JPWO2007066479A1 - 二重鎖dna量の測定方法および測定用キット - Google Patents
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Abstract
Description
DNAの簡易測定には、紫外部の吸光度比(260/280nm)を用いることが多いが、不純物や二重鎖DNA以外の核酸成分の影響が大きく、二重鎖DNAの測定方法としては精度が低い。
一方、二重鎖DNAのみを測定する方法としては、二重鎖DNAに特異的に結合する二重鎖DNA結合性物質の蛍光強度変化を測定する方法が一般的であるが、バックグラウンドが高いことや、測定可能な濃度範囲が狭いことから、測定データの処理が煩雑となる課題を有する。
特許文献1に示される方法では、二重鎖DNAを含む試料に対して、過剰量の二重鎖DNA結合性物質を添加した後、結合しなかった遊離の該結合性物質の電極酸化電流量を測定して、二重鎖DNA量を求める。この方法では、微弱な酸化電流を検出する必要から電極面積を常に精度よく一定に保たなければならず、高度な電極製造技術が要求される。
また、特許文献2に示される方法では、微弱な酸化電流を電極上で増幅させるため、固定化酵素電極を用いるが、やはり、高度な電極製造技術が要求され、さらには、固定化酵素を触媒とする酸化還元反応が可逆的に進行するように別反応と共役させる必要があり、測定用液の組成が複雑となってしまうという問題点を有している。
すなわち、本発明は、二重鎖DNAと二重鎖DNA結合性物質を反応させた後、反応液中に残った遊離の二重鎖DNA結合性物質の量を電気化学的に測定して、二重鎖DNA量を求める方法において、反応液に加える緩衝物質として、該緩衝物質を含む溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、その液中濃度に依存して変化する性質を示す物質を用いることを特徴とする、以下の(1)から(10)に示す、測定された酸化波電位の変化量より二重鎖DNA量を求める、電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法、およびその測定方法を用いた二重鎖DNA量の測定用キットに関する。
(1)二重鎖DNAを含む溶液に、該二重鎖DNAに対して過剰量の二重鎖DNA結合性物質を加えて反応させた後、二重鎖DNAと結合しなかった余剰の遊離した二重鎖DNA結合性物質の量を電気化学的に測定することによって、溶液中に含まれていた二重鎖DNA量を求める測定方法において、該反応溶液中に、緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖DNA結合性物質の濃度に依存して変化する性質を与える物質を用いることを特徴とする、電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(2)緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖DNA結合性物質の濃度が低下するに従って低電位側に移動する性質を与える物質を用いる、(1)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(3)緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が2つ以上のピークを有し、それらピーク間の電位差が反応溶液中に存在する遊離の二重鎖DNA結合性物質の濃度が低下するに従って小さくなる性質を与える物質を用いる、(1)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(4)緩衝物質がアルキルスルフォン酸誘導体である、(1)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(5)アルキルスルフォン酸誘導体が3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)、およびN−Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid(TAPS)から選ばれた一種以上である、(4)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(6)二重鎖DNA結合性物質が二重鎖DNAのインターカレーターである、(1)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(7)インターカレーターがアクリジン誘導体である、(6)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(8)アクリジン誘導体が9−アミノアクリジンである、(7)に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
(9)二重鎖DNAが、RNAより逆転写反応によって調製されたものである、(1)に記載の二重鎖DNAの測定方法。
(10)(1)から(9)の何れか1項に記載の電気学的な二重鎖DNA量の測定方法を用いた、二重鎖DNA量の測定用キット。
このような性質を示す緩衝物質としては、アルキルスルフォン酸誘導体が好ましく、特に3-Morpholinopropane sulfonic acid(以降MOPSと略す)やN-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane sulfonic acid(以降TAPSと略す)が好ましい。
本発明で使用される溶液中におけるアルキルスルフォン酸誘導体等の緩衝物質の濃度は、測定試料中に含まれるDNA量や種類によっても異なるが、測定試料と予め作成する検量線に使用される濃度が同じであれば良く、生化学的研究や試験検査で一般的に使用される濃度で何ら問題なく測定でき、1から200mMが適当である。
本発明で使用される二重鎖DNA結合性物質の量は、溶液中に含まれる二重鎖DNAに対して過剰量であればよいが、例えば、9AAまたはアクリジン誘導体等を用いて二重鎖DNAとの結合をはかる場合、二重鎖DNAと結合しなかった余剰の遊離した二重鎖DNA結合性物質の濃度として1から500μMが好ましく、10から200μMであることがより好ましい。なお、本発明において、「遊離する二重鎖DNA結合性物質」とは、溶液中で二重鎖DNAとは実質的に結合していない二重鎖DNA結合性物質を意味する。
本発明における電気化学的測定には、サイクリックボルタンメトリー(以降CVと略す)、リニアスィープボルタンメトリー(以降LSVと略す)等の電気化学的な測定を利用することができ、二重鎖DNA結合性物質の酸化波電位の変化から二重鎖DNAの量を定量的に測定することができる。
本発明における測定温度範囲は、DNAの二重鎖構造が維持され、かつ、二重鎖DNA結合性物質と二重鎖DNAとの結合状態が維持される0℃から85℃であるが、水分の蒸発による濃度変化や低温での凍結、また、それらに伴う測定試料へのダメージを防ぐため、通常は4℃から45℃の温度領域での測定が望ましい。
CVにおいては、自然電位から対参照極電位−2Vまで、500mV/s以下の走引速度で走引し、その後ただちに、対参照極電位2Vまで、同一の速度で走引する。電極の自然電位が安定していれば、自然電位から対参照極電位2Vまで、500mV/s以下の走引速度で走引するLSV測定を行っても良い。
この時、対銀参照極電位1Vから1.6Vにおいて、水の分解電流曲線上に検出される酸化波のピーク電位を計測する。酸化波のピーク電位は、ピークトップを計測しても良いが、緩衝液成分の濃度や不純物などの影響を受ける場合もあることから、ピーク電流値の一定割合、例えば50%から90%電流値をあらかじめ定めておき、その電流値における電位を計測する。あるいは、得られた電位電流曲線の微分値より、一定条件で電位を計測する方法をとることも出来る。
この検量線を用い、同様にして得られた被検試料における基準電位に対する電位変化量から二重鎖DNA濃度を求める。
被検試料の二重鎖DNA濃度が高い場合には、先に示した測定溶液(緩衝液、9AAの溶液)で希釈して測定することも出来る。また、試料溶液にTAPS、MOPSなどのアルキルスルフォン酸誘導体が充分に含まれている場合は、アルキルスルフォン酸誘導体を補充しなくてもよいが、これが試料溶液に含まれていない場合には、適宜、一定量(例えば、10mM相当)のTAPS、MOPS等を添加することで、良好に測定することが可能となる。
具体的には、アルキルスルフォン酸誘導体とアクリジン誘導体からなる測定試薬、作用極として金、白金などの貴金属電極と参照極、対極の三極からなる測定電極を用いることによって、当該測定方法を利用した簡便にして精度的に優れた二重鎖DNA測定用キットを構成し提供することが可能となる。
具体的なキットとしては、例えば、測定試薬として、100μMの9AA水溶液、および20mMのTAPS緩衝液、測定用の電極類として、樹脂シート上に対極と作用極を金でスパッタした電極、および参照極として銀ペーストを印刷した電極等を備えたキットが挙げられる。該キットには、標準用の二重鎖DNAを付属させてもよい。また、該キットに、試料溶液と測定試薬を混合するための試験管、バイアル瓶、マイクロプレート等、または採液用のマイクロピペット等を付属させてもよい。
本発明のキットを用いることによって、試料溶液と測定試薬を混合し、その一部を測定用の電極上に滴下した後、例えばポテンシオスタット装置等の市販の電流走引装置を用いて走引し、電位電流曲線上の酸化波電位のブランク値との差を求めることによって、試料中に含まれる二重鎖DNA量を極めて簡便に測定することが可能となる。
塩基数80から4900bpの電気泳動マーカー用の二重鎖DNAを用い、0から40ng/μLの二重鎖DNAを含むTAPS緩衝液(10mM TAPS、50mM KCl、pH8.5)溶液を調製した。この二重鎖DNA溶液47.5μLに9AA水溶液(1mM)2.5μLを加えて電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、銀線を参照極とし、作用極と対極に金スパッタ電極(電極面積1mm2)を用い自然電位から2VまでのLSV測定を行った。対銀参照電極1.2V付近の酸化波の80%電流値より酸化波電位を求めた。二重鎖DNA濃度0ng/μLにおける酸化波電位(E0)を基準に各二重鎖DNA濃度での酸化波電位(En)との電位差(ΔE)を求め、二重鎖DNA濃度とΔEとの検量線(R2=0.96)を作成した。次に、濃度不明の二重鎖DNA試料42.5μLにTAPS緩衝液(100mM TAPS、500mM KCl、pH8.5)5μLと9AA水溶液(1mM)2.5μLを加え、同様の電気化学的測定を行いE0との電位差ΔEを求めた。検量線より、この試料の二重鎖DNA量が、20±2ng/μL(n=4)であることが分かった。
実施例1におけるTAPS緩衝液をMOPS緩衝液(10mM MOPS、50mM KCl、pH8.5)とし検量線を作成した。同様にして、実施例1で用いたと同様の濃度不明の試料42.5μLにMOPS緩衝液(100mM MOPS、500mM KCl、pH8.5)5μLと9AA水溶液(1mM)2.5μLを加え、同様の電気化学的測定を行いE0との電位差ΔEを求めた。検量線より、この試料の二重鎖DNA量が、20ng/μLであることが分かった。
10から50μMの9AAを含む10mM TAPS緩衝液(pH8.5)を用い、自然電位から2V(対銀参照電極)までのLSV測定を行った。対極および作用極には金スパッタ電極(1mm2)を用いた。
50μMの9AAを含む溶液における酸化波電位を基準に、各9AA濃度の酸化波電位の低電位側シフト量を測定した。9AA濃度と電位シフト量には相関(R2=0.98)が認められた(図1)。
次に、0から30ng/μLのλDNAを含むTAPS緩衝液(pH8.5)を調製し、それぞれに50μM相当の9AAを添加した。同様にLSV測定を行い、λDNA無添加における酸化波電位からのシフト量を測定した。λDNA量と電位シフト量との間に相関が認められた(R2=0.96)(図2)。
10から50μMの9AAを含む10mM TAPS緩衝液(pH8.5)を用い、自然電位から2V(対銀参照電極)までのLSV測定を行った。対極および作用極には金スパッタ電極(1mm2)を用いた。対銀参照電極1.2V付近と0.65V付近の酸化波の90%電流値より酸化波電位を求め、次いで両者間の酸化波電位差を求めた。
50μMの9AAを含む溶液における酸化波電位差を基準に、各9AA濃度における酸化波電位差の低下量を測定した。9AA濃度と電位差の変化量には相関(R2=0.98)が認められた。
次に、0から30ng/μLのλDNAを含むTAPS緩衝液(pH8.5)を調製し、それぞれに50μM相当の9AAを添加した。同様にLSV測定を行い、λDNA無添加における酸化波電位差に対する各々の電位差の低下量を測定した。λDNA量と酸化波電位差の低下量との間に相関が認められた(R2=0.95)。
(a)5mM MgCl2、10mM TAPS−NaOH(pH8.5)、50mM KCl、1mM dNTP、2.5μM ランダム9merプライマー、および逆転写酵素 AMV Reverse Transcriptase(タカラバイオ株式社製)0.25U/μLを含む逆転写反応溶液19μLに、pSPTetRNA(Life Sciences社製)溶液1μLを加え、逆転写反応の初期に起こる鋳型RNAと逆転写産物DNAオリゴマーの熱変性を防ぐため30℃で10分間反応した後、45℃で15分間逆転写反応を行い、さらに、不要となった逆転写酵素活性を失活させるため反応液を99℃で10分間加熱処理し氷冷した。
(b)続いて、3.2mM MgCl2、12.5mM TAPS−NaOH(pH8.5)、62.5mM KCl、0.03U/μL DNAポリメラーゼ、0.25μM センスプライマー(5’−CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA−3’)および、0.25μM アンチセンスプライマー(5’−CGGCACCTGTCCTACGAGTTG−3’)を含むPCR反応液80μLに、上記(a)で調製した反応液20μLを添加し、そのうちの50μLを95℃2分間加熱した後、そのまま冷却せずに、変性温度95℃、アニーリング温度60℃、鎖延長温度72℃でのPCR反応を30サイクル行った。
(c)上記(b)においてPCR反応に供しなかった残りの反応液50μLを測定電極にて自然電位から2VまでLSV測定し、酸化波電位E0を求めた。続いて、PCR終了後の反応試料液を同様に測定して酸化波電位E1を求めた。測定電極には、作用極および対極としてポリエチレンテレフタレート樹脂フィルム上に金でスパッタした電極を、参照極として銀ペーストで印刷した電極を用いた。E0とE1の電位差ΔEは35mVで、あらかじめ同一の反応液組成の溶液にλDNAを溶解して作成しておいたλDNA検量線より、pSPTetRNAより生成した二重鎖DNA量がλDNA換算で25ng/μLであることが確認された。
Claims (10)
- 二重鎖DNAを含む溶液に、該二重鎖DNAに対して過剰量の二重鎖DNA結合性物質を加えて反応させた後、二重鎖DNAと結合しなかった余剰の遊離した二重鎖DNA結合性物質の量を電気化学的に測定することによって、溶液中に含まれていた二重鎖DNA量を求める測定方法において、該反応溶液中に、緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖DNA結合性物質の濃度に依存して変化する性質を与える物質を用いることを特徴とする、電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- 緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖DNA結合性物質の濃度が低下するに従って低電位側に移動する性質を与える物質を用いる、請求項1に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- 緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖DNA結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が2つ以上のピークを有し、それらピーク間の電位差が反応溶液中に存在する遊離の二重鎖DNA結合性物質の濃度が低下するに従って小さくなる性質を与える物質を用いる、請求項1に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- 緩衝物質がアルキルスルフォン酸誘導体である、請求項1に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- アルキルスルフォン酸誘導体が3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)、およびN−Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid(TAPS)から選ばれた一種以上である、請求項4に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- 二重鎖DNA結合性物質が二重鎖DNAのインターカレーターである、請求項1に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- インターカレーターがアクリジン誘導体である、請求項6に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- アクリジン誘導体が9−アミノアクリジンである、請求項7に記載の電気化学的な二重鎖DNA量の測定方法。
- 二重鎖DNAが、RNAより逆転写反応によって調製されたものである、請求項1に記載の二重鎖DNAの測定方法。
- 請求項1から9の何れか1項に記載の電気学的な二重鎖DNA量の測定方法を用いた、二重鎖DNA量の測定用キット。
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