WO2007074929A1 - 生物由来の被験試料の画像を取得する装置及び方法 - Google Patents

生物由来の被験試料の画像を取得する装置及び方法 Download PDF

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WO2007074929A1
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image
test sample
microscope
light
illumination
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PCT/JP2006/326342
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Inventor
Ryutaro Akiyoshi
Hirobumi Suzuki
Morinao Fukuoka
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Olympus Corporation
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/0088—Inverse microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a method and apparatus for imaging faint light emitted from a biological test sample, for example, a cell, bacteria, or other biological sample. More specifically, the present invention relates to imaging by measuring faint light due to a bioluminescence phenomenon. The present invention relates to a method and apparatus for observing a sample or performing various measurements. Background art
  • a fluorescent or luminescent protein can be expressed in a cell in a fused state with another specific protein (protein marking), or a gene encoding a fluorescent or luminescent protein can be expressed in the regulatory region of a particular gene. It can be inserted or replaced downstream so that it can be expressed only when that particular gene regulatory region is activated. Therefore, in various life phenomena occurring inside and outside the cell, the fluorescent protein or the fluorescent protein is expressed in accordance with the expression of the protein of interest or the activation of the gene region of interest. As a reporter molecule or probe molecule to observe or detect when or how a protein or gene region expressed or how a protein expressed inside or outside a cell behaves An attempt has been made.
  • Fluorescent proteins such as GFP are relatively stable in cells, and the fluorescence emitted from the proteins is bright, so they have already been used extensively to image intracellular structures stably and easily. While some (e.g., Mason, "fluorescence-emitting probe for biological activity” (Mason (1999), fluorescent and luminescent probes lor biological activity, Second edition).) a while Noreshifefu - the If any chemiluminescent or bioluminescent Photoproteins that emit light due to the phenomenon During observations, it does not require excitation light to excite the fluorescent dye (which can often damage cells or other biological samples), so that biological samples can be imaged without damage to them. It is expected as one of the probes to do this.
  • the fluorescence of the fluorescent protein is relatively bright as described above. It is possible to obtain a relatively clear image using an optical microscope and an imaging system.
  • the luminescence intensity of photoproteins from cells or other biological samples (hereinafter referred to as “cells”) is generally extremely weak, and a camera or an imaging device for photographing a normal microscopic image is generally used. It is quite difficult to take a microscopic image (in fact, the luminescence of a photoprotein is usually not visible with the naked eye from an eyepiece under an optical microscope). Therefore, in the imaging of photoproteins in the conventional technology, it is extremely expensive for an optical microscope.
  • Sensitivity cameras such as photo counting cameras, are used with systems that are equipped with specialized cameras or photographic devices to detect faint light (however, even with such ultra-high sensitivity cameras, one image is generated. Until then, it is necessary to integrate the light from the sample on the light-receiving surface of the camera for at least several minutes to several tens of minutes.)
  • the light that appears in the microscope image is only light emitted from protein in principle, so that the state of the region in the test sample where no protein exists or The morphology cannot be observed.
  • the fluorescence of the fluorescent protein is relatively bright, and self-fluorescence is emitted from substances other than the fluorescent protein inside the cell, etc. by applying excitation light. In some cases, the morphology or state of cells and the like can be observed.
  • the light from the sample such as luminescence from photoproteins, is so weak that an image cannot be generated unless it is accumulated for several minutes to several tens of minutes.
  • the position, shape, or change of cells in the test sample can hardly be grasped (it is unknown whether there are cells where light does not come). ).
  • the luminescence intensity may change, the cell may move or deform, and which cell emits light. It is extremely difficult to specify which part of the cell is emitting light. For example, in a certain neuron, it was very difficult to analyze changes in the cytoplasm and neurite emission phenomenon.
  • transmitted light observation is used together to observe the position and shape of cells and the like when luminescent observation of a photoprotein is performed. Since the amount of received light differs significantly between transmitted light observation and light emission observation, a camera different from the light emission observation camera is used for transmitted light observation (the actual lens may differ). ), A luminescent image (an image of photoprotein) and an illumination image (an image of transmitted light) are generated by separate cameras. That is, a microscopic image representing the morphology of cells and a microscopic image representing the distribution of photoproteins are present on separate images, so that the actual fraction of photoprotein in the test sample can be obtained.
  • one object of the present invention is to identify the light emitting sites of cells or cell ridges that emit light in the imaging of cells or other biological samples by weak light generated by the above-mentioned bioluminescence phenomenon. It is to provide an apparatus or method for acquiring a luminescent image of a cell or the like in a possible manner.
  • Another object of the present invention is to provide an apparatus or method for obtaining data from the region specified in the apparatus or method as described above and using it for analysis of various intracellular phenomena. Is to provide.
  • an apparatus that acquires an image of a biological test sample using an optical imaging device includes an illumination unit that illuminates the test sample, and an illumination image that acquires an illumination image of the test sample. Acquisition unit and emission image acquisition to acquire emission images of cells in the test sample And an image processing unit that generates a superimposed image by superimposing an illumination image and a light-emitting image, and specifies an analysis region in the superimposed image.
  • the optical imaging device may be an optical microscope.
  • the illumination image is a transmitted light microscope image obtained by observing the transmitted light in the optical microscope using the illumination light of the illumination unit
  • the luminescent image is the luminescence in the cell in the optical microscope.
  • the illumination image acquisition unit and the light emission image acquisition unit include a common microscope image capturing device, and the transmitted light microscope image and the light emission microscope image are captured by the common microscope image capturing device.
  • the luminescence image obtained by observing the luminescence phenomenon of the cells in the test sample is obtained by illuminating the test sample with the illumination unit, and the morphology or state of the cells in the test sample is observed.
  • the illumination image that can be generated By superimposing it with the illumination image that can be generated, the position of the luminescent site of the cell on the luminescent image in the test sample or in the cell can be identified more accurately than before.
  • an illumination image transmission light microscope image
  • a light emission image light emission microscope image
  • the transmitted light microscope image and the light emission microscope image to be superimposed are preferably photographed by a common microscope image photographing device.
  • a common microscope image photographing device in an optical microscope, an objective lens and a lens assembly for forming an image of a test sample on a light receiving surface of a microscope image photographing device, a test on the light receiving surface. If the square of the numerical aperture (NA) of the objective lens to the projection magnification (/ 3) of the sample image (NA + / 3) is greater than or equal to 0.01, the light emitted from a single cell It has been proved that an image can be generated by a photographing device such as a CCD camera (see Japanese Patent Application No.
  • this imaging condition has the potential to be applied to any biological sample that has previously been difficult to image, and cannot be directly observed with the naked eye under an optical microscope such as bioluminescence. It was found that even with such a weak luminescent component, an image of a cell or the like can be taken in a short time (for example, within 20 minutes). Also, further, according to the optical conditions that inventor has pursued, an optical condition represented the objective lens of the imaging device by the square of the numerical aperture (NA) / / projection magnification (beta) to zero.
  • NA numerical aperture
  • beta projection magnification
  • the square value of (NA ⁇ i3) is preferably not less than 0.01, more preferably not less than 0.071.
  • a fluorescence image acquisition unit for acquiring a fluorescence image of a cell may be further provided.
  • the fluorescence image is a fluorescence microscope image obtained by observing fluorescence of the test sample in the optical microscope.
  • the fluorescence microscope image and the light emission microscope image may be photographed by a common microscope image photographing device.
  • fluorescent dyes that are sensitive to various environmental conditions such as pH sensitive, Ca concentration sensitive, membrane potential sensitive dyes, are used.
  • the apparatus of the present invention is provided with a display unit for displaying a superimposed image so that the user can easily visually observe the luminescent site in the test sample or cell on the display unit. It ’s okay.
  • the apparatus of the present invention may be provided with a recording unit for recording superimposed images.
  • the photoprotein gene is luminescent. Introduced into the cell so that the protein is expressed in a fused state with the desired protein (to be measured), or inserted or replaced downstream of the regulatory region of the gene.
  • the photoprotein expressed in this way is used as a reporter molecule for searching when and where the desired protein to be measured is expressed.
  • proteins reported by photoproteins are often expressed when cells undergo various stimuli. Therefore, in the embodiment of the apparatus of the present invention, a cell stimulation supply unit that applies arbitrary stimulation to the cells may be provided.
  • the cell stimulation supply unit is, for example, at least selected from the group consisting of a reagent supply unit that supplies reagents to cells, a temperature adjustment unit that adjusts the temperature of a test sample, and a gas supply unit that supplies gas to cells. Both may be one.
  • the apparatus includes an optical microscope, a microscope image photographing device that photographs a microscope image observed by the optical microscope, and image processing that captures the microscope image as image data.
  • An image processing apparatus for acquiring an image of an organism-derived test sample including an image processing apparatus for performing observation of transmitted light on the test sample in an optical microscope.
  • the transmitted light image obtained by photographing with the image photographing device is superimposed on the light emitting image obtained by photographing the light emitted by the light emission phenomenon in the cells in the test sample with the optical microscope with the microscopic image photographing device.
  • the apparatus may include an image superimposing unit that generates a superimposed image and an image region designation unit that designates an analysis region in the superimposed image.
  • the microscope image photographing device has a light receiving surface
  • the optical microscope includes an objective lens and a lens assembly for forming an image of the test sample on the light receiving surface of the microscope image photographing device.
  • the optical system of the optical microscope is configured such that the square value of the ratio of the numerical aperture of the objective lens to the projection magnification of the image of the test sample on the light receiving surface is not less than 0.01.
  • a method of acquiring an image of a biological test sample using an optical imaging apparatus the method of illuminating a test sample and acquiring an illumination image, and the test sample
  • an image in which the illumination image and the luminescence image are superimposed is generated, and thereby, in the cell or the test sample that appears in the illumination image.
  • the method of the present invention can be executed using the above-described apparatus of the present invention, but may be executed using any other apparatus. Further, in the method of the present invention described above, a process of acquiring a fluorescence image of cells in the test sample in addition to the luminescence image and the illumination image may be performed. This makes it possible to correlate the light emission phenomenon with information obtained by fluorescence while grasping the site where the light emission phenomenon occurs in the cell or the test sample.
  • the optical imaging apparatus may be an optical microscope.
  • the illumination image is observed through the transmitted light in the optical microscope.
  • the luminescence image is a luminescence microscope image obtained by observing the luminescence phenomenon in the cell of the test sample in the optical microscope, and the transmission light microscope image and the luminescence microscope image are common. It is preferable to be photographed by a microscopic image photographing apparatus.
  • the objective lens and the lens assembly for forming an image of the test sample on the light receiving surface of the microscope image capturing apparatus are provided for the projection magnification of the image of the test sample on the light receiving surface. It may be configured such that the square value of the numerical aperture ratio of the objective lens is not less than 0.01.
  • the process of illuminating the test sample and acquiring the illumination image is executed a plurality of times, for example, when photographing the luminescence phenomenon over a long period of time, and thereby the cells in the test sample, etc. Any change in the form of the image or movement of the position may be confirmed arbitrarily.
  • certain stimuli on cells such as drug stimuli, electrical stimuli, gas stimuli, and heat If the photoprotein gene incorporated into the intracellular gene is expressed by applying a stimulus, it is necessary for the cell to obtain an illumination image and a luminescent image (or in addition, a fluorescent image) prior to the process of acquiring the image.
  • a process of selectively providing at least one of the stimuli as listed above may be performed. In that case, preferably, for the purpose of confirming the state before stimulation, a process of obtaining an illumination image and a luminescence image may be performed prior to the process of stimulating the cells.
  • the user confirms the image or for the purpose of any processing executed later, the illumination image and the light emission image.
  • the process of displaying or recording the superimposed image with may be performed.
  • an illumination image area corresponding to the analysis area, a light emission image area corresponding to the analysis area, and A process of displaying at least two of the fluorescence images corresponding to the analysis region (if there is also a fluorescence image) may be performed.
  • a process of measuring the light intensity in the area of the luminescent image corresponding to the analysis area and a process of displaying the change in the light intensity may be performed.
  • the light emitting cell and the non-light emitting cell can be respectively identified from the superimposed image of the illumination image and the light emission image, the number of cells in which light emission was observed and the light emission were observed. It is also possible to perform an arbitrary statistical analysis of the number of cells that were not obtained. In addition, it is much easier to observe the emission intensity over time focusing only on the cells that are emitting light. For example, even if cells move in the test sample during measurement, tracking the cells that emit light in the superimposed image of the illumination image and the light emission image It is possible.
  • the present invention can be said to increase the usefulness of photoproteins in imaging cells or other biological samples.
  • various experiments or measurement / analysis related to the expression of various proteins in cells using a photoprotein as a reporter molecule can be performed individually by imaging. It is expected to be able to execute while identifying cells.
  • Other objects and advantages of the present invention will be in part apparent and pointed out hereinafter. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing an outline of the configuration of the first embodiment of the apparatus for measuring weak light according to the present invention including an inverted optical microscope
  • FIG. 1B is a device for stimulating cells in a test sample.
  • FIG. 2 is a schematic view showing the periphery of the sample container in FIG.
  • Fig. 2A is a functional block diagram of the configuration of the computer 80 (image processing device) of the weak light measurement device
  • Fig. 2B is a schematic diagram of the operation panel connected to the computer 80. It is.
  • FIG. 3 shows the processing steps of the method for obtaining an image of a test sample derived from the organism of the present invention that can be executed using the apparatus for measuring weak light of the present invention in the form of a flow chart.
  • Fig. 4 is a diagram schematically showing periodic fluctuations in luminescence intensity observed in NIH 3 T 3 cells expressing a plasmid in which a luciferase gene is linked to an expression vector into which a clock gene has been introduced. . 2 In the time (a) when the light emission becomes extremely weak in a period of 4 hours, a light emission image cannot be obtained.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the configuration (optical system) of the second embodiment of the feeble light measurement apparatus of the present invention that simultaneously measures fluorescence and bioluminescence.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the configuration (optical system) of the third embodiment of the feeble light measurement apparatus according to the present invention that simultaneously measures fluorescence and bioluminescence and simultaneously enlarges an image by digital zoom and optical zoom.
  • FIG. 7 is assumed in a plasmid in which a luciferase gene is connected to an expression vector with a tetracycline 'operator (Tet 02) introduced into a He 1 a cell used as a test sample in Example 1. It is a figure explaining the state of a molecule.
  • Tet 02 tetracycline 'operator
  • FIG. 7A when T et R homodimer binds to the T et O 2 region, the luciferase gene connected to the T et O 2 region is not expressed, but gives the cell a tetracycline.
  • FIG. 7B the structure of the T et R homodimer changes, deviates from the Tet02 region, and luciferase is expressed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the addition timing of tetracycline and the exposure timing of the illumination image / luminescence image in Example 1.
  • Figure 9A is the illumination image acquired in Example 1
  • Figure 9B is the emission image acquired in Example 1
  • Figure 9C is the illumination image in Figure 9A and the emission image in Figure 9B.
  • a superimposed image (enlarged image in the frame of Fig. 9A) is shown.
  • the square frames indicated as RO I-1 and RO I _ 2 are areas designated as analysis areas.
  • FIG. 10 is a graph showing the change over time of the luminescence intensity (of HeLa cells) in the analysis region specified in FIG. 9C.
  • Fig. 1 1 A is the illumination image acquired in Example 2
  • Fig. 1 1 B is the luminescence image acquired in Example 2
  • Fig. 1 1 C is the same as the illumination image of Fig. 1 1 A.
  • Figure 11 shows an image that is a superimposition of the emission image of 1B.
  • the light emitting site is displayed in pseudo color in the actual device, but is shown in white in the figure.
  • FIG. 12 is a graph showing the variation with time of the light emission intensity of the light-emitting packet in the region P P-1 in FIG.
  • Fig. 1 3 A is the illumination image acquired in Example 3
  • Fig. 1 3 B is the emission image acquired in Example 3
  • Fig. 1 3 C is the same as the illumination image of Fig. 1 3 A.
  • Figure 13 shows an image with the 3 B emission image superimposed.
  • Figure 14 shows the movement of the light-emitting parameter with time change in Example 3. A superimposed image (left) and an illumination image (right) are shown.
  • FIG. 15 is a graph of the variation over time of the luminescence intensity of the luminescent bacteria (V. t.) In Example 3. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • FIG. 1A shows an apparatus for acquiring an image of a test sample derived from a living organism for imaging a cell or other biological sample by measuring the weak light generated by a bioluminescence phenomenon (hereinafter referred to as “low light measurement”).
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a first preferred embodiment of an “apparatus”.
  • the weak light measurement device of the present invention includes a light source 2, an illumination optical system 1 for guiding the light emitted from the light source 2 to parallel light, and guiding it to the test sample 4, and an image of the test sample 4.
  • An inverted microscope including an observation optical system 5 for generating the eyepiece, an eyepiece 6 for magnifying and visually observing the image of the test sample 4, and an image sensor 7 for capturing a microscope image of the test sample 4
  • a CCD camera 8 an image acquisition unit or a microscope image capturing device
  • a computer 8 an image processing unit or an image processing device
  • TV monitor 3 7 to which a CCD camera 8 is connected by a signal cable 81.
  • the configuration of the above optical microscope may be a normal inverted microscope, and the illumination optical system 1 includes a collector lens 10 and a deflection for deflecting the optical axis 11 of the illumination light in order from the light source 2 side. Consists of mirror 1 2 and condenser lens 1 4.
  • the light source 2 may be an incoherent light source having a visible wavelength such as a halogen lamp, an LED light source, a tungsten lamp, or a mercury lamp. Note that the light of a coherent light source such as a laser may be changed to incoherent light using a diffuser plate or the like and used as a light source. As the wavelength of the light source, visible light is usually used, but infrared light may be used.
  • the observation optical system 5 is a pair for forming an image of the test sample 4 in order from the test sample 4 side.
  • the second relay lens 18 is used to form an image on the image plane.
  • switching between the second relay lens 18 and the imaging plane 19 is performed so that the image of the test sample 4 can be arbitrarily switched between visual observation by the eyepiece 6 and observation by the CCD camera 8.
  • a mirror 20 may be arranged. In addition to the mechanical switching type, the switching mirror 20 may use a half mirror to separate the two optical paths.
  • the test sample 4 when observing a test sample with transmitted light, the test sample 4 is illuminated with Koehler illumination as in the case of observing transmitted light with a normal optical microscope. That is, the light from the light source 2 is converted into parallel light by the collector lens 10, and after the image of the light source 2 is formed at the pupil position g of the condenser lens 14, the test sample 4 is illuminated.
  • the light that illuminates the test sample 4 passes through the test sample 4 and enters the objective lens 15, and is incident on the imaging surface 19 by the first relay lens 16 and the second relay lens 18. An image of the test sample 4 is formed, and the image of the test sample 4 formed on the imaging surface 19 is observed by an observer through the eyepiece 6. Also.
  • test sample 4 is placed on sample stage 3 as shown. On sample stage 3, preferably as shown in more detail in FIG. 1B, test sample 4 is placed in a sample container 21 such as a petri dish with lid 26 together with the culture medium. Yo! The bottom surface of the sample container 21 is made of the same material as the optically transparent microscope cover glass and has a thickness of 0.17 mm. The sample on the bottom surface of the sample container 21 is observed with a normal objective lens.
  • the sample container 21 is not limited to a petri dish, and slide glass, microplate, etc. may be used.
  • the sample container 2 1 is placed in the water tank 2 2 to which pure water is supplied through the nozzle 2 3. Contained within 30.
  • C 0 2 gas is supplied to the surface through a gas supply tube 24 and a CO 2 nozzle 8 4 from a gas cylinder 25 placed outside the measuring apparatus main body. Gas in the gas cylinder 2 through 5, for example, C 0 2 5%, 0 2 9 5% mixed gas.
  • the flow rate of the C 0 2 gas supplied into the sealed container 30 with the lid may be about 5 O ml L min.
  • a heat plate 27 is placed under the sample container 21. The heat plate 27 is typically controlled by a temperature controller (not shown) at a 0.5 ° C step interval in the sample container.
  • an automatic dispensing device 1 is used as a device for stimulating cells in order to perform an experiment for generating a luminescent phenomenon (expressing a photoprotein) by giving the cells a stimulus. 0 0 may be provided.
  • the automatic dispensing apparatus 100 the reagent solution is sucked from the reagent container 100 by the pump 100, and a predetermined amount of reagent solution is discharged to the sample container 21 by the nozzle 103.
  • the lid 3 1 and the sample container lid 2 6 of the sealed container 30 have an automatic dispensing device 10.
  • the automatic dispensing apparatus 100 may be operable at any time before, during, or during the acquisition of a microscopic image under the control of a computer described later.
  • the sample stage 3 has two stepping motors (not shown) that move the sample stage 3 in the horizontal direction (X direction, Y direction) force S 90 ° direction each Two stepping motors are driven by the sample stage controller (not shown) based on the command from the computer, and the position of the sample stage 3 can be automatically controlled. Good.
  • the objective lens 15 disposed below the sample stage 3 is attached to the periphery of the objective lens heater 2 8 in contact with the objective lens 1 5.
  • the objective lens 15 is controlled by the objective lens heater 28 at 0.5 ° C step intervals, and the objective lens 15 can be held at any temperature from the outside. You may be supposed to.
  • an objective lens Z-axis drive mechanism 9 is provided around the objective lens heater 28 so that the objective lens 15 can be automatically driven along the Z-axis (optical axis direction).
  • Objective lens The Z-axis drive mechanism 9 moves the objective lens 15 up and down by a rack and pinion mechanism (not shown). The rotation of the knobs on the rack and pinion mechanism is performed by a computer-controlled stepper motor (not shown).
  • the objective lens Z-axis drive mechanism 9 may be a friction port-reller mechanism.
  • the number of pixels of the image sensor 7 on the light receiving surface of the camera 8 may be 1, 360 X 1, 0 24, for example, for receiving an image of the test sample 4.
  • the transmitted light microscope image obtained by observing the transmitted light of the test sample 4 and the luminescence observation of the test sample 4 that is, Both luminescence microscopic images obtained by observing the weak light emitted by the intracellular luminescence phenomenon are photographed. Therefore, it is preferable that the CCD camera 8 as a light receiver has a high sensitivity as much as possible in order to capture weak light at the time of light emission observation.
  • the CCD camera 8 is provided with a cooling device 29 consisting of Peltier elements at the bottom of the CCD camera 8 in order to suppress the drowning current generated from the CCD camera 8, and the temperature of the CCD camera 8 is + 5 ° C.
  • a cooling CCD that can be cooled in the temperature range of about 1-70 ° C.
  • an infrared cut filter 13 is disposed above the light receiving surface of the CCD camera 8 so as to block the infrared rays as background light.
  • the image captured by the CCD camera 8 is transmitted to the computer 80 through the signal cable 81 and displayed on the TV monitor 37 connected to the computer 80.
  • the CCD camera 8 may be a three-plate color camera so that a color illumination image can be obtained. Further, for example, a CMO image sensor or an SIT camera may be employed as a microscope image capturing device.
  • the computer 80 includes a CPU, and may be constituted by a computer capable of performing various types of image processing in any format known to those skilled in the art.
  • Computer 8 0 is obtained by controlling the operation of each part in the weak light measurement apparatus of the present invention to acquire a microscope image as image data, and by using an illumination image and emission observation acquired by transmitted light observation as described later.
  • Various processes using image data such as generation of a superimposed image of the acquired light-emitting image and designation of an analysis region using the superimposed image are executed.
  • Figure 2A shows the computer 80 in the form of a functional block diagram. Referring to the figure, the computer 80 has a CPU 35, a memory 41 storing a control program for controlling the operation of the CPU 35, and a captured image of the CCD camera 8 as image data.
  • Signal processing circuit 3 for conversion as 3 and digital zoom circuit 34, display control circuit 3 6 and TV monitor 3 7 for displaying captured image of CCD camera 8, and captured image of CCD camera 8 or it
  • the play button 4 3, the record button 4 7, the shutter button 44, the zoom enlarge button 4 2, the zoom reduce button 1 4 3, the cross cursor button 4 5 Various buttons such as a mode switch 48 are provided, and a user instruction is input via an operation panel 40 connected to the CPU 35.
  • the microscope image of the test sample 4 imaged on the image sensor 7 of the CCD camera 8 is converted into an analog electrical signal, that is, an image signal by the image sensor 7.
  • the signal is transmitted to the signal processing circuit 33, subjected to image processing such as amplification processing, filtering processing, and contour enhancement, and then sent to the digital zoom circuit 34 (digital signal processing unit).
  • the digital zoom circuit 34 A / D converts the analog image signal from the signal processing circuit 33 to a digital image signal, performs digital processing such as gamma correction as necessary, and then sends it to the TV monitor 37.
  • the digital image signal is transmitted to the recording / reproduction control circuit 38 for recording on the image.
  • the digital zoom circuit 34 in the device of the present invention is based on the control signal from the CPU 35 5. Only a part of the entire pixel area captured by the CD camera 8 is cut out, and the cut-out image area is enlarged at an arbitrary magnification to display control circuit 3 6 or recording / reproduction control circuit 3 8 Configured to send to.
  • the recording / reproducing control circuit 38 reads out the digital image signal recorded on the recording medium 39 in response to the reproducing control signal given from the CPU 35 and reads out the digital image signal.
  • the received digital image signal is input to the TV monitor 37 through the display control circuit 36, so that the image of the test sample 4 recorded on the screen of the TV monitor 37 is displayed. It may be.
  • the apparatus of the present invention enters the recording mode, and the CPU 3 5 controls the recording control signal to record and reproduce. Supply to circuit 3-8.
  • the recording / reproducing control circuit 38 records the image signal supplied from the digital zoom circuit 34 on the recording medium in response to the recording control signal.
  • the apparatus of the present invention enters the playback mode, the CPU 35 supplies the playback control signal to the recording / playback control circuit 3 8, and the recording / playback control circuit 3 8
  • the image data recorded as described above is displayed on the TV monitor 37.
  • pressing the button 4 4 outputs a control signal from the CPU 3 5 to the digital zoom circuit 3 4.
  • the image is written to the memory 41 after being subjected to digital signal processing by the digital zoom circuit 34.
  • the image data written to the memory 41 is compressed by an arbitrary compression circuit and recorded on the memory card by the card reader Z writer device.
  • zoom reduce button 1 4 3 and cross cursor button 4 5 Is set by
  • the “zoom center position” representing the center of the image area cut out by the digital zoom circuit 3 4 is displayed on the TV monitor 37, and the frame of the image area to be cut out is displayed. Is displayed. While watching the TV monitor 37, the user
  • the image may be enlarged not by the digital zoom circuit 34 but by adjusting the optical system in the microscope (optical zoom).
  • the optical zoom is executed, for example, by moving the focal distance between the CCD camera 8 and the second relay lens 18 on the optical axis with a motor driven by a stepping motor.
  • a lens (zoom lens) for performing optical zoom a three-magnification lens group, a correction lens group that performs aberration correction, and a focus lens (not shown) that performs force adjustment are used. It may be possible to change the focal length manually or automatically in 10 steps.
  • the zoom lens is driven by moving the zoom lens along the optical axis by the operation of a zoom motor (such as an ultrasonic motor) installed around the zoom lens based on a control signal sent from the CPU 35. May be done by
  • the computer 80 is connected to these devices to control the operation of the automatic dispensing device 100 and the lighting device 8 2 (including the light source 2), and dispensing by the automatic dispensing device 100 is possible.
  • the image signal captured by the CCD camera 8 can be acquired. Observation and measurement of a test sample by the apparatus of the first embodiment
  • the focus position of the objective lens in the light emission observation is that the light from the light source such as a halogen lamp is illuminated to the test sample through the illumination optical system by the transmitted light observation, and the microscope illumination image by the test sample is obtained Determined based on this The For example, in transmitted light observation, high contrast images can be obtained.
  • FIG. 3 shows the processing steps in the light emitting imaging method of the present invention in the form of a flow chart.
  • first put test sample 4 (cells, etc.) and culture medium in a petri dish (sample container 21), set sample container 21 in the apparatus (step 1), and the illumination light is turned on. Is done. (Step 2).
  • the microscope image of the test sample 4 is formed on the light receiving surface of the imaging element 7 of the CCD camera 8 through the objective lens 15, and an illumination image of the test sample is acquired from the signal from the imaging element 7 ( Step 3).
  • a desired region is designated, and a region having an appropriate cell density is designated (step 4).
  • move the stage and move the specified cell density area to the center of the field of view step 5
  • the illumination image data is stored in the storage device (step 6), the illumination is turned off (step 7), and the acquisition of the first illumination image is completed.
  • the cells are stimulated using a cell stimulation means.
  • Drugs that stimulate the cells may be administered with an automatic dispensing device (step 8).
  • illumination may be performed immediately after step 8, and the data of the illumination image may be stored in the storage device (step 9).
  • the light emission signal is acquired without performing illumination (Step 10), and the light emission signal is stored in the storage device (Step 11), whereby the acquisition of the first light emission image is completed.
  • Step 10 and Step 11 are repeated until a predetermined time or a predetermined light emission intensity or a predetermined number of times is reached, and a light emission image is acquired.
  • the acquisition of the illumination image and the acquisition of the luminescent image can be performed as a pair, or the illumination image can be acquired every predetermined number of times.
  • This pattern may be executed in a pattern more suitable for the ease of cell movement, the measurement period, and the like.
  • Step 15 it is determined whether or not the light emission site of the cell can be distinguished from each other in the superimposed image, and if it can be determined (Step 13: Y es), specify the measurement region (Step 15) .
  • the measurement area can be specified by using a mouse, cursor, or any means that allows manual specification of the screen area such as a pointer on the monitor, or by changing the threshold value by performing image processing. May be done.
  • one cell can be used as a measurement region, and a part of cells can be designated as a measurement region.
  • Step 14 the output from the CCD camera is displayed in a pseudo color (Step 14), and it is easy to see, and then specify the measurement area ( Step 1 5).
  • one cell can be set as the measurement region, and a part of the cell can be designated as the measurement region.
  • the region designation may be performed not only before stimulation to the analysis target such as cells but also after stimulation.
  • the analysis target can perform appropriate measurement.
  • the measurement area may be moved to the area where If there is no light emission at the time of stimulation, it is very weak, or there is little light, the measurement area may be changed to an area where proper light emission can be detected.
  • identify the analysis target whose luminescence level has increased due to the stimulus and then selectively track the detected analysis target and acquire data And may be analyzed.
  • the change in emission intensity over time may be displayed as an animation, or numerically displayed as a graph (step 16).
  • analysis is performed (step 17). Specifically, the obtained data can be used to compare the luminescence intensity of individual cells, compare the luminescence intensity of each part of the same cell, identify the luminescence pattern of the cells, and compare the time course of the luminescence pattern. Do. From this result, it is possible to analyze the state of cell response to drug, electricity, gas, and thermal stimulation. It is also possible to analyze cell activity when no stimulation is performed.
  • the emission intensity increases periodically.
  • the acquired illumination image and the luminescence image are superimposed, so that the luminescence of the desired cell is not lost before and after the luminescence disappears. Since changes in intensity can be observed, it is possible to identify specific cells and continuously track the luminescence intensity.
  • FIG. 5 schematically shows a second embodiment of the present invention in which a configuration for performing fluorescence observation is further added to the feeble light measurement apparatus of the first embodiment of the present invention illustrated in FIG. It is a representation.
  • the apparatus of the second embodiment of the present invention capable of simultaneously performing digital zoom or optical zoom as in the first embodiment is additionally provided with an optical system 49 for excitation light,
  • the observation optical system 5 has been modified to guide the fluorescence emitted from the test sample 4 to the CCD camera.
  • the excitation optical system 49 includes an excitation light source 50, a collimate lens 51, a deflection mirror 52, and a switchable dichroic mirror 53.
  • the excitation light source 50 is typically an argon laser with a wavelength of 48 8 nm and an output of 10 mW.
  • the excitation light source 50 may be a visible gas laser such as a helium neon laser.
  • the laser beam is converted into a circular parallel light beam having a beam width by the collimating lens 51, reflected by the deflecting mirror 52, and installed in the observation optical system 5. Is incident on.
  • the switchable dichroic mirror 58 has a spectral characteristic that reflects the light having the oscillation wavelength of the excitation light source 50 and transmits the spectrum of the fluorescence and emission signals from the test sample 4.
  • the laser beam incident on the observation optical system 5 is reflected by the switchable dichroic mirror 53, enters the objective lens 15 from below, and is focused on the test sample 4 in the sample container 21.
  • the switchable dichroic mirror 58 is housed in a holder (not shown), and may be installed interchangeably according to the oscillation wavelength of the excitation laser light. Further, if it is not necessary to change the wavelength of the excitation light source 50, a normal dichroic mirror may be fixed without using the switchable dichroic mirror 58.
  • the objective lens 15 may be an NA (numerical aperture) of about 0.9 or a high NA immersion type objective lens of 1.0 or higher.
  • the fluorescence signal and emission signal emitted from the test sample 4 pass through the switching lens dichroic mirror 58 when passing through the objective lens 15 and the observation optical system 5 of the main body of the apparatus.
  • the light passes through the Ray lens 16 and the second relay lens 18, is reflected by the switching mirror 20, and forms an image on the light receiving surface of the image sensor 7 of the CCD camera 8.
  • the optical signal from the CCD camera 8 is sent to the computer 80, and the computer 80 performs rendering and analysis of the luminescence image, time measurement of the luminescence intensity, signal analysis, and the like.
  • the analysis result is displayed on the screen of the TV monitor 37 of the computer 80.
  • Fluorescence observation may be performed in a manner known to those skilled in the art.
  • the fluorescent dye used in the fluorescence observation may be, for example, Rhodamine Green (RhG) TM R, Tetramethylrhodamine, or 5-Tam ra (5-carboxytetramethylrhodamine).
  • RhG Rhodamine Green
  • TMR Tetramethylrhodamine
  • 5-Tam ra 5-carboxytetramethylrhodamine
  • FIG. 6 is a schematic view of another embodiment of the apparatus for measuring weak light according to the present invention, which can perform digital zoom or optical zoom and can simultaneously measure fluorescence and bioluminescence similarly to the apparatus of FIG. Represents.
  • the measuring apparatus main body that is, the optical microscope is housed in the light shielding box 54, and the bottom of the light shielding box 54 is fixed on the bottom plate 5 5. It is fixed at 6 so that external light does not enter the observation optical system 5.
  • a shading lid 5 7 is separately mounted on the upper surface of the shading box 54. One end of the shading lid 5 7 is connected to the shading box 54 body by a hinge 58, and the shading lid 5 7 can be opened and closed in a fan shape. It ’s like that.
  • an illumination light source 2 such as a halogen lamp or a metal halide lamp is introduced into the upper surface of the sample container 2 1 on the sample stage 3 through the illumination optical fiber 60 and tested. Illuminate the entire specimen 4.
  • a laser (excitation) light source 50 is fixed inside the light source box 62 outside the main body, and the laser light emitted from the laser light source 50 is collected in an outer frame. The incident light enters the main body of the device through the attached laser beam entrance 6 4.
  • the laser can be, for example, an argon laser with a wavelength of 48 8 nm and an output of 10 mW.
  • the switchable dichroic mirror 53 is housed in a holder and is installed in a replaceable manner according to the oscillation wavelength of the excitation laser beam.
  • the sample container 21 is fixed on the XY sample stage 3 with a stop pin.
  • the XY sample stage 3 is configured so that the position on the XY plane can be freely moved along the XY plane by a rack and pinion mechanism.
  • the objective lens 15 installed below the sample container 21 is attached to the objective lens Z-axis drive mechanism 9 and can be moved along the optical axis (Z-axis).
  • the objective lens Z-axis drive mechanism 9 communicates and is controlled by a lead wire with a focus detection unit 77 installed outside the weak light measurement apparatus.
  • the signal light collected by the objective lens 15 is transmitted through the switchable dichroic mirror 53 and is not bent unlike the first and second embodiments. Then, the light passes through the lens 6 7 attached to the lower part 6 6 of the lens barrel and is condensed on the light receiving surface of the CCD camera 8.
  • the lens 6 7 is arranged at the lower part 6 6 of the lens barrel fixed to the base frame 75 with a stopper, and the CCD camera 8 has the center of the light receiving surface at the focus position on the Z axis of the lens 6 7. Placed on a base base 7 5 fixed on the base plate 5 5 to fit.
  • the body stage 7 6 carrying the sample stage 3 and the objective lens 15 is attached to the column 7 3 fixed on the bottom plate 55, and the body stage 7 6 includes the upper part 7 2 and the lens barrel. It can move up and down with respect to the lower part 6 6.
  • an objective lens focus detection unit 70 may be provided, connected to the position detection unit 71, and an output signal of the position detection unit 71 may be output to the TV monitor 37. Since the light emitted from the sample is weak, it is preferable to use the CCD camera 8 with the highest possible sensitivity as in the first and second embodiments.
  • the number of pixels of the CCD camera 8 is, for example, 1, 3 60 X 1, 0 24.
  • a cooling device 29 consisting of Peltier elements is attached to the bottom of the CCD camera 8 so that the temperature of the CCD camera 8 is kept at about 0 ° C. It may be.
  • An infrared cut filter 13 is installed above the light receiving surface of the CCD camera 8 to block infrared light as background light. However, when infrared light is extracted as signal light, the infrared force filter 13 is removed from the lower part 6 6 of the lens barrel before measurement.
  • a signal cable 69 is connected to the output part of the CCD camera 8, and the sample image from the CCD camera is transmitted to the computer 80 via the signal processing part 74 and displayed on the TV monitor 37.
  • the CCD camera 8 may be a three-plate color camera so that a color illumination image can be obtained.
  • the object lens is focused on the sample by the illumination image of the test sample 4 by the light source 2 for illumination.
  • the objective lens 15 is moved along the optical axis by the objective lens Z-axis drive mechanism 9, and the signal processing unit 74 analyzes the optical output signal from the CCD camera 8 at each movement step.
  • the position on the optical axis of the objective lens 15 from which a high contrast image can be obtained is detected.
  • the position on the optical axis of the objective lens 15 at which two high and low contrast images can be obtained is found, and the signal processing unit 7 4 performs the calculation, so that the approximate center positions at the two upper and lower positions are the focus at the time of light emission observation.
  • the objective lens Z-axis drive mechanism 9 is operated to move and fix the objective lens 15 to the focal position, and thereafter, the fluorescence signal and the emission signal emitted from the test sample 4 are received by the CCD camera 8.
  • the objective lens Z-axis drive mechanism 9 may be configured such that a plurality of objective lenses 15 can be interchangeably attached.
  • the field of view is narrow when observed with a high-magnification objective lens 15, so in some cases, cells etc. of test sample 4 move out of the field of view. It may disappear. Therefore, preferably, the test sample 4 is observed with a low-magnification objective lens 15 such as X 10 or X 20.
  • the desired position of the test sample 4 is confirmed and designated using a mouse or a keyboard. It would be desirable to magnify the image with the zoom-up function of the device of the present invention Brown.
  • a computer may be used as the signal processing unit 74.
  • Example 1 is caused by drug stimulation in multiple HeLa cells into which a luciferase gene has been introduced using a faint light measuring device with an automatic dispensing device 100 added to the measuring device in FIG.
  • a vector that constitutively expresses tetracycline repressor (T et R) in HeLa cells was used.
  • an expression vector“ pc DNA 4 / TO (Invitrogen) ” having a tetracycline 'operator (T et O 2) introduced with a plasmid ligated with a luciferase gene.
  • Tet R is first expressed by the T et R vector (pc DNA 6 / TR), as schematically shown in Fig. 7A.
  • T et R becomes a homodimer and binds to the T et O 2 gene region, thereby suppressing transcription of the luciferase gene connected to the T et O 2 region.
  • Fig. 7A the T et R vector
  • T et R homodimer when tetracycline is given to cells (drug stimulation), tetracycline causes a conformational change of T et R homodimer, and T et R homodimer becomes T Detach from the et O 2 region and induce transcription of luciferase gene and expression of luciferase.
  • luciferase was expressed in a cell by the stimulation with tetracycline and a luminescence phenomenon occurred in the cell into which the above gene was introduced.
  • the objective lens 15 is an Olympus UA po / 3 40 (20 times, NA 0.75), and a commercially available microscope objective lens “0 i and 20 times, “NA 0.8” or “5 times, NA 0.1 3” was used.
  • the CCD camera 8 used was a digital camera “DP 30 BW (manufactured by Olympus)” for microscopes cooled at 5 ° C.
  • the CCD element (corresponding to the image sensor 7) is a 23-inch type, the number of pixels is 1360 X 1024, and the pixel size is 6 ⁇ m square.
  • the total magnification of the test sample image formed on the CCD element from the objective lens through the imaging lens (relay lens) was set to 4 times. During the observation and imaging of HeLa cells, the entire apparatus was covered with a basket.
  • the experimental procedure was performed according to the following procedure.
  • a sample was prepared in which He La cells were co-expressed with a vector that constitutively expresses TetR and a plasmid in which a luciferase gene was linked to an expression vector with Tet02.
  • the culture solution used was a D-MEM medium containing 10 mM HEPES plus 1 mM luciferin.
  • the acquired illumination image and the luminescence image are overlaid to identify He La cells expressing luciferase, and the luminescence intensity of He La cells expressing luciferase Changes over time were quantified and analyzed.
  • the output value from the CCD camera 8 was displayed in a pseudo color for further visual recognition.
  • FIG. 9A, 9B, and 9C show an illumination image, a luminescent image, and a superimposed image, respectively.
  • Fig. 10 shows the images obtained by the above procedure, especially the regions RO I-1 and RO I-2 that are surrounded by the square frame in the superimposed image of Fig. 9C.
  • variation of the emitted light intensity in these two cells is shown.
  • Example 2 the same apparatus as in Example 1 was used to observe the luminescence of the luminescent bacterium Rphosphoreum), and the time-dependent change in luminescence intensity due to drug stimulation in the cells was followed.
  • Luminous bacteria are (i) independent living in seawater, (ii) symbiosis in fish and cephalopods, (iii) dead fish, breeding on beef, (iV) in the digestive tract of saltwater fish It is a luminescent organism with motility that exists widely in nature in the form of habitual parasitism on the skin of squid and squid, etc., and exhibits strong luminescence that can be continuously observed with the naked eye under aerobic conditions.
  • the objective lens 15 uses Olympus UA po 3 4 0 (40 times NA 1. 3 5) or Oil Iris “0 i 1, 40 times, NA 1. 3 5”. It was. Other imaging conditions were the same as in Example 1. .
  • the experimental procedure was performed according to the following procedure.
  • Luminescent bacteria symbiotic to the firefly squid luminophore were isolated and cultured in LB medium with 3% NaCl concentration. Glycerol was added to this culture solution to obtain a final concentration of 25% glycerol solution (V Z V).
  • Imaging in (2) was repeated at intervals of 5 min until 1 hour after the addition of ampicillin. Imaging is performed automatically by computer processing, The optical signal obtained by the CCD camera was automatically converted into digital data in the apparatus of the present invention.
  • Example 2 After the imaging is completed, the acquired illumination image and the luminescent image are overlaid, the luminescent park that emits strong light is identified, and the superimposed image is arranged in time order to animate, and the luminescent position changes with the movement of the luminescent bacteria.
  • the time course of the luminescence of the luminescent bacteria was quantified and analyzed.
  • the tracking of luminous bacteria may be performed automatically by computer processing.
  • Fig. 1 1A, Fig. 1 1B, and Fig. 1 1C show the illumination image, the luminescent image, and the superimposed image (coloring by pseudo color), respectively.
  • Figure 12 shows the time-dependent variation of the region P P-1 in Figure 11 C of the luminous intensity of the luminescent bacteria.
  • Example 3 the luminescence of the luminescent bacterium V.tischeri was observed, and the position of the luminescent bacterium and the change in luminescence intensity over time were followed.
  • the imaging conditions were the same as in Example 2.
  • the experimental procedure was performed according to the following procedure.
  • Luminescent luminescence is cultured on an agar LB medium plate with 3% NaC1 concentration, colonies with high luminescence intensity are selected from the culture plate, and the colonies are liquid LB medium with 3% NaCl concentration. Suspended in.
  • Imaging in (2) above was repeated. Imaging was automatically performed by computer processing, and the optical signal obtained by the CCD camera was automatically converted into digital data by the apparatus of the present invention.
  • the acquired illumination image and the light emission image are superimposed, and the light emission packet moves with time change.
  • the change of the luminescence position accompanying the movement of the luminescent bacteria (V. t.) was traced, and the change over time of the luminescence of the luminescent bacteria was quantified and analyzed.
  • the tracking of luminous bacteria may be performed automatically by computer processing.
  • Fig. 1 3 A, Fig. 1 3 B, and Fig. 1 3 C are an illumination image, a luminescence image, and a superimposed image, respectively, and Fig. 1 4 shows the movement of luminescent bacteria over time. ing. Fig. 15 shows the variation over time of the luminescence intensity of the luminescent bacteria (V. t.).
  • V. t. the luminescence intensity of the luminescent bacteria

Abstract

光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の発光現象をイメージングするための新規な装置及び方法が提供される。本発明の方法及び装置に於いては、被験試料を照明することにより取得された照明画像と、被験試料を照明せずに被験試料内の細胞の発光現象により放出される光により取得された発光画像とを重ね合わせて重ね合わせ画像が生成される。重ね合わせ画像に於いて解析領域が指定される。これにより、発光観察で検出される光が微弱であっても、被験試料に於いて、発光している細胞や細胞内の発光部位を特定することができる。

Description

明細書
生物由来の被験試料の画像を取得する装置及び方法 技術分野
本発明は、 生物由来の被験試料、 例えば、 細胞、 バクテリア又はその他の生物 試料から発せられる微弱光をイメージングする方法及び装置に係り、 より詳細に は、 生物発光現象による微弱光をイメージングして被験試料の観察又は種々の測 定をするための方法及び装置に係る。 背景技術
近年、 生命科学分野の研究に於いて、 任意の細胞内に遺伝子を導入して発現さ れる G F Pなどの蛍光タンパク質ゃルシフェラーゼゃェクオリンなどの発光タン パク質を利用して細胞などの生物由来の試料をイメージングする技術が利用され るようになってきている。 蛍光又は発光タンパク質は、 細胞内にて別の任意の特 定のタンパク質と融合した状態で発現させたり （タンパク質のマーキング）、 蛍光 又は発光タンパク質をコードした遺伝子を或る特定の遺伝子の調節領域の下流に 挿入又は置換し、 その特定の遺伝子調節領域が活性化されたときにのみ発現でき るようにすることができる。 そこで、 細胞内外で起こっている種々の生命現象に 於いて注目するタンパク質の発現又は注目する遺伝子領域の活性化に伴って蛍光 又は発光タンパク質を発現させ、 光学顕微鏡によるイメージングに於いて、 その 注目されるタンパク質又は遺伝子領域が何時或いはどのように発現するか、 或い は、 細胞内外で発現されたタンパク質がどのように振舞うかなどを観察又は検出 するためのレポ一ター分子又はプローブ分子として利用する試みが為されている。
G F P等の蛍光タンパク質は、 細胞内で比較的安定で、 そのタンパク質から発 せられる蛍光が明るいので、 既に、 細胞内の構造物を安定的に且容易にイメージ ングするために、 広範囲に利用されつつある （例えば、 メイソン著、 「生物活性の ための蛍光 · 発光プローブ」 ( Mason (1999), Fluorescent and luminescent probes lor biological activity, Second edition. ) ) a 他方、 ノレシフェフ— If どの化学発光又は生物発光現象により発光する発光タンパク質は、 光学顕微鏡に よる観察の際に、 蛍光色素を励起するための （しばしば細胞又はその他の生物試 料にダメージを与え得る） 励起光を必要としないので、 生物試料を、 それにダメ ージを与えることなく、 ィメージングするためのプローブの一つとして期待され ている。 そのような発光タンパク質を利用したィメ一ジングの例はいくつか報告 されている。例えば、ルッター等 （Rutter, White, Tavare (1995) "Involvement of MAP kinase in insulin signalling revealed by non invasive imaging of luciferase gene expression in single living cells. Current biology Vol. 5: 890-899.) は、 フオ トンカウンティングカメラを使用して単一の生細胞中のルシ フェラーゼの遺伝子発現のイメージングによりインシュリン信号伝達に M A Pキ ナーゼが関与していることを観察した。 また、 スターンベルグ等 （Sternberg, Eberl, Kongsbak, Molin (1997), "Detection of bioluminescence from individual bacterial cells: a comparison of two different lowlignt imaging system. J. Bioluminescence and Chemiluminescence Vol. 12: 7' 13.) fま、 フォトンカゥンテ イングカメラと冷却 C C Dカメラを用い生物発光の検出について報告した。更に、 タカス力等 （Takasuka， White, Wood, Robertson, Davis (1998), "Dynamic changes in prolactin promoter activation in individual living lactotrophic cells.", Endocrinology vol.139: 1361-1368.) は、 フォトン力ゥンティングカメラ を使用して単一の生細胞中のルシフェラーゼの遺伝子発現のイメージングにより プロラクチンプロモーターの活性化に於ける動的変化が観察されたことを報告し た。
上記の如き細胞内にて遺伝子発現させられた蛍光又は発光タンパク質のィメ一 ジングに於いて、蛍光タンパク質の蛍光は、既に述べた如く、比較的明るいので、 その蛍光の顕微鏡像は、 既存の光学顕微鏡及び撮影システムを用いて比較的鮮明 な画像として取得することが可能である。 しかしながら、 細胞又はその他の生物 試料 （以下、 「細胞等」 とする。） からの発光タンパク質の発光強度は、 一般に極 めて微弱であり、 通常の顕微鏡像を撮影するためのカメラ又は撮影装置では顕微 鏡像を撮影することが相当に困難である （実際、 発光タンパク質の発光は、 光学 顕微鏡下に於いて、 接眼レンズから肉眼で目視することは通常できない。）。 そこ で、 従来の技術に於ける発光タンパク質のイメージングでは、 光学顕微鏡に超高 感度カメラゃフォ トンカウンティングカメラ等の微弱光を検出するために特化し たカメラ又は撮影装置を取り付けたシステムが用いられる （しかしながら、 その ような超高感度カメラ等を用いても一つの画像を生成するまでには、 少なく とも 数分から数十分間、 カメラの受光面に於いて試料からの光を積算することが必要 となっている。）。
ところで、 光学顕微鏡下で蛍光観察又は発光観察する場合、 顕微鏡像に現れる 光は、 原理的にタンパク質から発せられる光だけであるので、 被験試料中のタン パク質が存在していない領域の様子又は形態は観察することができない。 蛍光タ ンパク質を観察する場合には、 蛍光タンパク質の蛍光が比較的明るいことと、 励 起光を当てることにより細胞等の内部の蛍光タンパク質以外の物質からの自家蛍 光が発せられることとにより、 細胞等の形態又は状態が観察可能な場合がある。 しかしながら、 発光タンパク質の発光観察の場合、 発光タンパク質からの発光の ように試料からの光は、数分から数十分間積算しないと画像が生成できないほど、 極めて微弱であり、 発光タンパク質以外の物質から光が全く発せられない状況に 於いては、 被験試料中の細胞等の位置、 形態又はその変化は、 殆ど把握すること ができない（光が来ないところに細胞があるのかないのかも分からない。）。また、 観察期間中に （特に、 生きた細胞等の試料を長期間観察する際）、 発光強度が変化 したり、 細胞が移動又は変形する場合があり、 どの細胞が発光しているのか、 又 は、 細胞のどの部位が発光しているのかの特定は極めて困難である。 例えば、 或 る神経細胞に於いて、 細胞質と神経突起の発光現象の変化を解析するといつたこ とは非常に困難であった。
従来の技術の幾つかに於いては、 発光タンパク質の発光観察の際に細胞等の位 置、 形態を観察するために透過光観察が併用されているが、 その場合、 カメラの 受光面に於ける受光量が透過光観察の場合と発光観察の場合とで著しく異なるの で、透過光観察のために、発光観察のためのカメラとは別のカメラが使用され（対 物レンズも異なる場合がある。）、 発光画像 （発光タンパク質の光による画像） と 照明画像 （透過光による画像） がそれぞれ別々のカメラで生成される。 即ち、 細 . 胞等の形態を表す顕微鏡像と、 発光タンパク質の分布を表す顕微鏡像が別々の画 像上に存在することとなるので、 被験試料内に於ける発光タンパク質の実際の分 布又は位置を正確に決定することは困難となる （しばしば、 透過光観察のための カメラと発光観察のためのカメラと視野の大きさや位置がずれることもあり、 そ うなると、 被験試料内に於ける発光タンパク質の実際の分布又は位置の特定はよ り困難となる。）。 また、 一度に観察する細胞数が多い場合には、 発光画像中の光 つている細胞を照明画像中の細胞に対応させることも容易ではない。
上記の如き発光タンパク質を用いた 「発光イメージング」 に於いて、 もし被験 試料内の細胞等の形態又は状態を把握しつつ、 被騄試料内の発光タンパク質の分 布を検出又は特定することができれば、 「発光イメージング」の利用範囲が広がり、 種々の生命現象に関わる反応の解析等に応用できるはずである。 しかしながら、 既に述べた如く、 従来の技術に於いては、 発光タンパク質が極めて微弱であり、 また、 試料中の発光タンパク質の存在しないところから全く光が来ないというこ とに起因にして、 画像に於いて発光タンパク質の発現の有無は検出できるが、 或 る細胞中のどこで又は被験試料中のどの細胞で発光タンパク質が発現したかとい つた情報を取得することが非常に困難となっている。 実際、 超高感度の検出素子 を用いれば、 微弱な発光を検出することが可能であるが、 モザイク画像しか得る ことができず、 発光量を測定する領域を指定して詳細な解析を行うことは困難で めつに。 発明の開示
かくして、 本発明の一つの目的は、 上記の生物発光現象により生ずる微弱光に よる細胞又はその他の生物試料のィメージングに於いて、 発光している細胞や細 胞內の発光部位を特定することのできる態様にて細胞等の発光画像を取得する装 置又は方法を提供することである。
また、 本発明のもう一つの目的は、 上記の如き装置又は方法に於いて特定した 領域からデータを取得して、 種々の細胞内の現象の解析に用いることを可能にす る装置又はその方法を提供することである。
本発明の一つの態様によれば、 光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の 画像を取得する装置は、 被験試料を照明する照明部と、 被験試料の照明画像を取 得する照明画像取得部と、 被験試料内の細胞の発光画像を取得する発光画像取得 部と、 照明画像と発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成し、 重ね合わせ 画像に於いて解析領域を指定する画像処理部とを有することを特徴とする。 かか る構成に於いて、 典型的には、 光学的結像装置は、 光学顕微鏡であってよい。 そ の場合、 照明画像は、 照明部の照明光を用いて光学顕微鏡に於いて透過光観察す ることにより得られる透過光顕微鏡像であり、 発光画像は、 光学顕微鏡に於いて 細胞内の発光現象により発せられる光を観察して得られる発光顕微鏡像である。 そして、 好ましくは、 照明画像取得部と発光画像取得部とは、 共通の顕微鏡像撮 影装置を含み、 透過光顕微鏡像と発光顕微鏡像とは、 共通の顕微鏡像撮影装置に より撮影される。
上記の構成によれば、 被験試料内の細胞の発光現象を観察して得られる発光画 像が、 被験試料を照明部により照明して得られ被験試料内の細胞等の形態又は状 態が観察できる照明画像と重ね合わされることにより、 発光画像上の細胞の発光 部位の、 被験試料内又は細胞内の位置が、 従前に比して、 より正確に特定できる こととなる。 特に、 照明画像 （透過光顕微鏡像） と発光画像 （発光顕微鏡像） と が共通の顕微鏡像撮影装置により撮影される場合には、 画像の重ね合わせは、 極 めて簡単となり、 有利である。 似たような形態の細胞が観察領域内に多数存在し ていても、 どの細胞が発光しているかは、 発光画像が被験試料内の細胞の形態を 表す照明画像と重ね合わされた画像を見れば、直ちに特定することが可能であり、 従って、 画像に於いて着目すべき領域、 即ち、 発光現象等の解析を行う際に注目 すべき領域 （解析領域） の指定も容易にできることとなる。 また、 被験試料の状 態が照明画像に於いて把握されるので、 細胞が移動又は変形しても、 どの細胞が 何処に如何に移動又は変形したかが容易に判定でき、 これに対応して発光強度が どのように変化したかも容易に把握できることとなる。 更に、 被験試料中の細胞 の密度により複数の細胞が重なっている場合、 発光画像のみでは、 そのような細 胞等の重なりは、 判別が困難であるが、 上記の本発明の構成によれば、 照明画像 により予め適宜の細胞密度の領域を指定でき、 細胞の重なりの有無を判別できる ので、 発光量を、 より正確に解析できることとなる。
上記の本発明の装置に於いては、 既に述べた如く、 重ね合わされる透過光顕微 鏡像と発光顕微鏡像とは、 好ましくは、 共通の顕微鏡像撮影装置により撮影され る。 この点に関し、 本願出願人の研究によれば、 光学顕微鏡の、 被験試料の像を 顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる対物レンズとレンズ組立体に於いて、 受 光面に於ける被験試料の像の投影倍率 （/3 ) に対する対物レンズの開口数 （N A ) の比 （N A + /3 ) の 2乗の値が 0 . 0 1以上とすると、 単一の細胞から発生する発 光だけで C C Dカメラ等の撮影装置に於いて画像を生成できることが証明された (特願 2 0 0 5 - 2 6 7 5 3 1号参照）。 そして、 驚くべきことに、 この撮像条件 は、 従来、 画像化が困難であったあらゆる生物由来の試料にも適用できる可能性 が有り、 生物発光のような光学顕微鏡下で肉眼では直接観察出来ないような微弱 な発光成分による場合でも、 細胞等の画像を短い時間 （例えば 2 0分以内） で撮 像できることが見出された。又、 さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、 撮影装置の対物レンズを開口数 （N A ) / /投影倍率 ( β ) の 2乗で表される光学 的条件が 0 . 0 7 1以上である場合に、 1一 5分以内という短時間で画像化でき、 画像解析も可能な細胞等の画像が取得できることを突き止めた。 従って、 本発明 の装置の実施の形態に於いては、 （N A ÷ i3 ) の 2乗の値が、 好ましくは、 0 . 0 1以上、 より好ましくは、 0 . 0 7 1以上となるよう、 顕微鏡像撮影装置の受光 面と対物レンズとレンズ組立体とを構成することにより、 より良好な透過光顕微 鏡像と発光顕微鏡像との重ね合わせ画像を生成できることとなる。
また、 上記の本発明の装置に於いては、 更に、 細胞の蛍光画像を取得するため の蛍光画像取得部が設けられていてもよい。 光学的結像装置が光学顕微鏡である 場合には、 蛍光画像は、 光学顕微鏡に於いて被験試料の蛍光観察をすることによ り得られる蛍光顕微鏡像となる。 この場合も、 蛍光顕微鏡像と発光顕微鏡像とは 共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されてよい。 当業者にとってよく知られてい るように、 蛍光観察に於いては、 種々の環境条件に感受性のある蛍光色素、 例え ば、 p H感受性、 C a濃度感受性、 膜電位感受性の色素など、 を用いることによ り、 細胞内の種々の反応を検出できるので、 そのような蛍光観察による蛍光画像 と発光画像とを組み合わせることにより、 細胞内の発光部位と種々の細胞内の現 象とを関連付けられることは理解されるべきである。 重要なことは、 照明画像と 発光画像とを重ね合わせることにより、 被験試料内の細胞等の形態と発光部位と の位置関係が容易に把握できるという特徴によって、 蛍光画像と発光画像とを組 み合わせることの有用性が更に增大するということである。
実施の形態に於いて、 本発明の装置では、 重ね合わせ画像を表示する表示部が 設けられ、 表示部上で使用者が被験試料内又は細胞内に於いて発光部位を容易に 目視できるようになつていてよい。 また、 画像の解析や表示の目的で、 本発明の 装置に於いては、 重ね合わせ画像を記録する記録部が設けられていてよい。
ところで、 細胞の発光を観察する場合、 特に、 その発光が遺伝子導入により発 現されるルシフェラーゼ、 ェクオリンなどの発光タンパク質の発光をイメージン グする場合、 既に述べた如く、 発光タンパク質の遺伝子が、 発光タンパク質が任 意の （測定対象となる） タンパク質と融合した状態で発現するように、 又は、 遺 伝子の調節領域の下流に置換若しくは挿入されるように、 細胞内に導入され、 か く して発現される発光タンパク質が、 測定対象の任意のタンパク質が何時何処で 発現するかを探索するためのレポーター分子として利用される。 この点に関し、 発光タンパク質により レポートされるタンパク質は、 しばしば、 細胞が種々の刺 激を受けたときに発現される。 そこで、 本発明の装置の実施の形態に於いては、 細胞へ任意の刺激を与える細胞刺激供給部が設けられていてよい。 細胞刺激供給 部は、 例えば、 細胞へ試薬を供給する試薬供給部と、 被験試料の温度を調整する 温度調整部と、 細胞へガスを供給するガス供給部とからなる群から選択される少 なく とも一つであってよい。
また、 実施の形態として、 上記の本発明による装置は、 光学顕微鏡と、 その光 学顕微鏡により観察される顕微鏡像を撮影する顕微鏡像撮影装置と、 該顕微鏡像 を画像データとして取込んで画像処理を行う画像処理装置とを含む生物由来の被 験試料の画像を取得する装置であって、 画像処理装置が、 光学顕微鏡に於いて被 験試料を透過光観察する際の被験試料の像を顕微鏡像撮影装置により撮影して得 られる透過光画像と、 光学顕微鏡に於いて被験試料中の細胞内の発光現象に発せ られる光を顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる発光画像とを重ね合わせて 重ね合わせ画像を生成する画像重合部と、 その重ね合わせ画像に於いて解析領域 を指定する画像領域指定部とを含むことを特徴とする装置であってよい。 かかる 装置に於いて、 好適には、 顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、 光学顕微鏡が被験 試料の像を顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる対物レンズと レンズ組立体を 含み、 光学顕微鏡の光学系は、 受光面に於ける被験試料の像の投影倍率に対する 対物レンズの開口数の比の 2乗の値が 0 . 0 1以上となるよう構成される。
本発明のもう一つの態様によれば、 光学的結像装置を用いて生物由来の被験試 料の画像を取得する方法であって、被験試料を照明し照明画像を取得する過程と、 被験試料を照明せずに被験試料内の細胞の発光現象により放出される光による発 光画像を取得する過程と、 照明画像と発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を 生成する過程と、 重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する過程とを含むこと を特徴とする方法が提供される。 かかる本発明の方法によれば、 上記の本発明に よる装置の場合と同様に、 照明画像と発光画像とを重ね合わせた画像を生成し、 これにより、 照明画像に現れる細胞内又は被験試料内に於いて発光の観られる領 域を把握しながら、 発光現象の解析を実行することが可能となる。 なお、 本発明 の方法は、 上記本発明の装置を用いて実行可能であるが、 その他の任意の装置を 用いて実行されてもよい。 また、 上記の本発明の方法に於いても、 発光画像と照 明画像に加えて、被験試料内の細胞の蛍光画像を取得する過程 実行されてよい。 これにより、 細胞内又は被験試料内で発光現象が起きている部位を把握しつつ、 発光現象と蛍光により得られる情報とを関連付けることが可能となる。
上記の本発明の方法に於いては、 本発明の装置の場合と同様に、 光学的結像装 置が光学顕微鏡であってよく、 その場合、 照明画像は光学顕微鏡に於いて透過光 観察することにより得られる透過光顕微鏡像であり、 発光画像が光学顕微鏡に於 いて被験試料の細胞内の発光現象を観察して得られる発光顕微鏡像であり、 透過 光顕微鏡像と発光顕微鏡像とが共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることが 好ましい。 また、 光学顕微鏡に於いて、 好適には、 被験試料の像を顕微鏡像撮影 装置の受光面に結像させる対物レンズとレンズ組立体は、 受光面に於ける被験試 料の像の投影倍率に対する対物レンズの開口数の比の 2乗の値が 0 . 0 1以上と なるよう構成されてよい。
実施の態様に於いて、 例えば、 発光現象を長時間に亙って撮影する場合など、 被験試料を照明し照明画像を取得する過程を複数回実行し、 これにより、 被験試 料内の細胞等の形態の変化、 位置の移動が任意に確認されてよい。 また、 細胞に 或る特定の刺激、 例えば、 薬剤刺激と、 電気刺激と、 ガスによる刺激と、 熱によ る刺激が与えられることにより、 細胞内の遺伝子に組み込まれた発光タンパク質 の遺伝子が発現する場合には、 照明画像及び発光画像 （又は追加的に、 蛍光画像） を取得する過程に先立って細胞に前記に列記されている如き刺激のうちの少なく とも一つの刺激を選択的に与える過程が実行されてよい。 その場合、 好適には、 刺激前の状態を確認する目的で、 細胞に刺激を与える過程に先立って照明画像及 び発光画像を取得する過程が実行されてよい。
また、 上記の一連の種々の画像の取得後、 照明画像と発光画像を重ね合わせる 処理過程の後、 使用者が画像を確認し又は後に実行される任意の処理の目的で、 照明画像と発光画像との重ね合わせ画像を表示し又は記録する過程が実行されて よい。 また、 任意に、 解析領域の指定後に、 より詳細に解析領域の状態を確認し 又は観察するために、 解析領域に対応する照明画像の領域と、 解析領域に対応す る発光画像の領域と、 （蛍光画像も在るときには）解析領域に対応する蛍光画像の うち少なく とも 2つを表示する過程が実行されてよい。 発光現象の解析に於いて は、 解析領域に対応する発光画像の領域の光強度を測定する過程と、 該光強度の 変化を表示する過程が実行されてよい。
上記の説明から理解される如く、総じて、発光イメージングに於いては、本来、 被験試料中の発光タンパク質が存在していない領域の状態を観察することができ ない上に、 画像を撮影する装置又はカメラに於いて観測される光が極めて微弱で あることにより、 発光タンパク質による発光現象が検出できても、 被験試料中の どこで発光現象が発生しているかを正確に把握することが困難であったところ、 本発明の装置及び方法によれば、 照明画像と発光画像とを重ね合わせた画像を生 成し、 これにより、 被験試料に於いてどこで発光が起きているかを把握した態様 にて発光現象の解析を実行することが可能となる。かかる本発明の特徴によれば、 照明画像と発光画像との重ね合わせ画像から直ちに発光している細胞と発光して いない細胞とをそれぞれ特定できるので、 発光が見られた細胞数と発光が見られ なかった細胞数についての任意の統計的な解析を実行することも可能となる。 ま た、 発光している細胞についてのみ注目した発光強度の経時的な観測も従前に比 . して非常に容易になる。例えば、測定中に、被験試料に於いて細胞が移動しても、 照明画像と発光画像との重ね合わせ画像に於いて発光している細胞を追跡すると いったことが可能である。顕微鏡の対物レンズの倍率を増大する場合、従前では、 対物レンズの倍率を上げることにより、 相対的に発光部位からの信号が低減し、 これにより、 発光部位を見失うことがあつたが、 本発明によれば、 照明画像と発 光画像との重ね合わせ画像に於いて発光する被験試料中の部位が特定されるので、 発光部位を見失うといった不具合も低減される。
本発明は、 細胞又はその他の生物試料のィメージングに於ける発光タンパク質 の有用性を增大するものであるということができる。本発明によれば、従前では、 専ら分光計測により実行されていた発光タンパク質をレポーター分子として用い る細胞内の種々のタンパク質の発現に関する種々の実験又は測定 ·解析が、 ィメ 一ジングにより個々の細胞を特定しつつ実行できるようになると期待される。 本発明のその他の目的及び利点は、 以下に於いて、 部分的に明らかになり、 指 摘される。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 倒立型光学顕微鏡を含む本発明の微弱光測定装置の第一の実施形態 の構成の概略を示す模式図であり、 図 1 Bは、 被験試料中の細胞に刺激を与える 装置を含む図 1 Aの試料容器周辺をより詳細に示す模式図である。
図 2 Aは、 微弱光測定装置のコンピューター 8 0 (画像処理装置） の構成を機 能ブロック図で表した図であり、 図 2 Bは、 コンピューター 8 0へ接続される操 作パネルの模式図である。
図 3は、 本発明の微弱光測定装置を用いて実行可能な本発明の生物由来の被験 試料の画像を取得する方法の処理過程をフローチヤ一トの形式で表したものであ る。
図 4は、 時計遺伝子を導入した発現べクタ一にルシフェラーゼ遺伝子をつなげ たプラスミ ドを発現させた N I H 3 T 3細胞に於いて観察される発光強度の周期 的変動を模式的に示す図である。 2 4時間周期で発光が極めて微弱となる時間 ( a ) に於いては、 発光画像が得られない状態となる。
図 5は、 蛍光と生物発光の同時測定を行なう本発明の微弱光測定装置の第二の 実施形態の構成 （光学系） の模式図である。 図 6は、 蛍光と生物発光についての測定およびデジタルズームと光学ズームに よる画像拡大をそれぞれ同時に行なう本発明の微弱光測定装置の第三の実施形態 の構成 （光学系） の模式図である。
図 7は、 例 1の被験試料として用いられる H e 1 a細胞に導入されるテトラサ イク リ ン ' オペレータ （T e t 02) をもつ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝 子をつなげたプラスミ ドに於いて想定される分子の状態を説明する図である。 図 7 Aに示されている如く、 T e t Rホモダイマ一が T e t O 2領域に結合すると、 T e t O 2領域に接続されたルシフェラ一ゼ遺伝子が発現しないが、 細胞にテト ラサイクリ ンを与えると、 図 7 Bに示されている如く、 T e t Rホモダイマーが 構造変化し、 T e t〇 2領域から外れ、 ルシフェラーゼが発現する。
図 8は、 例 1におけるテトラサイクリンの添加と照明画像 ·発光画像の露光タ ィミングを示す図である。
図 9 Aは、 例 1において取得された照明画像であり、 図 9 Bは、 例 1において 取得された発光画像であり、 図 9 Cは、 図 9 Aの照明画像と図 9 Bの発光画像を 重ね合わせた画像 （図 9 Aの枠内の拡大像） を示す。 図 9 Cに於いて、 RO I— 1、 RO I _ 2と示した四角枠は、 解析領域として指定された領域である。
図 1 0は、 図 9 Cに於いて指定された解析領域の （H e L a細胞の） 発光強度 の経時的変動を表すグラフである。
図 1 1 Aは、 例 2において取得された照明画像であり、 図 1 1 Bは、 例 2にお いて取得された発光画像であり、 図 1 1 Cは、 図 1 1 Aの照明画像と図 1 1 Bの 発光画像を重ね合わせた画像を示す。 図 1 1 Cに於いて、 発光部位は、 実際の装 置に於いては、 擬似カラーで表示されるが、 図に於いては、 白色にて示されてい る。
図 1 2は、 図 1 1に於ける領域 P P— 1の発光パクテリァの発光強度の経時的 変動を示すグラフである。
図 1 3 Aは、 例 3において取得された照明画像であり、 図 1 3 Bは、 例 3にお いて取得された発光画像であり、 図 1 3 Cは、 図 1 3 Aの照明画像と図 1 3 Bの 発光画像を重ね合わせた画像を示す。
図 1 4は、 例 3において時間変化に伴う発光パクテリァの移動している様子を 示す重ね合わせ画像 （左） と照明画像 (右)である。
図 1 5は、 例 3における発光バクテリア （V . t . ) の発光強度の経時的変動の グラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下に添付の図を参照しつつ、 本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳 細に説明する。 図中、 同一の符号は、 同一の部位を示す。
本発明の装置の第一の実施形態
装置の構成
図 1 Aは、 本発明による、 生物発光現象によって生ずる微弱光を測定して細胞 又はその他の生物試料のイメージングを行うための生物由来の被験試料の画像を 取得する装置 （以下、 「微弱光測定装置」 と称する。） の好ましい第一の実施形態 を模式的に表した図である。
同図を参照して、 本発明の微弱光測定装置は、 光源 2と、 光源 2から発せられ た光を平行光とし、 被験試料 4へ導くための照明光学系 1 と、 被験試料 4の像を 生成するための観察光学系 5と、 被験試料 4の像を拡大して目視観察するための 接眼レンズ 6とを含む倒立型顕微鏡と、 被験試料 4の顕微鏡像を撮像するための 撮像素子 7を有する C C Dカメラ 8 (画像取得部又は顕微鏡像撮影装置） と、 C C Dカメラ 8が信号ケーブル 8 1により接続され T Vモニタ 3 7を含むコンビュ ータ一 8 0 (画像処理部又は画像処理装置） とを含んでいる。
光学顕微鏡の構成
上記の光学顕微鏡の構成は、 通常の倒立型の顕微鏡であってよく、 照明光学系 1は、 光源 2側から順に、 コレクターレンズ 1 0、 照明光の光軸 1 1を偏向させ るための偏向ミラー 1 2及びコンデンサーレンズ 1 4により構成される。 光源 2 はハロゲンランプ、 L E D光源、 タングステンランプ、 水銀ランプなどの可視域 の波長のインコヒーレン ト光源であってよレ、。 なお、 レーザーのようなコヒーレ ント光源の光を拡散板などによりインコヒーレントな光に変えて、 光源として用 いても良い。 光源の波長は通常、 可視光を用いるが、 赤外光を用いても良い。 観察光学系 5は、 被験試料 4側から順に、 被験試料 4の像を形成するための対 物レンズ 1 5、 第 1のリ レーレンズ 1 6、 対物レンズ 1 5からの光を偏向するた めの偏向ミラー 1 7、 第 1のリ レーレンズ 1 6と共に対物レンズ 1 5の像 （被験 試料 4の像） を結像面に結像させるための第 2のリ レーレンズ 1 8により構成さ れる。 また、 第 2のリ レーレンズ 1 8と結像面 1 9との間には、 被験試料 4の像 を接眼レンズ 6による目視観察と C C Dカメラ 8による観察が任意に切り替える ことができるように、 切替ミラー 2 0が配置されていてよい。 なお、 切替ミラー 2 0は機械的な切り替えタイプ以外に、 ハ一フミラーを用いて 2つの光路を分離 するようにしても良い。
上記の構成に於いて、 透過光による被験試料の観察の際、 通常の光学顕微鏡に よる透過光観察の場合と同様に、被験試料 4は、ケーラー照明により照明される。 即ち、 光源 2からの光は、 コレクターレンズ 1 0により平行光とされ、 コンデン サーレンズ 1 4の瞳位 gにて光源 2の像が結像された後、被験試料 4を照明する。 そして、 被験試料 4を照明した光は、 被験試料 4を透過して対物レンズ 1 5に入 射し、 第 1のリ レーレンズ 1 6及び第 2のリ レーレンズ 1 8により結像面 1 9に て被験試料 4の像を形成し、 かかる結像面 1 9に形成された被験試料 4の像は、 接眼レンズ 6を介して観察者により観察される。 また。 C C Dカメラ 8にて被験 試料 4の像を撮影するときには、 第 2のリ レーレンズ 1 8を透過してきた光は、 切替ミラー 2 0により、 反射され、 C C Dカメラ 8の撮像素子 7上で被験試料 4 の像が形成される。 なお、 対物レンズの倍率は、 例えば、 2 0倍であってよい。 被験試料 4は、 図示されている如く、 試料ステージ 3に載置される。 試料ステ —ジ 3上に於いて、 好適には、 図 1 Bにより詳細に示されている如く、 被験試料 4は、 フタ 2 6付きのシャーレなどの試料容器 2 1に培養液と共に入れられてよ レ、。試料容器 2 1の底面は、光学的に透明な顕微鏡用カバーガラスと同じ材質で、 その厚さが 0 . 1 7 m mであり、 通常の対物レンズにより試料容器 2 1の底面上 の試料が観察できるようになつている （なお、 試料容器 2 1はシャーレに限るこ となく、 スライ ドガラス、 マイクロプレートなどを用いても良い。）。 また、 試料 容器 2 1内の湿度を保っために、 試料容器 2 1は、 ノズル 2 3を通して純水が供. 給される水槽 2 2内に配置され、 更に、 水槽 2 2とともにフタ付き密閉容器 3 0 内に収容される。 そして、 図 1 Bにより詳細に示されている如く、 水槽 2 2の上 面には、 測定装置本体の外部に置かれたガスボンベ 2 5からガス供給チューブ 2 4と C O 2ノズル 8 4を通して C 02ガスが供給される。 ガスボンベ 2 5内のガス は、 例えば、 C 02 5 %、 02 9 5 %の混合ガスである。 フタ付き密閉容器 3 0内 へ供給される C 0 2ガスの流速は、 5 O m Lノ m i n程度であってよい。 更に、 好 適には、 試料容器 2 1の下には、 ヒートプレート 2 7が配置されてよレ、。 ヒート プレート 2 7は、 典型的には、 温度コントローラ一 （図示せず） により 0 . 5 °C ステップ間隔で試料容器内の温度を調節する。
更に、 後で説明されるように、 細胞に刺激を与えることにより、 発光現象を発 生させる （発光タンパク質を発現させる） 実験を行うために、 細胞に刺激を与え る装置として自動分注装置 1 0 0が備えられてよい。 自動分注装置 1 0 0に於い ては、 ポンプ 1 0 2により試薬容器 1 0 1から試薬溶液を吸引し、 試料容器 2 1 に所定量の試薬溶液をノズル 1 0 3により吐出する。 図示の如く、 試料容器 2 1 がフタ付き密閉容器 3 0内に収容されている場合には、 好適には、 密閉容器 3 0 のフタ 3 1 と試料容器フタ 2 6が自動分注装置 1 0 0の作動と協調してノズル 1 0 3からの試薬溶液の吐出前にモーター （図示せず） により開き、 溶液の吐出が 終了すると、 フタ 3 1 と試料容器フタ 2 6がモーターにより閉じるようになって いてよい。 なお、 自動分注装置 1 0 0は、 後に説明するコンピュータ一の制御に より、 顕微鏡像の取得の前後又はその途中の任意の時点に作動できるようになつ ていてよい。
更にまた、 好適には、 試料ステージ 3には、 試料ステージ 3を水平方向 （X方 向、 Y方向） に自在に移動させる 2個のステッピング · モーター （図示せず） 力 S それぞれ 9 0 ° 方向に別々に取り付けられ、 コンピュータ一 8 0の指令に基づき 試料ステージコントローラ一 （図示せず） により 2個のステッピング ' モーター を駆動し、 自動的に試料ステージ 3の位置を移動制御できるようになっていてよ い。
また更に、好適には、試料ステージ 3の下方に配置された対物レンズ 1 5には、 対物レンズヒーター 2 8が接触して周囲に取り付けられ、 対物レンズ 1 5の温度 力 温度調整装置 （図示せず） の制御下、 対物レンズヒーター 2 8によって 0 . 5 °Cステップ間隔で制御され、 対物レンズ 1 5を外側から任意の温度に保持でき るようになっていてよい。 更に、 対物レンズヒータ一 28の周囲には対物レンズ Z軸駆動機構 9が備えられ、 対物レンズ 1 5を Z軸 （光軸方向） に沿って自動的 に駆動できるようになつていてよい。 対物レンズ Z軸駆動機構 9は、 ラックピニ オン機構 （図示せず） で対物レンズ 1 5を上下に移動させる。 ラックピニオン機 構のノブの回転動作はコンピューター制御されたステッピング 'モーター （図示 せず） により行なわれる。 なお、 対物レンズ Z軸駆動機構 9は、 フリクション口 —ラー機構であってもよい。
顕微鏡像撮影装置の構成
被験試料 4の像を受光する CCD (C h a r g e C o u p l e d D e v i c e ) カメラ 8の受光面にある撮像素子 7の画素数は、 例えば、 1 , 360 X 1 , 0 24であってよい。 本発明の装置に於いては、 後に説明される如く、 CCD力 メラ 8により、 被験試料 4の透過光観察により得られる透過光顕微鏡像と、 被験 試料 4の発光観察、 即ち、 被験試料 4中の細胞内の発光現象により発せられる微 弱光を観察することにより得られる発光顕微鏡像との双方を撮影する。 従って、 発光観察時の微弱光を撮影するために受光器としての CCDカメラ 8は、 できる 限り高感度のものであることが好ましい。 好適には、 CCDカメラ 8は、 CCD カメラ 8から発する喑電流を抑えるために、 CCDカメラ 8の底部にペルチェ素 子から成る冷却装置 2 9が備え付けられ、 CCDカメラ 8の温度が + 5°C一- 7 0°C程度の温度範囲にて冷却することのできる冷却 CCDである。 また更に、 C CDカメラ 8の受光面の上方には、 赤外線カッ トフィルター 1 3が配置され、 背 景光となる赤外線を遮断するようになつていることが好ましい。 CCDカメラ 8 で撮影された像は、 信号ケーブル 8 1を通してコンピューター 8 0へ送信され、 コンピューター 8 0に接続された TVモニタ 3 7上に映し出される。 なお、 CC Dカメラ 8は、 3板式カラ一カメラとして、 カラーの照明画像が得られるように なっていてもよい。 また、 顕微鏡像の撮影装置として、 例えば、 CMO Sィメー ジセンサ一や S I Tカメラなどが採用されてもよい。
画像処理装置の構成
コンピューター 80は、 C PUを含み、 当業者にとって公知の任意の形式の各 種の画像処理が可能なコンピュータ一により構成されてよい。 コンピューター 8 0は、 本発明の微弱光測定装置に於ける各部の作動を制御して顕微鏡像を画像デ ータとして取得するとともに、 後に説明される如く透過光観察により取得された 照明画像と発光観察により取得された発光画像の重ね合わせ画像の生成、 重ね合 わせ画像を用いた解析領域の指定等の画像データを用いた種々の処理を実行する。 図 2 Aは、 コンピューター 8 0を機能のブロック図の形式にて表したものであ る。 同図を参照して、 コンピュータ一 80は、 C PU 3 5と、 C PU 3 5の動作 を制御するための制御プログラムが記憶されているメモリ 4 1 と、 CCDカメラ 8の撮影像を画像データとして変換するための信号処理回路 3 3及ぴディジタル ズーム回路 34と、 CCDカメラ 8の撮影像を表示するための表示制御回路 3 6 及び TVモニタ 3 7と、 C CDカメラ 8の撮影像又はそれを画像処理により得ら れた画像を記録し或いは TVモニタ 3 7に表示するための記録再生制御回路 3 8 及び記録媒体 3 9のためのドライブと、 使用者の指示を入力するための操作パネ ノレ 40を含んでいる。操作パネル 40に於いては、図 2 Bに例示されている如く、 再生ボタン 4 3、録画ボタン 4 7、 シャッタボタン 44、ズーム拡大ボタン 4 2、 ズーム縮小ボタン 1 4 3、十字カーソルボタン 4 5、モードスィツチ 4 8等の種々 のボタンが設けられ、 使用者の指示が C PU 3 5に接続された操作パネル 40を 介して入力されるよう構成される。
上記の構成に於いて、 CCDカメラ 8の撮像素子 7に結像された被験試料 4の 顕微鏡像は、 撮像素子 7にてアナログの電気信号、 即ち、 画像信号に変換され、 画像信号は、 C PU 3 5の制御下、 信号処理回路 3 3へ送信され、 増幅処理ゃフ ィルタリング処理、 輪郭強調などの画像処理が施された後、 ディジタルズーム回 路 34 (ディジタル信号処理部） に送られる。 デジタルズーム回路 34は、 信号 処理回路 3 3からのアナログの画像信号を A/D変換してディジタル画像信号に 変換し、 必要に応じてガンマ補正などのディジタル処理を施した後、 TVモニタ 3 7に画像を表示するための表示制御回路 3 6と、 画像データをメモリスロッ ト (図示せず） に収容されている着脱可能な記録媒体 39 (例えば、 メモリカード、 ハードディスク、 磁気ディスク、 光磁気ディスクなど） に記録するための記録再 生制御回路 3 8とにディジタル画像信号を送信する。 この点に関し、 本発明の装 置に於けるデジタルズーム回路 34は、 C P U 3 5からの制御信号に基づいて C C Dカメラ 8によって取り込まれる全画素領域のうちの任意の一部の領域のみを 切り出して、 その切り出された画像領域を任意の倍率にて拡大して表示制御回路 3 6又は記録再生制御回路 3 8へ送信できるよう構成されている。 従って、 C C Dカメラ 8によって撮影された顕微鏡像のうちの一部のみを、 T Vモニタ 3 7上 に拡大して表示することができ、或いは、記録媒体に記録することが可能である。 また、 上記の構成に於いて、 記録再生制御回路 3 8は、 C P U 3 5から与えら れる再生制御信号に応答して、 記録媒体 3 9に記録されているディジタル画像信 号を読み出し、 読み出されたディジタル画像信号は、 表示制御回路 3 6を介して T Vモニタ 3 7に入力され、 これによつて、 T Vモニタ 3 7の画面上に記録され た被験試料 4の画像が表示されるようになっていてよい。
上記の画像処理装置の操作に於いて、 使用者が操作パネルの録画ボタン 4 7を O Nにすると、 本発明の装置は、 録画モードに入り、 C P U 3 5は、 記録制御信 号を記録再生制御回路 3 8に供給する。 記録再生制御回路 3 8は、 記録制御信号 に応答して、 ディジタルズーム回路 3 4から供給される画像信号を記録媒体に記 録する。 また、 再生ボタン 4 3を O Nすると、 本発明の装置は、 再生モードに入 り、 C P U 3 5は、 再生制御信号を記録再生制御回路 3 8に供給し、 記録再生制 御回路 3 8は、 上記の如く記録された画像データを T Vモニタ 3 7に表示する。 更に、 モードスィッチ 4 8が撮像モードとなっているとき、 シャツタボタン 4 4 を押すと、 C P U 3 5からデジタルズーム回路 3 4に制御信号が出力され、 その ときの C C Dカメラ 8から 1コマ分の画像が、 デジタルズーム回路 3 4にてディ ジタル信号処理を施された後、 メモリ 4 1に書き込まれる。 メモリ 4 1に書き込 まれた画像データは、 任意の圧縮回路によって圧縮処理されて、 カードリーダ Z ライタ装置によってメモリカードに記録される。
デジタルズーム回路 3 4に於ける C C Dカメラ 8によって取り込まれる全画素 領域のうちの任意の一部の領域のみの切り出しは、 ズーム拡大ボタン 4 2、 ズー ム縮小ボタン 1 4 3と十字カーソルボタン 4 5とにより設定される。 画像の切り 出し領域の設定の際、 T Vモニタ 3 7上には、 デジタルズーム回路 3 4によって 切り出される画像領域の中心を表す 「ズーム中心位置」 が表示され、 また、 切り 出される画像領域の枠が表示される。 使用者は、 T Vモニタ 3 7を観ながら、 十
7一 字カーソルボタン 4 5を操作して、 任意の位置にズーム中心位置を設定するとと もに、 ズーム拡大ボタン 4 2、 ズーム縮小ボタン 1 4 3を操作して、 切り出され る画像領域の大きさを設定することができる。切り出した後の画像の拡大倍率は、 M = 1 . 0 0 ( C C Dカメラで取り込む全領域） 一 4 . 0 0 ( C C Dカメラで取 り込む全領域の 1ノ4 ) の範囲内にて自由に設定可能であってよい。
なお、 上記の如き、 画像の拡大は、 デジタルズーム回路 3 4に於いて行うので はなく、 顕微鏡内の光学系を調節すること （光学的ズーム） により行なってもよ レ、。 光学ズームは、 例えば、 C C Dカメラ 8と第 2のリ レーレンズ 1 8の間の焦 点距離をステッピング · モーターによるモーター駆動で、 光軸上で移動させるこ とにより実行される。 また、 光学ズームを行うためのレンズ （ズームレンズ） の 構成として、 3変倍レンズ群、 収差補正などを行なう補正レンズ群及びフォー力 ス調整を行なうフォーカスレンズ （図示せず） を用いて、 レンズの焦点距離を 1 0段階で手動又は自動で可変できるようになっていてよい。 ズームレンズの駆動 は、 C P U 3 5から発せられる制御信号に基づいて、 ズームレンズの周囲に取り 付けられたズームモーター （超音波モーターなど） の作動により、 ズームレンズ を光軸に沿って移動させることにより為されてよい。
更に、 コンピューター 8 0は、 自動分注装置 1 0 0、 照明装置 8 2 (光源 2を 含む） の作動を制御するべく、 これらの装置と接続され、 自動分注装置 1 0 0に よる分注動作の実行と同期して、 C C Dカメラ 8による撮像された画像信号を取 得できるようになっていてよレ、。 第一の実施形態の装置による被験試料の観察及び測定
既に述べた如く、 発光タンパク質による発光現象を測定する場合、 発光強度が 極めて微弱で、 ほとんど光信号として、 C C Dカメラで検出することができず、 細胞の内部構造は、 通常、 観察できない。 即ち、 通常の顕微鏡観察のように、 試 料内の観察対象である細胞を確認しながら対物レンズのフォーカスを合わせるこ とができない。 そこで発光観察に於ける対物レンズのフォーカス位置は、 透過光 観察により、 ハロゲンランプなどの光源からの光を照明光学系を通して、 被験試 料に照明し、 被験試料による顕微鏡の照明画像を得て、 これに基づいて決定され る。 例えば、 透過光観察において、 高いコントラス ト像が得られる、 対物レンズ の光軸上の 2箇所の略中心位置を対物レンズの焦点位置とすることにより、 生物 発光タンパク質による発光強度が大きくなつてきたときに、 C C Dカメラに合焦 された鮮明な発光像が得られる。 以下、 上記の本発明の装置を用いて、 本発明の 発光タンパク質による発光によるイメージングの方法について述べる。
図 3は、 本発明の発光ィメ一ジングの方法に於ける処理過程をフローチヤ一ト の形式にて表したものである。 同図を参照して、 まず、 被験試料 4 (細胞等） と 培養液をシャーレ （試料容器 2 1 ) に入れ、 試料容器 2 1を装置にセッ トし （ス テツプ 1 )、 照明光が点灯される。 （ステップ 2 )。 そして、 対物レンズ 1 5を通し て、被験試料 4の顕微鏡像を C C Dカメラ 8の撮影素子 7の受光面上に結像させ、 撮像素子 7からの信号から、 被験試料の照明画像を取得する （ステップ 3 )。 次い で、 得られた照明画像のうち、 所望の領域を指定し、 適切な細胞密度の領域を指 定する （ステップ 4 )。 しかる後に、 ステージを移動し、 指定した適切な細胞密度 の領域を視野の中心に移動する （ステップ 5 )。 そして、 照明画像のデータを記憶 装置に記憶し （ステップ 6 )、 照明を消灯し （ステップ 7 )、 最初の照明画像の取 得が完了する。
次に、 被験試料中の細胞内で発光タンパク質を発現させるために、 細胞の刺激 手段を用いて細胞を刺激する。 細胞を刺激する薬剤は、 自動分注装置で投与され てよい （ステップ 8 )。 なお、 ここで、 ステップ 8の直後に照明を行い、 照明画像 のデータを記憶装置に保存してもよい （ステップ 9 )。 そして、 照明を行わず、 発 光信号を取得し、 （ステップ 1 0 )、 発光信号を記憶装置に保存して （ステップ 1 1 )、 これにより、最初の発光画像の取得が完了する。次いで、所定時間、 または、 所定の発光強度、 または、 所定回数に達するまで、 ステップ 1 0、 ステップ 1 1 を繰り返し、 発光画像を取得する。 このときに、 照明画像の取得と発光画像の取 得は一対で行うことも可能であり、 または、 所定回数ごとに照明画像を取得する ようにしてよレ、。 このパターンは、 細胞の動きやすさ、 測定期間等により適した パターンで実行されてよい。
かく して、 照明画像と発光画像の取込が完了すると、 画像処理装置 （コンビュ 一ター 8 0 ) に於いて、 照明画像と発光画像の重ね合わせ画像を作製し、 表示す る （ステップ 1 2 )。 かく して、 表示された照明画像と発光画像の重ね合わせ画像 を参照することにより、発光している細胞を特定することができる。 したがって、 測定中に細胞が移動しても容易に細胞を特定することができる。
次に、 重ね合わせた画像に於いて細胞の発光部位を丰 lj別できるかどうかの判断 を行い、 判別できる場合 （ステップ 1 3 ： Y e s ) は、 測定領域を指定する （ス テツプ 1 5 )。 測定領域の指定は、 モニタ上でマウスやカーソル、 或いは、 ポイン タなどの手動による画面領域の指定が可能な任意の手段を用いたり、 画像処理を 行って、 閾値を変更することによりすることにより為されてよい。 例えば、 細胞 1つを測定領域とすることも可能であり、 細胞のある一部を測定領域として指定 することもできる。
一方、 細胞の発光部位を判別しにくい場合 （ステップ 1 3 ： N o ) は、 C C D カメラからの出力を擬似カラーで表示し （ステップ 1 4 )、 見やすく してから、 測 定領域を指定する （ステップ 1 5 )。 ここでも、 例えば、 細胞 1つを測定領域とす ることも可能であり、 細胞のある一部を測定領域として指定することもできる。 なお、 領域指定は、 細胞などの解析対象への刺激前だけでなく、 刺激後にも行う ようにしてもよく、 刺激後に得た照明画像または発光画像に基づいて、 解析対象 が適切な測定を行なえる領域に、 測定領域を移動してもよい。 刺激時点では発光 がない、 極めて弱い、 または、 少ない場合に、 適正な発光を検出できる領域に測 定領域を変更してもよい。 または、 刺激時点では発光が極めて弱いか非発光の解 析対象細胞のうち、 刺激により発光量が増加した解析対象を特定し、 その後も検 出した解析対象を選択的に追跡してデータを取得し、 解析してもよい。
更に、 発光強度の経時変化をアニメーション表示したり、 数値化してグラフに して表示してもよい （ステップ 1 6 )。 そして、 最後に、 解析を行う （ステップ 1 7 )。 具体的には、 得られたデータを用いて、 個々の細胞の発光強度の比較、 同一 細胞の部位別の発光強度の比較、 細胞の発光パターンの同定や発光パターンの経 時変化の比較などを行う。 この結果から、 薬剤、 電気、 ガス、 熱刺激に対する細 胞の応答の状態を解析することが可能である。 なお、 刺激が行われない場合の細 胞活動に関しても解析することが可能である。
本発明を用いれば、 例えば、 図 4に示されている如く、 周期的に発光強度が增 減する試料を観察する場合に於いて、 発光が消失しても、 取得した照明画像と発 光画像を重ね合わせることにより、 発光消失の前後において当該細胞を見失うこ となく、 所望の細胞の発光強度の変化を観測することが出来るので、 特定の細胞 を特定し、 発光強度を継続して追跡することが可能である。 本発明の装置の第二の実施形態
図 5は、 図 1に例示の本発明の第一の実施形態の微弱光測定装置に於いて、 更 に蛍光観察を実行するための構成が追加された本発明の第二の実施形態を模式的 に表したものである。
同図を参照して、 第一の実施形態と同様にデジタルズーム又は光学ズームを同 時に行なうことができる本発明の第二の実施形態の装置は、 励起光用の光学系 4 9が追加され、 また、 被験試料 4から発せられた蛍光を C C Dカメラに導くよう 観察光学系 5が修正されている。
励起用光学系 4 9は、励起光源 5 0、 コリメー トレンズ 5 1、偏向ミラー 5 2、 切替式ダイクロイツクミラー 5 3より構成される。励起光源 5 0は、典型的には、 波長 4 8 8 n m、 出力 1 0 mWのアルゴンレーザーである。 なお、 励起光源 5 0 は、 ヘリ ウムネオン ' レーザーなどの可視域のガスレーザーであってもよい。 レ 一ザ一光は、 コリメートレンズ 5 1により ビーム幅を有する円形の平行光束に変 換されて偏向ミラ一 5 2で反射され、 観察光学系 5に設置された切替式ダイク口 イツクミラ一 5 8に入射する。
切替式ダイクロイツクミラー 5 8は、 励起光源 5 0の発振波長の光を反射し、 被験試料 4からの蛍光および発光信号のスぺク トルを透過させるスぺク トル特性 を有する。 観察光学系 5に入射したレーザ一光は、 切替式ダイクロイツクミラー 5 3により反射されて対物レンズ 1 5に下から入射し、 試料容器 2 1内の被験試 料 4に集光され、 被験試料 4内の蛍光分子を励起する。 なお、 切替式ダイクロイ ックミラー 5 8は、 ホルダー （図示せず） に収められており、 励起レーザー光の 発振波長に合わせて、 交換可能に設置されてよい。 また、 励起光源 5 0の波長を 変更する必要がなければ、 切替式ダイクロイツクミラー 5 8を用いず、 通常のダ ィクロイツクミラーが固定されていてもよい。 対物レンズ 1 5は、 NA (開口数） 0. 9程度のもの、 又は、 1. 0以上の高 NAの液浸式の対物レンズが用いられてよい。 被験試料 4から発せられた蛍光信 号、 発光信号は、 対物レンズ 1 5を通って、 装置本体の観察光学系 5を通過する 際に、 切替式ダイクロイックミラー 5 8を透過し、 第 1のリ レーレンズ 1 6、 第 2のリ レーレンズ 1 8を通って、 切替ミラー 20で反射され、 CCDカメラ 8の 撮像素子 7の受光面にて結像される。 そして、 第一の実施形態の装置と同様に、 C C Dカメラ 8からの光信号は、 コンピューター 80に送られ、 コンピューター 80により、 発光画像の描出、 解析、 また発光強度の時間測定、 信号解析などが 行なわれ、 解析結果はコンピューター 80の TVモニタ 3 7の画面上に表示され る。
蛍光観察は、 当業者にとって公知の態様にて行われてよい。 蛍光観察に於いて 用いられる蛍光色素は、例えば、 ローダミン ·グリーン （Rhodamine Green:RhG) T M R 、 Tetramethylrhodamine ) 、 5 - T a m r a ( 5 — carboxytetramethylrhodamine) であってよい。 TMRを励起する場合には、 波 長 5 1 4. 5 n mのアルゴンレーザー、 5 -T a m r aを励起する場合には、 波長 54 3. 5 nmの H e ' N e レーザーなどを励起レーザ一光源として用いられて よレヽ。 また、 蛍光色素として、 F I TC (Fluorescein- isothiocyanate)、 TOT O 1、 Acridine— Orange、 Texas - Redなどが用いられてもよい。 本発明の装置の第三の実施形態
図 6は、 図 5の装置と同様に、 デジタルズーム又は光学ズームを行なうことが でき、 蛍光と生物発光の同時測定を実施可能なもう一つの本発明の微弱光測定装 置の実施形態の模式図を表している。
同図を参照して、 本実施形態に於いては、 測定装置本体、 即ち、 光学顕微鏡は、 遮光ボックス 54内に収容され、 遮光ボックス 54の底部は、 底板 5 5の上に止 め具 5 6で固定され、外部の光が観察光学系 5に侵入しないよう構成されている。 遮光ボックス 54の上面には、 遮光フタ 5 7が分離して取り付けられており、 遮 光フタ 5 7の一端は、 遮光ボックス 54本体と蝶番 58で連結され、 遮光フタ 5 7は扇状に開閉できるようになつている。 照明画像を取得するために、 例えば、 ハロゲンランプ又はメタルハライ ドラン プなどの照明用の光源 2の光が、 照明用光ファイバ一 6 0を通して試料ステージ 3上の試料容器 2 1上面へ導入され、 被験試料 4全体を照明する。 また、 蛍光画 像を取得するために、 本体外部に於いて、 レーザー （励起） 光源 5 0が光源ボッ クス 6 2内に固定され、 レーザー光源 5 0を出射したレーザー光は、 外枠に取り 付けられたレーザ一入射口 6 4を通して、 装置本体に入射する。 レーザ一は、 例 えば、 波長 4 8 8 n m、 出力 1 0 mWのアルゴンレーザーであってよレ、。 レーザ 一入射口 6 4を通して装置本体に入射したレーザー光は、 観察光学系に入り、 切 替式ダイクロイツクミラー 5 3により反射されて対物レンズ 1 5に下部から入射 し、 被験試料 4に集光して照射される。 切替式ダイクロイツクミラー 5 3はホル ダ一に収められ、励起レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に設置される。 試料容器 2 1は X Y試料ステージ 3の上に止めピンで固定される。 X Y試料ス テージ 3は X Y平面に沿って、 ラックピニオン機構により自在に X Y平面上の位 置を移動できるよう構成される。 試料容器 2 1の下方に設置される対物レンズ 1 5は対物レンズ Z軸駆動機構 9に取り付けられており、 光軸 （Z軸） に沿って移 動可能となっている。 対物レンズ Z軸駆動機構 9は、 導線によって、 微弱光測定 装置外部に設置された焦点検出部 7 7と通信し制御される。
観察光学系 5に於いて、 対物レンズ 1 5により集光した信号光は、 切替式ダイ クロイツクミラー 5 3を透過し、 前記の第一及び第二の実施形態とは異なり、 屈 曲せずに鏡筒下部 6 6に取り付けられたレンズ 6 7を通過して、 C C Dカメラ 8 の受光面に集光される。 レンズ 6 7は、 ベース架台 7 5の上に止め具により固定 されている鏡筒下部 6 6に配置され、 C C Dカメラ 8は、 レンズ 6 7の Z軸上の フォーカス位置に受光面のほぼ中心が合うように、 底板 5 5の上に固定されたべ —ス架台 7 5上に置かれる。 試料ステージ 3、 対物レンズ 1 5を担持する本体架 台 7 6は、 底板 5 5の上に固定された支柱 7 3に取り付けられており、 本体架台 7 6は、 鏡筒上部 7 2及び鏡筒下部 6 6に対して上下移動できるようになつてい る。 なお、 任意に、 対物レンズの焦点検出部 7 0が設けられ、 位置検出部 7 1に 繋がれ、 位置検出部 7 1の出力信号が T Vモニタ 3 7に出力されるようになつて いてよい。 試料から発せられる光が微弱であるので、 第一及び第二の実施形態と同様に、 好適には、 C C Dカメラ 8はできる限り高感度のものが用いられる。 C C Dカメ ラ 8の画素数は、 例えば、 1 , 3 6 0 X 1 , 0 2 4となっていてよレヽ。 C C D力 メラ 8から発する喑電流を抑えるために、 C C Dカメラ 8の底部にはペルチェ素 子から成る冷却装置 2 9が装着され、 C C Dカメラ 8の温度を 0 °C程度で冷却保 温するようになっていてよい。 C C Dカメラ 8の受光面の上方には、 赤外線カツ トフィルター 1 3が設置され、 背景光となる赤外光を遮断する。 ただし、 赤外光 を信号光として取り出す場合は、 この赤外線力ッ トフィルター 1 3を測定の前に 鏡筒下部 6 6から取り外される。 C C Dカメラ 8の出力部には信号ケーブル 6 9 が接続され、 C C Dカメラからの試料の画像は、 信号処理部 7 4を介して、 コン ピューター 8 0へ送信され、 T Vモニタ 3 7上に表示される。 C C Dカメラ 8は 3板式カラーカメラとして、 カラーの照明画像が得られるようにしても良い。
作動に於いて、 まず、 照明用の光源 2による被験試料 4の照明画像により、 対 物レンズの焦点が試料に合わされる。 そのために、 対物レンズ Z軸駆動機構 9に より対物レンズ 1 5を光軸に沿って適当量移動し、 その移動ステップ毎に C C D カメラ 8からの光出力信号を信号処理部 7 4で信号解析し、 高コントラス ト画像 が得られる対物レンズ 1 5の光軸上の位置を検出する。 そして、 上下 2箇所の高 コントラス ト画像が得られる対物レンズ 1 5の光軸上の位置を見つけ出し、 信号 処理部 7 4で計算を行なって、 上下 2箇所の略中央位置を発光観察時の焦点位置 とする。 そして、 対物レンズ Z軸駆動機構 9を動作させて、 その焦点位置に対物 レンズ 1 5を移動し固定し、 その後、 被験試料 4から発せられる蛍光信号並びに 発光信号を C C Dカメラ 8で受光する。
対物レンズ Z軸駆動機構 9には、 複数の対物レンズ 1 5が交換可能に取り付け られるようになっていてよい。被験試料 4中の細胞等が培養液中で移動する場合、 高倍率の対物レンズ 1 5でこれを観察すると、 視野が狭いので、 場合によっては 被験試料 4の細胞等が移動して視野からいなくなってしまうことがある。そこで、 好適には、 X 1 0、 X 2 0といった低倍率の対物レンズ 1 5で被験試料 4を観察 . し、 被験試料 4の所望の位置を確認してマウスやキーボードを用いて指定し、 本 発明の装置によるズームアップ機能により画像を拡大することが望ましいであろ う。 なお、 信号処理部 7 4として、 コンピュータ一を用いても良い。 上記に説明した本発明の有効性を検証するために、 以下の如き実験を行った。 なお、 以下の実施例は、 本発明の有効性を例示するものであって、 本発明の範囲 を限定するものではないことは理解されるべきである。 例 1
例 1では、 図 1の測定装置に自動分注装置 1 0 0を付加した微弱光測定装置を 用いて、 ルシフェラーゼ遺伝子を導入した複数の H e L a細胞に於いて、 薬剤刺 激によって引き起こされる発光を画像中の特定の細胞について経時的に観察した 被験試料としては、 H e L a細胞に、 テトラサイクリン · リプレッサ一 （T e t R) を恒常的に発現させるベクター 「p c D NA 6 T R (インビトロジェン 社製）」 と、 テトラサイクリン'オペレータ （T e t O 2 ) をもつ発現べクタ一 「p c DNA 4 /T O (インビトロジェン社製）」 にルシフェラーゼ遺伝子をつなげた プラスミ ドとを導入したものを用いた。 これら二つの遺伝子を導入された細胞内 に於いては、 図 7 Aに模式的に示されているように、 まず、 T e t Rのベクター ( p c D NA 6 /T R) により T e t Rが発現し、 T e t Rがホモダイマ一とな つて、 T e t O 2遺伝子領域に結合し、 これにより、 T e t O 2領域に接続され ているルシフェラーゼ遺伝子の転写は抑制される。 ここで、 図 7 Bに模式的に示 されているように、 細胞にテトラサイクリンを与えると （薬物刺激）、 テトラサイ クリンが T e t Rホモダイマ一の立体構造変化を引き起こし、 T e t Rホモダイ マーが T e t O 2領域から脱離し、 ルシフヱラーゼ遺伝子の転写、 ルシフヱラー ゼの発現が誘導される。本実験例では、上記の遺伝子が導入された細胞に於いて、 テトラサイクリンによる刺激によって、 細胞内にてルシフェラーゼが発現し発光 現象が起きることを観察した。
図 1の装置に於いて、 対物レンズ 1 5は、 オリンパス製 UA p o / 3 4 0 ( 2 0倍、 N. A. 0. 7 5)、 及び、 市販の顕微鏡用対物レンズ 「0 i し 2 0倍、 N A 0. 8」 又は 「5倍、 NA 0. 1 3」 のものを用いた。 C CDカメラ 8は、 5 °C冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「D P 3 0 BW (オリンパス社製）」を用いた。 同 CCDカメラに於いて、 CCD素子 （撮像素子 7に対応） は、 2 3インチ型、 画素数 1 36 0 X 1 0 24、 画素サイズ 6 μ m角である。 対物レンズから結像レ ンズ （リ レーレンズ） を通して C CD素子上に結像する被験試料の像の総合倍率 は、 4倍とした。 H e L a細胞の観察及び撮像中は、 装置全体を喑箱で覆った状 態で行った。
実験操作は、 以下の手順で行った。
( 1 ) T e t Rを恒常的に発現させるベクターと T e t 02をもつ発現ベクター にルシフヱラーゼ遺伝子をつなげたプラスミ ドとを H e L a細胞に共発現させた 試料を調製した。 培養液は、 1 0 mMの HE P E Sを含む D- MEM培地に、 l m Mのルシフェリ ンを加えたものを用いた。
(2) 次いで、 （1 ) の試料を被験試料とし照明画像と発光画像を撮像した。 照明 画像と発光画像は常に一対で撮像した。 撮像時の露出時間 （CCDカメラに於け る信号の積算時間） は、 照明画像については、 1 0m s e c、 発光画像について は、 5 m i nとした。 '
(3) 次いで、 被験試料にテトラサイクリンを添加し、 被験試料におけるルシフ エラーゼ遺伝子の転写を誘導し、 テトラサイクリンの添加直後に、 （2) と同様に 照明画像と発光画像を一対として撮像した。
(4) その後、 図 8に示されている如く、 1 0m i nの間隔で、 1 0時間後まで 上記 （2) の撮像を繰り返した。 撮像はコンピューター処理によって自動的に行 い、 C CDカメラで得られた光信号は、 本発明の装置に於いて、 自動的にデジタ ルデータに変換した。
(5) 撮像の完了後、 取得した照明画像と発光画像を重ね合わせ、 ルシフェラー ゼが発現している H e L a細胞を特定し、 ルシフェラーゼが発現している H e L a細胞の発光強度の経時的変動を数値化し、解析した。重ね合わせ画像において、 H e L a細胞の発光部位の判別が困難なときは、 C C Dカメラ 8からの出力値を 疑似カラー表示にして、 より視認しゃすく した。
図 9A、 図 9 B及び図 9 Cは、 それぞれ、 照明画像、 発光画像及ぴ重ね合わせ 画像を示している。 図 1 0は、 上記の手順にて得られた画像に於いて、 特に、 図 9 Cの重ね合わせ画像に於いて四角枠にて囲まれた領域 RO I— 1 と RO I— 2 の二つの細胞に於ける発光強度の経時的変動を示す。かく して、本発明によれば、 どの細胞が発光しているかを特定して、 発光の経時変化を測定することが可能と なることが証明された。 2.
例 2では、 例 1 と同様の装置を用い、 発光バクテリア Rphosphoreum) の発 光観察を行い、 細胞に於ける薬物刺激による発光強度の経時的変動を追跡した。 発光バクテリアは、 （ i ) 海水中に独立生活、 （ i i ) 魚類、 頭足類の発光器内で の共生、 （ i i i ) 死魚、 獣肉上での繁殖、 （ i V ) 海水魚の消化管中やイカの表 皮への常習的寄生などの形で自然界に広く存在する運動性を有する発光生物であ り、 好気的条件にて連続的に肉眼で観察できるほど強い発光を示す。
観察に於いては、 対物レンズ 1 5は、 オリンパス製 UA p oノ 3 4 0 (4 0倍 N. A. 1. 3 5 ) 又は Oil Iris 「0 i 1 、 4 0倍、 N A 1. 3 5」 を用いた。 その他の撮像条件は例 1 と同じ条件で撮像を行った。 .
実験操作は、 以下の手順により行った。
( 1 ) ホタルイカの発光器に共生する発光バクテリアを分離して、 N a C l濃度 3 %の L B培地中で培養した。 この培養液にグリセロールを加え、 終濃度 2 5 % グリセロール溶液 （ V Z V ) とした。
( 2) ( 1 )の試料を被験試料とし、照明画像（観察画像） と発光画像を撮像した。 照明画像と発光画像は常に一対で撮像した。 撮像時の露出時間 （C CDカメラに 於ける信号の積算時間） は、 照明画像については、 1 0 m s e c、 発光画像につ いては、 1 m i nとした。
( 3 ) 次いで、 自動分注装置 1 0 0 を用いて、 被験試料にアンピシ リ ン (Ampicillin) を添加し、発光バクテリアの細胞壁合成を阻害した。 これにより、 発光バクテリアは増殖を抑制され、 死滅へ向かう。 アンピシリ ンの添加は、 自動 分注装置 1 0 0の動作と撮像とを同期させて実行し、 アンピシリ ンの添加直後に 照明画像と発光画像を一対として撮像した。
(4) その後、 5 m i nの間隔で、 アンピシリ ンの添加から 1時間後まで、 上記 (2) の撮像を繰り返した。 撮像はコンピューター処理によって自動的に行い、 C CDカメラで得られた光信号は、 本発明の装置に於いて、 自動的にデジタルデ ータに変換した。
(5) 撮像の完了後、 取得した照明画像と発光画像を重ね合わせ、 強く発光して いる発光パクテリァを特定し、 重ね合わせ画像を時間順に並べてアニメーション 化し、 発光バクテリアの移動に伴う発光位置の変化を追跡し、 発光バクテリアの 発光の経時的変動を数値化し、 解析した。 なお、 発光バクテリアの追跡はコンビ ユーター処理によって自動的に行っても良い。 図 1 1 A、 図 1 1 B及び図 1 1 Cは、 それぞれ、 照明画像、 発光画像及び重ね 合わせ画像 （疑似カラ一による着色） を示している。 図 1 2は、 発光バクテリア の発光強度の図 1 1 C中の領域 P P— 1の経時的変動を示す。 例 2によれば、 測 定中にパクテリァ等の微生物が移動しても、 どの微生物が発光しているかを特定 して、 発光の経時変化を測定することが可能となることが証明された。 例 3
例 3では、 発光バクテリア V.tischeri) の発光観察を行い、 発光バクテリアの 位置および発光強度の経時的変動を追跡した。 撮像条件は、 例 2と同じとした。 実験操作は、 以下の手順により行った。
( 1 ) 発光パクテリァを N a C 1濃度 3 %の寒天 L B培地プレートで培養し、 培 養プレー卜から発光強度の高いコロニーを選別し、 そのコロニーを N a C l濃度 3 %の液体 L B培地中に懸濁した。
(2) ( 1) の試料を被験試料とし、照明画像（観察画像） と発光画像を撮像した。 照明画像と発光画像は常に一対で撮像した。 撮像時の露出時間 （CCDカメラに 於ける信号の積算時間） は、 照明画像については、 5m s e c、 発光画像につい ては、 3 m i nとした。
(3) その後、 上記 （2) の撮像を繰り返した。 撮像はコンピューター処理によ つて自動的に行い、 C CDカメラで得られた光信号は、 本発明の装置に於いて、 自動的にデジタルデータに変換した。
(4) 撮像の完了後、 取得した照明画像と発光画像を重ね合わせ、 発光パクテリ ァは時間変化と共に移動するため、 重ね合わせ画像を時間順に並べてアニメ一シ ヨン化し、 発光バクテリア （V . t . ) の移動に伴う発光位置の変化を追跡し、 発 光バクテリアの発光の経時的変動を数値化し、 解析した。 なお、 発光バクテリア の追跡はコンピュータ一処理によって自動的に行っても良い。
図 1 3 A、 図 1 3 B及び図 1 3 Cは、 それぞれ、 照明画像、 発光画像及び重ね 合わせ画像であり、 図 1 4は、 時間変化に伴う発光バクテリアの移動している様 子を示している。 図 1 5は、 発光バクテリア （V . t . ) の発光強度の経時的変動 を示す。 例 3に示されている如く、 本発明によれば、 測定中にバクテリア等の微 生物が移動しても、 発光部位を特定して、 発光の経時変化を測定することが可能 となった。 このように、 刺激有無に関わらず動態追跡するだけでも、 例えば行動 学的ないし細胞学的解析 （増殖活性等） を行なうことができる。 また、 バタテリ ァの動態追跡が可能であることから、 刺激有無に関わらず、 被検試料の発光領域 の移動を測定することが可能である。
以上に於いては本発明を特定の実施形態について詳細に説明したが、 本発明は 上述の実施例に限定されるものではなく、 本発明の範囲内にて他の種々の実施例 が可能であることは当業者にとって明らかであろう。

Claims

請求の範囲
1 .光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の画像を取得する装置であって、 前記被験試料を照明する照明部と、 前記被験試料の照明画像を取得する照明画像 取得部と、 前記被験試料内の細胞の発光画像を取得する発光画像取得部と、 前記 照明画像と前記発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成し、 前記重ね合わ せ画像に於いて解析領域を指定する画像処理部とを有することを特徴とする装置。
2 . 請求項 1の装置であって、 前記光学的結像装置が光学顕微鏡であり、 前記照 明画像が前記照明部の照明光を用いて前記光学顕微鏡に於いて透過光観察するこ とにより得られる透過光顕微鏡像であり、 前記発光画像が前記光学顕微鏡に於い て前記細胞内の発光現象により発せられる光を観察して得られる発光顕微鏡像で あり、 前記照明画像取得部と前記発光画像取得部とが共通の顕微鏡像撮影装置を 含み、 前記透過光顕微鏡像と前記発光顕微鏡像とが前記共通の顕微鏡像撮影装置 により撮影されることを特徴とする装置。
3 . 請求項 2の装置であって、 前記顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、 前記光学 顕微鏡が前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる前記対 物レンズと レンズ組立体を含み、 前記受光面に於ける前記被験試料の像の投影倍 率に対する前記対物レンズの開口数の比の 2乗の値が 0 . 0 1以上であることを特 徴とする装置。
4 . 請求項 1の装置において、 前記細胞の蛍光画像を取得するための蛍光画像取 得部を有することを特徴とする装置。
5 . 請求項 4の装置であって、 前記光学的結像装置が光学顕微鏡であり、 前記蛍 光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記被験試料の蛍光観察をすることにより得ら れる蛍光顕微鏡像であり、 前記発光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記細胞内の 発光現象を観察して得られる発光顕微鏡像であり、 前記蛍光画像取得部と前記発 光画像取得部とが共通の顕微鏡像撮影装置を含み、 前記蛍光顕微鏡像と前記発光 顕微鏡像とが前記共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることを特徴とする装 置。
6 . 請求項 1の装置であって、 前記重ね合わせ画像を表示する表示部を有するこ とを特徴とする装置。
7 . 請求項 1の装置であって、 前記重ね合わせ画像を記録する記録部を有するこ とを特徴とする装置。
8 . 請求項 1の装置において、 細胞を刺激する細胞刺激供給部を有していること を特徴とする装置。
9 . 請求項 4の装置において、 前記細胞刺激供給部が、 前記細胞へ試薬を供給す る試薬供給部と、 前記被験試料の温度を調整する温度調整部と.、 前記細胞へガス を供給するガス供給部とからなる群から選択される少なく とも一つであることを 特徴とする装置。
1 0 . 光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の画像を取得する方法であつ て、
前記被験試料を照明し照明画像を取得する過程と、
前記被験試料を照明せずに前記被験試料内の細胞の発光現象により放出される 光による発光画像を取得する過程と、
前記照明画像と前記発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成する過程と、 前記重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する過程と、
を含むことを特徴とする方法。
1 1 . 請求項 1 0の方法であって、 前記重ね合わせ画像を表示する過程を含むこ とを特徴とする方法。 籍 PCTjgTP200fi/32fi342
WO 2007/074929 PCT/JP2006/326342
1 2 . 請求項 1 0の方法であって、 前記重ね合わせ画像を記録する過程を含むこ とを特徴とする方法。
1 3 . 請求項 1 0の方法であって、 前記被験試料を照明し前記照明画像を取得す る過程を複数回実行することを特徴とする方法。
1 4 . 請求項 1 0の方法であって、 前記照明画像及び前記発光画像を取得する過 程に先立って前記細胞に刺激を与える過程を含むことを特徴とする方法。
1 5 . 請求項 1 4の方法であって、 前記細胞に刺激を与える過程に先立って前記 照明画像及び前記発光画像を取得する過程を含むことを特徴とする方法。
1 6 . 請求項 1 4の方法であって、 前記細胞に刺激を与える過程に於いて該細胞 に与えられる刺激が、 薬剤刺激と、 電気刺激と、 ガスによる刺激と、 熱による刺 激とからなる群から選択される少なく とも一つの刺激であることを特徴とする方 法。
1 7 . 請求項 1 0の方法であって、 更に、 前記解析領域に対応する前記発光画像 の領域の光強度を測定する過程と、 該光強度の変化を表示する過程とを含むこと を特徴とする方法。
1 8 . 請求項 1 0の方法であって、 前記被験試料内の細胞の蛍光画像を取得する 過程を含むことを特徴とする方法。
1 9 . 請求項 1 8の方法であって、 前記解析領域に対応する前記照明画像の領域 と、 前記解析領域に対応する前記発光画像の領域と、 前記解析領域に対応する前 記蛍光画像のうち少なく とも 2つを表示する過程を含むことを特徴とする方法。
2 0 . 請求項 1 0の方法であって、 前記光学的結像装置が光学顕微鏡であり、 前 會 PC雕
WO 2007/074929 PCT/JP2006/326342 記照明画像が前記光学顕微鏡に於いて透過光観察することにより得られる透過光 顕微鏡像であり、 前記発光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記細胞内の発光現象 により発せられる光を観察して得られる発光顕微鏡像であり、 前記透過光顕微鏡 像と前記発光顕微鏡像とが共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることを特徴 とする方法。
2 1 . 請求項 2 0の方法であって、 前記顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、 前記 光学顕微鏡が前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる前 記対物レンズと レンズ組立体を含み、 前記受光面に於ける前記被験試料の像の投 影倍率に対する前記対物レンズの開口数の比の 2乗の値が 0 . 0 1以上であること を特徴とする方法。
2 2 . 光学顕微鏡と、 前記光学顕微鏡により観察される被験試料の顕微鏡像を撮 影する顕微鏡像撮影装置と、 前記顕微鏡像を画像データとして取込んで画像処理 を行う画像処理装置とを含む生物由来の被験試料の画像を取得する装置であって 前記画像処理装置が、 前記光学顕微鏡に於いて前記被験試料を透過光観察する 際の前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる透過光画 像と、 前記光学顕微鏡に於いて前記被験試料中の細胞内の発光現象に発せられる 光を前記顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる発光画像とを重ね合わせて重 ね合わせ画像を生成する画像重合部と、 前記重ね合わせ画像に於いて解析領域を 指定する画像領域指定部とを含むことを特徴とする装置。
2 3 . 請求項 2 2の装置であって、 前記顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、 前記 光学顕微鏡が前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる前 記対物レンズと レンズ組立体を含み、 前記受光面に於ける前記被験試料の像の投 影倍率に対する前記対物レンズの開口数の比の 2乗の値が 0 . 0 1以上であること を特徴とする装置。
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