理を行うことが好ましい。 (プローブ）
本発明のプローブは、 突出末端と、 該突出末端の塩基の種類に応じた識別標識 と、 制限酵素の認識配列を含有している。 本発明のプローブは、 2つの 1本鎖 D NAをアニーリングさせたプロ一ブ （本明細書において 「2分子性のプローブ」 と称することもある。 ） であってもよく、 1つの 1本鎖 DN Aを分子内でァニー リングさせた、 ヘアピン構造を有するプローブ （本明細書において 「1分子性の プローブ」 と称することもある。 ） であってもよい。 2分子性のプローブとして は、 突出末端または制限酵素の切断部位側の末端とは反対側の末端が標識されて いるものが好ましい。 プローブの末端が標識されている場合、 標識される末端は 5 ' 末端または 3， 末端のいずれでもよい。 1分子性のプローブとしては、 ヘア ピン構造部分が標識されているものが好ましい。
用いられるプローブの突出末端は、 解析対象 DNAの突出末端と、 突出末端の 鎖 （5' または 3' ) および突出末端の塩基数が同じであるものである。 具体的 には、 例えば、 解析対象 DN Aの突出末端が 1塩基突出の 3' 突出末端である場 合には、 1塩基突出の 3''突出末端を有するプローブが用いられる。 解析対象 D N Aの突出末端が 1塩基突出の 5' 突出末端である場合には、 1塩基突出の 5' 突出末端を有するプローブが用いられる。 用いられるプローブの突出耒端の塩基 は、 解析対象となる D N Aの突出末端を形成し得る塩基に相補的な塩基である。 具体的には、 突出末端が 1塩基突出末端である場合には、 例えば、 突出末端の塩 基が、 アデニン （A) 、 チミン （T) 、 シトシン （C) またはグァニン （G) で ある 4種のプロ一プが用いられる。 突出末端が 2塩基突出末端である場合には、 例えば、 突出末端の塩基が、 AA、 AT、 AC、 AG、 TA、 TT、 TC、 TG、 CA、 CT、 CC、 CG、 GA、 GT、 G Cまたは G Gである 16種のプローブ が用いられる。 突出する塩基数が増えると、 用いられるプローブの種類が多くな り、 各プローブの識別標識および識別が困難になる傾向があるので、 突出末端は 1または 2塩基突出末端であるのが好ましく、 特に 1塩基突出末端であるのが好 ましい。 もしくは、 NA、 NT、 NG、 NCの 2塩基突出末端を持つプローブを 4種類用意し、 1塩基ずつ読むことも可能である。 このようなプローブとしては、 末端側が Nであるプローブ （すなわち、 左側を末端として NA、 NT、 NG、 N C) 、 末端側が A、 T、 Gまたは Cであるプローブ （すなわち、 左側を末端とし て、 AN、 AT、 AG、 AC) が挙げられるが、 末端側が Nであるのが、 解析対 象 DN Aの塩基配列を末端から決定できる点で好ましい。 ここで、 Nは、 プロ一 ブを形成するオリゴ DNA合成の際に、 アデニン （A) 、 チミン （T) 、 シトシ ン （C) またはグァニン （G) が混合されたものを取り込ませた塩基部位を表し、 アデニン （A) 、 チミン (T) 、 シトシン （C) およびグァニン （G) が同比率 で混合されたものを取り込ませたものが好ましい。 すなわち、 Nの部位にはアデ ニン （A) 、 チミン （T) 、 シトシン （C) またはグァニン （G) のいずれかの 塩基が同確率で存在するのが好ましい。
NA、 NT、 NG、 NCに代えて、 NNA、 NNT、 NNG、 NNCなどの 3 塩基突出末端を持つプローブ、 NNNA、 NNNT、 NNNG、 NNNCなどの 4塩基突出汞端を持つプローブなど、 3塩基以上の突出末端を有するプローブも 好ましく用いることができる。 このような 3塩基以上の突出末端を有するプロ一 ブは、 アニーリングの効率が良いという点で好ましい。 もっとも、 あまり突出末 端の塩基数が多くなると、 誤アニーリングする可能性が高くなる傾向がある。 よ つて、 アニーリング効率と誤アニーリング回避という点からは、 3〜 5塩基突出 末端を有するプローブが好ましく、 特に 4塩基突出末端を有するプローブが好ま しい。
識別標識に用いられる標識物質としては、 前記突出末端の塩基の識別すること ができる標識物質であればよい。 標識物質としては、 例えば、 蛍光物質、 化学発 光物質、 偏光の変化を測定し得る標識物質などの各種標識物質を使用することが でき、 なかでも蛍光物質が好ましく用いられる。 本発明で用いられる蛍光物質は、 当該蛍光物質で標識されていることが検出可能なものであればよく、 特に制限は ない。 蛍光物質としては、 核酸の標識に用いられている蛍光物質を用いることが でき、 例えば、 ローダミン B、 ローダミン 6 G、 X—ローダミン'、 テトラメチル ローダミン （TMR) 、 テトラメチルローダミンイソチオシァネート （TMR I TC) 、 フルォレセイン、 フルォレセインイソチオシァネート （F I TC) 、 C y (登録商標） 3、 Cy (登録商標） 5、 TA RA (登録商標） 、 A l e x a F l u o r (登録商標） 350、 A l e x a F l u o r (登録商標） 405、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 430、 A l e x a F l u o r (登録商 標） 488、 A l e x a F l u o r (登録商標） 532、 A l e x a F l u o r (登録商標） 546、 A l e x a F l u o r (登録商標） 555、 A l e x a F l u o r (登録商標） 568、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 94, A 1 e x a F l u o r (登録商標） 6 33、 A l e x a F l u o r (登録商標） 647、 A l e x a F l u o r (登録商標） 680、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 700、 A l e x a F l u o r (登録商標） 749、 ァクリジンイェロー、 テキサスレツド、 量子ドット、 蛍光ビーズ、 T r a n s F 1 u o S p h e r e s (登録商標） ビーズ、 金属コロイ ドなどが挙げられる。 量 子ドットとしては、 例えば、 Qdot (登録商標） 525 ITK™ Car boxy 1 Quantum Dots, Qdot (登録商標) 545 ITK™ Carboxyl Quantum Dotsヽ Qdot (登録商標) 565 ITK™ Carboxyl Quantum Dots , Qdot (登録商標） 585 ITK™ Carboxyl Quantum Dots , Qdot (登録商標） 605 ITK™ Carboxyl Quantum Dotsヽ Qdot (登録商標) 655 ITK™ Carboxyl Quantum Dotsヽ Qdot (登録商標) 705 ITK™ Carboxyl Quantum Dots , Qdot (登録商標) 800 ITK™ Carboxyl Quantum Dotsヽ Qdot (登録商標) 525 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots , Qdot (登録商標） 545 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots, Qdot (登録商標） 565 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots、 Qdot (登録商標) 585 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots , Qdot (登録商檩) 605 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots, Qdot (登録商標） 655 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots, Qdot (登 録商標） 705 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots、 Qdot (登録商標） 800 ITK™ Amino (PEG) Quantum Dots , Qdot (登録商標） 545 ITK™ Organic Quantum Dots , Qdot (登録商標) 565 ITK™ Organic Quantum Dots , Qdot (登録商標) 585 ITK™ Organic Quantum Dots、 Qdot (登録商標） 605 ITK™ Organic Quantum Dots , Qdot (登録商標) 655 ITK™ Organic Quantum Dotsヽ Qdot (登録商標） 705 ITK™ Organic Quantum Dots, Qdot (登録商標） 800 ITK™ Organic Quantum Dots など (以上、 In vitro gen Corporation) 、 E v i d e n t T h e c h n o l o g i e s社製の量子ドットなどが挙げられる。 なお、 解析対象 D N Aの長さが長い場 合には、 解析に要する時間力長くなるので、 特に退色しにくい蛍光物質を用いる のが好ましい。 また、 蛍光色素に応じて退色防止剤を用いるのが好ましい。
プローブは、 突出末端の塩基の種類を識別できるように、 当該突出末端の塩基 の種類ごとに、 互いに識別可能な標識物質を用いて標識される。 具体的には、 突 出末端が 1塩基突出末端である場合には、 例えば、 それぞれ D N Aの 4種類の塩 基 （A、 T、 C、 G) に相補的な 1塩基突出末端を有する 4種のプローブを、 互 レ、に識別可能な 4種類の標識物質を用いて標識する。 突出末端が 2塩基突出末端 である場合には、 それぞれ D N Aの 2塩基突出末端の塩基の種類に相補的な 2塩 基突出末端を有する 1 6種のプローブを、 互いに識別可能な 1 6種類の識別物質 を用いて標識すればよ!、。 プ口ーブの突出末端が 3塩基以上突出している場合も、 当該突出末端の塩基の種類ごとに互いに識別可能な標識物質を用いて標識すれば よい。 プローブの標識は、 化学修飾など公知の方法によって、 直接的または間接 的に行うことができる。
プローブに含まれる制限酵素の認識配列は、 後で詳述する工程 （C ) で用いら れる制限酵素 （認識配列と切断部位とが離れている制限酵素） の種類に応じた塩 基配列を有している。 ここで、 工程 （c ) で用いられる制限酵素は、 用いられる プローブの突出末端と、 突出末端の鎖 （5 ' または 3 ' ) および突出末端の塩基 数が同じである突出末端を形成する切断部位を有する制限酵素である。 具体的に は、 例えば、 プローブの突出末端が 1塩基突出の 3， 突出末端である場合には、 3 ' 末端に 1塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。 プロ ーブの突出末端が、 1塩基突出の 5 ' 突出末端である場合には、 5 ' 末端に 1塩 基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。
認識配列と突出末端の距離は、 工程 （c ) で用いられる制限酵素の認識配列と 切断部位の距離より、 工程 （b ) で一度に決定される塩基の数だけ短い。 したが つて、 突出末端に突出している D N Aの塩基数と工程 （b ) で一度に決定される 塩基の数とが等しい場合には、 認識配列と突出末端の距離は、 工程 （c ) で用い られる制限酵素の認識配列と切断部位の距離より、 当該突出末端に突出している D N Aの塩基数だけ短くなつている。 具体的には、 例えば、 突出末端が 1塩基突 出末端である場合には、 工程 （b ) で一度に決定される塩基数も 1塩基であるの で、 認識配列と突出末端の距離は、 認識配列と切断部位の距離より 1塩基短い。 また、 例えば、 突出末端が 2塩基突出末端であり、 2塩基ずつ配列を決定する場 合には、 認識配列と突出末端の距離は、 認識配列と切断部位の距離より 2塩基短 レ、。 これに対し、 突出末端が 2塩基突出末端であっても、 例えば、 N A、 N T、 N G、 N Cの 2塩基突出末端を持つプローブを用いて 1塩基ずつ配列を決定する 場合には、 認識配列と突出末端の距離が、 認識配列と切断部位の距離より 1塩基 短いものが用いられる。
また、 1塩基突出末端を持ち、 認識配列と突出末端の距離が、 認識配列と切断 部位の距離より 2塩基短いプローブを用いることにより、 解析対象 D N A中の塩 基を 2塩基ごと （1塩基とばし） に解析することもできる。
さらに、 例えば、 NA、 N T、 N G、 N Cの 2塩基突出末端を持ち、 認識配列 と突出末端の距離が、 認識配列と切断部位の距離より 2塩基短い （すなわち、 突 出末端の塩基数と同じ塩基数だけ短い） プローブを用いることにより、 解析対象
DNA中の塩基を 2塩基ごと （1塩基とばし） に解析することもできる。
同様にして、 例えば、 NNNA、 NNNTS NNNG、 NNNCの 4塩基突出 末端を持ち、 認識配列と突出末端の距離が、 認識配列と切断部位の距離より 4塩 基短い （すなわち、 突出末端の塩基数と同じ塩基数だけ短い） プローブを用いる ことにより、 解析対象 DNA中の塩基を 4塩基ごと （3塩基とばし） に解析する こともできる。 認識配列と突出末端の距離が、 認識配列と切断部位の距離より 3 または 2塩基短いプローブを用いることにより、 解析対象 D N A中の塩基を 3ま たは 2塩基ごとに解析することもできる。 認識配列と突出末端の距離が、 認識配 列と切断部位の距離より 5または 6塩基短いプローブを用いることにより、 解析 対象 DNA中の塩基を 5または 6塩基ごとに解析することもできる。 このように して、 n (nは 1以上の整数を表す） 塩基突出末端を持ち、 認識配列と突出末端 の距離が、 認識配列と切断部位の距離より m (niは 2以上の整数を表す） 塩基短 いプローブを用いることにより、 解析対象 DNA中の塩基を m塩基ごと （m— 1 塩基とばし） に解析することができる。 以上のように、 解析対象 DN A中の塩基 を 2塩基以上ごとに解析した場合には、 塩基配列データベースに対して参照を行 うことにより、 該解析対象 DN Aを同定すること （すなわち、 解析対象 DN Aが どのような遺伝子であるかを決定すること） ができる。
プローブの長さは、 300塩基以下であることが好ましい。 好ましくは、 少な くとも 8塩基対、 少なくとも 9塩基対、 少なくとも 10塩基対、 少なくとも 1.1 塩基対、 少なくとも 1 2塩基対、 少なくとも 1 3塩基対、 少なくとも 14塩基対、 少なくとも 1 5塩基対、 少なくとも 1 6塩基対、 少なくとも 1 7塩基対、 少なく とも 18塩基対、 少なくとも 1 9塩基対または少なくとも 20塩基対である。 ま た、 プローブの長さは、 好ましくは、 100塩基対以下、 80塩基対以下、 60 塩基対以下、 50塩基対以下、 40塩基対以下、 35塩基対以下、 30塩基対以 下、 25塩基対以下、 24塩基対以下、 23塩基対以下、 22塩基対以下、 21 塩基対以下、 20塩基対以下、 1 9塩基対以下、 1 8塩基対以下、 1 7塩基対以 下、 16塩基対以下、 1 5塩基対以下、 14塩基対以下、 1 3塩基対以下、 1 2 塩基対以下、 1 1塩基対以下または 10塩基対以下である。
本発明のプローブは、 化学合成法など公知の方法に従って合成することができ る。
( D N A連結酵素による連結）
工程 （a) では、 解析対象 DNAとプローブとが DNA連結酵素によって連結 される。 解析対象 DNAと、 プローブと、 DNA連結酵素とを反応させると、 解 析対象 DNAと、 突出末端の塩基が解析対象となる DN Aの突出末端の塩基に相 補的であるプローブ （相補的なプローブと称することがある） が連結される。 用 いられる DNA連結酵素は、 突出末端を有する DNA断片を連結できるものであ ればよく、 特に制限はない。 DNA連結酵素としては、 例えば、 T4 DNAリ ガーゼ、 P i u DNAリガ一ゼ、 Ta q DNAリガ一ゼ、 TTH DNAリ ガーゼなどが挙げられる。
( 2 ) 工程 （ b ) ：解析対象 D N Aと連結されたプロ一ブの識別標識の種類の同 定
工程 （b) は、 工程 （a) において解析対象 DNAと連結されたプローブの識 別標識の種類を同定する工程である。
上述したように、 プローブは、 その突出末端の塩基の種類ごとに、 互いに識別 可能な標識物質を用いて標識 （識別標識） されているので、 該識別標識の種類を 同定することによって、 プローブの突出末端の塩基の種類を同定することができ る。 さらに、 プローブの突出末端の塩基は、 該プローブに連結された解析対象 D NAの突出末端の塩基と相補的であるので、 プローブの突出末端の塩基を同定す ることによって、 該プローブに連結された解析対象 D N Aの突出末端の塩基の種 類を同定することができる。 このようにして、 解析対象 DN Aとプローブの突出 末端が 3' 突出末端である場合には解析対象 DNAの 3' 末端の塩基が同定され、 解析対象 DNAとプローブの突出末端が 5' 突出末端である場合には、 解析対象 DNAの 5' 末端の塩基が同定される。
識別標識の種類の同定には、 用いられている標識物質に応じて得られる信号を 検出し、 標識物質の種類を同定することができる方法が用いられる。 このような 識別標識の種類の同定方法としては、 解析対象 D N Aと連結されたプローブと、 解析対象 DNAと連結されていない （フリーの） プローブを区別できる方法が好 ましい。 解析対象 DN Aと連結されたプローブと、 フリーのプローブを区別でき る方法としては、 例えば、 1分子観察による方法が挙げられる。 1分子観察によ れば、 ガラス表面に固定されたプローブのみが輝点として、 フリーなプローブは 弱い一様なバックグラウンドノイズとしてそれぞれ検出されるため、 連結したプ ローブとフリーなプローブとを区別することが出来る。 具体的には、 例えば、 標 識標識が蛍光標識である場合には、 蛍光標識の種類の同定には、 蛍光標識の蛍光 波長を検出し、 蛍光標識の種類を同定する方法、 例えば、 蛍光分光分析法が用い られる。 さらに、 解析対象 DN Aと連結されたプローブとフリーのプローブを区 別できる方法としては、 例えば、 1分子蛍光分光分析法が用いられる。 1分子蛍 光分光分析は、 例えば、 1分子蛍光分光顕微鏡、 市販の 1分子蛍光分析システム (例えば、 MS 20 (ォリン'パス株式会社製） など） 、 プリズムや回折格子を用 いた分光光学系、 複数の CCDカメラとフィルターを組み合わせたシステム、 高速 フィルター切り替え装置、 3 CCDカメラ、 単板カラー CCDカメラ、 デジタル C C Dカメラ （例えば、 E M— C C Dカメ ラなど） 、 Quad-View™ (Roper Bioscience ) 、 Dual-View™ ( Roper Bioscience ) 、 Dual -Cam™ ( Roper Bioscience) や Double - Viewなどを使用して行うことができる。 本発明で用いら れる 1分子蛍光分光分析法としては、 例えば、 蛍光相関分光法 （Fluorescence Correlation Spectroscopy) (例えば、 Biopolymers, 13, 29-61 (1974)など参 照） 、 蛍光強度多分布解析 (Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis) (例えば、 Biophysical Journal, 79， 2858-2866 (2000)、 特表 2 0 0 1 - 50 20 6 2号公報、 特表 200 1— 5 1 8 3 0 7号公報、 特表 2 00 2 - 50 5 74 2号公報など参照） などが挙げられる。
蛍光標識の励起に使用する光源としては、 水銀ランプ、 キセノンランプなどの アーク光源、 LED、 A rレーザー、 H e N eレ '一ザ一、 LDレーザー、 He C dレーザー、 N d Y AGレーザー、 K r A r レーザーなどのレーザー光源など、 公知の光源を使用することができる。 光源の波長は、 用いられる蛍光標識の励起 波長に応じて選択される。 アーク光源など、 広い波長領域を有する光源を用いる 場合には、 用いられる蛍光標識の励起波長に応じたバンドバスフィルターを使用 するのが好ましい。 バンドパスフィルタ一としては、 例えば、 誘電体バンドパス フィルター、 金属バンドパスフィルターなどが挙げられる。 アーク光源など、 広 い波長領域を有する光源は、 バンドパスフィルターを適宜選択することによって、 蛍光標識に応じた励起光を容易に選択することができる点で好ましく用いること ができる。
蛍光を検出する際には、 蛍光と、 励起光、 散乱光などの蛍光以外の光を分離す ることにより、 背景光を低減させて観察するのが好ましい。 このような、 蛍光と その他の光 （励起光、 散乱光など） の分離は、 ダイクロイツクミラー、 吸収フィ ルターなどを用いて行うことができる。 ダイクロイツクミラーとしては、 蛍光標 識の励起波長および蛍光波長に応じて、 励起光を反射し、 蛍光を透過するような 波長特性のものを選択すればよい。 吸収フィルタ一としては、 蛍光を透過し、 散 乱光などを吸収するようなものを選択すればよい。
蛍光標識の蛍光を検出するための検出器としては、 例えば C C Dカメラが挙げ られる。 ノイズ低減の観点から、 冷却 C C Dカメラが好ましく用いられる。 C C Dカメラを用いて蛍光を検出する場合には、 プリズムなどの分光素子を用いて蛍 光のスぺク トルを得ることが、 蛍光標識を識別する上で好ましい。
上記のようにして得られた画像を、 市販の画像解析ソフトウェア、 例えば MetaMorph (Universal Imagi ng Corporation) などを使用して角?析してもよレヽ。
( 3 ) 工程 （ c ) ：解析対象 D N Aとプローブとの連結体の制限酵素による切断 工程 （c ) は、 工程 （a ) において連結された解析対象 D N Aとプローブとの 連結体を、 制限酵素で切断する工程である。 上述したように、 プローブの認識配 列と突出末端の距離は、 認識配列と切断部位の距離より短いので、 解析対象 D N Aとプローブとが連結されることによって、 解析対象 D N A上に切断部位が出現 することになる。 具体的には、 例えば、 解析対象 D N Aとプローブの突出末端が 1塩基突出末端である場合には、 プローブの認識配列と突出末端の距離は、 認識 配列と切断部位の距離より 1塩基短くなつているので、 解析対象 D N Aとプロ一 ブが連結されると解析対象 D N Aの末端から 1番目と 2番目の塩基の間に切断部 位が出現する。 この解析対象 D N Aとプロ一ブの連結体が制限酵素で切断される ことによって、 解析対象 D N Aの末端の 1塩基が削られ、 新たな 1塩基突出末端 が生成される。
本発明で用いられる制限酵素は、 認識配列と切断部位とが離れている制限酵素 であり、 かつ突出末端を生成するものである。 生成される突出末端は、 3 ' 突出 末端でもよく、 5' 突出末端でもよい。 また、 突出する塩基数としては、 特に制 限はないが、 生成される突出末端は、 突出末端は 1または 2塩基突出末端である のが好ましく、 特に 1塩基突出末端であるのが好ましい。 このような制限酵素は、 例えば、 クラス I I S制限酵素から選択される。 具体的には、 例えば、 1塩基突 出の 3 ' 突出末端を生成する制限酵素としては、 Bmr Iおよびそのアイソシゾ マー （例えば、 B f i I、 Bmu lなど） 、 A s u H P I及びそのアイソシゾマ 一 （例えば、 H p h Iなど） 、 B c i V Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 B f u Iなど） 、 Hp yAVおよびそのアイソシゾマー、 Mb o I Iおよびその アイソシゾマー （例えば、' N c u Iなど） 、 Mn 1 Iおよびそのアイソシゾマー などが挙げられ、 、 なかでも Bm r I、 B c i V I、 Mb o I I、 Hp h Iが好 ましく、 特に Bmr Iが好ましい。 1塩基突出の 5' 突出末端を生成する制限酵 素としては、 A c 1 W Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 A 1 w I、 B i n I、 B s p P I、 B s tH9 I、 B s t 3 1 T I、 E a c lなど） 、， B c c Iお よびそのアイソシゾマー （例えば、 Hp y C 1 Iなど） 、 B c e f Iおよびその アイソシゾマ一、 P 1 e Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 P p s Iなど） などが挙げられ、 なかでも A l w l、 P l e l、 B c e f l、 H p y C 1 Iが好 ましく、 特に A 1 w I、 P 1 e Iが好ましい。
2塩基突出の 3' 突出末端を生成する制限酵素としては、 例えば、 Ac i Iお よびそのアイソシゾマー （例えば、 S s i Iなど） 、 B c e A Iおよびそのアイ ソシゾマ一、 Bme 585 Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 B s t F Z 4 38 1、 F a u I、 S m u Iなど） 、 B s c A Iおよびそのアイソシゾマー （例 えば、 B s t 1 9 Iなど） などが挙げられる。 2塩基突出の 5' 突出末端を生成 する制限酵素としては、 例えば、 A s p 26 H Iおよびそのアイソシゾマー （例 えば、 A s p 27H I、 A s p 35H I、 A s p 36H I、 A s p 40H I、 A s p 50H I、 Bma H I N B s aMI、 B s c C I、 B s m l、 M v a 1 26 9 1、 P c t Iなど） 、 B c e 83 Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 B p uE Iなど） 、 B c g Iおよびそのアイソシゾマー、 Bpm lおよびそのアイソ シゾマ一 （例えば、 G s u Iなど） 、 B s e 1 Iおよびそのアイソシゾマー （例 えば、 B s eN I、 B s r l、 B s r S I、 B s t l l l、 T s p l lなど） 、 B s e 3 D Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 B s eM I、 B s r D Iな ど） 、 B s e G Iおよびそのアイソシゾマー （例えば、 B s t F 5 I、 B t s C Iなど） 、 B s g Iおよびそのアイソシゾマー、 B s p KT 5 Iおよびそのアイ ソシゾマー、 B t s Iおよびそのアイソシゾマー、 C s p C Iおよびそのアイソ シゾマー、 C s tM Iおよびそのアイソシゾマー、 E c i Iおよびそのアイソシ ゾマー、 E c o 57M Iおよびそのアイソシゾマー、 T s pDT Iおよびそのァ イソシゾマー、 T s p G W I'およびそのアイソシゾマーなどが挙げら; ^る。
本発明で用いられる制限酵素は、 i程 （a) で用いられるプローブに対応して 選択される。 具体的には、 工程 （a) で用いられるプローブの突出末端と、 突出 末端の鎖 （5' または 3' ') および突出末端の塩基数が同じである突出末端を形 成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。 具体的には、 例えば、 プローブ の突出末端が 1塩基突出の 3 ''突出末端である場合には、 3' 末端に 1塩基突出 を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。 プローブの突出末端が、 1 塩基突出の 5' 突出末端である場合には、 5 ' 末端に 1塩基突出を生成する切断 部位を有する制限酵素が用いられる。 さらに、 用いられる制限酵素は、 認識配列 と切断部位の距離が、 用いられるプローブの認識配列と突出末端の距離より工程 (b) で一度に決定される塩基の数だけ長いものである。 したがって、 工程 (b) で一度に決定される塩基の数と突出末端に突出している DN Aの塩基数と が等しい場合には、 認識配列と切断部位の距離は、 用いられるプローブの認識配 列と突出末端の距離より、 当該突出末端に突出している D N Aの塩基数だけ長い ものである。 具体的には、 例えば、 用いられるプローブの突出末端が 1塩基突出 末端である場合には、 工程 （b) で一度に決定される塩基数も 1塩基であるので、 認識配列と切断部位の距離が、 認識配列と突出末端の距離より 1塩基長い制限酵 素が用いられる。 また、 例えば、 突出末端が 2塩基突出末端であり、 一度に決定 される塩基数が 2塩基である場合には、 認識配列と切断部位の距離が、 認識配列 と突出末端の距離より 2塩基長い制限酵素が用いられる。 これに対し、 突出末端 が 2塩基突出末端であっても、 例えば、 NA、 NT、 NG、 NCの 2塩基突出末 端を持つプローブを用いて 1塩基ずつ配列を決定するような場合には、 認識配列 と切断部位が、 認識配列と突出末端の距離の距離より 1塩基長い制限酵素が用い られ 。 さらに、 NA、 NT、 NG、 NCの 2塩基突出末端を持つプローブを用 いて 2塩基ごとに解析対象 DNA中の塩基を解析する場合など、 2塩基以上の突 出末端を持つプローブを用いて 2塩基以上ごとに塩基を解析する場合には、 認識 配列と切断部位の距離が認識配列と突出末端の距離より 2塩基以上長い制限酵素 が用いられる。 (4) 解析対象 DN Aの塩基配列の決定
上述したように、 工程 （a) において解析対象 DNAはプローブと連結され、 工程 （b) において解析対象 DNAの突出末端の塩基が同定される。 そして、 ェ 程 （c) において、 解析対象 DNAには新たな突出末端が生成される。 このよう にして、 新たな突出末端が生成された解析対象 DNAは、 さらに工程 （a) 〜 (c) に供することができ、 同様にして工程 （a) 〜 （c) を繰り返すことがで きる。 この工程 （a) 〜 （c) の繰り返しは、 工程 （c) における制限酵素によ る切断が可能である限り行うことができる。 このような工程 （a) 〜 （c) の繰 り返しによって、 解析対象 D N Aの突出末端の塩基を順次同定することによって、 解析対象 DN Aの塩基配列を決定 （または解析） することができる。 具体的には、 解析対象 DNAの突出末端が 3 ' 突出末端である場合には、 解析対象 DNAの塩 基配列を 3' 側から順次決定 （または解析） することができる。 解析対象 DNA の突出末端が 5 ' 突出末端である場合には、 解析対象 DN Aの塩基配列を 5' 側 から順次決定することができる。 また、 解析対象 DN Aの突出末端が 1塩基突出 末端である場合には、 1塩基ずつ決定していくことができる。
このような工程 （a) 〜 （c) の繰り返しは、 （1) 工程 （a). 、 工程 （b) および工程 （c) の 1または 2反応を行った後に反応液を交換して行うこともで き、 または （2) 解析対象 DN Aと、 プローブと、 DN A連結酵素と、 制限酵素 の共存下、 連鎖反応で行うこともできる。 工程 （a) 〜 （c) の繰り返しは、 解 析速度の観点からは、 連鎖反応で行うのが好ましレ、。
前記 （1) のように、 工程 （a) 、 工程 （b) および工程 （c) の 1または 2 反応を行った後に反応液を交換して行う場合には、 例えば、 マイクロ流路と温度 制御装置を組み合わせた系で、 ポンプなどにより反応液を交換する方法により行 うことができる。 DN A連結反応と DN A切断反応とでは反応至適条件が異なる ため、 それぞれの反応の至適条件となるように、 反応条件を交互に変えて各反応 を行ってもよレヽ。 次に、 本発明の DNAの塩基配列決定方法の 1つの実施態様について、 図 1お よび図 2に基づいて具体的に説明する。
まず、 工程 （a) の 1つの実施態様について説明する。 図 1 (1) に示されて いるように、 解析対象 DNAは、 突出末端とは反対の末端が、 アビジン，ノビォチ ン結合を介して間接的に基材に固定化されている。 解析対象 DN Aの上側の鎖は、 左が 5' 末端であり、 右が 3' 末端である。 従って、 解析対象 DNAの突出末端 は、 1塩基突出の 3' 末端である。 解析対象 DN Aの塩基は、 3' 突出末端の塩 基から順に、 第 1塩基、 第 2塩基、 第 3塩基というように表されている。
プロ一ブは、 突出末端とは反対の末端が、 突出末端の塩基の種類ごとに、 互い に識別可能な蛍光物質を用いて標識されている。 具体的には、 突出末端の塩基が Tであるプローブ 1は、 蛍光物質 1で標識されている。 同様に、 突出末端の塩基 がそれぞれ A、 C、 Gであるプローブ 2、 3、 4は、 それぞれ蛍光 質 2、 3、 4で標識されている。 プローブ 1〜4の下側の鎖は、 左が 3' 末端であり、 右が 5 ' 末端である。 従って、 プローブの突出末端は、 解析対象 DNAと同様に、 1 塩基突出の 3' 末端である。 プローブには、 Bmr I制限酵素の認識配列が含ま れている。 前記認識配列と突出末端の距離は、 Bmr I制限酵素の認識配列と切 断部位の距離より 1塩基短い。
解析対象 DN Aの突出末端の塩基 （第 1塩基） は Aであるので、 これに相補的 な Tを突出末端に有するプローブ 1が、 DN. A連結酵素によって連結され、 図 1 (2) に示されるような連結体が生成される。
次に、 工程 （b) の 1つの実施態様について説明する。 工程 （a) おいて生成 した解析対象 DN Aとプローブ 1との連結体 （図 1 (2) ) を、 蛍光分光分析法 などを用いて分析することによって、 解析対象 DNAと連結されたプロ一ブの蛍 光標識 （蛍光物質 1) が同定される。 このような蛍光標識の同定には、 例えば、 図 2 (1) に示されるような蛍光分光分析装置が用いられる。 図 2 (1) の蛍光 分光分析装置においては、 光源から発せられた光から、 バンドパスフィルターに よって、 蛍光物質の励起に必要な波長の光が抽出される。 このようにして抽出さ れた励起光は、 ダイクロイックミラーによって反射され、 サンプルに照射される。 照射された励起光によって、 プローブの蛍光標識は励起され、 蛍光を発する。 蛍 光標識から発せられた蛍光は、 ダイクロイツクミラーを透過し、 プリズムによつ て分光された後、 冷却 CCDによって観察される。 なお、 通常は蛍光顕微鏡など の拡大光学系を併用し、 1分子蛍光分光分析を行う。 1分子蛍光分光分析法によ れば、 ゆらぎの大きさなどから、 解析対象 DNAに連結されたプローブと、 フリ 一のプローブを区別することができるので、 1分子蛍光分光分析法を用いるのが 好ましレ、。 このようにして、 例えば、 図 1 (2) に示された解析対象 DN Aに連 結されたプローブがプローブ 1であることが同定される。 さらに、 解析対象 DN Aの突出末端の塩基は、 プローブ 1の突出末端の塩基 （T) に相補的な塩基 (A) と同定される。
サンプルとしては、 例えば、 図 2 (2) に示されるように、 基材に複数の解析 対象 D N Aが固定化されたものを用いることもできる。 1分子蛍光分光分析法に よれば、 同時に多数 （例えば、 数百から数千） の蛍光を観察することもできるの で、 基材に複数の解析対象 D N Aを固定化したサンプルを用いるこ によって、 同時に複数 （例えば、 数百から数千） の解析対象 DN Aの塩基配列を決定するこ ともできる。
次に、 工程 （c) の 1つの実施態様について説明する。 上述したように、 プロ ーブの認識配列と突出末端の距離は、 認識配列と切断部位の距離より 1塩基短い ので、 解析対象 DNAとプローブとが連結されることによって、 解析対象 DNA の第 1塩基と第 2塩基の間に切断部位が出現している （図 1 (2) ) 。 従って、 この解析対象 D N Aとプローブ 1との連結体を B r m I制限酵素で切.断すると、 解析対象 DN Aの第 1塩基がプローブ 1に連結された状態で切断され、 解析対象 DN Aは 1塩基短く削られる。 その結果、 解析対象 DN Aには、 第 2塩基が突出 した新たな 1塩基突出末端が生成される （図 1 (3) ) 。
このようにして生成された新たな 1塩基突出末端 （第 2塩基 （C) ) を有する 解析対象 DN Aは、 さらに工程 （a) 〜 （c) に供することができる。 すなわち、 第 2塩基 （C) が突出した解析対象 DN Aには、 これに相補的な Gを突出末端に 有するプローブ 4が DNA連結酵素によって連結される （工程 （a) ) 。 以下、 上述したように、 工程 （b) 、 工程 （c) を行うことができ、 さらに同様にして 工程 （a) 〜 （c) を繰り返すことができる。 このような工程 （a) 〜 （c) の 繰り返しは、 工程 （c) における制限酵素による切断が可能である限り行うこと ができる。 このような工程 （a ) 〜 （c ) の繰り返しによって、 解析対象 D N A の塩基配列が、 3 ' 側から 1塩基ずつ順次決定される。
2 . プローブぉよび D N Aの塩基配列決定用キット
また、 本発明の別の態様は、 突出末端を有し、 該突出末端の塩基の種類に応じ て識別標識したプローブであつて、 認識配列と切断部位とが離れている制限酵素 の認識配列を含有するプローブ、 および該プローブを含有する D N Aの塩基配列 決定用キットに関する。
本発明のプローブとしては、 前記と同様のものが挙げられ、 前記と同様のもの が好ましい。 例えば、 前記突出末端が 3 ' 突出末端であるのものと、 5 ' 突出末 端であるものが挙げられる。 なかでも、 前記突出末端が一塩基突出末端であるも のが好ましい。 また、 前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、 前記認識 配列と塩基切断部位との距離より一塩基短レ、ものが好ましい。 また、，前記認識配 列が、 クラス I I S制限酵素の認識配列であるものが好ましい。
本発明の D N Aの塩基配列決定用キットは、 上述の工程 （ a ) 〜工程 （ c ) を 含む方法により、 D N Aの塩基配列を決定するために用いられる。 本発明のキッ トに含有されるプローブとしては、 前記した本発明のプローブが挙げられ、 前記 と同様のものが好ましい。 特に、 プローブとして、 それぞれ A、 T、 Cまたは G に相補的な 1塩基突出末端を有する少なくとも 4種のプローブを含むキットが好 ま.しい。
本発明のキットには、 さらに制限酵素を含んでいてもよい。 本発明のキットに 含まれる制限酵素としては、 上述の工程 （c ) で用いられる制限酵素、 解析対象 D N Aに突出末端を形成するための制限酵素が挙げられる。 このような制限酵素 としては、 前記と同様のものが挙げられ、 前記と同様のものが好ましい。
本発明のキットには、 さらに D N A連結酵素を含んでいてもよい。 D N A連結 酵素としては、 前記と同様のものが挙げられ、 前記と同様のものが好ましい。
3 . D N Aの塩基配列決定装置
また、 本発明の別の態様は、 （i) 測定セル、 （i i) 光学手段、 （i i i) 光学情 報を識別信号に変換する手段、 および （iv) 識別信号を塩基配列情報に変換する 手段、 を備える D N Aの塩基配列決定装置であって、 前記測定セルは、 （a ) 突 出末端を有する、 基材に固定化された解析対象 D N Aと、 突出末端を有し、 かつ 該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、 認識配列と 切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、 D N A連 結酵素で連結する手段；及び （ c ) 前記解析対象 D N Aと前記プローブとの連結 体を、 前記認識配列と切断部位とが離れてレ、る制限酵素で切断する手段を備える 装置に関する。
本発明の D N Aの塩基配列決定装置においては、 まず、 （i) 測定セル内にお いて、 （a ) 突出末端を有する、 基材に固定化された解析対象 D N Aと、 突出末 端を有し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであつ て、 認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ とを、 D N A連結酵素で連結する反応が行われる。 次に、 （i i) 光学手段によつ て、 解析対象 D N Aと連結されたプローブの識別標識からの光学情報 （例えば、 色情報） を得る。 得られた光学情報を （ii i) 光学情報を識別信号に変換する手 段によって、 プローブの識別標識を識別しうる識別信号 （例えば、 電気的信号） に変換する。 この識別信号を （iv) 識別信号を塩基配列情報に変換する手段によ つて、 塩基配列を得る。 その後、 （i) 測定セル内において、 （c ) 前記解析対 象 D N Aと前記プローブとの連結体を、 前記認識配列と切断部位とが離れている 制限酵素で切断する反応が行われる。 これに続いて、 さらに上記の工程を繰り返 すことにより、 解析対象 D.N Aの塩基配列を順次決定することができる。. なお、 上記各工程は、 上述した本発明の D NAの塩基配列決定方法にしたがって行うこ とができる。
以下、 各構成要素について説明する。
(i) 測定セル■
測定セルは、 解析対象 D N Aが固定化された基材と、 プローブ、 バッファー、 制限酵素などを投入するための投入口と、 それらを排出するための排出口とを備 える。 ここで、 投入口と排出口とを別々に設ける必要はなく、 投入と排出とを行 うための投入 '排出口を設けてもよい。 測定セルの材料は、 プローブの識別標識 に蛍光物質、 量子ドット、 金属コロイ ドなどを用いる場合には、 光透過性を有す る材料が好ましく、 さらに、 ガラス、 石英ガラス、 シリコン'、 光透過性単結晶 (例えば、 A 1 2 0 3、 S i 0 2 ) などが好ましい。 測定セル'自体を解析対象 D N Aを固定化する基材として用いてもよい。
(i i) 光学手段
光学手段は、 プローブの識別標識を識別しうる光学情報 （例えば、 色情報） を 得ることが^きる光学系などで構成される。 具体的には、 例えば、 標識標識が蛍 光標識または量子ドットである場合に用いられる光学系としては、 例えば、 蛍光 顕微鏡など、 好ましくは、 1分子蛍光分光顕微鏡などが挙げられる。 本発明で用 いられる光学手段は、 プリズムや回折格子を用いた分光光学系、 高速フィルター 切り替え装置などを備えていてもよい。
(i i i) 光学情報を識別信号に変換する手段
光学情報 （例えば、 色情報など） を識別信号 （例えば、 電気的信号など） に変 換する手段は、 上記 （i i) 光学手段によって得られた、 プローブの識別標識を識 別しうる光学情報を、 プロ一ブの識別標識を識別しうる識別信号 （例えば、 電気 的信号など） に変換する手段である。 光学情報を識別信号に変換する手段として は、 例えば、 プローブの識別標識を識別しうる光学情報を、 分光後、 異なる C C Dまたは 1つの C C Dの異なる画素に結像させ、 結像部分にある画素からの輝度 情報を基に、 プローブの識別標識を識別しうる識別信号 （例えば、 電気的信号な ど） に変換する手段が挙げられる。 なお、 C C Dとしては、 通常、 デジタル C C Dが用いられる。 デジタル C C Dを用いた場合には、 識別信号をデジタル信号と して得ることができる。 デジタル信号は、 コンピュータによる処理に適している ので、 下記 （iv) 識別信号を塩基配列情報に変換する手段をコンピュータを用い て自動化する上で好ましい。 また、 光学情報を、 分光後、 異なる C C Dを用いて 輝度信号に変換すると、 各 C C Dチップからの輝度情報を区別することができる ので、 得られた識別信号から、 コンピュータ上で、 容易にプローブの識別標識の 種類を同定することができる。 したがって、 下記 （iv) 塩基配列情報に変換する 手段を容易に自動化することができるので、 光学情報を識別信号に変換する手段 には、 異なる C C D (例えば、 3 C C D ) を用いるのが好ましい。
また、 光学情報の識別情報への変換は、 1分子単位で行うのが好ましい。 (iv) 識別信号を塩基配列情報に変換する手段
識別信号を塩基配列情報に変換する手段は、 上記 （i i i) 光学情報を識別信号 に変換する手段によって得られた識別信号 （例えば、 電気的信号など） を DNA の塩基配列情報に変換する手段である。
上述したように、 各プローブは、 その突出末端の塩基の種類ごとに、 互いに識 別可能な標識 （識別標識） がされているので、 該識別標識の種類を同定すること によって、 プローブの突出末端の塩基の種類を同定することができる。 さらに、 プローブの突出末端の塩基は、 該プローブに連結された解析対象 DN Aの突出末 端の塩基と相捕的であるので、 プローブの突出末端の塩基を同定することによつ て、 該プローブに連結された解析対象 D N Aの突出末端の塩基の種類を同定する ことができる。 そして、 上記 （iii) によって各プローブの識別標識に対応した 識別信号を得ることができるので、 上記 （iii) で得られる識別信号から、 解析 対象 DN Aの突出末端の塩基の種類を同定することができる。 ここで、 上記 (iii) で得られる識別信号は、 一般的に使用される構成要素 （例えば、 RAM、 ROM, ハードディスクなどの記憶部、 記憶部に収納されたプログラム、 キーボ ードなどの入力部、 CPUなどの演算部） を備えるコンピュータによって処理し うる電気的信号として得ることができるので、 識別信号を塩基配列情報に変換す る手段を容易に自動化することができる。 コンピュータによって変換された塩基 配列情報は、 モニターなどの表示部、 プリンターなどの出力部によって表示また は出力することができる。
本明細書の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1] プローブ 1の一方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 2] プローブ 1の他方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 3] プローブ 2の一方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 4] プローブ 2の他方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 5] プローブ 3の一方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 6] プローブ 3の他方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 7] プローブ 4の一方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 8] プローブ 4の他方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 9] 実施例 1で用いた解析対象 DN Aの一方の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 0] 実施例 1で用いた解析対象 DN Aの他方の鎖の塩基配列を示 す。
[配列番号： 1 1] 実施例 2で用いた fi子ドット 525 DN Aプローブの一方 の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 2] 実施例 2で用いた量子ドット 525 DN Aプローブの他方 の鎖の塩基 ffi列を示す。
[配列番号： 1 3] 実施例 2で用いた量子ドット 605 DN Aプローブの一方 の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 14] 実施例 2で用いた量子ドット 605 DN Aプローブの他方 の鎖の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 5] 実施例 2で用いた解析対象 DN Aの 方の鎖の塩基配列を示 す。
[配列番号： 1 6] 実施例 2で用いた解析対象 DN Aの他方の鎖の塩基配列を示 す。
[配列番号： 1 7] 実施例 3で用いた量子ドット （525) プローブの一方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 8] 実施例 3で用いた量子ドット (525) プローブの他方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 9] 実施例 3で用いた量子ドット (565) プローブの一方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 20] 実施例 3で用いた量子ドット (565) プローブの他方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 21] 実施例 3で用いた量子ドット (605) プローブの一方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 22] 実施例 3で用いた量子ドット (605) プローブの他方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 23] 実施例 3で用いた量子ドット (655) プローブの一方の鎖 の塩基配列を示す。
[配列番号： 24] 実施例 3で用いた量子ドット (655) プローブの他方の鎖 の塩基配列を示す。 クローニングその他の操作、 反応条件などについて本明細書中 （下記の実施例 を含む） に特に記載がない場合、 Sambrook J. et al. , Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (モレキュラー 'クロ一ユング第 3版と略記する場合がある） ； Ausbel F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜 38， John Wi ley and Sons (1987-1997) ； Glover D. M. and Hames B. D. , DNA Cloning 1 : Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の標準的なプロ トコル集に記載の方法またはそれに 準じた方法により行うことができる。 実施例
以下、 本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。 なお、 本発明はこれ らの実施例に限定されるものではない。 実施例 1
多分子系における配列特異的な蛍光プローブの取り込み
1塩基突出末端を持つ D N Aの配列に特異的に結合する蛍光 D N Aプローブを 検出し、 さらに C I a s s I I S制限酵素と D N Aライゲースとを交互に反応さ せることで、 D N Aの塩基配列を決定した。
( 1 ) 解析対象 D N Aの基材への固定化
ァビジン ·ァガロースビーズ （S i g m a社、 A 9 2 0 7 ) ( 1 x P B Sで 3 0 μ 1スラリーに懸濁） に、 解析対象 D Ν Αにビォチンを結合したビォチン化 D N A ( 図 3 ) ( 配 歹 IJ 番 号 ： 9 ： 5， biotin- GCTACGTAAGCTTCATGAATTCGACACTGTGTCAGCA3' 、 配 列 番 号 ： 1 0 ： 5， GCTGACACAGTGTCGAATTCATGAAGCTTACGTAGC3 ' 、 ） （ 1 0 μ M) を混ぜて 1時間 混和し、 解析対象 D Ν Αをアビジン 'ァガロースビーズに固定化した。
( 2 ) 解析対象 D N Aと蛍光 D N Aプローブとの連結
上記 （ 1 ) で得られた、 解析対象 D N Aが固定化されたビーズを 1 X P B Sで 2回洗浄し、 さらに T4 DNAライゲースバッファ （50mM T r i s— H C l、 1 OraM Mg C l 2、 10 mM DTT) で 1回洗浄した後、 蛍光 D N Aプローブ （1 0 μΜ、 50 mM Τ r i s— HC 1、 1 0 mM Mg C 12、 1 OmM DTT) (10 μ 1 ) 、 T4 DNAライゲース （T o y o b o、 L i g a t i o n h i g h, LGK- 1 01) ( 10 μ 1 ) 、 を上記のァガロー スビーズに混ぜて、 20でで 1時間ィンキュベ一トし、 1 X P B Sで 2回洗浄し て、 解析対象 DNAと蛍光 DNAプ ーブとを連結させた。
なお、 蛍光 DNAプローブは、 図 1 (1) に示されたプローブ 1、 3および 4 と同様の構造のものを用いた。 蛍光物質 1 (蛍光 1) としては F I TCを、 蛍光 物質 3 (蛍光 3) としては Cy 5を、 蛍光物質 4 (蛍光 4) としては Cy 3を用 いた。
( 3 ) 解析対象 D N Aと連結された蛍光 D N Aプローブの同定
上記 （2) で得られた、 蛍光 DNAプローブを結合させたビーズの一部を蛍光 顕微鏡 （Z e i s s Ax i o v e r t 200M) で観察し、 ビーズ表面に結 合した蛍光 D N Aプローブを同定した。
( 4 ) 解析対象 D N Aと蛍光 D N Aプローブとの連結体の切断
上記 （3) で蛍光 DNAプローブを同定したビーズを 1 xNEB u f f e r 2 (NEB, B 7002 S) で 1回洗浄した後、 Bmr l (NEB, R 0600 S) (2 ^ 1) ^ l xNEB f f e r 2をビーズに添加して 37 °Cで 1時間ィ ンキュベートし、 解析対象 DNAと蛍光 DN Aプローブとの連結体を切断した。 その後、 1 X P B Sで 2回洗浄した。 (5) DN A塩基配列の順次同定
上記 （2) から （4) を繰り返すことで DN A塩基配列を順次同定した。
(6) 結果
まず、 （1) ~ (3) を行うことにより、 F I TCの蛍光が観察され、 解析対 象 DNAの 3 ' 末端の 1番目の塩基が Aと同定された。 続けて、 （4) および (2) 〜 （3) を繰返し行うことにより、 Cy 3の蛍光が観察され、 解析対象 D NAの 3' 末端の 2番目の塩基が Cと同定された。 さらに、 （4) および （2) 〜 （3) を繰返し行うことにより、 Cy 5の蛍光が観察され、 解析対象 DN Aの 3 ' 末端の 2番目の塩基が Gと同定された。 このようにして、 連結した蛍光プロ ーブの蛍光波長により解析対象 DNAの塩基配列が 3塩基同定された （図 4) 。 なお、 図 3に示されるように、 2回目の塩基の同定において、 Cy 3の蛍光と 共に F I TCの蛍光が観察された。 これは、 アビジン ·ァガロースビーズに結合 した複数 （100個程度） の解析対象 DNAの一部が、 Bmr Iによる切断を受 けずに次の反応へ進んだことを示している。 同様に、 3回目の塩基の同定におい ては、 Cy 5の蛍光と共に、 F I TCおよび C y 3の蛍光が観察され、 これは解 析対象 DNAの一部が 1回目または 2回目の B rm Iによる切断を受けずに次の 反応へ進んだことを示している。 このように、 同時に複数の解析対象 DNAを処 理する場合、 その一部が未反応のまま次の反応へ進む可能性がある で、 1分子 観察で識別標識の同定を行うのが望ましレ、。 実施例 2
制限酵素、 連結酵素による連鎖反応を 1分子観察することで、 DNAの塩基配 列の組み合わせを解析した。
(1) 量子ドット · DN Aプローブの調製
架橋剤 （E D C) を用い、 量子 ドッ ト （ 5 2 5、 6 0 5 ) (Q21341MP Qdot (登録商標） 525 ITK™ Carboxyl Quantum Dotsヽ Q21301MP Qdot (登録商標） 605 ITK™ Carboxyl Quantum Dots, Invitrogen Corporation) を、 それぞれ'下 記 DNAの 5' のァミノ基に共有結合し、 量子ドット . DNAプローブを調製し た。
量子ドット 525 (図 5 (l a) )
配列番号： 1 1
Figure imgf000031_0001
配列番号： 1 2 5 amine-gcatactagtactgggacgc3
量子ドット 605 (図 5 (l b) ) ：
配列番号： 13
Figure imgf000031_0002
酉己歹 IJ番号： 14 : 5' amine-gcatactagtactgggacgt3
(2) 解析対象 DNAの基材への固定化
まず、 カバーガラスの表面にアビジン （Signia、 A9275) を固定した。 アビジン を固定化したカバーガラスに、 解析対象 D N Aにビォチンを結合したビォチン化 D N A ( 図 5 ( 2 ) ) 、 （ 配 列 番 号 ： 1 5 : 5' biotin - actcggcatgcgccagagagagagagagag3 ' ヽ 酉己 ヅ1 J 番 "^ ： 1 ο ： 5' tctctctctctctctggcgcatgccgagt3' ) ( 1 00 μ M) を添加し、 1時間静置 し、 解析対象 D Ν Αをカバーガラスに固定化した。
(3) 解析対象 DN Aと連結された量子ドット · DN Aプローブの観察 解析対象 DNAが固定化されたカバーバラスを PB Sで洗浄した後、 量子ドッ トの結合した DNAプローブ （量子ドッ ト · DNAプローブ） 、 T4 DNAラ ィゲース （2 μ 1、 NEB (New England Biolabs Inc. )ヽ M 0202 M) 、 Bm r I (5 i l、 NEB、 R0600 L) 、 ATP ( 1 mM) 、 NEB u f f e r 2 (NEB) をカバーガラスの表面にのせ、 1分子蛍光顕微鏡 （N i k o n T Ε 2000 Ε , P l a n Αρ ο T I RF 100 χ NA1. 45) と 3 CCD (浜松ホトニタス、 C 7780— 20) により （図 6 (1) ) 、 解析対象 DNAに連鎖反応で結合するプローブを観察した。
(4) 結果
解析対象 DNAの塩基配列に応じた量子ドット · DNAプローブの連鎖的な取 り込みが 1分子レベルで観察された （図 6 (2) ) 。 実施例 3
複数の解析対象 DNAが固定化された基材を用い、 制限酵素、 連結酵素による 連鎖反応を 1分子観察することで、 D N Aの塩基配列を同定した。
(1) オリゴ DN Aのリン酸化
オリゴ DNA (50 pmo 1 / μ 1 ) 200 μ 1 (北海道システム ·サイェン ス) に 10 x T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e b u f f e r (NEB) 22 μ 1 s ATP (1 00 mM) 5 μ 1、 Τ4 p o 1 y n u c l e o t i d e k i n a s e (NEB) 10 μ ΐを加え、 37°Cで 5時間 インキュベートした。 インキュベート後、 フエノール抽出 （フエノール： クロ口 フオルム= 1 ： 1、 Vo r t e xミキサ一にて 10秒間振盪） 、 ク口ロフオルム 洗浄 （Vo r t e xミキサーにて 10秒間振納盪） 、 イソプロパノール沈殿 （5 0 %ィソプ口パノールと 0. 3 M酢酸ナトリウムで室温にて 1分間処理後、 20 000 X g、 1 5分間、 4。Cで遠心。 ） 、 および 70%エタノール洗浄 （100 0 μ 1で処理後、 20000 X gで遠心。 洗浄回数 1回） を行った。 洗浄後、 1 OmM He p e s— KOH (pH7. 5) に溶解し、 相補鎖とアニーリングさ せた。
(2) ピオチン化 DN A基質 （解析対象 DNA) の調製
ピオチン化 DN A基質 （解析対象 DNA) は北海道システム .サイエンス社か ら入手した （HPLC精製品） 。 ビォチン化 DNA基質 （解析対象 DNA) は、 rtcaaj 、 rtcatj 、 「tcag」 および 「tcac」 からなる塩基配列から選択される 2以上 （約 10個〜約 10000個） の塩基配列が連結された塩基配列を含む塩 基配列を有している。 ピオチン化 DNA基質も上記 （1) と同様の方法によりリ ン酸化した。 なお、 解析対象 DNAの長さは、 通常、 最低 1 O b p程度、 最大 1 万 b p程度であり.、 1000 b p程度が特に好ましい。
(3) 量子ドット · DN Aプローブの作成
架橋剤 （EDC) を用い、 下記のようにして、 カルボキシル基付量子ドッ ト (525、 565、 605、 655) を、 それぞれ下記オリゴ D N Aプローブの 5' のァミノ基に共有結合し、 量子ドット · DN Aプローブを調製した。
(各カルボキシル基付量子ドットに結合させたオリゴ DNAプローブ） 量子ドット 525 ：
(Q21341MP Qdot (登録商標） 525 ITK™ Carboxyl Quantum Dots, Invitrogen Corooration) 配列番号： 1 7 :
5 amine-tgcctgacatgtgtacgtctcgattagcacgaagtcaggatgcagtg3'
配列番号： 1 8 :
0 agttcactgcatcctgacttcgtgctaatcgagacgtacacatgtcagga3
量子ドット 56 5 ：
(Q21331MP Qdot (登録商標） 565 ITK™ Carboxyl Quantum Dots, Invitrogen Corporation)
配列番号： 1 9 :
D amine-tgcctgacatgtgtacgtctcgattagcacgaagtcaggatgcagtg3 '
配列番号： 20 :
5' agtacactgcatcctgacttcgtgctaatcgagacgtacacatgtcagga3
量子ドット 6 0 5 ：
(Q21301MP Qdot (登録商標） 605 ITK™ Carboxyl Quantum Dots, , Invitrogen Corporation)
配列番号： 2 1 :
5， amine-tgcctgacatgtgtacgtctcgattagcacgaagtcaggatgcagtg3'
配列番号： 2 2 :
5' agtccactgcatcctgacttcgtgctaatcgagacgtacacatgtcagga3，
量子ドッ卜 6 6 5 ：
（Q21321MP Qdot (登録商標） 665 ITK™ .Carboxyl Quantum Dots, Invitrogen Corporation)
配列番号： 2 3 :
5' amine-tgcctgacatgtgtacgtctcgattagcacgaagtcaggatgcagtg3' 5' 配列番号： 24 :
5 agtgcactgcatcctgacttcgtgctaatcgagacgtacacatgtcagga3 (架橋反応および精製）
各カルボキシル基付量子ドット （ 8 μ M) 20 μ 1を、 E D C ( 1 0 m g , m 1 ) 1. 5 μ 1、 炭酸塩バッファー （ρ Η8. 5、 0. 1M) 30. 5 μ 1およ び各ォリゴ D Ν Αプローブ （δ θ ρπιο ΐ /^ ΐ ) 48 ^ 1 と混合し、 室温で 3 時間インキュベートして各 DN Aの 5， のァミノ基に共有結合させ、 量子ドッ ト · DNAプローブを調製した。 得られた量子ドット · DNAプローブは、 ゲル 濾過 （NAP 5、 Am e r s h a m— P h a r ma c i a) により 10 mM H e p e s— KOH pH7. 5に溶媒置換した。
(4) ガラス表面への解析対象 DNAの固定
力バーガラスを強アル力リ性洗剤 （S c a t 20 X、 第一クリーンケミカ ノレ） で超音波洗浄した後、 メタノールで洗浄し、 風乾させた。 乾燥後、 カバーガ ラスをビォチンを結合した親水性リンカーで処理し、 ガラス表面をコーティング した。 20 n g / m 1アビジン （Av i d i n、 S i gma) をピオチンでコー ティングしたカバーガラス （固定ガラス） 表面にアプライし、 1 5分間'処理した 後、 He p e s—ΚΟΗで洗浄した。 洗浄後、 （ 2 ) で調製したビォチン化 D N A基質 （解析対象 DNA) をアプライし、 1 5分間処理した後、 He, p e s—K OHで洗浄した。
(5) 解析対象 DNAと連結された量子ドッ ト · DNAプローブの観察 上記 （ 4 ) で得られた解析対象 D N Aが固定化されたカバーバラスを P B Sで 洗浄した後、 上記 （3) で得られた量子ドット · DN Aプローブ、 T4 DNA ライゲース （2 μ 1、 NEB, M0202M) 、 ATP (1 00 mM) 、 10 x 反応バッファー （NEB u f f e r 2、 NEB) 、 C 1 a s s I I S制限酵素 (NEB, F o k l) 、 超純水をカバーガラスの表面にのせ、 倒立型蛍光顕微鏡 (N i k o n TE 2000 E) と EM— CCDカメラ （R o p e r C a s e a d e I I) により （図 6 (1) 参照） 、 解析対象 D N Aに連鎖反応で結合する 量子ドット · DNAプローブを観察した。 量子ドット · DNAプローブの観察に 使用した光学系および画像解析ソフトウエアは下記の通りである。
(光学系および画像解析ソフトウエア）
倒立型蛍光顕微鏡 （N i k o n TE 2000 E)
対物レンズ A PO T I RF、 油浸、 10 O x NA 1. 49
白色全反射照明装置 高速フィルターチェンジャー （P r i o r)
EM— CCDカメラ （Ro p e r C a s c a d e I I )
ダイクロイツクミラー 505 n m
励起フィルタ一 450— 490 n m
蛍光フィルター 520z'10、 560/ 15、 605/' 20、 655. ,20 画像解析ソフトウェア MetaMorph (Universal Imaging Corporation) 上記の条件で反応を観察し、 時間軸に対する色変化を横軸にずらしながら重ね た結果を図 7 (1) に示す。 1ラインが 1分子の DNAに結合した量子ドット . DN Aプローブの蛍光に由来し、 ラインの左端が時間 0を表す。 図 7 (1) の一部を拡大した画像を図 7 (2) に示す。 解析対象 DNAに結合 した量子ドット · D.NAプローブの種類に応じて異なる蛍光が順次取り込まれる 様子が観察された。 図 7 (2) の同じ箇所の連続シーケンスを並べた画像を図 7 (3) に示す。 解 析対象 DN Aの塩基配列に応じた量子ドット · DNAプローブの連鎖的な取り込 みが 1分子レベルで観察された。 産業上の利用可能性
本発明の D N Aの塩基配列決定方法は、 効率的に D N Aの塩基配列を決定する ことができる、 クローニングすることなく細胞から抽出した DNAを直接観察す ることができるなどの特徴を有するので、 DNAの塩基配列決定方法、 特にゲノ ム DNAの塩基配列決定方法として有用である。 さらに、 比較的小型かつ単純な 装置で実現することができるので、 臨床分野における DNAの塩基配列決定方法、 特に患者 1人 1人のゲノム情報に応じたテーラーメ一ド医療のための DN Aの塩 基配列決定方法として有用である。

Claims

請求の範囲
1. (a) 突出末端を有する、 基材に固定化された解析対象 DNAと、 突出末 端を有し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであつ て、 認識配列と切断部位とが離れてレ、る制限酵素の認識配列を含有するプローブ とを、 DN A連結酵素で連結する工程；
( b ) 前記解析対象 D N Aと連結された前記プ口ーブの識別標識の種類を同定す る工程；及び
(c) 前記解析対象 DNAと前記プローブとの連結体を、 前記認識配列と切断部 位とが離れている制限酵素で切断する工程
を含む、 DN Aの塩基配列決定方法。
2. 前記解析对象 DNAの突出末端および前記プローブの突出末端が、 いずれ も一塩基突出末端である請求項 1記載の方法。
3. 前記プローブが、 それぞれ A、 T、 Cまたは Gに相補的な 1塩基又は 2塩 基突出末端を有する 4種のプローブを含む、 請求項 1または 2に記載の方法。
4. 前記プローブの制限酵素の認識配列と突出末端との距離が、 前記制限酵素 の認識配列と切断部位との距離より一塩基短い、 請求項 2または 3に記載の方法。
5. 前記各工程が連鎖反応で行われる、 請求項 1〜 4のいずれかに記載の方法。
6. 前記識別標識が、 蛍光標識、 量子ドット又は金属コロイドである請求項 1 〜 5のいずれかに記載の方法。
7. 前記識別標識の種類の同定が、 1分子観察で行われる請求項 1〜 6のいず れかに記載の方法。
8. 前記識別標識の種類の同定が、 前記蛍光標識の蛍光波長の検出により行わ れる請求項 6記載の方法。
9. 前記蛍光波長の検出が、 1分子蛍光分光顕微鏡を用いて行われる請求項 8 記載の方法。
10. 同時に複数の解析対象 DNAの塩基配列を決定する、 請求項 1〜9のい ずれかに記載の方法。
1 1. 前記制限酵素が、 1塩基又は 2塩基突出末端を生成する酵素である、 請 求項 1〜 10のいずれかに記載の方法。
1 2. 前記酵素が、 クラス I I S制限酵素である、 請求項 1 1記載の方法。
13. 前記解析対象 DN Aの突出末端と、 前記プローブの突出末端が、 いずれ も 3 ' 突出末端である請求項 1〜 12のいずれかに記載の方法。
14. 前記制限酵素が、 3' 末端に 1塩基又は 2塩基突出末端を生成する酵素 である、 請求項 1〜1 3のいずれかに記載の方法。
15. 前記酵素が、 Bmr l、 Bmu l、 B f i I、 A s uHP I、 H p h I B c i V I、 B f u l、 Hp yAV、 Mb o I I、 Nc u l、 Mn 1 I、 A s p 26H I、 As p 27H I、 A s p 35H I、 A s p 36H I、 As p 40H I、 A s p 50H I、 B c e S 3 I、 B c g l、 BmaH I、 B pm l、 B p uE I、 B s aMI、 B s c C I、 B s e l l、 B s e 3D I、 B s e G I、 B s eMI、 B s eN I、 B s g l、 B sm l、 B s pKT5 I、 B s r l、 B s r D I、 B s r S I、 B s t l l l、 B s t F 5 I、 B t s l、 B t s C I、 C s p C I、 C s tMI、 E c i l、 E c o 57MI、 G s u I , Mv a 1 269 I , P e t I、 T s p l l、 T s pDT Iおよび T s p GW I力 ら選択される、 請求項 14 記載の方法。
16. 前記解析対象 DN Aの突出末端と、 前記プローブの突出末端が、 いずれ も 5 ' 突出末端である請求項 1〜 1 2のいずれかに記載の方法。
1 7. 前記制限酵素が、 5' 末端に 1塩基又は 2塩基突出末端を生成する酵素 である、 請求項 1〜1 2および 16のいずれか記載の方法。
18. 前記酵素が、 Ac lWI、 A l w l、 B i n l、 B s p P I、 B s tH 9 1、 B s t 3 1 T I、 E a c l、 B c c l、 Hp yC l I、 B c e f l、 P I e l、 P p s l、 Ac i l、 B c eA I、 Bme 585 I、 B s cA I、 B s t 1 9 1、 B s t FZ 438 I、 F a u l、 Sniu lおよび S s i Iから選択され る、 請求項 1 7記載の方法。
1 9. 前記基材が、 光透過性を有する材料から形成されている請求項 1〜1 8 のいずれかに記載の方法。
20. 突出末端を有し、 該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプロ一 ブであって、 認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有する プローブ。
21. 前記突出末端が、 1 塩基又は 2塩基突出末端である請求項 20記載のプ ローブ 0
22. 前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、 前記認識配列と前記切 断部位との距離より一塩基短い、 請求項 21記載のプローブ。
23. 前記突出末端が、 3 ' 突出末端である請求項 20〜22のいずれかに記 載のプローブ。
24. 前記突出末端が、 5 ' 突出末端である請求項 20〜 22のいずれかに記 載のプローブ。
25. 前記認識配列が、 クラス I I S制限酵素の認識配列である、 請求項 20 〜24のいずれかに記載のプローブ。
26. 請求項 20〜 25のいずれかに記載のプローブを含む、 DNAの塩基配 列決定用キット。
27. 前記プローブが、 それぞれ A、 T、 Cまたは Gに相補的な 1塩基又は 2 塩基突出末端を有する少なくとも 4種のプローブを含む、 請求項 26,記載のキッ 卜。
28. さらに、 制限酵素および DNA連結酵素を含む、 請求項 26または 27 に記載のキット。
29. (i) 測定セル；
(ii) 光学手段；
(iii) 光学情報を識別信号に変換する手段；および
(iv) 識別信号を塩基配列情報に変換する手段
を備える、 DN Aの塩基配列決定装置であって、 前記測定セル内は、
(a) 突出末端を有する、 基材に固定化された解析対象 DNAと、 突出末端を有 し、 かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、 認 識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、 DN A連結酵素で連結する手段；及び
(c) 前記解析対象 DNAと前記プローブとの連結体を、 前記認識配列と切断部 位とが離れている制限酵素で切断する手段
を備える装置。
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