JP2000515006A - コードアダプターの連結による配列決定 - Google Patents
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- 【特許請求の範囲】 1.ポリヌクレオチド末端のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法 は以下の工程: 1つ以上のコードアダプターをポリヌクレオチドの1つまたは両方の末端に連 結する工程であって、ここで各コードアダプターは、(i)最小にクロスハイブ リダイズするオリゴヌクレオチドのセットから選択されたオリゴヌクレオチドタ グ、および(ii)ポリヌクレオチドの鎖の一部分に相補的な突出鎖、を含む2本 鎖デオキシリボ核酸であり、ここで該最小にクロスハイブリダイズするオリゴヌ クレオチドのセットの各オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのヌクレオチド で該セットの他の全てのオリゴヌクレオチドとは異なる、工程、および タグ相補物を、それに連結された1つ以上のコードアダプターの各オリゴヌク レオチドタグに特異的にハイブリダイズさせることにより、該ポリヌクレオチド 鎖の該部分のそれぞれにおける1つ以上のヌクレオチドを同定する工程、 を包含する、方法。 2.請求項1に記載の方法であって、前記連結する工程が、前記複数の異なるコ ードアダプターの前記突出鎖が前記ポリヌクレオチドの鎖の複数の異なる部分に 相補的であり、その結果、該異なるコードアダプターと該鎖の該異なる部分との 間に1対1の対応が存在するように、該複数の異なるコードアダプターを該ポリ ヌクレオチドの前記末端に連結することを包含する、方法。 3.前記ポリヌクレオチドの鎖の前記異なる部分が連続している、請求項2に記 載の方法。 4.請求項1から3のいずれか1つに記載の方法であって、前記コードアダプタ ーの前記突出鎖が、2から6のヌクレオチドを含み、そして前記同定する工程が 、前記ポリヌクレオチドの前記部分における各ヌクレオチドの同一性が連続的に 決定されるように、前記タグ相補物を前記オリゴヌクレオチドタグに特異的にハ イ ブリダイズさせることを包含する、方法。 5.請求項1から4のいずれか1つに記載の方法であって、前記同定する工程が 、前記ポリヌクレオチドの前記部分において同定されるヌクレオチドの数に等し いタグ相補物の多数のセットを提供することをさらに包含する、方法。 6.請求項5に記載の方法であって、前記同定する工程が、蛍光シグナル発生部 分により発生されるシグナルによって予め決定されたヌクレオチドの存在を同定 し得る前記セットのそれぞれにおいて、前記タグ相補物を提供することをさらに 包含し、ヌクレオチドの各種類について異なる蛍光シグナル発生部分が存在する 、方法。 7.請求項1から6のいずれか1つに記載の方法であって、前記コードアダプタ ーの前記オリゴヌクレオチドタグが1本鎖であり、そして該オリゴヌクレオチド タグに対する前記タグ相補物が1本鎖であり、その結果、オリゴヌクレオチドタ グとそのそれぞれのタグ相補物との間の特異的なハイブリダイゼーションがワト ソン-クリック塩基対形成により生じる、方法。 8.請求項7に記載の方法であって、前記コードアダプターが以下の形態を有し : または ここで、Nはヌクレオチドであり、N'はその相補物であり、pはリン酸基であ り、zは3'水酸基または3'ブロッキング基であり、nは2から6の間の整数であ り、rは0から18の間の整数であり、sは、コードアダプターがヌクレアーゼ認 識部位を有する場合はいつでも4から6の間のいずれかである整数であるか、ま たはヌクレアーゼ認識部位がない場合はいつでも0であり、qは0を超える整数 であるかもしくは0に等しく、そしてtは8を超える整数であるかもしくは8に 等しい、方法。 9.請求項8に記載の方法であって、ここでrが0から12の間であり、tが8か ら20の間の整数であり、そしてzがリン酸基である、方法。 10.請求項1から6のいずれか1つに記載の方法であって、前記コードアダプ ターの前記オリゴヌクレオチドタグが2本鎖であり、そして該オリゴヌクレオチ ドタグに対する前記タグ相補物が1本鎖であり、その結果、オリゴヌクレオチド タグとそのそれぞれのタグ相補物との間の特異的なハイブリダイゼーションがフ ーグスティーンまたは逆フーグスティーン3重鎖の形成により生じる、方法。 11.請求項10に記載の方法であって、前記コードアダプターは以下の形態を 有し: または ここで、Nはヌクレオチドであり、N'はその相補物であり、pはリン酸基であ り、zは3'水酸基または3'ブロッキング基であり、nは2から6の間の整数であ り、rは0から18の間の整数であり、sは、コードアダプターがヌクレアーゼ認 識部位を有する場合はいつでも4から6の間のいずれかである整数であるか、ま たはヌクレアーゼ認識部位がない場合はいつでも0であり、qは0を超える整数 であるかもしくは0に等しく、そしてtは8を超える整数であるかもしくは8に 等しい、方法。 12.請求項11に記載の方法であって、rが0から12の間であり、tが12から 24の間の整数であり、そしてzがリン酸基である、方法。 13.請求項1から12のいずれか1つに記載の方法であって、前記最小にクロ スハイブリダイズするセットのメンバーは、少なくとも6ヌクレオチドで他の全 てのメンバーと異なる、方法。 14.複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該 方法は以下の工程: (a)レパートリー由来の各第1のオリゴヌクレオチドタグが第1の最小にク ロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットから選択されるように、該 タグレパートリー由来の第1のオリゴヌクレオチドタグをポリヌクレオチド集団 中の各ポリヌクレオチドに付着させる工程であって、ここで該第1の最小にクロ スハイブリダイズするセットの各オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのヌク レオチドで該第1のセットの他の全てのオリゴヌクレオチドとは異なる、工程; (b)該ポリヌクレオチドの集団をサンプリングして、サンプル中の実質に全 ての異なるポリヌクレオチドが、付着された異なる第1のオリゴヌクレオチドタ グを有するように、ポリヌクレオチドのサンプルを形成する工程; (c)該第1のオリゴヌクレオチドタグとそれらのそれぞれの相補物とを特異 定にハイブリダイズさせることにより、該サンプルの該ポリヌクレオチドを選別 する工程であって、該それぞれの相補物は、1つ以上の固相支持体の上の空間的 に別々の領域に実質的に同一のオリゴヌクレオチドの均一な集団として付着され る、工程 (d)1つ以上のコードアダプターを該サンプル中の該ポリヌクレオチドの1 つの末端または両末端に連結する工程であって、ここで各コードアダプターは、 (i)オリゴヌクレオチドの最小にクロスハイブリダイズするセットから選択さ れたオリゴヌクレオチドタグ、および(ii)該ポリヌクレオチド鎖の部分に相補 的な突出鎖を含む、2本鎖デオキシリボ核酸であり、第2の最小にクロスハイブ リダイズするセットの各オリゴヌクレオチドは、少なくとも2ヌクレオチドで該 第2のセットの他の全てのオリゴヌクレオチドと異なる、工程;および (e)タグ相補物を1つ以上の該コードアダプターの各第2のオリゴヌクレオ チドタグに特異的にハイブリダイズさせることにより、該ポリヌクレオチドの該 突出鎖における複数のヌクレオチドを同定する工程、 を包含する、方法 15.請求項14に記載の方法であって、(f)新たな突出鎖が前記ポリヌクレ オチドのそれぞれの前記末端に形成されるように、その切断部位から離れたヌク レアーゼ認識部位を有するヌクレアーゼを用いて前記コードアダプターを該ポリ ヌクレオチドから切断する工程、および(g)工程(d)から(f)を反復する 工程、をさらに包含する、方法。 16.mRNA分子の集団を同定する方法であって、該方法は以下の工程: (a)各cDNA分子が、付着された第1のオリゴヌクレオチドタグを有するよう に、該mRNA分子の集団からcDNA分子の集団を形成する工程であって、該第1のオ リゴヌクレオチドタグが、第1の最小にクロスハイブリダイズするオリゴヌクレ オチドのセットから選択され、ここで該第1の最小にクロスハイブリダイズする セットの各オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのヌクレオチドで該第1のセ ットの他の全てのオリゴヌクレオチドと異なる、工程; (b)該cDNA分子の集団をサンプリングして、実質的に全ての異なるcDNA分子 が付着された異なる第1のオリゴヌクレオチドタグを有するようなcDNA分子のサ ンプルを形成する工程; (c)該第1のオリゴヌクレオチドタグをそれらのそれぞれの相補物と特異的 にハイブリダイズさせることにより該cDNA分子を選別する工程であって、該それ ぞれの相補物は、1つ以上の固相支持体上の空間的に別々の領域において実質的 に同一の相補物の均一な集団として付着される、工程; (d)1つ以上のコードアダプターを該集団中の該cDNA分子の末端に連結する 工程であって、ここで各コードアダプターは、(i)最小にクロスハイブリダイ ズするオリゴヌクレオチドのセットから選択されたオリゴヌクレオチドタグ、お よび(ii)該ポリヌクレオチドの鎖の一部分に相補的な突出鎖を含む、2本鎖デ オキシリボ核酸であり、ここで第2の最小にクロスハイブリダイズするセットの 各オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのヌクレオチドで該第2のセットの他 の全てのオリゴヌクレオチドと異なる、工程;および (e)タグ相補物を1つ以上の該コードアダプターの各第2のオリゴヌクレオ チドタグに特異的にハイブリダイズさせることにより、該cDNA分子の該突出鎖の それぞれにおける複数のヌクレオチドの同一性および順序を決定する工程、 を包含し、ここで該mRNA分子の集団が、該cDNA分子の配列の一部分の頻度分布に より同定される、方法 17.請求項16に記載の方法であって、(f)新たな突出鎖が前記cDNA分子の それぞれの前記末端に形成されるように、その切断部位から離れたヌクレアーゼ 認識部位を有するヌクレアーゼを用いて前記コードアダプターを前記ポリヌクレ オチドから切断する工程、および(g)工程(d)から(f)を反復する工程、 をさらに包含する、方法。 18.ポリヌクレオチド末端のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方 法は以下の工程: (a)コードアダプターを該ポリヌクレオチドの末端に連結する工程であって 、ここで各コードアダプターは、(i)最小にクロスハイブリダイズするオリゴ ヌクレオチドのセットから選択されたオリゴヌクレオチドタグ、および(ii)該 ポリヌクレオチドの鎖の一部分に相補的な突出鎖を含む、2本鎖デオキシリボ核 酸であり、ここで該最小にクロスハイブリダイズするセットの各オリゴヌクレオ チドは、少なくとも2ヌクレオチドで該セットの他の全てのオリゴヌクレオチド と異なる、工程; (b)タグ相補物をそれに連結されたコードアダプターの該オリゴヌクレオチ ドタグに特異的にハイブリダイズさせることにより、該ポリヌクレオチド鎖の該 一部分における1つ以上のヌクレオチドを同定する工程; (c)新たな突出鎖が該ポリヌクレオチドの末端に形成されるように、その切 断部位から離れたヌクレアーゼ認識部位を有するヌクレアーゼを用いて、該コー ドアダプターを該ポリヌクレオチド末端から切断する工程;および (d)工程(a)から(c)を反復する工程、 を包含する、方法。 19.請求項18に記載の方法であって、前記コードアダプターの前記突出鎖が 2から6のヌクレオチドを含み、そして前記同定する工程が、前記ポリヌクレオ チドの前記部分における各ヌクレオチドの同一性が連続的に決定されるように、 連続的に前記タグ相補物を前記オリゴヌクレオチドタグに特異的にハイブリダイ ズさせる工程を包含する、方法。 20.請求項19に記載の方法であって、前記同定する工程が、前記ポリヌクレ オチドの前記部分において同定されたヌクレオチドの数に等しい前記タグ相補物 の多数のセットを提供することをさらに包含する、方法。 21.請求項20に記載の方法であって、前記同定する工程が、蛍光シグナル発 生部分により発生されるシグナルにより予め決定されたヌクレオチドの存在を示 し得る前記セットのそれぞれにおいて、前記タグ相補物を提供することをさらに 包含し、ヌクレオチドの各種類について異なる蛍光シグナル発生部分が存在する 、方法。 22.請求項18から21のいずれか1つに記載の方法であって、ここで前記コ ードアダプターの前記オリゴヌクレオチドタグが1本鎖であり、そして前記オリ ゴヌクレオチドタグに対する前記タグ相補物が1本鎖であり、その結果、オリゴ ヌクレオチドタグとそのそれぞれのタグ相補物との間の特異的なハイブリダイゼ ーションがワトソン-クリック塩基対形成により生じる、方法。 23.以下の形態を有する複数の2本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを含む物 質の組成物: または ここで、Nはヌクレオチドであり、N'はその相補物であり、pはリン酸基であ り、zは3'水酸基または3'ブロッキング基であり、nは2から6の間の整数であ り、rは0から18の間の整数であり、sは、コードアダプターがヌクレアーゼ認 識部位を有する場合はいつでも4から6の間のいずれかである整数であるか、ま たはヌクレアーゼ認識部位がない場合はいつでも0であり、qは0を超える整数 であるかもしくは0に等しく、そしてtは8を超える整数であるかもしくは8に 等しく、そして(N)1は、1本鎖であり、そして最小にクロスハイブリダイズする オリゴヌクレオチドのセットの各オリゴヌクレオチドが少なくとも2塩基対で該 セットの他の全てのオリゴヌクレオチドと異なるような該セットから選択される 、組成物。 24.請求項23に記載の組成物であって、ここで前記rが0から12の間であり 、前記tが8から20の間の整数であり、そして前記zがリン酸基である、組成物 。 25.以下の形態を有する複数の2本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを含む物 質の組成物: または ここで、Nはヌクレオチドであり、N'はその相補物であり、pはリン酸基であ り、zは3'水酸基または3'ブロッキング基であり、nは2から6の間の整数であ り、rは0から18の間の整数であり、sは、コードアダプターがヌクレアーゼ認 識部位を有する場合はいつでも4から6の間のいずれかである整数であるか、ま たはヌクレアーゼ認識部位がない場合はいつでも0であり、qは0を超える整数 であるかもしくは0に等しく、そしてtは8を超える整数であるかもしくは8に 等しく、 (N)t (N')t は、最小にクロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットの各オリゴヌ クレオチドが少なくとも2つの塩基対で該セットの他の全てのオリゴヌクレオチ ドと異なるような、該セットから選択される2本鎖部分を形成する、組成物。 26.請求項25に記載の組成物であって、ここで前記rが0から12の間であり 、前記tが12から24の間の整数であり、そして前記zがリン酸基である、組成物 。 27.請求項23から26のいずれか1つに記載の組成物であって、ここで前記 最小にクロスハイブリダイズするセットのメンバーは、少なくとも6つのヌクレ オチドで他の全てのメンバーと異なる、組成物。
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