WO2007066479A1 - 二重鎖ｄｎａ量の測定方法および測定用キット - Google Patents
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Definitions
- 001 relates to a double-quantity measuring kit that uses an electric method for determining the double-quantity contained in a sample. Motion is being analyzed on a molecular basis and applied to developments in medicine, agriculture, etc.
- the ultraviolet ratio (26 28) is often used for the determination, but the effect of the impurities outside is large, and the accuracy is low as the dual determination method.
- a method for measuring only the duplex a method of measuring the degree change of the dual compatibility substance that specifically binds to the double is generally used, but it has a high background and is not measurable. Since the enclosure is narrow, there is a problem in that the measurement data has a reason.
- a dual method using an electrical method has been developed. For example, a method of detecting the action of a complex composed of a double-bonding substance by adding a dual-combining substance that specifically binds to the double-bonding substance, and the amount of residual compatible substance that does not double-bond.
- a method of electrically determining for example, patent, 2.
- the excess amount of compatible material is added to the material containing double, and then the flow rate of the compatible material that is not bound is measured to obtain the double content. This method detects weak flow If necessary, the electrode area must always be kept constant and sophisticated electrode manufacturing technology is required.
- an immobilized enzyme electrode is used in order to amplify a weak flow on the electrode, but again, sophisticated electrode fabrication technology is required, and further, the immobilized enzyme is used.
- the reaction must be coupled to another reaction in order to proceed reversibly, which complicates the measurement.
- the amount of the residual compatible substance that remains in the reaction is electrically determined, and the amount of the reactive compound added is determined by the method of determining the double amount.
- the following () to () are characterized in that the line position of the dual compatibility substance measured in the liquid containing the substance is a substance that exhibits properties depending on the medium concentration.
- the present invention relates to an electric double quantity measuring method for obtaining the measured double quantity, and a double quantity measuring kit using the measuring method.
- the amount of double compound contained in the liquid is determined by electrically determining the amount of the separated double polymerizable substance without double bond.
- the position of the line of the dual compatible substance measured in the liquid containing it as a quality depends on the degree of the compatible substance present in the reaction liquid.
- the position of the line of the dual-compatibility substance measured in the liquid containing it has a peak above 2, and the electric charge between those two peaks is the compatibility of the dissociation present in the reaction liquid.
- Axon conductor is one or more selected from 3 Mo pho nop opanes Oncacd (OPS) and N s (hd ox meh) meh 3 amnop opanes Oncacd (PS), described in (4).
- a method for measuring double dose is one or more selected from 3 Mo pho nop opanes Oncacd (OPS) and N s (hd ox meh) meh 3 amnop opanes Oncacd (PS), described in (4).
- a method for measuring double dose is one or more selected from 3 Mo pho nop opanes Oncacd (OPS) and N s (hd ox meh) meh 3 amnop opanes Oncacd (PS), described in (4).
- a method for measuring double dose is one or more selected from 3 Mo pho nop opanes Oncacd (OPS) and N s (hd ox meh) me
- the substance has the desired properties.
- an axon conductor is preferable, and 3 Mo pho nop opaneS Oncacd (OPS) N T s (h d ox meh) meh 3 amnop opane S Onc acd (PS) is particularly preferable.
- the quality of the axon conductor in the liquid used in the light varies depending on the type included in the measurement, but it is sufficient if the measurement material and the line to be used have the same degree of use. It is possible to set any problem with the degree of general use in the research, and 2 is appropriate.
- 009 There is no particular limitation on the bond formula for the dual compatible substance used, but in the double It is preferable that it is an intrusive interface.
- an intercalator for example, an alkyne conductor such as 9 ano-actin, 36 bis (methia quinine, or 36 ano 2 7 meth ial kine is preferably used, and among them, especially 9 Noakujin (9
- the term “separable dual-compatibility material” means a dual-compatibility material that is not substantially bound to a double in a liquid.
- a single complementary base sequence immobilized on a carrier is used.
- a duplex include a duplex formed between a human and a mouse, or a duplex of SS, or a duplex prepared from c reverse-transcribed from, etc. it can.
- ⁇ A phenomenon in which waves near 5 change to concentration, more specifically, a phenomenon that occurs as the frequency decreases.
- This phenomenon in Fig. 9 is considered to be a phenomenon that appears as the sum of concentration phenomena, such as with the use of King's buffer, or dispersion on the electrode surface.
- the wave appears as a pick in the potential line, but it can also be sized to the corresponding potential above the pick, but in terms of measurableness, it corresponds to a particular choice of 5-9 boxes. It is preferable to use the electric potential as a unit. For substances whose wave shows a peak above 2, such as, the concentration of these peaks is not. It is preferable that the change is large. You can also measure the charge in question 2 and measure the double amount based on that change. 001
- the function used in the electrical constants in Ming is:
- metals such as platinum electrodes can be preferably used. You can use electrodes, etc., as long as the potential is stable during measurement. Materials such as gold, platinum, stainless steel, carbon, etc. are used for this, and any material can be used without any problems.
- the commonly used electrical method can be used to determine the amount of the dual compatible substance in 001 Ming.
- the position of the compatible substance can be measured, it is possible to use an electric measurement such as a cyclobottomet (), an asybottammet (S), etc.
- the amount of the doublet can be quantitatively determined from the position of the dual compatible substance.
- C to C which maintains the constant temperature in light, and maintains the state of the dual compatibility substance and the dual state. It is usually desirable to set the temperature in the range of 4C to 45C in order to prevent damage to charges.
- the knowledge of dual knowledge is diluted with one or more selected from OPS and PS, a fixed amount is added, and the electrode consisting of the action, counter electrode and reference electrode is added.
- the amount of double substance contained in the sample can be determined by determining the amount of free and double bond.
- measure the pico level of the wave detected on the water dividing line It is okay to measure the wave peak or the peak, but there are cases where it is affected by the frequency and impurities, so in the case of a peak, for example, 5 to 9 are specified in advance. Measure the electric potential. Alternatively, it is possible to measure the potential under a certain condition from the obtained potential line.
- the content is high in A degree, it can be determined by diluting with the above-mentioned (, g). Also, if the axon conductor such as sample PS OPS is sufficiently contained, it is not necessary to replenish the axon conductor, but if this is not contained in the sample, a certain amount ( For example, by adding O) PS OPS, etc., it becomes possible to achieve good determination.
- the kit of Ming is, for example,
- It can be composed of drugs, including substances, and gas-chemical steps such as electrodes.
- a substance is used so that the line position of the dual compatibility substance measured in the liquid containing it depends on the degree of the separated dual compatibility substance present in the liquid. .
- kits examples include a solution of, and 2 of PS as a measuring agent, an electrode of which a counter working electrode is gold-plated on a sheet as a measuring electrode, and an electrode having a printed electrode as a measuring electrode. Is mentioned.
- the kit may include a standard one. Also, a test tube, an ear, an cup, etc. for mixing the sample liquid and the drug, or an pipette, etc. may be attached to the box.
- the double amount contained in the sample can be determined very easily.
- a PS (O PS 5 C 8 5) solution containing 4 from was prepared using a radix of 8 to 49 b.
- the solution () 2 5 was added to this 47 5 and electricity was determined.
- PS (P 8 5) containing 3 was prepared, and 5 equivalents were added to each. S-constant was determined in this way, and the amount of addition was measured. A correlation was found with the potential 2
- Oxidation was determined by measuring the remaining 5 that were not subjected to PC reaction in (c) and (b) from the natural position to 2. Then, after the completion of the PC, the same was determined and asked. As the action and counter electrode, the electrode stuttered with gold on the potentiometer was used, and the electrode acted as the reference was used. A of and was created with the same composition
- the electrode-independent measurement can be performed. It is possible. More expensive measurement of quantified enzyme electrode It is not necessary to have an advanced electrode manufacturing technology that maintains a uniform area, and it should be used for the measurement of double amounts that have been synthesized or produced simply, or double amounts that have been amplified by PC, etc. You can
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Abstract
【課題】 固定化酵素電極のような高価な測定電極や均一な面積精度を維持する高度な電極製造技術を必要としない、簡便かつ精度的に優れた二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法、および該測定方法を用いた測定キットを提供する。
【解決手段】 被検溶液中の二重鎖ＤＮＡ量を、過剰量添加した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の残存量より求める電気化学的測定方法、および該測定方法を用いた測定キットにおいて、前記溶液中に緩衝物質を存在せしめ、前記緩衝物質として、それを含む溶液中で測定した前記二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位を、該溶液中で遊離する該二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度に依存して変化させる性質を示す物質を用いる。
Description
明 細 書
二重鎖 DNA量の測定方法および測定用キット
技術分野
[0001] 本発明は、試料中に含まれる二重鎖 DNA量を簡便かつ精度よく測定する電気化 学的測定方法および該測定方法を用いた二重鎖 DNA量の測定用キットに関する。 生命活動を分子化学的レベルでとらえ、医療、農業等の技術発展に応用して行く取 り組みが盛んになる中、効率的に優れた二重鎖 DNA量の測定方法および測定用キ ットの必要性は益々増大して!/、る。
背景技術
[0002] これまで、 DNAの測定では、特定塩基配列を有する DNAの検出に重点が置かれ 、試料中の二重鎖 DNA量を簡便かつ精度よく測定する技術の開発にはそれほど努 力が払われて ヽな 、のが実状であった。
DNAの簡易測定には、紫外部の吸光度比（260Z280nm)を用いることが多 、が 、不純物や二重鎖 DNA以外の核酸成分の影響が大きぐ二重鎖 DNAの測定方法 としては精度が低い。
一方、二重鎖 DNAのみを測定する方法としては、二重鎖 DNAに特異的に結合す る二重鎖 DNA結合性物質の蛍光強度変化を測定する方法が一般的であるが、バッ クグラウンドが高いことや、測定可能な濃度範囲が狭いことから、測定データの処理 が煩雑となる課題を有する。
[0003] この様な従来の簡易測定法に対し、電気化学的な手法を利用した二重鎖 DNAの 測定方法も開発されている。例えば、二重鎖 DNAに特異的に結合する二重鎖 DNA 結合性物質を添加して、二重鎖 DNAと結合性物質力もなる複合物の電気化学的な 挙動を検出する方法、二重鎖 DNAに結合して ヽな ヽ残余の結合性物質量を電気 化学的に測定する方法 (例えば、特許文献 1、 2参照)などがある。
特許文献 1に示される方法では、二重鎖 DNAを含む試料に対して、過剰量の二重 鎖 DNA結合性物質を添加した後、結合しなかった遊離の該結合性物質の電極酸化 電流量を測定して、二重鎖 DNA量を求める。この方法では、微弱な酸化電流を検出
する必要力 電極面積を常に精度よく一定に保たなければならず、高度な電極製造 技術が要求される。
また、特許文献 2に示される方法では、微弱な酸ィ匕電流を電極上で増幅させるため 、固定ィ匕酵素電極を用いるが、やはり、高度な電極製造技術が要求され、さら〖こは、 固定化酵素を触媒とする酸化還元反応が可逆的に進行するように別反応と共役させ る必要があり、測定用液の組成が複雑となってしまうという問題点を有している。
[0004] 特許文献 1 :特開 2002— 218998号公報
特許文献 2：特開 2004— 257993号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記事情に鑑みてなされた本発明の課題は、固定ィ匕酵素電極のような高価な測定 電極や均一な面積精度を維持する高度な電極製造技術を必要としな 1ヽ、簡便かつ 精度的に優れた二重鎖 DNA量の電気化学的測定方法、および該測定方法を用い た測定用キットを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 発明者は、電気化学的測定法が抱える上記のような問題を解決すべく鋭意検討を 行った結果、特定の緩衝物質を含む溶液中で測定される、ある種の二重鎖 DNA結 合性物質の電位電流曲線における酸ィ匕波電位が二重鎖 DNA結合性物質の濃度に 依存して変化する現象を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、二重鎖 DNAと二重鎖 DNA結合性物質を反応させた後、反 応液中に残った遊離の二重鎖 DNA結合性物質の量を電気化学的に測定して、二 重鎖 DNA量を求める方法において、反応液にカ卩える緩衝物質として、該緩衝物質 を含む溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の電位電流曲線の酸ィ匕波電位が 、その液中濃度に依存して変化する性質を示す物質を用いることを特徴とする、以下 の（1)から（10)に示す、測定された酸ィ匕波電位の変化量より二重鎖 DNA量を求め る、電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法、およびその測定方法を用いた二重鎖 DNA量の測定用キットに関する。
(1)二重鎖 DNAを含む溶液に、該二重鎖 DNAに対して過剰量の二重鎖 DNA結
合性物質を加えて反応させた後、二重鎖 DNAと結合しな力つた余剰の遊離した二 重鎖 DNA結合性物質の量を電気化学的に測定することによって、溶液中に含まれ ていた二重鎖 DNA量を求める測定方法において、該反応溶液中に、緩衝物質とし て、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の電位電流曲線の 酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖 DNA結合性物質の濃度に依 存して変化する性質を与える物質を用いることを特徴とする、電気化学的な二重鎖 D NA量の測定方法。
(2)緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の 電位電流曲線の酸ィ匕波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖 DNA結合性 物質の濃度が低下するに従って低電位側に移動する性質を与える物質を用いる、 ( 1)に記載の電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法。
(3)緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の 電位電流曲線の酸ィ匕波電位が 2つ以上のピークを有し、それらピーク間の電位差が 反応溶液中に存在する遊離の二重鎖 DNA結合性物質の濃度が低下するに従って 小さくなる性質を与える物質を用いる、 (1)に記載の電気化学的な二重鎖 DNA量の 測定方法。
(4)緩衝物質がアルキルスルフォン酸誘導体である、 (1)に記載の電気化学的な二 重鎖 DNA量の測定方法。
(5)アルキルスルフォン酸誘導体が 3- Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS)、お よび N Tris(hydroxymethyl)methyl— «3— aminopropanesulfonic acid (TAP¾)力ら選は れた一種以上である、（4)に記載の電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法。
(6)二重鎖 DNA結合性物質が二重鎖 DNAのインターカレーターである、（1)に記 載の電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法。
(7)インターカレーターがアタリジン誘導体である、 (6)に記載の電気化学的な二重 鎖 DNA量の測定方法。
(8)アタリジン誘導体が 9 アミノアクリジンである、 (7)に記載の電気化学的な二重 鎖 DNA量の測定方法。
(9)二重鎖 DNA力 RNAより逆転写反応によって調製されたものである、 (1)に記
載の二重鎖 DNAの測定方法。
(10) (1)から（9)の何れか 1項に記載の電気学的な二重鎖 DNA量の測定方法を用 いた、二重鎖 DNA量の測定用キット。
発明の効果
[0007] 固定化酵素電極のような高価な測定電極や均一な面積精度を維持する高度な電 極製造技術を必要とせず、二重鎖 DNA量を簡便かつ精度よく電気化学的に測定す ることが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明で使用される緩衝物質は、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA 結合性物質の電位電流曲線の酸ィヒ波電位力 反応溶液中に残った遊離の二重鎖 DNA結合性物質の濃度に依存して変化させる性質を示す物質であればよぐとりわ け、該二重鎖 DNA結合性物質の濃度が低下するに従って酸化波電位を低電位側 にシフトさせる性質を示す物質であることが好ましい。
このような性質を示す緩衝物質としては、アルキルスルフォン酸誘導体が好ましぐ 特に 3- Morpholinopropane sulfonic acid (以降 MOPSと略す）や N- Tris(hydroxymeth yl)methyl-3-aminopropane sulfonic acid (以降 TAPSと略す）が好ましい。
本発明で使用される溶液中におけるアルキルスルフォン酸誘導体等の緩衝物質 の濃度は、測定試料中に含まれる DNA量や種類によっても異なるが、測定試料と予 め作成する検量線に使用される濃度が同じであれば良ぐ生化学的研究や試験検 查で一般的に使用される濃度で何ら問題なく測定でき、 1から 200mMが適当である
[0009] 本発明に利用される二重鎖 DNA結合性物質の二重鎖 DNAに対する結合様式に 特に限定はな 、が、二重鎖 DNAの中に入り込むインターカレーターであることが好 ましい。このようなインターカレーターとしては、例えば、 9 アミノアクリジン、 3, 6— ビス (ジメチルァミノ)アタリジン、または 3, 6 ジァミノ一 2, 7 ジメチルァクリジンなど のアタリジン誘導体が好適に使用され、そのうちでも特に 9 アミノアクリジン (以降 9 AAと略す）がより好適に使用できる。
本発明で使用される二重鎖 DNA結合性物質の量は、溶液中に含まれる二重鎖 D
NAに対して過剰量であればよいが、例えば、 9AAまたはアタリジン誘導体等を用い て二重鎖 DNAとの結合をは力る場合、二重鎖 DNAと結合しな力つた余剰の遊離し た二重鎖 DNA結合性物質の濃度として 1から 500 μ Μが好ましぐ 10力 200 μ Μ であることがより好ましい。なお、本発明において、「遊離する二重鎖 DNA結合性物 質」とは、溶液中で二重鎖 DNAとは実質的に結合していない二重鎖 DNA結合性物 質を意味する。
[0010] 本発明の方法によって電気化学的に測定される二重鎖 DNAとしては、例えば、 遊離状態で溶液中に存在する一般的な二重鎖 DNAの他、担体上に固定化された 一本鎖のプローブ DNAと相補的な塩基配列を持つ試料 DNAとの間で形成された 二重鎖 DNA、または SRSVのような RNAウィルスの RNA、 mRNA、若しくは rRNA など力 逆転写された cDNAより調製された二重鎖 DNA等が挙げられ、二重鎖 DN Aであれば何れも問題なく適用できる。
[0011] 本発明における酸ィ匕波電位の変化とは、例えば、 9AAにおける対銀参照極電位 1 カゝら 1. 5V付近の酸化波が濃度依存的に変化する現象、詳しくは、 9AAの濃度が低 くなるに従って低電位側にシフトする現象をいう。 9AAにおけるこのような現象は、 9 AA分子間のスタツキング現象や緩衝物質との相互作用、あるいは電極表面におけ る拡散など、濃度依存的現象の総和として現れる現象と考えられる。
[0012] 本発明における酸化波電位は、測定される試料溶液の組成によって、影響を受け る力 測定に用いる二重鎖 DNA結合性物質と緩衝物質とを含む系における酸化波 電位の変化量と二重鎖 DNA量との検量線を予め作成しておくことで、なんら問題な く二重鎖 DNA量を測定することができる。酸ィ匕波は電位電流曲線の電流値のピーク として表われる力 該ピークの頂上に対応する電位を酸ィ匕波電位とすることもできる 力 測定精度の点から、該ピークの電流値の 50%から 90%の範囲力も選択した特定 の電流値に対応する電位を酸ィ匕波電位として用いることが好ま 、。 9AA等のように 酸化波が 2つ以上のピークを示す物質の場合、これらのピークのうち、濃度依存的な 変化が大きいピークの電位を酸ィ匕波電位として用いることが好ましい。また、 2つのピ ーク間の電位差を測定して、その変化に基づ ヽて二重鎖 DNA量を測定してもよ 、。
[0013] 本発明における電気化学測定で使用される作用極には、金電極、金スパッタ電極
のほか、白金電極などの貴金属電極が好適に使用できる。参照極には、銀電極、銀 一塩ィ匕銀電極などが使用でき、測定時に電位が安定していればよい。対極には、金 、白金をはじめステンレス、炭素などの材料が使用され、導電性の材料であればなん ら問題なく使用できる。
[0014] 本発明における二重鎖 DNA結合性物質量の電気化学的測定には、ごく一般的に 使用される電気化学的手法が利用可能であり、電位と電流の関係から二重鎖 DNA 結合性物質の酸ィ匕波電位を測定することができれば、特に限定されるものではな 、 本発明における電気化学的測定には、サイクリックボルタンメトリー（以降 CVと略す )、リニアスイープボルタンメトリー（以降 LSVと略す)等の電気化学的な測定を利用 することができ、二重鎖 DNA結合性物質の酸ィ匕波電位の変化から二重鎖 DNAの 量を定量的に測定することができる。
本発明における測定温度範囲は、 DNAの二重鎖構造が維持され、かつ、二重鎖 DNA結合性物質と二重鎖 DNAとの結合状態が維持される 0°C力 85°Cであるが、 水分の蒸発による濃度変化や低温での凍結、また、それらに伴う測定試料へのダメ ージを防ぐため、通常は 4°C力も 45°Cの温度領域での測定が望ま U、。
[0015] 本発明によれば、例えば、二重鎖 DNA量未知の試料を MOPSや TAPSより選ば れた一種以上を含む緩衝液で希釈し、一定量かつ過剰量の 9AAを添加し、そのま ま、作用極、対極、参照極力ゝらなる測定電極を挿入し、二重鎖 DNAに結合していな V、遊離の 9AAの電気化学的測定を行うことによって、試料中に含まれて 、た二重鎖 DNA量を求めることができる。
[0016] 本発明における具体的な操作を例示すれば、 10mM TAPS, 50mM KC1緩衝 液 pH8. 5を用い、二重鎖 DNA濃度既知（例えば 0から 50ngZ L)の DNA溶液を 調製し、一定かつ過剰量 (例えば、 50 iu M相当）の9AAを添カ卩し、作用極と対極とし て金電極、参照電極として銀電極の 3極を挿入し、 CVあるいは LSVを行う。参照極と して銀電極を用いる場合、測定溶液に塩素イオンを添加すると銀電位はより安定す るため、例示では KC1をカ卩えている力 安定な電極を用いれば、特に加える必要は ない。
CVにおいては、自然電位から対参照極電位 2Vまで、 500mVZs以下の走引 速度で走引し、その後ただちに、対参照極電位 2Vまで、同一の速度で走引する。電 極の自然電位が安定していれば、自然電位から対参照極電位 2Vまで、 500mV/s 以下の走引速度で走引する LSV測定を行っても良い。
この時、対銀参照極電位 IVから 1. 6Vにおいて、水の分解電流曲線上に検出され る酸化波のピーク電位を計測する。酸ィ匕波のピーク電位は、ピークトップを計測しても 良いが、緩衝液成分の濃度や不純物などの影響を受ける場合もあることから、ピーク 電流値の一定割合、例えば 50%から 90%電流値をあら力じめ定めておき、その電 流値における電位を計測する。あるいは、得られた電位電流曲線の微分値より、一定 条件で電位を計測する方法をとることも出来る。
[0017] この様にして得られた電位を元に、基準となる、例えば、二重鎖 DNA濃度 OngZ
Lの電位を基準電位とした各試料の電位変化量と DNA濃度力 検量線を作成す る。
この検量線を用い、同様にして得られた被検試料における基準電位に対する電位 変化量から二重鎖 DNA濃度を求める。
被検試料の二重鎖 DNA濃度が高い場合には、先に示した測定溶液 (緩衝液、 9A Aの溶液)で希釈して測定することも出来る。また、試料溶液に TAPS、 MOPSなど のアルキルスルフォン酸誘導体が充分に含まれて 、る場合は、アルキルスルフォン 酸誘導体を補充しなくてもよいが、これが試料溶液に含まれていない場合には、適宜 、一定量 (例えば、 10mM相当）の TAPS、 MOPS等を添加することで、良好に測定 することが可能となる。
[0018] 本発明の二重鎖 DNA測定用キットは、例えば、二重鎖 DNA結合性物質と、緩衝 物質とを含む測定試薬、および電極類などの電気化学的測定手段から構成できる。 緩衝物質としては、それを含む溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の電位電 流曲線の酸ィ匕波電位が、該溶液中に存在する遊離した二重鎖 DNA結合性物質の 濃度に依存して変化するようにさせる物質を用いる。
具体的には、アルキルスルフォン酸誘導体とアタリジン誘導体カゝらなる測定試薬、 作用極として金、白金などの貴金属電極と参照極、対極の三極力 なる測定電極を
用いることによって、当該測定方法を利用した簡便にして精度的に優れた二重鎖 D NA測定用キットを構成し提供することが可能となる。
具体的なキットとしては、例えば、測定試薬として、 100 Mの 9 AA水溶液、および 20mMの TAPS緩衝液、測定用の電極類として、榭脂シート上に対極と作用極を金 でスパッタした電極、および参照極として銀ペーストを印刷した電極等を備えたキット が挙げられる。該キットには、標準用の二重鎖 DNAを付属させてもよい。また、該キ ットに、試料溶液と測定試薬を混合するための試験管、ノィアル瓶、マイクロプレート 等、または採液用のマイクロピペット等を付属させてもょ 、。
本発明のキットを用いることによって、試料溶液と測定試薬を混合し、その一部を測 定用の電極上に滴下した後、例えばポテンシォスタツト装置等の市販の電流走引装 置を用 、て走引し、電位電流曲線上の酸ィ匕波電位のブランク値との差を求めること によって、試料中に含まれる二重鎖 DNA量を極めて簡便に測定することが可能とな る。
実施例
[0019] 以下、本発明を実施例および比較例をもって具体的に説明するが、本発明はこれ らの例によって限定されるものではない。
[0020] 実施例 1
塩基数 80から 4900bpの電気泳動マーカー用の二重鎖 DNAを用い、 0力ら 40ng / /z Lの二重鎖 DNAを含む TAPS緩衝液（10mM TAPS、 50mM KC1、 pH8. 5)溶液を調製した。この二重鎖 DNA溶液 47. 5 μ Lに 9ΑΑ水溶液（ImM) 2. 5 L を加えて電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、銀線を参照極とし、作用 極と対極に金スパッタ電極（電極面積 lmm2)を用い自然電位から 2Vまでの LSV測 定を行った。対銀参照電極 1. 2V付近の酸ィ匕波の 80%電流値より酸ィ匕波電位を求 めた。二重鎖 DNA濃度 OngZ w Lにおける酸ィ匕波電位 (E )を基準に各二重鎖 DN
0
A濃度での酸化波電位 (E )との電位差（Δ Ε)を求め、二重鎖 DNA濃度と Δ Εとの 検量線 (R2=0. 96)を作成した。次に、濃度不明の二重鎖 DNA試料 42. 5 Lに T APS緩衝液（lOOmM TAPS、 500mM KC1、 pH8. 5) 5 Lと 9AA水溶液（lm M) 2. を加え、同様の電気化学的測定を行い Eとの電位差 Δ Εを求めた。検
量線より、この試料の二重鎖 DN A量力 20±2ngZw L(n=4)であることが分かつ た。
[0021] 実施例 2
実施例 1における TAPS緩衝液を MOPS緩衝液（lOmM MOPS、 50mM KCl 、 pH8. 5)とし検量線を作成した。同様にして、実施例 1で用いたと同様の濃度不明 の試料 42. に MOPS緩衝液（lOOmM MOPS、 500mM KCl, pH8. 5) 5 /z Lと 9AA水溶液（lmM) 2. 5 Lを加え、同様の電気化学的測定を行い Eとの電
0 位差 Δ Εを求めた。検量線より、この試料の二重鎖 DNA量力 20ngZ Lであるこ とが分力つた。
[0022] 実施例 3
10から 50 Mの 9AAを含む lOmM TAPS緩衝液（pH8. 5)を用い、自然電位 から 2V (対銀参照電極)までの LSV測定を行った。対極および作用極には金スパッ タ電極（lmm2)を用いた。
50 Mの 9AAを含む溶液における酸ィ匕波電位を基準に、各 9AA濃度の酸化波 電位の低電位側シフト量を測定した。 9AA濃度と電位シフト量には相関 (R2=0. 98 )が認められた（図 1)。
次に、 0力ら 30ngZ Lのえ DNAを含む TAPS緩衝液（pH8. 5)を調製し、それ ぞれに 50 M相当の 9AAを添カ卩した。同様に LSV測定を行い、 DNA無添加に おける酸ィ匕波電位力 のシフト量を測定した。 λ DNA量と電位シフト量との間に相 関が認められた (R2=0. 96) (図 2)。
[0023] 実施例 4
10から 50 Mの 9AAを含む lOmM TAPS緩衝液（pH8. 5)を用い、自然電位 から 2V (対銀参照電極)までの LSV測定を行った。対極および作用極には金スパッ タ電極（lmm2)を用いた。対銀参照電極 1. 2V付近と 0. 65V付近の酸化波の 90% 電流値より酸ィ匕波電位を求め、次 、で両者間の酸ィ匕波電位差を求めた。
50 Mの 9AAを含む溶液における酸ィ匕波電位差を基準に、各 9AA濃度における 酸ィ匕波電位差の低下量を測定した。 9AA濃度と電位差の変化量には相関 (R2=0. 98)が認められた。
次に、 0力ら 30ngZ Lのえ DNAを含む TAPS緩衝液（pH8. 5)を調製し、それ ぞれに 50 M相当の 9AAを添カ卩した。同様に LSV測定を行い、 DNA無添加に おける酸化波電位差に対する各々の電位差の低下量を測定した。 λ DNA量と酸化 波電位差の低下量との間に相関が認められた (R2 = 0. 95)。
実施例 5
(a) 5mM MgCl 、 10mM TAPS— NaOH (pH8. 5)、 50mM KC1、 ImM dN
2
TP、 2. 5 μ Μ ランダム 9merプライマー、および逆転写酵素 AMV Reverse Tr anscriptase (タカラバイオ株式社製) 0. 25U/ μ Lを含む逆転写反応溶液 19 L に、 pSPTetRNA (Life Sciences社製)溶液 1 μ Lを加え、逆転写反応の初期に 起こる铸型 RNAと逆転写産物 DNAオリゴマーの熱変性を防ぐため 30°Cで 10分間 反応した後、 45°Cで 15分間逆転写反応を行い、さらに、不要となった逆転写酵素活 性を失活させるため反応液を 99°Cで 10分間加熱処理し氷冷した。
(b)続いて、 3. 2mM MgCl 、 12. 5mM TAPS— NaOH (pH8. 5)、 62. 5mM
2
KC1、 0. 03U/ μ L DNAポリメラーゼ、 0. 25 M センスプライマー（5， 一 CT GCTCGCTTCGCTACTTGG A - 3，）および、 0. 25 M アンチセンスプライマ 一（5，— CGGCACCTGTCCTACGAGTTG— 3，）を含む PCR反応液 80 Lに、 上記（a)で調製した反応液 20 μ Lを添カ卩し、そのうちの 50 μ Lを 95°C2分間加熱し た後、そのまま冷却せずに、変性温度 95°C、アニーリング温度 60°C、鎖延長温度 72 °Cでの PCR反応を 30サイクル行った。
(c)上記 (b)において PCR反応に供しな力つた残りの反応液 50 Lを測定電極にて 自然電位から 2Vまで LSV測定し、酸化波電位 Eを求めた。続いて、 PCR終了後の
0
反応試料液を同様に測定して酸化波電位 Eを求めた。測定電極には、作用極およ び対極としてポリエチレンテレフタレート榭脂フィルム上に金でスパッタした電極を、 参照極として銀ペーストで印刷した電極を用いた。 Eと Eの電位差 Δ Εは 35mVで、
0 1
あらかじめ同一の反応液組成の溶液に λ DNAを溶解して作成してぉ 、た λ DNA 検量線より、 pSPTetRNAより生成した二重鎖 DNA量が λ DNA換算で 25ng/ μ Lであることが確認された。
産業上の利用可能性
[0025] 電位電流曲線上の電位変化に基づいて定量できる本発明の二重鎖 DNA量の測 定方法および測定キットを用いることによって、従来の電流量の変化に基づいた電気 化学的測定法と異なり、電極面積に依存しないで高精度の測定を行うことが可能とな る。固定化酵素電極のような高価な測定電極や均一な面積精度を維持する高度な 電極製造技術を必要とせず、簡便かつ高精度で合成または抽出した二重 DNAや、 PCR等で増幅した二重鎖 DNA量の測定に利用することができる。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]反応混液中における 9AA濃度と酸ィ匕波電位シフト量との関係図である。
[図 2]二重鎖 DNA濃度と酸ィ匕波電位シフト量との関係図である。
Claims
[1] 二重鎖 DNAを含む溶液に、該二重鎖 DNAに対して過剰量の二重鎖 DNA結合 性物質を加えて反応させた後、二重鎖 DNAと結合しな力つた余剰の遊離した二重 鎖 DNA結合性物質の量を電気化学的に測定することによって、溶液中に含まれて いた二重鎖 DNA量を求める測定方法において、該反応溶液中に、緩衝物質として 、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の電位電流曲線の酸 化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖 DNA結合性物質の濃度に依存 して変化する性質を与える物質を用いることを特徴とする、電気化学的な二重鎖 DN A量の測定方法。
[2] 緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の電 位電流曲線の酸ィ匕波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖 DNA結合性物 質の濃度が低下するに従って低電位側に移動する性質を与える物質を用いる、請求 項 1に記載の電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法。
[3] 緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖 DNA結合性物質の電 位電流曲線の酸ィ匕波電位が 2つ以上のピークを有し、それらピーク間の電位差が反 応溶液中に存在する遊離の二重鎖 DNA結合性物質の濃度が低下するに従って小 さくなる性質を与える物質を用いる、請求項 1に記載の電気化学的な二重鎖 DNA量 の測定方法。
[4] 緩衝物質がアルキルスルフォン酸誘導体である、請求項 1に記載の電気化学的な 二重鎖 DNA量の測定方法。
[5] アルキルスルフォン酸誘導体が 3- Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS)、およ び N— Tns(hyaroxymethyl)methyl— 3— aminopropanesulfonic acid (TAPSノ； g り選【 れ た一種以上である、請求項 4に記載の電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法。
[6] 二重鎖 DNA結合性物質が二重鎖 DNAのインターカレーターである、請求項 1に 記載の電気化学的な二重鎖 DNA量の測定方法。
[7] インターカレーターがアタリジン誘導体である、請求項 6に記載の電気化学的な二 重鎖 DNA量の測定方法。
[8] アタリジン誘導体が 9—アミノアクリジンである、請求項 7に記載の電気化学的な二
重鎖 DNA量の測定方法。
[9] 二重鎖 DNAが、 RNAより逆転写反応によって調製されたものである、請求項 1に 記載の二重鎖 DNAの測定方法。
[10] 請求項 1から 9の何れか 1項に記載の電気学的な二重鎖 DNA量の測定方法を用 いた、二重鎖 DNA量の測定用キット。
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