JP2008157733A

JP2008157733A - 核酸増幅の有無の判定方法、標的核酸の検出方法及びそれらに用いられる装置

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Publication number: JP2008157733A
Application number: JP2006346283A
Authority: JP
Inventors: Yasuyoshi Mori; 安義森
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2026-12-22
Also published as: JP4908182B2

Abstract

【課題】簡易な工程で高感度な判定結果を得ることが可能な核酸増幅の有無の判定方法を提供すること。
【解決手段】核酸増幅反応を行う反応液の電気化学的特性の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定する、核酸増幅の有無の判定方法。更には、被検試料から核酸を精製するステップと、精製した核酸を含む反応液中で標的核酸を増幅する核酸増幅反応を行い、上記方法を用いて反応液における標的核酸の核酸増幅の有無を判定するステップとを備える、被検試料中の標的核酸の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅の有無の判定方法、標的核酸の検出方法及びそれらに用いられる装置に関する。

被検試料の塩基配列を分析するための有用な方法として、特定の標的核酸を増幅する核酸増幅法が知られており、この方法は遺伝子疾患の診断等に不可欠な技術である。この核酸増幅法の技術を有効に利用するために、標的核酸の核酸増幅の有無を高感度で判定する方法が求められる。

核酸増幅の有無を判定する一般的な方法としては、核酸増幅反応を行った反応液にエチジウムブロマイド等の蛍光インターカレーターを加えたものを電気泳動した後、蛍光を観察する方法が挙げられる。また、核酸増幅反応が進行する際に生成するピロリン酸と金属イオンとの結合を指標として核酸増幅の有無を判定する方法がある（例えば、特許文献１参照）。更に、蛍光色素等の標識物質で標識したプライマー又はヌクレオチドを核酸増幅反応に用いて、核酸に取り込まれた標識物質を観察することにより核酸増幅の有無を判定する方法もある（例えば、特許文献２参照）。

一方、核酸増幅反応を行う際には、前処理としてタンパク質等の増幅阻害物質を試料から除去する必要があるが、その方法としては、クロロホルムとエタノールを用いる技術が挙げられる。また、核酸とタンパク質の電荷の違いに着目して、電気泳動により核酸を精製する方法もある（例えば、特許文献３参照）。

また、グアニンは＋０．９Ｖ（銀／塩化銀電極）付近での酸化による酸化電流が測定可能であり、酸化電流に基づいてグアニンの濃度を定量することにより被検溶液中に含まれるＤＮＡ量を推定する方法について報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
特開２００４−２８３１６１号公報特開平９−１８７２７５号公報特表２００１−５００９６６号公報矢吹総一、外３名、"核酸グアニンの酸化電流に基づいたＤＮＡの定量"、［online］、２００４年１１月２６日、第５０回ポーラログラフィー及び電気分析化学討論会、［２００６年１１月１３日検索］、インターネット〈URL : http://www.aist.go.jp/RRPDB/system/Koukai.Detail〉

しかし、従来の核酸増幅の有無の判定方法は、特別な設備が必要である等、経済性や効率の点で満足できるものではなかった。また、感度の点でもさらに改善が求められていた。

例えば、蛍光インターカレーターを用いる方法においては、蛍光を観察するためのＵＶランプ及び暗室が必要であった。また、特許文献１記載の方法においては、反応液が微量である場合に判定が困難となる傾向があり、被検試料に着色物質、蛍光物質、不溶性物質等が含まれることにより判定結果に過誤が生じやすかった。更に、特許文献２記載の方法においては、核酸に取り込まれなかった被標識プライマー又はヌクレオチドを除去する必要があり、用いる被標識プライマー又はヌクレオチドが高価であった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡易な工程で高感度な判定結果を得ることが可能な核酸増幅の有無の判定方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、核酸増幅反応を行う反応液の電気化学的特性が核酸増幅反応の進行に伴って大きく変化することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、核酸増幅反応を行う反応液の電気化学的特性の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定する、核酸増幅の有無の判定方法である。

本発明者らの知見によれば、核酸増幅反応の進行に伴ってグアニンが核酸鎖中に取り込まれたときに、電極におけるグアニンの酸化に由来する反応液の電気化学的特性が大きく変化する。したがって、電気化学的特性の変化が生じた場合には核酸増幅が進行したと判断され、電気化学的特性の変化が実質的に生じなければ核酸増幅が進行しなかったと判断される。すなわち、この方法によれば単に反応液の電気化学的測定を行うだけで容易に核酸増幅の有無を判定することが可能である。また、係る電気化学的特性の変化は不純物の影響を受け難く、高感度での判定結果を得ることが可能である。

核酸増幅反応を行う反応液に所定の電圧を印加したときの電流値の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定してもよい。このような判定方法を用いることによって特に高感度な判定結果を容易に得ることができる。この場合、所定の電圧は、０．８〜１．２Ｖであることが好ましい。電圧が０．８Ｖより低いと核酸増幅反応の反応前後における電流の変化が小さくなる傾向があり、１．２Ｖより高いと核酸増幅反応の反応前後における電流の変化が小さくなる傾向がある。また、電流値の変化は、グアニンの酸化により生じる酸化電流に由来する電流値の低下であることが好ましい。グアニンが核酸鎖中に取り込まれると、グアニンの酸化により生じる酸化電流が減少するため、反応の進行に伴い、反応液の電流値は顕著に低下する。このような電流値の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定することで、より一層高感度な判定結果を得ることが可能である。

別の側面において、本発明は被検試料中の標的核酸の検出方法に関する。本発明に係る検出方法は、被検試料から核酸を精製するステップと、精製した核酸を含む反応液中で標的核酸を増幅する核酸増幅反応を行い、上記核酸増幅の有無の判定方法を用いて上記反応液における標的核酸の核酸増幅の有無を判定するステップとを備える。本発明の検出方法を用いることによって、簡易な工程で高感度な検出結果を得ることができる。

上記被検試料から核酸を精製するステップにおいて、核酸が回収槽内にプールされるように被検試料から核酸を精製してもよい。そして、本発明に係る検出方法は、回収槽内にプールされた核酸を回収槽に接続された反応槽内に導入するステップを更に備えていてもよい。この場合、核酸増幅の有無を判定するステップにおいて、回収槽に接続された反応槽内で核酸増幅反応を行うことが可能である。このような検出方法を用いることによって、外部からの物質の混入による検出過誤を抑制し、更に高感度な検出結果を得ることができる。

上記検出方法においては、電気泳動によって被検試料から核酸を精製することが好ましい。電気泳動法を用いることによって、容易に精度よく核酸を精製することができる。

更に別の側面において、本発明は上記判定方法に用いられる反応装置に関する。本発明に係る反応装置は、核酸増幅反応を行う反応液が導入される反応槽と、当該反応槽内に挿入された電極とを有する。本発明の反応装置を用いることによって、簡易な工程で高感度な判定結果を得ることができる。

更に別の側面において、本発明は上記検出方法に用いられる検出装置に関する。本発明に係る検出装置は、上記反応装置と、当該反応装置の反応槽に接続された、被検試料から核酸を精製する精製装置とを備える。精製装置が上記反応槽に接続されていることによって、外部からの物質の混入による検出過誤を抑制し、高感度な検出結果を得ることができる。

上記精製装置は、電気泳動によって被検試料から核酸を精製する精製装置であることが好ましい。このような精製装置を用いることによって、容易に精度よく核酸を精製することができる。

また、電気泳動によって核酸を精製する場合、上記精製装置が、陽極側電解槽と、上記反応槽に接続されており核酸がプールされる回収槽と、被検試料が保持される保持槽と、陰極側電解槽とを有し、これらがこの順に接続されていることが好ましい。このような精製装置を用いることによって、容易に精度よく核酸を精製することができ、精製した核酸を外部環境に曝さずに反応槽へ導入することができる。

本発明の方法によれば、核酸増幅の有無の判定において簡易な工程で高感度な判定結果を得ることができる。

以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸が回収槽内にプールされるように被検試料から核酸を精製するステップと、回収槽内にプールされた核酸を回収槽に接続された反応槽内に導入するステップと、精製した核酸を含む反応液中で標的核酸を増幅する核酸増幅反応を反応槽内で行い、核酸増幅反応を行う反応液の電気化学的特性の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定するステップとを備える。

すなわち、核酸又はポリヌクレオチド鎖上の標的核酸を合成又は増幅し、合成反応又は増幅反応に伴い変化する反応液中の電流値（特に、酸化電流値）を測定することにより、核酸の合成又は増幅反応の進行を検出するものである。この方法は反応液の色調変化を捉える従来の技術とは異なり、反応の場が着色していても影響を受けることはない。また、被検試料からの核酸の抽出を電気的に行い、抽出された核酸をそのまま反応の場に導入することも可能であるため、被検試料を添加した後に外部と接触する機会を極力抑えることができ、外部からの混入により検出結果が偽陽性となるのを抑制することが可能となる。

本実施形態に係る検出方法は、例えば、図１に示す検出装置を用いて行うことができる。図１に示す検出装置１００は、核酸増幅反応を行う反応液が投入される反応槽１１及び反応槽１１内に挿入された電極１２を有する反応装置１０と、被検試料から核酸を精製する精製装置３０とから構成される。精製装置３０は、陽極側電解槽３４と、核酸がプールされる回収槽３１と、被検試料が保持される保持槽３３と、陰極側電解槽３５と、を有しており、これらがこの順で接続されている。そして、回収槽３１と反応槽１１とは、内容物の出入りが可能なように接続部５０を介して接続されている。以下、図１の検出装置１００を用いて標的核酸を検出する場合を例にして検出方法の実施形態について詳細に説明する。

精製装置３０において、保持槽３３内に保持された被検試料から核酸が精製され、精製された核酸が回収槽３１内に一時的にプールされる。このとき、被検試料から核酸がある程度選択的に取り出される。

陽極側電解槽３４、陰極側電解槽３５及び保持槽３３内は、予め電解液で満たされている。電解液は、バッファー、支持電解質等を含む。保持槽３３と回収槽３１とは、多孔性濾過膜３７を介して隔てられている。また、陽極側電解槽３４には陽極４１が、陰極側電解槽３５には陰極４２が、それぞれ挿入されている。

一般に、核酸はその分子内に多くの負電荷を有するため、陽極側への高い電気泳動移動度を示す。一方タンパク質の電荷は正電荷を誘起するアミノ基と負電荷を誘起するカルボキシル基の割合で決定され、その合計電荷は核酸より少ない。そのため、陽極４１及び陰極４２の間に所定の電圧（５０Ｖ程度）を印加すると、移動度の高い核酸は移動度の低いタンパク質より先に多孔性濾過膜３７を通過して回収槽３１側に移動する。このような電気泳動を一定時間（２〜５分程度）行うことにより、回収槽３１内に精製された核酸がプールされる。電気泳動法を利用する方法により、被検試料中の主たる不純物であるタンパク質の量が少ない状態となるように核酸を選択的に取り出すことが可能である。

回収槽３１内にプールされた核酸は、接続部５０を通って反応槽１１内に導入される。例えば、接続部５０内の流路を閉じた状態で電気泳動を行って回収槽３１内に核酸をプールし、その後流路を開けることにより、精製された核酸を反応槽１１に送ることができる。

反応槽１１内には、遺伝子増幅用の試薬が予め投入されている。この試薬は多孔質支持体のような不溶性担体に保持された状態で反応槽１１内に投入されていてもよい。蛍光、濁度、吸光度等の光学的検出を用いた従来の方法の場合、多孔質支持体を用いた核酸増幅反応の進行を高精度で検出することは困難であり、特に着色物質、蛍光物質等が混入すると検出が著しく妨害される。これに対して、本実施形態によれば多孔質支持体を用いる場合であっても核酸増幅反応の進行を高精度で検出することが可能である。

反応槽１１内に核酸を導入した後、必要に応じて、核酸増幅反応を行う前に電気化学的測定を行い、初期の電気化学的特性を確認する。電気化学的測定は、作用電極１２ａ、参照電極１２ｂ及び対極１２ｃからなる電極１２を用いて行う。

反応液を加熱する加熱手段として反応槽１１と接して設けられたラバーヒーター１５に通電して反応液を所定の温度に加熱することにより、核酸増幅反応が進行する。核酸増幅反応の方法は特に限定されるものではないが、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であるＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法の他、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれる増幅法（特許第３３１３３５８号公報等）、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特公平７−１１４７１８号公報等）、ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許第２６５０１５９号公報）を適用することができる。

これら増幅反応の方法のうち、ＬＡＭＰ法は、増幅対象となる塩基配列の末端にループ構造を形成し、そこを起点としてポリメラーゼによる伸長反応が起きると同時に、ループ内の領域にハイブリダイズしたプライマーが、鎖置換反応により核酸鎖を伸長しながら先の伸長反応の産物を一本鎖に解離させていくというものである。生成した一本鎖核酸はその末端に自己相補性領域を持つため、末端にループを形成して新たな伸長反応が始まる。実際のＬＡＭＰ法では等温で進行するため、上記反応は同時に並行して起こる。ＬＡＭＰ法の特徴としては、等温で進行する鎖置換型の反応であることの他に、増幅産物の量が非常に多いことが挙げられる。これは、ポリメラーゼが失活する原因である熱変性の操作が含まれていないことも一因である。この増幅産物の量が多いことから核酸増幅によるグアニンの酸化電流値の変化も大きく、本実施形態で適用するための核酸増幅反応の方法としては、ＬＡＭＰ法が特に好適である。

核酸増幅反応において核酸の合成のために使用する酵素は特に限定されるものではない。好適に用いられる酵素の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。各酵素の反応は、公知の任意の条件で行うことができる（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）。

核酸増幅反応を行う反応液の電気化学的特性の経時変化に基づいて、増幅反応の有無が判定される。被検試料中に標的核酸が含まれていた場合、核酸増幅反応によって増幅反応が進行して、反応液の電気化学的特性が大きく変化する。電気化学的特性としては、所定の電圧を印加したときの電流値若しくは抵抗値や、所定の電流を通電させたときの電圧値が挙げられる。例えば、反応液に所定の電圧（好ましくは０．８〜１．２Ｖ）を印加したときの電流値が核酸増幅反応の進行に伴って低下する。被検試料中に標的核酸が含まれていなかった場合、増幅反応は進行せず、電流値等の電気化学的特性は実質的に変化しない。そのため、電気化学的特性の変化の有無によって、増幅反応の有無を明確に判定することが可能である。具体的には、例えば、反応液に０．８〜１．２Ｖの範囲内で一定の電圧を印加したときの電流値の変化が、初期の電流値に対して±７％以内であれば、増幅反応は進行しなかったと判断することができる。この場合、電流値の変化とは、例えば、グアニンの酸化により生じる酸化電流に由来する電流値（酸化電流値）の低下である。

増幅反応の有無を判定するための電気化学的測定を行う際の測定モードは、増幅反応に伴う電気化学的特性の変化が確認可能なものであれば、特に制限されない。測定モードの具体例としては、リニアー・スイープ・ボルタンメトリー（ＬＳＶ）法、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）法、クロノアンペロメトリー（ＣＡ）法が挙げられる。あるいは、定電圧測定や定電流測定も適用可能である。

検出装置１００は基板上に形成された微小化学分析システム（μＴＡＳ）であってもよい。この場合、基板及び該基板上に形成された微小化学分析システムを、標的核酸の検出のためのマイクロデバイスとして適用することも可能である。このようなマイクロデバイスによれば、微量の被検試料であっても簡易且つ高精度に標的核酸を検出することが可能である。従来の検出方法の場合、微小化学分析システムによって行うことは極めて困難であるが、本実施形態は微小化学分析システムによる検出に適しているという利点も有する。

以下、実施例により本発明について更に具体的に詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：ｄＮＴＰの電気化学的特性評価
核酸増幅反応基質であるｄＮＴＰ（デオキシリボクレオシド三リン酸）について電気化学的測定を行い、ｄＮＴＰの電気化学的特性の評価を行った。

（１）試料の調製
下記組成を有する試薬溶液を準備した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）２０ｍＭ
ＫＣｌ１０ｍＭ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４８ｍＭ
Ｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒ（ＦＩＰ、ＢＩＰ）３．２μＭ
Ｏｕｔｅｒｐｒｉｍｅｒ（Ｆ３、Ｂ３）０．８μＭ
Ｂｓｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ８Ｕ／ｔｕｂｅ

Ｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒ及びＯｕｔｅｒｐｒｉｍｅｒの配列を以下に示す。
ＦＩＰ TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG（配列番号１）
ＢＩＰ TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG（配列番号２）
Ｆ３ TGCTTGTGGCCTCTCGTG（配列番号３）
Ｂ３ GGGTGTGTGAAGCTGTG（配列番号４）

上記試薬溶液に核酸増幅反応基質であるｄＮＴＰを５．６ｍＭとなるように添加し、試料（ｄＮＴＰ試料）を調製した。ここで、ｄＮＴＰの構成成分であるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰがそれぞれ１．４ｍＭとなるようにｄＮＴＰ試料を調製した。さらに、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰのうちいずれか一つのｄＮＴＰを１．４ｍＭとなるように上記試薬溶液に添加した４種の試料（ｄＡＴＰ試料、ｄＴＴＰ試料、ｄＣＴＰ試料及びｄＧＴＰ試料）を調製した。

（２）測定モード
ポテンシオスタット（北斗電工社製、ＨＺ−５０００）を用い、リニアー・スイープ・ボルタンメトリー（ＬＳＶ）法による酸化電流値の測定を以下の条件で行った。
初期電位：自然電位
走査速度：８０ｍＶ／ｓｅｃ
最終電位：１．２Ｖ
サンプリング：１００ｍＶ

（３）測定方法
微量測定用セル（ＢＡＳ社製）に添加した試料８０μＬについて電気化学的測定を行った。

（４）電極
参照電極として銀／塩化銀電極（ＢＡＳ社製：直径４ｍｍ）を用い、対極として白金線を用い、作用電極としてグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ社製：外径３ｍｍ、電極直径１ｍｍのディスク電極）を用いた。測定前に、これらの電極表面を、セル研磨キット（ＢＡＳ社製）を用いて研磨した。

（５）評価
調製したｄＮＴＰ試料、ｄＡＴＰ試料、ｄＴＴＰ試料、ｄＣＴＰ試料及びｄＧＴＰ試料について、ＬＳＶ測定を行った。図２に、ＬＳＶ法による酸化電流値の測定結果を示す。図２に示されるように、ｄＮＴＰ試料の場合０．８Ｖ辺りより酸化電流が流れ始め、１．２Ｖまでその酸化電流値が上昇した。また、ｄＡＴＰ試料、ｄＴＴＰ試料及びｄＣＴＰ試料においては、０．８〜１．２Ｖの範囲内において酸化電流値の上昇はほとんど認められなかった。一方、ｄＧＴＰ試料においては、０．８Ｖ辺りから酸化電流が流れ始め、１．２Ｖまでその酸化電流値は上昇した。ｄＮＴＰ試料とｄＧＴＰ試料における酸化電流値の変化はほぼ一致した。

上記測定結果より、核酸塩基のうちグアニンのみが、０．８〜１．２Ｖの範囲内において電極で酸化され、酸化電流を生じさせることが明らかとなった。なお、核酸塩基のうち、グアニンの酸化電位が最も低いことが知られている。

更に、上記試薬溶液の成分（塩類、トリスバッファー、プライマー、Ｂｓｔ等）についても、上記電位範囲内において酸化電流値の上昇はほとんど認められなかった。これらのことから、核酸増幅反応を行う反応液の成分のうち、上記電位範囲内で酸化電流を生じさせるものはグアニンのみであることが明らかとなった。

実施例２：グアニンの電極酸化反応を利用した核酸増幅の有無の判定
核酸増幅反応を行う反応液について、実施例１と同様の条件で電気化学的測定を行うことにより、核酸増幅の有無を判定することが可能かどうか検討した。

（１）ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
実施例１で調製したｄＮＴＰ試料と同様の試料を増幅反応溶液として用い、核酸増幅法としてＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を採用して核酸増幅反応を行った。反応温度は６５℃とした。また、増幅反応陽性標準の鋳型核酸として、ＰＳＡのｃＤＮＡをクローニングしたｐＢＲ３２２を用いた。

（２）電気化学的測定
実施例１と同様の測定モード、測定方法及び電極により、反応時間が異なる増幅反応溶液について電気化学的測定を行い、電気化学的特性の反応時間の経過に伴う変化を評価した。

（３）測定結果
図３に、増幅反応液のＬＳＶ法による酸化電流値の測定結果を示す。図３に示されるように、核酸増幅反応（ＬＡＭＰ反応）の進行に伴って、すなわち濁度の増加に伴って酸化電流値が低下することが観察された。図４は、電位１Ｖにおける酸化電流値と濁度との関係を示すグラフである。図４から明らかなように、例えば１Ｖ近辺の酸化電流値の低下を確認することにより、核酸増幅の有無を判定することが可能であると考えられる。

実施例３：電極の影響
電極の種類が電気化学的測定の結果に与える影響について検討した。グラッシーカーボン電極に代えて金電極（ＢＡＳ社製：外径３ｍｍ、電極直径１．６ｍｍのディスク電極）を作用電極として用いて、実施例２と同様の核酸増幅反応における反応液の電気化学的特性の変化を評価した。また、作用電極（カーボンペースト）、参照電極（銀／塩化銀）及び対極（カーボンペースト）が約２ｍｍ角の基板上に形成されたサンプルリザーバー付きディスポーザブル電極（北斗科学産業社製）を電極として用いて同様の評価を行った。

（４）測定方法
作用電極が金電極の場合はサンプル容量を８０μＬとし、微量測定用セル（ＢＡＳ社製）を用いて電流値を測定した。また、ディスポーザブル電極の場合はサンプル容量を１００μＬとし、サンプルリザーバーを用いて電流値を測定した。

（５）測定結果
図５は作用電極として金電極を用いた場合、図６はディスポーザブル電極を用いた場合の電気化学的測定の測定結果を示すグラフである。図５、６に示すように、作用電極としてグラッシーカーボン電極に代えて金電極又はディスポーザブル電極を用いた場合でも、ＬＡＭＰ反応による核酸増幅が生じたとき（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の酸化電流値は、核酸増幅が生じなかった場合（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の酸化電流値より低値を示した。以上の結果から、核酸増幅反応の進行に伴う酸化電流値の低下は、電極の種類によらず測定可能であることが確認された。

実施例４：不溶性担体上での核酸増幅反応への適用
多孔質支持体中での核酸増幅反応の場合について、核酸増幅反応の有無の電気化学的な検出の可否を検討した。

（１）試料の調製等
試料の調製、ＬＡＭＰ法で検出する鋳型核酸及び反応温度、測定モードは実施例２と同様の条件で実験を行った。

（２）電気化学的測定
電極は、実施例３で使用したものと同様のディスポーザブル電極を用いた。５ｍｍ×１０ｍｍのサイズに切り出した吸水用濾紙（東洋濾紙社製：Ｎｏ．２６−ＷＡ）に増幅反応液を浸漬し、その濾紙を電極に押し付けることによって電気化学的な測定を行った。

（３）測定結果
図７に電気化学的測定の測定結果を示す。実施例３と同様に、例えば１Ｖ近辺において、核酸増幅反応が生じた場合（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の酸化電流値は、核酸増幅が生じなかった場合（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）の酸化電流値より低い値を示した。この結果から、電気化学的測定により、不溶性担体上での核酸増幅の有無を検出することが可能であることが確認された。このように、不溶性担体上に浸漬された増幅反応液の場合であっても核酸増幅の有無の検出ができたということは、試料に含まれる不溶性の不要物（変性したタンパク質や無機沈殿等）が反応液に持ち込まれても核酸増幅の検出が可能であることを示唆している。

実施例５：測定モードの検討
核酸増幅反応の進行に伴う酸化電流値の低下の要因を解明する目的で、ＬＳＶ法以外の測定モードによる電気化学的測定を行った。測定モード以外の条件は、実施例２と同様とした。

（１）ディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）
ＤＰＶ法による電気化学的測定を以下の条件で行った。ＤＰＶ法によれば、バックグラウンドからの電流や電極反応に伴う電気二重層の充電等の反応が低減でき、電極で生じる正味の反応を正確に捉えることが可能である。
初期電位：自然電位
最終電位：１．２Ｖ
パルス幅：５０ｍｓｅｃ
パルス周期：１ｓｅｃ
パルス高さ：１０ｍＶ
サンプリング間隔：５ｍＶ

（２）クロノアンペロメトリー（ＣＡ）
ＣＡ法による電気化学的な測定を以下の条件で行った。ＣＡ法は電極に一定の電位をかけ続けながら電流測定を行う方法であり、特定の電位における電流値をＬＳＶ法と比較してより正確に測定できる。
初期電位：自然電位
印加電位：１Ｖ
サンプリング：２０ｓｅｃ

（３）測定結果
図８は、ＤＰＶ法による電気化学的測定の結果を示すグラフである。ＤＰＶ法の場合、ＬＳＶ法の場合（図３）と異なり、０．８Ｖ付近に明瞭なピークが観察された。この酸化電流値のピークは、ＬＡＭＰ反応による核酸増幅の有無に拘らず、同等の０．８Ｖ付近に認められた。このことは、グアニンは、ｄＮＴＰの状態であっても核酸増幅が生じて核酸鎖中に取り込まれた状態であっても同様の反応機構で電極酸化を受けていることを示している。一方でＬＳＶ法の場合と同様に、増幅反応が進行したとき（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の酸化電流値はＮｅｇａｔｉｖｅと比較して低い値を示している。このことから、ｄＮＴＰがポリマー化して核酸鎖を生成したときに電極への接触頻度が低下していることが示唆される。

また、図９に示すように、ＣＡ法による限界電流測定においても増幅反応の進行に伴う酸化電流値の変化が認められた。図１０は、ＣＡ法によって得られた電流−時間曲線に対してコットレルプロット解析を行った結果を示すグラフである。核酸増幅反応が進んだ場合（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の直線の傾きは、核酸増幅反応が起きなかった場合（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）の直線の傾きより小さかった。コットレルプロットで得られる直線の傾きは、検出対象物質の拡散係数と相関することから、核酸増幅によってグアニンの拡散係数が低下した結果、酸化電流値が低下したものと考えられる。

検出装置の一実施形態を示す平面図である。ＬＳＶ法によるｄＮＴＰ中の各塩基の酸化電流値の測定結果を示すグラフである。増幅反応液のＬＳＶ法による酸化電流値の測定結果を示すグラフである。電位１Ｖにおける酸価電流値と濁度との関係を示すグラフである。増幅反応液のＬＳＶ法による酸化電流値の測定結果を示すグラフである。増幅反応液のＬＳＶ法による酸化電流値の測定結果を示すグラフである。増幅反応液のＬＳＶ法による酸化電流値の測定結果を示すグラフである。増幅反応液のＤＰＶ法による酸化電流値の測定結果を示すグラフである。増幅反応液のＣＡ法による酸化電流値の測定結果を示すグラフである。ＣＡ法による酸化電流値の測定結果のコットレルプロットによる解析結果を示すグラフである。

符号の説明

１０…反応装置、１１…反応槽、１２…電極、１２ａ…作用電極、１２ｂ…参照電極、１２ｃ…対極、１５…ラバーヒーター、３０…精製装置、３１…回収槽、３３…保持槽、３４…陽極側電解槽、３５…陰極側電解槽、３７…多孔性濾過膜、４１…陽極、４２…陰極、５０…接続部、１００…検出装置。

Claims

核酸増幅反応を行う反応液の電気化学的特性の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定する、核酸増幅の有無の判定方法。
前記反応液に所定の電圧を印加したときの電流値の変化に基づいて核酸増幅の有無を判定する、請求項１記載の判定方法。
前記所定の電圧が０．８〜１．２Ｖである、請求項２記載の判定方法。
前記電流値の変化が、グアニンの酸化により生じる酸化電流に由来する電流値の低下である、請求項２又は３記載の判定方法。
被検試料から核酸を精製するステップと、
精製した核酸を含む反応液中で標的核酸を増幅する核酸増幅反応を行い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を用いて前記反応液における標的核酸の核酸増幅の有無を判定するステップと、を備える、被検試料中の標的核酸の検出方法。
前記被検試料から核酸を精製するステップにおいて、核酸が回収槽内にプールされるように前記被検試料から核酸を精製し、
前記回収槽内にプールされた核酸を前記回収槽に接続された反応槽内に導入するステップを更に備え、
前記反応槽内で前記核酸増幅反応を行う、請求項５記載の検出方法。
電気泳動によって被検試料から核酸を精製する、請求項５又は６記載の検出方法。
核酸増幅反応を行う反応液が投入される反応槽と、
前記反応槽内に挿入された電極と、を有し、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の判定方法に用いられる反応装置。
請求項８記載の反応装置と、
当該反応装置の反応槽に接続された、被検試料から核酸を精製する精製装置と、を備え、
請求項５記載の検出方法に用いられる検出装置。
前記精製装置が、電気泳動によって被検試料から核酸を精製する精製装置である、請求項９記載の検出装置。
前記精製装置が、
陽極側電解槽と、
前記反応槽に接続されており、核酸がプールされる回収槽と、
被検試料が保持される保持槽と、
陰極側電解槽と、を有し、
これらがこの順に接続されている、請求項１０記載の検出装置。