CN101310176A - 双链dna量的测定方法以及用于测定的试剂盒 - Google Patents

Abstract

提供了一种以简单方式并以优异的精确度电化学测定双链DNA量的方法，该方法不需要任何昂贵的测量电极例如固定化酶电极或者能够保持均一表面积精确度的任何高水平电极制造技术；并且提供了采用该方法的测定用试剂盒。公开了电化学测定试样溶液中双链DNA量的方法，其基于过量加入到该溶液中的能够与该双链DNA结合的物质的残余量；以及采用所述方法的测定用试剂盒。在该方法或试剂盒中，向试样溶液中加入缓冲物质。该缓冲物质是如下物质，其能够允许在含有该缓冲物质的溶液中测定的能够与双链DNA结合的物质的电位－电流曲线的氧化波电位根据溶液中能够与双链DNA结合的游离物质的浓度而变化。

Description

双链DNA量的测定方法以及用于测定的试剂盒

技术领域

本发明涉及以简单和容易的方式精确地电化学测定试样中的双链DNA含量的方法以及用上述测定方法测定双链DNA量的试剂盒。当生命活动在分子化学水平上为人们所了解并且应用于医学科学、农业等的技术发展时，越来越需要测定双链DNA量的有效方法和测定用的试剂盒。

背景技术

迄今，测定DNA的极大重点放在了检测具有特定核苷酸序列的DNA上，而实际上很少将努力放在用简单和容易的方式精确地测定试样中双链DNA量的技术的发展上。

尽管紫外区中的吸光度比率(260/280nm)常常用于DNA的简单测定，但是它极大地受杂质和双链DNA以外的核酸成分的影响，因此测定双链DNA的精度低。

同时，测定双链DNA的方法通常只不过是测定能够与双链DNA特定结合的物质的荧光强度变化的那些方法。然而，它们的问题在于其背景高并且可测定的浓度范围窄，因此使测量数据的处理变得复杂。

除了这些常规的简单测定方法以外，已经开发出利用电化学技术测定双链DNA的方法。例如，存在的一种方法是其中向双链DNA增补能够与双链DNA特定结合的物质以便检测双链DNA与该双链DNA结合物质的复合物的电化学行为，以及一种方法是其中电化学测定没有与双链DNA结合的残余双链DNA结合物质的量(例如参见专利文献1和2)。

根据专利文献1中公开的方法，将过量的双链DNA结合物质加入到含双链DNA的试样中，然后测定没有与双链DNA结合的游离DNA结合物质的电极氧化电流的量以便得到双链DNA的量。该方法要求高水平的电极制造技术，因为该电极必须始终精确地保持其表面积不变以便检测微弱的氧化电流。

根据专利文献2中公开的方法，为了在电极上放大微弱的氧化电流，使用固定化酶电极。然而，该方法仍然要求高水平的电极制造技术，而且仍然存在的问题是它要求试样溶液具有复杂的组成，因为由固定化酶催化的氧化-还原反应必须与另一反应共轭以便反应可逆地进行。

专利文献1：特开2002-218998号公报

专利文献2：特开2004-257993号公报

发明内容

发明所要解决的问题

考虑到上述情况，本发明的目的在于提供一种电化学测定双链DNA量的方法，该方法简单和容易而且精确度优异但是不需要任何昂贵的测量电极例如固定化酶电极或者制造精确保持其表面积均一的电极的任何高水平技术，本发明的目的也在于提供采用上述方法的测定用试剂盒。

解决问题的手段

作为勤勉研究以解决电化学测定方法中的上述问题的结果，本发明人发现以下现象：在含有特定缓冲物质的溶液中测定的某些双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波的电位(即氧化波电位)根据该双链DNA结合物质的浓度而变化，从而完成本发明。

换句话说，本发明涉及如下列(1)至(10)中所述的基于测定的氧化波电位的变化来电化学测定双链DNA量的方法以及用所述测定方法测定双链DNA量的试剂盒，其中通过使双链DNA和能够与该双链DNA结合的物质(即双链DNA结合物质)反应然后电化学测定反应溶液中游离的双链DNA结合物质的残余量来测定双链DNA量，其特征在于向反应溶液中加入缓冲物质，所述缓冲物质具有如下性质：允许在含有该缓冲物质的溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位根据溶液中双链DNA结合物质的浓度而变化。

(1)一种电化学测定双链DNA量的方法，其包括向含有双链DNA的溶液中相对所述双链DNA过量加入能够与该双链DNA结合的物质以便相互反应，然后电化学测定没有与双链DNA结合的游离双链DNA结合物质的残余量以便测定所述反应溶液中双链DNA的含量，其中所述反应溶液包含具有以下性质的物质作为缓冲物质：允许在含有所述缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位根据反应溶液中游离双链DNA结合物质的浓度而变化。

(2)根据(1)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述缓冲物质是具有以下性质的物质：允许在含有该缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位随着反应溶液中游离双链DNA结合物质浓度的降低而向较低电位移动。

(3)根据(1)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述缓冲物质是具有以下性质的物质：允许在含有该缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位具有两个或更多个峰并且允许所述峰中的两个之间的电位差随着反应溶液中游离双链DNA结合物质浓度的降低而减小。

(4)根据(1)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述缓冲物质是烷基磺酸衍生物。

(5)根据(4)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述烷基磺酸衍生物是选自3-吗啉基丙磺酸(MOPS)和N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)中的一种或多种。

(6)根据(1)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述能够与双链DNA结合的物质是双链DNA的嵌入剂。

(7)根据(6)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述嵌入剂是吖啶衍生物。

(8)根据(7)的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述吖啶衍生物是9-氨基吖啶。

(9)根据(1)的测定双链DNA量的方法，其中所述双链DNA由RNA的逆转录反应制成。

(10)用根据(1)至(9)任一项的电化学测定双链DNA量的方法测定双链DNA量的试剂盒。

发明效果

根据本发明，能够以简单和容易的方式精确地电化学测定双链DNA量而无需任何昂贵的测量电极例如固定化酶电极或者制造精确保持表面积均一的电极的任何高水平技术。

本发明的最佳实施方式

用于本发明的缓冲物质可以是具有以下性质的物质：允许在含有该缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位根据反应溶液中游离双链DNA结合物质的浓度而变化。特别优选地，该缓冲物质是具有以下性质的物质：允许所述氧化波电位随着该双链DNA结合物质浓度的降低而向较低电位移动。

具有上述性质的缓冲物质优选是烷基磺酸衍生物，特别优选3-吗啉基丙磺酸(以下简写成“MOPS”)或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(以下简写成“TAPS”)。

在本发明所用溶液中诸如烷基磺酸衍生物等的缓冲物质的浓度根据试样中所含DNA的量和种类而变化。用于试样中的浓度只是必须与预先用于制备校准曲线的浓度相同，在生物化学研究或检验中通常采用的浓度(适宜地1-200mM)下可以令人满意地进行测定。

用于本发明的能够与双链DNA结合的物质可以与双链DNA以任何方式结合，且优选是可以嵌入双链DNA中的嵌入剂。作为这样的嵌入剂，例如，适宜地使用吖啶衍生物例如9-氨基吖啶、3，6-二(二甲氨基)吖啶和3，6-二氨基-2，7-二甲基吖啶。其中，尤其更适宜地使用9-氨基吖啶(以下简写成“9AA”)。

用于本发明的能够与双链DNA结合的物质的量应当相对于溶液中所含的双链DNA过量。例如，当吖啶衍生物9AA等用来与双链DNA合并时，没有与双链DNA结合的残余游离双链DNA结合物质的浓度优选为1-500μM，更优选10-200μM。在本发明中，“游离的双链DNA结合物质”是指在溶液中实质上没有与双链DNA结合的双链DNA结合物质。

可以由本发明的方法电化学测定的双链DNA包括：例如以游离形式存在于溶液中的一般的双链DNA，由载体固定的单链探针DNA和具有互补核苷酸序列的试样DNA形成的双链DNA，以及由RNA病毒(例如SRSV)的RNA、mRNA、rRNA等逆转录的cDNA制成的双链DNA。可以令人满意地采用任何双链DNA。

在本发明中，氧化波电位的变化是指例如相对于银参比电极为约1-1.5V电位的氧化波以依赖9AA浓度的方式变化的现象。更具体地，它是当9AA浓度降低时氧化波电位向较低电位移动的现象。认为9AA的这种现象是包括9AA分子间的堆叠现象、与缓冲物质的相互作用以及在电极表面上扩散在内的浓度依赖现象的总和。

在本发明中，氧化波电位受有待测定的试样溶液的组成影响；然而，可以通过在包含有待用于测定的双链DNA结合物质和缓冲物质的体系中预先作出双链DNA量相对于氧化波电位变化的校准曲线来令人满意地测定双链DNA的量。氧化波显示为电位-电流曲线的电流值的峰。对应于该峰顶点的电位可以看作是氧化波电位。然而，从测定精度的观点来看，优选将对应于选自该峰电流值50-90％范围内的特定电流值的电位用作氧化波电位。当使用在氧化波中显示出两个或更多个峰的物质、例如9AA时，优选将这些峰中以最依赖浓度的方式变化的峰电位用作氧化波电位。在这种情况下，可以通过测量两个峰之间电位的差值并且利用该差值的变化来测定双链DNA的量。

作为用于本发明的电化学测定的工作电极，可以适宜地使用贵金属电极例如金电极、溅射金的电极和铂电极。作为参比电极，可以使用银电极、银-氯化银电极和其它电极，只要其电位在测定过程中稳定即可。诸如金、铂、不锈钢和碳的材料用于对电极，也可以令人满意地使用其它导电材料。

可以将常用的电化学技术用于根据本发明的双链DNA结合物质量的电化学测定。对其没有特别限制只要可以基于电位和电流间的关系测定双链DNA结合物质的氧化波电位即可。

作为根据本发明的电化学测定，可以使用循环伏安法(以下简写成“CV”)、线性扫描伏安法(以下简写成“LSV”)和其它电化学测定，由此可以基于双链DNA结合物质氧化波电位的变化来定量测定双链DNA的量。

根据本发明的测定的温度范围是0℃-85℃，在该温度范围内DNA的双链结构得以保持并且双链DNA结合物质与双链DNA的结合状态得以保持。然而，一般期望在4℃-45℃的温度下进行测定以便防止由于水分蒸发而引起的浓度变化、低温下冻结以及因而的对测定试样的破坏。

根据本发明，可以通过例如下列过程测定试样中所含双链DNA的量：用含有选自MOPS和TAPS的一种或多种的缓冲溶液稀释含有未知量双链DNA的试样；加入恒定且过度量的9AA；在其中直接插入由工作电极、对电极和参比电极组成的测量电极；以及电化学测定没有与双链DNA结合的游离9从。

如下举例说明本发明的具体过程：用pH 8.5的10mM TAPS和50mMKCl缓冲溶液制备已知双链DNA浓度(例如，0-50ng/μL)的DNA溶液；加入恒定且过度量(例如，相当于50μM)的9AA；插入三个电极，即作为工作电极和对电极的金电极以及作为参比电极的银电极；进行CV或LSV。在该实例中，由于当银电极用作参比电极时通过向测定溶液中加入氯离子使银电位更加稳定化，因此加入KCl。然而，如果使用稳定的电极，则不必加入KCl。

在CV中，以500mV/s或更小的扫描速率从自然电位进行扫描至相对参比电极电位为-2V，然后立即以相同速率扫描直至相对参比电极为2V。如果电极的自然电位稳定，可以进行LSV测定，其中以500mV/s或更小的扫描速率从自然电位进行扫描至相对参比电极为2V。

在这种情况下，测定氧化波的峰电位。在水分解的电流曲线上相对银参比电极电位为1V-1.6V处检测氧化波。可以测量峰顶点作为氧化波的峰电位；然而，由于它可能受缓冲溶液成分的浓度、杂质等影响，应当在峰电流值的一定百分比下，例如该峰电流值的50％-90％的预定电流值处测量电位。作为替代，可以使用其中基于在一定条件下获得的电位-电流曲线的微分值测量电位的方法。

基于如此获得的电位，相对于在例如0ng/μL的DNA浓度下测定的基准电位，使用各试样表现出的电位变化和双链DNA浓度作出校准曲线作为标准。

利用该校准曲线，从相对于基准电位的电位变化测定双链DNA的浓度，其中以与上述相同的方式得到有待检验的试样的电位变化。

当有待检验的试样的双链DNA浓度高时，可以在测定前用上述的测定溶液(缓冲溶液和9AA溶液)稀释试样。当烷基磺酸衍生物例如TAPS和MOPS充足包含在试样溶液中时，不必加入烷基磺酸衍生物。当试样溶液中不含烷基磺酸衍生物时，适当加入一定量(例如，相当于10mM)的TAPS、MOPS等，由此可以良好地进行测定。

用于根据本发明测定双链DNA的试剂盒可以包含，例如包括能够与双链DNA结合的物质和缓冲物质的测量试剂，以及诸如电极的电化学测量装置。作为缓冲物质，使用下列物质：具有允许在含有该缓冲物质的溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位根据溶液中游离双链DNA结合物质的浓度而变化的性质的物质。

更具体地，通过使用由烷基磺酸衍生物和吖啶衍生物组成的测量试剂以及由三个电极、即作为工作电极的贵金属电极例如金或铂电极、参比电极和对电极组成的测量电极，可以形成和提供利用本发明方法以简单和容易的方式精确地测定双链DNA的试剂盒。

具体的试剂盒的构成是，例如作为测量试剂的100μM 9AA水溶液和20mM TAPS缓冲溶液、和具有在树脂片上溅射金的对电极和工作电极的测量电极、以及具有由印刷银膏形成的参比电极的电极。该试剂盒可以带有作为标准物的双链DNA。此外，该试剂盒可以包括用于将测量试剂与试样溶液混合的试管、小瓶容器、微量板等以及用于液体采样的微量吸液管等。

使用本发明的试剂盒，可以通过下列过程以简单和容易的方式精确地测定试样中的双链DNA含量：将测量试剂与试样溶液混合；将一部分混合溶液滴在测量电极上；用市售的电位施加设备例如恒电位仪进行扫描；以及测定电位-电流曲线的氧化波电位与空白试验值的差。

实施例

以下，将通过实施例和比较例详细说明本发明。然而，本发明不限于这些实施例。

实施例1

制备含0-40ng/μL双链DNA的TAPS缓冲溶液(10mM TAPS，50mMKCl，pH 8.5)。作为双链DNA，使用碱基对为80-4900电泳标记物用双链DNA。向47.5μL双链DNA溶液中加入2.5μL 9AA水溶液(1mM)，然后进行电化学测定。电化学测定根据从自然电位至2V的LSV测定，其使用银线作为参比电极并使用溅射金的电极(电极表面积1mm²)作为工作电极和对电极。在相对于银参比电极为约1.2V的氧化波的80％电流值下测定氧化波电位。将双链DNA浓度为0ng/μL时的氧化波电位(E₀)作为基准，测定该电位(E₀)与各个双链DNA浓度下的氧化波电位(E_n)之间的差值(ΔE)，并且作出ΔE相对双链DNA浓度的校准曲线(R²＝0.96)。然后，将5μL TAPS缓冲溶液(100mM TAPS，500mM KCl，pH 8.5)和2.5μL 9AA水溶液(1mM)加入到42.5μL具有未知双链DNA浓度的试样中，并以与上述相同的方式进行电化学测定。测出相对于E₀的电位差ΔE。基于该校准曲线，发现该试样的双链DNA浓度为20±2ng/μL(n＝4)。

实施例2

用MOPS缓冲溶液(10mM MOPS，50mM KCl，pH 8.5)代替实施例1中的TAPS缓冲溶液作出校准曲线。与上面相似，将5μL MOPS缓冲溶液(100mM MOPS，500mM KCl，pH 8.5)和2.5μL 9AA水溶液(1mM)加入到42.5μL与实施例1所用相同的未知浓度试样中。通过进行与上述相同的电化学测定测出相对于E₀的电位差ΔE。基于校准曲线，发现该试样的双链DNA浓度为20ng/μL。

实施例3

用含有10-50μM 9AA的10mM TAPS缓冲溶液(pH 8.5)进行从自然电位至2V(相对银参比电极)的LSV测定。使用溅射金的电极(1mm²)作为对电极和工作电极。

将含有50μM 9AA的溶液的氧化波电位作为基准，测定各个9AA浓度下氧化波电位向较低电位移动的量。在9AA浓度与电位移动量之间发现相关性(R²＝0.98)(图1)。

然后，制备含0-30ng/μLλDNA的TAPS缓冲溶液(pH 8.5)，并且向各个溶液中加入相当于50μM的9AA。以与上述相同的方式进行LSV测定，并且基于不含λDNA的溶液的氧化波电位测定移动量。在λDNA量与电位移动量之间发现相关性(R²＝0.96)(图2)。

实施例4

用含有10-50μM 9AA的10mM TAPS缓冲溶液(pH 8.5)进行从自然电位至2V(相对银参比电极)的LSV测定。使用溅射金的电极(1mm²)作为对电极和工作电极。在相对银参比电极为约1.2V和约0.65V的氧化波的90％电流值下测定氧化波电位。随后，测出该两个氧化波电位间的差值。

将含有50μM 9AA的溶液的两个氧化波电位间的差值作为基准，测定各个9AA浓度下两个氧化波电位间差值减小的量。在9AA浓度与两个电位间差值的变化之间发现相关性(R²＝0.98)。

然后，制备含0-30ng/μLλDNA的TAPS缓冲溶液(pH 8.5)，并且向各个溶液中加入相当于50μM的9AA。以与上述相同的方式进行LSV测定，并且基于不含λDNA的溶液的氧化波电位间的差值测定各个电位差值的减小量。在λDNA量与氧化波电位间差值的减小量之间发现相关性(R²＝0.95)。

实施例5

(a)将1μL pSPTetRNA(Life Sciences，Inc.的产品)溶液加入到19μL含5mM MgCl₂、10mM TAPS-NaOH(pH 8.5)、50mM KCl、1mMdNTP、2.5μM随机9mer引物(random 9mer primer)和0.25U/μL AMV逆转录酶(Takara Bio，Inc.的产品)的逆转录反应溶液中。为了防止逆转录反应初期发生的模板RNA和逆转录的DNA低聚物的热变性，首先在30℃进行逆转录反应10分钟然后在45℃进行15分钟。此后，将反应溶液在99℃加热10分钟然后用冰冷却以便使变得不必要的逆转录酶的活性失活。

(b)然后，将20μL上述(a)中制成的反应溶液加入到80μL含如下成分的PCR反应溶液中：3.2mM MgCl₂、12.5mM TAPS-NaOH(pH 8.5)、62.5mM KCl、0.03U/μL DNA聚合酶、0.25μM上游引物(sense primer)(5’-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3’)和0.25μM下游引物(antisenseprimer)(5’-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3’)。接着，将50μL该溶液在95℃加热2分钟。在不将其冷却的情况下，进行聚合物酶链反应(PCR)，其中分别在95℃、60℃和72℃下进行变性、退火和链延长。重复该循环30次。

(c)采用50μL没有用于上述(b)的PCR反应的残余反应溶液，用测量电极进行从自然电位至2V的LSV测定，并且得到氧化波电位E₀。然后，以同样方式测定进行过PCR的反应试样溶液，得到氧化波电位E₁。测量电极由作为在聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂膜上溅射金的电极的工作电极和对电极、以及作为印有银膏的电极的参比电极组成。E₀与E₁之间的电位差ΔE为35mV。使用λDNA在组成与上述反应溶液相同的液体中的溶液预先作出λDNA校准曲线。从该λDNA校准曲线中，证实作为λDNA当量的由pSPTetRNA产生的双链DNA的量为25ng/μL。

工业应用性

根据本发明的测定双链DNA量的方法以及测定用的试剂盒使得能够基于电位-电流曲线的电位变化定量测定。因此，本发明使高度精确的测定成为可能，其不像基于电流量变化的常规电化学测定方法那样依赖于电极的表面积。本发明不需要任何昂贵的测量电极例如固定化酶电极或保持均一表面积精确度的高水平电极制造技术。可以按简单和容易的方式精确地进行本发明以便测定合成或提取的双链DNA或者由PCR等扩增的双链DNA的量。

附图简述

图1是显示9AA浓度与反应混合物中氧化波电位移动量之间关系的坐标图；以及

图2是显示双链DNA浓度与氧化波电位移动量之间关系的坐标图。

Claims (10)

1.一种电化学测定双链DNA量的方法，其包括向含有双链DNA的溶液中相对所述双链DNA过量加入能够与该双链DNA结合的物质以便相互反应，然后电化学测定没有与双链DNA结合的游离双链DNA结合物质的残余量以便测定所述反应溶液中双链DNA的含量，其中所述反应溶液包含具有以下性质的物质作为缓冲物质：允许在含有所述缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位根据反应溶液中游离双链DNA结合物质的浓度而变化。

2.权利要求1的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述缓冲物质是具有以下性质的物质：允许在含有该缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位随着反应溶液中游离双链DNA结合物质浓度的降低而向较低电位移动。

3.权利要求1的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述缓冲物质是具有以下性质的物质：允许在含有该缓冲物质的反应溶液中测定的双链DNA结合物质的电位-电流曲线的氧化波电位具有两个或更多个峰而且允许所述峰中的两个之间的电位差随着反应溶液中游离双链DNA结合物质浓度的降低而减小。

4.权利要求1的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述缓冲物质是烷基磺酸衍生物。

5.权利要求4的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述烷基磺酸衍生物是选自3-吗啉基丙磺酸(MOPS)和N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)中的一种或多种。

6.权利要求1的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述能够与双链DNA结合的物质是双链DNA的嵌入剂。

7.权利要求6的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述嵌入剂是吖啶衍生物。

8.权利要求7的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述吖啶衍生物是9-氨基吖啶。

9.权利要求1的电化学测定双链DNA量的方法，其中所述双链DNA由RNA的逆转录反应制成。

10.用权利要求1-9任一项的电化学测定双链DNA量的方法测定双链DNA量的试剂盒。

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