JP2018138052A - Dna基質を処理するための改善された方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】DNAの物理的断片化の結果として損傷を受けた5’末端塩基を除去し、損傷を受けた塩基の除去により、5’リン酸を伴うライゲーション適合性塩基を露出させる方法を含む、第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含むアダプターポリヌクレオチドであり、第1のオリゴヌクレオチドが5’リン酸を含み、第2のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基とその3’末端に遮断基を含む、アダプターポリヌクレオチド。
【選択図】なし
Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2014年1月31日に出願された米国特許仮出願第61/934,515号、及び2014年11月11日に出願された米国特許仮出願第62/078,309号の優先権の利益を主張するものであり、それらの開示は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、コンピュータ読取り型の配列表(ファイル名:47999A_Seqlisting.txt;2015年1月
29日作成;47,035バイト)を含有する。
全ての市販の次世代シークエンシング(NGS:next-generation sequencing)技術は、計器によるシークエンシングを可能とするために、特異的アダプター配列の対を、DNA断片の末端へとライゲーションする、ライブラリーの調製を要求する。大半のNGSアダプターは、3つの機能的ドメイン:(1)ライブラリー及びクローン増幅のための、固有のPCRプライマーアニーリング配列、(2)固有のシークエンシングプライマーアニーリング配列、並びに(3)固有の試料インデックス化配列を含む。現在のところ、大半のプラットフォームでは、クローン増幅を活用して、各個別のDNAライブラリー分子の数百のコピーを作製する。これは、各ライブラリー分子の配列検出の特定の方式のために発生させるシグナル(例えば、蛍光又はpH)を増幅することを目的とする架橋増幅又はエマルジョンPCRにより達成する。合成によるシークエンシングのためには、シークエンシングプライマーのためのアニーリングドメインを、アダプター−インサート接合部と並置する(ペアドエンドシークエンシングを可能とするために、各アダプターは、プライマーアニーリングのための固有の配列を保有する)。試料インデックス配列は、典型的には6〜8塩基の、短い固有の配列であって、シークエンシングされると、特定の配列リードの試料供給源を同定し、試料のマルチプレックス化又は共シークエンシングを可能とする配列を含む。既存の単一分子シークエンシング技術及び新進の単一分子シークエンシング技術であって、シグナル検出のためのクローン増幅には依拠しないが、両方の鎖の、単一の分子としてのシークエンシングを可能とする、末端のヘアピンループの、DNA二重鎖への付加、又はナノポアに通すためのリーダー配列の導入など、他の目的で、アダプター配列の、それらの末端への結合をなおも要求する技術が存在する。
基質分子は、天然に存在する供給源から得られるか、又は合成でありうることが想定される。天然に存在する供給源は、ゲノムDNA、cDNA、全ゲノム増幅により産生されるDNA、少なくとも1つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びPCRアンプリコンを含むがこれらに限定されない。多様な実施形態では、天然に存在する供給源は、原核生物供給源又は真核生物供給源である。例えば、限定せずに述べると、供給源は、ヒト、マウス、ウイルス、植物若しくは細菌又は複数のゲノムを含む混合物でありうる。
本明細書で使用される「アンプリコン」とは、増幅法を使用して合成されたポリヌクレオチドの部分を意味することが理解される。
本開示は、5’アダプター及び3’アダプターの使用を想定する(図3を参照されたい)。本開示に従い、3’アダプターは任意に、「オリゴヌクレオチド1」及び「オリゴヌクレオチド2」を含む二本鎖である。このような二本鎖基質分子には、2つのオリゴヌクレオチドが、標準的な反応条件下で、互いとアニーリングすることが可能である限りにおいて、任意の長さのオリゴヌクレオチド1及びオリゴヌクレオチド2が想定される。したがって、オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2との間の相補性は、それらが、互いとアニールしうるような相補性である。多様な実施形態では、相補性は、約70%、75%、80%、85%、90%、95〜約100%、又は約70%、75%、80%、85%、90〜約95%、又は約70%、75%、80%、85〜約90%である。具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2との間の相補性の程度は、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%又は100%である。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド2は、非塩基性ヌクレオチド又は非塩基性リボヌクレオチドなど、分解/除去を受けやすいヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2とは、異なる長さであり、オリゴヌクレオチド1は、オリゴヌクレオチド2の長さに沿った任意の位置でハイブリダイズする。
方法のうちの最初の3つのインキュベーションは、プレライゲーションステップであり、(i)脱リン酸化、(ii)ポリッシング及び(iii)任意のアデニル化を含む。方法のうちの残りの2つのインキュベーションは、(1)3’アダプターのライゲーションと、(2)5’アダプターのライゲーションとを含み、(2)は、(a)5’アダプターのアニーリングと、(b)5’塩基の基質分子からの除去と、(c)5’アダプターのライゲーションとを含む(図4〜6を参照されたい)。この態様では、方法は、最大で3つのプレライゲーションステップと、2つのライゲーションステップとを有する。別の態様では、基質分子が、好ましくは、3’アダプターとして用いられる、既存の3’突出を含む場合、方法は、5’アダプターの単一のライゲーションステップを有する(図7aを参照されたい)。
(i)脱リン酸化
アダプターのライゲーションの前に、DNA末端を任意に処理して、アダプターのライゲーション反応の効率を改善する。既存の方法におけるDNA末端の処理では、2つの酵素反応:(a)3’突出を除去し、3’陥凹末端を充填することによりDNA末端をポリッシングする、プルーフリーディングDNAポリメラーゼを伴うインキュベーション、及び(b)リン酸基を5’末端へと付加する、ポリヌクレオチドキナーゼを伴うインキュベーションを使用することが典型的である。DNA末端を処理する場合、一部の方法はまた、3’末端において、ポリッシングされたDNAの、非プルーフリーディングDNAポリメラーゼとのインキュベーションにより、平滑末端化されたDNAもアデニル化する。アデニル化は、DNAの自己ライゲーション及びキメラ産物の形成を防止する一助となる。アデニル化はまた、対応するアダプターの3’末端におけるdTの存在のために、アダプター二量体の形成も最小化する。本発明では、これらの問題に、全く異なる方式で取り組む。DNA断片の5’末端へとリン酸基を付加するのではなく、本発明の方法では、DNA断片の5’末端からのリン酸基の完全な除去を任意で実装する。DNA末端の脱リン酸化は、DNA断片の、DNA末端からリン酸を除去することが可能な酵素とのインキュベーションにより達成する。本開示の方法で、5’リン酸又は3’リン酸を除去するのに有用な酵素の例は、各々が標準的な条件に従い使用される、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、細菌性アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、アンタークティックホスファターゼ、及び胎盤アルカリホスファターゼなど、任意のホスファターゼ酵素を含むがこれらに限定されない。
アルカリホスファターゼの除去又は熱によるその不活化の後で、DNA基質分子を、任意に、dNTPの存在下で、プルーフリーディングDNAポリメラーゼを伴うインキュベーションにかけて、平滑末端を創出する。反応は、標準的な条件に従い実施する。脱リン酸化及びポリッシングされたDNA断片は、3’アダプターの結合には基質として良好であるが、DNA断片のコンカテマーライゲーション及びキメラ形成には基質として良好でない。脱リン酸化及びポリッシングされたDNA断片はまた、従来型のアダプターのライゲーションにも基質として良好でない。
本発明はまた、DNAポリメラーゼIの(エキソ)クレノウ断片、及びTaq DNAポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、非鋳型ポリメラーゼ活性を伴うDNAポリメラーゼを使用する、平滑末端DNA断片の3’末端のアデニル化の使用も想定する。アルカリホスファターゼ処理及びアデニル化のいずれも、DNA断片の自己ライゲーション及びキメラライブラリー分子の形成の傾向を低減する。アデニル化ステップを含む場合、後続のステップで使用される3’アダプターは、単一のT突出を要求するであろう。
(1)3’アダプターのライゲーション又はDNA基質上の一本鎖3’突出の作製
オプションは、図7に描示する。
既存のNGSライブラリーの調製プロトコールは、アダプターの3’OH基と、DNA断片の末端における5’リン酸基とのライゲーションに依拠する。この理由で、従来型の方法で使用されるアダプターは、3’ヒドロキシル基及び任意の5’リン酸基を伴う、1つの官能性の二本鎖末端を有することが典型的である(図1及び2を参照されたい)。これに対し、本発明では、3’アダプターの5’リン酸基とDNA断片の3’OH基とのライゲーション反応を使用するが、3’アダプターの3’末端とDNA断片の5’末端との間にニックを残す(図3を参照されたい)。3’アダプターは、5’リン酸基を伴う官能性の二本鎖末端と、このオプションでは、ライゲーションに適さない3’ヌクレオチド(例えば、2’,3’ジデオキシ塩基又は3’デオキシ塩基など、糖修飾された塩基アナログを含む)とを有する。3’アダプターは、2つのオリゴヌクレオチド:5’末端におけるリン酸基及び3’末端における遮断基(C3スペーサーなど)を有する、オリゴヌクレオチド1と、5’末端におけるリン酸基を欠き、3’末端における非ライゲーション性の塩基を含む、オリゴヌクレオチド2とのアニーリングにより形成する。オリゴヌクレオチド2は加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び/又は修飾連結も含む。大半の適用において、基質分子とのライゲーションに関与する3’アダプターの末端は、平滑末端である。DNA断片のアデニル化を伴う適用では、3’アダプターのライゲーション性末端は、2’,3’ジデオキシチミジン塩基又は3’デオキシチミジン塩基(又はチミン塩基に対する他の修飾であって、隣接する塩基との共有結合的連結を形成するその能力を遮断する修飾)を含有する3’突出を有する。他の適用では、3’アダプターの官能性末端は、複数の塩基を含有する、3’突出又は5’突出を有しうるであろう。DNAリガーゼを伴うインキュベーション時には、3’アダプターの5’リン酸を、DNA基質分子の3’末端へとライゲーションする一方で、3’アダプターの3’末端とDNA基質分子の5’末端との間にはニックを残す。反応が完了した後で、ライゲーションされたDNAを、スピンカラムによる精製又はSPRIビーズベースの精製にかけて、過剰なアダプター及びライゲーション反応の他の成分を除去する。
代替法では、オリゴヌクレオチド2の3’末端における、遮断された、非ライゲーション性塩基を欠く3’アダプターを使用することができる。非遮断オリゴヌクレオチド2の、基質分子へのライゲーションは、やはり、脱リン酸化反応の結果としての、基質分子上の5’リン酸の欠如により防止されるであろう。非遮断オリゴヌクレオチド2を使用する利点は、オリゴヌクレオチド2の3’末端は、ジデオキシヌクレオチドミックスと、ニックトランスレーションによるDNA合成が可能なDNAポリメラーゼとを使用して一塩基伸長させることができることである。これは、基質分子からの5’塩基の切除を実施する代替法(下記で記載される後続のステップを参照されたい)を可能とする。非遮断3’アダプターを使用する短所は、ライゲーション反応時におけるアダプター二量体の創出であり、これは、アダプター濃度を低減し、結果として、アダプターのライゲーション効率を低下させる可能性がある。このオプションではまた、オリゴヌクレオチド2は加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び/又は修飾連結も含む。
一本鎖アダプターを、二本鎖(又は一本鎖)基質分子へと、共有結合的に結合させることが可能なリガーゼ(DNA又はRNA)の存在下では、オリゴヌクレオチド2を反応から除外することができる。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT:terminal deoxynucleotidyl transferase)などの鋳型非依存性ポリメラーゼ、ポリ(A)ポリメラーゼ、ポリ(U)ポリメラーゼ又は3’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くDNAポリメラーゼの存在下で、ヌクレオチドを含むときは、3’アダプター配列として用いられうる、ホモポリマーテール又は他のテールを、基質分子の3’末端に組み込むことができる。
TdTなどの鋳型非依存性ポリメラーゼ、ヌクレオチドの存在下で、リガーゼ及びアテニュエーター−アダプター分子をさらに含むときは、合成テールと、規定された3’アダプター配列とを、基質分子の3’末端に組み込むことができる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2013年3月13日に出願された、国際特許出願第PCT/US13/31104号明細書を参照されたい)。
天然に存在するか、又は先行する酵素的処理又は他の処理から生じる既存の3’突出を、規定された配列又はランダム配列として含む基質分子の場合、別個の3’アダプターのライゲーションステップは、要求されず、省略することができ、この場合、既存の3’突出は、3’アダプターとして用いられうる。
(I)5’アダプターのアニーリング
一本鎖3’アダプターのライゲーション(オプション2)、ホモポリマーの付加(オプション3)又は既存の3’突出の3’アダプターとしての使用(オプション5)の場合は、分解させるか又は置換するオリゴヌクレオチド2が存在しないので、5’アダプターのアニーリングを、他の事項を検討せずに、直接実施することができる。
i)3’アダプターとアニールさせたオリゴヌクレオチド2の分解後におけるオプション
ii)3’アダプターとアニールさせたオリゴヌクレオチド2に対する競合的置換を介するオプション
iii)5’アダプターを、オリゴヌクレオチド1上の、オリゴヌクレオチド2のアニーリング部位と比べてさらに3’側でアニールさせた後における、ニックトランスレーション及びオリゴヌクレオチド2の分解を介するオプション
iv)5’アダプターを、3’アダプターのオリゴヌクレオチド1の3’領域とあらかじめアニールさせた後における、ニックトランスレーション及びオリゴヌクレオチド2の分解を介するオプション
v)3’遮断基を伴う5’アダプターを、3’アダプターのオリゴヌクレオチド1(オリゴヌクレオチド2の代わりに)の5’領域とあらかじめアニールさせた後における、3’遮断基の酵素的切除を介するオプション
のうちのいずれかを使用して、5’アダプターを、3’アダプターへとアニールさせることができる。
3’アダプターのオリゴヌクレオチド2は加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び/又は修飾連結も含む。修飾は、dU塩基、デオキシイノシン及びRNA塩基を含むがこれらに限定されない。一本鎖5’アダプターの、3’アダプターのオリゴヌクレオチド1の5’部分とのアニーリングは、3’アダプター、具体的には、オリゴヌクレオチド2の部分的分解の結果としてなされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド2の分解を、酵素的に、より具体的には、第2のオリゴヌクレオチドが、デオキシウラシル塩基を含有する場合は、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)、若しくはUDGと非プリン性/非ピリミジン性エンドヌクレアーゼとの組合せを使用することにより、又は第2のオリゴヌクレオチドが、デオキシイノシン塩基を含有する場合は、エンドヌクレアーゼVにより達成する。オリゴヌクレオチド2の分解はまた、第2のオリゴヌクレオチドがRNA塩基を含有する場合は、RNアーゼ H1又はRNアーゼ H2を伴うインキュベーションによっても実施することができる。一部の適用では、第2のオリゴヌクレオチドの分解は、化学的又は物理的に、例えば、光によりなされうる。
一部の適用では、5’アダプターの、3’アダプターのオリゴヌクレオチド1とのアニーリングは、オリゴヌクレオチド2の分解を伴わずに行う。この場合、オリゴヌクレオチド2の、一本鎖5’アダプターによる置き換えは、5’アダプターの、オリゴヌクレオチド2のアフィニティーを上回る高アフィニティーであって、オリゴヌクレオチド1と5’アダプター配列との相補性の増大に起因するか、又はその溶融温度を増大させる5’アダプター内の塩基修飾(例えば、LNA塩基)に起因する高アフィニティーにより容易とすることができる。5’アダプターの設計に応じて、3’アダプターのオリゴヌクレオチド1とのアニーリングは、5’アダプターの3’末端とDNA基質分子の5’末端との間のニック若しくはギャップ、又は5’アダプター及びDNA基質分子のそれぞれの、3’塩基と5’塩基との重複を結果としてもたらす。
この場合は、オリゴヌクレオチド2の分解性修飾も、競合的置換も使用しない。そうではなく、5’アダプターは、オリゴヌクレオチド1上の、オリゴヌクレオチド2のアニーリング部位と比べてさらに3’側で、3’アダプターとアニールした後における、限定的ニックトランスレーションによる「チューイングフォワード」により、オリゴヌクレオチド2を置き換え、この結果として、オリゴヌクレオチド2の分解又は部分的分解をもたらす。
これらの場合、5’アダプターは、3’アダプターの部分を構成し、3’アダプターの、DNA基質へのライゲーション時に存在する。オプションivでは、5’アダプターは、オリゴヌクレオチド1上の、オリゴヌクレオチド2のアニーリング部位と比べてさらに3’側で、あらかじめ3’アダプターとアニールさせる(オプションiiiと同様)。オプションvでは、5’アダプターを、3’末端に遮断基を有し、オリゴヌクレオチド2の代わりに、3’アダプターとあらかじめアニールさせる。3’アダプターのライゲーションの後で、5’アダプターの3’末端における遮断基を酵素的に除去して、DNAポリメラーゼによるその伸長を可能とする。
このステップでは、ライゲーション適合性である5’末端のリン酸基の、基質分子上における創出は、DNAポリメラーゼ及びヌクレオチドを使用する、5’アダプターのオリゴヌクレオチドのニックトランスレーション(オプションi)を介するか、ヌクレオチドの非存在下において、5’アダプター及び5’−flapエンドヌクレアーゼを使用する置換−切断反応(オプションii)を介するか、又はオリゴヌクレオチド2からの単一のジデオキシ塩基の伸長に続く、ヌクレオチドの非存在下において、5’−flapエンドヌクレアーゼを使用する、置換−切断(オプションiii)を介する、DNA基質分子の損傷を受けた5’末端塩基の除去により達成する。第3のオプションでは、5’アダプターの代わりにアニールさせたオリゴヌクレオチド2を使用して実施するため、基質分子の5’塩基の切除は、5’アダプターのアニーリングの前に行うが、方法についての記載を単純化するために、本節に組み入れる(図9を参照されたい)。
ニックトランスレーションによるDNA合成は、5’アダプターの3’末端オリゴヌクレオチドと、DNA基質分子の5’末端との間のニック又はギャップにおいて開始され、ライゲーション反応によりニックがシールされたときに停止される(図4及び6aを参照されたい)。ニックトランスレーション反応は、DNAポリメラーゼI(ホロ酵素)、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、及びBst DNAポリメラーゼ(ホロ酵素)などのDNAポリメラーゼによるがこれらに限定されないDNAポリメラーゼにより実施することができる。使用のために想定されるさらなる酵素は、限定なしに述べると、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を伴うDNAポリメラーゼ、5’flapエンドヌクレアーゼ、及び鎖置換ポリメラーゼと5’flapエンドヌクレアーゼとの組合せを含む。
置換−切断反応は、dNTPを要求しないが、5’アダプター配列が、基質分子との重複を創出するように、3’末端に、1、2又は3以上のランダム塩基を含むことを要求し、反応物中に、複数の5’アダプターを含む(図5及び6bを参照されたい)。置換−切断反応は、5’アダプターのアニーリング、5’アダプターの3’塩基と重複する、DNA基質分子の5’DNA塩基の置換、置換された塩基の5’−flapエンドヌクレアーゼによる切断により誘発される。一部の実施形態では、5’アダプターは、3’末端に、1つのランダム塩基dNを有する。この場合、重複は、1つの塩基を伴い、DNA基質分子の5’末端から単一の5’塩基だけを除去し、5’アダプター配列に由来する類似の塩基で置き換える。置換−切断反応の効率は、その末端の3’塩基が、DNA基質分子の5’塩基とミスマッチする場合、5’アダプターを解離させ、再アニールさせるように、反応のサイクリング温度を40℃〜65℃の間とすることにより増大させる。
基質分子の5’塩基の切除に関与する5’アダプターに対する代替的実施形態は、代わりに、先行するステップで、3’アダプターのオリゴヌクレオチド2を、基質分子の5’塩基の切除に関与させる(図9を参照されたい)。
5’アダプターの、基質分子への共有結合的結合は、5’アダプター又はその伸長産物と、基質分子の露出させた5’リン酸とのライゲーションを伴う。DNA基質分子の5’塩基の切除を、ニックトランスレーション反応により達成する場合は、ライゲーション反応により、ポリメラーゼにより伸長させる5’アダプターと、切除されるDNA基質分子の5’末端との間のニックをシールする。DNA基質分子の5’塩基の切除を、置換−切断反応を介して達成する場合は、ライゲーションを、元の5’アダプターのオリゴヌクレオチドと、切除されるDNA基質分子の5’末端との間で行う。多様な実施形態では、このステップにおけるライゲーション反応に関する標準的な条件は、DNA内のニック又はギャップをシールすることが可能な、任意のDNAリガーゼの使用を含む。一実施形態では、リガーゼは、大腸菌DNAリガーゼであり、反応は、10℃〜50℃の間の温度間隔で行う。一部の実施形態では、リガーゼは、Taq DNAリガーゼ、又はAmplリガーゼなどの熱安定性DNAリガーゼであり、反応は、30℃〜75℃の間の温度間隔で行う。
Illumina社製NGSライブラリーの合成は、開示される方法を使用して実施することができる。図10で示されるとおり、Illumina社製ライブラリーは、ニックトランスレーションライゲーション法(左側)又は置換−切断ライゲーション法(右側)を使用して構築することができる。2つのIllumina社製アダプターの結合の順序は、柔軟であり、図10aでは、Illumina社製アダプターP7が、3’アダプターであり、Illumina社製アダプターP5が、5’アダプターであるのに対し、図10bでは、Illumina社製アダプターP5は、3’アダプターであり、Illumina社製アダプターP7は、5’アダプターである。図10で描示されるライブラリーは、PCRを伴わずに構築することもでき、インプット基質DNAの量に応じて、PCR増幅することもできる。代替的に、Illumina社製NGSライブラリーの合成は、開示される方法であって、短縮アダプター配列を使用するため、PCR増幅を要求する方法を使用して実施することもできる(図11を参照されたい)。この場合は、P5又はP7を、短縮アダプターとして導入する(P7だけを示す)が、全長アダプター配列を導入するほか、その5’末端に分解性塩基も含む、PCRプライマーを使用する増幅の後であり、結果として得られるアンプリコンの5’部分の分解後において、アニーリング及びライゲーションにより、P7又はP5を導入することができる。代替的に、短縮分解性プライマーをPCR増幅に使用する場合は、アダプターの残余部分の架橋ライゲーションを実施して、全長配列を完成させることができる。
開示される方法を使用して、全ゲノムシークエンシングと比べて、複雑性及びシークエンシング要件を低減する方策として、特異的標的を選択及び濃縮しうる、NGSライブラリーを構築することができる。このような適用の例は、3’アダプター及び5’アダプターの、ランダムに断片化し、変性させ、プライマーにより伸長させたDNA基質への結合であって、1又は複数のプライマーを、公知のターゲティングされるDNA領域とアニールさせる結合であろう。この場合、ターゲティングされる遺伝子座だけが二本鎖末端を含み、選択されない遺伝子座は一本鎖のままであり、それらの末端におけるアダプターのライゲーションは生じないであろう。
また、開示される方法を使用する、複数の代替的なアダプターの設計及びライゲーション法も提示される。図16では、アダプター配列対の代わりに、単一のアダプター配列を使用して、ライブラリーを構築する。この例では、ライゲーションの前の基質の処理、並びに3’アダプターのライゲーション及び5’アダプターのニックトランスレーションライゲーション又は置換−切断ライゲーションの両方のために、同じステップを使用し、結果として得られるライブラリーを、単一のプライマーを使用してPCR増幅することができる。
本開示の方法を実施するのに、標準的な反応条件に従い使用されうるリガーゼは、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ、T3 DNAリガーゼ又はT7 DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、Ampリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ及び大腸菌RNAリガーゼを含むがこれらに限定されない。多様な実施形態では、本開示は、平滑末端又は粘着(「スティッキー」)末端のライゲーションに適切な反応条件を想定する。一部の実施形態では、粘着末端は、5’突出又は3’突出を含む。
[実施例]
根拠:FAM標識オリゴヌクレオチド系を使用して、フィルインアダプター(図2A)又は3’アダプター(図3)を使用する平滑ライゲーションについて、基質の、アダプターに対する、異なるモル比で調べて、ライゲーション効率及びキメラ形成に対する効果について検討した。
・オリゴヌクレオチド12−900及び13−426(表1)を含有するフィルインアダプター
・3’アダプター;第1のオリゴヌクレオチド13−340(表1)
・3’アダプター;第2のオリゴヌクレオチドオプション1(3’末端に3’デオキシチミジン遮断塩基を伴う)13−559(表1)
・3’アダプター;第2のオリゴヌクレオチドオプション2(3’末端にリン酸基を伴う)13−558(表1)
・FAM基が基質の5’リン酸へのライゲーションを標識する、オリゴヌクレオチド13−562及び13−563から構成されるFAM基質A(表1)
・FAM基が基質の3’OHへのライゲーションを標識し、基質の対応する5’末端がリン酸を有する、オリゴヌクレオチド13−561及び13−564から構成されるFAM基質B(表1)
・FAM基が基質の3’OHへのライゲーションを標識し、基質の対応する5’末端がリン酸を欠く、オリゴヌクレオチド13−560及び13−564から構成されるFAM基質C(表1)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
従来型アダプターのライゲーション反応物を、1倍濃度のT4 DNAリガーゼ緩衝液、10ピコモルのFAM基質A、20若しくは200ピコモルのフィルインアダプター、600unitのT4 DNA Ligase (Rapid)を含むか、又はリガーゼを含まない、10μlの総容量中に集成した。
FAM基質Aは、フィルインアダプター及びT4 DNAリガーゼの存在下で、ライゲーション産物へと転換された(図19、レーン1〜2)。この従来型のアダプターのライゲーションは、使用するアダプターの、基質に対する比が2:1に過ぎない場合(図19、レーン1)、比を20:1とする場合(レーン2)と比較して、ある程度のFAM基質Aによるキメラ形成を示した。T4 DNAリガーゼの非存在下では、ライゲーション産物が観察されなかった(図19、レーン3)。
従来型アダプターのライゲーションは、FAM基質上の5’リン酸を要求し、これは、フィルインアダプターが過剰に存在しない場合、キメラの形成をもたらした。FAM基質が、5’ヒドロキシ基を有し、3’アダプターの3’デオキシチミジン塩基が遮断されている場合(オプション1)であって、アダプター分子間のライゲーションが防止され、基質とアダプターとの間のライゲーションに好適である場合、3’アダプターのライゲーションは、より効率的であり、キメラも少なかった。いずれの場合にも、アダプターの、基質に対する、20:1の比は、ライゲーション産物の形成に好適であった。
根拠
この実験は、物理的にせん断されたゲノムDNAのポリッシングの、従来型のアダプターのライゲーション又は3’アダプターのライゲーションの効率に対する効果について調べるのに実施した。
・オリゴヌクレオチド13−489及び13−426(表1)を含有するフィルインアダプター
・3’アダプター;第1のオリゴヌクレオチド13−340(表1)及び第2のオリゴヌクレオチドオプション1(3’末端に3’デオキシチミジン遮断塩基を含有する)13−559(表1)
・NEBuffer 2(New England Biolabs社製;型番B7002S)
・PCRグレードの100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP:2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・アデノシン5’三リン酸(ATP:Adenosine 5'-Triphosphate)(New England Biolabs社製;型番P0756S)
・DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment(New England Biolabs社製;型番M0210S)
・T4 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製;型番M0203S)
・T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs社製;型番M0201S)
・エキソヌクレアーゼIII(大腸菌)(New England Biolabs社製;型番M0293S)
・アンタークティックホスファターゼ(New England Biolabs社製;型番M0289S)
・アンタークティックホスファターゼ反応緩衝液(New England Biolabs社製;型番B0289S)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・大腸菌ゲノムDNA ATCC 11303株(Affymetrix社製;型番14380)
・M220 Focused-ultrasonicator(Covaris社製;型番PN 500295)
・Pippin Prep(Sage Science社製)
・CDF2010 2% agarose, dye free w/ internal standards(Sage Science社製)
・DNA Clean & Concentrator-5(Zymo research社製;型番D4004)
・25bpラダーDNAサイズマーカー(Invitrogen(Life technologies)社製;型
番10488-022)
大腸菌ゲノムDNA(gDNA:genomic DNA)を、DNA懸濁緩衝液(Teknova社製;型番T0227)中に、100ng/ulの濃度で再懸濁させた。DNAを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、150塩基対の平均サイズへと断片化した。その後、Pippin Prepを使用して、約150bp〜約185bpの緊密なサイズ分布の断片化DNAを、2%のアガロースゲル上で単離した。
せん断されたDNA基質上の5’リン酸を要求する、従来型のアダプターのライゲーション反応(図20、上パネル)は、これを要求しない3’アダプターのライゲーション(図20、下パネル)より低い効率を示した。ライゲーション反応は、両方いずれの種類のライゲーションについても、DNAを、T4 DNAポリメラーゼ単独(レーン3)又はクレノウと組み合わせたT4 DNAポリメラーゼ(レーン7)又はクレノウプラスエキソヌクレアーゼIIIと組み合わせたT4 DNAポリメラーゼ(レーン8)で処理した後において、より効率的であった。クレノウ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ又はアンタークティックホスファターゼ単独(それぞれ、レーン4、5及び6)による処理は、平滑ライゲーションを、非処理DNA(レーン2)と比較して、中程度に増強するに過ぎなかった。レーン9には、緊密な範囲分布の断片化DNAをロードした。
平滑アダプターの、せん断されたDNAへのライゲーションは、このDNAのポリッシングに高度に依存する。強力な5’−3’エキソヌクレアーゼ活性及び5’−3’ポリメラーゼ活性を提示する、T4 DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼは、この目的によく適する。従来型のアダプターのライゲーション反応は、基質の平滑末端上の無傷の5’リン酸の存在に依存する。しかし、3’アダプターのライゲーションは、ライゲーションが、断片化DNAの3’ヒドロキシル末端で生じるので、これに依存しない。せん断されたDNAの5’末端は、T4 DNAポリメラーゼの酵素基質ではないので、これにより、なぜ、3’アダプターが、フィルインアダプター(レーン3)よりライゲーションに成功するのかが説明される。T4 DNAポリメラーゼプラスクレノウ及びエキソヌクレアーゼIIIの組合せは、平滑ライゲーションを著明に増強した。エキソヌクレアーゼIII活性は、DNAの3’末端において損傷を受けた可能性がある3’ヒドロキシル末端を除去することにより、平滑アダプターのライゲーションに要求される平滑末端を産生した。エキソヌクレアーゼIIIはまた、3’ホスファターゼ活性も保有し、これは、3’末端を、DNAポリメラーゼによるポリッシング活性に対してアクセス可能とする。
根拠:この実験では、ニックトランスレーションにより媒介される5’アダプターのライゲーションの温度依存性及びdNTP組成を評価した。
・ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−144)(表1)
・FAMオリゴヌクレオチド基質(13−581)(表1)
・オリゴヌクレオチド鋳型(13−582)(表1)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・E. coli DNA Ligase(New England Biolabs社製;型番M0205S)
・10倍濃度のE. coli DNA Ligase Reaction Buffer(New England BioLabs社製)
・25U/ulに濃縮されたTaq DNAポリメラーゼ(Genscript社製;型番E00012)
・25bpラダーDNAサイズマーカー(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10488-022)
ニックトランスレーション反応物の第1のセットを、1倍濃度の大腸菌DNAリガーゼ緩衝液、30ピコモルのFAMオリゴヌクレオチド基質、45ピコモルのニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び45ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、200μMのdTTP又はdTTP/dGTPの各々200uMずつ若しくはdATP/dTTP/dGTPの各々200uMずつのミックス並びに2.5unitのTaq DNAポリメラーゼの最終濃度を含むか、又はTaq DNAポリメラーゼを含まない、30μlの総容量中に集成した。反応物を、30℃、40℃又は50℃で30分間にわたりインキュベートした。
図21、パネルAにおいて示されるとおり、Taq DNAポリメラーゼは、その5’flapエンドヌクレアーゼ活性により、FAMオリゴヌクレオチド基質上のヌクレオチドを除去しながら、ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’ヒドロキシル末端を伸長させた。dTTPだけ(図21、レーン2、5、8、パネルA)の添加は、ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’末端における、1塩基だけの付加を可能とし、dTTP/dGTP(図21、レーン3、6、9、パネルA)の添加は、3塩基の付加を可能とし、dTTP/dGTP/dATP(図21、レーン4、7、10、パネルA)の添加は、4塩基の付加を可能としたが、これらは、FAMオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の数(図21、パネルA)に比例した。また、FAMオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の数は、反応が生じる温度にも依存した。50℃(図21、レーン2〜4、パネルA)では、FAMオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の量は、40℃又は30℃で切断される量より大きかった。また、ニックトランスレーションの効率及び切断されるFAMオリゴヌクレオチド基質の量も、反応の温度に高度に依存した。40℃又は30℃では、dTTPだけの添加(図21、レーン5、8、パネルA)は、50℃で観察されるFAMオリゴヌクレオチド基質の切断(図21、レーン2、パネルA)を可能としなかった。dTTP/dGTP又はdTTP/dGTP/dATPの添加は、40℃でもある程度の切断を可能とした(レーン6及び7)又は30℃(レーン9及び10)が、有効性は、50℃の場合(レーン3及び4)より小さかった。レーン1(図21、パネルA)は、Taq DNAポリメラーゼの非存在下におけるFAMオリゴヌクレオチド基質を示す。
ニックトランスレーション時に、FAMオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の数は、反応物中に導入される相補性dNTPと、反応が生じる温度とに依存した。ニックトランスレーション反応時に、Taq DNAポリメラーゼは、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端を切断し、大腸菌リガーゼが2つの断片をライゲーションするのに不可欠な、末端の5’リン酸を作製する。高温でニックトランスレーションにより切断されるFAMオリゴヌクレオチド基質は、5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’末端と、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端との間に形成される潜在的なギャップのために、大腸菌リガーゼによるライゲーションのための基質として良好でなかった。
根拠:この実験は、変化させるdNTP組成の存在下で生じるニックトランスレーションの程度及びこれとカップリングさせたライゲーション反応に対する効果を評価するのに実施した。
・ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−144)(表1)
・FAMオリゴヌクレオチド基質(13−581)(表1)
・オリゴヌクレオチド鋳型(13−582)(表1)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・25bpラダーDNAサイズマーカー(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10488-022)
・E. coli DNA Ligase(Enzymatics社製;型番L6090L)
・10倍濃度のE. coli DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6090)
・Taq−B DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7250L)
反応物を、1倍濃度の大腸菌DNAリガーゼ緩衝液、30ピコモルのFAMオリゴヌクレオチド基質、45ピコモルのニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び45ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、各々200μMずつである4つのdNTP又は各々200μMずつである、dCTP、dTTP、dGTP;若しくはdATP、dTTP、dGTP;若しくはdATP、dCTP、dGTP;若しくはdATP、dTTP、dCTPのミックス(又はdNTPを含まない)、10unitの大腸菌リガーゼ及び10unitのTaq−B DNAポリメラーゼの最終濃度を含む、30μlの総容量中に集成した。全ての反応物を、40℃で30分間にわたりインキュベートした。これらの反応物10μlを、2倍濃度のホルムアミドローディングバッファー(97%のホルムアミド、10mMのEDTA、0.01%のブロモフェノールブルー及び0.01%のキシレンシアノール)10μlと混合し、95℃で5分間にわたり加熱し、その後、65℃のオーブン内の、TBE−尿素プレキャスト15%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社製;型番S11494)上で泳動させ、Dark readerライトボックス(Clare Chemical Research社製)上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した(下パネル)。その後、ゲルを、SYBR(登録商標)Gold核酸ゲル染色色素(Invitrogen社製;型番S11494)で染色し、Dark readerライトボックス(Clare Chemical Research社製)上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した(上パネル)。
図22の最初の2つのレーンは、対照オリゴヌクレオチドを示す。FAM基質は、5’リン酸修飾を欠くため、Taq−B DNAポリメラーゼの非存在下における、大腸菌リガーゼ単独では、5’アダプターのオリゴヌクレオチドを、FAMオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションすることができない(図22、レーン3)。Taq−B DNAポリメラーゼ及び4つのdNTPの存在下では、5’アダプターのオリゴヌクレオチドは伸長し、58塩基の新たな産物を形成し、FAMオリゴヌクレオチド基質は、置換され、Taq−B DNAポリメラーゼの5’flapエンドヌクレアーゼ活性により分解された(図22、レーン4)。大腸菌リガーゼ、Taq−B DNAポリメラーゼ及びdATP/dTTP/dGTP(図22、レーン7)又はdCTP/dTTP/dGTP(図22、レーン6)又はdATP/dTTP/dCTP(図22、レーン9)の存在下では、ニックトランスレーションは、それぞれ、4、3又は1塩基の付加に限定された。5’アダプターの伸長に伴い、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端に、flapが形成された。このflapは、ライゲーションに要求される5’リン酸を創出するTaq−B 5’flapエンドヌクレアーゼ活性のための基質となる。5’アダプターは、FAMオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションされ、69塩基の産物を形成した。3又は4塩基のflap(図22、レーン6及び7)は、1塩基のflap(図22、レーン9)より効率的にライゲーションを支援した。大腸菌リガーゼ、Taq−B DNAポリメラーゼ及びdATP/dCTP/dGTP(図22、レーン8)の存在下では、ライゲーション産物に対応する弱いバンドが観察された。ライゲーション活性の弱さは、「非マッチ」塩基(Tの代わりにC又はG)の組み込みに由来するが、これは、一部のFAMオリゴヌクレオチド基質上では、flapの形成をもたらす。大腸菌リガーゼ、Taq−B DNAポリメラーゼの存在下であっても、dNTPの非存在下では、ライゲーション産物は、観察されなかった。大腸菌リガーゼ、Taq−B DNAポリメラーゼ及び4つのdNTPの存在下では、5’アダプターは、FAMオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションされ、69塩基の産物を形成した(図22、レーン5)。5’アダプター及びオリゴヌクレオチド鋳型は、FAMオリゴヌクレオチド基質と比較して過剰に存在したので、ニックトランスレーション産物はまた、58塩基においても観察された(図22、レーン5、上パネル)。しかし、観察されたライゲーション産物の量は、同じであった。レーンMには、25bpラダーDNAサイズマーカーをロードした。
ライゲーションには、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端のリン酸化が要求される。dNTPの存在下では、5’アダプターの伸長を実施するのに、Taq DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性が要求され、これにより、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端には、flapが創出される。このflapは、Taq DNAポリメラーゼの5’flapエンドヌクレアーゼ活性の基質として良好であり、大腸菌リガーゼによるライゲーションのための完全な5’リン酸基質を作製する。flapが1つの塩基だけにより形成される場合であってもなおライゲーションは生じる。ライゲーションはまた、4つのdNTP全てが存在する場合にも生じ、flapの長さ又はニックトランスレーションの程度を制限しないことから、ライゲーションは、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端において、5’リン酸が創出された直後に生じることが示唆される。
根拠:この実験は、反応温度及びカップリング反応内のTaq DNAポリメラーゼ酵素のunit数の効果を評価するのに実施した。
・ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−144)(表1)
・FAMオリゴヌクレオチド基質(13−581)(表1)
・オリゴヌクレオチド鋳型(13−582)(表1)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・Taq DNA Ligase(New England Biolabs社製;型番M0208S)
・10倍濃度のTaq DNA ligase Reaction Buffer(New England BioLabs社製)
・25U/ulに濃縮されたTaq DNAポリメラーゼ(Genscript社製;型番E00012)
反応物を、1倍濃度のTaq DNAリガーゼ反応緩衝液、30ピコモルのFAMオリゴヌクレオチド基質、45ピコモルのニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び45ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、各々200μMずつのdATP、dTTP、dGTP又はdTTP、40unitのTaq DNAリガーゼ、又は80unitのTaq DNAリガーゼ、又は120unitのTaq DNAリガーゼ並びに10unitのTaq DNAポリメラーゼの最終濃度を含む、30μlの総容量中に集成した。反応物を、45℃、50℃、55℃、又は60℃で30分間にわたりインキュベートした。これらの反応物10μlを、2倍濃度のホルムアミドローディングバッファー(97%のホルムアミド、10mMのEDTA、0.01%のブロモフェノールブルー及び0.01%のキシレンシアノール)10μlと混合し、95℃で5分間にわたり加熱し、その後、65℃のオーブン内の、TBE−尿素プレキャスト15%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社製;型番S11494)上で泳動させ、Dark readerライトボックス(Clare Chemical Research社製)上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
Taq DNAポリメラーゼは、その5’flapエンドヌクレアーゼ活性により、FAMオリゴヌクレオチド基質上のヌクレオチドを除去しながら、5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’ヒドロキシル末端を伸長させた。dTTP/dGTP/dATP(図23、レーン2〜5、パネルA)又はdTTP(図23、レーン6〜9、パネルA)の添加は、それぞれ、5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’末端における、4及び1塩基の付加、及び後続のFAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端の切断を可能とした。60℃では、ライゲーションが損われた(図23、レーン5及び9、パネルA)。ライゲーションの効率は、dTTP/dGTP/dATP(図23、レーン2〜5、パネルA)又はdTTP(図23、レーン6〜9、パネルA)を添加することの影響を受けなかった。ライゲーション効率は、反応物中に存在するTaq DNAリガーゼの量に依存した。ライゲーション産物は、120unitのTaq DNAリガーゼ(図23、レーン4、パネルB)を、反応物へと添加する場合に、40又は80unitのTaq DNAリガーゼ(それぞれ、図23、レーン2及び3、パネルB)場合と比較して、より豊富であった。レーン1、パネルA及びレーン1、パネルBは、酵素を伴わない対照オリゴヌクレオチドを示す。
ニックトランスレーション反応時に、Taq DNAポリメラーゼは、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端を切断し、Taq DNAリガーゼが、45℃〜60℃の間で、ライゲーションを実施するのに不可欠な5’リン酸の末端を作製する。60℃では、ライゲーションが低減した。反応物中のTaq DNAリガーゼの濃度はまた、ライゲーションの効率にも影響を及ぼした。120Uの酵素の存在下では、80U及び40Uの場合と比較して、多くの産物が観察された。
根拠:この実験は、置換−切断−ライゲーション反応のカップリングにおいて、熱安定性Taq DNAリガーゼ又は熱不安定性大腸菌リガーゼを、Taq DNAポリメラーゼと組み合わせうることを実証するのに実施した。
・置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−156)(表1)
・FAMオリゴヌクレオチド基質(13−581)(表1)
・オリゴヌクレオチド鋳型(13−582)(表1)
・Taq DNA Ligase(New England Biolabs社製;型番M0208S)
・10倍濃度のTaq DNA ligase Reaction Buffer(New England BioLabs社製)
・25U/ulに濃縮されたTaq DNAポリメラーゼ(Genscript社製;型番E00012)
・E. coli DNA Ligase(New England Biolabs社製;型番M0205S)
・10倍濃度のE. coli DNA Ligase Reaction Buffer(New England BioLabs社製)
反応物を、1倍濃度の大腸菌DNAリガーゼ反応緩衝液又は1倍濃度のTaq DNAリガーゼ反応緩衝液、30ピコモルのFAMオリゴヌクレオチド基質、45ピコモルの置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び45ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、10unitの大腸菌DNAリガーゼ又は40unitのTaq DNAリガーゼ、並びに10unitのTaq DNAポリメラーゼの最終濃度を含む、30μlの総容量中に集成した。反応物を、40℃又は45℃で30分間にわたりインキュベートした。これらの反応物10μlを、2倍濃度のホルムアミドローディングバッファー(97%のホルムアミド、10mMのEDTA、0.01%のブロモフェノールブルー及び0.01%のキシレンシアノール)10μlと混合し、95℃で5分間にわたり加熱し、その後、65℃のオーブン内の、TBE−尿素プレキャスト15%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社製;型番S11494)上で泳動させ、Dark readerライトボックス(Clare Chemical Research社製)上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチドは、追加のマッチング塩基「T」を、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端と重複する、その3’末端に有する。5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’末端が、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端を置換すると、Taq DNAポリメラーゼの5’flapエンドヌクレアーゼ活性は、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端を切断して、大腸菌リガーゼ(図24、レーン2、パネルA)又はTaq DNAリガーゼ(図24、レーン2、パネルB)によるライゲーションに不可欠な5’リン酸を創出する。パネルA及びBのレーン1は、酵素を伴わないオリゴヌクレオチド対照を示す。
dNTPの非存在下では、5’アダプターの伸長は、生じなかった。しかし、Taq DNAポリメラーゼは、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端を切断し、大腸菌DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼがライゲーションを実施するのに不可欠な末端の5’リン酸を作製しうる。
根拠:この実験では、flapエンドヌクレアーゼを使用する、5’アダプターのライゲーションは、5’アダプターの3’末端の突出が、配列特異的なマッチであるか、又はこれが、縮重した非配列特異的な「N」から構成される場合に実施しうることを実証する。
・置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチド「T」(13−607)(表1)
・置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」(13−596)(表1)
・FAMオリゴヌクレオチド基質(13−581)(表1)
・オリゴヌクレオチド鋳型(13−582)(表1)
・Taq DNA Ligase(New England Biolabs社製;型番M0208S)
・10倍濃度のTaq DNA ligase Reaction Buffer(New England BioLabs社製)
・25U/ulに濃縮されたTaq DNAポリメラーゼ(Genscript社製;型番E00012)
・E. coli DNA Ligase(New England Biolabs社製;型番M0205S)
・10倍濃度のE. coli DNA Ligase Reaction Buffer(New England BioLabs社製)
反応物を、1倍濃度のTaq DNAリガーゼ反応緩衝液、30ピコモルのFAMオリゴヌクレオチド基質、45ピコモルの5’アダプターのオリゴヌクレオチド「T」又は45ピコモルの5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」1又は180ピコモルの5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」又は450ピコモルの5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」及び45ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、40unitのTaq DNAリガーゼ、並びに10unitのTaq DNAポリメラーゼの最終濃度を含む、30μlの総容量中に集成した。反応物を、45℃若しくは50℃若しくは55℃で30分間にわたり、又は45℃で3分間、65℃で15秒間のサイクル8回にわたりインキュベートした。これらの反応物10μlを、2倍濃度のホルムアミドローディングバッファー(97%のホルムアミド、10mMのEDTA、0.01%のブロモフェノールブルー及び0.01%のキシレンシアノール)10μlと混合し、95℃で5分間にわたり加熱し、その後、65℃のオーブン内の、TBE−尿素プレキャスト15%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社製;型番S11494)上で泳動させ、Dark readerライトボックス(Clare Chemical Research社製)上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド鋳型にマッチするその3’末端に、「T」を有する(図25、レーン3、5、7、パネルA)、(FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端と重複する)場合、ライゲーションは、5’アダプターのオリゴヌクレオチドが、縮重した「N」塩基を有し、オリゴ合成時に、全ての4つのヌクレオチドがこの位置に存在した(図25、レーン2、4、6、パネルA)場合であって、オリゴヌクレオチド鋳型に対して完全なマッチとなるのは、4分の1の確率であるに過ぎない場合より、高速で生じた。異なる反応温度(45℃、50℃及び55℃)について調べたが、5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」を使用するライゲーションは改善されなかった(図25、レーン2、4、6、パネルA)。また、異なる量の5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」(45ピコモル、180ピコモル及び450ピコモル)についても調べたが、ライゲーション反応は改善されなかった(図25、レーン3〜5、パネルB)。しかし、45℃〜65℃の間における、反応の温度サイクリングは、ライゲーションが、5’アダプターのオリゴヌクレオチドの「T」マッチング塩基の場合と同等の最高速度で生じることを可能とした(図25、レーン6、パネルB)。パネルA及びBのレーン1は、酵素を伴わないオリゴヌクレオチド対照を示す。
5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」を使用して、置換−切断カップリングさせた、効率的な5’アダプターのライゲーションを可能とするには、Taq DNAリガーゼを作動させるための第1の温度と、オリゴヌクレオチド鋳型と5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」との間の二重鎖を解離させうる第2の温度との間のサイクリングが極めて重要であった。サイクリング条件は、5’アダプターのオリゴヌクレオチド「N」とオリゴヌクレオチド鋳型との間の複数の会合を可能としたが、置換−切断反応が生じたのは、5’アダプターのオリゴヌクレオチドの3’末端塩基が、鋳型との完全なマッチであり、FAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端を置換しうる場合に限られた。
根拠:この実験では、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を保有するDNAポリメラーゼIはまた、ニックトランスレーションとカップリングさせたアダプターのライゲーション法にも関与しうることを実証する。
・ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−144)(表1)
・FAMオリゴヌクレオチド基質(13−581)(表1)
・オリゴヌクレオチド鋳型(13−582)(表1)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・25bpラダーDNAサイズマーカー(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10488-022)
・E. coli DNA Ligase(Enzymatics社製;型番L6090L)
・10倍濃度のE. coli DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6090)
・Taq−B DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7250L)
・DNAポリメラーゼI(New England Biolabs社製;型番M0209S)
反応物を、1倍濃度の大腸菌DNAリガーゼ緩衝液、30ピコモルのFAMオリゴヌクレオチド基質、45ピコモルのニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び45ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、各々200μMずつである4つのdNTP、10unitの大腸菌リガーゼ並びに10unitのTaq−B DNAポリメラーゼ又は5unitのDNAポリメラーゼI又は1unitのDNAポリメラーゼIの最終濃度を含む、30μlの総容量中に集成した。反応物を、40℃、18℃、16℃又は14℃で30分間にわたりインキュベートした。10μlの各反応物を、2倍濃度のホルムアミドローディングバッファー(97%のホルムアミド、10mMのEDTA、0.01%のブロモフェノールブルー及び0.01%のキシレンシアノール)10μlと混合し、95℃で5分間にわたり加熱し、その後、65℃のオーブン内の、TBE−尿素プレキャスト15%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社製;型番S11494)上で泳動させ、SYBR goldを伴うか又は伴わずに(それぞれ、上パネル及び下パネル)、Dark readerライトボックス(Clare Chemical Research社製)上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
図26の第1のレーンは、酵素による制御が存在しないことを示す。Taq−B DNAポリメラーゼ及び大腸菌リガーゼ(図26、レーン2)の存在下では、5’アダプターのオリゴヌクレオチドは、FAMオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションされ、69塩基の産物を産生する(図26、レーン2、上パネル及び下パネル)か、又は完全に伸長し、58塩基の新たな産物を形成した(図26、レーン2、上パネル)。69塩基の産物は、Taq−B DNAポリメラーゼによる伸長及びFAMオリゴヌクレオチド基質の5’末端におけるflapの形成に由来した。Taq−B 5’flapエンドヌクレアーゼ活性は、flapを切除し、大腸菌リガーゼにより使用される5’リン酸を作製して、ライゲーションを完成させた。58塩基の産物は、FAMオリゴヌクレオチド基質が、伸長の間に完全に置換され、Taq−B DNAポリメラーゼの5’flapエンドヌクレアーゼ活性により分解される場合に得られた。これらの2つの種類の産物はまた、Taq−B DNAポリメラーゼを、成長しつつあるDNA鎖の前方のヌクレオチドを1つずつ除去し、ニックトランスレーションが生じることを可能とする、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼIにより置き換えた場合(図26、レーン3〜8)にも形成された。反応は、5unitのDNAポリメラーゼI(図26、レーン3〜5)又は1unitのDNAポリメラーゼI(図26、レーン6〜8)により実施した。好熱性のTaq−B DNAポリメラーゼによる反応は、40℃(図26、レーン2)で実施したが、中温性のDNAポリメラーゼIによる反応は、18℃(図26、レーン3及び6)、16℃(図26、レーン4及び7)又は14℃(図26、レーン5及び8)で実施した。69塩基のライゲーション産物は、全ての場合に得られたが、1unitのDNAポリメラーゼI(図26、レーン6〜8)だけの添加が、5unit(図26、レーン3〜5)の場合より効率的であった。これは、それがライゲーションされうる前に、FAMオリゴヌクレオチド基質の迅速な部分的分解を引き起こす、DNAポリメラーゼの極めて強力な5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により説明される。分解産物は、下パネルの下方で観察された(図26、レーン3〜5)。レーンMには、25bpラダーDNAサイズマーカーをロードした。
Taq−B DNAポリメラーゼ(好熱性のポリメラーゼ)及びDNAポリメラーゼI(中温性のポリメラーゼ)のいずれも、ニックトランスレーションに媒介されるライゲーションを実施するのに使用しうるが、完全に活性となるには、異なる条件を要求する。これらはいずれも、69塩基の産物を作製し、これは、5’末端の切除に続くライゲーションの結果であったが、異なる機構が使用されている。Taq−Bが、大腸菌リガーゼによるライゲーションに要求される5’リン酸化末端を産生するのに切除されるflapを創出するのに対し、DNAポリメラーゼIは、成長しつつある鎖の前方のヌクレオチドを1つずつ除去し、5’リン酸化されたヌクレオチドを作製し、これは、2つの断片を接合する大腸菌リガーゼの完全な基質となった。DNAポリメラーゼIを使用して、ニックトランスレーションに媒介される5’アダプターのライゲーションを実施することができる。
根拠:この実験では、アダプターの、物理的にせん断されたDNA基質への平滑ライゲーションに対する、末端のポリッシング及び脱リン酸化の重要性を実証する。
・Blue Buffer(Enzymatics社製;型番B0110)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・アデノシン5’三リン酸(ATP)(New England Biolabs社製;型番P0756S)
・DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment(New England Biolabs社製;型番M0210S)
・T4 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製;型番M0203S)
・T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs社製;型番M0201S)
・エビアルカリホスファターゼ(Affymetrix社製;型番78390)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・大腸菌ゲノムDNA ATCC 11303株(Affymetrix社製;型番14380)
・M220 Focused-ultrasonicator(Covaris社製;型番PN 500295)
・Pippin Prep(Sage Science社製)
・DNA Clean & Concentrator-5(Zymo research社製;型番D4004)
・CDF2010 2% agarose, dye free w/ internal stds(Sage Science社製)
大腸菌gDNAを、DNA懸濁緩衝液(Teknova社製;型番T0227)中に、100ng/ulの濃度で再懸濁させた。DNAを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、150塩基対の平均サイズへと断片化した。その後、Pippin Prepを使用して、約150bp〜約185bpの緊密なサイズ分布の断片化DNAを、2%のアガロースゲル上でサイズ選択した。
ポリッシング前には、物理的にせん断されたDNAは、T4 DNAリガーゼによる平滑末端アダプターへのライゲーションに適する基質ではなかった(図27、レーン1)。T4ポリヌクレオチドキナーゼ、T4 DNAポリメラーゼ及びクレノウ断片によるポリッシング後に、DNA末端は平滑化され、一部の5’末端はリン酸化され、分子は、互いに連鎖又はライゲーションされうるほか、平滑アダプターへも連鎖又はライゲーションされうる(図27、レーン2及び4)。約325塩基、約500塩基及び500塩基超における分子種は、それぞれ、約175塩基ずつを、2分子、3分子及び4分子として併せたライゲーションに対応する(図27、レーン2及び4)。DNAの濃度は、ライゲーション産物の形成に影響を及ぼした。高DNA濃度では、高分子量のキメラライゲーション種が、より豊富であった(図27、レーン4)。ポリッシングステップ後における、DNAの、エビアルカリホスファターゼによる処理は、DNA分子間のコンカテマー形成を損った(図27、レーン3及び5)。エビアルカリホスファターゼによる処理はまた、断片化DNAのポリッシングの前に実施した場合にも、コンカテマー形成を防止した(図27、レーン6)。T4 DNAポリメラーゼ及びクレノウ断片によるポリッシング後に観察されるライゲーション産物(図27、レーン7)は、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼによるポリッシングの場合と比較して豊富ではなかった(図27、レーン2)。
物理的にせん断されたDNAの平滑ライゲーション効率は、DNAポリメラーゼによる末端のポリッシングに依存した。ライゲーションはまた、DNA断片の5’末端をリン酸化し、3’末端を脱リン酸化する、T4ポリヌクレオチドキナーゼの添加によっても改善された。DNAの濃度はまた、ライゲーション及びキメラ産物の形成の量にも影響を及ぼした。高濃度では、DNAは、T4 DNAリガーゼの存在下で、キメラ産物を形成する可能性が高かった。アルカリホスファターゼは、5’リン酸(ライゲーションに要求される)を除去し、キメラライゲーション産物(コンカテマー)の形成を防止する。
根拠:この実験では、NGSライブラリーの構築へのそれらの例示的適用において提示される反応の有用性、特に、5’アダプターのライゲーションとカップリングさせた5’塩基のトリミングを組み入れることから生じるライブラリー収率の増大を実証する。ライブラリーは、せん断されたDNAのサイズ選択から構築したので、ライブラリー産物は、ゲル電気泳動により容易に可視化することができた。
・Blue Buffer(Enzymatics社製;型番B0110)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・アデノシン5’三リン酸(ATP)(New England Biolabs社製;型番P0756S)
・クレノウ断片(Enzymatics社製;型番P7060L)
・T4 DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7080L)
・T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Enzymatics社製;型番Y904L)
・エビアルカリホスファターゼ(Affymetrix社製;型番78390)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・3’アダプター;第1のオリゴヌクレオチド13−501(表1)
・3’アダプター;第2のオリゴヌクレオチド13−712(表1)
・大腸菌ゲノムDNA ATCC 11303株(Affymetrix社製;型番14380)
・M220 Focused-ultrasonicator(Covaris社製;型番PN 500295)
・E. coli DNA Ligase(Enzymatics社製;型番L6090L)
・E. coli DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6090)
・ウラシルDNAグリコシラーゼ(Enzymatics社製;型番G5010L)
・Taq−B DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7250L)
・ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−489)(表1)
・置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−595)(表1)
・Taq DNAリガーゼ(Enzymatics社製;型番L6060L)
・SPRIselect(Beckman coulter社製;型番B23419)
大腸菌ゲノムDNAを、DNA懸濁緩衝液(Teknova社製;型番T0227)中に、100ng/μlの濃度で再懸濁させた。DNAを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、150塩基対の平均サイズへと断片化した。その後、Pippin Prepを使用して、約150bp〜約185bpの緊密な分布の断片化DNAを、2%のアガロースゲル上でサイズ選択した。
ライブラリー濃度は、プロット(図28、パネルA)上で報告し、ライブラリーは、6%のポリアクリルアミドゲル上で、変性条件下における電気泳動により可視化した(図28、パネルB)。インプットDNAは、約150塩基〜約185塩基の間を移動した(図28、レーンI、パネルB)。3’アダプターのライゲーションステップ後にアリコートを採取し、ゲル上にロードした。この産物は、64塩基の3’アダプターの付加に対応する、約225〜約250塩基の間を移動した(図28、レーンL、パネルB)。5’アダプターのライゲーションの前の、DNAの5’末端における、1又は2以上の塩基の除去及び5’リン酸基の露出における、Taq−B DNAポリメラーゼの寄与を、ライブラリー2と対比したライブラリー1において実証した(図28、レーン1及び2、パネルA及びB)。Taq−Bを伴わずに作製されたライブラリー1の濃度(2.6nM)は、Taq−B DNAポリメラーゼを伴って作製されたライブラリー2の濃度(7.9nM)の3分の1である。T4ポリヌクレオチドキナーゼによる処理の後であってもなお、断片化DNAのうちの75%は、ライゲーション適合性とするために、それらの5’末端の処理を要求した。完成したライブラリーもまた、ゲル上にロードした(図28、レーン1及び2、パネルB)。これらのライブラリーは、58塩基のニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド又は置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び64塩基の3’アダプターの付加に対応する、約275塩基〜約300塩基の間を移動した。ライブラリー1の産物が提示されるときの強度は、ライブラリー2のバンドより小さかった(図28、パネルB)。ライブラリー3及び4は、それぞれ、3’アダプターの部分的分解ステップ、5’アダプターのアニーリングステップ、5’末端のトリミングステップ及び5’アダプターのライゲーションステップにおいて、dATP、dTTP、dGTP及び大腸菌リガーゼ又はTaq DNAリガーゼにより作製された。ライブラリー3の濃度(4.8nM)は、ライブラリー2の濃度(7.9nM)の約60%であった。この収率の30%の喪失は、大腸菌ゲノム内のシトシン「C」の比率(25%)と関連する。DNA基質の5’末端がシトシンであるたびに、Taqにより、ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチドを伸長することができず、5’末端をトリミングすることもできない。また、DNA基質の5’末端において、2及び3の連続シトシンを有するさらなる確率も、それぞれ、6.25%及び1.5%存在する。Taq DNAリガーゼによる、45℃におけるライゲーション(ライブラリー4)も、40℃における大腸菌リガーゼ(5.2nM)(ライブラリー3)と比較して、同様の収率(4.8nM)をもたらした。置換−切断のための5’アダプターのオリゴヌクレオチドにより作製されたライブラリー5(4.2nM)は、ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチドにより作製されたライブラリー2(7.9nM)ほど効率的ではなかった。
開示されるアダプターのライゲーション法によるライブラリーの作製は成功した。Taq DNAポリメラーゼによる5’末端DNAのトリミングは、5’末端の処理ステップを有さないライブラリーと比較した場合、5’アダプターのライゲーション産物の収率の3倍の増大を可能とする(ライブラリー2と対比したライブラリー1)。Taq DNAリガーゼ(ライブラリー4)及び大腸菌リガーゼ(ライブラリー3)のいずれも、ニックトランスレーションの後で、5’アダプターを効率的にライゲーションした。Taq DNAリガーゼはまた、置換−切断の後でも、5’アダプターをライゲーションした(ライブラリー5)。ニックトランスレーション時に、3つのdNTP(ライブラリー3及び4)の代わりに、4つのdNTP(ライブラリー2)を使用することにより、より多くのDNA基質の、5’アダプターへのライゲーションを可能とすることができる。
根拠:この実験では、NGSライブラリーの構築へのそれらの例示的適用において提示される反応の有用性を実証する。ライブラリーは、せん断された大腸菌DNAから構築し、次いで、ゲノムの広範な塩基組成にわたり得られるカバレッジの優れた均一性を実証するために、シークエンシングした。
・Blue Buffer(Enzymatics社製;型番B0110)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・PCRグレード100mM 2’デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)セット(Invitrogen(Life technologies)社製;型番10297-018)
・アデノシン5’三リン酸(ATP)(New England Biolabs社製;型番P0756S)
・クレノウ断片(Enzymatics社製;型番P7060L)
・T4 DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7080L)
・T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Enzymatics社製;型番Y904L)
・エビアルカリホスファターゼ(Affymetrix社製;型番78390)
・T4 DNA Ligase (Rapid)(Enzymatics社製;型番L6030-HC-L)
・10倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6030)
・3’アダプター;第1のオリゴヌクレオチド13−510(表1)
・3’アダプター;第2のオリゴヌクレオチド13−712(表1)
・大腸菌ゲノムDNA ATCC 11303株(Affymetrix社製;型番14380)
・M220 Focused-ultrasonicator(Covaris社製;型番PN 500295)
・E. coli DNA Ligase(Enzymatics社製;型番L6090L)
・E. coli DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6090)
・ウラシルDNAグリコシラーゼ(Enzymatics社製;型番G5010L)
・Taq−B DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7250L)
・ニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド(13−489)
・SPRIselect(Beckman coulter社製;型番B23419)
大腸菌ゲノムDNAを、DNA懸濁緩衝液(Teknova社製;型番T0227)中に、100ng/μlの濃度で再懸濁させた。DNAを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、150塩基対の平均サイズへと断片化した。100ngの大腸菌covaris社ゲノムDNAを使用して、ライブラリーを調製した。第1の脱リン酸化反応物を、1倍濃度のBlue Buffer、100ngの断片化された大腸菌ゲノムDNA及び1unitのエビアルカリホスファターゼの最終濃度を含む、15μlの総容量中に集成した。反応物を、37℃で10分間にわたりインキュベートした。エビアルカリホスファターゼは、65℃で5分間にわたり不活化させた。ポリッシング反応物を、1倍濃度のBlue Buffer、各々100μMずつのdNTP、3unitのT4 DNAポリメラーゼ、5unitのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment及び15μlの脱リン酸化反応物の最終濃度を含む、30μl中に集成した。反応物を、20℃で30分間にわたりインキュベートした。DNA Clean & Concentrator-5を使用して、DNAを精製した。DNAを、DNA懸濁緩衝液を伴う15μl中に溶出させた。3’アダプターのライゲーション反応物を、1倍濃度のT4 DNAリガーゼ緩衝液、220ピコモルの3’アダプターの第1のオリゴヌクレオチド、440ピコモルの3’アダプターの第2のオリゴヌクレオチド、ポリッシング後において精製された15μlのDNA及び1200unitのT4 DNAリガーゼを含む、30μl中に集成した。反応物を、25℃で15分間にわたりインキュベートした。容量を50μlへと調整した後で、45μlのSPRIselectビーズ(0.9倍の比)を使用して、DNAを精製及びサイズ選択した。DNAを、15μlのDNA再懸濁緩衝液中に溶出させた。3’アダプターの部分的分解、5’アダプターのアニーリング、5’末端のDNAトリミング及び5’アダプターのライゲーションの全ては、次の反応物であって、1倍濃度の大腸菌DNAリガーゼ、各々200μMずつのdNTP、200ピコモルのニックトランスレーションのための5’アダプターのオリゴヌクレオチド、10unitの大腸菌リガーゼ、2unitのウラシルDNAグリコシラーゼ、10unitのTaq−B DNAポリメラーゼ及び3’アダプターのライゲーション反応後において精製された15μlのDNAを含有する、30μlの最終容量中に集成された反応物中で行った。反応物を、40℃で10分間にわたりインキュベートした。容量を50μlへと調整した後で、70μlのSPRIselectビーズ(1.4倍の比)を使用して、DNAを精製した。DNAを、20μl中に溶出させ、Kapa Library Quantification Kit - Illumina/Universal(型番KK4824)を使用するqPCRにより定量化した。DNAを、最終濃度を0.1mMとする水酸化ナトリウムで5分間にわたり変性させ、600μlの10pMのライブラリーを、MiSeq(Illumina社製)上にロードした。
qPCRにより定量化されたライブラリー濃度は、2.8nMであった。76塩基のペアエンドリードは、Illumina社製MiSeqのv2化学反応により作製した。928K/mm2のクラスターが作製され、スコアQ30は、第1のリード及び第2のリードについて、それぞれ、97.8%及び96.9%であった。配列データの品質は、FastQC報告書(Babraham Bioinformatics社製)を使用して評価した。解析の概要は、緑色のチェックマーク9つ、黄色のエクスクラメーションマーク(警告)2つを示したが、赤色の×マーク(不合格)は、観察されなかった(図29、パネルA)。全配列中の全塩基の全体的なGC%は、大腸菌ゲノムについて予測されるとおり、50%であった(緑色のチェックマーク、図29、パネルB)。配列の品質は、解析された76塩基を通して、あらゆるリードにおいて優良であった(緑色のチェックマーク、図29、パネルC)。各塩基の比率を、パネルDにプロットした。G/C量とA/T量との差違は、任意のリードにおいて、10%未満であった(緑色のチェックマーク、図29、パネルD)。GC含量は、解析された76塩基を通して、同様であった(緑色のチェックマーク、図29、パネルE)。各配列の全長にわたるリードごとのGC含量を、理論的分布と比較した(黄色のエクスクラメーションマーク、図29、パネルF)。警告は、15%を超えるリードにおいて、正規分布からの偏差和が見出されたために発せられた(黄色のエクスクラメーションマーク、図29、パネルF)。「塩基ごとのN含量」又は「配列長の分布」については、警告が発せられなかった(「概要」、図29、パネルA)。「配列の複製レベル」は、35.85%であった(図29、パネルG)。黄色の警告は、135倍という高レベルのカバレッジで、非固有の配列が、全体のうちの20%超を占めるために発せられた(黄色のエクスクラメーションマーク、図29、パネルG)。過剰表示配列又はkマーは、報告されなかった(「概要」、図29、パネルA)。事実上、アダプター二量体は、観察されなかった(0.02%、データは図示しない)。また、GCバイアスも、Picard CollectGcBiasMetricsを使用して査定した。カバレッジの均一性は、広範にわたる塩基組成を通じて保存された。カバレッジの偏差が観察されるのは、GC含量が、10%未満であるか又は80%を超える場合に限られた。塩基品質は、塩基コールにおける99.8%の確度に対応する、Q25を上回った。ここでもまた、低品質が観察されるのは、GC含量が極度に低値の場合と極度に高値の場合に限られた。
断片化された大腸菌ゲノムDNAを使用するライブラリーの作製に成功した。シークエンシングは、GC含量の範囲を通じて、データ品質が高く、カバレッジにバイアスが見られないことを実証した。
根拠:合計51のアンプリコンを、TP53遺伝子の全コード領域のほか、がんの臨床で適用可能な変異を表す、30のホットスポット遺伝子座もカバーするように設計した。
・ヒトHapMapゲノムDNA(Coriell Institute、NA12878)
・KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix(KAPA Biosystems社製;型番KK2802)
・102の標的特異的プライマー(表2)
・3’アダプターのオリゴヌクレオチドの短縮配列及び切断性塩基を含有するユニバーサルプライマー14−882(表2)
・E. coli DNA Ligase Buffer(Enzymatics社製;型番B6090)
・アダプターのライゲーションステップのための、5’アダプターのオリゴヌクレオチド(14−571)
・アダプターのライゲーションステップのための、3’アダプターのオリゴヌクレオチドの5’部分(14−877)
・アダプターのライゲーションステップのための、リンカーオリゴヌクレオチド14−382(表2)
・E. coli DNA Ligase(Enzymatics社製;型番L6090L)
・ウラシルDNAグリコシラーゼ(Enzymatics社製;型番G5010L)
・エンドヌクレアーゼVIII(Enzymatics社製;型番Y9080L)
・Taq−B DNAポリメラーゼ(Enzymatics社製;型番P7250L)
・SPRIselect(Beckman coulter社製;型番B23419)
・精製ステップのための、20%のPEG-8000/2.5MのNaCl溶液
ヒトゲノムDNAを、DNA懸濁緩衝液(Teknova社製;型番T0227)中に、2ng/μlの濃度で希釈した。2分間にわたりボルテックスすることにより、DNAを軽くせん断した。この10ngのせん断されたゲノムDNAを使用して、ライブラリーを調製した。増幅の第1の反応物を、1倍濃度のKAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix、10ngのせん断されたヒトゲノムDNA、300ピコモルのユニバーサルプライマー及び最終濃度を0.85uMとされ、異なる比で存在する、102の標的特異的プライマーのミックスの最終濃度を含む、30μlの総容量中に集成した。この反応物を、以下のサイクリングプログラム:95℃で3分間に続いて、98℃で20秒間、63℃で5分間及び72℃で1分間の4サイクルにかけて、標的特異的アンプリコンを作製し、98℃で20秒間及び64℃で1分間の23サイクルにより終結させて、標的特異的アンプリコンの複数のコピーを産生した。容量を50μlへと調整した後で、60μlのSPRIselectビーズ(1.2倍の比)を使用して、DNA産物を精製した。ビーズを、1倍濃度の大腸菌リガーゼ緩衝液、100ピコモルのリンカーオリゴヌクレオチド、10unitの大腸菌リガーゼ、10unitのエンドヌクレアーゼVIII、2unitのウラシルDNAグリコシラーゼ、20unitのTaq−B DNAポリメラーゼ、100ピコモルの5’アダプターのオリゴヌクレオチド及び100ピコモルの3’アダプターのオリゴヌクレオチドの5’部分を含有する1倍濃度の反応物ミックス50μl中に再懸濁させた。反応物を、37℃で10分間にわたりインキュベートし、次いで、42.5μlの20%のPEG-8000/2.5MのNaCl溶液(0.85倍の比)を添加することにより精製した。DNAを、20μl中に溶出させ、Kapa Library Quantification Kit - Illumina/Universal(型番KK4824)を使用するqPCRにより定量化した。DNAを、最終濃度を0.1mMとする水酸化ナトリウムで5分間にわたり変性させ、600μlの10pMのライブラリーを、MiSeq(Illumina社製)上にロードした。
qPCRにより定量化されたライブラリー濃度は、19.1nMであった。101塩基のペアドエンドリードは、Illumina社製MiSeqのv2化学反応により作製した。データ解析の前に、Cutadaptプログラムを使用して合成プライマー配列を除去するように、リード1及びリード2の両方の5’末端からの配列特異的トリミングを実施した。BWA-MEMツールを使用して、ヒトゲノム及びターゲティングされる領域へと対合させたリードのアライメントは、例外的な高品質データを示し、98%が、ターゲティングされる領域へと配列決定された。また、BEDtoolsを使用して、カバレッジデータも得た。カバレッジの均質性は、100%であったが、これは、51のアンプリコンの各々が、最終的なライブラリー内で表示されることを意味する。また、各アンプリコン内の各個別の塩基のカバレッジも計算したところ、塩基ごとの平均カバレッジより20%大きかったが、これは、51のアンプリコンのうちのいずれも、最終産物内で過小表示されないことを意味する。図45は、TP53遺伝子のコードエクソンをカバーする重複アンプリコンについて得られたカバレッジについて描示する。図46は、VarScan及びSAMtoolsを使用する配列解析により得られた、頻度18%のバリアントのコールについて描示する。
ターゲティング型アンプリコンライブラリーは、ヒトゲノムDNAを使用する作製に成功した。シークエンシングは、高品質データを実証した。
1.処理された基質分子を産生する方法であって、
(i)第1のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である基質分子の3’末端へとライゲーションするステップと;
(ii)アニーリングを促進する条件下で、第2のポリヌクレオチドを、第1のポリヌクレオチドとアニールさせるステップと;
(iii)少なくとも1つのヌクレオチドを、基質分子の5’末端から切除するステップと;次いで、
(iv)第2のポリヌクレオチドを、二本鎖基質分子の5’末端へとライゲーションして、処理された基質分子を産生するステップと
を含む方法。
2.ステップ(i)の前に、基質分子を、ホスファターゼ酵素と接触させるステップをさらに含む、項1の方法。
3.基質分子を、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼ酵素と接触させることにより、平滑末端化された基質分子を作製するステップをさらに含む、項2の方法。
4.基質分子を、鋳型非依存性ポリメラーゼと接触させて、基質分子の3’末端をアデニル化するステップをさらに含む、項3の方法。
5.基質分子が、天然に存在するか、又は基質分子が、合成である、項1〜4のいずれかの方法。
6.基質分子が、天然に存在する、項5の方法。
7.基質分子が、ゲノムDNAである、項6の方法。
8.ゲノムDNAが、真核生物ゲノムDNA又は原核生物ゲノムDNAである、項7の方法。
9.ゲノムDNAを、インビトロ又はインビボで断片化する、項7又は8の方法。
10.インビトロにおける断片化を、せん断、エンドヌクレアーゼによる切断、超音波処理、加熱、アルファ線源、ベータ線源、又はガンマ線源を使用する照射、金属イオンの存在下における化学的切断、ラジカルによる切断、及びこれらの組合せからなる群から選択される工程により実施する、項9の方法。
11.インビボにおける断片化を、アポトーシス、放射線、及びアスベストへの曝露からなる群から選択される工程により行う、項9の方法。
12.基質分子が、合成であり、cDNA、全ゲノム増幅により産生されるDNA、少なくとも1つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びPCRアンプリコンからなる群から選択される、項5の方法。
13.第1のポリヌクレオチドが、少なくとも部分的に二本鎖であり、オリゴヌクレオチド1及びオリゴヌクレオチド2を含む、項1〜12のいずれかの方法。
14.第2のポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド1とアニールする、項13の方法。
15.アニーリングが、ニック、ギャップ、又は第2のポリヌクレオチドと基質分子との重複塩基を結果としてもたらす、項14の方法。
16.第2のポリヌクレオチドを、ポリメラーゼと接触させ、その結果、オリゴヌクレオチド2の分解をもたらす、項14又は15の方法。
15.オリゴヌクレオチド2が、分解を受けやすい塩基を含む、項13〜16のいずれかの方法。
16.オリゴヌクレオチド2が、ライゲーションを防止する、その3’末端における遮断基を含む、項13〜17のいずれかの方法。
17.第2のポリヌクレオチドが、修飾塩基を含む、項1〜16のいずれかの方法。
18.アニーリングが、オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2とのデハイブリダイゼーションを結果としてもたらす、項14の方法。
19.(i)第3のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である、さらなる基質分子の3’末端へとライゲーションするステップと;
(ii)アニーリングを促進する条件下で、第4のポリヌクレオチドを、第3のポリヌクレオチドへとアニールさせるステップと;
(iii)少なくとも1つのヌクレオチドを、さらなる基質分子の5’末端から切除するステップと;次いで、
(iv)第4のポリヌクレオチドを、二本鎖のさらなる基質分子の5’末端へとライゲーションして、処理された、さらなる基質分子を産生するステップと
をさらに含む、項1〜18のいずれかの方法。
20.第1のポリヌクレオチドと第3のポリヌクレオチドとが、同じである、項19の方法。
21.第2のポリヌクレオチドと第4のポリヌクレオチドとが、同じである、項19又は20の方法。
Claims (38)
- 第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含むアダプターポリヌクレオチドであって、
前記二本鎖部分が、前記第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第2のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチドが、5’リン酸を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基とその3’末端に遮断基を含み、
前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択され、
前記遮断基が、3’−デオキシチミジン、3’−デオキシアデニン、3−’デオキシグアニン、3’−デオキシシトシン及び2’3’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、前記アダプターポリヌクレオチド。 - 第1のオリゴヌクレオチドの第1の切片が、一本鎖部分を形成する、請求項1に記載のアダプターポリヌクレオチド。
- 第1の切片が、第1のオリゴヌクレオチドの第2の切片の3’側であり、
前記第2の切片が、第2のオリゴヌクレオチドと二本鎖部分を形成する、請求項2に記載のアダプターポリヌクレオチド。 - 遮断基が、3’−デオキシチミジンである、請求項1に記載のアダプターポリヌクレオチド。
- 分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジンである、請求項1に記載のアダプターポリヌクレオチド。
- 第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含む3’アダプターポリヌクレオチドであって、
前記二本鎖部分が、前記第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第2のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチドが、5’リン酸を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドが、その3’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、3’−デオキシチミジン、3’−デオキシアデニン、3’−デオキシグアニン、3’−デオキシシトシン及び2’3’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、前記3’アダプターポリヌクレオチド;と、
基質核酸分子の5’末端からリン酸を除去するためのホスファターゼと、
前記基質核酸分子の3’陥凹末端の充填及び3’突出の切除のための、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ;と、
少なくとも1つの2’−デオキシヌクレオシド5’三リン酸(dNTP)と、
前記3’アダプターポリヌクレオチドを前記基質核酸分子の3’末端にライゲーションするための第1のリガーゼ;と
を含む、次世代シークエンシングアダプター系。 - 第2のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基を含み、前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択される、請求項6に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 分解を受けやすい塩基を認識するエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項7に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- エンドヌクレアーゼが、UDGプラスエンドヌクレアーゼVIII、RNアーゼ HI、RNアーゼ H2、及びエンドヌクレアーゼVからなる群から選択される、請求項8に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 3’アダプターポリヌクレオチドの第1のオリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的な第1の配列を含む5’アダプターポリヌクレオチド;
前記5’アダプターポリヌクレオチドを基質核酸分子の5’末端にライゲーションするための第2のリガーゼ;及び
ニックトランスレーション活性を有するDNAポリメラーゼ、
をさらに含む、請求項6に記載の次世代シークエンシングアダプター系。 - 第2のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基を含み、前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、イノシン、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項10に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 分解を受けやすい塩基を認識するエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項11に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- エンドヌクレアーゼが、UDGプラスエンドヌクレアーゼVIII、RNアーゼ HI、RNアーゼ H2、及びエンドヌクレアーゼVからなる群から選択される、請求項12に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 第1のリガーゼが、大腸菌DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T3リガーゼ、及びT7リガーゼからなる群から選択される、請求項10に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 第2のリガーゼが、大腸菌DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T3リガーゼ、T7リガーゼ、Taqリガーゼ、及びAmpリガーゼからなる群から選択される、請求項10に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 5’アダプターポリヌクレオチドが、一本鎖である、請求項10に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 第2のリガーゼが、第1のリガーゼと同一である、請求項10に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
- 以下のステップを含む、加工された基質核酸分子を産生する方法。
(i) ホスファターゼ酵素を、基質核酸分子を含む試料に適用するステップであって、前記基質核酸分子が、二本鎖である、ステップ;
(ii)前記ホスファターゼ酵素が、前記基質核酸分子の5’末端からリン酸を除去することを可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップ;
(iii)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ及びdNTPを前記試料に適用するステップ;
(iv)前記3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが、前記基質核酸分子の平滑末端化を可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップ;
(v)3’アダプターポリヌクレオチド及び第1のリガーゼを前記試料に適用するステップであって、前記3’アダプターポリヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含み、前記二本鎖部分が、前記第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第2のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチドが、5’リン酸を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドが、その3’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、3’−デオキシチミジン、3’−デオキシアデニン、3’−デオキシグアニン、3’−デオキシシトシン及び2’3’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、ステップ;及び
(vi)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記基質核酸分子の3’末端へのライゲーションを可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートし、第1の加工された基質核酸分子を産出するステップ; - ホスファターゼ酵素が、仔ウシ腸ホスファターゼ又はエビホスファターゼである、請求項18に記載の方法。
- (iv-a)鋳型非依存性ポリメラーゼを試料に適用し、基質分子の3’末端をアデニル化するステップをさらに含み、ステップ(iv-a)が、ステップ(iv)の後かつステップ(v)の前に行われる、請求項18に記載の方法。
- 基質核酸分子が、ゲノムDNAであり、ステップ(i)の前に、前記基質核酸分子を、せん断、エンドヌクレアーゼによる切断、超音波処理、加熱、化学的切断、又はその組み合わせからなる群から選択される処理によって断片化するステップを含む、請求項18に記載の方法。
- 基質核酸分子が、ゲノムDNAであるか、又は前記基質核酸分子が、合成であり、かつ、cDNA、全ゲノム増幅により産生されるDNA、少なくとも1つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びPCRアンプリコンからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 基質核酸分子が、循環無細胞DNAである、請求項18に記載の方法。
- 第1のリガーゼが、大腸菌DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T3リガーゼ、及びT7リガーゼからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 第2のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基を含み、前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 以下のステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
(vii)エンドヌクレアーゼを試料に適用するステップあって、前記エンドヌクレアーゼが、分解を受けやすい塩基を認識するステップ;
(viii)前記エンドヌクレアーゼが、前記分解を受けやすい塩基の分解を可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップ; - エンドヌクレアーゼが、UDGプラスエンドヌクレアーゼVIII、RNアーゼ HI、RNアーゼ H2、及びエンドヌクレアーゼVからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- ステップ(vii)が、5’アダプターポリヌクレオチド、第2のリガーゼ、少なくとも1つのdNTP、及びニックトランスレーション活性を有するDNAポリメラーゼを試料に適用するステップをさらに含み、前記5’アダプターポリヌクレオチドが、3’アダプターポリヌクレオチドの第1オリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的である第1の配列を含み、
ステップ(viii)において、条件は、
(a) 前記5’アダプターポリヌクレオチドの3’アダプターの第1のオリゴヌクレオチドへのアニーリングを促進すること、
(b)DNAポリメラーゼによるニックトランスレーションを可能にすること、及び
(c)前記5’アダプターポリヌクレオチドの基質分子の5’末端へのライゲーションを可能にすること
のために十分であり、
ステップ(viii)の完了後、第1の加工された基質核酸分子が、前記核酸分子の両鎖のそれぞれ3’末端及び5’末端にライゲーションされた前記3’アダプターポリヌクレオチド及び前記5’アダプターポリヌクレオチドを含む、第2の加工された基質核酸分子である、請求項26に記載の方法。 - 第2のリガーゼが、大腸菌DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T3リガーゼ、T7リガーゼ、Ampリガーゼ、及びTaqリガーゼからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 以下のステップをさらに含む、請求項18に記載の方法。
(vii)5’アダプターポリヌクレオチド、第2のリガーゼ、少なくとも1つのdNTP、及びニックトランスレーション活性を有するDNAポリメラーゼを試料に適用するステップであって、前記5’アダプターポリヌクレオチドが、前記3’アダプターポリヌクレオチドの第1のオリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的である第1の配列を含むステップ;
(viii)(a)前記5’アダプターポリヌクレオチドの3’アダプターの第1のオリゴヌクレオチドへのアニーリングを促進すること、
(b)DNAポリメラーゼによるニックトランスレーションを可能にすること、及び
(c)前記5’アダプターポリヌクレオチドの基質分子の5’末端へのライゲーションを可能にすること
のために十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップであって、
ステップ(viii)の完了後、第1の加工された基質核酸分子が、前記基質核酸分子の両鎖のそれぞれ3’末端及び5’末端にライゲーションされた前記3’アダプターポリヌクレオチド及び前記5’アダプターポリヌクレオチドを含む、第2の加工された基質核酸分子である、ステップ; - 5’アダプターポリヌクレオチドが、一本鎖である、請求項30に記載の方法。
- 第2の加工された基質核酸分子を精製することをさらに含む、請求項30に記載の方法。
- ステップ(viii)のために十分な条件が、40℃で少なくとも10分のインキュベーションを含む、請求項30に記載の方法。
- ステップ(ii)のために十分な条件が、37℃で少なくとも10分のインキュベーションを含む、請求項18に記載の方法。
- ステップ(iv)のために十分な条件が、20℃で少なくとも10分のインキュベーションを含む、請求項18に記載の方法。
- ステップ(vi)のために十分な条件が、25℃で15分以上のインキュベーションを含む、請求項18に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含む3’アダプターポリヌクレオチドであって、前記二本鎖部分が、前記第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第2のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチドが、5’リン酸を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドが、その3’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、3’−デオキシチミジン、3’−デオキシアデニン、3−デオキシグアニン、3’−デオキシシトシン及び2’3’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、前記3’アダプターポリヌクレオチド;と、
前記3’アダプターポリヌクレオチドの前記第1のオリゴヌクレオチドの切片と部分的又は完全に相補的である第1の配列を含む5’アダプターポリヌクレオチド;と、
前記3’アダプターポリヌクレオチドを、基質核酸分子の3’末端にライゲーションするための第1のリガーゼ;と、
前記5’アダプターポリヌクレオチドを、前記基質核酸分子の5’末端にライゲーションするための第2のリガーゼと
を含む、次世代シークエンシングアダプター系。 - 以下のステップを含む、加工された基質核酸分子を産生する方法。
(i)3’アダプターポリヌクレオチド及び第1のリガーゼを、基質核酸分子を含む試料に適用するステップであって、
前記基質核酸分子が、二本鎖であり、
前記3’アダプターポリヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含み、
前記二本鎖部分が、前記第1のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第2のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチドが、5’リン酸を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドが、その3’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、3’−デオキシチミジン、3’−デオキシアデニン、3’−デオキシグアニン、3’−デオキシシトシン及び2’3’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、ステップ;
(ii)前記第1のオリゴヌクレオチドの、前記基質核酸分子の3’末端へのライゲーションを可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートし、第1の加工された基質核酸分子を産出するステップ;
(iii)5’アダプターポリヌクレオチド、第2のリガーゼ、少なくとも1つのdNTP、及びニックトランスレーション活性を有するDNAポリメラーゼを、前記試料に適用するステップであって、前記5’アダプターポリヌクレオチドが、前記3’アダプターポリヌクレオチドの前記第1のオリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的である第1の配列を含む、ステップ;並びに
(iv)(a)前記5’アダプターポリヌクレオチドの前記3’アダプターの第1のオリゴヌクレオチドへのアニーリングを促進すること、
(b)DNAポリメラーゼによるニックトランスレーションを可能にすること、及び
(c)前記5’アダプターポリヌクレオチドの前記基質分子の5’末端へのライゲーションを可能にすること
のために十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップであって、
ステップ(iv)の完了後、第1の加工された基質核酸分子が、前記基質核酸分子の両鎖のそれぞれ3’末端及び5’末端にライゲーションされた前記3’アダプターポリヌクレオチド及び前記5’アダプターポリヌクレオチドを含む、第2の加工された基質核酸分子である、ステップ;
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