JPWO2007097443A1 - Ｄｎａ塩基配列を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法を提供する。本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法によれば、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列を含有するプローブを用いて、多数の解析対象ＤＮＡについて、同時に、解析対象ＤＮＡの末端塩基とプローブの連結および解析対象ＤＮＡの末端塩基の切断を連鎖反応で行い、１分子蛍光分光分析法によって塩基配列を順次決定することができるので、効率的にＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
Description
本発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法に関する。より具体的には、本発明は、制限酵素とＤＮＡ連結酵素によるＤＮＡ塩基削除連鎖反応を１分子レベルで検出することによって、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法に関する。
従来より、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法として、マクサム・ギルバート法やサンガー法が知られている。例えば、マクサム・ギルバート法においては、ＤＮＡの塩基配列を決定するために、例えば、以下のような工程を要する。
（１）細胞から抽出したＤＮＡを断片化し、遺伝子組換え技術などを用いて大腸菌などにＤＮＡ断片を組み込む。
（２）大腸菌などを培養し、組み込まれたＤＮＡ断片を増幅する（クローニング）。
（３）大腸菌などを溶解し、組み込まれたＤＮＡ断片を生化学的に分離し、純度の高いＤＮＡ精製を行う。
（４）ＰＣＲ技術を用い、精製されたＤＮＡ断片を基に１塩基ずつ長さの異なるＤＮＡ断片を作成する。この工程で、４種類の塩基に応じた４種類の標識をＤＮＡ断片に付加する。
（５）（４）の反応産物を精製する。
（６）電気泳動法により、１塩基ずつ長さの異なるＤＮＡ断片を分子量の大きさにより分離し、蛍光を検出することでＤＮＡの塩基配列を決定する。
上記のような方法はクローニングを必要とするが、一度にクローニングできるＤＮＡ断片の長さは、数千から数万塩基対である。従って、例えば、約３０億塩基対のヒトの全ゲノムの塩基配列を決定するためには、最低でも１０万回程度のクローニングが必要である。
このように、従来から用いられているＤＮＡの塩基配列決定方法では、ＤＮＡの塩基配列を決定するために大変な労力と時間、それに莫大な費用が必要であるという問題があった。特に、高等生物のゲノム情報は数十億塩基対にものぼるため、例えば、ヒト１人分の全ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定するためには、国家的なプロジェクトが必要であった。
（１）細胞から抽出したＤＮＡを断片化し、遺伝子組換え技術などを用いて大腸菌などにＤＮＡ断片を組み込む。
（２）大腸菌などを培養し、組み込まれたＤＮＡ断片を増幅する（クローニング）。
（３）大腸菌などを溶解し、組み込まれたＤＮＡ断片を生化学的に分離し、純度の高いＤＮＡ精製を行う。
（４）ＰＣＲ技術を用い、精製されたＤＮＡ断片を基に１塩基ずつ長さの異なるＤＮＡ断片を作成する。この工程で、４種類の塩基に応じた４種類の標識をＤＮＡ断片に付加する。
（５）（４）の反応産物を精製する。
（６）電気泳動法により、１塩基ずつ長さの異なるＤＮＡ断片を分子量の大きさにより分離し、蛍光を検出することでＤＮＡの塩基配列を決定する。
上記のような方法はクローニングを必要とするが、一度にクローニングできるＤＮＡ断片の長さは、数千から数万塩基対である。従って、例えば、約３０億塩基対のヒトの全ゲノムの塩基配列を決定するためには、最低でも１０万回程度のクローニングが必要である。
このように、従来から用いられているＤＮＡの塩基配列決定方法では、ＤＮＡの塩基配列を決定するために大変な労力と時間、それに莫大な費用が必要であるという問題があった。特に、高等生物のゲノム情報は数十億塩基対にものぼるため、例えば、ヒト１人分の全ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定するためには、国家的なプロジェクトが必要であった。
このような状況下、煩雑な操作を必要とせず、短時間にＤＮＡの塩基配列を決定することができる方法の開発が望まれていた。また、クローニングを必要としないＤＮＡの塩基配列決定方法の開発が望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、一塩基突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブを用いることによって、細胞から抽出したＤＮＡの塩基配列を、クローニングすることなく決定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のようなＤＮＡの塩基配列決定方法、プローブ、ＤＮＡの塩基配列決定用キットなどを提供する。
（１） （ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する工程；
（ｂ）前記解析対象ＤＮＡと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定する工程；及び
（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する工程
を含む、ＤＮＡの塩基配列決定方法。
（２） 前記解析対象ＤＮＡの突出末端および前記プローブの突出末端が、いずれも一塩基突出末端である上記（１）記載の方法。
（３） 前記プローブが、それぞれＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）またはＧ（グアニン）に相補的な１塩基又は２塩基突出末端を有する４種のプローブを含む、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４） 前記プローブの制限酵素の認識配列と突出末端との距離が、前記制限酵素の認識配列と切断部位との距離より一塩基短い、上記（２）または（３）に記載の方法。
（５） 前記各工程が連鎖反応で行われる、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記識別標識が、蛍光標識、量子ドット又は金属コロイドである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 前記識別標識の種類の同定が、１分子観察で行われる上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８） 前記識別標識の種類の同定が、前記蛍光標識の蛍光波長の検出により行われる上記（６）記載の方法。
（９） 前記蛍光波長の検出が、１分子蛍光分光顕微鏡を用いて行われる上記（８）記載の方法。
（１０） 同時に複数の解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定する、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１） 前記制限酵素が、１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２） 前記酵素が、クラスＩＩＳ制限酵素である、上記（１１）記載の方法。
（１３） 前記解析対象ＤＮＡの突出末端と、前記プローブの突出末端が、いずれも３’突出末端である上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記制限酵素が、３’末端に１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５） 前記酵素が、ＢｍｒＩ、ＢｍｕＩ、ＢｆｉＩ、ＡｓｕＨＰＩ、ＨｐｈＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＮｃｕＩ、ＭｎｌＩ、Ａｓｐ２６ＨＩ、Ａｓｐ２７ＨＩ、Ａｓｐ３５ＨＩ、Ａｓｐ３６ＨＩ、Ａｓｐ４０ＨＩ、Ａｓｐ５０ＨＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｇＩ、ＢｍａＨＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓｃＣＩ、Ｂｓｅ１Ｉ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＫＴ５Ｉ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＳＩ、Ｂｓｔ１１Ｉ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＣＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｓｔＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｔｓｐ１Ｉ、ＴｓｐＤＴＩおよびＴｓｐＧＷＩから選択される、上記（１４）記載の方法。
（１６） 前記解析対象ＤＮＡの突出末端と、前記プローブの突出末端が、いずれも５’突出末端である上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１７） 前記制限酵素が、５’末端に１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、上記（１）〜（１２）および（１６）のいずれか記載の方法。
（１８） 前記酵素が、ＡｃｌＷＩ、ＡｌｗＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｔＨ９Ｉ、Ｂｓｔ３１ＴＩ、ＥａｃＩ、ＢｃｃＩ、ＨｐｙＣ１Ｉ、ＢｃｅｆＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｓＩ、ＡｃｉＩ、ＢｃｅＡＩ、Ｂｍｅ５８５Ｉ、ＢｓｃＡＩ、Ｂｓｔ１９Ｉ、ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ、ＦａｕＩ、ＳｍｕＩおよびＳｓｉＩから選択される、上記（１７）記載の方法。
（１９） 前記基材が、光透過性を有する材料から形成されている上記（１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０） 突出末端を有し、該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ。
（２１） 前記突出末端が、１塩基又は２塩基突出末端である上記（２０）記載のプローブ。
（２２） 前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、前記認識配列と前記切断部位との距離より一塩基短い、上記（２１）記載のプローブ。
（２３） 前記突出末端が、３’突出末端である上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のプローブ。
（２４） 前記突出末端が、５’突出末端である上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のプローブ。
（２５） 前記認識配列が、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列である、上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載のプローブ。
（２６） 上記（２０）〜（２５）のいずれかに記載のプローブを含む、ＤＮＡの塩基配列決定用キット。
（２７） 前記プローブが、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧに相補的な１塩基又は２塩基突出末端を有する少なくとも４種のプローブを含む、上記（２６）記載のキット。
（２８） さらに、制限酵素およびＤＮＡ連結酵素を含む、上記（２６）または（２７）に記載のキット。
（２９） （ｉ）測定セル；（ｉｉ）光学手段；（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段；および（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段を備える、ＤＮＡの塩基配列決定装置であって、前記測定セルは、（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する手段；及び（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する手段を備える装置。
本発明は次のような効果を奏する。
（１）ＤＮＡの塩基配列決定を極めて迅速に行うことができる。
（２）細胞から抽出したＤＮＡを直接観察できる。つまり、後述のように、クローニングが必要がでない。
（３）比較的小型かつ単純な装置で実現できる。
（１）と（２）の特徴から、全ゲノム塩基配列の決定に要する時間を大幅に短縮し、ゲノム生物学、遺伝学、医学、薬理学など、様々な領域に革命的変革をもたらすことができる。また、（２）と（３）の特徴から、臨床分野での幅広い応用も考えられる。たとえば、遺伝子が関わる疾患（例えば、遺伝子の変異、多型（例えば、ＳＮＰｓなど）などが関わる疾患）においては、患者１人１人のゲノム情報に応じたテーラーメード医療へ利用することができる。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、一塩基突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブを用いることによって、細胞から抽出したＤＮＡの塩基配列を、クローニングすることなく決定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のようなＤＮＡの塩基配列決定方法、プローブ、ＤＮＡの塩基配列決定用キットなどを提供する。
（１） （ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する工程；
（ｂ）前記解析対象ＤＮＡと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定する工程；及び
（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する工程
を含む、ＤＮＡの塩基配列決定方法。
（２） 前記解析対象ＤＮＡの突出末端および前記プローブの突出末端が、いずれも一塩基突出末端である上記（１）記載の方法。
（３） 前記プローブが、それぞれＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）またはＧ（グアニン）に相補的な１塩基又は２塩基突出末端を有する４種のプローブを含む、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４） 前記プローブの制限酵素の認識配列と突出末端との距離が、前記制限酵素の認識配列と切断部位との距離より一塩基短い、上記（２）または（３）に記載の方法。
（５） 前記各工程が連鎖反応で行われる、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記識別標識が、蛍光標識、量子ドット又は金属コロイドである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 前記識別標識の種類の同定が、１分子観察で行われる上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８） 前記識別標識の種類の同定が、前記蛍光標識の蛍光波長の検出により行われる上記（６）記載の方法。
（９） 前記蛍光波長の検出が、１分子蛍光分光顕微鏡を用いて行われる上記（８）記載の方法。
（１０） 同時に複数の解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定する、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１） 前記制限酵素が、１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２） 前記酵素が、クラスＩＩＳ制限酵素である、上記（１１）記載の方法。
（１３） 前記解析対象ＤＮＡの突出末端と、前記プローブの突出末端が、いずれも３’突出末端である上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記制限酵素が、３’末端に１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５） 前記酵素が、ＢｍｒＩ、ＢｍｕＩ、ＢｆｉＩ、ＡｓｕＨＰＩ、ＨｐｈＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＮｃｕＩ、ＭｎｌＩ、Ａｓｐ２６ＨＩ、Ａｓｐ２７ＨＩ、Ａｓｐ３５ＨＩ、Ａｓｐ３６ＨＩ、Ａｓｐ４０ＨＩ、Ａｓｐ５０ＨＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｇＩ、ＢｍａＨＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓｃＣＩ、Ｂｓｅ１Ｉ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＫＴ５Ｉ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＳＩ、Ｂｓｔ１１Ｉ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＣＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｓｔＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｔｓｐ１Ｉ、ＴｓｐＤＴＩおよびＴｓｐＧＷＩから選択される、上記（１４）記載の方法。
（１６） 前記解析対象ＤＮＡの突出末端と、前記プローブの突出末端が、いずれも５’突出末端である上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１７） 前記制限酵素が、５’末端に１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、上記（１）〜（１２）および（１６）のいずれか記載の方法。
（１８） 前記酵素が、ＡｃｌＷＩ、ＡｌｗＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｔＨ９Ｉ、Ｂｓｔ３１ＴＩ、ＥａｃＩ、ＢｃｃＩ、ＨｐｙＣ１Ｉ、ＢｃｅｆＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｓＩ、ＡｃｉＩ、ＢｃｅＡＩ、Ｂｍｅ５８５Ｉ、ＢｓｃＡＩ、Ｂｓｔ１９Ｉ、ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ、ＦａｕＩ、ＳｍｕＩおよびＳｓｉＩから選択される、上記（１７）記載の方法。
（１９） 前記基材が、光透過性を有する材料から形成されている上記（１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０） 突出末端を有し、該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ。
（２１） 前記突出末端が、１塩基又は２塩基突出末端である上記（２０）記載のプローブ。
（２２） 前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、前記認識配列と前記切断部位との距離より一塩基短い、上記（２１）記載のプローブ。
（２３） 前記突出末端が、３’突出末端である上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のプローブ。
（２４） 前記突出末端が、５’突出末端である上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のプローブ。
（２５） 前記認識配列が、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列である、上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載のプローブ。
（２６） 上記（２０）〜（２５）のいずれかに記載のプローブを含む、ＤＮＡの塩基配列決定用キット。
（２７） 前記プローブが、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧに相補的な１塩基又は２塩基突出末端を有する少なくとも４種のプローブを含む、上記（２６）記載のキット。
（２８） さらに、制限酵素およびＤＮＡ連結酵素を含む、上記（２６）または（２７）に記載のキット。
（２９） （ｉ）測定セル；（ｉｉ）光学手段；（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段；および（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段を備える、ＤＮＡの塩基配列決定装置であって、前記測定セルは、（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する手段；及び（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する手段を備える装置。
本発明は次のような効果を奏する。
（１）ＤＮＡの塩基配列決定を極めて迅速に行うことができる。
（２）細胞から抽出したＤＮＡを直接観察できる。つまり、後述のように、クローニングが必要がでない。
（３）比較的小型かつ単純な装置で実現できる。
（１）と（２）の特徴から、全ゲノム塩基配列の決定に要する時間を大幅に短縮し、ゲノム生物学、遺伝学、医学、薬理学など、様々な領域に革命的変革をもたらすことができる。また、（２）と（３）の特徴から、臨床分野での幅広い応用も考えられる。たとえば、遺伝子が関わる疾患（例えば、遺伝子の変異、多型（例えば、ＳＮＰｓなど）などが関わる疾患）においては、患者１人１人のゲノム情報に応じたテーラーメード医療へ利用することができる。
図１は、本発明の１つの実施態様を説明するための概略図である。
図２は、蛍光標識の同定方法などを説明するための概略図である。
図３は、実施例１で用いた、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡの構造を示す図である。
図４は、実施例１における解析対象ＤＮＡを結合させたビーズの観察結果を示す図である。
図５は、実施例２で用いた、量子ドット・ＤＮＡプローブと、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡの構造を示す図である。
図６は、実施例２における量子ドット・ＤＮＡプローブの観察装置と観察結果を示す図である。
図７は、実施例３における解析対象ＤＮＡと連結された量子ドットプローブの観察結果を示す図である。（２）は、（１）の一部を拡大した画像を示す図である。（３）は、（２）の同じ箇所の連続シーケンスを並べた画像を示す図である。
図２は、蛍光標識の同定方法などを説明するための概略図である。
図３は、実施例１で用いた、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡの構造を示す図である。
図４は、実施例１における解析対象ＤＮＡを結合させたビーズの観察結果を示す図である。
図５は、実施例２で用いた、量子ドット・ＤＮＡプローブと、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡの構造を示す図である。
図６は、実施例２における量子ドット・ＤＮＡプローブの観察装置と観察結果を示す図である。
図７は、実施例３における解析対象ＤＮＡと連結された量子ドットプローブの観察結果を示す図である。（２）は、（１）の一部を拡大した画像を示す図である。（３）は、（２）の同じ箇所の連続シーケンスを並べた画像を示す図である。
本発明は、一塩基突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ、前記プローブを用いたＤＮＡの塩基配列決定方法、前記プローブを含有するＤＮＡの塩基配列決定用キットなどに関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＤＮＡの塩基配列決定方法
本発明の第１の態様は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する、ＤＮＡの塩基配列決定方法に関する。
（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する工程；
（ｂ）前記解析対象ＤＮＡと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定する工程；
（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する工程。
以下、各工程の詳細について説明する。
（１）工程（ａ）：解析対象ＤＮＡとプローブとのＤＮＡ連結酵素による連結
工程（ａ）は、解析対象ＤＮＡとプローブをＤＮＡ連結酵素で連結する工程である。
（解析対象ＤＮＡ）
解析対象となるＤＮＡは、特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ由来であってもよく、ｃＤＮＡ由来であってもよい。本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法は、１分子のＤＮＡの塩基配列を、クローニングすることなく決定することができるので、細胞から抽出したゲノムＤＮＡの塩基配列を決定するのに特に好ましく用いることができる。すなわち、解析対象ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを好ましく用いることができる。
解析対象ＤＮＡの長さには特に制限はないが、通常１〜５０００塩基、好ましくは２〜１０００塩基、より好ましくは５〜５００塩基、特に好ましくは１０〜１００塩基である。
本発明の解析対象ＤＮＡの調製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。具体的には、例えば、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを用いる場合には、まず、解析対象となる生物の組織、細胞からＤＮＡを抽出・精製してゲノムＤＮＡを調製する。次に、ゲノムＤＮＡを制限酵素などを用いて切断してＤＮＡ断片を調製する。このようにして得られたＤＮＡ断片を、クローニングすることなく本発明の解析対象ＤＮＡとして用いることができる。
解析対象ＤＮＡは基材に固定化される。基材は、塩基配列決定を阻害しないものであればよく、特に制限はない。基材としては、生体分子を固定する基材となるものを用いることができ、例えば、ガラス基板、石英ガラス基板、石英基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、石英ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。複数の解析対象ＤＮＡを固定化し、同時に複数の解析対象ＤＮＡの塩基配列決定を行うためには、基材は板状であるのが好ましく、例えば、ガラス基板、石英ガラス基板、シリコン基板、アルミ基板、光透過性単結晶基板（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２）などが挙げられる。後述するプローブの識別標識に蛍光物質を用いる場合には、基材としては光透過性を有するものが好ましく、さらに光透過性を有する板状のものが好ましく、特に、ガラス基板、石英ガラス基板、シリコン基板、光透過性単結晶基板（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２）が好ましく、なかでもガラス基板が好ましい。
解析対象ＤＮＡを基材に固定化する手段は、解析対象ＤＮＡの塩基配列決定に障害とならない手段であればよく、直接的に、または間接的に固定化する手段を用いることができる。好ましくは、解析対象ＤＮＡと基材に設けられた結合部分を使用することによって間接的に固定化することができる。このような結合部分としては、親和性結合を形成する物質の組合せや、架橋剤などを利用した化学結合を用いることができる。親和性結合を形成する物質の組合せとしては、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン／ビオチン、抗体または抗体断片／抗原分子（エピトープ）などの組合せが挙げられ、アビジンまたはストレプトアビジン／ビオチンの組合せが好ましく用いられる。このような親和性結合を形成する物質の組合せを用いる場合、組合せの一方の物質が基材に結合され（または本来的にその一部である）、もう一方の物質が解析対象ＤＮＡに結合される。好ましくは、アビジンまたはストレプトアビジンが基材に結合され（または本来的にその一部である）、ビオチンが解析対象ＤＮＡに結合される。これらを接触させることにより、アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとが親和性結合を形成し、解析対象ＤＮＡが基材に固定化される。
解析対象ＤＮＡを基材に固定化する部位は、解析対象ＤＮＡの塩基配列決定を阻害しない部位であればよく、特に制限はないが、突出末端（すなわちプローブが連結される末端）とは反対の末端であるのが好ましい。
基材に固定化する解析対象ＤＮＡの数は、特に制限はない。本発明においては、例えば、１〜約１００、約１００〜約１０００、約１０００〜約１０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約５０，０００〜約１００，０００、約１００，０００〜約５００，０００の解析対象ＤＮＡを基材に固定化して処理することができる。迅速に塩基配列を決定するという観点からは、基材に固定化する解析対象ＤＮＡの数は、１００以上であるのが好ましい。
解析対象ＤＮＡの固定化されない末端には、突出末端が形成されている。突出末端は、用いられるプローブが連結できるように形成される。具体的には、３’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も３’突出末端とされる。５’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も５’突出末端とされる。１塩基突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も１塩基突出末端とされる。プローブが２塩基突出またはそれ以上である場合には、解析対象ＤＮＡも、これに対応して、２塩基突出またはそれ以上とされる。より具体的には、１塩基突出の３’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も１塩基突出の３’突出末端とされる。１塩基突出の５’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も１塩基突出の５’突出末端とされる。
このような突出末端は、適切な制限酵素を用いて形成することができる。例えば、解析対象ＤＮＡ中に、後で詳述する工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列が含まれている場合には、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列と同じ配列を認識する制限酵素を用いて突出末端を形成することができ、工程（ｃ）で用いる制限酵素によって突出末端を形成してもよい。解析対象ＤＮＡの突出末端の形成は、好ましくは解析対象ＤＮＡを基材に固定化した後に行われる。
なお、解析対象ＤＮＡ中に、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列が含まれていると、工程（ｃ）において、制限酵素がその認識配列を認識して解析対象ＤＮＡを切断してしまうため、塩基配列決定の障害となる。そこで、工程（ａ）を行う前に、あらかじめ工程（ｃ）で用いる制限酵素によって処理するなど、前記した解析対象ＤＮＡの切断を回避する処理を行うことが好ましい。
（プローブ）
本発明のプローブは、突出末端と、該突出末端の塩基の種類に応じた識別標識と、制限酵素の認識配列を含有している。本発明のプローブは、２つの１本鎖ＤＮＡをアニーリングさせたプローブ（本明細書において「２分子性のプローブ」と称することもある。）であってもよく、１つの１本鎖ＤＮＡを分子内でアニーリングさせた、ヘアピン構造を有するプローブ（本明細書において「１分子性のプローブ」と称することもある。）であってもよい。２分子性のプローブとしては、突出末端または制限酵素の切断部位側の末端とは反対側の末端が標識されているものが好ましい。プローブの末端が標識されている場合、標識される末端は５’末端または３’末端のいずれでもよい。１分子性のプローブとしては、ヘアピン構造部分が標識されているものが好ましい。
用いられるプローブの突出末端は、解析対象ＤＮＡの突出末端と、突出末端の鎖（５’または３’）および突出末端の塩基数が同じであるものである。具体的には、例えば、解析対象ＤＮＡの突出末端が１塩基突出の３’突出末端である場合には、１塩基突出の３’突出末端を有するプローブが用いられる。解析対象ＤＮＡの突出末端が１塩基突出の５’突出末端である場合には、１塩基突出の５’突出末端を有するプローブが用いられる。用いられるプローブの突出末端の塩基は、解析対象となるＤＮＡの突出末端を形成し得る塩基に相補的な塩基である。具体的には、突出末端が１塩基突出末端である場合には、例えば、突出末端の塩基が、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）である４種のプローブが用いられる。突出末端が２塩基突出末端である場合には、例えば、突出末端の塩基が、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣまたはＧＧである１６種のプローブが用いられる。突出する塩基数が増えると、用いられるプローブの種類が多くなり、各プローブの識別標識および識別が困難になる傾向があるので、突出末端は１または２塩基突出末端であるのが好ましく、特に１塩基突出末端であるのが好ましい。もしくは、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを４種類用意し、１塩基ずつ読むことも可能である。このようなプローブとしては、末端側がＮであるプローブ（すなわち、左側を末端としてＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣ）、末端側がＡ、Ｔ、ＧまたはＣであるプローブ（すなわち、左側を末端として、ＡＮ、ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ）が挙げられるが、末端側がＮであるのが、解析対象ＤＮＡの塩基配列を末端から決定できる点で好ましい。ここで、Ｎは、プローブを形成するオリゴＤＮＡ合成の際に、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）が混合されたものを取り込ませた塩基部位を表し、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）が同比率で混合されたものを取り込ませたものが好ましい。すなわち、Ｎの部位にはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）のいずれかの塩基が同確率で存在するのが好ましい。
ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣに代えて、ＮＮＡ、ＮＮＴ、ＮＮＧ、ＮＮＣなどの３塩基突出末端を持つプローブ、ＮＮＮＡ、ＮＮＮＴ、ＮＮＮＧ、ＮＮＮＣなどの４塩基突出末端を持つプローブなど、３塩基以上の突出末端を有するプローブも好ましく用いることができる。このような３塩基以上の突出末端を有するプローブは、アニーリングの効率が良いという点で好ましい。もっとも、あまり突出末端の塩基数が多くなると、誤アニーリングする可能性が高くなる傾向がある。よって、アニーリング効率と誤アニーリング回避という点からは、３〜５塩基突出末端を有するプローブが好ましく、特に４塩基突出末端を有するプローブが好ましい。
識別標識に用いられる標識物質としては、前記突出末端の塩基の識別することができる標識物質であればよい。標識物質としては、例えば、蛍光物質、化学発光物質、偏光の変化を測定し得る標識物質などの各種標識物質を使用することができ、なかでも蛍光物質が好ましく用いられる。本発明で用いられる蛍光物質は、当該蛍光物質で標識されていることが検出可能なものであればよく、特に制限はない。蛍光物質としては、核酸の標識に用いられている蛍光物質を用いることができ、例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ｘ−ローダミン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７４９、アクリジンイエロー、テキサスレッド、量子ドット、蛍光ビーズ、ＴｒａｎｓＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ビーズ、金属コロイドなどが挙げられる。量子ドットとしては、例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、 Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓなど（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の量子ドットなどが挙げられる。なお、解析対象ＤＮＡの長さが長い場合には、解析に要する時間が長くなるので、特に退色しにくい蛍光物質を用いるのが好ましい。また、蛍光色素に応じて退色防止剤を用いるのが好ましい。
プローブは、突出末端の塩基の種類を識別できるように、当該突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な標識物質を用いて標識される。具体的には、突出末端が１塩基突出末端である場合には、例えば、それぞれＤＮＡの４種類の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）に相補的な１塩基突出末端を有する４種のプローブを、互いに識別可能な４種類の標識物質を用いて標識する。突出末端が２塩基突出末端である場合には、それぞれＤＮＡの２塩基突出末端の塩基の種類に相補的な２塩基突出末端を有する１６種のプローブを、互いに識別可能な１６種類の識別物質を用いて標識すればよい。プローブの突出末端が３塩基以上突出している場合も、当該突出末端の塩基の種類ごとに互いに識別可能な標識物質を用いて標識すればよい。プローブの標識は、化学修飾など公知の方法によって、直接的または間接的に行うことができる。
プローブに含まれる制限酵素の認識配列は、後で詳述する工程（ｃ）で用いられる制限酵素（認識配列と切断部位とが離れている制限酵素）の種類に応じた塩基配列を有している。ここで、工程（ｃ）で用いられる制限酵素は、用いられるプローブの突出末端と、突出末端の鎖（５’または３’）および突出末端の塩基数が同じである突出末端を形成する切断部位を有する制限酵素である。具体的には、例えば、プローブの突出末端が１塩基突出の３’突出末端である場合には、３’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。プローブの突出末端が、１塩基突出の５’突出末端である場合には、５’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。
認識配列と突出末端の距離は、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列と切断部位の距離より、工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数だけ短い。したがって、突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数と工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数とが等しい場合には、認識配列と突出末端の距離は、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列と切断部位の距離より、当該突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数だけ短くなっている。具体的には、例えば、突出末端が１塩基突出末端である場合には、工程（ｂ）で一度に決定される塩基数も１塩基であるので、認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より１塩基短い。また、例えば、突出末端が２塩基突出末端であり、２塩基ずつ配列を決定する場合には、認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より２塩基短い。これに対し、突出末端が２塩基突出末端であっても、例えば、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを用いて１塩基ずつ配列を決定する場合には、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より１塩基短いものが用いられる。
また、１塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より２塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を２塩基ごと（１塩基とばし）に解析することもできる。
さらに、例えば、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より２塩基短い（すなわち、突出末端の塩基数と同じ塩基数だけ短い）プローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を２塩基ごと（１塩基とばし）に解析することもできる。
同様にして、例えば、ＮＮＮＡ、ＮＮＮＴ、ＮＮＮＧ、ＮＮＮＣの４塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より４塩基短い（すなわち、突出末端の塩基数と同じ塩基数だけ短い）プローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を４塩基ごと（３塩基とばし）に解析することもできる。認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より３または２塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を３または２塩基ごとに解析することもできる。認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より５または６塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を５または６塩基ごとに解析することもできる。このようにして、ｎ（ｎは１以上の整数を表す）塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離よりｍ（ｍは２以上の整数を表す）塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基をｍ塩基ごと（ｍ−１塩基とばし）に解析することができる。以上のように、解析対象ＤＮＡ中の塩基を２塩基以上ごとに解析した場合には、塩基配列データベースに対して参照を行うことにより、該解析対象ＤＮＡを同定すること（すなわち、解析対象ＤＮＡがどのような遺伝子であるかを決定すること）ができる。
プローブの長さは、３００塩基以下であることが好ましい。好ましくは、少なくとも８塩基対、少なくとも９塩基対、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対または少なくとも２０塩基対である。また、プローブの長さは、好ましくは、１００塩基対以下、８０塩基対以下、６０塩基対以下、５０塩基対以下、４０塩基対以下、３５塩基対以下、３０塩基対以下、２５塩基対以下、２４塩基対以下、２３塩基対以下、２２塩基対以下、２１塩基対以下、２０塩基対以下、１９塩基対以下、１８塩基対以下、１７塩基対以下、１６塩基対以下、１５塩基対以下、１４塩基対以下、１３塩基対以下、１２塩基対以下、１１塩基対以下または１０塩基対以下である。
本発明のプローブは、化学合成法など公知の方法に従って合成することができる。
（ＤＮＡ連結酵素による連結）
工程（ａ）では、解析対象ＤＮＡとプローブとがＤＮＡ連結酵素によって連結される。解析対象ＤＮＡと、プローブと、ＤＮＡ連結酵素とを反応させると、解析対象ＤＮＡと、突出末端の塩基が解析対象となるＤＮＡの突出末端の塩基に相補的であるプローブ（相補的なプローブと称することがある）が連結される。用いられるＤＮＡ連結酵素は、突出末端を有するＤＮＡ断片を連結できるものであればよく、特に制限はない。ＤＮＡ連結酵素としては、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、ＴＴＨ ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。
（２）工程（ｂ）：解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの識別標識の種類の同定
工程（ｂ）は、工程（ａ）において解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの識別標識の種類を同定する工程である。
上述したように、プローブは、その突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な標識物質を用いて標識（識別標識）されているので、該識別標識の種類を同定することによって、プローブの突出末端の塩基の種類を同定することができる。さらに、プローブの突出末端の塩基は、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基と相補的であるので、プローブの突出末端の塩基を同定することによって、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基の種類を同定することができる。このようにして、解析対象ＤＮＡとプローブの突出末端が３’突出末端である場合には解析対象ＤＮＡの３’末端の塩基が同定され、解析対象ＤＮＡとプローブの突出末端が５’突出末端である場合には、解析対象ＤＮＡの５’末端の塩基が同定される。
識別標識の種類の同定には、用いられている標識物質に応じて得られる信号を検出し、標識物質の種類を同定することができる方法が用いられる。このような識別標識の種類の同定方法としては、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブと、解析対象ＤＮＡと連結されていない（フリーの）プローブを区別できる方法が好ましい。解析対象ＤＮＡと連結されたプローブと、フリーのプローブを区別できる方法としては、例えば、１分子観察による方法が挙げられる。１分子観察によれば、ガラス表面に固定されたプローブのみが輝点として、フリーなプローブは弱い一様なバックグラウンドノイズとしてそれぞれ検出されるため、連結したプローブとフリーなプローブとを区別することが出来る。具体的には、例えば、標識標識が蛍光標識である場合には、蛍光標識の種類の同定には、蛍光標識の蛍光波長を検出し、蛍光標識の種類を同定する方法、例えば、蛍光分光分析法が用いられる。さらに、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブとフリーのプローブを区別できる方法としては、例えば、１分子蛍光分光分析法が用いられる。１分子蛍光分光分析は、例えば、１分子蛍光分光顕微鏡、市販の１分子蛍光分析システム（例えば、ＭＳ２０（オリンパス株式会社製）など）、プリズムや回折格子を用いた分光光学系、複数のＣＣＤカメラとフィルターを組み合わせたシステム、高速フィルター切り替え装置、３ＣＣＤカメラ、単板カラーＣＣＤカメラ、デジタルＣＣＤカメラ（例えば、ＥＭ−ＣＣＤカメラなど）、Ｑｕａｄ−ＶｉｅｗＴＭ（Ｒｏｐｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｄｕａｌ−ＶｉｅｗＴＭ（Ｒｏｐｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｄｕａｌ−ＣａｍＴＭ（Ｒｏｐｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）やＤｏｕｂｌｅ−Ｖｉｅｗなどを使用して行うことができる。本発明で用いられる１分子蛍光分光分析法としては、例えば、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（例えば、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１３，２９−６１（１９７４）など参照）、蛍光強度多分布解析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（例えば、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７９，２８５８−２８６６（２０００）、特表２００１−５０２０６２号公報、特表２００１−５１８３０７号公報、特表２００２−５０５７４２号公報など参照）などが挙げられる。
蛍光標識の励起に使用する光源としては、水銀ランプ、キセノンランプなどのアーク光源、ＬＥＤ、Ａｒレーザー、ＨｅＮｅレーザー、ＬＤレーザー、ＨｅＣｄレーザー、ＮｄＹＡＧレーザー、ＫｒＡｒレーザーなどのレーザー光源など、公知の光源を使用することができる。光源の波長は、用いられる蛍光標識の励起波長に応じて選択される。アーク光源など、広い波長領域を有する光源を用いる場合には、用いられる蛍光標識の励起波長に応じたバンドパスフィルターを使用するのが好ましい。バンドパスフィルターとしては、例えば、誘電体バンドパスフィルター、金属バンドパスフィルターなどが挙げられる。アーク光源など、広い波長領域を有する光源は、バンドパスフィルターを適宜選択することによって、蛍光標識に応じた励起光を容易に選択することができる点で好ましく用いることができる。
蛍光を検出する際には、蛍光と、励起光、散乱光などの蛍光以外の光を分離することにより、背景光を低減させて観察するのが好ましい。このような、蛍光とその他の光（励起光、散乱光など）の分離は、ダイクロイックミラー、吸収フィルターなどを用いて行うことができる。ダイクロイックミラーとしては、蛍光標識の励起波長および蛍光波長に応じて、励起光を反射し、蛍光を透過するような波長特性のものを選択すればよい。吸収フィルターとしては、蛍光を透過し、散乱光などを吸収するようなものを選択すればよい。
蛍光標識の蛍光を検出するための検出器としては、例えばＣＣＤカメラが挙げられる。ノイズ低減の観点から、冷却ＣＣＤカメラが好ましく用いられる。ＣＣＤカメラを用いて蛍光を検出する場合には、プリズムなどの分光素子を用いて蛍光のスペクトルを得ることが、蛍光標識を識別する上で好ましい。
上記のようにして得られた画像を、市販の画像解析ソフトウェア、例えばＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などを使用して解析してもよい。
（３）工程（ｃ）：解析対象ＤＮＡとプローブとの連結体の制限酵素による切断
工程（ｃ）は、工程（ａ）において連結された解析対象ＤＮＡとプローブとの連結体を、制限酵素で切断する工程である。上述したように、プローブの認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より短いので、解析対象ＤＮＡとプローブとが連結されることによって、解析対象ＤＮＡ上に切断部位が出現することになる。具体的には、例えば、解析対象ＤＮＡとプローブの突出末端が１塩基突出末端である場合には、プローブの認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より１塩基短くなっているので、解析対象ＤＮＡとプローブが連結されると解析対象ＤＮＡの末端から１番目と２番目の塩基の間に切断部位が出現する。この解析対象ＤＮＡとプローブの連結体が制限酵素で切断されることによって、解析対象ＤＮＡの末端の１塩基が削られ、新たな１塩基突出末端が生成される。
本発明で用いられる制限酵素は、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素であり、かつ突出末端を生成するものである。生成される突出末端は、３’突出末端でもよく、５’突出末端でもよい。また、突出する塩基数としては、特に制限はないが、生成される突出末端は、突出末端は１または２塩基突出末端であるのが好ましく、特に１塩基突出末端であるのが好ましい。このような制限酵素は、例えば、クラスＩＩＳ制限酵素から選択される。具体的には、例えば、１塩基突出の３’突出末端を生成する制限酵素としては、ＢｍｒＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｆｉＩ、ＢｍｕＩなど）、ＡｓｕＨＰＩ及びそのアイソシゾマー（例えば、ＨｐｈＩなど）、ＢｃｉＶＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｆｕＩなど）、ＨｐｙＡＶおよびそのアイソシゾマー、ＭｂｏＩＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＮｃｕＩなど）、ＭｎｌＩおよびそのアイソシゾマーなどが挙げられ、、なかでもＢｍｒＩ、ＢｃｉＶＩ、ＭｂｏＩＩ、ＨｐｈＩが好ましく、特にＢｍｒＩが好ましい。１塩基突出の５’突出末端を生成する制限酵素としては、ＡｃｌＷＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＡｌｗＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｔＨ９Ｉ、Ｂｓｔ３１ＴＩ、ＥａｃＩなど）、ＢｃｃＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＨｐｙＣ１Ｉなど）、ＢｃｅｆＩおよびそのアイソシゾマー、ＰｌｅＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＰｐｓＩなど）などが挙げられ、なかでもＡｌｗＩ、ＰｌｅＩ、ＢｃｅｆＩ、ＨｐｙＣ１Ｉが好ましく、特にＡｌｗＩ、ＰｌｅＩが好ましい。
２塩基突出の３’突出末端を生成する制限酵素としては、例えば、ＡｃｉＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＳｓｉＩなど）、ＢｃｅＡＩおよびそのアイソシゾマー、Ｂｍｅ５８５Ｉおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ、ＦａｕＩ、ＳｍｕＩなど）、ＢｓｃＡＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、Ｂｓｔ１９Ｉなど）などが挙げられる。２塩基突出の５’突出末端を生成する制限酵素としては、例えば、Ａｓｐ２６ＨＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、Ａｓｐ２７ＨＩ、Ａｓｐ３５ＨＩ、Ａｓｐ３６ＨＩ、Ａｓｐ４０ＨＩ、Ａｓｐ５０ＨＩ、ＢｍａＨＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓｃＣＩ、ＢｓｍＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩなど）、Ｂｃｅ８３Ｉおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｐｕＥＩなど）、ＢｃｇＩおよびそのアイソシゾマー、ＢｐｍＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＧｓｕＩなど）、Ｂｓｅ１Ｉおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＳＩ、Ｂｓｔ１１Ｉ、Ｔｓｐ１Ｉなど）、Ｂｓｅ３ＤＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｒＤＩなど）、ＢｓｅＧＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＣＩなど）、ＢｓｇＩおよびそのアイソシゾマー、ＢｓｐＫＴ５Ｉおよびそのアイソシゾマー、ＢｔｓＩおよびそのアイソシゾマー、ＣｓｐＣＩおよびそのアイソシゾマー、ＣｓｔＭＩおよびそのアイソシゾマー、ＥｃｉＩおよびそのアイソシゾマー、Ｅｃｏ５７ＭＩおよびそのアイソシゾマー、ＴｓｐＤＴＩおよびそのアイソシゾマー、ＴｓｐＧＷＩおよびそのアイソシゾマーなどが挙げられる。
本発明で用いられる制限酵素は、工程（ａ）で用いられるプローブに対応して選択される。具体的には、工程（ａ）で用いられるプローブの突出末端と、突出末端の鎖（５’または３’）および突出末端の塩基数が同じである突出末端を形成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。具体的には、例えば、プローブの突出末端が１塩基突出の３’突出末端である場合には、３’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。プローブの突出末端が、１塩基突出の５’突出末端である場合には、５’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。さらに、用いられる制限酵素は、認識配列と切断部位の距離が、用いられるプローブの認識配列と突出末端の距離より工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数だけ長いものである。したがって、工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数と突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数とが等しい場合には、認識配列と切断部位の距離は、用いられるプローブの認識配列と突出末端の距離より、当該突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数だけ長いものである。具体的には、例えば、用いられるプローブの突出末端が１塩基突出末端である場合には、工程（ｂ）で一度に決定される塩基数も１塩基であるので、認識配列と切断部位の距離が、認識配列と突出末端の距離より１塩基長い制限酵素が用いられる。また、例えば、突出末端が２塩基突出末端であり、一度に決定される塩基数が２塩基である場合には、認識配列と切断部位の距離が、認識配列と突出末端の距離より２塩基長い制限酵素が用いられる。これに対し、突出末端が２塩基突出末端であっても、例えば、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを用いて１塩基ずつ配列を決定するような場合には、認識配列と切断部位が、認識配列と突出末端の距離の距離より１塩基長い制限酵素が用いられる。さらに、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを用いて２塩基ごとに解析対象ＤＮＡ中の塩基を解析する場合など、２塩基以上の突出末端を持つプローブを用いて２塩基以上ごとに塩基を解析する場合には、認識配列と切断部位の距離が認識配列と突出末端の距離より２塩基以上長い制限酵素が用いられる。
（４）解析対象ＤＮＡの塩基配列の決定
上述したように、工程（ａ）において解析対象ＤＮＡはプローブと連結され、工程（ｂ）において解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基が同定される。そして、工程（ｃ）において、解析対象ＤＮＡには新たな突出末端が生成される。このようにして、新たな突出末端が生成された解析対象ＤＮＡは、さらに工程（ａ）〜（ｃ）に供することができ、同様にして工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことができる。この工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、工程（ｃ）における制限酵素による切断が可能である限り行うことができる。このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しによって、解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基を順次同定することによって、解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定（または解析）することができる。具体的には、解析対象ＤＮＡの突出末端が３’突出末端である場合には、解析対象ＤＮＡの塩基配列を３’側から順次決定（または解析）することができる。解析対象ＤＮＡの突出末端が５’突出末端である場合には、解析対象ＤＮＡの塩基配列を５’側から順次決定することができる。また、解析対象ＤＮＡの突出末端が１塩基突出末端である場合には、１塩基ずつ決定していくことができる。
このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、（１）工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）の１または２反応を行った後に反応液を交換して行うこともでき、または（２）解析対象ＤＮＡと、プローブと、ＤＮＡ連結酵素と、制限酵素の共存下、連鎖反応で行うこともできる。工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、解析速度の観点からは、連鎖反応で行うのが好ましい。
前記（１）のように、工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）の１または２反応を行った後に反応液を交換して行う場合には、例えば、マイクロ流路と温度制御装置を組み合わせた系で、ポンプなどにより反応液を交換する方法により行うことができる。ＤＮＡ連結反応とＤＮＡ切断反応とでは反応至適条件が異なるため、それぞれの反応の至適条件となるように、反応条件を交互に変えて各反応を行ってもよい。
次に、本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法の１つの実施態様について、図１および図２に基づいて具体的に説明する。
まず、工程（ａ）の１つの実施態様について説明する。図１（１）に示されているように、解析対象ＤＮＡは、突出末端とは反対の末端が、アビジン／ビオチン結合を介して間接的に基材に固定化されている。解析対象ＤＮＡの上側の鎖は、左が５’末端であり、右が３’末端である。従って、解析対象ＤＮＡの突出末端は、１塩基突出の３’末端である。解析対象ＤＮＡの塩基は、３’突出末端の塩基から順に、第１塩基、第２塩基、第３塩基というように表されている。
プローブは、突出末端とは反対の末端が、突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な蛍光物質を用いて標識されている。具体的には、突出末端の塩基がＴであるプローブ１は、蛍光物質１で標識されている。同様に、突出末端の塩基がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇであるプローブ２、３、４は、それぞれ蛍光物質２、３、４で標識されている。プローブ１〜４の下側の鎖は、左が３’末端であり、右が５’末端である。従って、プローブの突出末端は、解析対象ＤＮＡと同様に、１塩基突出の３’末端である。プローブには、ＢｍｒＩ制限酵素の認識配列が含まれている。前記認識配列と突出末端の距離は、ＢｍｒＩ制限酵素の認識配列と切断部位の距離より１塩基短い。
解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基（第１塩基）はＡであるので、これに相補的なＴを突出末端に有するプローブ１が、ＤＮＡ連結酵素によって連結され、図１（２）に示されるような連結体が生成される。
次に、工程（ｂ）の１つの実施態様について説明する。工程（ａ）おいて生成した解析対象ＤＮＡとプローブ１との連結体（図１（２））を、蛍光分光分析法などを用いて分析することによって、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの蛍光標識（蛍光物質１）が同定される。このような蛍光標識の同定には、例えば、図２（１）に示されるような蛍光分光分析装置が用いられる。図２（１）の蛍光分光分析装置においては、光源から発せられた光から、バンドパスフィルターによって、蛍光物質の励起に必要な波長の光が抽出される。このようにして抽出された励起光は、ダイクロイックミラーによって反射され、サンプルに照射される。照射された励起光によって、プローブの蛍光標識は励起され、蛍光を発する。蛍光標識から発せられた蛍光は、ダイクロイックミラーを透過し、プリズムによって分光された後、冷却ＣＣＤによって観察される。なお、通常は蛍光顕微鏡などの拡大光学系を併用し、１分子蛍光分光分析を行う。１分子蛍光分光分析法によれば、ゆらぎの大きさなどから、解析対象ＤＮＡに連結されたプローブと、フリーのプローブを区別することができるので、１分子蛍光分光分析法を用いるのが好ましい。このようにして、例えば、図１（２）に示された解析対象ＤＮＡに連結されたプローブがプローブ１であることが同定される。さらに、解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基は、プローブ１の突出末端の塩基（Ｔ）に相補的な塩基（Ａ）と同定される。
サンプルとしては、例えば、図２（２）に示されるように、基材に複数の解析対象ＤＮＡが固定化されたものを用いることもできる。１分子蛍光分光分析法によれば、同時に多数（例えば、数百から数千）の蛍光を観察することもできるので、基材に複数の解析対象ＤＮＡを固定化したサンプルを用いることによって、同時に複数（例えば、数百から数千）の解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定することもできる。
次に、工程（ｃ）の１つの実施態様について説明する。上述したように、プローブの認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より１塩基短いので、解析対象ＤＮＡとプローブとが連結されることによって、解析対象ＤＮＡの第１塩基と第２塩基の間に切断部位が出現している（図１（２））。従って、この解析対象ＤＮＡとプローブ１との連結体をＢｒｍＩ制限酵素で切断すると、解析対象ＤＮＡの第１塩基がプローブ１に連結された状態で切断され、解析対象ＤＮＡは１塩基短く削られる。その結果、解析対象ＤＮＡには、第２塩基が突出した新たな１塩基突出末端が生成される（図１（３））。
このようにして生成された新たな１塩基突出末端（第２塩基（Ｃ））を有する解析対象ＤＮＡは、さらに工程（ａ）〜（ｃ）に供することができる。すなわち、第２塩基（Ｃ）が突出した解析対象ＤＮＡには、これに相補的なＧを突出末端に有するプローブ４がＤＮＡ連結酵素によって連結される（工程（ａ））。以下、上述したように、工程（ｂ）、工程（ｃ）を行うことができ、さらに同様にして工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことができる。このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、工程（ｃ）における制限酵素による切断が可能である限り行うことができる。このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しによって、解析対象ＤＮＡの塩基配列が、３’側から１塩基ずつ順次決定される。
２．プローブおよびＤＮＡの塩基配列決定用キット
また、本発明の別の態様は、突出末端を有し、該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ、および該プローブを含有するＤＮＡの塩基配列決定用キットに関する。
本発明のプローブとしては、前記と同様のものが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。例えば、前記突出末端が３’突出末端であるのものと、５’突出末端であるものが挙げられる。なかでも、前記突出末端が一塩基突出末端であるものが好ましい。また、前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、前記認識配列と塩基切断部位との距離より一塩基短いものが好ましい。また、前記認識配列が、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列であるものが好ましい。
本発明のＤＮＡの塩基配列決定用キットは、上述の工程（ａ）〜工程（ｃ）を含む方法により、ＤＮＡの塩基配列を決定するために用いられる。本発明のキットに含有されるプローブとしては、前記した本発明のプローブが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。特に、プローブとして、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧに相補的な１塩基突出末端を有する少なくとも４種のプローブを含むキットが好ましい。
本発明のキットには、さらに制限酵素を含んでいてもよい。本発明のキットに含まれる制限酵素としては、上述の工程（ｃ）で用いられる制限酵素、解析対象ＤＮＡに突出末端を形成するための制限酵素が挙げられる。このような制限酵素としては、前記と同様のものが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。
本発明のキットには、さらにＤＮＡ連結酵素を含んでいてもよい。ＤＮＡ連結酵素としては、前記と同様のものが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。
３．ＤＮＡの塩基配列決定装置
また、本発明の別の態様は、（ｉ）測定セル、（ｉｉ）光学手段、（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段、および（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段、を備えるＤＮＡの塩基配列決定装置であって、前記測定セルは、（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する手段；及び（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する手段を備える装置に関する。
本発明のＤＮＡの塩基配列決定装置においては、まず、（ｉ）測定セル内において、（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する反応が行われる。次に、（ｉｉ）光学手段によって、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの識別標識からの光学情報（例えば、色情報）を得る。得られた光学情報を（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段によって、プローブの識別標識を識別しうる識別信号（例えば、電気的信号）に変換する。この識別信号を（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段によって、塩基配列を得る。その後、（ｉ）測定セル内において、（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する反応が行われる。これに続いて、さらに上記の工程を繰り返すことにより、解析対象ＤＮＡの塩基配列を順次決定することができる。なお、上記各工程は、上述した本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法にしたがって行うことができる。
以下、各構成要素について説明する。
（ｉ）測定セル
測定セルは、解析対象ＤＮＡが固定化された基材と、プローブ、バッファー、制限酵素などを投入するための投入口と、それらを排出するための排出口とを備える。ここで、投入口と排出口とを別々に設ける必要はなく、投入と排出とを行うための投入・排出口を設けてもよい。測定セルの材料は、プローブの識別標識に蛍光物質、量子ドット、金属コロイドなどを用いる場合には、光透過性を有する材料が好ましく、さらに、ガラス、石英ガラス、シリコン、光透過性単結晶（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２）などが好ましい。測定セル自体を解析対象ＤＮＡを固定化する基材として用いてもよい。
（ｉｉ）光学手段
光学手段は、プローブの識別標識を識別しうる光学情報（例えば、色情報）を得ることができる光学系などで構成される。具体的には、例えば、標識標識が蛍光標識または量子ドットである場合に用いられる光学系としては、例えば、蛍光顕微鏡など、好ましくは、１分子蛍光分光顕微鏡などが挙げられる。本発明で用いられる光学手段は、プリズムや回折格子を用いた分光光学系、高速フィルター切り替え装置などを備えていてもよい。
（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段
光学情報（例えば、色情報など）を識別信号（例えば、電気的信号など）に変換する手段は、上記（ｉｉ）光学手段によって得られた、プローブの識別標識を識別しうる光学情報を、プローブの識別標識を識別しうる識別信号（例えば、電気的信号など）に変換する手段である。光学情報を識別信号に変換する手段としては、例えば、プローブの識別標識を識別しうる光学情報を、分光後、異なるＣＣＤまたは１つのＣＣＤの異なる画素に結像させ、結像部分にある画素からの輝度情報を基に、プローブの識別標識を識別しうる識別信号（例えば、電気的信号など）に変換する手段が挙げられる。なお、ＣＣＤとしては、通常、デジタルＣＣＤが用いられる。デジタルＣＣＤを用いた場合には、識別信号をデジタル信号として得ることができる。デジタル信号は、コンピュータによる処理に適しているので、下記（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段をコンピュータを用いて自動化する上で好ましい。また、光学情報を、分光後、異なるＣＣＤを用いて輝度信号に変換すると、各ＣＣＤチップからの輝度情報を区別することができるので、得られた識別信号から、コンピュータ上で、容易にプローブの識別標識の種類を同定することができる。したがって、下記（ｉｖ）塩基配列情報に変換する手段を容易に自動化することができるので、光学情報を識別信号に変換する手段には、異なるＣＣＤ（例えば、３ＣＣＤ）を用いるのが好ましい。
また、光学情報の識別情報への変換は、１分子単位で行うのが好ましい。
（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段
識別信号を塩基配列情報に変換する手段は、上記（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段によって得られた識別信号（例えば、電気的信号など）をＤＮＡの塩基配列情報に変換する手段である。
上述したように、各プローブは、その突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な標識（識別標識）がされているので、該識別標識の種類を同定することによって、プローブの突出末端の塩基の種類を同定することができる。さらに、プローブの突出末端の塩基は、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基と相補的であるので、プローブの突出末端の塩基を同定することによって、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基の種類を同定することができる。そして、上記（ｉｉｉ）によって各プローブの識別標識に対応した識別信号を得ることができるので、上記（ｉｉｉ）で得られる識別信号から、解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基の種類を同定することができる。ここで、上記（ｉｉｉ）で得られる識別信号は、一般的に使用される構成要素（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスクなどの記憶部、記憶部に収納されたプログラム、キーボードなどの入力部、ＣＰＵなどの演算部）を備えるコンピュータによって処理しうる電気的信号として得ることができるので、識別信号を塩基配列情報に変換する手段を容易に自動化することができる。コンピュータによって変換された塩基配列情報は、モニターなどの表示部、プリンターなどの出力部によって表示または出力することができる。
本明細書の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］プローブ１の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２］プローブ１の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：３］プローブ２の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：４］プローブ２の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：５］プローブ３の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：６］プローブ３の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：７］プローブ４の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：８］プローブ４の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いた解析対象ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いた解析対象ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１１］実施例２で用いた量子ドット５２５・ＤＮＡプローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１２］実施例２で用いた量子ドット５２５・ＤＮＡプローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１３］実施例２で用いた量子ドット６０５・ＤＮＡプローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１４］実施例２で用いた量子ドット６０５・ＤＮＡプローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１５］実施例２で用いた解析対象ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１６］実施例２で用いた解析対象ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１７］実施例３で用いた量子ドット（５２５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１８］実施例３で用いた量子ドット（５２５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１９］実施例３で用いた量子ドット（５６５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２０］実施例３で用いた量子ドット（５６５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２１］実施例３で用いた量子ドット（６０５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２２］実施例３で用いた量子ドット（６０５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２３］実施例３で用いた量子ドット（６５５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２４］実施例３で用いた量子ドット（６５５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
クローニングその他の操作、反応条件などについて本明細書中（下記の実施例を含む）に特に記載がない場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（モレキュラー・クローニング第３版と略記する場合がある）；Ａｕｓｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の標準的なプロトコル集に記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＤＮＡの塩基配列決定方法
本発明の第１の態様は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する、ＤＮＡの塩基配列決定方法に関する。
（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する工程；
（ｂ）前記解析対象ＤＮＡと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定する工程；
（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する工程。
以下、各工程の詳細について説明する。
（１）工程（ａ）：解析対象ＤＮＡとプローブとのＤＮＡ連結酵素による連結
工程（ａ）は、解析対象ＤＮＡとプローブをＤＮＡ連結酵素で連結する工程である。
（解析対象ＤＮＡ）
解析対象となるＤＮＡは、特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ由来であってもよく、ｃＤＮＡ由来であってもよい。本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法は、１分子のＤＮＡの塩基配列を、クローニングすることなく決定することができるので、細胞から抽出したゲノムＤＮＡの塩基配列を決定するのに特に好ましく用いることができる。すなわち、解析対象ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを好ましく用いることができる。
解析対象ＤＮＡの長さには特に制限はないが、通常１〜５０００塩基、好ましくは２〜１０００塩基、より好ましくは５〜５００塩基、特に好ましくは１０〜１００塩基である。
本発明の解析対象ＤＮＡの調製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。具体的には、例えば、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを用いる場合には、まず、解析対象となる生物の組織、細胞からＤＮＡを抽出・精製してゲノムＤＮＡを調製する。次に、ゲノムＤＮＡを制限酵素などを用いて切断してＤＮＡ断片を調製する。このようにして得られたＤＮＡ断片を、クローニングすることなく本発明の解析対象ＤＮＡとして用いることができる。
解析対象ＤＮＡは基材に固定化される。基材は、塩基配列決定を阻害しないものであればよく、特に制限はない。基材としては、生体分子を固定する基材となるものを用いることができ、例えば、ガラス基板、石英ガラス基板、石英基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、石英ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。複数の解析対象ＤＮＡを固定化し、同時に複数の解析対象ＤＮＡの塩基配列決定を行うためには、基材は板状であるのが好ましく、例えば、ガラス基板、石英ガラス基板、シリコン基板、アルミ基板、光透過性単結晶基板（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２）などが挙げられる。後述するプローブの識別標識に蛍光物質を用いる場合には、基材としては光透過性を有するものが好ましく、さらに光透過性を有する板状のものが好ましく、特に、ガラス基板、石英ガラス基板、シリコン基板、光透過性単結晶基板（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２）が好ましく、なかでもガラス基板が好ましい。
解析対象ＤＮＡを基材に固定化する手段は、解析対象ＤＮＡの塩基配列決定に障害とならない手段であればよく、直接的に、または間接的に固定化する手段を用いることができる。好ましくは、解析対象ＤＮＡと基材に設けられた結合部分を使用することによって間接的に固定化することができる。このような結合部分としては、親和性結合を形成する物質の組合せや、架橋剤などを利用した化学結合を用いることができる。親和性結合を形成する物質の組合せとしては、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン／ビオチン、抗体または抗体断片／抗原分子（エピトープ）などの組合せが挙げられ、アビジンまたはストレプトアビジン／ビオチンの組合せが好ましく用いられる。このような親和性結合を形成する物質の組合せを用いる場合、組合せの一方の物質が基材に結合され（または本来的にその一部である）、もう一方の物質が解析対象ＤＮＡに結合される。好ましくは、アビジンまたはストレプトアビジンが基材に結合され（または本来的にその一部である）、ビオチンが解析対象ＤＮＡに結合される。これらを接触させることにより、アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとが親和性結合を形成し、解析対象ＤＮＡが基材に固定化される。
解析対象ＤＮＡを基材に固定化する部位は、解析対象ＤＮＡの塩基配列決定を阻害しない部位であればよく、特に制限はないが、突出末端（すなわちプローブが連結される末端）とは反対の末端であるのが好ましい。
基材に固定化する解析対象ＤＮＡの数は、特に制限はない。本発明においては、例えば、１〜約１００、約１００〜約１０００、約１０００〜約１０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約５０，０００〜約１００，０００、約１００，０００〜約５００，０００の解析対象ＤＮＡを基材に固定化して処理することができる。迅速に塩基配列を決定するという観点からは、基材に固定化する解析対象ＤＮＡの数は、１００以上であるのが好ましい。
解析対象ＤＮＡの固定化されない末端には、突出末端が形成されている。突出末端は、用いられるプローブが連結できるように形成される。具体的には、３’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も３’突出末端とされる。５’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も５’突出末端とされる。１塩基突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も１塩基突出末端とされる。プローブが２塩基突出またはそれ以上である場合には、解析対象ＤＮＡも、これに対応して、２塩基突出またはそれ以上とされる。より具体的には、１塩基突出の３’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も１塩基突出の３’突出末端とされる。１塩基突出の５’突出末端を有するプローブを用いる場合には、解析対象ＤＮＡの突出末端も１塩基突出の５’突出末端とされる。
このような突出末端は、適切な制限酵素を用いて形成することができる。例えば、解析対象ＤＮＡ中に、後で詳述する工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列が含まれている場合には、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列と同じ配列を認識する制限酵素を用いて突出末端を形成することができ、工程（ｃ）で用いる制限酵素によって突出末端を形成してもよい。解析対象ＤＮＡの突出末端の形成は、好ましくは解析対象ＤＮＡを基材に固定化した後に行われる。
なお、解析対象ＤＮＡ中に、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列が含まれていると、工程（ｃ）において、制限酵素がその認識配列を認識して解析対象ＤＮＡを切断してしまうため、塩基配列決定の障害となる。そこで、工程（ａ）を行う前に、あらかじめ工程（ｃ）で用いる制限酵素によって処理するなど、前記した解析対象ＤＮＡの切断を回避する処理を行うことが好ましい。
（プローブ）
本発明のプローブは、突出末端と、該突出末端の塩基の種類に応じた識別標識と、制限酵素の認識配列を含有している。本発明のプローブは、２つの１本鎖ＤＮＡをアニーリングさせたプローブ（本明細書において「２分子性のプローブ」と称することもある。）であってもよく、１つの１本鎖ＤＮＡを分子内でアニーリングさせた、ヘアピン構造を有するプローブ（本明細書において「１分子性のプローブ」と称することもある。）であってもよい。２分子性のプローブとしては、突出末端または制限酵素の切断部位側の末端とは反対側の末端が標識されているものが好ましい。プローブの末端が標識されている場合、標識される末端は５’末端または３’末端のいずれでもよい。１分子性のプローブとしては、ヘアピン構造部分が標識されているものが好ましい。
用いられるプローブの突出末端は、解析対象ＤＮＡの突出末端と、突出末端の鎖（５’または３’）および突出末端の塩基数が同じであるものである。具体的には、例えば、解析対象ＤＮＡの突出末端が１塩基突出の３’突出末端である場合には、１塩基突出の３’突出末端を有するプローブが用いられる。解析対象ＤＮＡの突出末端が１塩基突出の５’突出末端である場合には、１塩基突出の５’突出末端を有するプローブが用いられる。用いられるプローブの突出末端の塩基は、解析対象となるＤＮＡの突出末端を形成し得る塩基に相補的な塩基である。具体的には、突出末端が１塩基突出末端である場合には、例えば、突出末端の塩基が、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）である４種のプローブが用いられる。突出末端が２塩基突出末端である場合には、例えば、突出末端の塩基が、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣまたはＧＧである１６種のプローブが用いられる。突出する塩基数が増えると、用いられるプローブの種類が多くなり、各プローブの識別標識および識別が困難になる傾向があるので、突出末端は１または２塩基突出末端であるのが好ましく、特に１塩基突出末端であるのが好ましい。もしくは、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを４種類用意し、１塩基ずつ読むことも可能である。このようなプローブとしては、末端側がＮであるプローブ（すなわち、左側を末端としてＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣ）、末端側がＡ、Ｔ、ＧまたはＣであるプローブ（すなわち、左側を末端として、ＡＮ、ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ）が挙げられるが、末端側がＮであるのが、解析対象ＤＮＡの塩基配列を末端から決定できる点で好ましい。ここで、Ｎは、プローブを形成するオリゴＤＮＡ合成の際に、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）が混合されたものを取り込ませた塩基部位を表し、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）が同比率で混合されたものを取り込ませたものが好ましい。すなわち、Ｎの部位にはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）のいずれかの塩基が同確率で存在するのが好ましい。
ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣに代えて、ＮＮＡ、ＮＮＴ、ＮＮＧ、ＮＮＣなどの３塩基突出末端を持つプローブ、ＮＮＮＡ、ＮＮＮＴ、ＮＮＮＧ、ＮＮＮＣなどの４塩基突出末端を持つプローブなど、３塩基以上の突出末端を有するプローブも好ましく用いることができる。このような３塩基以上の突出末端を有するプローブは、アニーリングの効率が良いという点で好ましい。もっとも、あまり突出末端の塩基数が多くなると、誤アニーリングする可能性が高くなる傾向がある。よって、アニーリング効率と誤アニーリング回避という点からは、３〜５塩基突出末端を有するプローブが好ましく、特に４塩基突出末端を有するプローブが好ましい。
識別標識に用いられる標識物質としては、前記突出末端の塩基の識別することができる標識物質であればよい。標識物質としては、例えば、蛍光物質、化学発光物質、偏光の変化を測定し得る標識物質などの各種標識物質を使用することができ、なかでも蛍光物質が好ましく用いられる。本発明で用いられる蛍光物質は、当該蛍光物質で標識されていることが検出可能なものであればよく、特に制限はない。蛍光物質としては、核酸の標識に用いられている蛍光物質を用いることができ、例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ｘ−ローダミン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７４９、アクリジンイエロー、テキサスレッド、量子ドット、蛍光ビーズ、ＴｒａｎｓＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ビーズ、金属コロイドなどが挙げられる。量子ドットとしては、例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、 Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ ＩＴＫＴＭ Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ ＩＴＫＴＭ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓなど（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の量子ドットなどが挙げられる。なお、解析対象ＤＮＡの長さが長い場合には、解析に要する時間が長くなるので、特に退色しにくい蛍光物質を用いるのが好ましい。また、蛍光色素に応じて退色防止剤を用いるのが好ましい。
プローブは、突出末端の塩基の種類を識別できるように、当該突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な標識物質を用いて標識される。具体的には、突出末端が１塩基突出末端である場合には、例えば、それぞれＤＮＡの４種類の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）に相補的な１塩基突出末端を有する４種のプローブを、互いに識別可能な４種類の標識物質を用いて標識する。突出末端が２塩基突出末端である場合には、それぞれＤＮＡの２塩基突出末端の塩基の種類に相補的な２塩基突出末端を有する１６種のプローブを、互いに識別可能な１６種類の識別物質を用いて標識すればよい。プローブの突出末端が３塩基以上突出している場合も、当該突出末端の塩基の種類ごとに互いに識別可能な標識物質を用いて標識すればよい。プローブの標識は、化学修飾など公知の方法によって、直接的または間接的に行うことができる。
プローブに含まれる制限酵素の認識配列は、後で詳述する工程（ｃ）で用いられる制限酵素（認識配列と切断部位とが離れている制限酵素）の種類に応じた塩基配列を有している。ここで、工程（ｃ）で用いられる制限酵素は、用いられるプローブの突出末端と、突出末端の鎖（５’または３’）および突出末端の塩基数が同じである突出末端を形成する切断部位を有する制限酵素である。具体的には、例えば、プローブの突出末端が１塩基突出の３’突出末端である場合には、３’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。プローブの突出末端が、１塩基突出の５’突出末端である場合には、５’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。
認識配列と突出末端の距離は、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列と切断部位の距離より、工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数だけ短い。したがって、突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数と工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数とが等しい場合には、認識配列と突出末端の距離は、工程（ｃ）で用いられる制限酵素の認識配列と切断部位の距離より、当該突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数だけ短くなっている。具体的には、例えば、突出末端が１塩基突出末端である場合には、工程（ｂ）で一度に決定される塩基数も１塩基であるので、認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より１塩基短い。また、例えば、突出末端が２塩基突出末端であり、２塩基ずつ配列を決定する場合には、認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より２塩基短い。これに対し、突出末端が２塩基突出末端であっても、例えば、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを用いて１塩基ずつ配列を決定する場合には、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より１塩基短いものが用いられる。
また、１塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より２塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を２塩基ごと（１塩基とばし）に解析することもできる。
さらに、例えば、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より２塩基短い（すなわち、突出末端の塩基数と同じ塩基数だけ短い）プローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を２塩基ごと（１塩基とばし）に解析することもできる。
同様にして、例えば、ＮＮＮＡ、ＮＮＮＴ、ＮＮＮＧ、ＮＮＮＣの４塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より４塩基短い（すなわち、突出末端の塩基数と同じ塩基数だけ短い）プローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を４塩基ごと（３塩基とばし）に解析することもできる。認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より３または２塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を３または２塩基ごとに解析することもできる。認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離より５または６塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基を５または６塩基ごとに解析することもできる。このようにして、ｎ（ｎは１以上の整数を表す）塩基突出末端を持ち、認識配列と突出末端の距離が、認識配列と切断部位の距離よりｍ（ｍは２以上の整数を表す）塩基短いプローブを用いることにより、解析対象ＤＮＡ中の塩基をｍ塩基ごと（ｍ−１塩基とばし）に解析することができる。以上のように、解析対象ＤＮＡ中の塩基を２塩基以上ごとに解析した場合には、塩基配列データベースに対して参照を行うことにより、該解析対象ＤＮＡを同定すること（すなわち、解析対象ＤＮＡがどのような遺伝子であるかを決定すること）ができる。
プローブの長さは、３００塩基以下であることが好ましい。好ましくは、少なくとも８塩基対、少なくとも９塩基対、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対または少なくとも２０塩基対である。また、プローブの長さは、好ましくは、１００塩基対以下、８０塩基対以下、６０塩基対以下、５０塩基対以下、４０塩基対以下、３５塩基対以下、３０塩基対以下、２５塩基対以下、２４塩基対以下、２３塩基対以下、２２塩基対以下、２１塩基対以下、２０塩基対以下、１９塩基対以下、１８塩基対以下、１７塩基対以下、１６塩基対以下、１５塩基対以下、１４塩基対以下、１３塩基対以下、１２塩基対以下、１１塩基対以下または１０塩基対以下である。
本発明のプローブは、化学合成法など公知の方法に従って合成することができる。
（ＤＮＡ連結酵素による連結）
工程（ａ）では、解析対象ＤＮＡとプローブとがＤＮＡ連結酵素によって連結される。解析対象ＤＮＡと、プローブと、ＤＮＡ連結酵素とを反応させると、解析対象ＤＮＡと、突出末端の塩基が解析対象となるＤＮＡの突出末端の塩基に相補的であるプローブ（相補的なプローブと称することがある）が連結される。用いられるＤＮＡ連結酵素は、突出末端を有するＤＮＡ断片を連結できるものであればよく、特に制限はない。ＤＮＡ連結酵素としては、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、ＴＴＨ ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。
（２）工程（ｂ）：解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの識別標識の種類の同定
工程（ｂ）は、工程（ａ）において解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの識別標識の種類を同定する工程である。
上述したように、プローブは、その突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な標識物質を用いて標識（識別標識）されているので、該識別標識の種類を同定することによって、プローブの突出末端の塩基の種類を同定することができる。さらに、プローブの突出末端の塩基は、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基と相補的であるので、プローブの突出末端の塩基を同定することによって、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基の種類を同定することができる。このようにして、解析対象ＤＮＡとプローブの突出末端が３’突出末端である場合には解析対象ＤＮＡの３’末端の塩基が同定され、解析対象ＤＮＡとプローブの突出末端が５’突出末端である場合には、解析対象ＤＮＡの５’末端の塩基が同定される。
識別標識の種類の同定には、用いられている標識物質に応じて得られる信号を検出し、標識物質の種類を同定することができる方法が用いられる。このような識別標識の種類の同定方法としては、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブと、解析対象ＤＮＡと連結されていない（フリーの）プローブを区別できる方法が好ましい。解析対象ＤＮＡと連結されたプローブと、フリーのプローブを区別できる方法としては、例えば、１分子観察による方法が挙げられる。１分子観察によれば、ガラス表面に固定されたプローブのみが輝点として、フリーなプローブは弱い一様なバックグラウンドノイズとしてそれぞれ検出されるため、連結したプローブとフリーなプローブとを区別することが出来る。具体的には、例えば、標識標識が蛍光標識である場合には、蛍光標識の種類の同定には、蛍光標識の蛍光波長を検出し、蛍光標識の種類を同定する方法、例えば、蛍光分光分析法が用いられる。さらに、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブとフリーのプローブを区別できる方法としては、例えば、１分子蛍光分光分析法が用いられる。１分子蛍光分光分析は、例えば、１分子蛍光分光顕微鏡、市販の１分子蛍光分析システム（例えば、ＭＳ２０（オリンパス株式会社製）など）、プリズムや回折格子を用いた分光光学系、複数のＣＣＤカメラとフィルターを組み合わせたシステム、高速フィルター切り替え装置、３ＣＣＤカメラ、単板カラーＣＣＤカメラ、デジタルＣＣＤカメラ（例えば、ＥＭ−ＣＣＤカメラなど）、Ｑｕａｄ−ＶｉｅｗＴＭ（Ｒｏｐｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｄｕａｌ−ＶｉｅｗＴＭ（Ｒｏｐｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｄｕａｌ−ＣａｍＴＭ（Ｒｏｐｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）やＤｏｕｂｌｅ−Ｖｉｅｗなどを使用して行うことができる。本発明で用いられる１分子蛍光分光分析法としては、例えば、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（例えば、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１３，２９−６１（１９７４）など参照）、蛍光強度多分布解析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（例えば、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７９，２８５８−２８６６（２０００）、特表２００１−５０２０６２号公報、特表２００１−５１８３０７号公報、特表２００２−５０５７４２号公報など参照）などが挙げられる。
蛍光標識の励起に使用する光源としては、水銀ランプ、キセノンランプなどのアーク光源、ＬＥＤ、Ａｒレーザー、ＨｅＮｅレーザー、ＬＤレーザー、ＨｅＣｄレーザー、ＮｄＹＡＧレーザー、ＫｒＡｒレーザーなどのレーザー光源など、公知の光源を使用することができる。光源の波長は、用いられる蛍光標識の励起波長に応じて選択される。アーク光源など、広い波長領域を有する光源を用いる場合には、用いられる蛍光標識の励起波長に応じたバンドパスフィルターを使用するのが好ましい。バンドパスフィルターとしては、例えば、誘電体バンドパスフィルター、金属バンドパスフィルターなどが挙げられる。アーク光源など、広い波長領域を有する光源は、バンドパスフィルターを適宜選択することによって、蛍光標識に応じた励起光を容易に選択することができる点で好ましく用いることができる。
蛍光を検出する際には、蛍光と、励起光、散乱光などの蛍光以外の光を分離することにより、背景光を低減させて観察するのが好ましい。このような、蛍光とその他の光（励起光、散乱光など）の分離は、ダイクロイックミラー、吸収フィルターなどを用いて行うことができる。ダイクロイックミラーとしては、蛍光標識の励起波長および蛍光波長に応じて、励起光を反射し、蛍光を透過するような波長特性のものを選択すればよい。吸収フィルターとしては、蛍光を透過し、散乱光などを吸収するようなものを選択すればよい。
蛍光標識の蛍光を検出するための検出器としては、例えばＣＣＤカメラが挙げられる。ノイズ低減の観点から、冷却ＣＣＤカメラが好ましく用いられる。ＣＣＤカメラを用いて蛍光を検出する場合には、プリズムなどの分光素子を用いて蛍光のスペクトルを得ることが、蛍光標識を識別する上で好ましい。
上記のようにして得られた画像を、市販の画像解析ソフトウェア、例えばＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などを使用して解析してもよい。
（３）工程（ｃ）：解析対象ＤＮＡとプローブとの連結体の制限酵素による切断
工程（ｃ）は、工程（ａ）において連結された解析対象ＤＮＡとプローブとの連結体を、制限酵素で切断する工程である。上述したように、プローブの認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より短いので、解析対象ＤＮＡとプローブとが連結されることによって、解析対象ＤＮＡ上に切断部位が出現することになる。具体的には、例えば、解析対象ＤＮＡとプローブの突出末端が１塩基突出末端である場合には、プローブの認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より１塩基短くなっているので、解析対象ＤＮＡとプローブが連結されると解析対象ＤＮＡの末端から１番目と２番目の塩基の間に切断部位が出現する。この解析対象ＤＮＡとプローブの連結体が制限酵素で切断されることによって、解析対象ＤＮＡの末端の１塩基が削られ、新たな１塩基突出末端が生成される。
本発明で用いられる制限酵素は、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素であり、かつ突出末端を生成するものである。生成される突出末端は、３’突出末端でもよく、５’突出末端でもよい。また、突出する塩基数としては、特に制限はないが、生成される突出末端は、突出末端は１または２塩基突出末端であるのが好ましく、特に１塩基突出末端であるのが好ましい。このような制限酵素は、例えば、クラスＩＩＳ制限酵素から選択される。具体的には、例えば、１塩基突出の３’突出末端を生成する制限酵素としては、ＢｍｒＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｆｉＩ、ＢｍｕＩなど）、ＡｓｕＨＰＩ及びそのアイソシゾマー（例えば、ＨｐｈＩなど）、ＢｃｉＶＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｆｕＩなど）、ＨｐｙＡＶおよびそのアイソシゾマー、ＭｂｏＩＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＮｃｕＩなど）、ＭｎｌＩおよびそのアイソシゾマーなどが挙げられ、、なかでもＢｍｒＩ、ＢｃｉＶＩ、ＭｂｏＩＩ、ＨｐｈＩが好ましく、特にＢｍｒＩが好ましい。１塩基突出の５’突出末端を生成する制限酵素としては、ＡｃｌＷＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＡｌｗＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｔＨ９Ｉ、Ｂｓｔ３１ＴＩ、ＥａｃＩなど）、ＢｃｃＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＨｐｙＣ１Ｉなど）、ＢｃｅｆＩおよびそのアイソシゾマー、ＰｌｅＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＰｐｓＩなど）などが挙げられ、なかでもＡｌｗＩ、ＰｌｅＩ、ＢｃｅｆＩ、ＨｐｙＣ１Ｉが好ましく、特にＡｌｗＩ、ＰｌｅＩが好ましい。
２塩基突出の３’突出末端を生成する制限酵素としては、例えば、ＡｃｉＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＳｓｉＩなど）、ＢｃｅＡＩおよびそのアイソシゾマー、Ｂｍｅ５８５Ｉおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ、ＦａｕＩ、ＳｍｕＩなど）、ＢｓｃＡＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、Ｂｓｔ１９Ｉなど）などが挙げられる。２塩基突出の５’突出末端を生成する制限酵素としては、例えば、Ａｓｐ２６ＨＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、Ａｓｐ２７ＨＩ、Ａｓｐ３５ＨＩ、Ａｓｐ３６ＨＩ、Ａｓｐ４０ＨＩ、Ａｓｐ５０ＨＩ、ＢｍａＨＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓｃＣＩ、ＢｓｍＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩなど）、Ｂｃｅ８３Ｉおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｐｕＥＩなど）、ＢｃｇＩおよびそのアイソシゾマー、ＢｐｍＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＧｓｕＩなど）、Ｂｓｅ１Ｉおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＳＩ、Ｂｓｔ１１Ｉ、Ｔｓｐ１Ｉなど）、Ｂｓｅ３ＤＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｒＤＩなど）、ＢｓｅＧＩおよびそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＣＩなど）、ＢｓｇＩおよびそのアイソシゾマー、ＢｓｐＫＴ５Ｉおよびそのアイソシゾマー、ＢｔｓＩおよびそのアイソシゾマー、ＣｓｐＣＩおよびそのアイソシゾマー、ＣｓｔＭＩおよびそのアイソシゾマー、ＥｃｉＩおよびそのアイソシゾマー、Ｅｃｏ５７ＭＩおよびそのアイソシゾマー、ＴｓｐＤＴＩおよびそのアイソシゾマー、ＴｓｐＧＷＩおよびそのアイソシゾマーなどが挙げられる。
本発明で用いられる制限酵素は、工程（ａ）で用いられるプローブに対応して選択される。具体的には、工程（ａ）で用いられるプローブの突出末端と、突出末端の鎖（５’または３’）および突出末端の塩基数が同じである突出末端を形成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。具体的には、例えば、プローブの突出末端が１塩基突出の３’突出末端である場合には、３’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。プローブの突出末端が、１塩基突出の５’突出末端である場合には、５’末端に１塩基突出を生成する切断部位を有する制限酵素が用いられる。さらに、用いられる制限酵素は、認識配列と切断部位の距離が、用いられるプローブの認識配列と突出末端の距離より工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数だけ長いものである。したがって、工程（ｂ）で一度に決定される塩基の数と突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数とが等しい場合には、認識配列と切断部位の距離は、用いられるプローブの認識配列と突出末端の距離より、当該突出末端に突出しているＤＮＡの塩基数だけ長いものである。具体的には、例えば、用いられるプローブの突出末端が１塩基突出末端である場合には、工程（ｂ）で一度に決定される塩基数も１塩基であるので、認識配列と切断部位の距離が、認識配列と突出末端の距離より１塩基長い制限酵素が用いられる。また、例えば、突出末端が２塩基突出末端であり、一度に決定される塩基数が２塩基である場合には、認識配列と切断部位の距離が、認識配列と突出末端の距離より２塩基長い制限酵素が用いられる。これに対し、突出末端が２塩基突出末端であっても、例えば、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを用いて１塩基ずつ配列を決定するような場合には、認識配列と切断部位が、認識配列と突出末端の距離の距離より１塩基長い制限酵素が用いられる。さらに、ＮＡ、ＮＴ、ＮＧ、ＮＣの２塩基突出末端を持つプローブを用いて２塩基ごとに解析対象ＤＮＡ中の塩基を解析する場合など、２塩基以上の突出末端を持つプローブを用いて２塩基以上ごとに塩基を解析する場合には、認識配列と切断部位の距離が認識配列と突出末端の距離より２塩基以上長い制限酵素が用いられる。
（４）解析対象ＤＮＡの塩基配列の決定
上述したように、工程（ａ）において解析対象ＤＮＡはプローブと連結され、工程（ｂ）において解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基が同定される。そして、工程（ｃ）において、解析対象ＤＮＡには新たな突出末端が生成される。このようにして、新たな突出末端が生成された解析対象ＤＮＡは、さらに工程（ａ）〜（ｃ）に供することができ、同様にして工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことができる。この工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、工程（ｃ）における制限酵素による切断が可能である限り行うことができる。このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しによって、解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基を順次同定することによって、解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定（または解析）することができる。具体的には、解析対象ＤＮＡの突出末端が３’突出末端である場合には、解析対象ＤＮＡの塩基配列を３’側から順次決定（または解析）することができる。解析対象ＤＮＡの突出末端が５’突出末端である場合には、解析対象ＤＮＡの塩基配列を５’側から順次決定することができる。また、解析対象ＤＮＡの突出末端が１塩基突出末端である場合には、１塩基ずつ決定していくことができる。
このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、（１）工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）の１または２反応を行った後に反応液を交換して行うこともでき、または（２）解析対象ＤＮＡと、プローブと、ＤＮＡ連結酵素と、制限酵素の共存下、連鎖反応で行うこともできる。工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、解析速度の観点からは、連鎖反応で行うのが好ましい。
前記（１）のように、工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）の１または２反応を行った後に反応液を交換して行う場合には、例えば、マイクロ流路と温度制御装置を組み合わせた系で、ポンプなどにより反応液を交換する方法により行うことができる。ＤＮＡ連結反応とＤＮＡ切断反応とでは反応至適条件が異なるため、それぞれの反応の至適条件となるように、反応条件を交互に変えて各反応を行ってもよい。
次に、本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法の１つの実施態様について、図１および図２に基づいて具体的に説明する。
まず、工程（ａ）の１つの実施態様について説明する。図１（１）に示されているように、解析対象ＤＮＡは、突出末端とは反対の末端が、アビジン／ビオチン結合を介して間接的に基材に固定化されている。解析対象ＤＮＡの上側の鎖は、左が５’末端であり、右が３’末端である。従って、解析対象ＤＮＡの突出末端は、１塩基突出の３’末端である。解析対象ＤＮＡの塩基は、３’突出末端の塩基から順に、第１塩基、第２塩基、第３塩基というように表されている。
プローブは、突出末端とは反対の末端が、突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な蛍光物質を用いて標識されている。具体的には、突出末端の塩基がＴであるプローブ１は、蛍光物質１で標識されている。同様に、突出末端の塩基がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇであるプローブ２、３、４は、それぞれ蛍光物質２、３、４で標識されている。プローブ１〜４の下側の鎖は、左が３’末端であり、右が５’末端である。従って、プローブの突出末端は、解析対象ＤＮＡと同様に、１塩基突出の３’末端である。プローブには、ＢｍｒＩ制限酵素の認識配列が含まれている。前記認識配列と突出末端の距離は、ＢｍｒＩ制限酵素の認識配列と切断部位の距離より１塩基短い。
解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基（第１塩基）はＡであるので、これに相補的なＴを突出末端に有するプローブ１が、ＤＮＡ連結酵素によって連結され、図１（２）に示されるような連結体が生成される。
次に、工程（ｂ）の１つの実施態様について説明する。工程（ａ）おいて生成した解析対象ＤＮＡとプローブ１との連結体（図１（２））を、蛍光分光分析法などを用いて分析することによって、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの蛍光標識（蛍光物質１）が同定される。このような蛍光標識の同定には、例えば、図２（１）に示されるような蛍光分光分析装置が用いられる。図２（１）の蛍光分光分析装置においては、光源から発せられた光から、バンドパスフィルターによって、蛍光物質の励起に必要な波長の光が抽出される。このようにして抽出された励起光は、ダイクロイックミラーによって反射され、サンプルに照射される。照射された励起光によって、プローブの蛍光標識は励起され、蛍光を発する。蛍光標識から発せられた蛍光は、ダイクロイックミラーを透過し、プリズムによって分光された後、冷却ＣＣＤによって観察される。なお、通常は蛍光顕微鏡などの拡大光学系を併用し、１分子蛍光分光分析を行う。１分子蛍光分光分析法によれば、ゆらぎの大きさなどから、解析対象ＤＮＡに連結されたプローブと、フリーのプローブを区別することができるので、１分子蛍光分光分析法を用いるのが好ましい。このようにして、例えば、図１（２）に示された解析対象ＤＮＡに連結されたプローブがプローブ１であることが同定される。さらに、解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基は、プローブ１の突出末端の塩基（Ｔ）に相補的な塩基（Ａ）と同定される。
サンプルとしては、例えば、図２（２）に示されるように、基材に複数の解析対象ＤＮＡが固定化されたものを用いることもできる。１分子蛍光分光分析法によれば、同時に多数（例えば、数百から数千）の蛍光を観察することもできるので、基材に複数の解析対象ＤＮＡを固定化したサンプルを用いることによって、同時に複数（例えば、数百から数千）の解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定することもできる。
次に、工程（ｃ）の１つの実施態様について説明する。上述したように、プローブの認識配列と突出末端の距離は、認識配列と切断部位の距離より１塩基短いので、解析対象ＤＮＡとプローブとが連結されることによって、解析対象ＤＮＡの第１塩基と第２塩基の間に切断部位が出現している（図１（２））。従って、この解析対象ＤＮＡとプローブ１との連結体をＢｒｍＩ制限酵素で切断すると、解析対象ＤＮＡの第１塩基がプローブ１に連結された状態で切断され、解析対象ＤＮＡは１塩基短く削られる。その結果、解析対象ＤＮＡには、第２塩基が突出した新たな１塩基突出末端が生成される（図１（３））。
このようにして生成された新たな１塩基突出末端（第２塩基（Ｃ））を有する解析対象ＤＮＡは、さらに工程（ａ）〜（ｃ）に供することができる。すなわち、第２塩基（Ｃ）が突出した解析対象ＤＮＡには、これに相補的なＧを突出末端に有するプローブ４がＤＮＡ連結酵素によって連結される（工程（ａ））。以下、上述したように、工程（ｂ）、工程（ｃ）を行うことができ、さらに同様にして工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことができる。このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しは、工程（ｃ）における制限酵素による切断が可能である限り行うことができる。このような工程（ａ）〜（ｃ）の繰り返しによって、解析対象ＤＮＡの塩基配列が、３’側から１塩基ずつ順次決定される。
２．プローブおよびＤＮＡの塩基配列決定用キット
また、本発明の別の態様は、突出末端を有し、該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ、および該プローブを含有するＤＮＡの塩基配列決定用キットに関する。
本発明のプローブとしては、前記と同様のものが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。例えば、前記突出末端が３’突出末端であるのものと、５’突出末端であるものが挙げられる。なかでも、前記突出末端が一塩基突出末端であるものが好ましい。また、前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、前記認識配列と塩基切断部位との距離より一塩基短いものが好ましい。また、前記認識配列が、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列であるものが好ましい。
本発明のＤＮＡの塩基配列決定用キットは、上述の工程（ａ）〜工程（ｃ）を含む方法により、ＤＮＡの塩基配列を決定するために用いられる。本発明のキットに含有されるプローブとしては、前記した本発明のプローブが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。特に、プローブとして、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧに相補的な１塩基突出末端を有する少なくとも４種のプローブを含むキットが好ましい。
本発明のキットには、さらに制限酵素を含んでいてもよい。本発明のキットに含まれる制限酵素としては、上述の工程（ｃ）で用いられる制限酵素、解析対象ＤＮＡに突出末端を形成するための制限酵素が挙げられる。このような制限酵素としては、前記と同様のものが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。
本発明のキットには、さらにＤＮＡ連結酵素を含んでいてもよい。ＤＮＡ連結酵素としては、前記と同様のものが挙げられ、前記と同様のものが好ましい。
３．ＤＮＡの塩基配列決定装置
また、本発明の別の態様は、（ｉ）測定セル、（ｉｉ）光学手段、（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段、および（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段、を備えるＤＮＡの塩基配列決定装置であって、前記測定セルは、（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する手段；及び（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する手段を備える装置に関する。
本発明のＤＮＡの塩基配列決定装置においては、まず、（ｉ）測定セル内において、（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する反応が行われる。次に、（ｉｉ）光学手段によって、解析対象ＤＮＡと連結されたプローブの識別標識からの光学情報（例えば、色情報）を得る。得られた光学情報を（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段によって、プローブの識別標識を識別しうる識別信号（例えば、電気的信号）に変換する。この識別信号を（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段によって、塩基配列を得る。その後、（ｉ）測定セル内において、（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する反応が行われる。これに続いて、さらに上記の工程を繰り返すことにより、解析対象ＤＮＡの塩基配列を順次決定することができる。なお、上記各工程は、上述した本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法にしたがって行うことができる。
以下、各構成要素について説明する。
（ｉ）測定セル
測定セルは、解析対象ＤＮＡが固定化された基材と、プローブ、バッファー、制限酵素などを投入するための投入口と、それらを排出するための排出口とを備える。ここで、投入口と排出口とを別々に設ける必要はなく、投入と排出とを行うための投入・排出口を設けてもよい。測定セルの材料は、プローブの識別標識に蛍光物質、量子ドット、金属コロイドなどを用いる場合には、光透過性を有する材料が好ましく、さらに、ガラス、石英ガラス、シリコン、光透過性単結晶（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２）などが好ましい。測定セル自体を解析対象ＤＮＡを固定化する基材として用いてもよい。
（ｉｉ）光学手段
光学手段は、プローブの識別標識を識別しうる光学情報（例えば、色情報）を得ることができる光学系などで構成される。具体的には、例えば、標識標識が蛍光標識または量子ドットである場合に用いられる光学系としては、例えば、蛍光顕微鏡など、好ましくは、１分子蛍光分光顕微鏡などが挙げられる。本発明で用いられる光学手段は、プリズムや回折格子を用いた分光光学系、高速フィルター切り替え装置などを備えていてもよい。
（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段
光学情報（例えば、色情報など）を識別信号（例えば、電気的信号など）に変換する手段は、上記（ｉｉ）光学手段によって得られた、プローブの識別標識を識別しうる光学情報を、プローブの識別標識を識別しうる識別信号（例えば、電気的信号など）に変換する手段である。光学情報を識別信号に変換する手段としては、例えば、プローブの識別標識を識別しうる光学情報を、分光後、異なるＣＣＤまたは１つのＣＣＤの異なる画素に結像させ、結像部分にある画素からの輝度情報を基に、プローブの識別標識を識別しうる識別信号（例えば、電気的信号など）に変換する手段が挙げられる。なお、ＣＣＤとしては、通常、デジタルＣＣＤが用いられる。デジタルＣＣＤを用いた場合には、識別信号をデジタル信号として得ることができる。デジタル信号は、コンピュータによる処理に適しているので、下記（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段をコンピュータを用いて自動化する上で好ましい。また、光学情報を、分光後、異なるＣＣＤを用いて輝度信号に変換すると、各ＣＣＤチップからの輝度情報を区別することができるので、得られた識別信号から、コンピュータ上で、容易にプローブの識別標識の種類を同定することができる。したがって、下記（ｉｖ）塩基配列情報に変換する手段を容易に自動化することができるので、光学情報を識別信号に変換する手段には、異なるＣＣＤ（例えば、３ＣＣＤ）を用いるのが好ましい。
また、光学情報の識別情報への変換は、１分子単位で行うのが好ましい。
（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段
識別信号を塩基配列情報に変換する手段は、上記（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段によって得られた識別信号（例えば、電気的信号など）をＤＮＡの塩基配列情報に変換する手段である。
上述したように、各プローブは、その突出末端の塩基の種類ごとに、互いに識別可能な標識（識別標識）がされているので、該識別標識の種類を同定することによって、プローブの突出末端の塩基の種類を同定することができる。さらに、プローブの突出末端の塩基は、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基と相補的であるので、プローブの突出末端の塩基を同定することによって、該プローブに連結された解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基の種類を同定することができる。そして、上記（ｉｉｉ）によって各プローブの識別標識に対応した識別信号を得ることができるので、上記（ｉｉｉ）で得られる識別信号から、解析対象ＤＮＡの突出末端の塩基の種類を同定することができる。ここで、上記（ｉｉｉ）で得られる識別信号は、一般的に使用される構成要素（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスクなどの記憶部、記憶部に収納されたプログラム、キーボードなどの入力部、ＣＰＵなどの演算部）を備えるコンピュータによって処理しうる電気的信号として得ることができるので、識別信号を塩基配列情報に変換する手段を容易に自動化することができる。コンピュータによって変換された塩基配列情報は、モニターなどの表示部、プリンターなどの出力部によって表示または出力することができる。
本明細書の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］プローブ１の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２］プローブ１の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：３］プローブ２の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：４］プローブ２の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：５］プローブ３の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：６］プローブ３の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：７］プローブ４の一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：８］プローブ４の他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いた解析対象ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いた解析対象ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１１］実施例２で用いた量子ドット５２５・ＤＮＡプローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１２］実施例２で用いた量子ドット５２５・ＤＮＡプローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１３］実施例２で用いた量子ドット６０５・ＤＮＡプローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１４］実施例２で用いた量子ドット６０５・ＤＮＡプローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１５］実施例２で用いた解析対象ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１６］実施例２で用いた解析対象ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１７］実施例３で用いた量子ドット（５２５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１８］実施例３で用いた量子ドット（５２５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：１９］実施例３で用いた量子ドット（５６５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２０］実施例３で用いた量子ドット（５６５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２１］実施例３で用いた量子ドット（６０５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２２］実施例３で用いた量子ドット（６０５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２３］実施例３で用いた量子ドット（６５５）プローブの一方の鎖の塩基配列を示す。
［配列番号：２４］実施例３で用いた量子ドット（６５５）プローブの他方の鎖の塩基配列を示す。
クローニングその他の操作、反応条件などについて本明細書中（下記の実施例を含む）に特に記載がない場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（モレキュラー・クローニング第３版と略記する場合がある）；Ａｕｓｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の標準的なプロトコル集に記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
多分子系における配列特異的な蛍光プローブの取り込み
１塩基突出末端を持つＤＮＡの配列に特異的に結合する蛍光ＤＮＡプローブを検出し、さらにＣｌａｓｓＩＩＳ制限酵素とＤＮＡライゲースとを交互に反応させることで、ＤＮＡの塩基配列を決定した。
（１）解析対象ＤＮＡの基材への固定化
アビジン・アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ９２０７）（１ｘＰＢＳで３０μｌスラリーに懸濁）に、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡ（図３）（配列番号：９：５’ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＴＡＣＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＧＣＡ３’、配列番号：１０：５’ＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＡＧＣ３’、）（１０μＭ）を混ぜて１時間混和し、解析対象ＤＮＡをアビジン・アガロースビーズに固定化した。
（２）解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとの連結
上記（１）で得られた、解析対象ＤＮＡが固定化されたビーズを１ｘＰＢＳで２回洗浄し、さらにＴ４ ＤＮＡライゲースバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄した後、蛍光ＤＮＡプローブ（１０μＭ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ）（１０μｌ）、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ、ＬＧＫ−１０１）（１０μｌ）、を上記のアガロースビーズに混ぜて、２０℃で１時間インキュベートし、１ｘＰＢＳで２回洗浄して、解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとを連結させた。
なお、蛍光ＤＮＡプローブは、図１（１）に示されたプローブ１、３および４と同様の構造のものを用いた。蛍光物質１（蛍光１）としてはＦＩＴＣを、蛍光物質３（蛍光３）としてはＣｙ５を、蛍光物質４（蛍光４）としてはＣｙ３を用いた。
（３）解析対象ＤＮＡと連結された蛍光ＤＮＡプローブの同定
上記（２）で得られた、蛍光ＤＮＡプローブを結合させたビーズの一部を蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ）で観察し、ビーズ表面に結合した蛍光ＤＮＡプローブを同定した。
（４）解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとの連結体の切断
上記（３）で蛍光ＤＮＡプローブを同定したビーズを１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ、Ｂ７００２Ｓ）で１回洗浄した後、ＢｍｒＩ（ＮＥＢ、Ｒ０６００Ｓ）（２μｌ）、１ｘＮＥＢｆｆｅｒ ２をビーズに添加して３７℃で１時間インキュベートし、解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとの連結体を切断した。
その後、１ｘＰＢＳで２回洗浄した。
（５）ＤＮＡ塩基配列の順次同定
上記（２）から（４）を繰り返すことでＤＮＡ塩基配列を順次同定した。
（６）結果
まず、（１）〜（３）を行うことにより、ＦＩＴＣの蛍光が観察され、解析対象ＤＮＡの３’末端の１番目の塩基がＡと同定された。続けて、（４）および（２）〜（３）を繰返し行うことにより、Ｃｙ３の蛍光が観察され、解析対象ＤＮＡの３’末端の２番目の塩基がＣと同定された。さらに、（４）および（２）〜（３）を繰返し行うことにより、Ｃｙ５の蛍光が観察され、解析対象ＤＮＡの３’末端の２番目の塩基がＧと同定された。このようにして、連結した蛍光プローブの蛍光波長により解析対象ＤＮＡの塩基配列が３塩基同定された（図４）。
なお、図３に示されるように、２回目の塩基の同定において、Ｃｙ３の蛍光と共にＦＩＴＣの蛍光が観察された。これは、アビジン・アガロースビーズに結合した複数（１００個程度）の解析対象ＤＮＡの一部が、ＢｍｒＩによる切断を受けずに次の反応へ進んだことを示している。同様に、３回目の塩基の同定においては、Ｃｙ５の蛍光と共に、ＦＩＴＣおよびＣｙ３の蛍光が観察され、これは解析対象ＤＮＡの一部が１回目または２回目のＢｒｍＩによる切断を受けずに次の反応へ進んだことを示している。このように、同時に複数の解析対象ＤＮＡを処理する場合、その一部が未反応のまま次の反応へ進む可能性があるので、１分子観察で識別標識の同定を行うのが望ましい。
実施例２
制限酵素、連結酵素による連鎖反応を１分子観察することで、ＤＮＡの塩基配列の組み合わせを解析した。
（１）量子ドット・ＤＮＡプローブの調製
架橋剤（ＥＤＣ）を用い、量子ドット（５２５、６０５）（Ｑ２１３４１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑ２１３０１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、それぞれ下記ＤＮＡの５’のアミノ基に共有結合し、量子ドット・ＤＮＡプローブを調製した。
量子ドット５２５（図５（１ａ））：
配列番号：１１：５’ｃｇｔｃｃｃａｇｔａｃｔａｇｔａｔｇｃ３’
配列番号：１２：５’ａｍｉｎｅ−ｇｃａｔａｃｔａｇｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃ３’
量子ドット６０５（図５（１ｂ））：
配列番号：１３：５’ｃｇｔｃｃｃａｇｔａｃｔａｇｔａｔｇｃ３’
配列番号：１４：５’ａｍｉｎｅ−ｇｃａｔａｃｔａｇｔａｃｔｇｇｇａｃｇｔ３’
（２）解析対象ＤＮＡの基材への固定化
まず、カバーガラスの表面にアビジン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９２７５）を固定した。アビジンを固定化したカバーガラスに、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡ（図５（２））、（配列番号：１５：５’ｂｉｏｔｉｎ−ａｃｔｃｇｇｃａｔｇｃｇｃｃａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇ３’、配列番号：１６：５’ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｇｇｃｇｃａｔｇｃｃｇａｇｔ３’）（１００μＭ）を添加し、１時間静置し、解析対象ＤＮＡをカバーガラスに固定化した。
（３）解析対象ＤＮＡと連結された量子ドット・ＤＮＡプローブの観察
解析対象ＤＮＡが固定化されたカバーバラスをＰＢＳで洗浄した後、量子ドットの結合したＤＮＡプローブ（量子ドット・ＤＮＡプローブ）、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（２μｌ、ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）、Ｍ０２０２Ｍ）、ＢｍｒＩ（５μｌ、ＮＥＢ、Ｒ０６００Ｌ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ）をカバーガラスの表面にのせ、１分子蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００ Ｅ，Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＴＩＲＦ １００ｘ ＮＡ１．４５）と３ＣＣＤ（浜松ホトニクス、Ｃ７７８０−２０）により（図６（１））、解析対象ＤＮＡに連鎖反応で結合するプローブを観察した。
（４）結果
解析対象ＤＮＡの塩基配列に応じた量子ドット・ＤＮＡプローブの連鎖的な取り込みが１分子レベルで観察された（図６（２））。
実施例３
複数の解析対象ＤＮＡが固定化された基材を用い、制限酵素、連結酵素による連鎖反応を１分子観察することで、ＤＮＡの塩基配列を同定した。
（１）オリゴＤＮＡのリン酸化
オリゴＤＮＡ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）２００μｌ（北海道システム・サイエンス）に１０ｘ Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）２２μｌ、ＡＴＰ（１００ｍＭ）５μｌ、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ）１０μｌを加え、３７℃で５時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール抽出（フェノール：クロロフォルム＝１：１、Ｖｏｒｔｅｘミキサーにて１０秒間振盪）、クロロフォルム洗浄（Ｖｏｒｔｅｘミキサーにて１０秒間振納盪）、イソプロパノール沈殿（５０％イソプロパノールと０．３Ｍ酢酸ナトリウムで室温にて１分間処理後、２００００×ｇ、１５分間、４℃で遠心。）、および７０％エタノール洗浄（１０００μｌで処理後、２００００×ｇで遠心。洗浄回数１回）を行った。洗浄後、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）に溶解し、相補鎖とアニーリングさせた。
（２）ビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）の調製
ビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）は北海道システム・サイエンス社から入手した（ＨＰＬＣ精製品）。ビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）は、「ｔｃａａ」、「ｔｃａｔ」、「ｔｃａｇ」および「ｔｃａｃ」からなる塩基配列から選択される２以上（約１０個〜約１００００個）の塩基配列が連結された塩基配列を含む塩基配列を有している。ビオチン化ＤＮＡ基質も上記（１）と同様の方法によりリン酸化した。なお、解析対象ＤＮＡの長さは、通常、最低１０ｂｐ程度、最大１万ｂｐ程度であり、１０００ｂｐ程度が特に好ましい。
（３）量子ドット・ＤＮＡプローブの作成
架橋剤（ＥＤＣ）を用い、下記のようにして、カルボキシル基付量子ドット（５２５、５６５、６０５、６５５）を、それぞれ下記オリゴＤＮＡプローブの５’のアミノ基に共有結合し、量子ドット・ＤＮＡプローブを調製した。
（各カルボキシル基付量子ドットに結合させたオリゴＤＮＡプローブ）
量子ドット５２５：
（Ｑ２１３４１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：１７：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’
配列番号：１８：
５’ａｇｔｔｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｃｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
量子ドット５６５：
（Ｑ２１３３１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：１９：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’
配列番号：２０：
５’ａｇｔａｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｃｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
量子ドット６０５：
（Ｑ２１３０１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：２１：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’
配列番号：２２：
５’ａｇｔｃｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
量子ドット６６５：
（Ｑ２１３２１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）６６５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：２３：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’５’
配列番号：２４：
５’ａｇｔｇｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｃｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
（架橋反応および精製）
各カルボキシル基付量子ドット（８μＭ）２０μｌを、ＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．５μｌ、炭酸塩バッファー（ｐＨ８．５、０．１Ｍ）３０．５μｌおよび各オリゴＤＮＡプローブ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）４８μｌと混合し、室温で３時間インキュベートして各ＤＮＡの５’のアミノ基に共有結合させ、量子ドット・ＤＮＡプローブを調製した。得られた量子ドット・ＤＮＡプローブは、ゲル濾過（ＮＡＰ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ―Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ ｐＨ７．５に溶媒置換した。
（４）ガラス表面への解析対象ＤＮＡの固定
カバーガラスを強アルカリ性洗剤（Ｓｃａｔ ２０ｘ、第一クリーンケミカル）で超音波洗浄した後、メタノールで洗浄し、風乾させた。乾燥後、カバーガラスをビオチンを結合した親水性リンカーで処理し、ガラス表面をコーティングした。２０ｎｇ／ｍｌアビジン（Ａｖｉｄｉｎ、Ｓｉｇｍａ）をビオチンでコーティングしたカバーガラス（固定ガラス）表面にアプライし、１５分間処理した後、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨで洗浄した。洗浄後、（２）で調製したビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）をアプライし、１５分間処理した後、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨで洗浄した。
（５）解析対象ＤＮＡと連結された量子ドット・ＤＮＡプローブの観察
上記（４）で得られた解析対象ＤＮＡが固定化されたカバーバラスをＰＢＳで洗浄した後、上記（３）で得られた量子ドット・ＤＮＡプローブ、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（２μｌ、ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｍ）、ＡＴＰ（１００ｍＭ）、１０ｘ反応バッファー（ＮＥＢｕｆｆｅｒ２、ＮＥＢ）、ＣｌａｓｓＩＩＳ制限酵素（ＮＥＢ、ＦｏｋＩ）、超純水をカバーガラスの表面にのせ、倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００Ｅ）とＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ ＣａｓｃａｄｅＩＩ）により（図６（１）参照）、解析対象ＤＮＡに連鎖反応で結合する量子ドット・ＤＮＡプローブを観察した。量子ドット・ＤＮＡプローブの観察に使用した光学系および画像解析ソフトウェアは下記の通りである。
（光学系および画像解析ソフトウェア）
倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００Ｅ）
対物レンズＡＰＯ ＴＩＲＦ、油浸、１００ｘ ＮＡ１．４９
白色全反射照明装置
高速フィルターチェンジャー（Ｐｒｉｏｒ）
ＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ ＣａｓｃａｄｅＩＩ）
ダイクロイックミラー ５０５ｎｍ
励起フィルター ４５０−４９０ｎｍ
蛍光フィルター ５２０／１０、５６０／１５、６０５／２０、６５５／２０
画像解析ソフトウエア ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
上記の条件で反応を観察し、時間軸に対する色変化を横軸にずらしながら重ねた結果を図７（１）に示す。１ラインが１分子のＤＮＡに結合した量子ドット・ＤＮＡプローブの蛍光に由来し、ラインの左端が時間０を表す。
図７（１）の一部を拡大した画像を図７（２）に示す。解析対象ＤＮＡに結合した量子ドット・ＤＮＡプローブの種類に応じて異なる蛍光が順次取り込まれる様子が観察された。
図７（２）の同じ箇所の連続シーケンスを並べた画像を図７（３）に示す。解析対象ＤＮＡの塩基配列に応じた量子ドット・ＤＮＡプローブの連鎖的な取り込みが１分子レベルで観察された。
実施例１
多分子系における配列特異的な蛍光プローブの取り込み
１塩基突出末端を持つＤＮＡの配列に特異的に結合する蛍光ＤＮＡプローブを検出し、さらにＣｌａｓｓＩＩＳ制限酵素とＤＮＡライゲースとを交互に反応させることで、ＤＮＡの塩基配列を決定した。
（１）解析対象ＤＮＡの基材への固定化
アビジン・アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ９２０７）（１ｘＰＢＳで３０μｌスラリーに懸濁）に、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡ（図３）（配列番号：９：５’ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＴＡＣＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＧＣＡ３’、配列番号：１０：５’ＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＡＧＣ３’、）（１０μＭ）を混ぜて１時間混和し、解析対象ＤＮＡをアビジン・アガロースビーズに固定化した。
（２）解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとの連結
上記（１）で得られた、解析対象ＤＮＡが固定化されたビーズを１ｘＰＢＳで２回洗浄し、さらにＴ４ ＤＮＡライゲースバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄した後、蛍光ＤＮＡプローブ（１０μＭ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ）（１０μｌ）、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ、ＬＧＫ−１０１）（１０μｌ）、を上記のアガロースビーズに混ぜて、２０℃で１時間インキュベートし、１ｘＰＢＳで２回洗浄して、解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとを連結させた。
なお、蛍光ＤＮＡプローブは、図１（１）に示されたプローブ１、３および４と同様の構造のものを用いた。蛍光物質１（蛍光１）としてはＦＩＴＣを、蛍光物質３（蛍光３）としてはＣｙ５を、蛍光物質４（蛍光４）としてはＣｙ３を用いた。
（３）解析対象ＤＮＡと連結された蛍光ＤＮＡプローブの同定
上記（２）で得られた、蛍光ＤＮＡプローブを結合させたビーズの一部を蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ）で観察し、ビーズ表面に結合した蛍光ＤＮＡプローブを同定した。
（４）解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとの連結体の切断
上記（３）で蛍光ＤＮＡプローブを同定したビーズを１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ、Ｂ７００２Ｓ）で１回洗浄した後、ＢｍｒＩ（ＮＥＢ、Ｒ０６００Ｓ）（２μｌ）、１ｘＮＥＢｆｆｅｒ ２をビーズに添加して３７℃で１時間インキュベートし、解析対象ＤＮＡと蛍光ＤＮＡプローブとの連結体を切断した。
その後、１ｘＰＢＳで２回洗浄した。
（５）ＤＮＡ塩基配列の順次同定
上記（２）から（４）を繰り返すことでＤＮＡ塩基配列を順次同定した。
（６）結果
まず、（１）〜（３）を行うことにより、ＦＩＴＣの蛍光が観察され、解析対象ＤＮＡの３’末端の１番目の塩基がＡと同定された。続けて、（４）および（２）〜（３）を繰返し行うことにより、Ｃｙ３の蛍光が観察され、解析対象ＤＮＡの３’末端の２番目の塩基がＣと同定された。さらに、（４）および（２）〜（３）を繰返し行うことにより、Ｃｙ５の蛍光が観察され、解析対象ＤＮＡの３’末端の２番目の塩基がＧと同定された。このようにして、連結した蛍光プローブの蛍光波長により解析対象ＤＮＡの塩基配列が３塩基同定された（図４）。
なお、図３に示されるように、２回目の塩基の同定において、Ｃｙ３の蛍光と共にＦＩＴＣの蛍光が観察された。これは、アビジン・アガロースビーズに結合した複数（１００個程度）の解析対象ＤＮＡの一部が、ＢｍｒＩによる切断を受けずに次の反応へ進んだことを示している。同様に、３回目の塩基の同定においては、Ｃｙ５の蛍光と共に、ＦＩＴＣおよびＣｙ３の蛍光が観察され、これは解析対象ＤＮＡの一部が１回目または２回目のＢｒｍＩによる切断を受けずに次の反応へ進んだことを示している。このように、同時に複数の解析対象ＤＮＡを処理する場合、その一部が未反応のまま次の反応へ進む可能性があるので、１分子観察で識別標識の同定を行うのが望ましい。
実施例２
制限酵素、連結酵素による連鎖反応を１分子観察することで、ＤＮＡの塩基配列の組み合わせを解析した。
（１）量子ドット・ＤＮＡプローブの調製
架橋剤（ＥＤＣ）を用い、量子ドット（５２５、６０５）（Ｑ２１３４１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｑ２１３０１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、それぞれ下記ＤＮＡの５’のアミノ基に共有結合し、量子ドット・ＤＮＡプローブを調製した。
量子ドット５２５（図５（１ａ））：
配列番号：１１：５’ｃｇｔｃｃｃａｇｔａｃｔａｇｔａｔｇｃ３’
配列番号：１２：５’ａｍｉｎｅ−ｇｃａｔａｃｔａｇｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃ３’
量子ドット６０５（図５（１ｂ））：
配列番号：１３：５’ｃｇｔｃｃｃａｇｔａｃｔａｇｔａｔｇｃ３’
配列番号：１４：５’ａｍｉｎｅ−ｇｃａｔａｃｔａｇｔａｃｔｇｇｇａｃｇｔ３’
（２）解析対象ＤＮＡの基材への固定化
まず、カバーガラスの表面にアビジン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９２７５）を固定した。アビジンを固定化したカバーガラスに、解析対象ＤＮＡにビオチンを結合したビオチン化ＤＮＡ（図５（２））、（配列番号：１５：５’ｂｉｏｔｉｎ−ａｃｔｃｇｇｃａｔｇｃｇｃｃａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇ３’、配列番号：１６：５’ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｇｇｃｇｃａｔｇｃｃｇａｇｔ３’）（１００μＭ）を添加し、１時間静置し、解析対象ＤＮＡをカバーガラスに固定化した。
（３）解析対象ＤＮＡと連結された量子ドット・ＤＮＡプローブの観察
解析対象ＤＮＡが固定化されたカバーバラスをＰＢＳで洗浄した後、量子ドットの結合したＤＮＡプローブ（量子ドット・ＤＮＡプローブ）、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（２μｌ、ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）、Ｍ０２０２Ｍ）、ＢｍｒＩ（５μｌ、ＮＥＢ、Ｒ０６００Ｌ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ）をカバーガラスの表面にのせ、１分子蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００ Ｅ，Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＴＩＲＦ １００ｘ ＮＡ１．４５）と３ＣＣＤ（浜松ホトニクス、Ｃ７７８０−２０）により（図６（１））、解析対象ＤＮＡに連鎖反応で結合するプローブを観察した。
（４）結果
解析対象ＤＮＡの塩基配列に応じた量子ドット・ＤＮＡプローブの連鎖的な取り込みが１分子レベルで観察された（図６（２））。
実施例３
複数の解析対象ＤＮＡが固定化された基材を用い、制限酵素、連結酵素による連鎖反応を１分子観察することで、ＤＮＡの塩基配列を同定した。
（１）オリゴＤＮＡのリン酸化
オリゴＤＮＡ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）２００μｌ（北海道システム・サイエンス）に１０ｘ Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）２２μｌ、ＡＴＰ（１００ｍＭ）５μｌ、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ）１０μｌを加え、３７℃で５時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール抽出（フェノール：クロロフォルム＝１：１、Ｖｏｒｔｅｘミキサーにて１０秒間振盪）、クロロフォルム洗浄（Ｖｏｒｔｅｘミキサーにて１０秒間振納盪）、イソプロパノール沈殿（５０％イソプロパノールと０．３Ｍ酢酸ナトリウムで室温にて１分間処理後、２００００×ｇ、１５分間、４℃で遠心。）、および７０％エタノール洗浄（１０００μｌで処理後、２００００×ｇで遠心。洗浄回数１回）を行った。洗浄後、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）に溶解し、相補鎖とアニーリングさせた。
（２）ビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）の調製
ビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）は北海道システム・サイエンス社から入手した（ＨＰＬＣ精製品）。ビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）は、「ｔｃａａ」、「ｔｃａｔ」、「ｔｃａｇ」および「ｔｃａｃ」からなる塩基配列から選択される２以上（約１０個〜約１００００個）の塩基配列が連結された塩基配列を含む塩基配列を有している。ビオチン化ＤＮＡ基質も上記（１）と同様の方法によりリン酸化した。なお、解析対象ＤＮＡの長さは、通常、最低１０ｂｐ程度、最大１万ｂｐ程度であり、１０００ｂｐ程度が特に好ましい。
（３）量子ドット・ＤＮＡプローブの作成
架橋剤（ＥＤＣ）を用い、下記のようにして、カルボキシル基付量子ドット（５２５、５６５、６０５、６５５）を、それぞれ下記オリゴＤＮＡプローブの５’のアミノ基に共有結合し、量子ドット・ＤＮＡプローブを調製した。
（各カルボキシル基付量子ドットに結合させたオリゴＤＮＡプローブ）
量子ドット５２５：
（Ｑ２１３４１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：１７：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’
配列番号：１８：
５’ａｇｔｔｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｃｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
量子ドット５６５：
（Ｑ２１３３１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：１９：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’
配列番号：２０：
５’ａｇｔａｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｃｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
量子ドット６０５：
（Ｑ２１３０１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：２１：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’
配列番号：２２：
５’ａｇｔｃｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
量子ドット６６５：
（Ｑ２１３２１ＭＰ Ｑｄｏｔ（登録商標）６６５ ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
配列番号：２３：
５’ａｍｉｎｅ−ｔｇｃｃｔｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｇａｔｔａｇｃａｃｇａａｇｔｃａｇｇａｔｇｃａｇｔｇ３’５’
配列番号：２４：
５’ａｇｔｇｃａｃｔｇｃａｔｃｃｔｇａｃｔｔｃｇｔｇｃｔａａｔｃｇａｇａｃｇｔａｃａｃａｔｇｔｃａｇｇａ３’
（架橋反応および精製）
各カルボキシル基付量子ドット（８μＭ）２０μｌを、ＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．５μｌ、炭酸塩バッファー（ｐＨ８．５、０．１Ｍ）３０．５μｌおよび各オリゴＤＮＡプローブ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）４８μｌと混合し、室温で３時間インキュベートして各ＤＮＡの５’のアミノ基に共有結合させ、量子ドット・ＤＮＡプローブを調製した。得られた量子ドット・ＤＮＡプローブは、ゲル濾過（ＮＡＰ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ―Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ ｐＨ７．５に溶媒置換した。
（４）ガラス表面への解析対象ＤＮＡの固定
カバーガラスを強アルカリ性洗剤（Ｓｃａｔ ２０ｘ、第一クリーンケミカル）で超音波洗浄した後、メタノールで洗浄し、風乾させた。乾燥後、カバーガラスをビオチンを結合した親水性リンカーで処理し、ガラス表面をコーティングした。２０ｎｇ／ｍｌアビジン（Ａｖｉｄｉｎ、Ｓｉｇｍａ）をビオチンでコーティングしたカバーガラス（固定ガラス）表面にアプライし、１５分間処理した後、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨで洗浄した。洗浄後、（２）で調製したビオチン化ＤＮＡ基質（解析対象ＤＮＡ）をアプライし、１５分間処理した後、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨで洗浄した。
（５）解析対象ＤＮＡと連結された量子ドット・ＤＮＡプローブの観察
上記（４）で得られた解析対象ＤＮＡが固定化されたカバーバラスをＰＢＳで洗浄した後、上記（３）で得られた量子ドット・ＤＮＡプローブ、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（２μｌ、ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｍ）、ＡＴＰ（１００ｍＭ）、１０ｘ反応バッファー（ＮＥＢｕｆｆｅｒ２、ＮＥＢ）、ＣｌａｓｓＩＩＳ制限酵素（ＮＥＢ、ＦｏｋＩ）、超純水をカバーガラスの表面にのせ、倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００Ｅ）とＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ ＣａｓｃａｄｅＩＩ）により（図６（１）参照）、解析対象ＤＮＡに連鎖反応で結合する量子ドット・ＤＮＡプローブを観察した。量子ドット・ＤＮＡプローブの観察に使用した光学系および画像解析ソフトウェアは下記の通りである。
（光学系および画像解析ソフトウェア）
倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００Ｅ）
対物レンズＡＰＯ ＴＩＲＦ、油浸、１００ｘ ＮＡ１．４９
白色全反射照明装置
高速フィルターチェンジャー（Ｐｒｉｏｒ）
ＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ ＣａｓｃａｄｅＩＩ）
ダイクロイックミラー ５０５ｎｍ
励起フィルター ４５０−４９０ｎｍ
蛍光フィルター ５２０／１０、５６０／１５、６０５／２０、６５５／２０
画像解析ソフトウエア ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
上記の条件で反応を観察し、時間軸に対する色変化を横軸にずらしながら重ねた結果を図７（１）に示す。１ラインが１分子のＤＮＡに結合した量子ドット・ＤＮＡプローブの蛍光に由来し、ラインの左端が時間０を表す。
図７（１）の一部を拡大した画像を図７（２）に示す。解析対象ＤＮＡに結合した量子ドット・ＤＮＡプローブの種類に応じて異なる蛍光が順次取り込まれる様子が観察された。
図７（２）の同じ箇所の連続シーケンスを並べた画像を図７（３）に示す。解析対象ＤＮＡの塩基配列に応じた量子ドット・ＤＮＡプローブの連鎖的な取り込みが１分子レベルで観察された。
本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法は、効率的にＤＮＡの塩基配列を決定することができる、クローニングすることなく細胞から抽出したＤＮＡを直接観察することができるなどの特徴を有するので、ＤＮＡの塩基配列決定方法、特にゲノムＤＮＡの塩基配列決定方法として有用である。さらに、比較的小型かつ単純な装置で実現することができるので、臨床分野におけるＤＮＡの塩基配列決定方法、特に患者１人１人のゲノム情報に応じたテーラーメード医療のためのＤＮＡの塩基配列決定方法として有用である。
［配列表］
［配列表］
Claims (29)
- （ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する工程；
（ｂ）前記解析対象ＤＮＡと連結された前記プローブの識別標識の種類を同定する工程；及び
（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する工程
を含む、ＤＮＡの塩基配列決定方法。 - 前記解析対象ＤＮＡの突出末端および前記プローブの突出末端が、いずれも一塩基突出末端である請求項１記載の方法。
- 前記プローブが、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧに相補的な１塩基又は２塩基突出末端を有する４種のプローブを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記プローブの制限酵素の認識配列と突出末端との距離が、前記制限酵素の認識配列と切断部位との距離より一塩基短い、請求項２または３に記載の方法。
- 前記各工程が連鎖反応で行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記識別標識が、蛍光標識、量子ドット又は金属コロイドである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記識別標識の種類の同定が、１分子観察で行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 前記識別標識の種類の同定が、前記蛍光標識の蛍光波長の検出により行われる請求項６記載の方法。
- 前記蛍光波長の検出が、１分子蛍光分光顕微鏡を用いて行われる請求項８記載の方法。
- 同時に複数の解析対象ＤＮＡの塩基配列を決定する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
- 前記制限酵素が、１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- 前記酵素が、クラスＩＩＳ制限酵素である、請求項１１記載の方法。
- 前記解析対象ＤＮＡの突出末端と、前記プローブの突出末端が、いずれも３’突出末端である請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
- 前記制限酵素が、３’末端に１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- 前記酵素が、ＢｍｒＩ、ＢｍｕＩ、ＢｆｉＩ、ＡｓｕＨＰＩ、ＨｐｈＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＮｃｕＩ、ＭｎｌＩ、Ａｓｐ２６ＨＩ、Ａｓｐ２７ＨＩ、Ａｓｐ３５ＨＩ、Ａｓｐ３６ＨＩ、Ａｓｐ４０ＨＩ、Ａｓｐ５０ＨＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｇＩ、ＢｍａＨＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓｃＣＩ、Ｂｓｅ１Ｉ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＫＴ５Ｉ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＳＩ、Ｂｓｔ１１Ｉ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＣＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｓｔＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｔｓｐ１Ｉ、ＴｓｐＤＴＩおよびＴｓｐＧＷＩから選択される、請求項１４記載の方法。
- 前記解析対象ＤＮＡの突出末端と、前記プローブの突出末端が、いずれも５’突出末端である請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
- 前記制限酵素が、５’末端に１塩基又は２塩基突出末端を生成する酵素である、請求項１〜１２および１６のいずれか記載の方法。
- 前記酵素が、ＡｃｌＷＩ、ＡｌｗＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｔＨ９Ｉ、Ｂｓｔ３１ＴＩ、ＥａｃＩ、ＢｃｃＩ、ＨｐｙＣ１Ｉ、ＢｃｅｆＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｓＩ、ＡｃｉＩ、ＢｃｅＡＩ、Ｂｍｅ５８５Ｉ、ＢｓｃＡＩ、Ｂｓｔ１９Ｉ、ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ、ＦａｕＩ、ＳｍｕＩおよびＳｓｉＩから選択される、請求項１７記載の方法。
- 前記基材が、光透過性を有する材料から形成されている請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
- 突出末端を有し、該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識したプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブ。
- 前記突出末端が、１塩基又は２塩基突出末端である請求項２０記載のプローブ。
- 前記認識配列と前記一塩基突出末端との距離が、前記認識配列と前記切断部位との距離より一塩基短い、請求項２１記載のプローブ。
- 前記突出末端が、３’突出末端である請求項２０〜２２のいずれかに記載のプローブ。
- 前記突出末端が、５’突出末端である請求項２０〜２２のいずれかに記載のプローブ。
- 前記認識配列が、クラスＩＩＳ制限酵素の認識配列である、請求項２０〜２４のいずれかに記載のプローブ。
- 請求項２０〜２５のいずれかに記載のプローブを含む、ＤＮＡの塩基配列決定用キット。
- 前記プローブが、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧに相補的な１塩基又は２塩基突出末端を有する少なくとも４種のプローブを含む、請求項２６記載のキット。
- さらに、制限酵素およびＤＮＡ連結酵素を含む、請求項２６または２７に記載のキット。
- （ｉ）測定セル；
（ｉｉ）光学手段；
（ｉｉｉ）光学情報を識別信号に変換する手段；および
（ｉｖ）識別信号を塩基配列情報に変換する手段
を備える、ＤＮＡの塩基配列決定装置であって、前記測定セル内は、
（ａ）突出末端を有する、基材に固定化された解析対象ＤＮＡと、突出末端を有し、かつ該突出末端の塩基の種類に応じて識別標識されたプローブであって、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素の認識配列を含有するプローブとを、ＤＮＡ連結酵素で連結する手段；及び
（ｃ）前記解析対象ＤＮＡと前記プローブとの連結体を、前記認識配列と切断部位とが離れている制限酵素で切断する手段
を備える装置。
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