KR20160115938A - Dna 기질을 처리하는 개선 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단편화된 이중 가닥의 DNA 분자의 말단에의 어댑터 결찰 방법을 설명한다.

Description

DNA 기질을 처리하는 개선 방법{IMPROVED METHODS FOR PROCESSING DNA SUBSTRATES}
(관련 출원의 상호 참조)
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 2014년 1월 31일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/934,515 및 2014년 11월 11일자로 제출된 미국 가출원 번호 62/078,309의 우선권 이익을 청구하며, 이들 각각의 발명은 본 명세서에서 그 전체를 참조자료로서 포함한다.
(전자적으로 제출된 재료의 참조에 의한 포함)
본 출원은 발명의 별도의 부분으로서, 컴퓨터 리드 가능한 형태의 서열 목록(파일명: 47999A_Seqlisting.txt; 2015년 1월 29일자로 생성; 47,035바이트)을 포함하고, 본 명세서에서 그 전체를 참조자료로서 포함한다.
상용의 차세대 서열화(NGS) 기법은 모두 라이브러리 조제를 필요로 하므로, 장비에 의한 서열화를 가능하게 하기 위해, 특정 어댑터 서열의 쌍을 DNA 단편의 말단에 결찰시킨다. 대부분의 NGS 어댑터는 3의 기능적인 도메인을 포함한다: (1) 라이브러리 및 클로날 증폭을 위한 서열을 어닐링하는 고유의 PCR 프라이머, (2) 서열을 어닐링하는 고유의 서열화 프라이머, 및 (3) 서열을 인덱싱하는 고유의 샘플. 최근, 대부분의 플랫폼은 각각의 개별적인 DNA 라이브러리 분자의 수백의 복제본을 제조하기 위해 클로날 증폭을 이용한다. 이것은 각각의 라이브러리 분자에 대한 특정 형태의 서열 검출(예를 들면, 형광 또는 pH)을 위해 생성되는 시그널을 증폭시킬 목적으로 브릿지 증폭 또는 에멀젼 PCR에 의해 달성된다. 합성에 의한 서열화에 있어서, 프라이머를 서열화하기 위해 도메인을 어닐링하는 것은 쌍을 이루는 말단 서열화를 가능하게 하도록 어댑터-삽입 정션과 병치되고, 각각의 어댑터는 프라이머 어닐링을 위해 고유의 서열을 갖는다. 샘플 인덱스 서열은 짧은 고유의 서열, 통상 6-8의 염기로 이루어지고, 이것은 서열화될 때에 샘플이 다중되거나 공동 서열화되는 것이 가능하도록 리드되는 특정 서열의 샘플 소스를 식별한다. 시그널 검출을 위한 클로날 증폭에 의존하지 않는 기존 및 신규 단일 분자 서열화 기술이 있지만, 단일 분자로서의 양쪽 가닥의 서열화 또는 나노기공 엔트리를 위한 선도 서열의 도입을 가능하게 하도록 DNA 듀플렉스에 말단의 헤어핀-루프를 첨가하는 등의 다른 목적을 위해, 그들의 말단에 어댑터 서열의 부착을 여전히 필요로 한다.
목적의 차세대 서열화는 두 가지 선도 기술을 포함한다: 전체 게놈 라이브러리로부터 앰플리콘 서열화 및 목적의 혼성-포획 풍부화. 앰플리콘 서열화는 목표 좌위의 패널이 전체 엑솜이 요구하는 것보다 현저하게 작은 경우에, 그리고 제조용 시약과 서열화 깊이 양쪽에서 현저한 전체 비용의 절감을 위해 단계의 수가 감소된 신속한 처리 시간을 선택하기 위한 방법이다. 앰플리콘 서열화는 다양한 이용가능한 기술로 나타내어진다. 이들의 예로는 1. 분해 가능한 표적-특이적 프라이머를 이용하여 프라이머 다이머를 제거하고, 이어서 폴리싱 및 NGS 어댑터 결찰하는 다중 PCR(여기서, 중복되는 표적은 개별 튜브로 나눠진다(이온 토렌트 앰플리식), 2. 각각의 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 쌍의 말단에 NGS 어댑터를 포함하고, 이어서 NGS 어댑터는 PCR 증폭을 매개하는 다중 신장-결찰 반응(다중 PCR 전체를 회피하지만, 결찰-매개 PCR은 높은 DNA 주입량을 필요로 한다(일루미나 TSCA)), 3. 프라이머 다이머 형성을 회피하고, 목적의 좌위를 중복하는 것을 가능하게 하도록 프라이머 쌍을 분리하는 미세유체 세포에 대한 다중 PCR(각각의 반응은 더욱 높은 DNA 주입량을 필요로 한다(플루이다임 엑세스 어레이)), 4. 프라이머 다이머 형성을 회피하고, 목적의 좌위가 중복되는 것을 가능하게 하기 위해 또한 프라이머 쌍을 분리하는 디지털 드롭렛 PCR(또한, 높은 DNA 주입량에 대한 요구가 있다(레인댄스)). 각각의 기법은 다중 증폭 공정시에 프라이머 다이머를 제거하거나 또는 그들의 형성을 회피하여 이들 인공물이 얻어진 NGS 앰플리콘 라이브러리를 장악하지 못하도록 설계되어 있다. 기존의 방법의 단점은 다음과 같다: A. 미세유체 또는 디지털 드롭렛 기기 및 소모품의 높은 가격, B. 높은 주입량 요구, 및 C. 별도의 다중반응에 대한 필요성(여기서, 중복 또는 연속 범위가 요구되면, 주입 량 요구가 더욱 증가된다). 연속 범위가 요구되는 이들 선택의 대안은 장거리 PCR을 행하는 것이다. 그러나, 장거리 PCR은 다중화하기 어렵고, 개별의 NGS 라이브러리 제조로 이어지는 대부분의 서열화 플랫폼에서 요구되는 후속의 단편화는 시간 소목적이고 비용도 많이 든다. 당업계에서 요구되는 것은 대략 10ng의 DNA의 저주입을 가능하게 하고, 서모사이클러 이외의 기기를 필요로 하지 않으며, 또한 연속 범위가 요구될 때의 표적이 별도의 핫스팟 좌위인지, 게놈의 중복 영역인지에 상관없는 엠플리콘의 생성에 대한 간략한 방법이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 이들 요구에 대한 해결책을 제공한다.
통상, NGS DNA 라이브러리의 조제는 5가지 단계를 포함한다: (1) DNA 단편화, (2) 폴리싱, (3) 어댑터 결찰, (4) 크기 선별, 및 (5) 라이브러리 증폭(도 1 및 도 2 참조)
(1) 단편화: DNA의 단편화는 효소 소화, 또는 초음파 분쇄, 분무 또는 유체동역학 전단 등의 물리적 방법에 의해 달성될 수 있다. 단편화 방법은 각각 그것의 이점 및 한계를 갖는다. 효소 소화는 어댑터 서열에 효율적으로 폴리싱되고 결찰될 수 있는 DNA 말단을 생성한다. 그러나, 효소 반응을 제어하고 예측 가능한 길이의 단편을 생성하는 것은 곤란하다. 또한, 효소 단편화는 빈번하게 염기 특이적이어서 서열 분석에 발현 편향성이 도입된다. DNA를 단편화하기 위한 물리적 방법은 보다 무작위적이고 DNA 크기 분포가 보다 용이하게 제어될 수 있지만, 물리적 단편화에 의해 생산되는 DNA 말단은 손상되어 종래의 폴리싱 반응은 충분한 결찰-호환 말단을 생성하기에 불충분하다.
(2) 폴리싱: 통상의 폴리싱 혼합물은 T4 DNA 폴리머라아제 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)를 함유한다. T4 DNA 폴리머라아제의 5'-3' 폴리머라아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성은 3' 오버행을 절제하고 3' 오목 말단을 필링하며, 이것은 DNA 말단을 폴리싱(블런트의 생성)하는 것뿐만 아니라 손상된 3' 염기의 절제를 야기한다. 상기 폴리싱 믹스에 있어서의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제는 결여될 수 있는 DNA 단편의 5' 말단에 포스페이트를 첨가함으로써 그것들이 NGS 어댑터에 결찰-호환 가능하게 한다.
당업계에서 공개되어 있지 않은 것은 물리적 단편화에 의해 생산되는 5' 말단의 고유 번호는 미식별된 방식으로 손상되고, PNK에 의해 인산화되지 않는다는 것이다. 종래의 폴리싱 믹스에는 손상된 5' 말단의 염기를 트리밍할 수 있는 효소가 없다. 그들은 NGS 어댑터에 그들의 5' 말단에서 호환될 수 없는 결찰을 남기기 때문에, 결과적으로 조제에 있어서의 상당수의 DNA 단편의 분획은 NGS 라이브러리 분자로 전환되지 않는다. 통상, 어댑터 결찰은 비효율적이라는 것이 당업계에 공지되어 있지만, 결찰이 양쪽 가닥에 동시에 행해지므로 가닥이 한정되는 것으로 공지되어 있지 않다. 본 발명자들은 각각의 효율을 시험하기 위해 가닥 특이적 결찰로 반응을 각각 분리하였다. 이 분석을 통해, 본 발명자들은 상당수의 DNA 단편의 분획에 대해 PNK 및 결과적으로 어댑터 결찰에 열악한 기질인 5' 말단에 대한 전제 공정에서의 속도 제한 단계를 파악할 수 있었다.
(3) 어댑터 결찰: 5' 포스페이트기의 결여 이외에 NGS 라이브러리 저수율에 기여하는 또 다른 요인은 그 자체의 결찰 반응이다. 결찰 전에, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 폴리머라아제를 이용하여 수복된 DNA의 아데닐화가 종종 키메라 형성 및 어댑터-어댑터(다이머) 결찰 생산물을 최소화하기 위하여 행해진다. 이들 방법에 있어서, 단일 3' A-오버행 DNA 단편은 단일 5' T-오버행 어댑터에 결찰되고, 반면에 A-오버행 단편 및 T-오버행 어댑터는 자기-결찰을 위해 호환 불가능한 응집성 말단을 갖는다. 그러나, 상기 아데닐화 반응은 불완전하고, 비특이적 부산물을 생성하고, 또한 라이브러리 수율을 감소시키는 결찰을 위해 가능한 분자의 수를 감소시킨다. 본원에 연쇄체 형성을 최소화하기 위한 보다 효율적이고, 치환적인 접근을 제시한다.
(4) 크기 선별: 또한, 크기 선별 공정은 라이브러리 수율에 영향을 미친다. 크기 선별시에, 소망하지 않는 크기의 단편은 소망의 서열화 리드 길이로 라이브러리 삽입 크기를 최적화하기 위하여 겔 또는 비드 기반의 방법을 이용하여 라이브러리로부터 제거된다. 이것은 짧은 DNA 라이브러리 삽입을 야기하는 쌍을 이루는 말단 서열화의 중복을 최소화함으로써 서열 데이터 출력을 최소화한다. 극히 제한된 주입량을 갖는 샘플의 경우에 있어서, 이 단계는 건너뛰고, 더욱 높은 정도의 쌍을 이룬 말단 중복의 대가로 보다 희소한 단편이 서열화된다.
(5) 증폭: 낮은 라이브러리 수율의 문제는 NGS 분석 전에 PCR에 의해 라이브러리를 증폭하기 위한 필요성을 야기하고, 이것은 염기 조성물 편향성의 도입 및 라이브러리 복잡성의 손실로 이어진다. 이 문제를 회피하기 위한 현재의 해결책은 단지 라이브러리 조제에 있어서의 더욱 높은 양의 주입 DNA이고, NGS 분석을 위해 제출되는 임상 샘플의 최대 20%는 불충분한 DNA 양을 가지므로, 대신에 추가적인 PCR 사이클이 불충분한 DNA 양을 해결하기 위해 적용된다. 이것은 PCR 듀플리케이트의 허용 불가능한 백분율의 존재로부터 감소된 서열 데이터를 야기한다.
NGS 라이브러리 구조체에 있어서 저수율을 야기하는 상술의 기존의 문제 중 일부를 해결하기 위해, 향상된 어댑터 결찰 방법이 제공된다. 이 새로운 방법은 DNA 단편의 5' 말단에 포스페이트기를 첨가하기 위한 필요성(이것은, 종래의 어댑터 결찰을 필요로 한다; 도 1 및 도 2 참조)을 극복한다. 그 대신에, DNA의 물리적 단편화의 결과로 손상된 5' 말단의 염기가 제거된다. 상기 손상된 염기의 제거에 의해, 5' 포스페이트를 갖는 결찰 호환 가능한 염기가 노출되고, 어댑터 결찰 효율이 복원되어 감소된 DNA 양으로부터 라이브러리를 구조체하기 위한 능력 및 라이브러리 수율의 현저한 증가로 이어진다. 또한, 키메라 라이브러리 삽입(결찰시의 연쇄체 형성)의 방지 및 어댑터 다이머 결찰 생산물의 형성을 위한 아데닐화/TA 결찰의 치환제가 도입되고, 또한 더욱 높은 라이브러리 조제 수율에 기여한다. 본원에 기재된 방법의 임의의 실시형태에 있어서, 상기 공정은 결찰-호환 가능한 기질 분자의 5' 및/또는 3' 말단을 전환하는 것을 포함한다.
이 방법은, 그것의 예시적 형태에 있어서, 처리된 기질 분자를 생성하기 위해 4가지 별도의 배양을 포함한다(도 3, 도 4 및 도 5 참조). 제 1 배양에 있어서, 이중-가닥 단편화 DNA는 포스파타아제 효소와 결합되고, 적절한 반응 조건 하에서 상기 효소는 DNA 단편의 말단으로부터 포스페이트기를 제거한다. 이것은 후속의 결찰 반응에 있어서의 DNA 단편 연쇄체 형성을 방지함으로써 키메라 라이브러리 삽입이 생성되는 것을 방지한다.
제 2 배양에 있어서, 상기 탈-인산화 DNA 단편은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 또는 폴리머라아제의 칵테일과 조합된다. 적절한 반응 조건 및 dNTP의 존재 하에서, 손상된 3' 염기는 트리밍되고, 상기 이중-가닥 DNA 단편의 폴리싱은 물리적 단편화시에 생성되었던 3' 오버행의 절제 및 3' 리세스드 말단의 필링에 의해 달성된다. 이 단계의 완료시에, DNA 단편은 포스페이트기가 결여됨으로써 자기-결찰이 불가능한 DNA 단편을 렌더링하는 결찰 호환 가능한 3' 말단 및 5' 말단을 갖는 블런트 말단을 갖는다.
제 3 배양에 있어서, 상기 블런트 말단화된, 이중-가닥 DNA 단편은 5' 포스페이트를 포함하고 DNA 단편의 3' 말단과 결찰할 수 있는 제 1 이중-가닥 블런트 말단화된 NGS 어댑터(3' 어댑터) 및 DNA 리가아제와 조합된다(도 3 참조). 통상, 이 3' 어댑터의 특별한 특징은 DNA 단편의 5' 말단에 동시에 결찰할 수 있는 어댑터 DNA 가닥의 결찰을 방지하는 3' 말단 수식을 갖고, 따라서 틈이 5' 포스페이트의 존재 하에서도 결찰 반응 후에 각각의 DNA 단편의 5' 말단과 3' 어댑터의 3' 말단의 정션에 존재하는 것이다. 또한, DNA 단편의 5' 말단에의 결찰을 방지하는 동일한 3' 수식은 비록 그들이 기능적 어댑터 다이머(기능적 다이머는 양쪽 어댑터로 이루어짐)가 아닌 단일 어댑터 서열로 이루어지는 경우라도 어댑터-어댑터 결찰 생산물이 형성되는 것을 방지한다. 이 단계의 생성물은 양쪽 3' 말단에 대해 단지 하나의 가닥에만 결찰되는 단일 NGS 어댑터를 갖는 이중-가닥 DNA 단편이다.
제 2 배양에 있어서, DNA 단편에 비결찰된 채 존재(3' 수식으로 인해)하는 3' 어댑터의 가닥은 또한 올리고 합성시에 분해 가능한 염기의 병합에 의해 치환 가능하거나 분해 가능하다. 제 4 배양시에 임의의, 적절한 효소의 존재 하에서, 3' 어댑터 표준은 분해되거나, 또는 반응에서도 존재하는 제 2 NGS 어댑터(5' 어댑터, 도 3 참조) 서열을 포함하는 새로운 단일-가닥의 어댑터로 교체되고, 어댑터-삽입의 정션에서의 3' 어댑터에 대한 상보하는 서열에 의해, 단일-가닥의 5' 어댑터가 이중-가닥의 DNA 단편의 3' 말단에 결찰되는 3' 어댑터의 상보하는 부위에 어닐링되고, 틈 또는 갭의 복원을 야기한다. 추가적으로, 상기 반응에는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제가 존재하고, dNTP, 리가아제 및 적절한 반응 조건의 존재 하에서, 틈 번역이 DNA 단편의 5' 어댑터와 5' 말단의 정션에 존재하는 틈 또는 갭에서 개시된다. 틈 번역은 손상된 5' 말단의 염기(및 5' 말단의 내부의 추가적인 하나 이상의 염기)의 치환을 야기하고, 결찰-호환 가능한 5' 말단의 포스페이트기를 노출시킨다. 계속해서, DNA 기질 분자로의 5' 어댑터의 효율적인 결찰은 리가아제가 하나 이상의 염기로 번역되는 틈을 실링할 때에 발생된다(도 4 참조). 이 새로운 어댑터 결찰 공정의 완료시에, 각각의 이중 DNA 단편의 양쪽 말단은 어댑터-삽입 정션에서 짧은 상보하는 어댑터 서열을 공유하는 2의 상이한 단일-가닥의 NGS 어댑터에 의해 옆에 배치된다.
대안적으로, 5' 말단의 염기의 제거 및 5' 어댑터 결찰은 기질 분자의 손상된 5' 염기와 중복하고, dNTP의 존재 하에서 치환 후에 5' 플랩-특이적 뉴클레아제에 의해 DNA 기질 분자의 5' 말단에서 치환된 염기의 절단이 발생하는 그것의 3' 말단에서 하나 이상의 추가적인 무작위 염기를 갖는 단일-가닥의 5' 어댑터를 어닐링함으로써 중합없이 달성될 수 있고, 이것은 상기 절단될 DNA 기질 분자의 말단 상에 노출된 5' 포스페이트로의 제 2 NGS 어댑터의 효율적인 결찰을 야기한다(도 5 참조).
또 다른 대안에 있어서, 5' 말단의 염기 제거 및 5' 어댑터 결찰은 폴리머라아제의 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성에 의해 DNA 단편의 5' 말단의 염기의 절단으로 이어지는 분해 가능한, 또는 치환 가능한 3' 어댑터의 가닥으로부터의 단일 디데옥시 염기 신장에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 상기 가닥은 5' 어댑터에 의해 분해되거나 치환되고, 리가아제의 존재에 있어서 5' 어댑터가 효율적으로 DNA 단편 상의 노출된 5' 포스페이트에 결찰된다. 이하, 이 단계 및 이전의 단계의 대안적인 실시형태를 설명한다.
따라서, 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 처리된 기질 분자를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 기질 분자의 3' 말단에 제 1 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계, (ii) 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드에 제 2 폴리뉴클레오티드를 어닐링하는 단계, (iii) 상기 기질 분자의 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제하는 단계, 및 이어서 (iv) 상기 처리된 기질 분자를 생산하기 위해 이중 가닥의 기질 분자의 상기 5' 말단에 제 2 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단계 (i) 전에 포스파타아제 효소와 상기 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 효소와 상기 기질 분자를 접촉시킴으로서 상기 기질 분자를 블런드-말단화하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상기 기질 분자의 3' 말단을 아데닐화하기 위해 주형-독립 폴리머라아제와 상기 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법에 있어서, 상기 기질 분자는 천연물질이거나 합성물질인 것으로 간주된다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 기질 분자는 천연물질이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 기질은 유전체 DNA이고, 다른 실시형태에 있어서, 상기 유전체 DNA는 진핵 또는 원핵이다. 상기 기질 분자가 유전체 DNA인 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 유전체 DNA가 시험관 내 또는 생체 내에서 단편화되는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 시험관 내 단편화 단계는 전단, 엔도뉴클레아제를 이용한 절단, 초음파 분쇄, 가열, 알파, 베타, 또는 감마 소스를 이용한 조사, 금속 이온의 존재 하에서의 화학적 절단, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 행해진다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 생체 내 단편화 단계는 세포사멸, 방사선, 및 석면에의 노출로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 발생된다.
또한, 본 발명은 상기 기질 분자가 합성물질이고, cDNA, 적어도 하나의 이중-가닥의 말단을 포함하는 전체 게놈 증폭, 프라이머 신장 생산물에 의해 생산되는 DNA, 및 PCR 앰플리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는 실시형태로 간주된다.
본 발명의 임의의 양태 또는 실시형태에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 이중 가닥이고, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2를 포함하는 것으로 생각된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 1에 어닐링되고, 다른 실시형태에 있어서 상기 어닐링 단계는 상기 제 2 폴리뉴클레오티드와 상기 기질 분자 사이에 틈, 갭, 또는 중복되는 염기를 야기한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 어닐링 단계는 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2의 탈혼성화를 야기한다.
상기 제 2 폴리뉴클레오티드는, 각종 실시형태에 있어서 올리고뉴클레오티드 2의 분해를 야기하는 폴리머라아제와 접촉한다.
또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 2가 분해되기 쉬운 염기를 포함하는 실시형태인 것으로 간주되고, 또한 본 발명은 올리고뉴클레오티드 2가 결찰을 방지하기 위해 그것의 3' 말단에 블로킹기를 포함하는 실시형태를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 수식된 염기를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥의 추가적인 기질 분자의 3' 말단에 제 3 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계, (ii) 상기 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 상기 제 3 폴리뉴클레오티드에 제 4 폴리뉴클레오티드를 어닐링하는 단계, (iii) 상기 추가적인 기질 분자의 상기 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제하는 단계, 및 이어서 (iv) 처리된 추가적인 기질 분자를 생산하기 위해 추가적인 기질 분자의 이중 가닥의 상기 5' 말단에 상기 제 4 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 3 폴리뉴클레오티드는 동일하다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 4 폴리뉴클레오티드는 동일하다.
목적의 앰플리콘 NGS 라이브러리의 구조체 방법은 2가지 별도의 단계를 포함한다: 다중 PCR 표적 풍부화 후 NGS 어댑터 결찰 단계(도 39 참조). 2의 별도의 워크플로우 선택이 가능하다: 2가지-단계 PCR 후 어댑터 결찰 또는 1단계 PCR 후 결찰
상기 다중 PCR 단계에 있어서, 어느 쪽의 방법을 이용하여 표적-특이적 프라이머의 쌍이 소망의 표적 좌위로 설계되고, 그들의 5' 말단에서 범용의 절삭된 NGS 어댑터 서열을 포함한다(도 40 및 도 41, 표 2 참조). 상기 제 1 PCR 사이클은 프라이머 쌍의 높은 복잡성을 가능하게 하는 긴 사이클 시간을 갖고, 각각 그들의 표적 서열로부터 범용의 NGS 어댑터 태그된 앰플리콘을 생성하도록 낮은 농도이다. 이들 프라이머는 선택적으로 각각의 앰플리콘(UI=고유의 식별자)을 식별하도록 고유의 분해된 서열 태그를 갖고, UI는 각각 각 프라이머(및 NNNN 염기의 신장으로 나타내어짐, 도 40, 41)의 상기 5' 말단의 상기 범용의 NGS 어댑터 서열과 상기 3' 말단의 상기 표적-특이적 부위에 위치된다. UI 서열이 사용되는 경우, 긴 다중 PCR 사이클은 이전에 생성된 앰플리콘의 복제본으로의 추가적인 UI 서열의 병합을 회피하기 위하여 2 사이클로 제한되고, UI 서열이 사용되지 않는 경우, 상기 긴 다중 PCR 사이클은 2 사이클 초과 동안 행해질 수 있다. 행해지는 표적-특이적 사이클 수를 제한할수록, 더욱 적은 수의 프라이머 다이머 생산물이 축적되고, 따라서 주입 샘플량을 실현할 수 있는 최소수의 다중 사이클이 행해져야 한다. 상기 다중 사이클(2 이상) 후에, PCR은 각각의 표적 앰플리콘의 옆에 배치되는 범용의 절삭된 NGS 어댑터에 대응하는 단일의 범용의 프라이머를 이용하여 증폭의 제 2 단계 동안에 보다 짧은 신장 시간 동안 계속된다. 상기 범용의 프라이머는 표적-특이적 프라이머와 비교해서 비교적 높은 농도에서 사용되고, 사이클의 전체수는 소망의 라이브러리 수율에 의해 결정된다. 표적-특이적 프라이머의 농도는 표적을 증폭하기에 충분하지 않으므로 자기-상호작용할 수 없는 범용의 프라이머는 추가적인 프라이머 다이머 형성의 존재로 증폭 반응을 인계한다. 추가적으로, 제한된 다중 사이클시에 축적되는 프라이머 다이머는 소망의 앰플리콘보다 길이가 더 짧을 수 있고, 안정적인 2차 구조의 대상이 될 수 있어 단일의 범용의 프라이머에 의한 증폭이 덜 효율적이다. UI 서열이 사용되는 경우, 이전에 생성된 앰플리콘의 후속의 복제본을 레이블링하는 추가적인 UI 서열을 방지하기 위하여, 다중 프라이머의 정제 단계 또는 엑소뉴클레아제 I 소화가 범용의 프라이머의 추가 전에 요구된다. UI 서열이 사용되지 않은 경우, 범용의 프라이머는 다중 프라이머와의 반응 초기에 첨가될 수 있고, 범용의 어댑터 태그된 앰플리콘이 생성되면 기능적으로 될 수 있다.
범용의 프라이머의 추가적인 특징은 후속의 어댑터 결찰을 가능하게 하도록 절단 가능한 염기를 추가적으로 포함하는 것이다. 제한없이, 절단 가능한 염기는 데옥시우리딘, RNA 또는 데옥시이노신으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 범용의 프라이머는 절단 가능한 염기를 포함하지 않고, 이 서열은 어댑터 결찰(도 42 참조)을 가능하게 하도록 5' 엑소뉴클레아제를 이용하여 이후에 절제된다. 또한, 표적-특이적 프라이머 및 범용의 프라이머 양쪽은 선택적으로 그들의 3' 말단에 뉴클레아제-저항성 수식을 포함하고, 이들은 포스포로티오에이트 연결기, 2' O-메틸 또는 메틸포스포네이트 수식을 포함한다. 이들은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 교정 폴리머라아제를 이용할 때에 보다 특이적이고 효율적인 프라이밍을 가능하게 한다. 또한, 이 효소가 어댑터 결찰 전에 앰플리콘으로부터 범용의 어댑터 서열을 제거하기 위해 사용되는 경우에 5' 엑소뉴클레아제 소화를 제한한다.
어댑터 결찰의 최종 단계에 있어서(도 42 참조), 범용의 프라이머로부터 유래된 각각의 앰플리콘의 일부는 프라이머에의 분해 가능한 염기의 병합 및 수식 특이적 엔도뉴클레아제의 이용으로 인해 소화된다. 대안적으로, 그들의 3' 말단에 뉴클레아제-저항성 염기를 함유하는 프라이머에 있어서, 각각의 엠플리콘의 5' 부위는 5' 엑소뉴클레아제 소화에 의해 트리밍될 수 있다. 이 경우에 있어서, 앰플리콘의 5' 말단의 엑소뉴클레아제 소화는 뉴클레아제-저항성 염기의 위치에서 종료될 수 있다. 상기 프라이머 소화 반응은 각각의 앰플리콘의 말단 양쪽에 단일 가닥의 3' 오버행을 생성한다. 또한, 반응에는 전체-길이가 존재하고, 단일-가닥의 어댑터 B는 제 2 NGS 어댑터 서열을 포함하고, 어댑터-표적의 정션에서 범용의 어댑터로의 상보적 서열에 의해, 단일-가닥의 제 2 어댑터 B는 각 앰플리콘의 3' 오버행에 위치되는 범용의 어댑터의 상보적 부위에 어닐링되고, 상기 어댑터 어닐링은 틈 또는 갭의 형성을 야기한다. 추가적으로, 반응에는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제가 있고, dNTP, 리가아제 및 적절한 반응 조건의 존재 하에서, 틈 번역은 어댑터 B와 앰플리콘의 5' 말단의 정션에 존재하는 틈 또는 갭에서 개시된다. 틈 번역은 5' 말단의 내부의 하나 이상의 염기의 치환을 야기하고, 결찰-호환 가능한 5' 말단의 포스페이트기를 노출시킨다. 계속해서, DNA 기질 앰플리콘으로의 어댑터 B의 효율적인 결찰은 리가아제가 하나 이상의 염기를 번역하는 틈을 시일링할 때에 발생된다. 대안적으로, 어댑터 B의 결찰은 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 및 추가적으로 리가아제를 이용하여 치환-절단 반응에 의해 달성된다. 이 경우에 있어서, dNTP가 요구되지 않고, 단지 몇몇 염기만 각각의 앰플리콘에 잔존하는 어댑터 B의 3' 말단과 범용의 어댑터 부위의 5' 말단 사이에 중복된다. 어댑터 결찰 공정을 완료하기 위하여, 링커-매개된 결찰은 각각의 앰플리콘의 3' 말단에 잔존하는 범용의 어댑터 서열 상에서 제 1 어댑터(A)를 완료하도록 동시에 행해진다. 상기 링커 올리고뉴클레오티드는 각각의 앰플리콘 상에 잔존하는 범용의 어댑터의 3' 말단에 상보적이고, 제 1 어댑터의 잔사를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 양쪽 서열의 상보성에 의해, 링커 올리고뉴클레오티드는 제 1 어댑터의 3' 잔사 양쪽에 혼성되고, 잔사 범용의 어댑터는 결찰을 발생시킬 수 있는 각각의 앰플리콘 상에 존재한다. 이 새로운 어댑터 결찰 공정의 완료시에, 각각의 앰플리콘의 양쪽 말단은 어뎁터-표적 정션에서 짧은 상보하는 어댑터 서열을 공유하는 2의 상이한, 단일-가닥의 NGS 어댑터(A 및 B)에 의해 옆에 배치된다. 이어서, 라이브러리 정량 전에 최종 정제 단계가 행해진다.
본 개시된 방법의 추가적인 특징은 다중된 PCR 증폭 반응에 사용되는 DNA 폴리머라아제의 선택이다. 증폭시의 에러율은 고충실도 Pfu DNA 폴리머라아제, 퓨전 DNA 폴리머라아제, 카파 하이파이 DNA 폴리머라아제, Q5 DNA 폴리머라아제 또는 그들의 유도체 및 유사체를 사용할 때에 개선될 수 있다. 추가적으로, 증복 반응의 제 2 단계에서 사용되는 범용의 프라이머가 절단 가능한 염기를 포함하는 것을 간주하면, 우라실, RNA 또는 이노신 염기에 내성이 있는 고충실도 DNA 폴리머라아제가 바람직하다. 이것은 카파 하이파이 U+ 폴리머라아제, 서모 퓨전 U 및 효소의 베라식 울트라 폴리머라아제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않고, 모두 기질을 함유하는 우라실에 내성을 갖도록 엔지니어링되어 있다. 증폭 반응에서 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 고충실도 효소의 사용을 간주하면, 범용의 프라이머뿐만 아니라 모든 표적-특이적 프라이머는 프라이머 신장의 충실도 및 효율성을 증가시키도록 그들의 3' 말단에 뉴클레아제 저항성 연결기를 포함한다. 이것은 포스포로티오에이트 연결 또는 기타 뉴클레아제 저항성 부위를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
추가적으로, 상술한 바와 같이 단일 튜브 형식으로 연속된 범위에 대한 중복하는 표적을 증폭시킬 수 있는 목적의 NGS 라이브러리를 위한 다중된 PCR 방법이 소망된다. 본원에 개시된 방법은 이 효과를 달성할 수 있다(도 43 및 도 44). 중복하는 표적 영역을 갖는 2의 프라이머 쌍의 경우에 있어서, 4의 가능한 앰플리콘이 생성될 수 있다: 2의 프라이머 쌍의 각각에 특이적인 앰플리콘, 2의 디지털 프라이머의 증폭을 야기하는 최대-앰플리콘, 및 2의 근위 프라이머의 증폭을 야기하는 최소-앰플리콘. 상기 최소-앰플리콘이 다중 PCR 반응을 장악하는 것(이것 등의 짧은 앰플리콘 및 프라이머 다이머가 종종 그들의 짧은 길이 및 증폭의 용이함으로 인해 증폭 반응을 장악함)을 회피하기 위해, 대부분의 방법에서는 2의 튜브로 중복하는 프라이머 쌍을 분리하며, 이것은 작업 부하 및 필요한 DNA 주입량이 2배가 되지만 효율적이다. 본원에 개시된 방법은 각각의 말단에서의 범용의 서열의 존재로 인해, 상기 짧은 최소-앰플리콘이 단일 범용의 프라이머에 의해 덜 효율적인 증폭을 야기하는 2차 구조를 안정화시킬 수 있기 때문에, 중복하는 앰플리콘이 단일 튜브에서 생성되는 것을 가능하게 한다. 따라서, 상기 최소-앰플리콘이 초기 표적-특이적 PCR 사이클 동안에 생산된 경우라도 효율적으로 증폭되지 않을 수 있다. 결과적으로, 본원에 개시된 방법을 사용하면, 단지 각각의 프라이머 쌍에 특이적인 앰플리콘 및 최대-앰플리콘만 고정성, 고분자량의 DNA 주입으로부터 생산된다. 가교된 FFPE DNA 또는 단편화된 DNA(구체적으로는 165bp 범위인 순환 무세포 DNA인 것)가 사용될 때에, 상기 최대-앰플리콘의 형성은 주형 길이로 인해 억제되고, 무결성은 이 크기의 앰플리콘을 지지할 수 없고, 단지 각각의 프라이머 쌍에 특이적인 앰플리콘만 생산할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법에 있어서, 상기 샘플 DNA 주입이 천연물질인 것으로 생각된다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 주입 DNA는 유전체 DNA이거나, 본래의 고분자량 DNA 또는 단편화된 순환 무세포 DNA 중 어느 하나이고, 또한 다른 실시형태에 있어서, 상기 유전체 DNA는 진핵, 원핵, 미토콘드리아 또는 바이러스 기원이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 주입 DNA는 단일-가닥 또는 이중-가닥이거나 합성물질이고, 이전의 전체 게놈 증폭의 결과 또는 무작위 아니면 프라이밍된 RNA의 프라임 역전사의 결과이다.
본 발명의 다른 양태에 있어서, 리가아제 및 적어도 부분적으로 이중 가닥이고 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2를 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제공되고, 올리고뉴클레오티드 1은 5' 포스페이트 및 그것의 3' 말단에 블로킹기를 포함하고, 올리고뉴클레오티드 2는 (i) 분해되기 쉬운 염기를 포함하고, 그리고/또한 (ii) 비변성 가열 조건에 의해 치환될 수 있고, 또한 그것의 3' 말단에 블로킹기를 포함하고, 상기 블로킹기는 올리고뉴클레오티드 1의 3'말단의 결찰을 방지하지만, 5' 말단의 결찰을 가능하게 한다.
일부 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2의 블로킹기는 3' 데옥시티미딘, 3' 데옥시아데닌, 3' 데옥시구아닌, 3' 데옥시사이토신 또는 디데옥시 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 분해되기 쉬운 염기는 데옥시우리딘, 리보뉴클레오티드, 데옥시이노신, 또는 이노신이다. 상기 비변성 가열 조건은, 각종 실시형태에 있어서 약 50℃-약 85℃이다.
일부 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2는 상기 올리고뉴클레오티드 2의 결합 안정성을 감소시키는 염기 수식을 포함하고, 상기 염기 수식은 데옥시이노신, 이노신 또는 범용의 염기이다.
또한, 본 발명은 일부 양태에 있어서, 본 발명의 조성물과 이중 가닥의 기질의 배양으로부터 얻어지는 결찰, 리가아제, 틈 번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 분해되기 쉬운 염기를 인식하는 엔도뉴클레아제, 및 단일 가닥이고, 폴리뉴클레오티드 1의 올리고뉴클레오티드 2가 분해되거나 치환될 때에 적절한 조건 하에서 어닐링되도록 폴리뉴클레오티드 2의 올리고뉴클레오티드 1의 5' 부위에 충분히 상보하는 3' 도메인을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 2를 치환하기에 충분한 길이이거나, 또는 그것의 결합 안정성을 증가시키는 염기 수식을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 UDG+엔도뉴클레아제 VIII, RN아제 HI, RN아제 H2 및 엔도뉴클레아제 V로 이루어지는 군에서 선별된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 리가아제는 E. coli DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제이다. 그것의 결합 안정성을 증가시키는 염기 수식은, 각종 실시형태에 있어서 잠금 핵산(LNA)이다.
본 발명의 다른 양태에 있어서, 조성물은 본 발명의 조성물과 이중 가닥의 기질의 배양으로부터 얻어지는 결찰 생산물, 리가아제, 플랩 엔도뉴클레아제, 분해되기 쉬운 염기를 인식하는 엔도뉴클레아제, 폴리뉴클레오티드 1의 올리고뉴클레오티드 2가 분해되거나 대체될 때에 적절한 조건 하에서 어닐링되도록 폴리뉴클레오티드 2의 올리고뉴클레오티드 1의 5' 부위에 충분히 상보하는 3' 도메인을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 2를 치환하기 충분한 길이이거나, 또는 그것의 결합 안정성을 증가시키는 염기 수식을 포함하고, 또한 3' 말단의 분해 염기를 더 포함한다.
본 발명은 처리된 기질 분자의 생산 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 기질 분자의 3' 말단에 제 1 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계, (ii) 상기 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드에 제 2 폴리뉴클레오티드를 어닐링하는 단계, (iii) 상기 기질 분자의 상기 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제하는 단계, 및 이어서 (iv) 상기 처리된 기질 분자를 생산하기 위해 이중 가닥의 기질 분자의 상기 5' 말단에 상기 제 2 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단계 (i) 전에, 포스파타아제 효소와 상기 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 포스파타아제 효소는 송아지 소장 유래 포스파타아제 또는 새우 유래 포스파타아제다.
다른 실시형태에 있어서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 효소와 상기 기질 분자를 접촉시킴으로써 상기 기질 분자를 블런트 말단화하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 폴리머라아제 효소는 T4 DNA 리가아제, 클레나우 단편, T7 폴리머라아제, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선별된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 주형-독립 폴리머라아제와 상기 기질 분자를 접촉시켜 상기 기질 분자의 상기 3' 말단을 아데닐화하는 단계를 더 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, 상기 기질 분자는 천연물질이거나 합성물질이다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 상기 기질 분자는 천연물질이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 기질 분자는 유전체 DNA이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 유전체 DNA는 진핵 또는 원핵이고, 다른 추가적인 실시형태에 있어서 상기 유전체 DNA는 시험관 내 또는 생체 내에서 단편화된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 기질 분자는 순환 무세포 DNA인 것이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단계 (i) 전에, 온도를 약 50℃~약 85℃로 조정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 온도는 65℃이다.
추가적인 실시형태에 있어서, 상기 시험관 내 단편화 단계는 전단, 엔도뉴클레아제에 의한 절단, 초음파 분해, 가열, 알파, 베타, 또는 감마원을 이용한 조사, 금속 이온의 존재 하에서의 화학적 절단, 라디칼 절단, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 행해진다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 생체 내 단편화 단계는 세포사멸, 방사선, 및 석면에 대한 노출로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 발생된다.
상기 기질 분자는, 다른 실시형태에 있어서 합성물질이고, cDNA, 전체 게놈 증폭에 의해 생산된 DNA, 적어도 하나의 이중 가닥의 말단을 포함하는 프라이머 신장 제품, 및 PCR 앰플리콘으로 이루어지는 군에서 선별된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 이중 가닥이고, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2를 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 1에 어닐링한다. 상기 어닐링 단계는, 일부 실시형태에 있어서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드와 상기 기질 분자 사이에 틈, 갭, 또는 중복 염기를 야기한다.
상기 제 2 폴리뉴클레오티드는, 각종 실시형태에 있어서 올리고뉴클레오티드 2의 분해를 야기하는 폴리머라아제와 접촉된다.
일부 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2는 분해되기 쉬운 염기를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 분해되기 쉬운 염기는 데옥시우리딘, RNA, 데옥시이노신, 및 이노신으로 이루어지는 군에서 선별된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 2는 그것의 3' 말단에의 결찰을 방지하는 블로킹기를 포함한다. 상기 블로킹기는, 각종 실시형태에 있어서, 3' 데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 수식된 염기를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 어닐링 단계는 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2의 탈혼성화를 야기한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 추가적인 기질 분자의 3' 말단에 제 3 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계, (ii) 상기 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 상기 제 3 폴리뉴클레오티드에 제 4 폴리뉴클레오티드를 어닐링하는 단계, (iii) 상기 추가적인 기질 분자의 상기 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제하는 단계, 및 이어서 (iv) 처리된 추가적인 기질 분자를 생산하기 위해 상기 이중 가닥의 추가적인 기질 분자의 상기 5' 말단에 상기 제 4 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 3 폴리뉴클레오티드는 동일하다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 4 폴리뉴클레오티드는 동일하다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 범용의 프라이머 및 복수의 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 포함하고, 상기 복수의 프라이머 쌍의 표적-특이적 프라이머는 각각 표적 기질 분자와 상보하지 않는 5' 말단의 서열 및 표적-특이적 서열을 포함하고, 상기 범용의 프라이머는 수식에 저항성이 있는 절단 가능한 염기 또는 뉴클레아제 및 상기 5' 말단의 서열을 포함하고, 상기 복수의 프라이머 쌍의 표적-특이적 프라이머 각각 및 상기 범용의 프라이머는 각각 그들의 3' 말단에 뉴클레아제 저항성 수식을 포함하고, 상기 범용의 프라이머에 포함되는 상기 절단 가능한 염기에 내성이 있는 고충실도 폴리머라아제를 포함하고, 상기 표적-특이적 프라이머 쌍 및 상기 범용의 프라이머는 동일한 온도에서 그들의 표적 기질 분자에 어닐링하고, 또한 상기 표적 특이적 프라이머 쌍과 상기 범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:100이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 절단 가능한 염기는 데옥시우리딘, RNA, 데옥시이노신, 또는 이노신이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 뉴클레아제 저항성 수식은 포스포로티오에이트이다.
추가적인 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 표적-특이적 프라이머는 상기 표적-특이적 서열과 상기 5' 말단의 서열 사이에 분자 식별 태그를 더 포함한다.
본 발명의 각종 실시형태에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머와 범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:200이거나, 적어도 약 1:300이거나, 적어도 약 1:400이거나, 적어도 약 1:500이거나, 적어도 약 1:1000이거나, 적어도 약 1:2000이거나, 적어도 약 1:3000이거나, 적어도 약 1:5000이거나, 적어도 약 1:10000 이상이다.
각종 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 기질 분자를 더 포함한다.
일부 양태에 있어서, 본 발명은 범용의 프라이머에 의해 생성되는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 생산물로서, 상기 범용의 프라이머를 통해 포함되는 적어도 하나의 절단 가능한 염기를 포함하는 생산물, 상기 절단 가능한 염기를 절단할 수 있는 엔도뉴클레아제, (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드 및 틈 번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 또는 (ii) 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소, DNA 리가아제, (i) 상기 범용의 프라이머의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 노출되는 상기 범용의 프라이머의 상기 역상보의 상기 5' 부위와 상보하는 3' 서열 및 (ii) 상기 범용의 프라이머의 역상보에 상보하지 않는 5' 부위를 포함하는 5' 어댑터를 포함하고, 상기 범용의 프라이머의 역상보의 3' 부위는 부분적으로 이중 가닥의 절삭된 3' 어댑터에 어닐링하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 UDG+엔도뉴클레아제 VIII, RN아제 HI, RN아제 H2, 및 엔도뉴클레아제 V로 이루어지는 군에서 선별된다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 DNA 리가아제는 E. coli DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 범용의 프라이머에 의해 생성되는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 생산물로서, 상기 범용의 프라이머를 통해 병합되는 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 수식을 포함하는 생산물, 상기 뉴클레아제 저항성 수식 이상으로 상기 PCR 생산물을 소화시킬 수 없는 5' 엑소뉴클레아제, (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드 및 틈 번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 또는 (ii) 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소, DNA 리가아제, (i) 상기 범용의 프라이머의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 노출되는 상기 범용의 프라이머의 상기 역상보의 상기 5' 부위와 상보하는 3' 서열 및 (ii) 상기 범용의 프라이머의 역상보에 상보하지 않는 5' 부위를 포함하는 5' 어댑터를 포함하고, 상기 범용의 프라이머의 역상보의 3' 부위는 부분적으로 이중 가닥의 절삭된 3' 어댑터에 어닐링하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 방법은 (i) 표적-특이적 프라이머 쌍으로서, 각각의 프라이머는 기질 분자와 상보적이지 않고, 얻어진 앰플리콘의 상기 말단에 단일의 범용의 어댑터를 포함하는 5' 서열을 포함하는 표적-특이적 프라이머 쌍, 및 (ii) 상기 단일의 범용의 어댑터 서열 및 추가적으로 뉴클레아제 저항성 수식 또는 절단 가능한 염기를 포함하는 단일 프라이머와 기질 분자를 접촉시키는 단계를 포함하고, 고충실도 DNA 폴리머라아제 및 뉴클레오티드의 존재 하에서, 각 PCR 사이클에 대해 일정한 어닐링 온도를 이용하지만, 어닐링 시간을 변경하는 적절한 반응 조건에서, 각각의 표적-특이적 프라이머: 범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:100이고, 표적-특이적 앰플리콘은 5분 이상의 어닐링 시간을 갖는 초기 2회 이상의 PCR 사이클 동안에 생성되고, 계속해서 각각 1분 이하의 어닐링 시간을 포함하는 잔사 PCR 사이클 동안에 얻어지는 앰플리콘의 증폭이 이어지고, 더욱 높은 농도의 단일 범용의 프라이머에 의해 상기 표적-특이적 앰플리콘의 증폭이 달성되는 것을 제공한다.
추가적인 양태에 있어서, 다중 PCR의 방법은 (i) 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍으로서, 각각의 프라이머는 상기 기질과 상보하지 않고, 얻어진 앰플리콘의 상기 말단에 단일 범용의 어댑터를 포함하는 5' 서열을 포함하는 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍, 및 (ii) 상기 단일 범용의 어댑터 서열을 포함하고, 추가적으로 뉴클레아제 저항성 수식 또는 절단 가능한 염기를 포함하는 단일 프라이머와 기질 분자를 접촉시키는 단계를 포함하고, 고충실도 DNA 폴리머라아제 및 뉴클레오티드의 존재 하에서, 각 PCR 사이클에 대해 일정한 어닐링 온도를 이용하지만, 어닐링 시간을 변경하는 적절한 반응 조건에서, 각각의 표적-특이적 프라이머: 범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:100이고, 표적-특이적 앰플리콘은 5분 이상의 어닐링 시간을 갖는 초기 2회 이상의 PCR 사이클 동안에 생성되고, 계속해서 각각 1분 이하의 어닐링 시간을 포함하는 잔사 PCR 사이클 동안에 얻어지는 앰플리콘의 증폭이 이어지고, 더욱 높은 농도의 단일 범용의 프라이머에 의해 상기 표적-특이적 앰플리콘의 다중 증폭이 달성되는 것을 제공한다.
일부 양태에 있어서, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 생산물을 전환하는 방법은 (a) 절단 가능한 염기 또는 뉴클레아제 저항성 수식 중 어느 하나가 도입되는 상기 PCR 생산물의 상기 5' 말단을 소화하는 단계, 그 다음에(b) 어닐링 단계, 및 (i) 틈-번역 결찰 또는 (ii) 상기 소화 단계에 의해 노출된 상기 범용의 어댑터의 역상보의 상기 5' 부위와 상보하는 5' 어댑터의 플랩 엔도뉴클레아제 절단 결찰, 및 (c) 부분적으로 이중 가닥의 절삭된 3' 어댑터가 상기 범용의 어댑터의 역상보의 3' 부위에 어닐링 및 결찰됨으로써 상기 PCR 생산물을 각각의 말단에서 비대칭의 어댑터를 포함하는 생산물로 전환시키는 단계를 포함하는, 각각의 말단에서의 비대칭의 5' 및 3' 어댑터를 포함하는 생산물로 각각의 말단에서의 단일의 범용의 어댑터 서열을 포함하는 것을 제공한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 PCR 생산물은 전체 게놈 증폭(WGA) 생산물이다.
본원에 개시된 임의의 방법에 있어서, 다중 증폭을 위해 선별된 표적 좌위는 종양학 특이적 표적, 약물 내성 특이적 표적, 유전 질환에 대한 표적, 전염성 병원균으로부터의 표적, 병원균 호스트에 대한 표적, 종-특이적 표적, 및 임상적으로 실행 가능한 표적을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 임의의 다양한 용도에 대응하는 것으로 간주된다.
도 1. 현재의 NGS 어댑터
· 3' 및 5' 히드록실을 갖는 필-인 어댑터(블런트-말단화 또는 T-오버행을 가짐)
· 3' 히드록실 및 5' 포스페이트를 갖는 Y-어댑터(T-오버행을 가짐)
· 3' 히드록실 및 5' 히드록실 또는 포스페이트를 갖는 스템-루프 어댑터(블런트-말단화 또는 T-오버행을 가짐)
도 2a 및 도 2b. 종래의 어댑터 결찰 화학반응
도 3. 3' 및 5' 어댑터 특징
도 4. 틈-번역에 의한 5' 어댑터 결찰
단계는:
· - 기질 분자 탈인산화
· - 기질 분자 폴리싱/블런트 말단 생성
· - 3' 어댑터 결찰
· - 상기 3' 어댑터의 부분 분해 및 상기 5' 어댑터의 어닐링
· - 틈-번역에 의한 상기 5' 어댑터의 폴리머라아제 신장
· - 상기 DNA 기질의 상기 노출된 5' 포스페이트에의 상기 신장된 5' 어댑터의 결찰을 포함한다.
도 5. 치환-절단에 의한 5' 어댑터 결찰
단계는:
· 1 - 기질 분자 탈인산화
· 2 - 기질 분자 말단 폴리싱/블런트 말단 생성
· 3 - 3' 어댑터 결찰
· 4 - 상기 3' 어댑터의 부분 분해 및 상기 5' 어댑터의 어닐링
· 5 - 상기 DNA 단편의 5' 염기(들)의 치환 및 상기 5' 어댑터의 3' 염기(들)의 어닐링
· 6 - 5'-플랩 엔도뉴클레아제에 의한 DNA의 상기 치환된 5' 염기(들)의 절단
· 7 - 상기 기질 DNA의 상기 노출된 5' 포스페이트에의 상기 5' 어댑터의 상기 3' 말단의 결찰을 포함한다.
도 6. 어댑터 결찰은 2가지 배양에 의해 달성된다.
· 연결된 어닐링-틈-번역-결찰에 의한 5'-어댑터 부착은 제 1 배양이 3'-어댑터 부착이고, 제 2 배양이 순차적으로 발생되는 3 반응액과 조합되는 2가지 배양에서 달성된다: (1) 상기 5'-어댑터의 어닐링, (2) 틈-번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제에 의한 5'-어댑터 신장(기질 DNA의 손상된 5' 말단의 절제), 및 (3) 기질 DNA의 노출된 5'-포스페이트로의 상기 5'-어댑터의 결찰
· 연결된 어닐링-틈-번역-결찰에 의한 5'-어댑터 부착은 제 1 배양이 3'-어댑터 부착이고, 제 2 배양이 순차적으로 발생되는 3 반응액과 조합되는 2가지 배양에서 달성된다: (1) 상기 3'-말단에 하나 이상의 무작위 염기를 갖는 상기 5'-어댑터의 어닐링 및 기질 DNA의 하나 이상의 말단의 5'-염기의 치환, (2) 5'-플랩 엔도뉴클레아제에 의한 치환된 5-염기의 절단(기질 DNA의 손상된 5' 말단의 절제), 및 (3) 상기 기질 DNA의 노출된 5'-포스페이트에의 상기 5'-어댑터의 결찰
도 7. 단일-가닥의 3' 오버행의 생성
· 3'-어댑터 오버행 서열은 적어도 4가지 상이한 방법에 의해 효소적으로 첨가될 수 있다:
。 T4 DNA 리가아제를 이용한 종래의 결찰에 의해
。 단일-가닥의 DNA(RNA) 리가아제에 의해
。 말단의 전사 효소에 의한 종래의 호모폴리머 테일링에 의해
。 말단의 전사 효소, DNA 리가아제 및 감쇠기-어댑터 분자를 이용한 제어된 테일링 및 동시의 어댑터 결찰(2013년 3월 13일자로 제출된 국제출원번호 PCR/US13/31104를 참조하고, 그 전체를 참고자료로서 포함함.)
· 대안적으로, DNA 단편화 또는 기타 프로세싱은 5' 어댑터 어닐링에 충분한 3'-오버행을 갖는 기존의 DNA 말단을 야기할 수 있다.
도 8. 상기 5' 어댑터를 어닐링하는 방법. 도 8a는 단계 (i)-단계 (iii)를 도시한다; 도 8b는 단계 (iv)-단계 (v)를 도시한다.
i) 상기 3'-어댑터에 미리 어닐링되어 있던 상기 제 2 올리고뉴클레오티드의 분해 후에 결합함으로써
ii) 상기 3'-어댑터에 미리 어닐링되어 있던 상기 제 2 올리고뉴클레오티드의 경쟁적 치환에 의해
iii) 상기 3'-어댑터의 상위 영역에 결합함으로써(그 다음에, 상기 3'-어댑터에 미리 어닐링되어 있던 상기 제 2 올리고뉴클레오티드의 제한된 틈-번역 및 분해가 이어짐.)
iv) 상기 3'-어댑터의 상위 영역에 미리 어닐링된 상기 5'-어댑터를 가짐으로써(그 다음에, 상기 3'-어댑터에 미리 어닐링되어 있던 상기 제 2 올리고뉴클레오티드의 제한된 틈-번역 및 분해가 이어짐.)
v) 절단에 의해 활성화되는 제 2 올리고뉴클레오티드 대신에 3' 블로킹된 5'-어댑터를 가짐으로써
도 9a-도 9d. 단일 염기 신장을 이용한 5' 어댑터 결찰
도 10. 일루미나 NGS 라이브러리 I의 합성
라이브러리 I 합성은 5 단계 또는 6 단계 중 어느 하나에서 발생된다.
도 10a:
· 1 - 기질 분자 탈인산화 및 폴리싱
· 2 - 일루미나 서열 P7(a) 또는 P5'(b)를 갖는 상기 3' 어댑터의 결찰
· 3 - 상기 3' 어댑터의 부분 분해 및 일루미나 서열 P5(a) 또는 P7'(b)를 갖는 상기 상보하는 5' 어댑터의 어닐링
· 4 - 틈-번역에 의한 상기 5' 어댑터의 폴리머라아제 신장, 및
· 5 - 상기 DNA 기질의 노출된 5' 포스페이트에의 상기 5' 어댑터의 상기 3' 말단의 결찰
· 또는, 대안적으로, 도 10b에 있어서:
· 상기 DNA 기질의 상기 5' 염기(들)의 4-치환 및 상기 5' 어댑터의 상기 3' 염기(들)의 어닐링
· 5'-플랩 엔도뉴클레아제에 의한 상기 DNA 기질의 상기 치환된 5' 염기(들)의 5-절단, 및
· 6 - 상기 DNA 기질의 상기 노출된 5' 포스페이트에의 상기 5' 어댑터의 상기 3' 말단의 결찰
상기 라이브러리는 프라이머 P5 및 P7'를 이용하여 PCR에 의해 증폭된다.
도 11. 일루미나 NGS 라이브러리 II의 합성
라이브러리 II 합성은 4가지 단계에서 발생된다:
· 1 - 도 6에 기재된 2가지 방법 중 하나에 의해 절삭된 어댑터 P7을 갖는 NGS 라이브러리의 합성
· 2 - 절삭되거나 완전한 길이 분해 가능한 프라이머 P7*을 이용하여 라이브러리 증폭
· 3 - 상기 병합된 P7* 프라이머의 분해, 그 다음에 이어지는 어닐링 및 상기 5' 어댑터 P5의 결찰
· 4 - 절삭된 분해 가능한 프라이머 P7*은 2가지 단계에서 사용되었고, 상기 절삭된 어댑터 P7*'에의 상기 P7*" 어댑터의 브릿지-결찰은 전체-길이 어앱터 P7을 완료하기 위해 행해진다.
도 12a 및 도 12b. 이온 토렌트 라이브러리의 합성
라이브러리 합성은:
· 1 - DNA 기질 탈인산화 및 폴리싱
· 2 - 서열 A1'-P1'(a) 또는 A'(b)를 갖는 상기 3' 어댑터의 결찰
· 3 - 트리밍된 DNA의 상기 5' 말단에의 서열 A(a) 또는 서열 P1-A1(b)를 갖는 상기 5' 어댑터의 상기 3' 말단의 염기 절단 결찰 또는 틈-번역 결찰에 의해 행해진다.
· 4 - 프라이머 A 및 P1을 이용한 PCR에 의한 라이브러리 증폭
도 13. 단지 20의 어댑터 서열만을 이용한 96의 조합된 바코드 서열을 갖는 이온 토렌트 라이브러리의 합성
라이브러리 합성 단계:
· 1 - DNA 말단 탈인산화 및 폴리싱(도시하지 않음)
· 2 - 서열 T'n- L'-P1' 및 5' 포스페이트기를 갖는 상기(블런트) 3'-어댑터 P1n의 결찰 및 서열 P1tr-L-Tn을 갖는 3'-블로킹된 상보하는 올리고뉴클레오티드
· 3 - 상기 3'-블로킹된 상보하는 올리고뉴클레오티드 P1tr-L-Tn의 분해
· 4 - 상기 링커 영역 L'에의 서열 A-tm-L을 갖는 상기 5'-어댑터 Am의 어닐링
· 5 - 틈-번역 중합에 의한 상기 5'-어댑터 Am의 5-신장 및 DNA의 상기 5' 말단에의 상기 신장된 5'-어댑터 Am의 상기 3' 말단의 결찰
· 6 - 프라이머 A 및 P1을 이용한 PCR에 의한 라이브러리 증폭
조합된 바코드를 갖는 어댑터는 바코드 서열 T1, T2, …, T8을 함유하는 8의 어댑터 P1n 및 바코드 서열 t1, t2, …, t12를 함유하는 12 어댑터 Am을 포함한다.
생성된 라이브러리는 최대 96의 바코드 조합을 갖는 조합된 바코드 서열 tm-L-Tn을 갖는다.
도 14. 5' 어댑터 결찰에 의한 선별된 제한 단편의 풍부화
제한 DNA 단편은 5'-어댑터 결찰 다음에 이어지는 PCR 증폭에 의해 선별된다. 선별은 제한 단편의 상기 5' 말단의 서열과 동일한 서열 a 및 b를 함유하는 2의 5'-어댑터-셀렉터 A 및 B에 의해 발생된다. 풍부화의 방법은:
1. 제한 엔도뉴클레아제에 의한 DNA 소화
2. 상기 3'-어댑터의 결찰
3. 상기 3'-어댑터의 부분 분해 및 상기 5'-어댑터-셀렉터의 어닐링
4. 상기 제한 단편의 말단의 서열 a 및 b에의 상기 5'-어댑터-셀렉터의 침입
5. 5'-플랩 엔도뉴클레아제에 의한 상기 치환된 말단의 서열 a 및 b의 절단
6. 상기 제한 단편의 상기 말단에의 상기 5'-어댑터-셀렉터의 결찰
7. PCR에 의한 상기 선별된 제한 단편의 증폭
단계 1, 단계 2 및 또한 단계 3-단계 6은 단일 배양 반응으로 조합될 수 있다.
도 15. 프라이머 신장에 의한 표적 풍부화
풍부화는 3' 오버행이 어댑터 A 및 B를 이용한 라이브러리 상에서의 표적 DNA 영역과 상보하는 프라이머의 신장 및 어댑터 A의 상기 5' 도메인의 부분 소화에 의해 생성되는 5' 어댑터 부착에 의해 행해진다. 바이오티닐화된 5'-어댑터는 어댑터 A의 3'-오버행에 어닐링되고, 이어서 제한된 틈-번역(a) 또는 침입-절단 반응(b)에 의한 트리밍 중 어느 것 다음에 어댑터 A의 상기 5' 말단에 결찰된다. 이어서, 표적 DNA 영역을 함유하는 라이브러리 단편은 PCR에 의해 증폭되고, 서열화에 의해 분석되는 스트렙타아비딘 자기 비드를 이용한 친화성 포획에 의해 분리된다.
도 16. 대안적인 라이브러리 구조체 I
라이브러리 구조체는 6 또는 7단계 중 어느 하나에서 단일 어댑터를 이용하여 행해질 수 있다.
1 - 기질 분자 탈인산화
2 - 기질 분자 및 폴리싱/블런트 말단 생성
3 - 서열 A'를 갖는 상기 3' 어댑터의 결찰
4 - 서열 A를 갖는 상기 상보하는 5' 어댑터의 어닐링 및 상기 3' 어댑터의 부분 분해
5 - 틈-번역에 의한 상기 5' 어댑터의 폴리머라아제 신장, 및
6 - 상기 DNA 기질의 상기 노출된 5' 포스페이트에의 상기 5' 어댑터의 상기 3' 말단의 결찰,
또는 대안적으로,
5 - DNA의 상기 5' 염기(들)의 치환 및 상기 5' 어댑터의 3' 염기(들)의 어닐링
6 - 5'-플랩 엔도뉴클레아제에 의한 DNA의 상기 치환된 5' 염기(들)의 절단, 및
7 - 상기 DNA 기질의 상기 노출된 5' 포스페이트에의 상기 5' 어댑터의 상기 3' 말단의 결찰
상기 라이브러리는 단일 프라이머 A를 이용한 PCR에 의해 증폭될 수 있다.
도 17. 대안적인 라이브러리 구조체 II
어댑터 부착은 공유 결합된 3' 및 5' DNA 말단을 갖는 이중-가닥의 DNA 단편의 라이브러리를 생성할 수 있다. 라이브러리 구조체는:
1 - 기질 분자 탈인산화(도시하지 않음)
2 - 기질 분자 말단 폴리싱/블런트 말단 생성(도시하지 않음)
3 - 인산화된 5' 말단 및 블로킹된(선택적으로) 3' 말단의 상기 헤어핀 블런트 어댑터의 결찰
4 - 신장 가능한 3' 말단을 생성하기 위한 헤어핀 어댑터의 부분 분해
5 - 헤어핀 어댑터의 3' 말단의 틈-번역 및 DNA 기질의 노출된 5' 포스페이트에의 그것의 결찰에 의해 행해진다.
도 18. 대안적인 라이브러리 구조체 III
순환 NGS 라이브러리는 이하의 단계를 이용하여 구축될 수 있다:
1 - 기질 분자 탈인산화(도시하지 않음)
2 - 기질 분자 말단 폴리싱/블런트 말단 생성(도시하지 않음)
3 - 인산화 5' 말단 및 블로킹된(선택적으로) 3' 말단 및 서로 상보하는 서열 X 및 X'를 갖는 어댑터의 결찰
4 - 단일-가닥의 3' 오버행을 생성하기 위한 비결찰 어댑터 가닥의 분해
5 - 말단의 서열 X 및 X'의 어닐링에 의해 DNA의 비공유 순환(낮은 DNA 농도에서 행해짐)
6 - 틈-번역 결찰 반응에 의한 DNA의 공유 순환화
도 19. FAM-표지된 올리고뉴클레오티드 기질을 이용한 3' 어댑터 결찰과 종래의 어댑터 결찰의 비교(실시예 1)
도 20. 전단의, 크기 선별된 유전체 DNA 기질을 이용한 3' 어댑터 결찰과 종래의 어댑터 결찰의 비교(실시예 2)
도 21a 및 도 21 b. FAM-표지된 올리고뉴클레오티드 기질을 이용한 5' 어댑터 결찰에 대한 온도 최적화(실시예 3)
도 22. 5' 어댑터 결찰에 대한 dNTP 조성물 효과의 분석(실시예 4)
도 23a 및 도 23b. 열 안정형 효소와 연결된 틈 번역-결찰 반응(실시예 5)
도 24. 연결된 치환-절단-결찰 반응(실시예 6)
도 25. "N" 범용의/분해된 5' 어댑터 3' 오버행 또는 "T" 기질-특이적 5' 어댑터 3' 오버행 중 어느 하나를 이용하여 연결된 배치-절단-결찰 반응(실시예 7)
도 26. DNA 폴리머라아제 I을 이용한 연결된 틈-번역-결찰 반응(실시예 8)
도 27. 폴리싱은 물리적으로 전단된 DNA의 블런트 결찰에 요구되고, 탈인산화는 키메릭 결찰 생산물의 형성을 방지한다(실시예 9).
도 28a 및 도 28b. NGS 라이브러리는 어댑터 결찰 반응에 연결된 5' 염기 트리밍을 이용하여 조제될 때에 수율이 증가된다(실시예 10).
도 29a, 도 29b, 및 도 29c. 어댑터 결찰에 연결된 5' 염기 트리밍을 이용하여 조제되는 NGS 라이브러리의 서열 분석(실시예 11)
도 30은 실시예 1에 기재된 어댑터, 모델 기질 및 올리고뉴클레오티드 구조체의 구조를 도시한다.
도 31은 FAM 기질 분자를 도시한다(실시예 1 참조).
도 32는 실시예 2에 기재된 바와 같은 어댑터의 구조를 도시한다.
도 33은 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5, 및 실시예 8에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 구조체 시스템을 도시한다.
도 34는 실시예 6에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 구조체 시스템을 도시한다.
도 35는 실시예 7에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 구조체 시스템을 도시한다.
도 36은 실시예 7에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 구조체 시스템을 도시한다.
도 37은 실시예 10에 기재된 바와 같은 P7 및 P5 어댑터의 구조를 도시한다.
도 38은 실시예 11에 기재된 바와 같은 P7 및 P5 어댑터의 구조를 도시한다.
도 39는 앰플리콘 NGS 라이브러리 구조체 방법에 대한 2가지 워크플로우를 도시한다.
도 40은 다중 PCR이 정제 단계로 나눠진 제 1 워크플로우를 도시한다.
도 41은 다중 PCR이 단일 단계로 행새지는 제 2 워크플로우를 도시한다.
도 42는 각각의 앰플리콘에의 어댑터 A 및 B의 동시 결찰의 최종 단계를 도시한다.
도 43은 단일 튜브 대 2의 튜브의 워크플로우를 비교한다.
도 44a 및 도 44b는 중복하는 프라이머 쌍 표적 영역으로부터 생성되는 앰플리콘 생산물을 도시한다.
도 45. 실시예 1: TP53 코딩 엑손에 대한 앰플리콘 적용범위의 플롯.
도 46. 실시예 1: TP53의 엑손 8에서의 체세포 돌연변이의 식별.
하나의 양태에 있어서, 본 발명은 단편화된 이중 가닥의 DNA 분자의 말단에의 어댑터 결찰의 매우 효율적인 방법을 기재한다. 여기서, 이러한 DNA 분자는 "기질 분자"라고 칭한다. 하나의 양태에 있어서, 상기 방법은 (1) 기질 분자 상의 기존의 3' 오버행에의 5' 어댑터, 바람직하게는 3' 어댑터에의 어닐링, (2) 상기 기질 분자의 상기 5'-말단으로부터의 손상된 염기의 제거, 이것이 가능하게는 (3) 사기 기질 분자의 노출된 5'-포스페이트로의 상기 5' 어댑터의 효율적인 결찰을 포함하는 단일 배양을 포함한다. 다른 양태에 있어서, 상기 방법은 상술한 바와 같이(도 6 참조) 2의 배양을 포함하고, 제 1 배양에 있어서 3' 어댑터는 기질 분자에 결찰되고, 제 2 배양에 있어서 상기 5' 어댑터는 기질 분자에 결찰된다. 각종 실시형태에 있어서, 본 발명은, (i) 탈인산화 반응, (ii) 손상된 3' 말단을 절제하고 블런트 말단을 생성하기 위한 폴리싱 반응, 및 (iii) 아데닐화 반응을 포함한, 한 가지 또는 두가지의 결찰 단계 전에 발생되는 추가적인 단계를 포함하는 방법을 더 제공하고, 이 단계의 각종 조합은 본 게시에 의해 간주되며, 이하에 더욱 상세하게 설명된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 다중앰플리콘 NGS 라이브러리 조제의 매우 효율적인 방법을 설명한다. 하나의 양태에 있어서, 상기 방법은 단일 튜브에 있어서의 다중의 중복하는 앰플리콘의 합성 및 증폭을 가능하게 한다. 다른 양태에 있어서, 키메라 앰플리콘 및 어댑터-다이머가 없는 PCR 앰플리콘의 말단의 어댑터 결찰의 신규한 매우 효율적인 방법을 설명한다. 하나의 양태에 있어서, 그것은 각각의 앰플리콘을 식별하기 위한 고유의 분해된 서열 태그의 포함을 가능하게 한다. 다른 양태에 있어서, 상기 방법은 앰플리콘의 상기 5' 말단의 분해 후 기질 앰플리콘으로의 제 2 어댑터 B의 동시 결찰 및 제 1 어댑터 A의 잔사의 링커-매개된 결찰을 포함하는 단일 배양을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 본 발명은, (i) 다중 PCR 반응, (ii) 정제 단계, 및 (iii) 범용의 단일 프라이머 증폭 단계를 포함한, 상기 결찰 단계 이전에 발생되는 추가적인 단계를 포함하는 방법을 더 제공한다. 대안적으로, 결찰 단계 전에 발생되는 추가적인 스텝은 (i) 범용의 단일의 프라이머 증폭과 결합된 다중 PCR 반응, 이어서 (ii) 정제 단계를 포함한다. 상기 단계의 각종 선택은 본 개시에 의해 간주되며, 이하에 더욱 상세하게 설명된다.
본원에 사용되는 용어 "반응 조건" 또는 "표준 반응 조건"은 제조사의 지시사항에 따른 조건을 의미한다. 본원에 개시된 효소는 모두 특별히 명시하지 않은 한 표준 반응 조건 하에서 사용되는 것으로 이해된다. 본원에 사용되는 용어 "제 1 폴리뉴클레오티드"는 "3' 어댑터", "제 1 어댑터," 또는 "어댑터 A"와 상호교환적으로 사용되고, 본원에 사용되는 용어 "제 2 폴리뉴클레오티드"는 "5' 어댑터", "제 2 어댑터" 또는 "어댑터 B"와 상호교환적으로 사용된다. 특정 예에 있어서, 어댑터 A가, 예를 들면 도 12-도 13에서 IonTorrent™ 기법을 참조하여 사용되는 경우, 상기 IonTorrent™ 방법에 대해 제조사가 제공한 어댑터 A를 의미하는 것이며, 본원에 정의된 "어댑터 A"를 의미하는 것은 아니다.
본원에 사용되는 "3' 어댑터"는 기질 분자의 3' 말단에 결찰하고, "5' 어댑터"는 기질 분자의 5' 말단에 결찰한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "손상된" 5' 말단은 5' 포스페이트가 결여된 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "처리된" 기질 분자는 5' 어댑터가 부착된 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "고충실도 폴리머라아제"는 3'-5' 엑소뉴클레아제(즉, 교정) 활성을 갖는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "저항성"은 절단 가능한 염기(예를 들면, 우라실, 이노신, 및 RNA)를 함유하는 주형에 의해 신장될 수 있는 폴리머라아제의 속성을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "비대칭의"는 양쪽 말단에 단일 어댑터 대신에 양쪽 말단에 양쪽 어댑터를 갖는 이중 가닥의 분자를 의미한다. 따라서, 상기 비대칭성은 양쪽 어댑터가 대체로 서로 비상보적이고, 단일 가닥의 부위를 갖는다는 사실로부터 발생된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "범용의 프라이머"는 범용의 어댑터 서열을 병합하도록 증폭 반응에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 사용되는 "범용의 어댑터"는 상기 범용의 프라이머 서열에 대응하는 증폭 생산물의 일부 및 그것의 역상보이다.
2의 핵산의 결합 안정성을 감소시키는 수식은 뉴클레오티드 미스매치, 데옥시이노신, 이노신 또는 범용의 염기를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 것으로 이해될 수 있다.
또한, 2의 핵산의 결합 안정성을 증가시키는 수식은 잠금 핵산(LNA), 스페르민 및 스페르미딘 또는 기타 폴리아민, 및 사이토신 메틸화를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 것으로 이해될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "범용의 염기"는 수소 결합없이 천연물질인 모두 4의 염기와 염기쌍일 수 있고 미스매치보다 덜 불안정하며, 5' 니트로인돌을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "분자 식별 태그"는 길이가 4~16염기 중 어느 하나이며, 최적의 길이는 8~12의 분해된 N 염기이다.
기질 분자
기질 분자는 천연물질인 소스이거나 또는 합성될 수 있는 것으로 간주된다. 천연물질원은 유전체 DNA, cDNA, 전체 게놈 증폭에 의해 생성되는 DNA, 적어도 하나의 이중-가닥의 말단을 포함하는 프라이머 신장 생산물, 및 PCR 앰플리콘을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 천연물질 소스는, 각종 실시형태에 있어서 원핵 소스 또는 진핵 소스이다. 예를 들면 그리고 제한 없이, 상기 소스는 인간, 마우스, 바이러스, 식물 또는 박테리아, 또는 복수의 게놈을 포함하는 혼합물일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "앰플리콘"은 증폭 기법을 이용하여 합성된 폴리뉴클레오티의 일부를 의미하는 것으로 이해된다.
기질 분자의 소스는 유전체 DNA이고, 일부 실시형태에 있어서 상기 유전체 DNA는 단편화되는 것으로 간주된다. 유전체 DNA의 단편화는 당업자에게 공지된 일반적인 절차이고, 예를 들면 그리고 제한없이 상기 DNA를 전단(분무)하는 것, 상기 DNA를 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단하는 것, 상기 DNA를 소니케이팅하는 것, 상기 DNA를 가열하는 것, 알파, 베타, 감마 또는 다른 방사선 소스를 이용한 상기 DNA의 조사, 광, 금속 이온의 존재하에서의 DNA의 화학적 절단, 라디컬 절단 및 그들의 조합에 의해 시험관 내에서 행해진다. 또한, 유전체 DNA의 단편화는, 예를 들면 그리고 제한 없이 세포사멸, 방사선 및/또는 석면에의 노출로 인해 생체 내에서 발생될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 따르면, 기질 분자의 집단은 동일한 크기일 필요는 없다. 따라서 본 발명의 방법은 상이한 크기의 기질 폴리뉴클레오티드 단편의 집단을 사용하기에 효율적이다.
기질 분자는, 본원에 개시된 바와 같이 적어도 부분적으로 이중 가닥이고, 3' 오버행(도 7a 참조), 블런트 말단, 3' 리세스드 말단, 또는 자유 3' 히드록실기를 포함한다. 기질 폴리뉴클레오티드의 오버행 또는 리세스드 말단의 길이는 다양할 수 있다. 각종 양태에 있어서, 기질 분자의 오버행 또는 리세스드 말단의 길이는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상인 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 기질 분자의 오버행 또는 리세스드 말단의 길이는 길이가 적어도 1이고, 적어도 2이고, 적어도 3이고, 적어도 4이고, 적어도 5이고, 적어도 6이고, 적어도 7이고, 적어도 8이고, 적어도 9이고, 적어도 10이고, 적어도 11이고, 적어도 12이고, 적어도 13이고, 적어도 14이고, 적어도 15이고, 적어도 16이고, 적어도 17이고, 적어도 18이고, 적어도 19 또는 적어도 20인 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 기질 분자의 오버행 또는 리세스드 말단의 길이는 길이가 약 1~약 5이거나, 약 1~약 10이거나, 약 1~약 15이거나, 약 1~약 20의 뉴클레오티드이다. 기질 분자의 집단은, 각종 양태에 있어서 상술의 기질 분자의 유형 중 하나 초과가 단일 반응에 존재하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 기질 분자는 적어도 부분적으로 단일 가닥인 것으로 간주된다. 상기 기질 분자가 단일 가닥인 본 발명의 양태는 단일 가닥의 리가아제 효소의 사용을 포함한다.
현재 발명의 일부 적용은 원래의 또는 본연의 이중 가닥의 DNA 기질 분자가 아닌 프라이머 신장 합성에 의해 생산된 이중 가닥의 DNA로의 어댑터 서열의 부착을 포함한다. 이러한 적용의 일례는 (a) 프라이머 신장을 가능하게 하기 위한 단일-가닥 또는 이중 가닥의 DNA의 3' 말단에의 프라이머-결합 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 부착, (b) 올리고뉴클레오티드에 어닐링되는 프라이머의 신장, 및 (c) 프라이머-신장에 의해 생산되는 이중-가닥의 DNA 말단에의 3' 및 5' 어댑터의 부착에 의해 생산되는 DNA 라이브러리이다.
기질 분자의 이중-가닥의 부위 또는 단일-가닥의 부위 중 어느 하나의 길이는 약 3~약 1×106의 뉴클레오티드인 것으로 간주된다. 일부 양태에 있어서, 기질 분자의 길이는 약 10~약 3000의 뉴클레오티드, 또는 약 40~약 2000의 뉴클레오티드, 또는 약 50~1000의 뉴클레오티드, 또는 약 100~약 500의 뉴클레오디드, 또는 약 1000~약 5000의 뉴클리오티드, 또는 약 10000~약 50000의 뉴클레오티드, 또는 약 100000~약 1×106의 뉴클레오티드이다. 다른 양태에 있어서, 기질 분자의 길이는 적어도 3~최대 약 50, 100 또는 1000의 뉴클레오티드; 또는 적어도 10~최대 약 50, 100 또는 1000의 뉴클레오티드; 또는 적어도 100~최대 약 1000, 5000 또는 10000의 뉴클레오티드; 또는 적어도 1000~약 10000, 20000 및 50000; 또는 적어도 10000~최대 약 20000, 50000 및 100000의 뉴클레오티드; 또는 적어도 20000~최대 약 100000, 200000 또는 500000의 뉴클레오티드; 또는 적어도 200000~최대 약 500000, 700000 또는 1000000의 뉴클레오티드이다. 각종 양태에 있어서, 상기 기질 분자의 길이는 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 310, 약 320, 약 330, 약 340, 약 350, 약 360, 약 370, 약 380, 약 390, 약 400, 약 410, 약 420, 약 430, 약 440, 약 450, 약 460, 약 470, 약 480, 약 490, 약 500, 약 510, 약 520, 약 530, 약 540, 약 550, 약 560, 약 570, 약 580, 약 590, 약 600, 약 610, 약 620, 약 630, 약 640, 약 650, 약 660, 약 670, 약 680, 약 690, 약 700, 약 710, 약 720, 약 730, 약 740, 약 750, 약 760, 약 770, 약 780, 약 790, 약 800, 약 810, 약 820, 약 830, 약 840, 약 850, 약 860, 약 870, 약 880, 약 890, 약 900, 약 910, 약 920, 약 930, 약 940, 약 950, 약 960, 약 970, 약 980, 약 990, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900, 약 3000, 약 3100, 약 3200, 약 3300, 약 3400, 약 3500, 약 3600, 약 3700, 약 3800, 약 3900, 약 4000, 약 4100, 약 4200, 약 4300, 약 4400, 약 4500, 약 4600, 약 4700, 약 4800, 약 4900, 약 5000, 10000, 15000, 20000, 50000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 350000, 400000, 450000, 500000, 550000, 600000, 650000, 700000, 750000, 800000, 850000, 900000, 950000, 1000000개 이상의 뉴클레오티드이다.
앰플리콘 분자
본원에 사용되는 바와 같이, "앰플리콘"은 증폭 기법을 이용하여 합성되는 폴리뉴클레오티드의 일부를 의미하는 것으로 이해된다.
상기 앰플리콘의 길이는 약 10bp~175bp인 것으로 간주되고, 소망의 앰플리콘 크기는 순환 무세포 DNA 단편(~165bp)보다 현저하게 짧고, 유지 샘플로부터 포르말린에 의해 유도된 가교된 DNA를 초과할 수 없는 정도의 크기, 이상적으로는 크기가 <150bp로 충분히 작다. 상기 앰플리콘은 길이가 15bp, 20bp, 25bp, 30bp, 35bp, 40bp, 45bp, 50bp, 51bp, 52bp, 53bp, 54bp, 55bp, 56bp, 57bp, 58bp, 59bp, 60bp, 61bp, 62bp, 63bp, 64bp, 65bp, 66bp, 67bp, 68bp, 69bp, 70bp, 71bp, 72bp, 73bp, 74bp, 75bp, 76bp, 77bp, 78bp, 79bp, 80bp, 81bp, 82bp, 83bp, 84bp, 85bp, 86bp, 87bp, 88bp, 89bp, 90bp, 91bp, 92bp, 93bp, 94bp, 95bp, 96bp, 97bp, 98bp, 99bp, 100bp, 101bp, 102bp, 103bp, 104bp, 105bp, 106bp, 107bp, 108bp, 109bp, 110bp, 111bp, 112bp, 113bp, 114bp, 115bp, 116bp, 117bp, 118bp, 119bp, 120bp, 121bp, 122bp, 123bp, 124bp, 125bp, 126bp, 127bp, 128bp, 129bp, 130bp, 131bp, 132bp, 133bp, 134bp, 135bp, 136bp, 137bp, 138bp, 139bp, 140bp, 141bp, 142bp, 143bp, 144bp, 145bp, 146bp, 147bp, 148bp, 149bp, 150bp, 151bp, 152bp, 153bp, 154bp, 155bp, 156bp, 157bp, 158bp, 159bp, 160bp, 161bp, 162bp, 163bp, 164bp, 165bp, 166bp, 167bp, 168bp, 169bp, 170bp, 171bp, 172bp, 173bp, 174bp, 175bp 이상일 수 있는 것으로 간주된다.
대안적으로, 더욱 긴 리드을 위해, 구체적으로는 하플로타이핑 정보 또는 스팬 반복 또는 다른 상이한 서열(PacBio)을 제공하는 멀티-킬로베이스 리드을 제공할 수 있는 긴 리드 서열 기법을 위해, 고분자량 DNA가 증폭 반응을 위한 주입 DNA로서 사용될 때에 앰플리콘 길이는 길이는 150bp~150000bp 이상인 것으로 간주된다. 앰플리콘은 길이가 150bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 800bp, 900bp, 1000bp, 2000bp, 3000bp, 4000bp, 5000bp, 6000bp, 7000bp, 8000bp, 9000bp, 10000bp, 11000bp, 12000bp, 13000bp, 14000bp, 15000bp, 16000bp, 17000bp, 18000bp, 19000bp, 20000bp, 30000bp, 40000bp, 50000bp, 100000bp, 150000bp 이상일 수 있는 것으로 간주된다.
본원에 개시된 임의의 방법에 있어서, 다중 증폭을 위해 선별된 표적 좌위는 종양학 특이적 표적, 약물 내성 특이적 표적, 약물 대사 및 흡수 표적(예를 들면, CYP2D6), 유전 질환의 표적(예를 들면, 낭포성 섬유증 CFTR 유전자, 린치 증후군 MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 및 EPCAM 유전자), 전염성 병원균으로부터의 표적, 병원균 호스트 좌위에 대한 표적, 종-특이적 표적, 및 임상적으로 실행 가능한 표적을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 임의의 다양한 적용에 대응하는 것으로 간주된다. 하나의 양태에 있어서, 상기 표적 좌위는 BRAF, KRAS, EGFR, 키트, HRAS, NRAS, MET, RET, GNA11, GNAQ, NOTCH1, ALK, PIK3CA, JAK2, AKT1, DNMT3A, IDH2, ERBB2 및 TP53을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 종약학 표적의 집합으로부터 선별된다. 다른 양태에 있어서, 상기 종양학 표적은 이하의 유전자의 부분집합을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 400-600의 유전자를 포함한다: ACURL1, AKT1, APC, APEX1, AR, ATM, ATP11B, BAP1, BCL2L1, BCL9, BIRC2, BIRC3, BRCA1, BRCA2, CCND1, CCNE1, CD274, CD44, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CSNK2A1, DCON1D1, EGFR, ERBB2, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, GAS6, GATA3, IGF1R, IL6, 키트, KRAS, MCL1, MDM2, MET, MSH2, MYC, MYCL, MYCN, MYO18A, NF1, NF2, NKX2-1, NKX2-8, NOTCH1, PDCD1LG2, PDGFRA, PIK3CA, PIK3R1, PNP, PPARG, PTCH1, PTEN, RB1, RPS6KB1, SMAD4, SMARCB1, SOX2, STK11, TERT, TET2, TIAF1, TP53, TSC1, TSC2, VHL, WT1 및 ZNF217. 다른 실시형태에 있어서, 상기 표적 좌위는 ABI1, ABL1, ABL2, ACSL3, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AKAP9, AKT1, AKT2, ALDH2, ALK, ALO17, AMER1, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATP1A1, ATP2B3, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPR1A, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIP1, BTG1, BUB1B, C12orf9, C15orf21, C15orf55, C16orf75, C2orf44, CACNA1D, CALR, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CASP8, CBFA2T1, CBFA2T3, CBFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2C, CDKN2a(p14), CDX2, CEBPA, CEP1, CEP89, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHN1, CIC, CIITA, CLIP1, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1A1, COL2A1, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CSF3R, CTNNB1, CUX1, CYLD, D10S170, DAXX, DCTN1, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, DICER1, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBF1, ECT2L, EGFR, EIF3E, EIF4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS15, ERBB2, ERC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EXT1, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FAS, FBXO11, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFR1OP, FGFR2, FGFR3, FH, FHIT, FIP1L1, FLI1, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXA1, FOXL2, FOXO1A, FOXO3A, FOXO4, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, H3F3B, HCMOGT-1, HEAB, HERPUD1, HEY1, HIP1, HIST1H3B, HIST1H4I, HLA-A, HLF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPA2B1, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, HSPCA, HSPCB, IDH1, IDH2, IGH\, IGK, IGL, IKZF1, IL2, IL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIAA1598, KIF5B, 키트, KLF4, KLK2, KMT2D, KRAS, KTN1, LAF4, LASP1, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LMNA, LMO1, LMO2, LPP, LRIG3, LSM14A, LYL1, MAF, MAFB, MALAT1, MALT1, MAML2, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECT1, MED12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLH1, MLL, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYO5A, MYST4, NAB2, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFATC2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NR4A3, NRAS, NRG1, NSD1, NT5C2, NTRK1, NTRK3, NUMA1, NUP214, NUP98, NUTM2A, NUTM2B, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PER1, PHF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG1, PLCG1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPFIBP1, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1A, PSIP1, PTCH1, PTEN, PTPN11, PTPRB, PTPRC, PTPRK, PWWP2A, RAB5EP, RAC1, RAD21, RAD51L1, RAF1, RALGDS, RANBP17, RAP1GDS1, RARA, RB1, RBM15, RECQL4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RSPO2, RSPO3, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, 42253, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, S℃S1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SS18, SS18L1, SSX1, SSX2, SSX4, STAG2, STAT3, STAT5B, STAT6, STK11, STL, SUFU, SUZ12, SYK, TAF15, TAL1, TAL2, TBL1XR1, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TOP1, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TRRAP, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, UBR5, USP6, VHL, VTI1A, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WWTR1, XPA, XPC, XPO1, YWHAE, ZCCHC8, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9 및 ZRSR2를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 종약학에 있어서의 임상적 연관성을 갖는 것으로 알려진 유전자의 하위집합으로부터 선별된다.
다른 양태에 있어서, 상기 표적은 표적화된 항암제, 상기 표적화된 항암제와 연관된 기타 표적 좌위, 항생제 저항성 좌위, 및 항바이러스 저항성 좌위로서 사용되는 티로신 키나아제 억제제에 저항성을 부여하는 좌위를 포함한 약물 저항성 좌위에 특정된다.
다른 양태에 있어서, 박테리아, 곰팡이, 효모, 바이러스 또는 기생충을 포함한, 장내 병원균, 혈액 유래 병원균, CNS 병원균, 호흡기 병원균, 성적 접촉으로 전염된 병원균, 및 요로 병원균의 검출이 행해질 수 있다. 또한, 귀, 진피, 또는 눈의 감염을 유발하는 병원균이 검출될 수 있다. 항생제 저항성을 촉진하거나 독성을 인코딩하는 유전자뿐만 아니라 박테리아 또는 바이러스의 병원균 사이의 분화가 실시될 수 있다.
얻어진 앰프리콘의 서열 분석으로부터 검출될 수 있는 유전적 병변의 유형은 SNV(단일 뉴클레오티드 변종), 점 돌연변이, 전이, 교차, 넌센스 돌연변이, 과오 돌연변이, 단일 염기 삽입과 삭제, 프라이머 쌍 사이에 맵핑되는 더 큰 삽입 및 삭제, 프라이머 쌍이 이러한 공지된 재배열의 구획점을 플랭크하도록 설계된 전좌, 유전자 융합, 삭제, 삽입 등의 공지된 염색체의 재배열, 증폭 이벤트를 포함하는 복제수 변경, 이형접합성의 삭제 및 손실, 이수성, 단친성 이염색체, 및 기타 유전 또는 후천적인 염색체 이상을 포함한다. 또한, 중아황산염 전환이 다중 PCR 전에 행해지고, 프라이머가 전환된 DNA를 중아황산염화하도록 설계되고, 추가적으로 프라이머 설계를 곤란하게 하는 각종 수식된 서열 상태를 야기할 수 있는 CpG 디뉴클레오티드와 중복되지 않는 경우, 메틸화 변경은 개시된 방법을 이용하여 검출될 수 있다.
표적 좌위의 증폭을 위해, 상기 프라이머의 3' 표적-특이적 부위의 최적의 길이는 15~ 30 염기가지만 이 범위에 한정되지 않고, 상기 프라이머의 표적-특이적 부위는 5~50의 염기 또는 10~40의 염기가거나, 이들 사이의 임의의 길이이다. 올리고뉴클레오티드의 2.5mM Mg2 +, 50mM NaCl 및 0.25μM에서 규정된 소망의 Tm은 63℃이고, 다중 프라이머 사이의 Tm의 차는 고정 반응 조건 하에서 증폭을 보장하도록 ±2.5℃를 초과하지 않는다. 상기 프라이머의 표적-특이적 부위의 소망의 GC 함유량은 이상적으로는 50%이지만, 30%~70%로 변경될 수 있다. 표적-특이적 프라이머는 다양한 유전적 배경의 DNA 샘플로부터 특정한 편향되지 않은 증폭을 보장하기 위하여, 반복적인 비고유의 서열과의 중복 또는 어세이되는 조건에 대해 통상의 SNP 다형성 또는 공지된 돌연변이를 회피하도록 설계된다. 추가적으로, 표적-특이적 표적 및 상보하는 프라이머 설계는 성능을 감소시킬 수 있는 2차 구조 형성에는 실시되지 않아야 한다.
범용의 프라이머는 데옥시우리딘, 데옥시이노신 또는 RNA를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 절단 가능한 염기를 포함하고, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 절단 가능한 염기를 함유할 수 있다. 추가적으로, 표적-특이적 프라이머 및 범용의 프라이머는 그들의 3' 말단에 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 뉴클레아제 저항성 부위를 포함한다.
어댑터 분자
본 발명은 5' 어댑터 및 3' 어댑터의 사용을 간주한다(도 3 참조). 본 개시에 따르면, 3' 어댑터는 선택적으로 "올리고뉴클레오티드 1" 및 "올리고뉴클레오티드 2"를 포함하는 이중 가닥이다. 이러한 이중 가닥의 기질 분자에 있어서, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2의 임의의 길이는 2의 올리고뉴클레오티드가 표준 반응 조건 하에서 어닐링할 수 있을 만큼 긴 것으로 간주된다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2 사이의 상보성이 있어 그들이 서로 어닐링 할 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 상기 상보성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%~약 100%이거나, 또는 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%~약 95%이거나, 또는 약 70%, 75%, 80%, 85%~약 90%이다. 특정 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2 사이의 상보성의 정도는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%이다. 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2는 무염기 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 등의 분해/제거가 가능한 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2는 상이한 길이이고, 올리고뉴클레오티드 1은 올리고뉴클레오티드 2의 길이에 따라 혼성된다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 5' 어댑터는 단일 가닥이다. 상기 5' 어댑터가 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 1와 혼성화되는 실시형태에 있어서, 다른 실시형태에 있어서 이러한 어닐링은 상기 5' 어댑터 및 기질 분자 사이에 틈, 갭 또는 중복 염기 또는 염기들을 야기하는 것으로 간주된다(도 8 참조). 각종 실시형태에 있어서, 갭 또는 중복되는 염기의 수는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100이다. 3' 어댑터가 이중 가닥인 다른 실시형태에 있어서, 3' 어댑터로의 상기 5' 어댑터의 어닐링 후에 효소가 틈 번역에 의해 상기 5' 어댑터의 "츄잉 포워드"를 촉매하여 올리고뉴클레오티드 2를 제거하기 위해 첨가된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 5' 어댑터는 추가적으로 올리고뉴클레오티드 1과 상보하지 않고, 그것의 5' 염기가 배치되어 있는 경우에 기질 분자의 제 1 염기(들)에 어닐링될 수 있는 그것의 3' 말단에 무작위의 단일 또는 이중 이상의 N 염기를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 5' 어댑터는 수식된 폴리뉴클레오티드이다. 사용이 간주되는 수식된 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 공개 번호 2011/0129832에 개시되어 있고, 그 전체를 참고자료로서 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 5' 어댑터는 잠금 핵산(LNA) 및 펩티드 핵산(PNA)로 이루어지는 군에서 선택되는 염기 수식을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 5'-어댑터 올리고뉴클레오티드는 3'-어댑터로 미리 어닐링된다(도 8 참조).
또한, 본 발명은 PCR에 의해 포함된 범용의 어댑터, 단일 가닥의 5' 어댑터, 및 부분적으로 처리된 앰플리콘 기질 상에서 범용의 어댑터의 하나의 가닥으로 결찰되는 3' 어댑터의 잔사의 사용을 간주한다. 본 개시에 따르면, 3' 어댑터의 잔사의 결찰은 링커에 의해 매개된다. 상기 링커 분자에 대해, 범용의 어댑터 및 3' 어댑터의 잔사와 상보하는 임의의 길이는 3의 올리고뉴클레오티드가 표준 반응 조건 하에서 서로 어닐링될 수 있는 것으로 간주된다. 따라서, 상보성이 있어 그들이 서로 어닐링할 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 상보성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%~약 100%, 또는 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%~약 95%, 또는 약 70%, 75%, 80%, 85%~약 90%이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 5' 어댑터는 단일 가닥이다. 상기 5' 어댑터가 앰플리콘 말단 상에서 범용의 어댑터의 3' 오버행과 혼성되는 실시형태에 있어서, 그것은 이러한 어닐링이 상기 5' 어댑터의 앰플리콘 기질 사이의 틈 또는 갭 중 어느 것을 야기하는 다른 실시형태에 간주된다. 각종 실시형태에 있어서, 갭은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100염기이다.
범용의 어댑터, 5' 어댑터 또는 3' 어댑터 A의 잔사 중 어느 하나의 길이는 약 5~약 200뉴클레오티드인 것으로 간주된다. 일부 양태에 있어서, 범용의 어댑터, 5' 어댑터 또는 3' 어댑터의 길이는 약 5~약 200뉴클레오티드, 또는 약 5~약 150뉴클레오티드, 또는 약 5~약 100뉴클레오티드, 또는 약 5~약 50뉴클레오티드, 또는 약 5~약 25뉴클레오티드, 또는 약 10~200뉴클레오티드, 또는 약 10~100뉴클레오티드이다. 다른 양태에 있어서, 상기 5' 어댑터 또는 3' 어댑터의 길이는 적어도 5~최대 약 50, 100 또는 200뉴클레오티드; 또는 적어도 10~최대 약 50, 100 또는 200뉴클레오티드; 또는 적어도 15~최대 약 50, 100, 또는 200뉴클레오티드; 또는 적어도 20~최대 약 50, 100 또는 200뉴클레오티드; 또는 적어도 30~최대 약 50, 100 또는 200뉴클레오티드; 또는 적어도 40~최대 약 50, 100 또는 200뉴클레오티드이다. 각종 양태에 있어서, 기질 분자의 길이는 길이가 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900, 약 3000, 약 3100, 약 3200, 약 3300, 약 3400, 약 3500, 약 3600, 약 3700, 약 3800, 약 3900, 약 4000, 약 4100, 약 4200, 약 4300, 약 4400, 약 4500, 약 4600, 약 4700, 약 4800, 약 4900, 약 5000, 약 5100, 약 5200, 약 5300, 약 5400, 약 5500, 약 5600, 약 5700, 약 5800, 약 5900, 약 6000, 약 6100, 약 6200, 약 6300, 약 6400, 약 6500, 약 6600, 약 6700, 약 6800, 약 6900, 약 7000, 약 7100, 약 7200, 약 7300, 약 7400, 약 7500, 약 7600, 약 7700, 약 7800, 약 7900, 약 8000, 약 8100, 약 8200, 약 8300, 약 8400, 약 8500, 약 8600, 약 8700, 약 8800, 약 8900, 약 9000, 약 9100, 약 9200, 약 9300, 약 9400, 약 9500, 약 9600, 약 9700, 약 9800, 약 9900, 약 10000, 약 10500, 약 11000, 약 11500, 약 12000, 약 12500, 약 13000, 약 13500, 약 14000, 약 14500, 약 15000, 약 15500, 약 16000, 약 16500, 약 17000, 약 17500, 약 18000, 약 18500, 약 19000, 약 19500, 약 20000, 약 20500, 약 21000, 약 21500, 약 22000, 약 22500, 약 23000, 약 23500, 약 24000, 약 24500, 약 25000, 약 25500, 약 26000, 약 26500, 약 27000, 약 27500, 약 28000, 약 28500, 약 29000, 약 29500, 약 30000, 약 30500, 약 31000, 약 31500, 약 32000, 약 32500, 약 33000, 약 33500, 약 34000, 약 34500, 약 35000, 약 35500, 약 36000, 약 36500, 약 37000, 약 37500, 약 38000, 약 38500, 약 39000, 약 39500, 약 40000, 약 40500, 약 41000, 약 41500, 약 42000, 약 42500, 약 43000, 약 43500, 약 44000, 약 44500, 약 45000, 약 45500, 약 46000, 약 46500, 약 47000, 약 47500, 약 48000, 약 48500, 약 49000, 약 49500, 약 50000, 약 60000, 약 70000, 약 80000, 약 90000, 약 100000 이상인 뉴클레오티드이다.
NGS 어댑터 결찰을 완료하기 위해, 범용의 어댑터 프라이머는 추가적으로 효소적으로, 화학적으로, 또는 물리적으로 파괴될 수 있는 수식된 염기 및/또는 연결기를 포함한다. 수식은 dU-염기, 데옥시이노신 및 RNA 염기를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 앰플리콘의 3' 오버행으로의 단일-가닥의 5' 어댑터의 어닐링은 절단 가능한 염기를 갖는 상기 포함된 범용의 프라이머에 대응하는 범용의 어댑터의 하나의 가닥의 분해의 결과로서 발생된다. 일부 실시형태에 있어서, 분해는 효소적으로 달성될 수 있고, 보다 구체적으로는 올리고뉴클레오티드가 데옥시우라실 염기를 포함하는 경우에 우라실-DNA 글리코실라아제(UDG) 또는 UDG 및 아퓨린산/아피리미딘산 엔도뉴클레아제를 이용하거나, 또는 올리고뉴클레오티드가 데옥시이노신 염기를 함유하는 경우에 엔도뉴클레아제 V를 사용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 분해는 병합되는 프라이머가 RNA 염기를 함유하는 경우에 RN아제 H1 또는 RN아제 H2와의 배양에 의해 행해질 수 있다. 일부 응용에 있어서, 상기 포함된 프라이머의 분해는 화학적으로 또는 물리적으로, 예를 들면 광에 의해 행해질 수 있다. 대안적으로, 앰플리콘의 3' 오버행은 앰플리콘의 상기 5' 말단의 제한된 엑소뉴클레아제 소화에 의해 생산될 수 있다. 이러한 제한된 소화는 효소적으로, 보다 구체적으로는 프라이머 올리고뉴클레오티드가 3' 말단에 뉴클레아제-저항성 염기(들), 구체적으로는 포스포로티오에이트 연결을 갖는 염기를 함유하는 경우에 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 또는 람다 5'→3' 엑소뉴클레아제를 이용함으로써 달성될 수 있다. 이 경우에 있어서, 엑소뉴클레아제 반응은 수식된 염기에서 정지되고, 3' 오버행을 생산한다.
방법-단계
상기 방법의 초기 3가지 배양은 전-결찰 단계이고, (i) 탈인산화, (ii) 폴리싱 및 (iii) 임의의 아데닐화를 포함한다. 상기 방법의 나머지 2가지 배양은 (1) 3' 어댑터 결찰, 및 (2)(a) 5' 어댑터 어닐링, (b) 기질 분자로부터의 상기 5' 염기의 제거, 및 (c) 5' 어댑터 결찰(도 4-도 6 참조)을 포함하는 5' 어댑터 결찰을 포함한다. 이 양태에 있어서, 상기 방법은 최대 3가지의 전-결찰 단계 및 2가지의 결찰 단계를 갖는다. 다른 양태에 있어서, 상기 방법은 기질 분자가 바람직하게는 3' 어댑터로서 역할을 하는 기존의 3' 오버행을 포함하는 경우에 상기 5' 어댑터의 단일 결찰 단계를 갖는다(도 7a 참조).
증폭 반응 내에서, 다중화된 사이클의 수는 비다중화된 범용의 어댑터 단일의 프라이머 증폭으로의 스위칭 전에 최소 2사이클로 제한되거나, 3사이클, 4사이클, 5사이클 이상, 최대 N사이클로 행해질 수 있다. 범용의 사이클의 수는 DNA 주입 및 소망의 라이브러리 수율에 따라서 1사이클~40사이클까지 변경될 수 있다. 다중 PCR 증폭 후에, 정제 단계가 행해지고, 이어서 동시 어댑터 결찰 단계가 행해진다.
프리-결찰 단계:
(i) 탈인산화
어댑터 결찰 전에, DNA 말단은 추가적으로 어댑터 결찰 반응의 효율성을 개선시키기 위해 처리된다. 기존의 방법에 있어서의 DNA 말단 프로세싱은 2가지 효소 반응을 이용한다: (a) 3'-오버행를 제거하고, 리세스드 3' 말단을 필-인함으로써 DNA 말단을 폴리싱하도록 교정 DNA 폴리머라아제(들)과 배양 및 (b) 상기 5' 말단에 포스페이트기를 첨가하도록 폴리뉴클레오티드 키나아제와 배양. 또한, DNA 말단을 처리할 때에, 일부 방법은 비교정 DNA 폴리머라아제와 폴리싱된 DNA의 배양에 의해 3' 말단에서 블런트-말단화 DNA를 아데닐화한다. 아데닐화는 DNA 자기-결찰 및 키메라 생산물의 형성을 방지하도록 돕는다. 또한, 그것은 대응하는 어댑터의 3' 말단의 dT의 존재로 인한 어댑터-다이머의 형성을 최소화한다. 현재의 발명은 이들 문제를 완전히 상이한 방법으로 해결한다. DNA 단편의 상기 5' 말단에 포스페이트기를 첨가하기 보다는 오히려 본 발명의 방법은 DNA 단편의 상기 5' 말단로부터의 포스페이트기의 임의의 완전한 제거를 구현한다. DNA 말단의 탈인산화는 DNA 말단으로부터 포스페이트를 제거할 수 있는 효소와 DNA 단편의 배양에 의해 달성된다. 5' 또는 3' 포스페이트를 제거하기 위한 본 발명의 방법에 유용한 효소의 예로는 송아지 소장 유래의 알칼리 포스파타아제, 박테리아 유래의 알칼리 포스파타아제, 새우 유래의 알칼리 포스파타아제, 극지생물 유래 포스파타아제, 및 태반 유래의 알칼리 포스파타아제 등의 임의의 포스파타아제 효소가 포함되지만, 이들에 한정되지 않고, 각각 표준 조건에 따라 사용된다.
(ii) 폴리싱
알칼리 포스파타아제의 제거 또는 그것의 열에 의한 불활성화 후에, DNA 기질 분자는 선택적으로 블런트 말단을 생성하도록 dNTP의 존재 하에서 교정 DNA 폴리머라아제와의 배양이 실시된다. 상기 반응은 표준 조건에 따라 행해진다. 탈인산화 및 폴리싱된 DNA 단편은 3' 어댑터의 부착에 양호한 기질이지만, DNA 단편 연쇄체 결찰 및 키메라 형성에 있어서는 열악한 기질이다. 또한, 그들은 종래의 어댑터의 결찰에 있어서도 열악한 기질이다.
현재의 발명의 일부 응용에 있어서, 포스파타아제 효소에 의한 5' 말단 탈인산화는 생략될 수 있지만, DNA 폴리싱 믹스로의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 등의 효소의 첨가는 DNA 폴리싱 전에 3' 말단으로부터의 포스페이트기의 제거를 보장하는 이 경우에 있어서는 바람직하다. 대안적으로, 상술한 초기 2가지 프리-결찰 반응, 탈인산화, 및 폴리싱은 임의의 순서로 실행되고, 그들의 말단에서 블런트-말단ed, 이중-가닥의 DNA 결여 5' 포스페이트기를 야기할 수 있다.
(iii) 아데닐화
또한, 현재의 발명은 DNA 폴리머라아제 I의(엑소-) 클레나우 단편 및 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 비주형 폴리머라아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 이용하여 블런트-말단 DNA 단편의 3' 말단의 아데닐화의 이용을 간주한다. 알칼리 포스파타아제 처리 및 아데닐화 양쪽은 DNA 단편 자기-결찰 및 키메라 라이브러리 분자의 형성의 경향을 감소시킨다. 아데닐화 단계를 포함하는 경우에 있어서, 후속의 단계에 사용되는 3' 어댑터는 단일의 T 오버행을 필요로 할 수 있다.
결찰 단계:
(1) 3' 어댑터 결찰, 또는 DNA 기질 상에서의 단일-가닥의 3' 오버행의 생성
상기 선택은 도 7에 도시된다.
선택 1a: 이중 가닥의 3' 어댑터의 일부로서의 3' 블로킹된 올리고뉴클레오티드 2(도 7a)
기존의 NGS 라이브러리 제조 프로토콜은 DNA 단편의 말단에서의 어댑터의 3'OH기와 상기 5' 포스페이트기 사이의 결찰에 의존했다. 이 이유에 대해, 종래의 방법에서 사용되는 어댑터는 통상 3' 히드록실기 및 임의의 5' 포스페이트기를 갖는 하나의 기능적인 이중-가닥의 말단을 갖는다(도 1 및 도 2 참조). 대조적으로, 현재의 발명은 3' 어댑터의 5' 포스페이트기와 DNA 단편의 3' OH기 사이의 결찰 반응을 이용하지만, 3' 어댑터의 3' 말단과 DNA 단편의 상기 5' 말단 사이에 틈을 남긴다(도 3 참조). 3' 어댑터는 5'-포스페이트기를 갖는 기능적인 이중-가닥의 말단, 이 선택에 있어서는 결찰에 간주되지 않는 3' 뉴클레오티드(예를 들면, 2',3' 디데옥시 염기 또는 3'-데옥시 염기 등의 당 수식된 염기 유사체로 이루어짐)를 갖는다. 3' 어댑터는 2의 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 형성된다: 상기 5' 말단에 포스페이트기 및 3' 말단에 블로킹기(C3 스페이서 등)를 갖는 올리고뉴클레오티드 1, 및 상기 5' 말단에 포스페이트기가 결여되고 3' 말단에 비결찰 가능한 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 2. 올리고뉴클레오티드 2는 추가적으로 ㅎ효효소적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 파괴될 수 있는 수식된 염기 및/또는 연결기를 포함한다. 대부분의 응용에 있어서, 기질 분자와의 결찰에 포함되는 3' 어댑터의 말단은 블런트 말단이다. DNA 단편의 아데닐화를 포함하는 응용에 있어서, 3' 어댑터의 결찰 가능한 말단은 2',3' 디데옥시티미딘 또는 3'-데옥시티미딘 염기를 함유하는 3' 오버행(또는 인접한 염기와 공유 결합을 형성하는 그것의 능력을 블로킹하는 티민 염기의 기타 수식)을 갖는다. 다른 응용에 있어서, 3' 어댑터의 기능적인 말단은 다중 염기를 함유하는 3' 또는 5' 오버행 중 어느 하나를 가질 수 있다. DNA 리가아제와의 배양시에, 3' 어댑터의 상기 5' 포스페이트는 DNA 기질 분자의 3' 말단에 결찰되지만, 3' 어댑터의 3' 말단과 DNA 기질 분자의 상기 5' 말단 사이에 틈을 남긴다. 반응이 완료된 후에, 결찰된 DNA는 스핀-컬럼 또는 SPRI 비드 기반의 정제에 의한 정제를 실시하여 과잉의 어댑터 및 결찰 반응의 기타 구성성분을 제거한다.
선택 1b: 이중 가닥의 3' 어댑터의 일부로서의 3' 히드록실 올리고뉴클레오티드 2(도 7a)
대안적인 방법에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2의 3' 말단에 블로킹된, 결찰 불가능한 염기가 결여되어 있는 3'-어댑터가 사용될 수 있다. 기질 분자로의 비블로킹된 올리고뉴클레오티드 2의 결찰은 여전히 탈인산화 반응의 결과로서 기질 분자 상에서의 5' 포스페이트의 결여에 의해 방지될 수 있다. 비블로킹된 올리고뉴클레오티드 2를 이용하는 이점은 올리고뉴클레오티드 2의 3' 말단가 디데옥시 뉴클레오티드 믹스 및 틈-번역 DNA 합성이 가능한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 단일 염기에 의해 신장될 수 있다. 이것은 기질 분자로부터 5' 염기 절제를 행하기 위한 대안적인 방법을 가능하게 하고, 후술의 후속 단계를 참조한다. 비블로킹된 3'-어댑터를 사용하는 것의 난점은 어댑터 농도를 저감시키기고, 그 결과 어댑터 결찰 효율을 감소시킬 수 있는 결찰 반응시에 어댑터-다이머의 생성이다. 또한, 이 선택에 대해, 올리고뉴클레오티드 2는 추가적으로 효소적으로, 화학적으로 또는 ㅁ물리적으로 파괴될 수 있는 수식된 염기 및/또는 연결기를 포함한다.
선택 2: 단일 가닥의 3' 어댑터(도 7a)
이중 가닥의(또는 단일 가닥의) 기질 분자에 부착되는 단일 가닥의 어댑터를 공유 부착할 수 있는 리가아제(DNA 또는 RNA)의 존재 하에서, 올리고뉴클레오티드 2는 반응으로부터 생략될 수 있다.
선택 3: 호모폴리머 3' 어댑터(도 7a)
3'-엑소뉴클레아제 교정 활성이 결여되고, 뉴클레오티드를 포함하는, 말단의 데옥시뉴클레오티딜 전사 효소(TdT), 폴리(A) 폴리머라아제, 폴리(U) 폴리머라아제 또는 DNA 폴리머라아제 등의 주형-독립 폴리머라아제의 존재 하에서, 호모폴리머 또는 기타 테일은 3' 어댑터 서열로서 기능할 수 있는 기질 분자의 3' 말단 상에 포함될 수 있다.
선택 4: 제어된 테일링 및 동시 3' 어댑터 결찰(도 7a)
TdT 등의 주형 독립 폴리머라아제의 존재 하에서, 추가적으로 리가아제 및 감쇠기-어댑터 분자, 합성 테일 및 규정된 3' 어댑터 서열을 포함하는 뉴클레오티드가 기질 분자의 3' 말단 상에 포함될 수 있다. 2013년 3월 13일자로 제출된 국제출원번호 PCR/US13/31104를 침조하고, 본원에 그 전체가 참고자료로서 포함된다.
선택 5: 3' 어댑터 결찰 단계를 생략(도 7b)
천연물질이거나 이전의 효소 처리 또는 기타 처리로부터 얻어지는 기존의 3' 오버행을 포함하는 기질 분자의 경우에 있어서, 규정된 또는 무작위의 서열 중 어느 하나는 별도의 3' 어댑터 결찰 단계를 필요로 하지 않고, 생략할 수 있으며, 상기 기존의 3' 오버행은 3' 어댑터로서 기능할 수 있다.
대안적인 실시형태에 있어서, 아연 및 다른 반응 구성성분을 갖는 포스파타아제 효소가 그것의 완료시에 3' 어댑터 결찰 반응에 첨가될 수 있다. 3' 어댑터 결찰 후에 포스파타아제 반응을 행하는 것은 후속의 결찰을 불가능하게 하는 임의의 비결찰된 3' 어댑터 분자를 렌더링하는 방법이고, 이것은 5' 어댑터가 존재할 때에 어댑터 다이머가 후속의 단계에서 형성되는 것을 방지한다.
(2) 단일 배양에서 발생되는 3가지 단계로 이루어지는 5' 어댑터 결찰
(I) 상기 5' 어댑터의 어닐링
단일 가닥의 3' 어댑터 결찰(선택 2), 호모폴리머 추가(선택 3) 또는 3' 어댑터(선택 5)으로서의 기존의 3' 오버행의 사용(선택 5)의 경우에 있어서, 상기 5' 어댑터의 어닐링은 올리고뉴클레오티드 2가 분해 또는 치환되지 않기 때문에 기타 고려사항없이 직접 행해질 수 있다.
이중-가닥의 3'-어댑터의 결찰이 이중-가닥의 DNA의 말단에 단일-가닥의 3' 오버행을 생성(상기 선택1a, 선택1b 및 선택4)하기 위해 사용되는 경우, 상기 5'-어댑터는 임의의 5가지 상이한 선택을 이용하여 3'-어댑터에 어닐링될 수 있고, 이들은 각각 이하에 설명되고, 도 8에 도시된다:
i) 상기 3' 어댑터에 어닐링된 올리고뉴클레오티드 2의 분해 이후
ii) 상기 3' 어댑터에 어닐링된 올리고뉴클레오티드 2의 경쟁적 치환에 의해
iii) 올리고뉴클레오티드 2의 상기 어닐링 부위에 대하여 올리고뉴클레오티드 1 상의 상기 5' 어댑터 또한 3'를 어닐링하고, 그 다음 올리고뉴클레오티드 2의 틈-번역 및 분해가 이어짐으로써
iv) 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 1의 3' 영역에 프리-어닐링된 상기 5' 어댑터를 갖고, 그 다음 올리고뉴클레오티드 2의 틈-번역 및 분해가 이어짐으로써
v) 상기 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 1(올리고뉴클레오티드 2 대신에)의 상기 5' 영역에 프리-어닐링된 3' 블로킹기를 갖는 상기 5' 어댑터를 갖고, 그 다음 3' 블로킹기의 효소적 절제가 이어짐으로써
선택 i:
3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 2는 추가적으로 수식된 염기 및/또는 효소적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 파괴될 수 있는 연결기를 포함한다. 수식은 dU-염기, 데옥시이노신 및 RNA 염기를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 1의 5' 부위에 단일-가닥의 5' 어댑터를 어닐링하는 것은 3' 어댑터, 구체적으로는 올리고뉴클레오티드 2의 부분 분해의 결과로서 발생된다. 일부 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2의 분해는 효소적으로, 보다 구체적으로는 제 2 올리고뉴클레오티드가 데옥시우라실 염기를 함유하고 있는 경우에 우라실-DNA 글리코실라아제(UDG), 또는 UDG 및 아퓨린산/아피리미딘산 엔도뉴클레아제의 조합을 이용하거나, 또는 제 2 올리고뉴클레오티드가 데옥시이노신 염기를 함유하는 경우에 엔도뉴클레아제 V를 이용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드 2의 분해는 제 2 올리고뉴클레오티드가 RNA 염기를 함유하는 경우에 RN아제 H1 또는 RN아제 H2와의 배양에 의해 행해질 수 있다. 일부 응용에 있어서, 제 2 올리고뉴클레오티드의 분해는 화학적으로 또는 물리적으로, 예를 들면 광에 의해 행해질 수 있다.
선택 ii:
일부 응용에 있어서, 3'어댑터의 올리고뉴클레오티드 1로의 상기 5' 어댑터의 어닐링은 올리고뉴클레오티드 2의 분해 없이 발생된다. 이 경우에 있어서, 단일-가닥의 5' 어댑터와 올리고뉴클레오티드 2의 교체는 올리고뉴클레오티드 1 과 상기 5' 어댑터 서열 사이의 증가된 상보성 또는 그것의 용융 온도를 증가시키는 상기 5' 어댑터 내의 염기 수식(예를 들면, LNA 염기) 중 어느 하나로 인해 올리고뉴클레오티드 2위의 상기 5' 어댑터의 더욱 높은 친화성에 의해 용이해질 수 있다. 상기 5' 어댑터의 설계에 따라서, 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 1로의 어닐링은 상대적으로상기 5' 어댑터의 3' 말단과 DNA 기질 분자의 상기 5' 말단 사이의 틈 또는 갭, 또는 상기 5' 어댑터의 3' 및 5' 염기와 DNA 기질 분자의 중복을 야기한다.
선택 iii:
이 경우에 있어서, 올리고뉴클레오티드 2의 분해 가능한 수식 또는 경쟁적 치환이 이용되지 않는다. 대신에, 상기 5' 어댑터는 올리고뉴클레오티드 2의 어닐링 사이트에 대하여 3' 어댑터 또한 올리고뉴클레오티드 1의 3'에 어닐링하고, 그 다음 올리고뉴클레오티드 2의 분해 또는 부분 분해를 야기하는 제한된 틈-번역 "츄잉 포워드"에 의해 올리고뉴클레오티드 2를 교체한다.
선택 iv 및 선택 v:
이들 경우에 있어서, 상기 5' 어댑터는 3' 어댑터의 일부를 구성하고, DNA 기질로의 3' 어댑터의 결찰시에 존재한다. 선택 iv에 있어서, 상기 5' 어댑터는 올리고뉴클레오티드 2의 어닐링 사이트에 대하여 3' 어댑터 또한 올리고뉴클레오티드 1의 3'에 프리-어닐링된다(선택 iii과 마찬가지임). 선택 v에 있어서, 상기 5' 어댑터는 3' 말단에 블로킹기를 갖고, 올리고뉴클레오티드 2 대신에 프리-어닐링된 3' 어댑터이다. 3' 어댑터의 결찰 후, 상기 5' 어댑터의 3' 말단에서의 블로킹기는 효소적으로 제거되어 DNA 폴리머라아제에 의한 그것의 신장을 가능하게 한다.
(II) 5' 포스페이트의 노출을 야기하는 기질 분자로부터의 5'-염기 제거
이 단계에 있어서, 기질 분자 상에서의 결찰-호환성 5' 말단의 포스페이트기의 생성은 DNA 폴리머라아제 및 뉴클레오티드를 이용한 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 틈-번역(선택 i), 뉴클레오티드의 부재 하에서 상기 5' 어댑터 및 5'-플랩 엔도뉴클레아제를 이용한 치환-절단반응에 의한 DNA 기질 분자의 손상된 5' 말단의 염기의 제거(선택 ii), 또는 올리고뉴클레오티드 2로부터의 단일의 디데옥시 염기 신장 후에 뉴클레오티드의 부재 하에서 5'-플랩 엔도뉴클레아제를 이용한 치환-절단(선택 iii) 중 어느 하나에 의한 DNA 기질 분자의 손상된 5' 말단의 염기의 제거에 의해 달성된다. 제 3 선택에 대해, 기질 분자의 5' 염기 절제는 상기 5' 어댑터 대신에 어닐링된 올리고뉴클레오티드 2를 이용하여 대안적으로 행해지기 때문에, 5' 어댑터 어닐링 전에 발생되지만, 상기 방법의 설명을 간략화하기 위해 이 섹션에 포함된다(도 9 참조).
선택 i:
틈-번역 DNA 합성은 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 DNA 기질 분자의 상기 5' 말단 사이의 틈 또는 갭에서 개시되고, 결찰 반응이 틈을 시일링하면 정지된다(도 4 및 도 6a 참조). 틈-번역 반응은 DNA 폴리머라아제 I(유사효소), TAQ DNA 폴리머라아제, TTH DNA 폴리머라아제, 및 BST DNA 폴리머라아제(유사효소) 등의 DNA 폴리머라아제에 의해 행해질 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 사용을 위해 간주되는 추가적인 효소는 제한없이 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 및 가닥 치환 폴리머라아제와 5' 플랩 엔도뉴클레아제의 조합을 포함한다.
이 단계를 위해 간주되는 반응 조건은 (i) 내생 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 및 리가아제가 활성화, (ii) 가닥 치환 폴리머라아제와 플랩 엔도뉴클레아제 폴리머라아제 및 리가아제가 활성화, (iii) 플랩 엔도뉴클레아제 및 리가아제가 활성화, (iv) 열안정성 효소 및 열 열불안정성 효소 양쪽의 동시 활성이 발생, 또는 (v) 열안정성 효소만 또는 열불안정성 효소만의 활성이 발생할 수 있는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 조건 (i) 및 (ii)는 각각 틈 번역을 위해 dNTP를 이용하여 행해진다. 특정 실시형태에 있어서, TAQ 폴리머라아제 및 E. coli 리가아제가 40℃의 반응 온도에서 사용된다. 그러나, 각종 실시형태에 있어서, 10℃~75℃의 반응 온도의 범위가 간주된다.
틈-번역 반응은 상기 5' 어댑터 신장 생산물와 DNA 기질 분자 사이에서 발생되는 결찰 반응 전에 DNA 기질 분자의 상기 5' 말단로부터의 1개, 2개 이상의 염기의 제거를 야기한다. 틈-번역 합성은 모두 4의 뉴클레오티드 dGTP, dCTP, dTTP 및 dATP 또는 그들의 제한적인 조합의 존재 하에서 발생될 수 있다. 제한된 조합은 dGTP, dCTP 및 dATP, 또는 dGTP, dCTP 및 dTTP, 또는 dGTP, dATP 및 dTTP, 또는 dCTP, dATP 및 dTTP 등의 3의-뉴클레오티드 조합; dGTP 및 dCTP, 또는 dGTP 및 dATP, 또는 dGTP 및 dTTP, 또는 dCTP 및 dATP, 또는 dCTP 및 dTTP, 또는 dATP 및 dTTP 등의 2의 뉴클레오티드 조합; 또는 dGTP, 또는 dCTP, 또는 dATP, 또는 dTTP 등의 단지 1의 뉴클레오티드를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
선택 ii:
치환-절단반응은 dNTP를 필요로 하지 않지만, 상기 5' 어댑터 서열이 기질 분자를 갖고, 상기 반응에서 복수의 5' 어댑터를 포함하는 중복을 생성하도록 3' 말단에 1개, 2개 이상의 무작위 염기를 포함하는 것을 필요로 한다(도 5 및 6b 참조). 상기 치환-절단 반응은 5' 어댑터의 어닐링, 상기 5' 어댑터의 3' 염기와 중복되는 DNA 기질 분자의 5' DNA 염기의 치환, 및 5'-플랩 엔도뉴클레아제에 의한 상기 치환된 염기의 절단에 의해 개시된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 5' 어댑터는 3' 말단에 하나의 무작위 염기 dN을 갖는다. 이 경우에 있어서, 상기 중복은 하나의 염기를 포함하고, 단지 단일 5' 염기가 DNA 기질 분자의 5' 말단로부터 제거되고, 상기 5' 어댑터 서열로부터 마찬가지의 염기로 교체될 수 있다. 치환-절단반응의 효율은 그것의 말단의 3' 염기가 DNA 기질 분자의 상기 5' 염기에 미스매치되는 경우, 5' 어댑터가 해리되었다가 재어닐링되도록 40℃~65℃의 반응의 온도를 순환시킴으로써 증가된다.
선택 iii:
기질 분자의 상기 5' 염기 절제에 관여하는 상기 5' 어댑터에 대한 대안적인 실시형태는 대신에 이전 단계에서 기질 분자의 상기 5' 염기 절제에 관여하는 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 2를 갖는다(도 9 참조).
하나의 접근에 있어서(도 9a 및 도 9c), 3' 어댑터의 올리고뉴클레오티드 2는 신장 가능한 3' 말단을 포함하고, 적절한 조건 하의 디데옥시 뉴클레오티드 혼합물 및 폴리머라아제의 존재 하에서 단일의 디데옥시 염기의 첨가는 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 적절한 플랩 엔도뉴클레아제 또는 폴리머라아제에 의한 단일 염기 치환-절단을 유도하는, 기질 분자의 상기 5' 말단과의 단일의 염기 중복으로 이어지는 것을 발생시킨다. 계속해서, 그것의 3' 말단에 무작위 dN 염기를 갖는 5' 어댑터가 사용되고(도 9a), 이중 가닥의 DNA에 부착된 3'-어댑터로의 결합 후에 틈이 형성된다. 상기 틈은 DNA 기질 분자의 상기 5' 말단으로의 상기 5'어댑터의 공유 부착을 야기하는 DNA 리가아제에 의해 시일링될 수 있다.
대안적으로, 그것의 3' 말단에 무작위 dN 염기가 결여된 5'어댑터 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있고(도 9c), 이중 가닥의 DNA 기질 분자의 말단에 부착된 3'-어댑터에 결합한 후에 단일의 염기 갭을 형성한다. 상기 갭은 가닥-치환 활성이 결여된 DNA 폴리머라아제(예를 들면 T7 또는 T4 DNA 폴리머라아제)로 필-인되어, 결과적으로 DNA 기질 분자의 상기 5' 말단에 상기 5'어댑터의 공유 부착을 야기하는 DNA 리가아제에 의해 시일링될 수 있는 틈을 생성한다.
다른 대안에 있어서(도 9b 및도 9d 참조), 블로킹된 3' 말단을 포함하는 올리고뉴클레오티드 2는 DNA의 5' 말단으로부터의 단일 염기의 절제를 야기하는 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제에 의해 단일 디데옥시-염기를 이용하여 신장되는 프라이머 올리고뉴클레오티드에 의해 부분적으로 분해되거나 치환된다. 프라이머 올리고뉴클레오티드는 결과적으로 그것의 3' 말단에 무작위 dN 염기를 이용하여 상기 5' 어댑터에 의해 분해되거나 치환되어 DNA 리가아제에 의해 시일링될 수 있는 틈을 생성한다.
(III) 상기 5' 어댑터의 결찰
기질 분자로의 상기 5' 어댑터의 공유 부착은 기질 분자의 상기 5' 어댑터 또는 그것의 신장 생산물과 노출된 5' 포스페이트 사이의 결찰을 포함한다. DNA 기질 분자의 상기 5' 염기(들)의 절제는 틈-번역 반응에 의해 달성되고, 상기 결찰 반응은 폴리머라아제-신장된 5' 어댑터 및 DNA 기질 분자의 절제된 5' 말단 사이의 틈을 시일링한다. DNA 기질 분자의 상기 5' 염기의 절제는 치환-절단 반응에 의해 달성되고, 상기 결찰은 DNA 기질 분자의 원래의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드와 절제된 5' 말단 사이에 발생된다. 이 스텝에 있어서의 결찰 반응에 대한 표준 조건은 각종 실시형태에 있어서, DNA에 있어서의 틈 및 갭을 시일링할 수 있는 임의의 DNA 리가아제의 사용을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 리가아제는 E. coli 유래 DNA 리가아제이고, 상기 반응은 10℃~50℃의 온도 구간에서 발생된다. 일부 실시형태에 있어서, 리가아제는 TAQ DNA 리가아제, 또는 앰플리가아제 등의 열에 안정한 DNA 리가아제이고, 상기 반응은 30℃ 및 75℃의 온도 구간에서 발생된다.
현재 발명의 각종 양태에 있어서, 상기 5' 어댑터 결찰 단계의 3가지 단계 (I), (II) 및 (III)은 (i) 임의의 분해 엔도뉴클레아제(예를 들면, UDG, 엔도뉴클레아제 V, RN아제 H, 또는 그들의 조합), (ii) 틈-번역 DNA 폴리머라아제 또는 5'-플랩 엔도뉴클레아제, 및 (iii) DNA 리가아제(도 6 참조)를 이용하여 3'-수용 기질 DNA를 혼합 및 배양함으로써 단일 배양에서 동시에 행해진다. 상기 배양은 일정한 온도에서 실시되고, 10℃-75℃의 구간에서의 온도 순환 조건을 이용한다. 다른 응용에 있어서, 3' 어댑터 부분 분해는 하위 반응과 별도로 행해진다.
NGS 라이브러리의 구조체
일루미나 NGS 라이브러리의 합성은 본 개시된 방법을 이용하여 행해질 수 있다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 일루미나 라이브러리는 틈 번역 결찰 방법(왼쪽) 또는 치환 절단 결찰 방법(오른쪽) 중 어느 하나를 이용하여 구축될 수 있다. 2의 일루미나 어댑터의 부착의 순서는 유동적이며, 도 10a에 있어서 일루미나 어댑터 P7은 3' 어댑터이고, 일루미나 어댑터 P5는 5' 어댑터이며, 반면에 10b에 있어서, 일루미나 어댑터 P5는 3' 어댑터이고, 일루미나 어댑터 P7은 5' 어댑터이다. 도 10에 도시된 라이브러리는 주입 기질 DNA의 양에 따라서 PCR하지 않고 구축될 수 있거나 PCR 증폭될 수 있다. 대안적으로, 일루미나 NGS 라이브러리의 합성은 상기 방법이 절삭된 어댑터 서열을 이용하기 때문에(도 11 참조), PCR 증폭이 요구되는 상기 개시된 방법을 이용하여 행해질 수 있다. 이 경우에 있어서, P5 또는 P7 중 어느 하나는 절삭된 어댑터로서 도입되고(P7만 도시됨), 전체-길이 어댑터 서열을 도입할뿐만 아니라 그것의 5' 말단에서의 분해 가능한 염기를 포함하는 PCR 프라이머를 이용한 증폭 후, 얻어진 앰플리콘의 상기 5' 부위의 분해 후, P7 또는 P5 중 어느 하나는 어닐링 및 결찰에 의해 도입될 수 있다. 대안적으로 절삭된 분해 가능한 프라이머가 PCR 증폭에 사용되는 경우, 어댑터의 잔사의 브릿지-결찰은 전체-길이 서열을 완료하기 위해 행해질 수 있다.
개시된 방법은 다양한 서열화 플랫폼에 대한 NGS 라이브러리를 구조체하기 위해 사용될 수 있고, 또 다른 실시예는 이온-토렌트 라이브러리 구조체 이 도시되어 있는 도 12 및 도 13에 나타낸다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 삽입 정션 부위에서 P1 어댑터 상에서의 A 어댑터 서열의 부분 복제를 도입함으로써, 3' 어댑터 결찰 후의 5' 어댑터의 후속 어닐링이 발생될 수 있다. 결찰의 순서는 유동적이고, 어댑터 A의 부분 복제를 갖는 어댑터 P1은 3' 어댑터와 같이 도입되고, 그 다음에 틈 번역 또는 치환 절단 중 어느 하나를 이용하여 어댑터 A의 결찰이 5' 어댑터와 같이 도입될 수 있다(도 12a). 대안적으로, 어댑터 A는 3' 어댑터와 같이 도입될 수 있고, 어댑터 A의 부분 복제를 갖는 어댑터 P1은 5' 어댑터일 수 있다(도 12b). 이온-토렌트 서열화는 P1 어댑터 상의 어댑터 A의 부분 복제의 길이로 인해 A 어댑터로부터 단일 리드으로 해서 행해지기 때문에, 서열화 프라이머 어닐링 또는 기타 어댑터 기능에 간섭하지 않는다.
대안적으로, 도 13에 있어서 조합된 바코딩은 상기 개시된 방법을 이용하여 이온-토렌트 라이브러리에 도입될 수 있다. 3' 어댑터 결찰 단계시에, 모두 20의 바코드에 공통되는 링커 영역 L에 인접한 듀얼 조합의 바코드의 제 1 부위가 도입된다. DNA 기질에 결찰되지 않은 3' 블로킹된 가닥의 분해 후, 5' 어댑터는 링커 영역 L에 인접한 듀얼 바코드 5'의 제 2 부분을 포함하는 공통의 링커 영역 L에 어닐링된다. 틈 번역 결찰에 이어서, 얻어진 라이브러리는 표준 이온-토렌트 PCR 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 라이브러리 분자가 상기 A 어댑터 쪽으로부터 서열화될 때에, 각각의 이온 스피어의 샘플 식별은 리드의 시작시에 리드되고, 96의 가능성 있는 조합이 달성될 수 있다.
표적으로 선별된 NGS 라이브러리에 대한 응용
상기 개시된 방법은 전체 게놈 서열화에 대한 복잡성 및 서열화 요구사항을 감소시키는 방식으로 특정 표적이 선택되고 풍부화되는 NGS 라이브러리를 구조체하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 응용의 예는 무작위로 단편화되고, 변성되고, 프라이머에 의해 신장된 DNA 기질로의 3' 어댑터 및 5' 어댑터의 부착일 수 있고, 프라이머 또는 복수의 프라이머는 공지된 표적 DNA 영역에 어닐링된다. 이 경우에 있어서, 단지 표적 좌위는 이중 가닥의 말단을 포함할 수 있고, 비선택 좌위는 단일 가닥으로 잔존하여 어댑터 결찰이 그들의 말단 상에서 발생될 수 없다.
다른 응용에 있어서, 현재의 발명의 5' 어댑터는 공지된 말단의 서열을 갖는 작은 DNA 단편을 선택 및 풍부화하기 위해 사용될 수 있다. 프리-선별된 DNA 서열은 1개, 2개, 3개 이상의 말단의 DNA 염기를 함유할 수 있다. 이러한 선택을 달성하기 위하여, 상기 5' 어댑터 서열은 3' 말단 에 선별된 침입 염기 또는 염기 조합을 함유할 수 있다. 결과적으로, 선별된 말단의 서열을 갖는 DNA 단편만이 5' 어댑터에 결찰되고 증폭될 수 있다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 선별된 제한 단편의 말단의 서열과 상보하는 3' 말단을 갖는 5' 어댑터의 사용은 복수의 제한 단편으로부터 제한 단편 표적을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단을 갖는 5' 어댑터의 사용은 CpG 섬으로부터 기원한 단편에 대해 풍부화할 수 있다.
대안적으로, 개시된 방법을 이용한 표적 선택은 다음의 라이브러리 구조체를 행할 수 있다(도 15 참조). 이러한 라이브러리가 하나의 어댑터가 그것의 5' 말단에서 분해 가능한 염기를 포함하는 것을 구축하면, 표적-특이적 프라이머 신장 및 어댑터의 분해 가능한 부분의 부분 분해에 이어서, 바이오티닐화된 5' 어댑터가 얻어진 3' 오버행에 어닐링될 수 있고, 틈 번역 결찰(도 15a) 또는 치환 절단 결찰(도 15b) 중 어느 하나를 이용하여 바이오티닐화된 5' 어댑터가 단지 표적 DNA 기질에만 공유 부착될 수 있고, 계속해서 스트렙타아비딘 자기장 비드를 이용하여 포획될 수 있고, 이어서 서열화를 위해 충분한 재료를 생성하도록 PCR 증폭될 수 있다.
대안적인 어댑터 설계 및 응용
또한, 개시된 방법을 이용한 몇몇 대안적인 어댑터 설계 및 결찰 방법을 나타낸다. 도 16에 있어서, 라이브러리는 어댑터 서열의 쌍 대신에 단일 어댑터 서열을 이용하여 구조체된다. 이 실시예에 있어서, 동일한 단계가 결찰 및 3' 어댑터 결찰 및 상기 5' 어댑터의 틈 번역 결찰 또는 배치 절단 결찰 중 어느 하나 양쪽 전에 기질 프로세싱에 사용되고, 얻어진 라이브러리는 단일 프라이머를 이용하여 PCR 증폭될 수 있다.
도 17에 있어서, 단일의 올리고뉴클레오티드 헤어핀 어댑터의 결찰을 위한 방법은, 헤어핀 어댑터의 상기 5' 말단이 기질 분자에의 3' 어댑터 결찰을 행하기 위해 사용되고, 상기 헤어핀 어댑터의 블로킹된 3' 말단의 분해에 이어서 헤어핀 어댑터의 절삭된 3' 말단이 기질 분자의 노출된 5' 포스페이트에의 틈 번역 결찰에 사용된다.
그것은 메이트-쌍 NGS 라이브러리의 구조체을 위한 중간체 구조 등의 순환 DNA 라이브러리를 생성하는데 유용한 경우가 있다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 이러한 라이브러리는 상기 발명의 방법을 이용하여 구축될 수 있다. 제 1 단계에 있어서, 3' 어댑터 결찰은 서로 상보하는 어댑터 X 및 X'를 이용하여 행해진다. 비결찰된 가닥의 분해에 이어서, 비공유 DNA 순환은 각각의 기질 분자 상에서의 3' 오버행 X 및 X'의 상보성에 의해 발생될 수 있다. 단분자 어닐링을 지향하고, 연쇄체 형성을 감소시키기 위해, 이 어닐링 반응은 적절히 낮은 DNA 농도에서 행해진다. 3' 오버행 어닐링에 이어서 틈 번역 결찰이 행해질 수 있다.
효소
상기 방법을 실행하기 위해 표준 반응 조건에 따라 사용될 수 있는 리가아제는 T4 DNA 리가아제, T4 RNA 리가아제, T3 DNA 리가아제 또는 T7 DNA 리가아제, TAQ DNA 리가아제, 앰플리가아제, E. coli DNA 리가아제 및 E. coli RNA 리가아제를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 상기 발명은, 각종 실시형태에 있어서, 블런트 말단 또는 응집성의 ("점성") 말단 결찰에 적합한 반응 조건을 간주한다. 상기 응집성의 말단은 일부 실시형태에 있어서 5' 오버행 또는 3' 오버행 중 어느 하나를 포함한다.
5' 또는 3' 포스페이트를 제거하기 위한 상기 발명의 방법에 유용한 효소의 예로는 송아지 소장 유래의 알칼리 포스파타아제, 박테리아 유래의 알칼리 포스파타아제, 새우 유래의 알칼리 포스파타아제, 극지생물 유래의 포스파타아제, 및 태반 유래의 알칼리 포스파타아제 등의 임의의 포스파타아제 효소를 포함하지만, 이들에 한정되지 않고, 각각 표준 조건에 따라서 사용된다. 추가적으로, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제의 포스파타아제 활성은 3' 포스페이트기를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 실행에 유용한 폴리머라아제 효소는 DNA 폴리머라아제(열안정성 DNA 폴리머라아제, 예를 들면 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함할 수 있는), RNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 I 및 역전사 효소를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명을 실행하기 위해 사용될 수 있는 효소의 비제한적 실시예는 카파 하이파이 및 카파 하이파이 우라실+, 베라식 울트라 DNA 폴리머라아제, 베라식 2.0 고충실도 DNA 폴리머라아제, Takara PrimeSTAR DNA 폴리머라아제, 애질런트 Pfu Turbo CX 폴리머라아제, Phusion U DNA 폴리머라아제, Deep VentR™ DNA 폴리머라아제, LongAmp™ TAQ DNA 폴리머라아제, Phusion™ 고충실도 DNA 폴리머라아제, Phusion™ 핫 스타트 고충실도 DNA 폴리머라아제, 카파 고충실도 DNA 폴리머라아제, Q5 고충실도 DNA 폴리머라아제, 플래티넘 Pfx 고충실도 폴리머라아제, Pfu 고충실도 DNA 폴리머라아제, Pfu 울트라 고충실도 DNA 폴리머라아제, KOD 고충실도 DNA 폴리머라아제, 아이프루프 고충실도 폴리머라아제, 고충실도 2 DNA 폴리머라아제, 베로시티 고충실도 DNA 폴리머라아제, 프루프스타트 고충실도 DNA 폴리머라아제, Tigo 고충실도 DNA 폴리머라아제, 아큐자임 고충실도 DNA 폴리머라아제, VentR® DNA 폴리머라아제, DyNAzyme™ II 핫 스타트 DNA 폴리머라아제, Phire™ 핫 스타트 DNA 폴리머라아제, Phusion™ 핫 스타트 고충실도 DNA 폴리머라아제, Crimson LongAmp™ TAQ DNA 폴리머라아제, DyNAzyme™ EXT DNA 폴리머라아제, LongAmp™ TAQ DNA 폴리머라아제, Phusion™ 고충실도 DNA 폴리머라아제, 표준 TAQ(Mg 없음) 버퍼를 갖는 TAQ DNA 폴리머라아제, 표준 TAQ 버퍼를 갖는 TAQ DNA 폴리머라아제, ThermoPol II(Mg 없음) 버퍼를 갖는 TAQ DNA 폴리머라아제, ThermoPol 버퍼를 갖는 TAQ DNA 폴리머라아제, Crimson TAQ™ DNA 폴리머라아제, (Mg 없음) 버퍼를 갖는 Crimson TAQ™ DNA 폴리머라아제, Phire™ 핫 스타트 DNA 폴리머라아제, VentR®(엑소-) DNA 폴리머라아제, Hemo KlenTAQ™, Deep VentR™(엑소-) DNA 폴리머라아제, Deep VentR™ DNA 폴리머라아제, DyNAzyme™ EXT DNA 폴리머라아제, Hemo KlenTAQ™, LongAmp™ TAQ DNA 폴리머라아제, ProtoScript® AMV First 표준 cDNA 합성 키트, ProtoScript® M-MμlV 제 1 표준 cDNA 합성 키트, BST DNA 폴리머라아제, 전체 길이, BST DNA 폴리머라아제, 큰 단편, 9°Nm DNA 폴리머라아제, DyNAzyme™ II 핫 스타트 DNA 폴리머라아제, Hemo KlenTAQ™, Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV, Therminator™ γ DNA 폴리머라아제, Therminator™ DNA 폴리머라아제, Therminator™ II DNA 폴리머라아제, Therminator™ III DNA 폴리머라아제, Bsu DNA 폴리머라아제, 큰 단편, DNA 폴리머라아제 I(E. coli), DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편, 클레나우 단편(3'→5' 엑소-), phi29 DNA 폴리머라아제, T4 DNA 폴리머라아제, T7 DNA 폴리머라아제(비수식됨), 말단의 전사 효소, 역전사 효소 및 RNA 폴리머라아제, E. coli 폴리(A) 폴리머라아제, AMV 역전사 효소, M-MμlV 역전사 효소, phi6 RNA 폴리머라아제(RdRP), 폴리(U) 폴리머라아제, SP6 RNA 폴리머라아제, 및 T7 RNA 폴리머라아제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기 개시에 유용한 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 플랩 엔도뉴클레아제 1(FEN1), T5 엑소뉴클레아제, TAQ DNA 폴리머라아제, BST 폴리머라아제, TTH 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 I 및 그들의 유도체를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
실시예
실시예 1
FAM-표지된 올리고뉴클레오티드를 갖는 3' 어댑터 결찰과 종래의 어댑터 결찰의 비교
이론적 설명: 결찰 효율 및 키메라 형성에 대한 효과를 조사하기 위해, FAM-표지된 올리고뉴클레오티드계를 이용하여, 필-인 어댑터(도 2A) 또는 3' 어댑터(도 3)를 이용한 블런트 결찰이 기질과 어댑터의 상이한 몰비로 시험되었다.
재료:
필-인 어댑터는 올리고뉴클레오티드 12-900 및 13-426을 함유한다(표 1)
· 3'어댑터; 제 1 올리고뉴클레오티드 13-340(표 1)
· 3'어댑터; 제 2 올리고뉴클레오티드 선택 1(3' 말단에 블로킹 3' 데옥시티미딘 염기를 가짐) 13-559(표 1)
· 3'어댑터; 제 2 올리고뉴클레오티드 선택 2(3' 말단에 포스페이트기를 가짐) 13-558(표 1)
· FAM 기질 A가 기질의 상기 5' 포스페이트에의 결찰을 표지하는 올리고뉴클레오티드 13-562 및 13-563로 구성된 FAM 기질 A(표 1)
· FAM기가 기질의 3' OH에의 결찰을 표지하고, 기질의 대응하는 5' 말단이 포스페이트를 갖는 올리고뉴클레오티드 13-561 및 13-564로 구성된 FAM 기질 B(표 1)
· FAM기가 기질의 3' OH에의 결찰을 표지하고, 기질의 대응하는 5' 말단은 포스페이트가 결여된 올리고뉴클레오티드 13-560 및 13-564로 구성된 FAM 기질 C(표 1)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
방법:
종래의 어댑터 결찰 반응은 1x T4 DNA 리가아제 버퍼, 10피코몰의 FAM 기질 A, 20 또는 200피코몰의 필-인 어댑터, 600유닛 T4 DNA 리가아제(급속) 또는 리가아제를 포함하지 않은 총 체적 10μl로 조합되었다.
3' 어댑터 결찰 반응액은 1x T4 DNA 리가아제 버퍼, 10피코몰의 FAM 기질 B 또는 10피코몰의 FAM 기질 C, 20 또는 200피코몰의 3'어댑터 선택 1 또는 20 또는 200피코몰의 3' 어댑터 선택 2 및 600유닛 T4 DNA 리가아제(급속) 또는 T4 DNA 리가아제를 함유하지 않는 총 체적 10μl로 조합되었다.
결찰 반응은 모두 25℃에서 30분 동안 행해졌다. 총 결찰 반응 체적(10μl)은 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀) 10μl와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아 상에 실행되고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다. 계속해서, 상기 겔은 SYBR® Gold 핵산 겔 염색제(Invitrogen, 제품번호 S11494)로 염색된다(도시하지 않음).
결과:
FAM 기질 A는 필-인 어댑터 및 T4 DNA 리가아제의 존재 하에서 결찰 생산물로 전환된다(도 19, 레인 1-2). 이 종래의 어댑터 결찰은 단지 2:1의 어댑터:기질의 비(도 19, 레인 1)가 20:1(레인 2)의 비와 비교해서 사용된 경우의 일부 FAM 기질 A 키메라 형성을 나타낸다. 어떠한 결찰 생산물도 T4 DNA 리가아제(도 19, 레인 3)의 부재 하에서 관찰되지 않았다.
3' 어댑터 결찰의 상이한 시나리오는 레인 4-12(도 19)에서 시험되었다. 레인 4 및 5는 FAM 기질 B 및 3' 어댑터 선택 1 사이의 결찰 반응을 나타낸다. 2:1(레인 4) 또는 20:1(레인 5)의 어댑터:기질 비에서, 3' 어댑터를 포함해도 포함하지 않아도 더욱 고분자량의 키메라 생산물이 형성된다. 그러나, 결찰 생산물은 20:1의 어댑터:기질(레인 5)의 비에서 더욱 풍부하고, 그것의 형성이 선호되었다. 레인 6 및 7은 FAM 기질 C와 3' 어댑터 선택 1 사이의 결찰 반응액을 나타낸다. 상기 반응은 20:1의 어댑터:기질(레인 7)에서 선호되고, 어떠한 키메라 생산물도 관찰되지 않았다. 레인 8 및 9는 FAM 기질 B와 3' 어댑터 선택 2 사이의 결찰 반응액을 나타낸다. 어떠한 결찰 생산물도 관찰되지 않았지만, 키메라 생산물이 검출되었다. 레인 10 및 11은 FAM 기질 C와 3' 어댑터 선택 2 사이의 결찰 반응액을 나타낸다. 어떠한 결찰 생산물도 관찰되지 않았다. 어떠한 결찰 생산물도 T4 DNA 리가아제(레인 12)의 부재 하에서 관찰되지 않았다.
결론:
종래의 어댑터 결찰은 필-인 어댑터가 과잉으로 존재하지 않는 경우에 키메라의 형성으로 이어지는 FAM 기질 상에서의 5'-포스페이트를 필요로 한다. 3' 어댑터의 결찰은 FAM 기질이 5'히드록시기를 갖고, 3' 어댑터가 어댑터 분자 사이의 결찰을 방지하고, 기질과 어댑터 사이의 결찰을 선호하는 블로킹 3-데옥시티미딘 염기(선택 1)을 가질 때에 보다 효율적이고 더 적은 키메라를 갖는다. 양쪽의 경우에 있어서, 20: 1의 어댑터: 기질의 비는 결찰 생산물 형성에 선호되었다.
실시예 2
전단된, 크기 선별된 유전체 DNA와 종래의 어댑터 결찰의 비교
이론적 설명
이 실험은 종래의 또는 3' 어댑터 결찰의 효율성에 대한 물리적으로 전단된 유전체 DNA의 폴리싱의 효과를 시험하기 위해 행해졌다.
재료:
· 필-인 어댑터는 올리고뉴클레오티드 13-489 및 13-426(표 1)을 함유한다.
· 3'어댑터; 제 1 올리고뉴클레오티드 13-340(표 1) 및 제 2 올리고뉴클레오티드 선택 1(3' 말단에 블로킹3' 데옥시티미딘 염기를 함유함) 13-559(표 1)
· NE 버퍼 2(New England Biolabs, 제품번호 B7002S)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)(New England Biolabs, 제품번호 P0756S)
· DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편(New England Biolabs, 제품번호 M0210S)
· T4 DNA 폴리머라아제(New England Biolabs, 제품번호 M0203S)
· T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(New England Biolabs, 제품번호 M0201S)
· 엑소뉴클레아제 III(E. coli)(New England Biolabs, 제품번호 M0293S)
· 극지생물 유래 포스파타아제(New England Biolabs, 제품번호 M0289S)
· 극지생물 유래 포스파타아제 반응 버퍼(New England Biolabs, 제품번호 B0289S)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· E. coli 유전체 DNA ATCC 11303 염색제(Affymetrix, 제품번호 14380)
· M220 초점형-초음파파쇄기(Covaris, 제품번호 PN 500295)
· 피핀 추출(Sage Science)
· CDF2010 2% 아가로오스, 염료 자유 w/내부 표준(Sage Science)
· DNA 클린 & 농축기-5(Zymo research, 제품번호 D4004)
· 25bp 래더 DNA 크기 마커(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10488-022)
방법:
E. coli 유전체(gDNA)는 100ng/μl의 농도에서 DNA 현탁 버퍼(Teknova, 제품번호 T0227)에서 재현탁하였다. DNA는 M220 초점형-초음파파쇄기에 의해 150 염기 쌍의 평균 크기로 단편화되었다. 계속해서, 대략 150bp~대략 185bp의 단편화된 DNA의 엄격한 크기 분포는 피핀 추출을 이용하여 2% 아가로오스 겔 상에서 분리하였다.
200ng의 크기-선별된 DNA가 다른 효소의 활성에 실시되었다. 상기 반응은 1x NE 버퍼 2,100μM의 각각의 dNTP, 3유닛 T4 DNA 폴리머라아제 또는 5유닛 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편 또는 3유닛 T4 DNA 폴리머라아제 및 5유닛 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편 또는 3유닛 T4 DNA 폴리머라아제 및 5유닛 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편 및 1유닛의 엑소뉴클레아제 III의 최종 농도를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 또 다른 반응은 1x NE 버퍼 2, 1mM ATP, 10유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제의 최종 농도를 포함하는 30μl의 총 체적으로 조합되었다. 또 다른 반응은 최종 농도 1x 극지생물 유래 포스파타아제 반응 버퍼 및 5유닛의 극지생물 유래 포스파타아제를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 제어 반응은 1x NE 버퍼 2와 200ng의 상기 크기-선별된 DNA를 조합하였다. 반응은 모두 37℃에서 30분 동안 배양되고, DNA는 DNA 클린 & 농축기-5 컬럼을 이용하여 정제되었다. DNA는 30μl의 DNA 현탁 버퍼에서 용출되었고, 후속의 종래의 어댑터 결찰 또는 3' 어댑터 결찰을 위해 2의 15μl 튜브에 분배하였다. 종래의 어댑터 결찰은 1x T4 DNA 리가아제 버퍼, 올리고뉴클레오티드 13-489(220피코몰) 및 13-426(440피코몰)을 함유하는 필-인 어댑터, 및 T4 DNA 리가아제(급속)의 1200유닛을 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 3' 어댑터 결찰 반응액은 1x T4 DNA 리가아제 버퍼, 220피코몰의 3' 어댑터 제 1 올리고뉴클레오티드, 440피코몰의 3'어댑터 제 2 올리고뉴클레오티드 및 1200유닛 T4 DNA 리가아제(급속)를 함유하는 총 체적 30μl로 조합하였다. 모든 반응은 DNA 클린 & 농축기-5-컬럼을 이용하여 정제되었다. 상기 DNA는 10μl의 DNA 현탁 버퍼로 재현탁되었고, 10μl의 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀)와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 6% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되었다. 상기 겔은 SYBR® Gold 핵산 겔 염색제(Invitrogen, 제품번호 S11494)로 염색되고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다.
결과:
전단된 DNA 기질 상에 5' 포스페이트를 필요로 하는 종래의 어댑터 결찰 반응액(도 20, 상부 패널)은 3' 어댑터 결찰보다 낮은 효율성을 나타낸다(도 20, 하부 패널). 결찰 반응액은 양쪽 유형의 결찰을 위해 단독으로 또는 클레나우(레인 7) 또는 클레나우+엑소뉴클레아제 III(레인 8)와 조합하여 T4 DNA 폴리머라아제로 DNA를 처리한 후에 보다 효율적이었다. 클레나우, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 또는 극지생물 유래 포스파타아제 단독의 처리는 비처리된 DNA(레인 2)와 비교해서 블런트 결찰을 적당히 향상시켰다. 좁은 범위 분포의 단편화된 DNA는 레인 9 상에 로딩되었다.
결론:
전단된 DNA에의 블런트 어댑터의 결찰은 이 DNA의 폴리싱에 따라서 매우 다르다. 강한 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및 5'-3' 폴리머라아제 활성을 나타내는 T4 DNA 폴리머라아제와 같은 DNA 폴리머라아제는 이 목적에 매우 적합하다. 종래의 어댑터 결찰 반응은 기질의 블런트 말단 상에서의 고유의 5' 포스페이트 기질의 존재에 따라서 다르다. 그러나, 3' 어댑터의 결찰은, 상기 결찰이 단편화된 DNA의 3' 히드록실 말단에서 발생되기 때문에 일어나지 않는다. 전단된 DNA의 상기 5' 말단가 T4 DNA 폴리머라아제의 효소적 기질이 아니기 때문에, 이것은 3' 어댑터가 필-인 어댑터(레인 3)보다 성공적으로 결찰되는 이유를 설명한다. T4 DNA 폴리머라아제+클레나우 및 엑소뉴클레아제 III의 조합은 블런트 결찰을 향상시킨다. 블런트 말단을 생성하는 엑소뉴클레아제 III 활성은 DNA의 3' 말단에서 손상될 수 있는 3' 히드록실 말단을 제거함으로써 블런트 어댑터의 결찰을 위해 요구된다. 또한, 엑소뉴클레아제 III은 3' 말단을 DNA 폴리머라아제 폴리싱 활성에 접근시킬 수 있는 3' 포스파타아제 활성을 갖는다.
실시예 3
FAM-표지된 올리고뉴클레오티드 기질을 이용한 5' 어댑터 결찰을 위한 온도 최적화
이론적 설명: 이 실험은 틈 번역 매의 5' 어댑터 결찰에 있어서의 온도 의존성 및 dNTP 조성물을 평가한다.
재료:
· 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-144)(표 1)
· FAM 올리고뉴클레오티드 기질(13-581)(표 1)
· 올리고뉴클레오티드 주형(13-582)(표 1)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· E. coli DNA 리가아제(New England BioLabs, 제품번호 M0205S)
· 10x E. coli DNA 리가아제 반응 버퍼(New England BioLabs)
· 25U/μl 농도의TAQ DNA 폴리머라아제, (Genscript, 제품번호 E00012)
· 25bp 래더 DNA 크기 마커(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10488-022)
방법:
틈 번역 반응액의 제 1 세트는 최종 농도 1x E. coli DNA 리가아제 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 틈-번역을 위한 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 45피코몰 올리고뉴클레오티드 주형, 200μM의 dTTP 또는 each dTTP/dGTP의 200uM 또는 각각의 dATP/dTTP/dGTP의 200uM의 혼합, 및 2.5유닛의 TAQ DNA 폴리머라아제 또는 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함하지 않는 총 체적 30μl로 조합되었다. 상기 반응은 30℃, 40℃ 또는 50℃에서 30분 동안 배양되었다.
틈 번역 반응의 제 2 세트 다음의 결찰은 최종 농도 1x E. coli DNA 리가아제 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 틈-번역을 위한 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드와 45피코몰의 올리고뉴클레오티드 주형, 200uM의 각각의 dATP/dTTP/dGTP, 및 2.5유닛의 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함하는 30μl로 조합되었다. 상기 반응은 50℃, 53℃, 56℃ 또는 60℃에서 30분 동안 배양되었다. 그들 반응액 10μl는 겔 분석을 위해 취해졌다. 10유닛의 E. coli 리가아제는 남아있는 20μl에 첨가되었다. 추가적인 제어 반응은 최종 농도 1x E. coli DNA 리가아제 버퍼 및 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질을 포함하는 30μl로 조합되었다. 그들 반응액 10μl는 10μl의 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀)와 혼합되고, 95℃에서 5분 동안 가열되고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영된다.
결과:
도 21, 패널 A에 나타낸 바와 같이, TAQ DNA 폴리머라아제는 그것의 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성에 의해 FAM 올리고뉴클레오티드 기질 상에서 뉴클레오티드를 제거하는 틈-번역을 위한 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 히드록실 말단을 신장시킨다. dTTP(도 21, 레인 2, 5, 8, 패널 A)만 첨가하는 것은 틈-번역을 위한 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 하나의 염기만을 첨가하는 것을 가능하게 하고, dTTP/dGTP(도 21, 레인 3, 6, 9, 패널 A)를 첨가하는 것은 3의 염기의 첨가를 가능하게 하고, 또한 dTTP/dGTP/dATP(도 21, 레인 4, 7, 10, 패널 A)를 첨가하는 것은 FAM 올리고뉴클레오티드 기질(Fig,21, 패널 A)로부터 절단되는 염기의 수에 비례하는 4의 염기의 첨가를 가능하게 한다. 또한, FAM 올리고뉴클레오티드 기질로부터 절단되는 염기의 수는 반응이 일어나는 온도에 따라 다르다. 50℃(도 21, 레인 2-4, 패널 A)에서, FAM 올리고뉴클레오티드 기질로부터 절단되는 염기의 양은 40℃ 또는 30℃에서 절단되는 것보다 많다. 또한, 틈 번역의 효율성 및 절단되는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 양은 반응의 온도에 따라 매우 달랐다. 40℃ 또는 30℃에서, dTTP만(도 21, 레인 5, 8, 패널 A)을 첨가하는 것은 50℃(도 21, 레인 2, 패널 A)에서 관찰된 바와 같이, FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 임의의 절단을 가능하게 하지 않는다. dTTP/dGTP 또는 dTTP/dGTP/dATP를 첨가하는 것은 50℃(레인 3 및 4)에서보다 더욱 낮은 효율성으로 40℃(레인 6 및 7) 또는 30℃(레인 9 및 10)에서의 일부 절단을 가능하게 한다. 레인 1(도 21, 패널 A)은 TAQ DNA 폴리머라아제의 부재 하에서의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질을 나타낸다.
틈 번역의 효율성 및 절단되는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 양은 반응의 온도에 따라서 매우 다르다. 60℃에서, FAM 올리고뉴클레오티드 기질은 더욱 작은 종(도 21, 레인 4, 패널 B)에 거의 전체적으로 처리되었다. FAM 올리고뉴클레오티드 기질 절단 생산물 크기는 증가되는 반응의 온도(도 21, 레인 1-4, 패널 B)에 따라서 감소된다. 레인 5(도 21, 패널 B)는 TAQ DNA 폴리머라아제의 부재 하에서의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질을 나타낸다. 틈 번역 반응시에, TAQ DNA 폴리머라아제는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 5' 말단을 절단하고, E. coli 리가아제가 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단에 공유 부착하는데 필수적인 말단의 5' 포스페이트를 생성한다. 또한, 결찰 효율성은 반응이 일어나는 온도에 따라서 달랐다. 결찰 생산물은 50℃(레인 6)에서 보다 풍부하고, 60℃(레인 9)에서는 거의 존재하지 않았으며, 결찰 생산물의 중간체 양은 53℃ 및 56℃에서 생성되었다.
결론:
틈 번역시에, FAM 올리고뉴클레오티드 기질로부터 절단된 염기의 수는 반응에서 도입된 상보하는 dNTP 및 반응이 일어나는 온도에 따라서 달라졌다. 틈 번역 반응 시에, TAQ DNA 폴리머라아제는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단을 절단하고, E. coli 리가아제가 2의 단편을 결찰하는데 필수적인 말단의 5' 포스페이트를 생성한다. 고온에서 틈 번역에 의해 절단되는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질은 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 5' 말단 사이에 형성되는 잠재적인 갭 때문에 E. coli 리가아제에 의한 결찰에는 열악한 기질이었다.
실시예 4
5' 어댑터 결찰에 미치는 dNTP 조성물 효과의 분석
이론적 설명: 본 실험은 다양한 dNTP 조성물의 존재 하에서 발생되는 틈-번역의 정도 및 연결된 결찰 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 행해졌다.
재료:
· 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-144)(표 1)
· FAM 올리고뉴클레오티드 기질(13-581)(표 1)
· 올리고뉴클레오티드 주형(13-582)(표 1)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· 25bp 래더 DNA 크기 마커(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10488-022)
· E. coli DNA 리가아제(Enzymatics, 제품번호 L6090L)
· 10x E. coli DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6090)
· TAQ-B DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7250L)
방법:
반응액은 최종 농도 1x E. coli DNA 리가아제 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 틈-번역을 위한 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드와 45피코몰의 올리고뉴클레오티드 주형, 200μM의 각각의 dNTP 또는 dCTP, dTTP, dGTP 또는 dATP, dTTP, dGTP 또는 dATP, dCTP, dGTP 또는 dATP, dTTP, dCTP 또는 no dNTP 각각의 200μM의 믹스, 10유닛의 E. coli 리가아제 및 10유닛의 TAQ-B DNA 폴리머라아제를 포함하는 30μl의 총 체적으로 조합되었다. 반응액은 모두 40℃dptj 30분 동안 배양되었다. 그들 반응액 10μl는 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀) 10μl과 혼합되고, 95℃에서 5분 동안 가열되고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되고, 디지털 카메라(하부 패널)를 이용하여 촬영되었다. 계속해서, 상기 겔은 SYBR® Gold 핵산 겔 염색제(Invitrogen, 제품번호 S11494)으로 염색되고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되고, 디지털 카메라(상부 패널)를 이용하여 촬영되었다.
결과:
도 22의 처음 2의 레인은 대조군의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. TAQ-B DNA 폴리머라아제의 부재 하에서, E. coli 리가아제 단독은 FAM 기질이 5' 포스페이트 modification(도 22, 레인 3)를 결여시키기 때문에 FAM 올리고뉴클레오티드 기질에 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드를 결찰할 수 없다. TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 4 dNTP의 존재 하에서, 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드는 신장되고, 58의 염기의 새로운 생산물 및 FAM 올리고뉴클레오티드 기질을 형성하는 것은 TAQ-B DNA 폴리머라아제(도 22, 레인 4)의 상기 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성에 의해 치환되고 분해되었다. E. coli 리가아제, TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 dATP/dTTP/dGTP(도 22, 레인 7) 또는 dCTP/dTTP/dGTP(도 22, 레인 6) 또는 dATP/dTTP/dCTP(도 22, 레인 9)의 존재 하에서, 틈 번역은 각각 4개, 3개 또는 1의 염기의 첨가로 제한된다. 상기 5' 어댑터의 신장에 의해, 플랩이 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단에 형성되었다. 이 플랩은 결찰을 위해 필요한 5' 포스페이트을 생성하는 TAQ-B 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 위한 기질이 된다. 상기 5' 어댑터는 69의 염기의 생산물을 형성하는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질에 결찰되었다. 3개 또는 4의 염기(도 22, 레인 6 및 7)의 플랩은 하나의 염기 플랩(도 22, 레인 9)보다 효율적인 결찰을 지지한다. E. coli 리가아제, TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 dATP/dCTP/dGTP(도 22, 레인 8)의 존재 하에서, 결찰 생산물에 대응하는 희미한 밴드가 관찰되었다. 약한 결찰 활성은 일부 FAM 올리고뉴클레오티드 기질 상에서의 플램의 형성으로 이어지는 "비매칭된" 염기(T 대신에 A, C 또는 G)의 포함으로부터 유래될 수 있다. E. coli 리가아제, TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 dNTP의 존재 하에서, 어떠한 결찰 생산물도 관찰되지 않았다. E. coli 리가아제, TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 4 dNTP의 존재 하에서, 상기 5' 어댑터는 69의 염기(도 22, 레인 5)의 생산물을 형성하는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질에 결찰되었다. 상기 5' 어댑터 및 올리고뉴클레오티드 주형이 FAM 올리고뉴클레오티드 기질과 비교해서 과잉이었기 때문에, 또한, 틈 번역 생산물은 58의 염기(도 22, 레인 5, 상부 패널)에서 관찰되었다. 그러나, 결찰 생산물의 동일한 양이 관찰되었다. 25bp 래더 DNA 크기 마커는 레인 M 상에 로딩되었다.
결론:
FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단의 인산화가 결찰에 요구된다. dNTP의 존재 하에서의 TAQ DNA 폴리머라아제의 폴리머라아제 활성은 5' 어댑터의 신장을 행하기 위해 필요하고, 이것은 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단에서의 플랩을 생성한다. 이 플랩은 E. coli 리가아제에 의한 결찰을 위한 완벽한 5' 포스페이트 기질을 생성하는 TAQ DNA 폴리머라아제의 상기 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 위한 양호하 기질이다. 상기 결찰은 플랩이 1의 염기에 의해 형성되는 경우라도 발생된다. 또한, 상기 결찰은 5'포스페이트가 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단에 생성된 직후에 발생되는, 틈 번역의 신장 또는 플랩의 길이를 제한하지 않는 4의 dNTP 모두가 제시될 때에 발생된다.
실시예 5
열 안정형 효소와 연결된 틈 번역-결찰 반응
이론적 설명: 이 실험은 연결된 반응에 있어서의 반응 온도 및 TAQ DNA 폴리머라아제 효소의 유닛 수의 영향을 평가하기 위해 행해졌다.
재료:
· 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-144)(표 1)
· FAM 올리고뉴클레오티드 기질(13-581)(표 1)
· 올리고뉴클레오티드 주형(13-582)(표 1)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· TAQ DNA 리가아제(New England BioLabs, 제품번호 M0208S)
· 10x TAQ DNA 리가아제 반응 버퍼(New England BioLabs)
· 25U/μl 농도의 TAQ DNA 폴리머라아제(Genscript, 제품번호 E00012)
방법:
반응액은 최종 농도 1x TAQ DNA 리가아제 반응 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 틈-번역을 위한 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드와 45피코몰의 올리고뉴클레오티드 주형, 각각의 dATP, dTTP, dGTP 또는 dTTP 200μM, 40유닛의 TAQ DNA 리가아제, 또는 80유닛 TAQ DNA 리가아제, 또는 120유닛 TAQ DNA 리가아제, 및 10유닛의 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 반응액은 45℃, 50℃, 55℃, 또는 60℃에서 30분 동안 배양되었다. 그들 반응액 10μl는 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀) 10μl와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되었고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되었고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다.
결과:
TAQ DNA 폴리머라아제는 그것의 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성에 의해 FAM 올리고뉴클레오티드 기질 상의 뉴클레오티드를 제거하는 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 히드록실 말단을 신장시킨다. dTTP/dGTP/dATP(도 23, 레인 2-5, 패널 A) 또는 dTTP(도 23, 레인 6-9, 패널 A)를 첨가하는 것은 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 및 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단의 후속 절단에 각각 4개 및 1의 염기의 첨가를 가능하게 한다. 60℃에서, 결찰이 손상되었다(도 23, 레인 5 및 9, 패널 A). 결찰의 효율성은 dTTP/dGTP/dATP(도 23, 레인 2-5, 패널 A) 또는 dTTP(도 23, 레인 6-9, 패널 A)를 첨가하는 것에 영향받지 않았다. 상기 결찰 효율성은 반응에 존재하는 TAQ DNA 리가아제의 양에 따라 달라졌다. 결찰 생산물은 40 또는 80유닛(도 23, 각각 레인 2 및 3, 패널 B)과 비교해서 반응에 120유닛의 TAQ DNA 리가아제(도 23, 레인 4, 패널 B)가 첨가된 경우에 보다 풍부하였다. 레인 1, 패널 A 및 레인 1, 패널 B는 효소가 없는 대조군의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
결론:
틈 번역 반응시에, TAQ DNA 폴리머라아제는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단을 절단하고, 45℃ 및 60℃에서 결찰을 행하기 위해 TAQ DNA 리가아제에 필수적인 5' 포스페이트 말단을 생성한다. 상기 결찰은 60℃에서 감소되었다. 또한, 반응에 있어서의 TAQ DNA 리가아제의 농도는 결찰의 효율성에 영향을 미치고, 보다 많은 생성물이 80U 및 40U과 비교해서 120U 효소의 존재 하에서 관찰되었다.
실시예 6
연결된 치환-절단-결찰 반응
이론적 설명: 이 실험은 열 안정형 TAQ DNA 리가아제 또는 열불안정성 E. coli 리가아제 중 어느 하나가 연결된 치환-절단-결찰 반응에서 TAQ DNA 폴리머라아제와 결합할 수 있는 것을 설명하기 위해 행해졌다.
재료:
· 치환-절단을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-156)(표 1)
· FAM 올리고뉴클레오티드 기질(13-581)(표 1)
· 올리고뉴클레오티드 주형(13-582)(표 1)
· TAQ DNA 리가아제(New England BioLabs, 제품번호 M0208S)
· 10x TAQ DNA 리가아제 반응 버퍼(New England BioLabs)
· TAQ DNA 폴리머라아제, 농도 25U/μl(Genscript, 제품번호 E00012)
· E. coli DNA 리가아제(New England BioLabs, 제품번호 M0205S)
· 10x E. coli DNA 리가아제 반응 버퍼(New England BioLabs)
방법:
반응액은 최종 농도 1x E. coli DNA 리가아제 반응 버퍼 또는 1x TAQ DNA 리가아제 반응 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 치환-절단을 위한 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드와 45피코몰의 올리고뉴클레오티드 주형, 10유닛의 E. coli DNA 리가아제 또는 40유닛 TAQ DNA 리가아제, 및 10유닛의 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 반응액은 40℃ 또는 45℃에서 30분 동안 배양되었다. 그들 반응액 10μl는 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀) 10μl와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되었고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되었고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다.
결과:
치환-절단을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 5' 말단과 중복하는 3' 말단에 여분의 매칭된 염기 "T"를 갖는다. 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단으로 치환될 때에, TAQ DNA 폴리머라아제의 상기 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성이 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 5' 말단을 절단하여 E. coli 리가아제(도 24, 레인 2, 패널 A) 또는 TAQ DNA 리가아제(도 24, 레인 2, 패널 B)를 이용한 결찰에 필수적인 5' 포스페이트를 생성한다. 패널 A 및 B의 레인 1은 효소가 없는 올리고뉴클레오티드 대조군을 나타낸다.
결론:
dNTP의 부재 하에서는 어떠한 상기 5' 어댑터의 신장도 발생되지 않는다. 그러나, TAQ DNA 폴리머라아제는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단을 절단하고, 결찰을 행하기 위해 E. coli DNA 리가아제 또는 TAQ DNA 리가아제에 필수적인 말단의 5' 포스페이트를 생성한다.
실시예 7
"N" 범용의/분해된 오버행 또는 "T" 기질-특이적 5' 어댑터 3' 오버행 중 어느 하나를 이용한 연결된 치환-절단-결찰 반응
이론적 설명: 이 실험은 플랩 엔도뉴클레아제를 이용한 5' 어댑터 결찰이 상기 5' 어댑터 3' 말단의 오버행이 서열-특이적 매칭이거나 분해된 비서열-특이적 "N"으로 구성되는 경우에 행해질 수 있는 것을 설명한다.
재료:
· 치환-절단 "T"를 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-607)(표 1)
치환-절단 "N"을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-596)(표 1)
· FAM 올리고뉴클레오티드 기질(13-581)(표 1)
· 올리고뉴클레오티드 주형(13-582)(표 1)
· TAQ DNA 리가아제(New England BioLabs, 제품번호 M0208S)
· 10x TAQ DNA 리가아제 반응 버퍼(New England BioLabs)
· TAQ DNA 폴리머라아제, concentrated 25U/μl(Genscript, 제품번호 E00012)
· E. coli DNA 리가아제(New England BioLabs, 제품번호 M0205S)
· 10x E. coli DNA 리가아제 반응 버퍼(New England BioLabs)
방법:
반응액은 최종 농도 1x TAQ DNA 리가아제 반응 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "T" 또는 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N" 1 또는 180피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N" 또는 450피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N" 및 45피코몰의 올리고뉴클레오티드 주형, 40유닛의 TAQ DNA 리가아제, 및 10유닛의 TAQ DNA 폴리머라아제를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 반응액은 45℃ 또는 50℃ 또는 55℃에서 30분 동안 또는 45℃에서 3분 동안, 65℃에서 15초 동안 8사이클로 배양되었다. 그들 반응액 10μl는 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀) 10μl와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다.
결과:
치환-절단을 위한 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드가 (FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단과 중복하는)올리고뉴클레오티드 주형(도 25, 레인 3, 5, 7, 패널 A)과 매칭하는 그것의 3' 말단에 "T"를 갖는 경우에, 결찰은 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드가 분해된 "N" 염기를 갖는 경우보다 높은 비율로 발생되고, 올리고 합성시에 4의 뉴클레오티드는 모두 이 반응(도 25, 레인 2, 4, 6, 패널 A)에 존재하였고, 이것은 단지 1/4 시간에만 올리고뉴클레오티드 주형과 완벽하게 일치한다. 상이한 반응 온도(45℃, 50℃ 및 55℃)는 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N"(도 25, 레인 2, 4, 6, 패널 A)을 이용하여 결찰을 개선시키는 일없이 시험되었다. 또한, 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N"(45피코몰, 180피코몰 및 450피코몰)의 상이한 양이 결찰 반응(도 25, 레인 3-5, 패널 B)을 개선시키는 일없이 시험되었다. 그러나, 45℃~65℃에서의 반응의 온도 사이클링은 결찰이 염기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(도 25, 레인 6, 패널 B)와 매칭되는 "T"와 비교할 만한 가장 높은 비율로 발생되는 것을 가능하게 한다. 패널 A 및 B의 레인 1은 효소가 없는 올리고뉴클레오티드 대조군을 나타낸다.
결론:
5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N"를 이용한 치환-절단에 연결된 효율적인 5' 어댑터 결찰을 가능하게 하기 위해, 동작을 위한 TAQ DNA 리가아제에 대한 제 1 온도와 올리고뉴클레오티드 주형과 올리고뉴클레오티드 주형 및 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N" 사이의 듀플렉스가 해리될 수 있는 제 2 온도가 중요하였다. 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 염기가 주형과 완벽하게 매칭되고, FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단을 치환하는 경우에만, 사이클링 조건은 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 "N"과 치환-절단 반응이 발생되는 올리고뉴클레오티드 주형 사이의 복수의 연결을 가능하게 한다.
실시예 8
DNA 폴리머라아제 I을 이용한 연결된 틈-번역-결찰 반응
이론적 설명: 이 실험은 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 I이 어댑터 결찰 방법과 연결된 틈 번역에 관여할 수 있는 것을 설명한다.
재료:
· 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-144)(표 1)
· FAM 올리고뉴클레오티드 기질(13-581)(표 1)
· 올리고뉴클레오티드 주형(13-582)(표 1)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· 25bp 래더 DNA 크기 마커(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10488-022)
· E. coli DNA 리가아제(Enzymatics, 제품번호 L6090L)
· 10x E. coli DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6090)
· TAQ-B DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7250L)
· DNA 폴리머라아제 I(New England Biolabs, 제품번호 M0209S)
방법:
반응액은 1x E. coli DNA 리가아제 버퍼, 30피코몰의 FAM 올리고뉴클레오티드 기질, 틈-번역을 위한 45피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 45피코몰의 올리고뉴클레오티드 주형, 각각의 4 dNTP 200μM, 10유닛의 E. coli 리가아제와 10유닛의 TAQ-B DNA 폴리머라아제 또는 5유닛 of DNA 폴리머라아제 I 와 1유닛의 DNA 폴리머라아제 I를 포함하는 최종 농도 30μl로 조합되었다. 반응액은 40℃, 18℃, 16℃ 또는 14℃에서 30분 동안 배양되었다. 각각의 반응액의 10μl는 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀) 10μl와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되었고, SYBR gold(각각 상부 패널 및 하부 패널을 갖는 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되었고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다.
결과:
도 26의 제 1 레인은 효소가 없는 대조군을 나타낸다. TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 E. coli 리가아제(도 26, 레인 2)의 존재 하에서, 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드는 69의 염기 생산물(도 26, 레인 2, 상부 및 하부 패널)을 생산하는 FAM 올리고뉴클레오티드 기질에 결찰되거나, 58 염기(도 26, 레인 2, 상부 패널)의 새로운 생산물을 형성하기 위해 완전히 신장되거나 하였다. 69 염기 생산물은 TAQ-B DNA 폴리머라아제에 의한 신장 및 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 상기 5' 말단에서의 플랩의 형성으로부터 유래된다. TAQ-B 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성은 플랩을 컷팅하고, 결찰을 완료하기 위해 E. coli 리가아제에 의해 사용되는 5' 포스페이트를 생성한다. 58 염기 생산물은 FAM 올리고뉴클레오티드 기질이 신장시에 완전히 치환되고, TAQ-B DNA 폴리머라아제의 상기 5' 플랩 엔도뉴클레아제 활성에 의해 분해되었을 때에 얻어졌다. 또한, 이들 유형의 생산물은 TAQ-B DNA 폴리머라아제가 성장하는 DNA 쇄에 앞서 뉴클레오티드를 하나씩 제거하고 틈 번역이 일어날 수 있게 하는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 I(도 26, 레인 3-8)에 의해 치환되었을 때에 형성되었다. 반응은 5유닛의 DNA 폴리머라아제 I(도 26, 레인 3-5) 또는 1유닛의 DNA 폴리머라아제 I(도 26, 레인 6-8) 중 어느 하나에 의해 행해졌다. 고온의 TAQ-B DNA 폴리머라아제에 의한 반응은 40℃(도 26, 레인 2)에서 행해진 반면에, 중온의 DNA 폴리머라아제 I에 의해 행해지는 반응은 18℃(도 26, 레인 3 및 6), 16℃(도 26, 레인 4 및 7) 또는 14℃(도 26, 레인 5 및 8)에서 행해졌다. 상기 69의 염기의 결찰 생산물은 모든 경우에 얻어졌지만, 단지 1유닛의 DNA 폴리머라아제 I(도 26, 레인 6-8)의 첨가가 5유닛(도 26, 레인 3-5)보다 효율적이었다. 이것은 결찰될 수 있기 전에 FAM 올리고뉴클레오티드 기질의 급속 부분 분해를 일으키는 DNA 폴리머라아제의 매우 강한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성으로 설명된다. 분해 생산물은 하부 패널((도 26, 레인 3-5)의 저부에서 관찰되었다. 25bp 래더 DNA 크기 마커는 레인 M 상에 로딩되었다.
결론:
TAQ-B DNA 폴리머라아제(고온의 폴리머라아제) 및 DNA 폴리머라아제 I(중온의 폴리머라아제) 양쪽은 틈 번역 매칭의 결찰을 행하기 위해 사용될 수 있지만, 완전히 활성화시키기 위해서는 다른 조건이 요구된다. 그들 양쪽은 상기 5' 말단의 절제 후 결찰의 결과인 69의 염기 생산물을 생성하지만, 그들은 상이한 매커니즘을 이용한다. TAQ-B는 E. coli 리가아제에 의한 결찰을 위해 필요한 5' 인산화된 말단을 생산하기 위해 컷팅된 플랩을 생성하고, DNA 폴리머라아제 I은 성장하는 가닥 앞에서 뉴클레오티드를 하나씩 제거하고, 2의 단편을 결합하기 위한 E. coli 리가아제를 위한 완벽한 기질인 상기 5' 인산화된 뉴클레오티드를 생성한다. DNA 폴리머라아제 I은 틈 번역에 의해 매개된 5' 어댑터 결찰을 행하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 9
폴리싱은 물리적으로 전단된 DNA의 블런트 결찰을 위해 필요하고, 탈인산화는 키메라 결찰 생산물의 형성을 방지함
이론적 설명: 이 실험은 물리적으로 전단된 DNA 기질에의 어댑터의 블런트 결찰을 위한 탈인산화 및 말단 폴리싱의 중요성을 설명한다.
재료:
· 블루 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B0110)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)(New England Biolabs, 제품번호 P0756S)
· DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편(New England Biolabs, 제품번호 M0210S)
· T4 DNA 폴리머라아제(New England Biolabs, 제품번호 M0203S)
· T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(New England Biolabs, 제품번호 M0201S)
· 새우 유래 알칼리 포스파타아제(Affymetrix, 제품번호 78390)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· E. coli 유전체 DNA ATCC 11303 염색제(Affymetrix, 제품번호 14380)
· M220 초점형-초음파파쇄기(Covaris, 제품번호 PN 500295)
· 피핀 추출(Sage Science)
· DNA 클린 & 농축기-5 -(Zymo research, 제품번호 D4004)
· CDF2010 2% 아가로오스, 염료 자유 w/내부 표준(Sage Science)
방법
E. coli gDNA는 DNA 현탁 버퍼(Teknova, 제품번호 T0227)에 100ng/μl의 농도로 재현탁되었다. DNA는 M220 초점형-초음파파쇄기를 이용하여 150 염기 쌍의 평균 크기로 단편화되었다. 계속해서, 150bp~185bp의 단편화된 DNA의 엄격한 분포는 피핀 추출을 이용하여 2% 아가로오스 겔로부터 선별된 크기였다.
반응액 A의 세트에 있어서, 크기-선별된 DNA의 100ng 또는 500ng에는 폴리싱 표소의 활성을 실시하였다. 반응액은 최종 농도 1x 블루 버퍼, 100μM의 각각의 dNTP, 3유닛 T4 DNA 폴리머라아제, 5유닛 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편, 1mM ATP, 10유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 반응액은 30℃에서 20분 동안 배양되었다. DNA는 DNA 클린 & 농축기-5 컬럼을 이용하여 정제되었다. DNA는 15μl의 DNA 현탁 버퍼에서 용출되었고, 후속의 탈인산화 반응 B 후에는 어댑터 결찰이 이어지거나, 탈인산화없이 결찰 반응으로 직접 배치되었다. 탈인산화 반응은 처리된 DNA, 1x 블루 버퍼, 및 1유닛의 새우 유래 알칼리 포스파타아제를 포함한 30μl의 최종 체적으로 조합되었다. 반응액은 37℃에서 10분 동안 배양되었다. DNA는 DNA 클린 & 농축기-5 컬럼을 이용하여 정제되었고, 15μl의 DNA 현탁 버퍼에서 용출하였다.
반응액 C의 세트에 있어서, 100ng의 크기-선별된 DNA에는 탈인산화 후 폴리싱 또는 반응 D의 세트로 직접 폴리싱을 실시하였다. 탈인산화 반응은 처리된 DNA, 1x 블루 버퍼, 및 1유닛의 새우 유래 알칼리 포스파타아제를 포함한 30μl의 최종 체적으로 조합되었다. 반응액은 37℃에서 10분 동안 배양되었다. DNA는 DNA 클린 & 농축기-5 컬럼을 이용하여 정제되고, 15μl의 DNA 현탁 버퍼를 이용하여 희석되었다. 폴리싱 반응액 D는 최종 농도 1x 블루 버퍼, 100μM의 각각의 dNTP, 3유닛 T4 DNA 폴리머라아제, 5유닛 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편, (레인 6-7)을 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. DNA는 DNA 클린 & 농축기-5 컬럼을 이용하여 정제되고, 15μl의 DNA 현탁 버퍼에서 용출되었다.
정제 후에, 이전의 반응에는 모두 결찰 반응이 실시되었다. 반응액은 처리된 DNA, 1x T4 DNA 리가아제 반응 버퍼 및 1200유닛의 T4 DNA 리가아제를 포함하는 총 체적 30μl로 조합되었다. 반응액은 25℃에서 15분 동안 배양되었다. 각각의 결찰으로부터의 33ng의 DNA는 2x 포름아미드 로딩 버퍼(97% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브로모페놀 블루 및 0.01% 크실렌 시아놀)와 혼합되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었고, 계속해서 65℃의 오븐에서 프리캐스트 15% 폴리아크릴아미드 겔, TBE-우레아(Invitrogen, 제품번호 S11494) 상에서 실행되었고, SYBR Gold로 염색되었고, 다크 리더 라이트 박스(Clare Chemical Research) 상에서 시각화되었고, 디지털 카메라를 이용하여 촬영되었다.
결과:
폴리싱 전에, 육체적으로 전단된 DNA는 T4 DNA 리가아제(도 27, 레인 1)에 의한 블런트 말단화된 어탭터에의 결찰에 적합한 기질이 아니었다. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, T4 DNA 폴리머라아제 및 클레나우 단편을 이용한 폴리싱 후에, DNA 말단은 블런트화되었고, 일부 5' 말단은 인산화되었고, 상기 분자는 서로뿐만 아니라 블런드 어댑터(도 27, 레인 2 및 4)에 연결되거나 결찰될 수 있다. ~325 염기, ~500 염기 및 500 염기 이상의 종은 각각 ~175염기의 2 분자, 3 분자 및 4 분자가의 결찰에 함께 대응한다. DNA의 농도는 결찰 생산물의 형성에 영향을 미친다. DNA의 농도가 높을수록, 더욱 높은 분자량의 키메라 결찰종은 보다 풍부(도 27, 레인 4)해진다. 폴리싱 단계 후에 새우 유래 알칼리 포스파타아제를 이용한 DNA의 처리는 DNA 분자(도 27, 레인 3 및 5) 사이의 연쇄체 형성을 손상시킨다. 또한, 새우 유래 알칼리 포스파타아제를 이용한 처리는, 그것이 단편화된 DNA(도 27, 레인 6)의 폴리싱 전에 행해지는 경우에 연쇄체 형성을 방지한다. T4 DNA 폴리머라아제 및 클레나우 단편(도 27, 레인 7)을 이용한 폴리싱 후에 관찰되는 결찰 생산물은 T4 DNA 폴리머라아제, 클레나우 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(도 27, 레인 2)를 이용한 폴리싱과 비료해서 풍부하지 않았다.
결론: 물리적으로 전단된 DNA의 블런트 결찰 효율은 DNA 폴리머라아제에 의한 말단 폴리싱에 따라 다르다. 또한, 상기 결찰은 DNA 단편의 상기 5' 말단을 인산화시키고, 3' 말단을 탈인산화시키는 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제의 첨가에 의해 개선되었다. 또한, DNA의 농도는 결찰의 양 및 키메라 생산물의 형성에 영향을 미친다. 농도가 높을수록, DNA는 T4 DNA 리가아제의 존재 하에서 키메라 생산물를 생산할 가능성이 더욱 높다. 알칼리 포스파타아제는 5' 포스페이트(결찰에 필요함)를 제거하고, 키메라 결찰 생산물(연쇄체)의 형성을 방지한다.
실시예 10
NGS 라이브러리는 어댑터 결찰 반응과 연결된 5' 염기 트리밍을 이용하여 조제될 때에 수율이 높아진다.
이론적 설명: 이 실험은 NGS 라이브러리 구조체, 특히 5' 어댑터 결찰 과 커플링되는 5' 염기 트리밍을 포함하는 것으로부터 야기되는 라이브러리 수율의 증가를 위해 그들의 예시적 응용에 제시된 반응액의 효용성을 설명한다. 라이브러리는 크기 선별된 전단 DNA로부터 구조체되었고, 따라서 라이브러리 생산물은 겔 전기영동에 의해 용이하게 시각화될 수 있다.
재료:
· 블루 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B0110)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)(New England Biolabs, 제품번호 P0756S)
· 클레나우 단편(Enzymatics, 제품번호 P7060L)
· T4 DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7080L)
· T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Enzymatics, 제품번호 Y904L)
· 새우 유래 알칼리 포스파타아제(Affymetrix, 제품번호 78390)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· 3'어댑터; 제 1 올리고뉴클레오티드 13-501(표 1)
· 3'어댑터; 제 2 올리고뉴클레오티드 13-712(표 1)
· E. coli 유전체 DNA ATCC 11303 염색제(Affymetrix, 제품번호 14380)
· M220 초점형-초음파파쇄기(Covaris, 제품번호 PN 500295)
· E. coli DNA 리가아제(Enzymatics, 제품번호 L6090L)
· E. coli DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6090)
· 우라실-DNA 글리코실라아제(Enzymatics, 제품번호 G5010L)
· TAQ-B DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7250L)
· 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-489)(표 1)
· 치환-절단을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-595)(표 1)
· TAQ DNA 리가아제(Enzymatics, 제품번호 L6060L)
· SPRIselect(Beckman coμlter, 제품번호 B23419)
방법:
E. coli 유전체 DNA는 100ng/μl의 농도에서 DNA 현탁 버퍼(Teknova, 제품번호 T0227)에 재현탁된다. DNA는 M220 초점형-초음파파쇄기를 이용하여 150 염기 쌍의 평균 크기로 단편화되었다. 계속해서, ~150bp~185bp의 단편화된 DNA의 엄격한 분포는 피핀 추출을 이용하여 2% 아가로오스 겔 상에서 크기 선별되었다.
크기-선별된 E. coli 유전체 DNA의 100ng은 강화된 어댑터 결찰 방법을 이용하여 라이브러리를 조제하는데 사용되었다. 폴리싱 반응은 최종 농도 1x 블루 버퍼, 100μM의 각각의 dNTP, 3유닛의 T4 DNA 폴리머라아제, 5유닛의 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편, 10유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 포함하는 30μl로 조합되었다. 반응액은 37℃에서 20분 동안 배양되었다. DNA는 DNA 클린 & 농축기-5를 이용하여 정제되고, DNA 현탁 버퍼 15μl에 용출되었다. 3' 어댑터 결찰 반응은 1x T4 DNA 리가아제 버퍼, 220피코몰의 3' 어댑터 제 1 올리고뉴클레오티드, 440피코몰의 3' 어댑터 제 2 올리고뉴클레오티드, 15μl의 정제된 DNA 및 1200유닛의 T4 DNA 리가아제를 포함하는 30μl에 조합되었다. 반응은 25℃에서 15분 동안 배양되었다. DNA는 최대 50μl 체적까지 성장하였고, 70μl SPRIselect 비드(비 1.4x)를 이용하여 크기 선별되었다. DNA는 DNA 재현탁 버퍼 15μl에 용출되었다. 3' 어댑터의 부분 분해, 상기 5' 어댑터의 어닐링, 상기 5' 어댑터의 5'-말단 트리밍 및 결찰은 모두 1x E. coli DNA 리가아제 버퍼 또는 1x TAQ DNA 리가아제 버퍼, 각각의 dNTP 200μM 또는 각각의 dATP, dTTP, dGTP 또는 무dNTP 200μM, 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 또는 치환-절단을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 200피코몰, 10유닛의 E. coli 리가아제 또는 40유닛의 TAQ DNA 리가아제, 2유닛의 우라실-DNA 글리코실라아제, 10유닛의 TAQ-B DNA 폴리머라아제, 및 3' 어댑터 결찰 반응 후에 정제된 DNA 15μl를 함유하는 30μl의 최종 체적으로 조합된 다음 반응액에서 일어난다. 반응은 40℃ 또는 45℃에서 10분 동안 또는 (45℃에서 45초·65℃에서 5초 동안)(라이브러리 5)의 30사이클로 배양되었다. DNA는 최대 50μl 체적까지 성장하였고, 정제되어 40μl의 SPRIselect 비드(비 0.8x)를 이용하여 크기 선별되었다. DNA는 20μl에 용출되었고, 카파 라이브러리 정량 키트-일루미나/유니버셜(제품번호 KK4824)를 이용하여 qPCR에 의해 정량되었다.
결과:
라이브러리 농도는 플롯(도 28, 패널 A) 상에 보고되었고, 라이브러리는 변성 조건(도 28, 패널 B) 하에서 전기영동에 의해 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 시각화되었다. 주입 DNA는 ~150 염기 및 ~185 염기(도 28, 레인 I, 패널 B) 사이로 이동한다. 분액은 3' 어댑터 결찰 단계 후에 취해지고, 겔 상에 로딩되었다. 이 생산물은 3' 어댑터(도 28, 레인 L, 패널 B)의 64 염기의 첨가에 대응하는 ~225-~250 염기 사이로 이동한다. 하나 이상의 염기를 제거하고, 상기 5' 어댑터의 결찰 전의 DNA의 5' 말단에서의 5'포스페이트기를 노출하는데 있어서의 TAQ-B DNA 폴리머라아제의 기여는 라이브러리 1 대 2(도 28, 레인 1 및 2, 패널s A 및 B)에서 설명되었다. TAQ-B(2.6nM)가 없는 라이브러리 1의 농도는 TAQ-B DNA 폴리머라아제(7.9nM)가 있는 라이브러리 2의 농도보다 3배 더 적었다. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제의 처리 후라도, 단편화된 DNA의 75%는 결찰을 호환 가능하게 하기 위하여 그들의 5' 말단의 프로세싱이 요구된다. 또한, 완료된 라이브러리는 겔(도 28, 레인 1 및 2, 패널 B) 상에 로딩되었다. 이들 라이브러리는 틈-번역을 위한 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 또는 치환-절단을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 58 염기 및 3' 어댑터의 64 염기의 첨가에 대응하는 ~275 염기-~300 염기 사이로 이동한다. 라이브러리 1 생산물은 라이브러리 2밴드(도 28, 패널 B)보다 낮은 강도로 존재한다. 라이브러리 3 및 4는 3' 어댑터의 부분 분해, 상기 5' 어댑터의 어닐링, 상기 5'-말단 트리밍 및 상기 5' 어댑터의 결찰 단계시에 각각 dATP, dTTP, dGTP 및 E. coli 리가아제, 또는 TAQ DNA 리가아제로 이루어진다. 라이브러리 3의 농도(4.8nM)는 약 60%의 라이브러리 2(7.9nM)였다. 이 수율의 30%의 손실은 E. coli 게놈(25%)에 있어서의 사이토신 "C"의 존재와 관련이 있다. DNA 기질의 상기 5' 말단이 사이토신일 때마다, 틈-번역을 위한 상기 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드는 TAQ에 의해 신장될 수 없고, 상기 5' 말단은 트리밍될 수 없다. 또한, DNA 기질의 상기 5' 말단에, 각각, 2 및 3의 연속적인 사이토신을 가질 가능이 6.25% 및 1.5% 더 있다. 45℃에서 TAQ DNA 리가아제(라이브러리 4)를 이용한 결찰은 40℃(5.2nM)(라이브러리 3)에서의 E. coli 리가아제와 비교했을 때 마찬가지의 수율을 나타낸다. 치환-절단(4.2nM)을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 라이브러리 5는 틈-번역(7.9nM)을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 라이브러리 2보다 덜 효율적이었다.
결론:
라이브러리는 개시된 어댑터 결찰 방법을 이용하여 성공적으로 이루어진다. TAQ DNA 폴리머라아제에 의한 5'-말단 DNA 트리밍은 5' 말단 프로세싱 단계 (라이브러리 1 대 2)을 갖지 않는 라이브러리와 비교했을 때 어댑터 결찰 생산물의 수율을 3배 증가시킬 수 있다. TAQ DNA 리가아제(라이브러리 4) 및 E. coli 리가아제(라이브러리 3)는 모두 틈-번역 후에 상기 5' 어댑터를 효율적으로 결찰시킨다. 또한, TAQ DNA 리가아제는 치환-절단(라이브러리 5) 후에 5' 어댑터를 결찰시킨다. 틈-번역시에 3(라이브러리 3 및 4) 대신에 4 dNTP(라이브러리 2)를 이용하면 상기 5' 어댑터에의 더 큰 DNA 기질의 결찰을 가능하게 할 수 있다.
실시예 11
어댑터 결찰에 연결된 5' 염기 트리밍을 이용하여 조제되는 NGS 라이브러리의 서열 분석
이론적 설명: 이 실험은 NGS 라이브러리 구조체의 그들의 예시적 응용에 제시되는 반응액의 유용성을 설명한다. 라이브러리는 전단된 E. coli DNA로부터 구조체되었고, 이어서 게놈의 광범위한 염기 조성에 의해 얻어지는 범위의 우수한 균일성을 설명하기 위하여 서열화되었다.
재료:
· 블루 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B0110)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· 100mM 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(dNTP) 세트, PCR 그레이드(Invitrogen(Life technologies), 제품번호 10297-018)
· 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)(New England Biolabs, 제품번호 P0756S)
· 클레나우 단편(Enzymatics, 제품번호 P7060L)
· T4 DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7080L)
· T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Enzymatics, 제품번호 Y904L)
· 새우 유래 알칼리 포스파타아제(Affymetrix, 제품번호 78390)
· T4 DNA 리가아제(급속)(Enzymatics, 제품번호 L6030-HC-L)
· 10x T4 DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6030)
· 3'어댑터; 제 1 올리고뉴클레오티드 13-510(표 1)
· 3'어댑터; 제 2 올리고뉴클레오티드 13-712(표 1)
· E. coli 유전체 DNA ATCC 11303 염색제(Affymetrix, 제품번호 14380)
· M220 초점형-초음파파쇄기(Covaris, 제품번호 PN 500295)
· E. coli DNA 리가아제(Enzymatics, 제품번호 L6090L)
· E. coli DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6090)
· 우라실-DNA 글리코실라아제(Enzymatics, 제품번호 G5010L)
· TAQ-B DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7250L)
· 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(13-489)
· SPRIselect(Beckman coulter, 제품번호 B23419)
방법:
E. coli 유전체 DNA는 100ng/μl의 농도에서 DNA 현탁 버퍼(Teknova, 제품번호 T0227)에 재현탁되었다. DNA는 M220 초점형-초음파파쇄기를 이용하여 150 염기 쌍의 평균 크기로 단편화되었다. 100ng의 E. coli covaris 유전체 DNA는 라이브러리를 조제하기 위해 사용되었다. 탈인산화의 제 1 반응은 최종 농도 1x 블루 버퍼, 100ng의 단편화된 E. coli 유전체 DNA, 및 1유닛의 새우 유래 알칼리 포스파타아제를 포함하는 15μl의 총 체적으로 조합되었다. 반응은 37℃에서 10분 동안 배양되었다. 새우 유래 알칼리 포스파타아제는 65℃에서 5분 동안 배양되었다. 폴리싱 반응은 최종 농도 1x 블루 버퍼, 각각의 dNTP 100 μM, 3유닛의 T4 DNA 폴리머라아제, 5유닛의 DNA 폴리머라아제 I, 라지(클레나우) 단편 및 15μl의 탈인산화 반응액을 포함하는 30μl로 조합되었다. 상기 반응액은 20℃에서 30분 동안 배양되었다. DNA는 DNA 클린 & 농축기-5를 이용하여 정제되었다. DNA는 DNA 현탁 버퍼 15μl에서 용출되었다. 3' 어댑터 결찰 반응은 1x T4 DNA 리가아제 버퍼, 220피코몰 of 3' 어댑터 제 1 올리고뉴클레오티드, 440피코몰의 3' 어댑터 제 2 올리고뉴클레오티드, 폴리싱 후에 정제된 DNA 15μl, 및 1200유닛의 T4 DNA 리가아제를 포함하는 30μl로 조합되었다. 반응액은 25℃에서 15분 동안 배양되었다. 50μl로 체적을 조정한 후, DNA가 정제되었고, 45μl SPRIselect 비드(비율 0.9x)를 이용하여 크기 선별되었다. DNA는 15μl의 DNA 재현탁 버퍼에서 용출되었다. 3' 어댑터, 어닐링 of 상기 5' 어댑터, 5'-말단 DNA 트리밍 및 상기 5' 어댑터의 결찰은 모두 1x E. coli DNA 리가아제, 각각의 dNTP의 200μM, 틈-번역을 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 200피코몰, 10유닛의 E. coli 리가아제, 2유닛의 우라실-DNA 글리코실라아제, 10유닛의 TAQ-B DNA 폴리머라아제 및 3' 어댑터 결찰 반응 후에 정제되는 DNA 15μl를 포함하는 최종 체적 30μl로 조합되는 다음 반응액에서 일어났다. 반응액은 40℃에서 10분 동안 배양되었다. 체적을 50μl로 조정한 후에, DNA는 70 μl의 SPRIselect 비드(ratio 1.4x)를 이용하여 정제되었다. DNA는 20μl로 용출되었고, 카파 라이브러리 정량 키트-일루미나/유니버셜(제품번호 KK4824)을 이용하여 qPCR에 의해 정량되었다. DNA는 최종 농도로 0.1mM 소듐 히드록시드를 이용하여 5분 동안 변성되었고, 600μl의 10pM 라이브러리는 MiSeq(일루미나) 상에 로딩되었다.
결과:
qPCR에 의해 정량된 라이브러리 농도는 2.8nM였다. 76 염기의 쌍 말단 리드는 일루미나 MiSeq의 v2 케미스트리에 의해 생성되었다. 928K/㎟ 클러스터가 생성되었고, Q30 스코어는 각각 제 1 및 제 2 리드 대해 97.8% 및 96.9%이었다. 서열 데이터 정성은 급속 QC 보고서(Babraham Bioinformatics)를 이용하여 평가되었다. 분석의 요약은 9 녹색 체크 마크, 2 황색 느낌표(경고)를 나타내지만, 적색 X(실패)는 관찰되지 않았다(도 29, 패널 A). 모든 서열에 있어서의 모든 염기의 전체 %GC는 E. coli 게놈(녹색 체크 마크, 도 29, 패널 B)에서 예상된 바와 같이 50%이었다. 서열의 정성은 76 염기 분석(녹색 체크 마크, 도 29, 패널 C)을 통한 매 리드시마다 우수하였다. 각각의 염기의 백분율은 패널 D에서 플롯팅되었다. G/C 및 A/T의 양은 임의의 리드(녹색 체크 마크, 도 29, 패널 D)에서 <10% 차를 가졌다. GC 함유량은 분석된 76 염기(녹색 체크 마크, 도 29, 패널 E)) 전반에 걸쳐 마찬가지였다. 각각의 서열의 길이에 대한 리드당 GC 함유량은 이론상의 분포(황색 느낌표, 도 29, 패널 F)와 비교되었다. 정상 분포로부터의 편차의 합계가 리드(황색 느낌표, 도 29, 패널 F)의 15% 초과인 것을 발견하였기 때문에 경고가 발생되었다. 염기 N 함유량 당 또는 서열 길이 분포(요약, 도 29, 패널 A)에 대해 경고가 발생되지 않았다. 서열 복제 레벨은 35.85%(도 29, 패널 G)였다. 적용범위 135x(황색 느낌표, 도 29, 패널 G)의 높은 레벨로 인해 비고유의 서열이 전체의 20%를 초과하여 구성되어 있기 때문에, 황색 경고가 발생되었다. 지나치게 많은 서열 또는 크메르는 어떠한 것도 보고되지 않았다. 사실상, 관찰되는 어댑터 다이머가 없었다(0.02%, 데이터 도시하지 않음). 또한, GC 편향성은 피카드 콜렉트 Gc 바이어스 통계를 이용하여 평가되었다. 범위의 균일성은 염기 조성의 광범위한 염기 조성을 통해 유지되었다. 범위의 편차는 단지 10% GC 함유량보다 낮고, 80%보다 높게 관찰되었다. 염기 정성은 염기 호출에 있어서 99.8% 정확도에 대응하는 Q25 이상이었다. 또한, 더욱 낮은 Q25는 극도의 낮고 높은 GC 함유량에서만 관찰되었다.
결론:
라이브러리는 단편화된 E. coli 유전체 DNA를 이용하여 성공적으로 제조되었다. 상기 서열화는 높은 정성 데이터 및 GC 함유량의 범위의 전반에 걸친 적용범위에서 편향되어 있지 않은 것을 설명한다.
실시예 12
TP53 유전자의 광범위한 적용범위와 결합된 종양학 핫스팟 패널
이론적 설명: 총 51의 앰플리콘이 TP53 유전자의 전체 코딩 영역뿐만 아니라 종약학에 있어서의 임상적으로 작용 가능한 돌연변이를 나타내는 39의 핫스팟 좌위를 포함하도록 설계되었다.
이론적 설명: 이 앰플리콘 패널은 개시된 방법을 위한 컨셉의 증거를 제공하고, 51의 앰플리콘은 반응을 지배하는 최소-앰플리콘의 부재뿐만 아니라 제한된 다중 사이클수를 이용하여 달성될 수 있는 앰플리콘 사이의 적용범위의 균일성을 설명하기 위해 현저한 중복을 갖는다. 또한, 목적의 리드에 대한 높은 백분율은 프라이머 다이머 및 비특이적 오프 표적 증폭 생산물이 서열화된 라이브러리에 나타나지 않기 때문에 프라이밍의 특이성을 설명한다.
재료:
· 인간 합맵 유전체 DNA(Coriell Institute, NA12878)
· 카파 하이파이 핫스타트 우라실+ 레디믹스(카파 Biosystems, 제품번호 KK2802)
· 102 표적-특이적 프라이머(표 2)
· 3' 어댑터 올리고뉴클레오티드 절삭된 서열 및 절단 가능한 염기를 함유하는 범용의 프라이머 14-882(표 2)
· E. coli DNA 리가아제 버퍼(Enzymatics, 제품번호 B6090)
· 어댑터 결찰 단계를 위한 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드(14-571)
· 어댑터 결찰 단계를 위한 5' 부문의 3' 어댑터 올리고뉴클레오티드(14-877)
· 어댑터 결찰 단계를 위한 링커 올리고뉴클레오티드14-382(표 2)
· E. coli DNA 리가아제(Enzymatics, 제품번호 L6090L)
· 우라실-DNA 글리코실라아제(Enzymatics, 제품번호 G5010L)
· 엔도뉴클레아제 VIII(Enzymatics, 제품번호 Y9080L)
· TAQ-B DNA 폴리머라아제(Enzymatics, 제품번호 P7250L)
· SPRIselect(Beckman coμlter, 제품번호 B23419)
· 정제 단계를 위한 20% PEG-8000/2.5M NaCl 용액
방법:
인간 유전체 DNA는 DNA 현탁 버퍼(Teknova, 제품번호 T0227)에 2ng/μl의 농도로 희석되었다. DNA는 2분 동안의 볼텍싱에 의해 약간 전단되었다. 이 전단된 유전체 DNA의 10ng은 라이브러리를 조제하기 위해 사용되었다. 제 1 반응의 증폭은 최종 농도 1x 카파 하이파이 핫스타트 우라실+레디믹스, 10ng의 전단된 인간 유전체 DNA, 300피코몰의 범용의 프라이머, 및 다른 비율로 존재하는 최종 농도 102 표적-특이적 프라이머의 믹스의 0.85uM를 포함하는 30μl의 최종 체적으로 조합되었다. 이하의 사이클링 프로그램은 이 반응 상에서 실행된다: 표적-특이적 앰플리콘을 생성하기 위해 95℃에서 3분 후 98℃에서 20초의 4사이클, 63℃에서 5분 및 72℃에서 1분, 그리고 표적-특이적 앰플리콘의 복수의 복제본을 생성하기 위해 98℃에서 20초의 23사이클 및 64℃에서 1분으로 종료한다. 체적을 50μl로 조정한 후, DNA 생산물은 60μl의 SPRIselect 비드(비 1.2x)를 이용하여 정제되었다. 상기 비즈는 1x E.coli 리가아제 버퍼, 100피코몰의 링커 올리고뉴클레오티드, 10유닛의 E.coli 리가아제, 10유닛의 엔도뉴클레아제 VIII, 2유닛의 우라실-DNA 글리코실라아제, 20유닛의 TAQ-B DNA 폴리머라아제, 100피코몰의 5' 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 3' 어댑터 올리고뉴클레오티드의 5' 부위의 100피코몰을 함유하는 50μl의 1x 반응 믹스로 재현탁되었다. 반응액은 37℃에서 10분 동안 배양되었고, 이어서 42.5μl의 20% PEG-8000/2.5M NaCl 용액(비 0.85x)을 첨가함으로써 정제되었다. DNA는 20μl에서 용출되었고, 카파 라이브러리 정량 키트-일루미나/유니버셜(제품번호 KK4824)을 이용하여 qPCR에 의해 정량되었다. DNA는 최종 농도 0.1mM의 소듐 히드록시드로 5분 동안 변성되었고, 600μl의 10pM 라이브러리는 MiSeq(일루미나) 상에 로딩되었다.
결과:
qPCR에 의해 정량된 라이브러리 농도는 19.1nM이었다. 101 염기의 쌍을 이룬 말단 리드는 일루미나 MiSeq의 v2 케미스트리에 의해 생성되었다. 데이터 데이터 분석 전에, 리드 1 및 리드 2의 양쪽 5' 말단로부터의 서열-특이적 트리밍은 Cutadapt 프로그램을 이용하여 합성 프라이머 서열을 제거하기 위해 행해진다. 쌍을 이룬 배열은 표적의 영역과 정렬되는 98%의 예외적인 정성 데이터를 나타내는 BWA-MEM 툴을 이용하여 인간 게놈 및 목적의 영역으로 리드된다. 또한, 적용범위 데이터는 BED 툴을 이용하여 얻어졌다. 적용범위 균일성은 51 앰플리콘이 각각 최종 라이브러리에 나타내어진 것을 100% 의미한다. 또한, 각각의 앰플리콘에 있어서의 각각의 개별적인 염기의 적용범위가 산출되었고, 염기 적용범위당 평균보다 20%의 높았고, 이것은 앰플리콘 중 어떤 것도 최종 생산물에 반영되지 않은 것을 의미한다. 도 45는 TP53 유전자의 코딩 엑손을 포함하는 중복하는 앰플리콘에 대해 얻어진 적용범위를 도시한다. 도 46은 VarScan 및 SAM 툴을 이용한 서열 분석에 의해 얻어진 18% 빈도수의 변형 호출을 도시한다.
결론:
표적 앰플리콘 라이브러리는 인간 유전체 DNA를 이용하여 제조되었다. 상기 서열화는 고정성의 데이터를 설명한다.
(표 1)
Figure pct00001
*: 포스포로티오에이트화 DNA 염기
/5SpC3/: 5' C3 스페이서(IDT)
/3SpC3/: 3' C3 스페이서(IDT)
/5PHOS/: 5' 인산화(IDT)
/3PHOS/: 3' 인산화(IDT)
/5FAM/: 5' 6-카르복시플루오레신(IDT)
/3FAM/: 3' 6-카르복시플루오레신(IDT)
ddT: 2',3'- Di데옥시티미딘(TriLink)
(표 2. 실시예 12에서 사용된 올리고뉴클레오티드)
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
*: 포스포로티오에이트화 DNA 염기(IDT)
/3PHOS/: 3' 인산화(IDT)
선행되는 발명은 이하의 열거된 단란에서 제공된 바와 같이, 본 발명의 각종 양태 및 실시형태의 이하의 설명에 의해 보충된다.
1. (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 기질 분자의 3' 말단에 제 1 폴리뉴클레오티드를 결찰하고,
(ii) 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 제 1 폴리뉴클레오티드에 제 2 폴리뉴클레오티드를 어닐링하고,
(iii) 상기 기질 분자의 상기 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제하고, 이어서
(iv) 상기 처리된 기질 분자를 생산하기 위해 이중 가닥의기질 분자의 상기 5' 말단에 상기 제 2 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계를 포함하는, 처리된 기질 분자의 생산 방법.
2. 단락 1에 있어서,
(i) 단계 전에, 포스파타아제 효소와 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
3. 단락 2에 있어서,
3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 효소와 기질 분자를 접촉시킴으로써 상기 기질 분자를 블런트-말단화하는 단계를 더 포함하는 방법.
4. 단락 3에 있어서,
기질 분자의 3' 말단을 아데닐화하기 위해 주형-독립 폴리머라아제와 상기 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 하나에 있어서,
기질 분자는 천연이거나 합성인 방법.
6. 단락 5에 있어서,
상기 기질 분자는 천연인 방법.
7. 단락 6에 있어서,
상기 기질 분자는 유전체 DNA인 방법.
8. 단락 7에 있어서,
상기 유전체 DNA는 진핵 또는 원핵인 방법.
9. 단락 7 또는 단락 8에 있어서,
상기 유전체 DNA는 시험관 내 또는 생체 내에서 단편화되는 방법.
10. 단락 9에 있어서,
시험관 내 단편화 단계는 전단, 엔도뉴클레아제를 이용한 절단, 초음파 분쇄, 가열, 알파, 베타 또는 감마원을 이용한 조사, 금속 이온의 존재 하에서의 화학적 절단, 라디칼 절단, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 행해지는 방법.
11. 단락 9에 있어서,
생체 내 단편화 단계는 세포사멸, 방사선, 및 석면에의 노출로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 발생되는 방법.
12. 단락 5에 있어서,
상기 기질 분자는 합성물질이고, cDNA, 전체 게놈 증폭에 의해 생산되는 DNA, 적어도 하나의 이중-가닥의 말단을 포함하는 프라이머 신장 생산물, 및 PCR 앰플리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
13. 단락 1 내지 단락 12 중 어느 하나에 있어서,
상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 이중 가닥이고, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2를 포함하는 방법.
14. 단락 13에 있어서,
상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 1에 어닐링하는 방법.
15. 단락 14에 있어서,
상기 어닐링 단계는 제 2 폴리뉴클레오티드와 기질 분자 사이에 틈, 갭 또는 중복 염기를 야기하는 방법.
16. 단락 14 또는 단락 15에 있어서,
상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 2의 분해를 야기하는 폴리머라아제와 접촉되는 방법.
15. 단락 13 내지 단락 16 중 어느 하나에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드 2는 분해되기 쉬운 염기를 포함하는 방법.
16. 단락 13 내지 단락 17 중 어느 하나에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드 2는 그것의 3' 말단에 결찰을 방지하는 블로킹기를 포함하는 방법.
17. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 수식된 염기를 포함하는 방법.
18. 단락 14에 있어서,
상기 어닐링 단계는 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2의 탈혼성화를 야기하는 방법.
19. 단락 1 내지 단락 18 중 어느 하나에 있어서,
(i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 추가적인 기질 분자의 3' 말단에 제 3 폴리뉴클레오티드를 결찰하고,
(ii) 상기 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 제 3 폴리뉴클레오티드에 제 4 폴리뉴클레오티드를 어닐링하고,
(iii) 상기 추가적인 기질 분자의 상기 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제하고, 이어서
(iv) 처리된 추가적인 기질 분자를 생산하기 위해 이중가닥의 추가적인 기질 분자의 상기 5' 말단에 제 4 폴리뉴클레오티드를 결찰하는 단계를 더 포함하는 방법.
20. 단락 19에 있어서,
상기 제 1 폴리뉴클레오티드와 제 3 폴리뉴클레오티드는 동일한 방법.
21. 단락 19 또는 단락 20에 있어서,
상기 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 4 폴리뉴클레오티드는 동일한 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Makarov, et al. <120> Improved methods for processing DNA substrates <130> 31595/47999A <150> US 61/934515 <151> 2014-01-31 <150> US 62/078309 <151> 2014-11-11 <160> 127 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> 3' C3 spacer (IDT) <400> 2 agatcggaag agcgtcgtgt ag 22 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Phosphorylation (IDT) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> 3' C3 spacer (IDT) <400> 3 agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgtagatctc ggtggtcgcc gtatcatt 58 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 3'- Dideoxythymidine (TriLink) <400> 4 acacgacgct cttccgatc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> 3' Phosphorylation (IDT) <400> 5 acacgacgct cttccgatct 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Phosphorylation (IDT) <400> 6 tgtacctcac ttctcatcac tgct 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 agcagtgatg agaagtgagg taca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Phosphorylation (IDT) <400> 8 tgtacctcac ttctcatcac tgct 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' 6-carboxyfluorescein (IDT) <400> 9 agcagtgatg agaagtgagg taca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 tgtacctcac ttctcatcac tgct 24 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> 3' 6-carboxyfluorescein (IDT) <400> 12 tgtacctcac ttctcatcac tgctgtcatc cgat 34 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> 3' C3 spacer (IDT) <400> 13 agcagtgatg agaagtgagg tacaagatcg gaagagcgtc gtgtag 46 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctt 33 <210> 15 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atctt 65 <210> 16 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C3 spacer (IDT) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Phosphorothioated base <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Phosphorothioated base <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atctn 65 <210> 17 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Phosphorylation (IDT) <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> Phosphorothioated base <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Phosphorothioated base <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> 3' C3 spacer (IDT) <400> 17 agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacatcacg atctcgtatg ccgtcttctg 60 cttg 64 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> 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<222> (40)..(40) <223> Phosphorothioated DNA bases (IDT) <400> 112 tcagacgtgt gctcttccga tctctggacc aagcccatca c 41 <210> 113 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> Phosphorothioated DNA bases (IDT) <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Phosphorothioated DNA bases (IDT) <400> 113 tcagacgtgt gctcttccga tcttgtggcc ttgtactgca ga 42 <210> 114 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Phosphorothioated DNA bases (IDT) <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Phosphorothioated DNA bases (IDT) <400> 114 tcagacgtgt gctcttccga tctcagtgtg ttcacagaga cctg 44 <210> 115 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Phosphorothioated DNA bases (IDT) <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Phosphorothioated DNA 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Claims (55)

  1. 리가아제, 및 적어도 부분적으로 이중 가닥이고 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2를 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 올리고뉴클레오티드 1은 5' 포스페이트 및 그것의 3' 말단에 블로킹기를 포함하고, 또한
    상기 올리고뉴클레오티드 2는 (i) 분해되기 쉬운 염기를 포함하고, 및/또는 (ii) 비변성 가열 조건에 의해 치환될 수 있고, 그것의 3' 말단에 블로킹기를 더 포함하고, 상기 블로킹기는 상기 3' 말단의 결찰을 방지하지만 상기 올리고뉴클레오티드 1의 5' 말단의 결찰을 가능하게 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 2의 3' 블로킹기는 3' 데옥시티미딘, 3' 데옥시아데닌, 3' 데옥시구아닌, 3' 데옥시사이토신 또는 디데옥시뉴클레오티드인 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 분해되기 쉬운 염기는 데옥시우리딘, 리보뉴클레오티드, 데옥시이노신, 또는 이노신인 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비변성 가열 조건은 약 50℃~약 85℃인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 2는 상기 올리고뉴클레오티드 2의 결합 안정성을 감소시키는 염기 수식을 포함하고, 상기 염기 수식은 데옥시이노신, 이노신 또는 범용의 염기인 조성물.
  6. 제 1 항에 기재된 조성물과 이중 가닥의 기질의 배양으로부터 얻어지는 결찰 생산물,
    리가아제,
    틈 번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제,
    분해되기 쉬운 염기를 인식하는 엔도뉴클레아제, 및
    단일 가닥이고, 폴리뉴클레오티드 1의 올리고뉴클레오티드 2가 분해되거나 치환될 때의 적절한 조건 하에서 어닐링되도록 폴리뉴클레오티드 2의 올리고뉴클레오티드 1의 5' 부위와 충분하게 상보하는 3' 도메인을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 폴리뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 2를 치환하기에 충분한 길이이거나, 또는 그것의 결합 안정성을 증가시키는 염기 수식을 포함하는 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제는 UDG+엔도뉴클레아제 VIII, RN아제 HI, RN아제 H2 및 엔도뉴클레아제 V로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 리가아제는 E. coli DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제인 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서,
    결합 안정성을 증가시키는 상기 염기 수식은 잠금 핵산(LNA)인 조성물.
  11. 제 1 항에 기재된 조성물과 이중 가닥의 기질의 배양으로부터 얻어지는 결찰 생산물,
    리가아제,
    플랩 엔도뉴클레아제,
    분해되기 쉬운 염기를 인식하는 엔도뉴클레아제,
    폴리뉴클레오티드 1의 올리고뉴클레오티드 2가 분해되거나 치환될 때의 적절한 조건 하에서 어닐링되도록 폴리뉴클레오티드 2의 올리고뉴클레오티드 1의 5' 부위와 충분하게 상보하는 3' 도메인을 포함하는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 폴리뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 2를 치환하기에 충분한 길이이거나, 또는 결합 안정성을 증가시키는 염기 수식을 포함하고, 또한
    3' 말단의 퇴화 염기를 더 포함하는 조성물.
  12. (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 기질 분자의 3' 말단에 제 1 폴리뉴클레오티드를 결찰하고,
    (ii) 상기 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드에 제 2 폴리뉴클레오티드를 어닐링하고,
    (iii) 상기 기질 분자의 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제한 후, 이어서
    (iv) 상기 이중 가닥의 기질 분자의 5' 말단에 상기 제 2 폴리뉴클레오티드를 결찰하여 처리된 기질 분자를 생산하는 단계를 포함하는, 처리된 기질 분자의 생산 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    단계 (i) 전에, 포스파타아제 효소와 상기 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 포스파타아제 효소는 송아지 소장 유래 포스파타아제 또는 새우 유래 포스파타아제인 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제 효소와 상기 기질 분자를 접촉시킴으로써 상기 기질 분자를 블런트-말단화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 폴리머라아제 효소는 T4 DNA 리가아제, 클레나우 단편, T7 폴리머라아제, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 기질 분자의 상기 3' 말단을 아데닐화하도록 주형-독립 폴리머라아제와 상기 기질 분자를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기질 분자는 천연이거나 합성인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 기질 분자는 천연인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 기질 분자는 유전체 DNA인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 유전체 DNA는 진핵 또는 원핵인 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 유전체 DNA는 시험관 내 또는 생체 내에서 단편화되는 방법.
  23. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 기질 분자는 순환 무세포 DNA인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    단계 (i) 전에, 온도를 약 50℃~약 85℃로 조정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 온도는 65℃인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서,
    상기 시험관 내 단편화 단계는 전단, 엔도뉴클레아제에 의한 절단, 초음파 분해, 가열, 알파, 베타, 또는 감마원을 이용한 조사, 금속 이온의 존재 하에서의 화학적 절단, 라디칼 절단, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 행해지는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서,
    상기 생체 내 단편화 단계는 세포사멸, 방사선, 및 석면에 대한 노출로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 발생되는 방법.
  28. 제 18 항에 있어서,
    상기 기질 분자는 합성이고, cDNA, 전체 게놈 증폭에 의해 생산된 DNA, 적어도 하나의 이중 가닥의 말단을 포함하는 프라이머 신장 생산물, 및 PCR 앰플리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  29. 제 12 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 이중 가닥이고, 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 1에 어닐링하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 어닐링 단계는 상기 제 2 폴리뉴클레오티드와 상기 기질 분자 사이에 틈, 갭, 또는 중복 염기를 야기하는 방법.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 2의 분해를 야기하는 폴리머라아제와 접촉되는 방법.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 2는 분해되기 쉬운 염기를 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 분해되기 쉬운 염기는 데옥시우리딘, RNA, 데옥시이노신, 및 이노신으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  35. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 2는 그것의 3' 말단에 결찰을 방지하는 블로킹기를 포함하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 블로킹기는 3' 데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시뉴클레오티드인 방법.
  37. 제 12 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 수식된 염기를 포함하는 방법.
  38. 제 30 항에 있어서,
    상기 어닐링 단계는 올리고뉴클레오티드 1 및 올리고뉴클레오티드 2의 탈혼성화를 야기하는 방법.
  39. 제 12 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 적어도 부분적으로 이중 가닥인 추가적인 기질 분자의 3' 말단에 제 3 폴리뉴클레오티드를 결찰하고,
    (ii) 상기 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 상기 제 3 폴리뉴클레오티드에 제 4 폴리뉴클레오티드를 어닐링하고,
    (iii) 상기 추가적인 기질 분자의 5' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드를 절제한 후, 이어서
    (iv) 상기 이중 가닥의 추가적인 기질 분자의 상기 5' 말단에 상기 제 4 폴리뉴클레오티드를 결찰하여 처리된 추가적인 기질 분자를 생산하는 단계를 더 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 제 1 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 3 폴리뉴클레오티드는 동일한 방법.
  41. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서,
    상기 제 2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 4 폴리뉴클레오티드는 동일한 방법.
  42. 범용의 프라이머 및 복수의 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 포함하는 조성물로서,
    상기 복수의 프라이머 쌍의 표적-특이적 프라이머는 각각 표적-특이적 서열및 표적 기질 분자와 상보하지 않는 5' 말단의 서열을 포함하고,
    상기 범용의 프라이머는 상기 5' 말단의 서열 및 절단 가능한 염기 또는 뉴클레아제 저항성 수식을 포함하고,
    상기 복수의 프라이머 쌍의 각각의 표적-특이적 프라이머 및 상기 범용의 프라이머는 각각 그들의 3' 말단에 뉴클레아제 저항성 수식, 및
    상기 범용의 프라이머에 병합되는 상기 절단 가능한 염기에 내성이 있는 고충실도 폴리머라아제를 포함하고,
    상기 표적-특이적 프라이머 쌍 및 상기 범용의 프라이머는 동일한 온도에서 그들의 표적 기질 분자에 어닐링하고, 또한
    상기 표적-특이적 프라이머와 상기 범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:100인 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 절단 가능한 염기는 데옥시우리딘, RNA, 데옥시이노신, 또는 이노신인 조성물.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서,
    상기 뉴클레아제 저항성 수식은 포스포로티오에이트인 조성물.
  45. 제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 표적-특이적 프라이머는 상기 표적-특이적 서열과 상기 5' 말단의 서열 사이에 분자 식별 태그를 더 포함하는 조성물.
  46. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적-특이적 프라이머와 범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:200이거나, 적어도 약 1:300이거나, 적어도 약 1:400이거나, 적어도 약 1:500이거나, 적어도 약 1:1000이거나, 적어도 약 1:2000이거나, 적어도 약 1:3000이거나, 적어도 약 1:5000이거나, 적어도 약 1:10000 이상인 조성물.
  47. 제 42 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질 분자를 더 포함하는 조성물.
  48. 범용의 프라이머에 의해 생성되는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 생산물로서, 상기 범용의 프라이머에 의해 병합되는 적어도 하나의 절단 가능한 염기를 포함하는 생산물,
    상기 절단 가능한 염기를 절단할 수 있는 엔도뉴클레아제,
    (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드 및 틈 번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 또는 (ii) 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소,
    DNA 리가아제,
    (i) 상기 범용의 프라이머의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 노출되는 상기 범용의 프라이머의 상기 역상보의 5' 부위와 상보하는 3' 서열 및 (ii) 상기 범용의 프라이머의 역상보와 상보하지 않은 5' 부위를 포함하는 5' 어댑터를 포함하는 조성물로서,
    상기 범용의 프라이머의 역상보의 3' 부위는 부분적으로 이중 가닥의 절삭된 3' 어댑터에 어닐링하는 조성물.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제는 UDG+엔도뉴클레아제 VIII, RN아제 HI, RN아제 H2, 및 엔도뉴클레아제 V로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  50. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서,
    상기 DNA 리가아제는 E. coli DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제인 조성물.
  51. 범용의 프라이머에 의해 생성되는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 생산물로서, 상기 범용의 프라이머에 의해 병합되는 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 수식을 포함하는 생산물,
    상기 뉴클레아제 저항성 수식 이상으로 상기 PCR 생산물을 소화시킬 수 없는 5' 엑소뉴클레아제,
    (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드 및 틈 번역 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 또는 (ii) 플랩 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소,
    DNA 리가아제,
    (i) 상기 범용의 프라이머의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 노출되는 상기 범용의 프라이머의 상기 역상보의 5' 부위와 상보하는 3' 서열 및 (ii) 상기 범용의 프라이머의 역상보와 상보하지 않는 5' 부위를 포함하는 5' 어댑터를 포함하는 조성물로서,
    상기 범용의 프라이머의 역상보의 3' 부위는 부분적으로 이중 가닥의 절삭된 3' 어댑터 분자에 어닐링하는 조성물.
  52. (i) 각각의 프라이머가 상기 기질 분자와 상보하지 않고, 얻어진 앰플리콘의 말단에 단일의 범용의 어댑터를 병합하는 5' 서열을 포함하는 표적-특이적 프라이머 쌍, 및
    (ii) 상기 단일의 범용의 어댑터 서열 및 추가적으로 절단 가능한 염기 또는 뉴클레아제 저항성 수식을 포함하는 단일 프라이머와 기질 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 방법으로서,
    PCR의 각각의 사이클에 대해 일정한 어닐링 온도를 이용하지만, 상기 어닐링 시간을 변경할 수 있는 적절한 반응 조건 하에서, 고충실도 DNA 폴리머라아제 및 뉴클레오티드의 존재 하에, 각각의 표적-특이적 프라이머:범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:100이고, 표적-특이적 앰플리콘은 5분 이상의 어닐링 시간을 갖는 초기 2회 이상의 PCR 사이클 동안에 생성되고, 그 다음에 각각 1분 이하의 어닐링 시간을 포함하는 나머지 PCR 사이클 동안에 얻어진 앰플리콘의 증폭이 이어지고, 더욱 높은 농도의 단일의 범용의 프라이머에 의해 상기 표적-특이적 앰플리콘의 증폭이 달성되는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)의 방법.
  53. (i) 각각의 프라이머가 상기 기질과 상보하지 않고, 얻어진 앰플리콘의 상기 말단에 단일의 범용의 어댑터를 포함하는 5' 서열을 포함하는 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍, 및
    (ii) 상기 단일의 범용의 어댑터 서열, 및 추가적으로 절단 가능한 염기 또는 뉴클레아제 저항성 수식을 포함하는 단일 프라이머와 기질 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 다중 PCR의 방법으로서,
    각각의 PCR 사이클에 대해 일정한 어닐링 온도를 이용하지만, 어닐링 시간을 변경시킬 수 있는 적절한 반응 조건 하에서, 고충실도 DNA 폴리머라아제 및 뉴클레오티드의 존재 하에, 각각의 표적-특이적 프라이머:범용의 프라이머의 몰비는 적어도 약 1:100이고, 표적-특이적 앰플리콘은 5분 이상의 어닐링 시간을 갖는 초기 2회 이상의 PCR 사이클 동안에 생성되고, 그 다음에 각각 1분 이하의 어닐링 시간을 포함하는 나머지 PCR 사이클 동안에 얻어진 앰플리콘의 증폭이 이어지고, 더욱 높은 농도의 단일의 범용의 프라이머에 의해 상기 표적-특이적 앰플리콘의 다중 증폭이 달성되는 다중 PCR의 방법.
  54. 각각의 말단에 단일의 범용의 어댑터 서열을 포함하는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 생산물을 각각의 말단에 비대칭의 5' 및 3' 어댑터를 포함하는 생산물로 전환하는 방법으로서,
    (a) 절단 가능한 염기 또는 뉴클레아제 저항성 수식 중 어느 하나가 도입된 상기 PCR 생산물의 상기 5' 말단을 소화하고, 이어서
    (b) 어닐링하고, (i) 틈-번역 결찰 또는 (ii) 상기 소화에 의해 노출된 상기 범용의 어댑터의 역상보의 5' 부위와 상보하는 5' 어댑터의 플랩 엔도뉴클레아제 절단 결찰하고, 및
    (c) 부분적으로 이중 가닥의 절삭된 3' 어댑터가 상기 범용의 어댑터의 역상보의 3' 부위에 어닐링 및 결찰됨으로써 상기 PCR 생산물을 각각의 말단에 비대칭의 어댑터를 포함하는 생산물로 전환하는 단계를 포함하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    상기 PCR 생산물은 전체 게놈 증폭(WGA) 생산물인 방법.
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