CN111465706A - 经由pH调节进行的荧光团多路复用 - Google Patents

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Abstract

检测溶液中超过一种分析物的设备，包括至少一个与该溶液接触的电极、包括第一染料和第二染料的至少两种染料，和电化学活性剂，其中该溶液具有pH，该电极配置为通过氧化或还原电化学活性剂来调节溶液的pH，第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光，第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在，且第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。还提供了检测溶液中多种分析物的方法。

Description

经由pH调节进行的荧光团多路复用
发明领域
本发明的方面涉及检测溶液中多种分析物的设备和方法。
背景
多路复用是一项通过减少试剂消耗和提高吞吐量来节约成本并在处理珍贵样品时广泛使用的技术。该技术在分析活检样品的应用中是有益的，所述应用如聚合酶链式反应（PCR）、用于检测单个细胞或组织样品中的特定DNA或RNA靶标的荧光原位杂交（FISH）、以及荧光抗体测定。在这些应用中，多路复用的程度通常受到具有非重叠光谱性质的荧光探针的数量和分析仪器上可用的光通道的数量的限制。
例如，通常，可以同时在一个PCR管中检测的反应数量限制为五个，主要是因为PCR仪器可以检测不超过四个或五个颜色通道，其中之一可被保留作为参考通道。实时定量PCR（qPCR）可以通过读取来自4至5种具有非重叠光谱性质的不同染料的荧光一次检测4至5种分析物。扩充每个通道的分析物数量的一种策略是组合发射最大值相同但对光漂白的荧光稳定性不同的荧光团。参见Schuler等人, F. Anal. Chem. 2016, 88 (5), 2590–2595。但是，这项技术仅能进行终点检测，因为光漂白是不可逆过程，且因此不适于qPCR。其它策略利用通过缓冲液交换、脱盐或透析来改变生物溶液的pH。但是，所有这些方法均会导致一部分样品损失或稀释，耗费时间，并且不适合反复并入qPCR过程。
概述
下面阐述了本发明的某些示例实施方案的概述。应当理解的是，呈现这些方面仅为了向读者提供这些特定实施方案的简要概述，并且这些方面并非意在限制本发明的范围。事实上，本发明可以涵盖下文中可能未阐述的多个方面。
本发明的示例实施方案通过利用有机染料的pH依赖性荧光性质增加了可以在单一样品中区分的荧光探针数量。如果两种染料在相同波长下发出荧光（即具有重叠的光谱性质），但具有明显不同的pH特性（例如，一种在酸性或碱性pH下具有更高的荧光，而另一种具有相反的pH行为或对pH变化不敏感），那么可以通过测量在两种不同pH下的信号用相同的检测器（即通道）来检测两种荧光团。通过改变溶液pH调节染料的荧光可以扩展相同数量的通道中可检测的靶标的数量。
本发明的示例实施方案利用了快速、可逆、可重复且不需要交换溶液以保持qPCR所需基本成分（例如核苷酸、盐、引物、聚合酶、荧光标记探针和DNA）的浓度（除了水合氢离子、羟基和/或缓冲离子的浓度外）的pH调节步骤。本发明的示例实施方案利用电化学pH调节，其中水合氢离子浓度因与qPCR溶液接触的电极表面发生的受控电化学反应（氧化或还原）而原位改变。这种方法能够对溶液pH实现动态控制，是可逆的，并在初始一次性添加电活性试剂后可以在整个qPCR过程中重复多次。电化学反应发生的电势低到足以防止qPCR过程的任何其它组分发生电化学变化。该限制主要由氨基酸和核苷酸对氧化/还原的稳定性来限定。参见Arrigan, D. W. M. 2007, 132, 615–632。另一限制是电活性试剂与qPCR组分的化学相容性。
美国专利号9,810,688描述了一种电化学pH调节平台，其对溶液pH提供动态的按需控制。与微流体环境结合，该pH调节技术可用于改变微流体通道内部整个溶液的pH。
在本发明的示例实施方案中，在终点PCR反应的情况下，pH仅需要在扩增过程结束时改变一次以扩展在相同通道中可检测的靶标的数量，并且该步骤无需是可逆的。
在本发明的示例实施方案中，在实时定量PCR（qPCR）的情况下，pH应在每次扩增循环后改变以构建扩增曲线，且因此该步骤是可逆的。通过消除染料具有非重叠光谱性质的要求，在读出时并入pH调节步骤扩展了可以独立检测的染料的数量。使用具有重叠的吸收和发射光谱但具有不同的pH特性的多种染料使得能够在一锅法中检测更多分析物，而无需改变现有的检测仪器（相同的光源和滤光片可用于读数）。常规用于qPCR且可以容易地购得的染料可用于该方法。
根据示例实施方案，检测溶液中超过一种分析物的设备包括：（a）至少一个与该溶液接触的电极；（b）至少两种染料，包括第一染料和第二染料；和（c）电化学活性剂；其中该溶液具有pH，该电极配置为通过氧化或还原电化学活性剂来调节溶液的pH，第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光，第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在，且第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。
在一些示例实施方案中，该电化学活性剂是醌。
在一些示例实施方案中，第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在中性或碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
在一些示例实施方案中，第一染料在碱性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在酸性或中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
在一些示例实施方案中，第一染料选自LysoSensor Green、FAM、pH rodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO 488、ATTO 633、TAMRA、ATTO 550、ROX、萘荧光素（naphtafluorescein）和Cy5。
在一些示例实施方案中，该设备包括多种染料，其中各种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且其中每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。
在一些示例实施方案中，该设备包含在分析仪器的通道内。
在一些示例实施方案中，该电极是铂、金、银、铟锡氧化物、掺杂氟的氧化锡、玻璃碳或石墨。
根据示例实施方案，检测溶液中多种分析物的方法，其中该溶液包含电化学活性剂和包括第一染料和第二染料的至少两种染料，所述方法包括：（a）向在具有pH的溶液中的电极施加电流或电压；（b）氧化或还原电化学试剂以便将溶液的pH改变至第一pH；（c）测量第一pH下第一染料的荧光，表明存在第一分析物；（d）氧化或还原该电化学试剂以便将溶液的pH改变至第二pH；和（e）测量第二pH下第二染料的荧光，表明存在第二分析物。
在一些示例实施方案中，第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在中性或碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
在一些示例实施方案中，第一染料在碱性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在酸性或中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
在一些示例实施方案中，第一染料选自LysoSensor Green、FAM、pH rodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO 488、ATTO 633、TAMRA、ATTO 550、ROX、萘荧光素（naphtafluorescein）和Cy5。
在一些示例实施方案中，该溶液进一步包括多种染料，其中每种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且其中每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。
在一些示例实施方案中，在分析仪器的通道内发生多种分析物的检测。
根据示例实施方案，一种设备包括：（a）荧光传感器；（b）包括处理电路的控制单元；（c）配置为将包含多种分析物与相应染料并包含电化学活性剂的溶液保持在其中的容器；（d）和至少一个相对于该容器布置的电极，使得当该容器容纳溶液时，所述至少一个电极与所述溶液接触；其中该处理电路配置为：（i）控制至少一个电极以便进行氧化和还原该电化学活性剂中的至少一种，由此调节溶液的pH；（ii）在通过调节获得的该溶液的多个pH值水平的每个pH值下由该荧光传感器获得相应的荧光信号，该信号指示由染料中的每一种在相应的pH水平下引起的溶液的荧光；（iii）基于获得的荧光信号和获得的荧光信号中的每一种与多种pH水平中的每一种的关联来识别溶液中包含的分析物的每一种；和（iv）输出该识别。
在一些示例实施方案中，该溶液布置在容器中，该染料包括在不同的pH水平下发射荧光的第一染料和第二染料。
尽管可以独立地描述本发明的示例实施方案的各个方面，应理解为在本文中也是指示例实施方案的组合。此外和相反，应当理解的是，尽管在与其它特征组合的情况下可以描述一特征，对本发明的功能性或可用的实施方案来说，不同的特征是可分离的且不一定彼此需要或依赖。
呈现上文中描述的方面和实施方案仅为了提供这些示例实施方案的概述，并且多个方面和多个实施方案方面并非意在限制本公开的范围。事实上，本发明还可以涵盖多个其它方面。结合附图通过某些示例性实施方案的以下详述，本发明的这些和其它特征、方面和优点将进一步清晰化，在整个附图中，相同的字符表示相同的部件。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。专利局将根据要求并在支付必要费用时提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1显示了表格，该表格显示了检测提高数量的分析物的染料组合的实例。
图2是通过pH调节在单一通道中对来自两种染料的信号去卷积的示意图。
图3示出了经由醌的氧化/还原在溶液中的pH变化。
图4示出了根据示例实施方案的装置。
详述
本发明的示例实施方案利用染料的pH依赖性荧光性质，以便能够将多路复用与动态改变溶液pH的能力结合。根据示例实施方案，具有匹配的激发/发射性质的染料可以在同一仪器通道中成像，提高可以在现有数量的光学通道中在单一反应中检测的分析物的数量。
最常用的PCR染料是荧光素衍生物（如JOE、TET、HEX和FAM）、罗丹明衍生物（ROX、TAMRA）和花青染料（Cy-3、Cy-5）。这些染料的荧光性质受周围溶液pH的影响。例如，荧光素衍生物在中性pH中显示最大荧光，而在酸性环境中其荧光急剧下降。参见Martinez等人,Biomarkers and Biological Spectral Imaging, 2(16), 144–156 (2001)。另一方面，花青染料和罗丹明衍生物在酸性pH中显示最大荧光。参见Han等人, FluorescentIndicators for Intracellular pH. Chemical Reviews, 110, 2709–2728 (2010)。ATTO染料是新的一类qPCR染料，其荧光独立于生物相关值范围内的pH变化。
在本发明的示例实施方案中，为了将每种染料的贡献去卷积，在不同的pH下记录荧光。一些可能的染料组合概述在图1中。例如，LysoSensor Green、FAM和ATTO 488在光谱的绿色区域中具有峰值吸收和发射。但是，LysoSensor Green在酸性pH中具有最佳荧光，而在中性或碱性pH中其荧光淬灭，并且FAM染料表现出相反的pH依赖行为。相反，ATTO 488具有独立于pH的荧光（图2，部分(a)）。因此，可以在同一通道中将LysoSensor Green与FAM组合。在酸性pH中，FAM的荧光将淬灭，同时将测量LysoSensor Green的荧光；在中性pH中，LysoSensor Green的荧光将淬灭，使得可以测量FAM信号（图2，部分(b)）。或者，可以将LysoSensor Green与ATTO 488结合。在这种情况下，在酸性pH中，测得的荧光信号将是LysoSensor Green加ATTO 488的总和，而在中性pH中，将仅测量ATTO 488（图2，部分(c)）。可以作为酸性和中性pH下荧光强度的差异来获得LysoSensor Green的贡献。
遵循相同的原理，FAM可以与ATTO 488结合；pH rodo和罗丹明B衍生物均可与ATTO550、TAMRA或ROX结合；ATTO 633可以与SNARF结合；且萘荧光素可以与Cy5结合。这些实例不是限制性的，因为可以以相同的方式使用具有相容光谱性质（即可以在相同波长下激发，并且它们的荧光可以在相同波长下读出）但pH特性截然不同的任意两种或更多种染料。
在本发明的示例实施方案中，为了定量测定各染料对聚集信号的贡献（并因此测定各分析物的浓度），由于染料的消光系数和荧光强度将受pH影响，在各采样pH处对每种单独组分构建校准曲线。可以通过构建每种染料的pH曲线并确定荧光强度差别最大时的值来确定用于采样的最佳pH值。
在本发明的示例实施方案中，经由导致产生或消耗水合氢离子或羟基离子的可逆电化学氧化/还原反应，可以实现pH的快速和可重复的变化：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
在本发明的示例实施方案中，使用能够进行导致生成或消耗质子的电化学氧化或还原反应的电活性分子。例如，可以使用任何醌衍生物、肼衍生物或酚-Ru(2,2’-联吡啶)3 2+)。此类反应的实例是醌衍生物（如美国序列号14/792,553中所述）、肼衍生物或水的氧化或还原。使用醌衍生物的pH范围为大约4至大约10。在酸性端，可以通过该方法生成的pH没有理论上的限制，而在碱性端，由所用的特定醌衍生物的pKa来限定。
图3显示了经由醌的氧化/还原改变溶液的pH。具体而言，图3展示了在1 mM磷酸盐缓冲液中在铟锡氧化物电极上的2,5-二甲基对苯二酚氧化造成的pH变化的可重复性。通过测量pH响应性探针绿色荧光蛋白的荧光信号测定该pH值。在将阳极电流施加到浸没在含有2,5-二甲基对苯二酚的缓冲溶液中的电极上时，产生的质子受到缓冲液的极大影响且溶液的pH变得更偏酸性。由于可逆反应，施加阴极电流导致溶液碱化——2,5-二甲基苯醌的还原和质子的消耗。
图4显示了设备400，其包括荧光传感器402、包括处理电路406的控制单元404、含有溶液410的容器408和与溶液410接触的电极412。溶液410包括分析物412(a)、412(b)和412(c)，其各自具有相应染料414(a)、414(b)和414(c)，以及电化学活性剂416。处理电路406配置为控制电极412以氧化或还原电化学活性剂416，由此调节溶液410的pH。染料414(a)、414(b)和414(c)在溶液410的不同pH水平下发射荧光，各自在特定pH水平下提供荧光信号，分别指示分析物412(a)、412(b)和412(c)的存在。荧光传感器402检测染料414(a)、414(b)和414(c)的这些荧光信号，并将此类信号转送至处理电路406，该处理电路基于获得的荧光信号和该信号与特定pH水平的关联来识别溶液410中的分析物412(a)、412(b)和412(c)。处理电路406将分析物412(a)、412(b)和412(c)的鉴定输出到显示单元418。
本发明的一个示例实施方案涉及一个或多个处理器，该处理器可以使用任何常规处理电路和装置或其组合，例如个人计算机（PC）的中央处理器（CPU）或其它工作站处理器来实现，以便执行例如在包括任何常规存储设备的硬件非暂时性计算机可读介质上提供的代码，以便单独或组合实施任何本文中描述的方法，例如用于控制电极和/或分析荧光信号。一个或多个处理器可以体现在服务器或用户终端或其组合中。用户终端可以体现为例如台式机、笔记本电脑、手持设备、个人数字助理（PDA）、电视机顶盒互联网设备、移动电话、智能电话等等，或者作为其一种或多种的组合。该存储设备可以包括任何常规的永久和/或临时存储电路或其组合，其非穷举名单包括随机存取存储器（RAM）、只读存储器（ROM）、光盘（CD）、数字通用光盘（DVD）和磁带。此类设备可用于沿并行历史分支导航页面和/或沿并行重做分支重新进行编辑。
本发明的一个示例实施方案涉及一种或多种硬件计算机可读介质，例如如上所述具有存储在其上的指令，该指令可以由处理器执行以单独或组合地进行本文中描述的各种方法。
本发明的一个示例实施方案涉及一种例如硬件组件或机器的方法，所述硬件组件或机器单独地或组合地传递可以由处理器执行的指令以实施本文中描述的方法。
由前面的描述将理解上述实施方案（其已经通过实例的方式显示并描述）以及其许多优点，且显而易见的是，可以在部件的形式、构造和布置中进行各种改变，而不脱离公开的主题或不牺牲其一个或多个优点。实际上，这些实施方案的所述形式仅仅是说明性的。这些实施方案容易进行各种修改和替代形式，并且下文列举的权利要求并非意在排除任何此类改变，并且实施方案不限于公开的特定形式，而是覆盖落入本公开的精神和范围的所有修改、等同物和替代形式。
也就是说，以上描述意在是说明性的而非限制性的，并且是在特定应用及其要求的背景下提供的。本领域技术人员从先前的描述中可以理解，本发明可以以多种形式实施，并且各个实施方案可以单独或组合实施。因此，虽然已经结合其特定实例描述了本发明的实施方案，在不脱离所述实施方案的精神和范围的情况下，本文中限定的一般原理可以应用于其它实施方案和应用，并且本发明的实施方案和/或方法的真实范围不限于显示和描述的实施方案，因为在研究附图、说明书和以下权利要求之后，各种修改对本领域技术人员将变得显而易见。例如，组件和功能可以不同于各种所述实施方案的方式分离或组合，并且可以使用不同的术语来描述。这些和其它变型、修改、添加和改进可以落入如以下权利要求限定的本公开的范围内。

Claims (20)

1.检测溶液中的多种分析物的设备，所述设备包括：
至少一个与所述溶液接触的电极；
至少两种染料，包括第一染料和第二染料；和
电化学活性剂；
其中：
所述溶液具有pH；
所述电极配置为通过氧化或还原所述电化学活性剂来调节溶液的pH；
第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光；
第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在；和
第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。
2.权利要求1的设备，其中所述电化学活性剂是醌。
3.权利要求1的设备，其中第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光。
4.权利要求3的设备，其中第二染料在中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
5.权利要求3的设备，其中第二染料在碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
6.权利要求1的设备，其中第一染料在中性pH中表现出比第二染料更高的荧光，并且第二染料在碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
7.权利要求1的设备，其中第一染料选自LysoSensor Green、FAM、pH rodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO 488、ATTO 633、TAMRA、ATTO 550、ROX、萘荧光素和Cy5。
8.权利要求1的设备，其中各种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。
9.权利要求1的设备，其中所述设备包含在分析仪器的通道内。
10.权利要求1的设备，其中所述电极是铂、金、银、铟锡氧化物、掺杂氟的氧化锡、玻璃碳或石墨。
11.检测溶液中多种分析物的方法，其中所述溶液包含电化学活性剂和包括第一染料和第二染料的至少两种染料，所述方法包括：
向在具有pH的溶液中的电极施加电流或电压；
氧化或还原电化学试剂以便将溶液的pH改变至第一pH；
测量第一pH下第一染料的荧光，表明存在第一分析物；
氧化或还原所述电化学试剂以便将溶液的pH改变至第二pH；并
测量第二pH下第二染料的荧光，表明存在第二分析物。
12.权利要求11的方法，其中第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光。
13.权利要求12的方法，其中第二染料在中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
14.权利要求12的方法，其中第二染料在碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
15.权利要求11的方法，其中第一染料在中性pH中表现出比第二染料更高的荧光，并且第二染料在碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。
16.权利要求11的方法，其中第一染料选自LysoSensor Green、FAM、pH rodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO 488、ATTO 633、TAMRA、ATTO 550、ROX、萘荧光素和Cy5。
17.权利要求11的方法，其中所述溶液进一步包括多种染料，其中每种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且其中每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。
18.权利要求11的方法，其中在分析仪器的通道内发生多种分析物的检测。
19.一种设备，包括：
荧光传感器；
包括处理电路的控制单元；
配置为将包含多种分析物与相应染料并包含电化学活性剂的溶液保持在其中的容器；和
至少一个相对于所述容器布置的电极，使得当所述容器容纳溶液时，所述至少一个电极与所述溶液接触；
其中所述处理电路配置为：
控制至少一个电极以便进行氧化和还原所述电化学活性剂中的至少一种，由此调节溶液的pH；
在通过调节获得的所述溶液的多个pH值水平的每个pH值下由所述荧光传感器获得相应的荧光信号，该信号指示由染料中的每一种在相应的pH水平下引起的溶液的荧光；
基于获得的荧光信号和获得的荧光信号中的每一种与多种pH水平中的每一种的关联来识别溶液中包含的分析物的每一种；和
输出该识别。
20.权利要求19的设备，进一步包括布置在所述容器中的溶液，其中所述染料包括在不同的pH水平下发射荧光的第一染料和第二染料。
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