JP2009528072A - 標的核酸配列の電気化学的検出方法 - Google Patents

Abstract

この発明は、標的核酸配列の電気化学的検出方法およびそのための集合体に関するものである。
この発明によれば、標的配列を含むことができる核酸を含んでいてもよい、酸化剤と混合された生物サンプルが提供され、該標的配列が該酸化剤で酸化される少なくとも１つのヌクレオチド塩基からなっていること；該所定標的配列とカップリングすることができる相補手段を提供すること；該相補手段が、該標的配列を複製するために適しかつ該ヌクレオチド塩基を含むタイプのヌクレオチドから少なくとも構成される活性化可能増幅手段であって、該ヌクレオチドが複製中に消費されて複製核酸を構成できる活性化可能増幅手段を構成していること；および該サンプルに電界を負荷し、電流の低下を記録することにより該所定標的配列の存在を特定することからなる標的核酸配列の電気化学的検出方法を提供する。

Description

この発明は、標的核酸配列の電気化学的検出方法およびその方法を実施するための検出集合体（コレクション）に関するものである。

既知の方法は、電気化学的検出により、所定の生物サンプルの標的核酸配列の存在または不存在を同定することが可能である。

これらの方法は、特に、例えば所定ウイルスの遺伝子的遺伝部分に対応する、核酸中の標的配列を同定することが可能である。

これらの既知の技法によれば、このヌクレオチド配列が一旦同定されると、その配列を導入するオリゴヌクレオチドから形成されるプローブが調製され、これらのプローブは固体支持体に結合される。このプローブには、酸化可能なヌクレオチド塩基を有する所定数のヌクレオチドが含まれている。次いで、この生物サンプルは、上記プローブがグラフトされる固体支持体に接触して、必要に応じて、標的配列を含む核酸がそのプローブとハイブリダイズする。さらに、このハイブリダイズした核酸は、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド塩基を酸化できる遷移金属錯体と反応し、その生物サンプルに上記標的配列を含む核酸が含有されている場合に発生するこのハイブリダイゼーションが発生したかまたは発生しなかったかが、可変電場を生物サンプルに負荷するとともに、その中を循環する電流を測定することによって特定する。この電流は、酸化できる所定塩基数に依存する。実際、電位スキャンを行うとともに、サンプル中を流れる電流を記録すると、その電流に対する応答は、プローブが標的配列を含む核酸とハイブリダイズされているかまたはハイブリダイズされていないかによって依存が異なっている。いかなる場合でも、ハイブリダイズされたプローブのヌクレオチド塩基酸化のための電流は、ハイブリダイズされていないヌクレオチド塩基の酸化に関連する電流よりも高い値を有している。

かかる検出法については特にアメリカ特願第２００２／１０６６８３号明細書に記載されている（特許文献１）。

しかしながら、かかる方法は、特に固体支持体にグラフトするために、オリゴヌクレオチドプローブを調製する必要があり、時間も費用もかかるので、実施するのはかなり困難である。
アメリカ特願２００２／１０６６８３明細書

したがって、この発明が解決しようとする課題は、実施が簡単で、より経済的な標的核酸検出方法を提供することである。

そこで、この発明の課題を解決する第１の形態は、標的核酸配列の電気化学的検出方法であって、その方法が：所定の標的配列を含むことができる少なくとも１つの核酸を含有し、酸化剤と混合された生物サンプルであって、上記標的配列が上記酸化剤で酸化できるヌクレオチド塩基から構成されている生物サンプルを提供すること；上記所定標的配列とカップリングできる相補手段を提供すること；上記酸化剤と上記ヌクレオチド塩基との反応を生起できる電界を上記サンプルに負荷し、上記サンプルを流れる電流を測定して、上記標的配列の存在を特定すること；上記相補手段が、上記標的配列を複製することに適した活性可能増幅手段であって、その増幅手段が上記ヌクレオチド塩基を含有するタイプのヌクレオチドから少なくとも構成され、そのタイプのヌクレオチドが複製中に消費されて複製核酸を構成すること；および上記増幅手段が活性化されたときにその電流が低下することにより、上記所定標的配列の存在を特定すること；から構成されている。

つまり、この発明の１つの特徴は、核酸を増幅する方法と、増幅中の上記増幅手段の１要素、具体的には遊離ヌクレオチドの１つが消費されたかどうかを実証するこの電流を同時に測定する方法とを実行することにある。このようにして、標的核酸配列が活性化可能増幅手段とよく対応しているならば、この標的配列は増幅プロセス中に複製されて、この複製中に基質として使用される遊離ヌクレオチドの数と、開始時に特定されるその濃度とは減少することになるであろう。その結果、この遊離ヌクレオチドの数が、増幅中に合成される核酸中に組み込まれるヌクレオチド数のために減少すれば、酸化剤は、増加する限られた数の遊離ヌクレオチドとだけ反応することができ、その結果電子移動がほとんど起こらず、最終的に測定される電流が低下することになろう。しかしながら、酸化剤はまた、初期に存在した核酸中に、また複製により合成される核酸中に組み込まれるヌクレオチドの塩基を酸化できるが、他方その結果生じる電流は、遊離ヌクレオチドの塩基の酸化から生じる電流に比べて弱いことは、下記に詳細に説明するとおりである。

この発明の特に有利な態様によれば、標的配列を同定するための核酸は、１重鎖もしくは２重鎖DNAもしくはRNA分子である。つまり、活性化可能増幅手段は、標的配列の上流をハイブリダイズするのに適した手段と、上記配列の複製を実施するための手段とからなっている。この複製から生じる核酸数は、時間経過と共に指数関数的に増加して、酸化可能ヌクレオチドの塩基を示す遊離ヌクレオチド数が時間経過と共に指数関数的に減少すると同時に、サンプル中を流れる電流が急速に認識できるようになる。

有利なことに、遊離ヌクレオチドに関連する窒素系塩基は、プリンヌクレオチド塩基、例えば、グアニンもしくは、メルカプトグアニン、オキソグアニンタイプ等のグアニンの化学同族体であり、また使用される酸化剤はルテニウム錯体である。後者には、還元型と酸化型があり、その後者はグアニンの酸化を不可逆的に触媒する。この混合物に電流を流すと、それによって生じて測定される電流は、グアニン残基を有する遊離ヌクレオチドの濃度に実質的に依存する。というのは、酸化剤もまた複製核酸中に組み込まれたグアニンを酸化するけれども、その遊離ヌクレオチドの酸化動力学と拡散係数が上記複製核酸のそれよりもずっと大きくなるからである。

その上、上記標的配列の複製によって生じる核酸の数は時間に左右されるので、サンプル中を流れる電流の低下もまた時間に左右される。つまり、開始サンプルが高濃度の核酸を有していて、同一タイプのこれらの核酸が標的配列を有しているならば、核酸の消費はずっと大きくなるであろう。したがって、電流の変化の測定は急速に認識できることになろう。他方、核酸濃度が低くなれば、その電流変化をより長期間観察することが必要になるであろう。その結果、この発明は標的配列の定量的決定に適用することができる。

したがって、実際には、電界を負荷して、それから生じる電流を、例えば、負荷ゼロ（０）時に測定後、経時的に測定すれば増幅プロセス期間全体に亘ってその電流の低下を記録することができる。別の方法としては、電流を所定時間後に記録することもできる。

実際に、論理的には、グアニン残基を有する遊離ヌクレオチドの濃度は、増幅開始前に最大であり、その結果サンプル中を通過できる電流もまた最大である。その後、増幅中もしくは増幅後に、電流測定を、増幅プロセス中での測定と比較すると、その差を評価することができる。これらの測定中に、電流が有意に減少することが観察されると、このことはグアニン残基を有する遊離ヌクレオチドが消費され、したがって標的配列を持つ核酸がサンプル中に実際に存在することを意味している。標的配列が存在していると結論づける前に行われるべき追加の証明については下記に詳しくは説明する。

その上、この電流は、電界を同じ増幅のために比較的に一定に所定期間負荷した後に測定される。というのは、電流を負荷した時と、サンプル中を流れる電流が最大になる瞬間との間、サンプル中に存在するイオン化された化学種の流動性が最大になる遷移相が発生するからである。したがって、最大の感受性を提供するために、電流は、その電流が最大の時、つまり、下記に詳述する所定時間後に測定するのが好ましい。それがどうあろうと、電流の測定は、ポテンシャル・スウイープ・ボルタムメトリー (potential sweep voltammetry) タイプ、例えばリニア、サイクリックもしくはパルス・スウイープ・ボルタムメトリー等や、ポテンシャル・ステップ・ボルタムメトリー (potential step voltammetry) タイプ、例えばクロノアンペロメトリー (chronoamperometry) 等の既知の電気化学的技法によって行うことができる。

さらに、好ましくは、上記電界は、サンプル中に浸漬するのに適した電極間に負荷される。例えば、電界は、金属酸化物ベースもしくは炭素ベース電極または貴金属ベース電極と、標準電極とを共にサンプル中に浸漬して、それらの間に負荷される。この電界負荷に際しては、同じ増幅の各電流測定に対する電極表面の活性を一定にして、電流変化が、チャージキャリアーの低下により、表面変化によるのではないことを確認するように注意すべきである。電極は、例えば、金、プラチナ等の貴金属から選択することができる。

この発明の別の特に好ましい態様によれば、上記酸化剤は、上記一方の電極の壁に、酸化剤を捕捉するその電極に適用されたゲル、メンブレンまたはフイルムによって、または、酸化剤がカップリングされるポリマーによって規制され、その全体が一方の電極の表面上に吸着もしくはグラフトされる。

この発明の別の形態によれば、この発明は、標的核酸配列を電気化学的に検査するための集合体（コレクション）を提供する。この集合体は、酸化剤によって酸化できるヌクレオチド塩基からなる所定標的配列を含むことができる核酸の少なくとも１つを含む生物サンプルであって、酸化剤と混合された生物サンプルを収容する収容手段；上記所定標的配列とカップリングできる相補手段；上記サンプルに、上記酸化剤と上記ヌクレオチド塩基との反応を生起させることができる電界を負荷する負荷手段；および、上記標的配列の存在を測定するために上記サンプル中を通過する電流を測定する測定手段；とから構成され、また上記相補手段が、上記標的配列を複製するのに適した活性化可能増幅手段であって、複製中に消費されて複製核酸を構成することができるヌクレオチドの塩基を含むタイプの少なくともヌクレオチドからなる増幅手段から構成され、また上記測定手段が、上記核酸が上記所定標的配列を含んでいる場合、増幅手段が活性化されたときに低下する電流値を測定できることから構成されている。

この発明に係るその他の特長と利点は、非限定的に記載された本明細書の下記記載を、添付図面を参照して読めば明らかである。

この発明に係る標的核酸配列の電気化学的検出方法は、核酸を増幅する方法と、標的核酸配列の存在を反映する、特定の化学種の低下を追跡できる電気化学的方法とを組み合わせたものである。下記に記載する増幅方法は、「PCR（polymerase chain reaction: ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）タイプ」の方法である。しかし、その他の何れの増幅方法も同様に効果的に使用することができる。かかる方法としては、例えば、「LCR（ligase chain reaction: リガーゼ・チェーン・リアクション）タイプ」、「SDA（strand displacement amplification: ストランド・ディスプレイセメント・アンプリフィケーション）タイプ」、「RCA（rolling circle amplification: ローリング・サークル・アンプリフィケーション）タイプ」、「NASBA（nucleic acid sequence based assay or amplification: 核酸シークエンス・ベースド・アッセイ／アンプリフィケーション）タイプ」または「HDA（helicase-dependent isothermal DNA amplification: ヘリカーゼ依存性イソサーマルDNAアンプリフィケーション）タイプ」などの方法が挙げられる。

PCRタイプの方法の原理は、所望のDNAを作成する２個の相捕ストランドとプライマー対とを用いて複製することにより、最初の２個のストランドの新しい２個のコピーを合成するためのDNAポリメラーゼの性質の１つを繰り返し用いることにあり、ここで使用する該プライマーは、約２０塩基の核酸の小ストランドからなり、塩基相補性により特異的にハイブリダイズできて複製される２個のそれぞれのDNAストランドになる。当然のことながら、このプライマーは、核酸上に現れる標的配列に従って選択される。

このプライマーがストランドにハイブリダイズされた後に、このプライマーから相補ストランドを合成することができるDNAポリメラーゼに加えて、ヌクレオチドもまた提供される。かかるヌクレオチドとしては、例えば、DNAをそれぞれ構成するｄGTP（デオキシグアニントリホスフェート）、ｄATP（デオキシアデニントリホスフェート）、ｄTTP（デオキシチロシントリホスフェート）およびｄCTP（デオキシシトシントリホスフェート）の４種類のヌクレオチドが挙げられ、DNAポリメラーゼが集合して、複製された相補ストランドを形成する。

その上、標的核酸配列を含む被験サンプル、DNAポリメラーゼ、プライマーおよび４種類のヌクレオチドを導入する反応媒体は、液体でバッファである。この方法では、さらに反応混合物は、同じサイクルの経過中、様々なフェーズに従って、変性、ハイブリダイゼーションならびに核酸延伸などの温度変化を行なってもよい。通常では、この反応混合物は約３０サイクル連続して反応するのがよい。

さらに、この発明の対象である増幅方法は、その原理は上述したとおりであるが、その増幅サイクルの経過中、必要に応じて、４タイプの１つのヌクレオチドが消失するような電気化学的方法と組み合わせてもよい。その４タイプの１つのヌクレオチドは、DNAポリメラーゼの作用により、相補DNAストランド中に導入されてもよい。

このことを実施するためには、酸化剤が使用され、かかる酸化剤としては、例えば、トリス（２，２'‐ビピリジル）ルテニウム（II）などのルテニウム錯体が挙げられ、このようなルテニウム錯体は、酸化型で、グアニン残基ｄGTPを有するヌクレオチドのグアニンを酸化することができる。その他のグアニンを酸化できる酸化剤も当然使用することができ、例えば、IrCl₆ ^4-が挙げられる。図１に示すように、電極１０を水性反応媒体１２中に浸漬し、これに酸化剤を入れて電界を負荷する。これにより、酸化剤は、先ず、矢印Ｆで示すように還元型１４から酸化型１６に変化し、電子を電極１０に付与する。その上、その酸化型１６で、酸化剤は、グアニン残基を有するヌクレオチド１８のグアニンを酸化することができ、遊離されるか、または核酸中に挿入される。このグアニンを酸化するに際して、酸化剤は同時に、矢印Rに示すように還元され、酸化されたグアニンはもはや反応に関与しないことになる。電極で測定された電流、つまり電子の流れは、本質的には、グアニン残基を有する遊離ヌクレオチドの酸化からDNAストランド中に挿入されたヌクレオチドに僅かに流れた電流によるものである。また、このことは、拡散係数の差異や、遊離グアニン残基を有するヌクレオチドと核酸中に導入されたグアニン残基を有するヌクレオチドとの間のグアニン酸化速度論の差異によっても説明することができる。

その結果、グアニンを含むヌクレオチドが、増幅サイクル中に、上記４タイプのそれぞれのヌクレオチドを実質的に同数含有する複製された核酸を合成するために、他のヌクレオチドと同程度に消費されるならば、電子の流れ、つまり電極で測定された電流自体もまた低下する。

この発明に係る方法を説明する目的で、実施例を下記に記載する。

図２は、この発明の第１の態様を示すもので、チューブ３０をサーモサイクラー３２に取り付ける。このサーモサイクラー自体は、チューブ３０を、PCRタイプの方法に従って種々の増幅工程を表す所定の温度にすることができる。通常では、サイクルの第１ステップは、DNAの場合、チューブを数秒加熱して９４℃にして核酸の変性を起こすステップである。次に、約１分間の第２ステップでは、その温度を急激に５８℃に下げて、プライマーのハイブリダイゼーションを起す。続いて、チューブを１分間加熱して、その温度を７２℃に上げ、DNAポリメラーゼを活性化して相補ストランドの延伸を行う。その後、新しいサイクルを開始する。

反応混合物３４をチューブ３０のペレット３６に封入し、電極３８、４０をチューブ３０中に導入し反応混合物３４中に浸漬した。１本の電極３８は、例えば炭素電極であり、もう一方の電極４０は標準電極である。これらの電極３８、４０は、所定のプロフィールに従って、２個の電極間の電位を変化させることができるポテンシオスタット４２にそれぞれ結合され、それらの電極間を流れる電流を記録することができる。

この発明の第２の態様においては、図３に示した必須要素についての増幅方法は、あらゆる面において、上記の方法の場合と同一である。ただし、検出は、増幅中に行わずに、その最後に行われる。この場合、電極はチューブ３０に直接導入するのではなく、反応混合物３４自体が、図３に示した１個もしくはそれ以上のマイクロキュベット４４中に導入される。これらのマイクロキュベット４４は、電極４８、５０をスクリーン印刷した集積回路タイプのプレート４６に漏れないようにシールした。これらの電極４８、５０には、活性エンド５２、５４がそれぞれマイクロキュベット４４の底部に配置されていて、結合エンド５６、５８にそれぞれ延設されている。上記の第１の態様と同様に、結合エンド５６、５８は、ポテンシオスタット４２にそれぞれ結合され、電界をマイクロキュベット４４に配置した反応混合物に負荷することができる。

また、これらのマイクロキュベット４４は、上記したNASBA、RCAまたはHDAタイプの増幅方法にとっても適している。

本実施例は、詳述するように、生物サンプル中のサイトメガロウイルス（CMV）を検出する方法への応用例である。このウイルスのゲノムは、４０６塩基対からなる配列として同定され、この実施例では、この配列を特異的に増幅できる市販のプライマーAC１、AC２（６０‐００３、６０‐００４（Argene社製）を使用した。反応混合物の全容量は５０μｌで、２種類のプライマーをそれぞれ濃度０．８μｍｏｌ／ｌ、４タイプのヌクレオチドをそれぞれ濃度１００μｍｏｌ／ｌ、ポリメラーゼの濃度μｌ当たり０．０２単位、ルテニウム錯体を濃度２０μｍｏｌ／ｌ、１０Xバッファー１／１０希釈液を添加した。当然のことながら、反応混合物には、サイトメガロウイルスを導入する細胞抽出物からなる生物サンプルが含まれている。

電気化学的測定は、ポテンシオスタット４２を使用してボルタムメトリー技法を応用して測定した。測定条件は、１秒当たり０．０１から１００Ｖの間のスイープ（ｓｗｅｅｐ）率に対して、電極３８、４０または５２、５４間の電位を、開始時は、例えば、カロメル電極に対して初期電圧０．５Ｖから、最終電圧１．３Ｖ（同じカロメル電極に対して）まで変化させた。同時に、得られた電流は電位スイープ間で記録した。

図４は、ポテンシオスタットによって上記電極間の負荷電位差の関数として０．１V・ｓ^ー１の割合で記録し、電流密度として表した２つのボルタムメトリーカーブを示す。第１のカーブ６０は、上記実験による２番目の増幅サイクルで測定した電流の変化を表している。生物サンプルは当初標的配列を１０万コピー含んでいた。このカーブは、１cm^２当たり約６８μAの第１の極値６２に達した。第２のカーブ６４は、上記実験による３０番目のサイクルで測定した電流変化を示している。このカーブは、１cm^２当たり約５６μAの第１の極値６６に達した。この第１の極値６６は、１cm^２当たり約１２μAほど第１の極値６２より下に位置していた。

その上、サイトメガロウイルスを含んでいない生物サンプルに適用した、上記増幅手段を用いた上記操作スキームの２つのステップが、実質的に同一の２つのカーブを示すことは、以前明白に証明されている。その結果、ウイルスが生物サンプルに存在しないときには、増幅は起こらない。

そこで、２つのカーブ６０と６４を比較することによって、３０回の増幅サイクル後に、増幅前のその最初の値に対して電流の強さが低下したことは明白である。その結果、生物サンプルの核酸中にサイトメガロウイルスが存在することは対応するプライマーAC１およびAC２によって認識され、また、酸化剤、例えばルテニウム錯体が酸化できるのはこのヌクレオチドの塩基であるから、このヌクレオチド、特にグアニン残基導入するｄGTPタイプのヌクレオチドが消費されて、相補ストランドが明らかに延伸していることは明白である。それで電流の測定は、実質的には、ルテニウム錯体の還元に対応するとともに、ｄGTPグアニンを含むヌクレオチドの酸化に対応する電子の流れも測定した結果である。したがって、後者のヌクレオチドが部分的に消失すると、それらは相補核酸ストランド中に組み込まれてしまうので、それらの遊離状態の量は減少し、その結果、それから派生する酸化電流もまた減少する。

ここで、所定のサンプル中の核酸の標的配列を定量化する原理を図５に示したグラフを参照して説明する。

このグラフには、そのx軸８０に沿って複製サイクル数、y軸８２に沿って図２に示した態様による所定の電圧での各サイクルで記録した電流の正規化値を記録している。これらの正規化値は、増幅開始以前に行った電流測定によって分割された電流測定に対応している。

５つのカーブ８４、８６、８８、９０および９２は、サイトメガロウイルスがそれぞれ上記標的配列ゼロ（０）コピー（８４）、１０００コピー（８６）、１万コピー（８８）、１０万コピー（９０）および１００万コピー（９２）からなる生物サンプルから始めてプロットしたカーブを表している。

したがって、生物サンプルに標的配列を導入する核酸の内容が多ければ多いほど、サンプル中を通過するサイクル数の関数としての電流がより急速に減少する。このことは、サンプル中に標的配列を導入する核酸の内容が多ければ、始めに、複製においてｄGTPタイプのヌクレオチドがより多く消費され、その結果、サイクル数の関数としての電流がより早く低下することが原因である。このようにして、標的配列を導入する核酸の量は、サンプル中を通過する電流の量が下がることから始まるサイクル数を決定することによって測定できることが理解できる。これに加えて、この図５はまた、上記標的配列が当初わずか１０００コピーしかサンプルに存在していなかった場合でも、その標的配列の存在を検出できることを示している。

したがって、この発明に係る方法を、同定されたウイルスを含むかもしれない生物サンプルに適用すると、増幅方法ばかりではなく、電気化学的測定を行えば、上記ウイルスの存在または不存在を明らかにするとともに、その定量を行うことができる。その結果、同定するための物質の調製が複雑な先行技術で使用されている方法と比べて、この発明に係る方法は、従来の増幅方法を実施するだけが必要であり、次いで増幅中に生物サンプルを電界に暴露し、そこから発生する電流を測定するだけである。この発明の方法は、従来の増幅方法では一切使用されていない酸化剤を使用して、例えば、グアニンを有するヌクレオチドタイプまたはグアニンと同じ生物学的役割を有する化合物などの化学種の消失を明らかにしている。それに加えて、酸化剤の選択は、その消失の測定を所望するヌクレオチドタイプの性質に依存している。

上記実施例は、２重鎖核酸、つまりDNA分子に関するものである。しかしながら、この発明は、適切な増幅手段を使用するためのRNAやDNAタイプの１重鎖核酸にも同様に適用することができる。上記二つの場合、これらの核酸の増幅は、グアニンを含むヌクレオチドの消費につながり、その結果、増幅プロセスが起こると、媒体中のこの化学種の減少につながる。

したがって、この発明の対象である方法の態様が、たとえ図２を参照して上記に記載された第１の方法であっても、図３を参照して上記に記載された第２の方法であっても、電流の値が有意に低下する瞬間は、増幅プロセスの経過に従って測定することによって評価される。このことは、標的DNA配列の存在を明らかにするばかりではなく、検出する標的配列を導入する核酸の初期濃度を間接的に測定することができる。これは、標的配列を導入する核酸の初期コピー数が高くなればなるほど、電流の低下が早くなり、逆にコピー数が少なくなり、かつ、電流の低下が遅く観察されることに起因している。

その上、図６に示すこの発明の別の形態によれば、この発明はまた標的核酸配列の電気化学的検出に特に適した集合体（コレクション）に関するものである。この集合体は、図３に表すような少なくとも１個の生物サンプル９５を収容する断熱装備のマイクロキュベット９４からなっている。このマイクロキュベット９４は、その底部にスクリーン印刷した電極９６を有していて、その電極はポテンシオスタットＰに結合されている。さらに、マイクロキュベット９４は、マイクロキュベット９４内部の温度を調製するのに適した発電機によって結合された２個のペルテイエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）効果モジュール９８、１００の間に配置されている。このようにして、生物サンプル９５は、その温度を、ちょうどPCRタイプの上記方法のように急激に変化させて、９４℃まで上昇させることができる。さらに、活性化可能増幅物質、例えば酸化可能ヌクレオチド塩基を有するヌクレオチドを生物サンプルに添加してもよい。

つまり、図６に示す集合体は、コンピューター制御可能であり、所望の標的配列が、マイクロキュベット９４中に置かれたサンプル中に実際に含まれているかどうか、また含まれている場合には、標的配列を含む核酸の濃度の情報を自動的に提供するのに適している。

したがって、コンピューターには、所定のサイクルに従った複製手段、つまりペルテイエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）効果モジュール９８、１００を同時に操作できるコンピュータープログラムと、所定の電位値に対するサンプル９５間を通過する電流量を測定するためのサイクル間のポテンシオスタットが搭載されている。

その上、増幅手段が使用されているとき、上記電極の表面条件は修正される。また、増幅サイクルが実施されていると、反応混合物の溶媒は、つまりこの場合は水であるが、加温して蒸発させる必要がある。溶媒を蒸発させると、溶質の濃度が自然に増加する。

その結果、測定された電流が消費されたヌクレオチド塩基の濃度に比例するとしても、それは増幅された核酸量に完全に相関関係を有していないかもしれない。

したがって、ここで起こる課題は、電極における障害と、溶媒の蒸発に係る問題を克服することである。

このことをするために、この発明の別の特に有利な態様によれば、検出手段はまた次のステップから構成するのがよい：上記酸化剤と上記ヌクレオチド塩基とが反応する電界値とは異なるシフト電界値で反応できるレドックス（ｒｅｄｏｘ）化合物を提供するステップ；上記シフト電界値でのレドックス電流値を測定するステップ；および上記増幅手段を活性化したとき、レドックス電流と、上記酸化剤と上記ヌクレオチド塩基との反応の電流との間の電流差が低下することにより、上記所定標的配列の存在を特定するステップ。

したがって、レドックス化合物、つまり内部標準として、例えば、フェロセン、ビオロゲン（ｖｉｏｌｏｇｅｎ）、オスミウム錯体などを選択し、上記酸化剤と上記ヌクレオチド塩基の酸化電位に対してシフトされた酸化電位を例えば８００ｍＶに設定することによって、レドックス化合物が酸化されても酸化剤とヌクレオチド塩基に対する酸化電流の測定を妨げるものではない。さらに、この酸化剤は活性化可能増幅手段を干渉することもない。

この発明の他の態様に従った第１の態様について図７を参照して説明すれば、電流測定の正規化は、同じ実験中に単一サンプルに対して行われる。

つまり、サンプルは、フェロセンメタノールが５０μＭの濃度で導入され、２個の電極間に開始時の電位を５０ｍＶならびに終了時の電位を１３００ｍＶに変化させて負荷した以外は、上記実施例のサンプルと同じ反応混合物中で使用した。図７で報告されたボルタムメトリーカーブはこのようにして最初の増幅サイクルで得られたものである。

このカーブは、もはや単一の極値ではなく、２個の極値を有している。第１の極値２１０は、飽和カロメル電極に対して１１００ｍＶあたりに存在し、図４に示したカーブの極値に対応する第２の極値２２０は、２００ｍＶあたりに存在し、フェロセンメタノールの酸化に対応している。第１の極値は、酸化剤、つまりルテニウム錯体の酸化の結果であり、対応する電流測定は約３２μＡであった。他方、第２の極値は、約２μＡであり、レドックス化合物の酸化の結果である。

５０ｍＶと１３００ｍＶとの間の電位スイープと電流強度との同時測定後、第１の極値２１０に対応する電流は、その値３２μＡ（図７に示す例参照）を、２μＡの第２の極値２２０で割って１６に正規化される。

次に、同じプロセスを上記実験の全ての増幅サイクルに実施した。つまり、２つの極値２１０と２２０の強度値の差の変化の測定は、ヌクレオチド塩基、つまりこの実験ではｄＧＴＰの濃度の低下からだけに由来し、実験条件を克服することができる。

その結果、第２の態様によれば、そのプロセスは、図３に示すようなタイプの一連のマイクロキュベット中にそれぞれ導入された一連のサンプルに対して同様に実施して、一連の実験が行われる。これらの生物サンプルは同じ源由来のものがよく、ここでは所定の標的配列の存在を確認することが問題である。したがって、各実験に対する酸化剤の酸化に対応する強度値を正規化することによって、生物サンプルは、容量や電極の表面条件がそれぞれ独立して変化しているので、互いに比較できることになる。

したがって、この発明のこの別の態様によれば、ヌクレオチドの実際の消費の検出を精査すると、標的配列が少数の増幅サイクル後に存在することを結論づけることができる。その結果、診断を確定するために必要な時間を短くすることができる。

その上、上記した第２の態様によって説明したように、測定は、操作条件とは無関係に比較することができる。

その上、この発明に係る検出方法は、ウイルスばかりではなく、細菌にも適用することができる。つまり、この検出方法は、細菌、例えば、アクロモバクター・ザイロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）の存在を検出するために使用することができる。この細菌の可動遺伝要素である例えばインテグロンは抗生物質耐性遺伝子の獲得に基本的役割を果たしている。

したがって、この細菌株を特徴づける３個のDNAフラグメントが同定され、PCRタイプの方法によって増幅されたこの発明の方法を実施することにより、約９００塩基対を有する第１の遺伝子「veb-1」を同定することによって上記細菌の存在を検出することができた。この遺伝子は、アモキシシリン、チカルシリン等の種々の抗生物質に高レベルの耐性を付与するベーター-ラクタマーゼをコードしている。活性化可能増幅手段は、４種のヌクレオチドと、DNAポリメラーゼと、遺伝子に対して特異的なプライマー対（「ＶＥＢ−Ｆ」と「ＶＥＢ−Ｒ」）とから構成し、上記細菌を含む生物サンプル中に導入した。

そこで、図４に表したものと同様のボルタモグラムを観察した。その実験条件によれば、増幅の開始前の電流測定による第１のカーブは、1.075 V の電位値に対して６μＡの極値を示した。増幅後に生じた第２のカーブは、その極値が約１μＡ程低下した。その結果、電流の低下は、増幅中のヌクレオチドの消費から生じたものであり、結果として、ｖｅｂ−１遺伝子が効果的に存在していることから生じたものである。

上記細菌を特徴づける１００塩基対からなる遺伝子「int 1」の第２のフラグメントが同定され、同様に検出された。

上記細菌を特徴づける２５００塩基対からなる第３のフラグメントも同定され、同様に検出された。この第３のフラグメントのヌクレオチド配列は、ｖｅｂ−１遺伝子を含む全てのカセットを含有するインテグロンの可変領域に相当する。

したがって、この発明に係る方法は、異なる活性化可能増幅手段または生物キットを用いることにより、異なるプロトコルの異なるサイズの遺伝物質のフラグメントに適用することができる。

この発明に係る方法を実施する間に発生する化学的ならびに電気化学的反応の概略を説明する反応スキームを示す図である。 この発明の第１の態様による方法を実施するための第１の集合体（コレクション）の説明図である。 この発明の第２の態様による方法を実施するためのデバイスの要素の説明図である。 この発明の方法を説明し、かつ、適用電位の関数としての電流変化のカーブを示すグラフである。 増幅プロセスの関数としての電流の低下を示すグラフである。 この発明に係る方法を実施するための第２の集合体の概略を示す説明図である。 ボルタムメトリーのカーブを示すグラフである。

符号の説明

１０ 電極
１２ 水性反応媒体
１４ 還元型
１６ 酸化型
１８ ヌクレオチド
３０ チューブ
３２ サーモサイクラー
３４ 反応混合物
３６ ペレット
３８ 電極
４０ 電極
４２ ポテンシオスタット
４４ マイクロキュベット
４６ プレート
５２ 活性エンド
５４ 活性エンド
５６ 結合エンド
５８ 結合エンド
６０ 第１のカーブ
６２ 第１の極値
６４ 第２のカーブ
６６ 第１の極値
８０ x軸
８２ y軸
８４ カーブ
８６ カーブ
８８ カーブ
９０ カーブ
９２ カーブ
９４ マイクロキュベット
９５ サンプル
９６ 電極
９８ 効果モジュール
１００ 効果モジュール
Ｐ ポテンシオスタット

Claims (14)

1. 標的核酸配列の電気化学的検出方法であって、該方法が、
   酸化剤と混合された少なくとも１種の核酸を含有してもよい生物サンプルであって、該核酸が所定の標的配列を含な、かつ、該標的配列が前記酸化剤で酸化できる少なくとも１種のヌクレオチド塩基から構成されている生物サンプルを提供すること；
   前記所定標的配列とカップリングすることができる相補手段を提供すること；ならびに
   前記生物サンプルに電界を負荷して、前記酸化剤と前記ヌクレオチド塩基との反応を生起し、前記サンプルを通過する電流を測定して、前記標的配列の存在を特定すること；
   からなる方法において、
   前記相補手段が、前記標的配列を複製するために適し、かつ、前記ヌクレオチド塩基を含むタイプのヌクレオチドで少なくとも構成されている活性化可能増幅手段であって、前記タイプのヌクレオチドが複製中に消費されて複製核酸を構成できるように構成されていること；
   前記生物サンプルと前記酸化剤とを前記活性化可能増幅手段と混合すること；および
   前記活性化可能増幅手段が活性化されて、電流の低下により前記所定標的配列の存在を特定すること；
   からなることを特徴とする標的核酸配列の電気化学的検出方法。
2. 請求項１に記載の検出方法において、前記核酸がDNAまたはRNA分子であることを特徴とする検出方法。
3. 請求項１または２に記載の検出方法において、前記ヌクレオチドがプリン窒素系塩基であることを特徴とする検出方法。
4. 請求項３に記載の検出方法において、前記ヌクレオチド塩基がグアニンまたはグアニンの化学同族体であることを特徴とする検出方法。
5. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の検出方法において、前記酸化剤がルテニウム錯体であることを特徴とする検出方法。
6. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の検出方法において、前記標的配列が時間経過と共に複製されるので、所定時間中前記電界を負荷した後、前記電流を測定することを特徴とする検出方法。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の検出方法において、前記標的配列が増幅サイクルに従って複製され、また前記電流を所定サイクル数後に測定することを特徴とする検出方法。
8. 請求項１ないし７のいずれか１項に記載の検出方法において、前記電界を前記サンプル中に浸漬するのに適した電極間に負荷することを特徴とする検出方法。
9. 請求項８に記載の検出方法において、前記電極の一つが金属酸化物ベース電極であることを特徴とする検出方法。
10. 請求項８に記載の検出方法において、前記電極の一つが貴金属酸化物ベース電極であることを特徴とする検出方法。
11. 請求項８に記載の検出方法において、前記電極の一つが炭素電極であることを特徴とする検出方法。
12. 請求項８ないし１１のいずれか１項に記載の検出方法において、前記酸化剤が前記電極の一つの表面に制限されていることを特徴とする検出方法。
13. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の検出方法において、該検出方法が次のステップから構成されていることを特徴とする検出方法：
    前記酸化剤と前記ヌクレオチド塩基とが反応する電界値とは異なるシフト電界値で反応できるレドックス化合物を提供するステップ；
    前記シフト電界値でレドックス電流値を測定するステップ；および
    前記増幅手段が活性化されたときに、該レドックス電流と、前記酸化物と前記ヌクレオチド塩基との反応による前記電流との電流差の低下に基づいて前記所定標的配列の存在を特定するステップ。
14. 標的核酸配列の電気化学的検出のための集合体であって、該集合体が：
    所定の標的配列を含むことができる少なくとも１種の核酸を含んでいてもよい、酸化剤と混合することができる生物サンプル（３４、９５）を収容する手段（３０、４４、９４）であって、前記標的配列が少なくとも１種のヌクレオチド塩基であり、前記酸化剤によって酸化できる塩基である手段；
    前記所定標的配列とカップリングできる相補手段；
    前記サンプルに電界を負荷するための手段（３８、４２、５２、５４、９６）であって、前記電界が前記酸化剤と前記ヌクレオチド塩基との反応を生起できる手段と、前記標的配列の存在を特定するように前記サンプル中を通過する電流を測定する手段（４２、Ｐ）；
    とからなる集合体において、
    前記相補手段が、前記標的配列を複製するのに適した活性化可能増幅手段からなり、前記増幅手段が、複製中に消費されて、複製核酸を構成することができるヌクレオチド塩基を含むタイプのヌクレオチドから少なくとも構成されている手段；および
    前記測定手段（４２、Ｐ）が、前記増幅手段を活性化したときに、前記核酸が前記所定標的配列を含んでいれば低下する電流値を測定することができる手段；となることを特徴とする集合体。

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